Bioquimica copia by Cami Mier

* Volumen 1

* N.1

INGENIERIA BIOQUIMICA * FCIAL 2014

Contenidos

Créditos Editora: Vanessa Vivanco Colaboradores:  Paola Vargas  Elizabeth Barragán  Rodrigo Vivanco

 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS DE OLLUCO (ULLUCUS TUBEROSUS)  ESTIMULACIÓN DE ALGUNAS ENZIMAS RELACIONADAS CON LA DEFENSA EN PLANTAS DE ARROZ (ORYZA SATIVA, L.) OBTENIDAS DE SEMILLAS TRATADAS CON QUITOSANA  ESTIMULACIÓN DE ALGUNAS ENZIMAS RELACIONADAS CON LA DEFENSA EN PLANTAS DE ARROZ (ORYZA SATIVA, L.) OBTENIDAS DE SEMILLAS TRATADAS CON QUITOSANA

CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS DE OLLUCO (Ullucus tuberosus) RESUMEN El trabajo de investigación se realizó en los laboratorios de biotecnología del Instituto de Desarrollo e Investigación en Biotecnología (IDIB) de la Universidad Nacional del Centro del Perú y de Química Bioorgánica del Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición (CIBN) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, con el objetivo de evaluar el contenido proteico de 50 variedades promisorias de olluco así como la variabilidad proteica y complejidad bioquímica. El contenido proteico de olluco liofilizado fue determinado en forma indirecta por el método de semimicro Kjeldahl, encontrándose un contenido alto de proteínas que están en un rango de 10,07 a 11,55 g /100g, de contenido medio de proteínas siendo el rango 7,00 a 9,98 g /100 g y de bajo contenido de proteínas siendo el rango de 5,60 a 6,65 g /100 g. También se ha caracterizado las proteínas de las variedades promisorias de olluco mediante la técnica de electroforesis no denaturante en gel de poliacrilamida (ND - PAGE) y de electroforesis con SDS en gel de poliacrilamida (SDS - PAGE), encontrándose variabilidad proteica por presentar dos grupos de bandas proteicas uno de 14 - 24 kD y el otro de 24 – 60 kD. Palabras clave gel de poliacrilamida, variabilidad proteica ABSTRACT The present research was carried out in the laboratories of Biotechnology of the Institute of Development and Investigation in Biotechnology (IDIB) of the National University of the Center of the Peru and of Bioorganic chemistry of the Investigation Center of Biochemistry and Nutrition (CIBN) of the National University of San Marcos, with the objective to evaluate the protein content of 50 promissory varieties of olluco as well as the protein variability and biochemical complexity. The protein content of liofilized olluco was determined in indirect form by the semimicro Kjeldahl method, by finding a high content of proteins in a range from 10,07 to 11,55 g /100g, a half content of proteins in a range from 7,00 to 9,98 g /100 g and a low content of proteins in a range from 5,60 to 6,65 g /100 g. It has also been characterized the proteins of the promissory varieties of olluco by means of the technique of electrophoresis non denaturant in polyacrylamide gel (ND - PAGE) and of electrophoresis with SDS in polyacrylamide gel (SDS - PAGE), finding protein variability because it is presented two groups of bands proteins one of 14 - 24 kD and the other of 24-60 kD. Key words polyacrylamide gel, protein variability INTRODUCCIÓN El olluco (Ullucus tuberosus Caldas) en el Perú es el segundo tubérculo en importancia luego de la papa. Es parte de la alimentación de la población peruana de todas las clases sociales.

Existen estudios realizados por diferentes investigadores que enfocan los aspectos nutricionales. Estos estudios muestran que el olluco tiene un aporte nutricional de energía 62 kcal/ 100 y un contenido de ácido ascórbico de 15, 40 mg/100g y que

además representa una buena variante nutricional por su contenido de proteínas reportándose como valor máximo un total de 15,7% sobre la base de peso seco (Pietila y Tapia 1991). Se han realizado estudios sobre la caracterización morfológica de las accesiones pertenecientes al Banco de Germoplasma de olluco del Instituto Nacional de Investigación Agraria (INIA), Programa Nacional de Investigación de Recursos Genéticos y Biotecnología (PRONIRGEB), Estación Experimental Santa Ana – Huancayo. Utilizando los descriptores morfológicos propuestos por Germoplasma del Instituto Nacional de Investigación Agraria (INIA), Programa Nacional de Investigación de Recursos Genéticos y Biotecnología (PRONIRGEB), Estación Experimental Santa Ana – Huancayo. INIA – PRONIRGEB (1985), logrando identificar 343 morfotipos, encontrándose además que el 14% de las entradas serian posibles duplicados. Diferentes métodos de análisis electroforético han sido ensayados como electroforesis en gradiente de porosidad (poroPAGE) usando una gradiente de poliacrilamida entre 12 a 25% y encontraron en el olluco dos grupos principales de bandas entre 6,5 – 12 kD y entre 25 – 58 kD. En electroforesis discontinua con SDS (SDS – disc – PAGE) y electroforesis en gradiente de porosidad con SDS (SDS – poro PAGE) revelaron para el olluco 21 bandas para muestras no reducidas y 25 bandas para muestras reducidas (Akbar y col., 1993).

Determinación de nitrógeno total mediante el método de semi micro Kjeldahl Para la digestión se pesó 0,5 g de muestra liofilizada de cada variedad de olluco, se colocaron en balones y se agrego 2 g de mezcla de sales y 4 mL de ácido sulfúrico concentrado, se calentó a 460 °C durante 2 horas. Las muestras digeridas fueron diluidas con 15 mL de agua destilada y luego se procedió a la destilación en un equipo de destilación semi micro Kjeldahl, el sulfato de amonio presente en la muestra digerida, es atacada con 15 mL de hidróxido de sodio al 50%, liberando el amoniaco que es recepcionado en 10 mL de ácido bórico al 2% con indicador rojo de metilo enmascarado. La titulación se realizó en una bureta de vidrio de 100 mL utilizando como titulante ácido clorhídrico valorado al 0,1 normal. Para la determinación del contenido de proteína de olluco se usó el MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron 50 variedades promisorias de olluco, procedentes del Banco de total en proteína cruda. Electroforesis en geles de poliacrilamida denaturante (SDS PAGE) Para obtener las proteínas totales de olluco, los tubérculos se congelaron a – 20 °C durante 24 horas, se pesaron y descongelaron. Para la obtención de extractos se utilizó una extractora de jugos, así mismo para evitar la oxidación se adicionó una solución antioxidante compuesta de sulfito de sodio al 20% y bisulfito de sodio al 15% de concentración final. El extracto se centrifugó a 3 000 rpm durante 10 minutos con la finalidad de remover el almidón y demás restos y el sobrenadante se guardó en refrigeración a

una temperatura de –20 °C hasta el momento de ser usado. Para hacer uso del extracto para los análisis electroforéticos se procedió de la siguiente manera. Se tomó 1 mL de extracto de olluco y se precipitó con 4 volúmenes de acetona fría, luego se centrifugó a 3 000 rpm por 5 minutos se descartó el sobrenadante y el sedimento fue resuspendido por buffer de muestra/agua (1:1), según el sistema discontinuo descritos por Laemili (1960) que contiene Tris – HCl pH 6,8, 0,5M, SDS 10%, glicerol 20% y 2 – mercaptoetanol 10%, y se llevó a un volumen final de 250 l, se homogenizó bien y luego se centrifugó a 12 000 rpm, durante 5 minutos, luego se calentó la muestra en baño maría por 3 minutos. Se enfrió con agua, luego se agregó 5 l de amidoblack. Las muestras fueron aplicadas en un gel de poliacrilamida al 12% (SDS – PAGE). La electrofóresis se realizó en una cámara electroforética de tipo vertical durante 6 horas, para lo cual se usó una corriente constante de 10 a 40 miliamperios. Una vez terminada la corrida electroforética los geles fueron teñidos durante toda la noche con una solución colorante de coommassie blue R – 250 al 1 % en 40 mL de ácido acético, 12 mL de ácido tricloroacético 10%, 40 mL de metanol y 160 mL de agua destilada. Posteriormente fueron decoloradas con una solución de 10 mL de ácido acético y 60 mL de metanol y 140 mL de agua destilada. Se usaron estándares de proteína (SIGMA) de pesos moleculares (PM) que van de 14 200 a 66 000 daltons. Electroforesis en geles de poliacrilamida no denaturante (ND– PAGE) Las proteínas totales de olluco fueron tratadas con una solución de sucrosa

al 60% para dar densidad y amidoblack al 0,003 % como indicador de corrida. Se utilizó el sistema discontinuo, con geles de separación de concentración 12 % a pH 8,8 y el gel de stacking o concentrador a una concentración de 5% a pH 6,8. La electrofóresis, la coloración y decoloración de los geles se siguió el mismo procedimiento descrito para los geles denaturantes. RESULTADOS DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO PROTEICO Cuadro 1. Contenido proteico de 50 variedades promisorias de olluco Variedades g/100g Variedades g/100g Peso Peso seco seco HNCO-062 11,55 HNCO8,40 SA-323 11,32 076 8,40 HNCO-072 11,20 HNCO8,40 HNCO-98 10,85 080 8,05 HNCO-010 10,85 AYA-060 8,05 AYA-26-A 10,68 HNCO7,70 SA-343 10,68 011 7,70 AYA-24 10,33 HNCO7,70 HNCO-059 10,33 016 7,70 SA-339 10,07 SA-051 7,70 HNCO-083 9,98 HNCO-28 7,35 HNCO-058 9,80 SA-12-A 7,05 SA-264 9,80 SA-262 7,00 HNCO-040 9,80 SA-138 7,00 AYA-04 9,45 SA-207 7,00 HNCO-085 9,45 SA-342 7,00 AYA-01 9,45 HNCO-55 6,65 SA-110-B 9,45 HNCO.018 6,65 HNCO-038 9,10 HNCO6,65 SA-177 8,75 045 6,30 SA-179 8,75 SA-353 6,30 HNCO-09 8,75 HNCO6,30 HNCO-087 8,75 067 5,95 SA-136 8,40 HNCO5,95 AYA-17 8,40 017 5,60 HNCO019

En el cuadro 1 se observa que, el contenido de proteína en las 50 variedades promisorias de olluco liofilizado varía entre 11,55 g/ 100g como valor máximo y 5,60 g /100g como valor mínimo. En la figura 1 se observa que del total de variedades, el 20% tienen alto contenido de proteínas, el 62% tienen un contenido medio de proteínas y el 18% tienen un bajo contenido de proteínas Fig. 1. Rangos de contenido de proteínas de olluco (Ullucus tuberosus) 35 62% 30

Bajo

Medio

Alto

15 10

20%

18%

5 0 5,60-6,65

7,00-9,98

10,07-11,55

% de proteínas

ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO Fig.2. Gel de poliacrilamida denaturante con sodio dodecil sulfato (SDS – PAGE) al 12%, de proteína total extraída de 9 variedades promisorias de olluco

En la figura 2, el análisis electroforético de las proteínas de

olluco, muestran un grupo de proteínas con pesos moleculares de 24 a 60 kD aproximadamente. Y otro grupo de proteínas, cuyo peso molecular está en el rango de 14 a 24 kD. Las proteínas menos abundantes son las de peso molecular que probablemente estaría en el rango de 5 kD a 10 kD. Se observa una gran variedad de pesos moleculares entre proteínas. DISCUSIÓN Los tubérculos andinos como la oca, olluco y la mashua representan una buena variante nutricional por su contenido en proteínas. Collazos y col., (1975) reportan que, el contenido proteínico en base húmeda es muy similar en estas especies de 1.0 a 1,5%; pero hay una considerable variación nutricional especialmente en el contenido de proteínas cuando la muestra es deshidratada; así el porcentaje de proteína en las 50 variedades promisorias analizadas fluctúa entre 11,55 % como valor máximo y 5,60 % como valor mínimo (cuadro 1), en estudios realizados por Pietila y Tapia (1991) reportan que, el porcentaje de proteína sobre la base de peso seco está entre 15,7 % como valor máximo y 5,1 % como valor mínimo. Así mismo Samanez (1974) reporta que, los porcentajes de proteína de 20 clones de olluco están en rangos de 5,1 a 8,35 %. Estos resultados al ser comparados con los obtenidos en el presente trabajo se observan que existen diferencias en el porcentaje de proteínas sobre la base de peso seco, las causas de estas diferencias, probablemente se debe a factores externos como fotoperiodo, riego, los niveles de nitrógeno disponibles para la planta, que podría haber afectado marcadamente en la concentración relativa de las proteínas de los tubérculos, pero se puede sugerir que en esta especie existe una apreciable

variación genética con respecto al contenido proteico del tubérculo, debido probablemente al carácter genético que gobierna a cada variedad. Se podría también atribuir que posiblemente se produjo alteraciones de las regiones regulatorias de genes de proteínas de reserva que provocaron sus niveles de expresión. La caracterización bioquímica de las proteínas totales de olluco mediante electrofóresis denaturante (SDS – PAGE) Figura 2, demuestran que las proteínas están divididos en dos grupos principales de bandas proteicas uno de 14 - 24 kD y el otro de 24 – 60 kD aproximadamente, esta alta variabilidad proteica hace pensar que las proteínas presentes en el olluco son bioquímicamente complejas. Similares resultados fueron reportados por Espinoza (1998) para proteínas de mashua a pesar de ser una especie genéticamente diferente, presentan también dos grupos de bandas uno formado por proteínas con pesos moleculares de 24 a 70 kD y el otro por proteínas medianamente abundantes, con pesos moleculares en el rango de 14 a 23 kD. Por otro lado resultados semejantes fueron reportados por Akbar y col., (1993) en Poro PAGE, detectándose que las proteínas del olluco están divididos en dos grupos principales uno entre 8 – 12 kD y el otro entre 25 58 kD, lo que confirma la complejidad de las proteínas del olluco. Así mismo, mediante electroforesis no denaturante (ND – PAGE) (Figuras 3 y 4), se observa dos grupos de posibles duplicados

formados por las variedades HNCO040, SA-177 y un segundo grupo formado por las variedades HNCO-55, HNCO-061 y HNCO-088 por presentar bandas similares, es decir las proteínas tienen la misma movilidad electroforética, esto podría deberse a que no hay variaciones en la secuencia de los aminoácidos de la proteína, lo que implicaría que no hay variaciones alélicas en el gen que la codifican. Las 15 variedades restantes presentan bandas diferentes, esto me hace suponer que las variantes alélicas en un locus dado codifican para proteínas similares en estructura, pero que difieren en alguna parte de la secuencia de sus aminoácidos, lo cual probablemente se traduce en cambios en la movilidad electroforética de las proteínas. Lo que me hace pensar que existe variabilidad genética entre estas accesiones.

REFERENCIAS 1. PIETILA

y TAPIA. 1991. Investigación Sobre el Ulluku. TURKU.

2. ARBIZU, C. 1994. Descriptores

Morfológicos de Olluco. Separata de 10 pag. Lima – Perú. 3. AKBAR, A., STEGEMANN, H. &

GALVEZ, M. 1993. Mashua, Oca and Ulluco: Protein Characters and Optimizing Discrimination of varieties by Electrophoretic Techniques.Institut fur Biochemie und Pflanzenvirologie, Biologische Bundesanstalt, D-3300 Braunschweig, Germany. 4. LAEMMLI, U.K. 1970, Natur. 227,

680-688.

DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES, FRUCTANOS Y PUNGENCIA EN SEIS CULTIVARES DE AJOS (Allium sativum L.) EN EL PERÚ RESUMEN La cuantificación de los compuestos químicos en las diferentes variedades de ajos son un factor importante para poder seleccionar los cultivares con mejores características químicas para la prevención de enfermedades. Nuestro trabajo de investigación cuantificó los niveles de fenoles totales, fructanos, ácido pirúvico (pungencia) y pH. Los cultivares Cincomesino E1C2, Barranquino precoz E1C5, Mapuri E1C6, Alfa suquia E1C4, Pata de perro E1C7, Barranquino tardío E1C3, fueron evaluados después de 40 días de secado, la unidad analítica consistió de 10 dientes por muestra. Los niveles de fenoles totales, fructanos, ácido pirúvico (pungencia) y pH varían en un rango de 0,307-0,626 mg GAE/g de muestra fresca, 16,1322,50 g de fructanos/100 g de muestra fresca, 55,13-86,21 ì mol de ácido pirúvico/g de muestra fresca, 6,01-6,10. El cultivar Barranquino tardío E1C3 exhibe la mayor concentración de fenoles totales (0,626 GAE/g de muestra fresca); el cultivar Mapuri E1C6 presenta la mayor concentración de fructanos (22,50 g de fructanos/100 g de muestra fresca); el cultivar Pata de Perro E1C7 presenta la mayor concentración de ácido pirúvico (86,21 ì mol de ácido pirúvico/g de muestra fresca). Palabras clave: Allium sativum L., fenoles totales, fructanos y ácido pirúvico, pungencia, ácido gálico equivalente GAE. ABSTRACT The quantification of chemistry components in different varieties of garlics, are an important factor to differentiate and to select the cultivars with the best chemistry characteristics in prevention of specific diseases. Our work of investigation quantified the levels of total phenols, fructans, pyruvic acid (pungency) and pH. The cultivars Cincomesino E1C2, Barranquino early E1C5, Mapuri E1C6, Alfa Suquia E1C4, Pata de Perro E1C7, Barranquino Late E1C3, were evaluated after of 40 day dried them, the analytic unit was of ten cloves for sample. The levels of total phenols, pyruvic acid (pungency), fructans and pH rank variation 0,3070,626 mg GAE/g fresh sample, 16,13-22,50 g of fructans/100 g . Key words: Allium sativum L., total phenols, fructans and pyruvic acid, pungency, gallic acid equivalent GAE. INTRODUCCIÓN El ajo es una de las principales hortalizas cultivadas en el mundo, debido a las propiedades culinarias, medicinales e insecticidas que posee. Estos beneficios atribuidos al ajo y sus preparaciones, están estrechamente ligados a los compuestos químicos que presenta, tales como proteínas, grasas, carbohidratos, fibra, ceniza, dimetilsulfito, aceites esenciales,

minerales como K, P, Mg, Na, Ca, Fe, Se, etc1. El compuesto precursor del olor y sabor que se encuentra en mayor concentración en el ajo es el (+)-S-alilcisteína-sulfóxido (aliina); cuando el bulbo es dañado la acción enzimática de la aliinasa produce la conversión de la aliina en alicina, ácido pirúvico y amoniaco2. Las cantidades de ácido pirúvico y amoniaco producidos son equivalentes a las cantidades de sustrato

consumidos (aliina), por lo que en la actualidad se utiliza la cuantificación de ácido pirúvico para medir la pungencia e indirectamente y cualitativamente la concentración del sustrato precursor3. En el grupo de carbohidratos presentes en el ajo, se encuentran los fructanos en un rango de 5868 % de materia seca4. Estas moléculas son importantes porque escapan al proceso digestivo en el intestino delgado, siendo fermentados selectivamente por bifidobacterias y lactobacillus en el intestino grueso, lo que le confiere propiedades prebióticas5, 6. Los compuestos fenólicos y azufrados del ajo actúan sinérgicamente bloqueando la actividad del oxígeno reactivo sobre las proteínas, lípidos y ADN, brindándole al ajo propiedades antioxidantes. Individualmente los compuestos azufrados participan en actividades hipolipémicas, antimicrobianas, antiparasitarias, antifúngicas, antibacteriales, anticancerígenas, hepatoprotectivas, antitrombóticas, protectores cardiovasculares, inmunogénicas, glicémicas, inmunomodulatorias7, 8. En el Perú el cultivo de ajos se distribuye desde el nivel del mar hasta los 3 700 m.s.n.m. lo que demuestra su amplia capacidad de adaptación9. Pero las variedades y cultivares presentes no han sido caracterizadas químicamente para poder ser dirigidas al uso específico en prevención de enfermedades, motivo por el cual este trabajo de investigación evalúa y determina el cultivar con mayor concentración de fructanos, fenoles totales y ácido pirúvico.

Materiales y reactivos Muestras: Los cultivares de ajos Cincomesino E1C2, Barranquino precoz E1C5, Mapuri E1C6, Alfa suquia E1C4, Pata de perro E1C7, Barranquino tardío E1C3 procedieron de la estación experimental agraria Donoso (Huaral). Reactivos: Sacarasa (100 U) plus áamilasa (B. cereus, 500 U), pululanasa (K. pneumoniae, 100 U) y maltasa (levadura, 1000 U) liofilizadas, fructanasa, exoinulinasa (10,000 U) y endoinulinanasa (100 U), control de fructano, control de celulosa, control de sacarosa, solución estándar de fructosa (1,5 mg/mL) Megazyme International, ácido maleico Sigma 95%, hidróxido de sodio 99,5%, ácido acético glacial Merck, 4-hydroxibenzilhidrasida Sigma, borohídrido de sodio 98,5% Sigma, Folin Ciocalteu Merck y ácido gálico Sigma, metanol Fermont, carbonato de sodio Merck, cloruro de calcio dihidratado 99%+ Sigma, ácido tricloroacético 99,4% Fisher, 2,4-dinitrofenoldidrazina Harleco, piruvato de sodio al 99% Sigma. Métodos de análisis - Compuestos fenólicos totales10. - Fructanos11. - Ácido pirúvico enzimático12. - pH13. Metodología experimental Preparación de muestras: La plantación de los cultivares se realizó el 30 de abril; para esto se utilizó el sistema de surcos a doble hilera con una separación de 0,6 m entre hileras, y 10 cm de distancia entre planta. La fertilización se realizó con 330, 150, 100 kg/ ha (urea, súper triple y sulfato de potasio). La cosecha fue manual y al azar. La cosecha de los cultivares precoces se realizó entre los meses de octubre y noviembre, Cincomesino E1C2, Barranquino precoz E1C5 el 7 de octubre; Mapuri E1C6, Alfa suquia E1C4 el 27 de noviembre, y para los

PARTE EXPERIMENTAL Lugar de ejecución El presente trabajo de investigación se realizó en los laboratorios de análisis químico y productos naturales, micología y biotecnología de la Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Agraria La Molina.

cultivares tardíos Pata de perro E1C7, Barranquino tardío E1C3 se realizó el 8 de diciembre. Los bulbos cosechados fueron agrupados en atados de 10, y el secado se llevó a cabo en secaderos verticales con protección directa del sol y con ventilación natural. Los bulbos fueron colgados aproximadamente a 70 cm del suelo y mantenidos por 40 días. Los bulbos recolectados fueron desramados y agrupados en un número de 10, los cuales fueron mantenidos en congelación para su posterior análisis.

Determinación de fructanos: 200 ì l de extracto fueron mezclados con 200 ì l de la solución sacarasa/amilasa, incubándose a 40 C por 30 minutos, posteriormente se agregó 200 0 ì l de una solución de borohídrido al 1%; después de 30 minutos de incubación a 40°C se agregó 0,5 ml de una solución de ácido acético (200 mM) solución A. 200 ì l de la solución A (duplicado), fueron mezclados con 100 ì l de la enzima fructanasa, después de 30 minutos de incubación a 40°C se agregó 5 ml del reactivo PAHBAH; seguidamente fueron llevados a incubación en agua hirviendo por un tiempo de 6 min. Los tubos retirados fueron inmediatamente puestos en agua fría. La lectura se realizó a 410 nm en un espectrofotómetro (Génesis 6.0)11.

Preparación de extractos Fenoles totales: 5 g de muestra homogenizada fue extraída tres veces con 10 ml de alcohol metílico al 80%; posteriormente los extractos fueron filtrados en papel filtro cualitativo10. Fructanos: 100 mg de muestra homogenizada fue extraída con 40 ml de agua destilada a 80°C por 15 minutos. Los extractos obtenidos fueron enrasados a 50 ml y posteriormente filtrados en papel Wathman N° 111. Ácido pirúvico: 10 g de muestra fue mezclada y homogenizada con 100 ml de agua desionizada por un tiempo de 2 minutos. Las muestras homogenizadas fueron filtradas en papel filtro cualitativo12.

Determinación de ácido pirúvico: 3 ml de muestras homogenizada fueron mezclados con 3 ml de ácido tricloroacético (5%); después de 1 hora de reposo, el sobrenadante obtenido se centrifugó durante 10 minutos a 10000 rpm. Posteriormente, 200 ì l del sobrenadante fueron mezclados con 1 ml de dinitrofenolhidrazina y 1 ml de agua desionizada; la mezcla fue incubada a 37 °C por 30 minutos. La lectura se realizó a 420 nm usando piruvato de sodio como patrón para obtener la curva estándar14.

Análisis de los extractos obtenidos Determinación de fenoles totales: Los extractos fenólicos fueron cuantificados colorimétricamente usando reactivo Folin Ciocalteu y ácido gálico como curva estándar. 200 ì l de extracto fueron combinados con 800 ì l de Folin Ciocalteu diluido 30 veces, después de 3 minutos de incubación se añadio 1000 ì l de carbonato de sodio al 7,5%. Después de 30 minutos de incubación a 25°C, se procedió a leer la absorbancia a 765 nm en un spectrofotómetro (Génesis 6.0). Los resultados fueron expresados en ácido gálico equivalente/g de muestra10.

Análisis estadístico Los resultados fueron procesados por un análisis de varianza (ANOVA) y la significancia estadística por la prueba de Tukey. Las diferencias en p < 0,05 fueron consideradas significativas. El programa empleado fue el Statgraphics Plus Versión 5,1 RESULTADO Y DISCUSIÓN Análisis químico La concentración promedio de fenoles totales, fructanos, ácido pirúvico 9

(pungencia) y pH de los seis cultivares de ajos son mostrados en la tabla 1.

0,7 0,6 0,5

Determinación de fenoles totales Las concentración de fenoles totales de los seis cultivares de ajos son mostrados en la figura1. Entre los cultivares de ajos analizados, el cultivar Barranquino tardío E1C3 exibe una mayor concentración fenoles totales (0,626 mg GAE/g de muestra fresca), seguido del cultivar Pata de perro E1C7 (0,491 mg GAE/g de muestra fresca), Mapuri E1C6 (0,409 mg GAE/g de muestra fresca), Alfa suquia E1C4 (0,339 mg GAE/g de muestra fresca), Cincomesino E1C2 (0,330 mg GAE/g de muestra fresca), Barranquino precoz E1C5 (0,307 mg GAE/g de muestra fresca). El contenido de fenoles totales varía en un rango de (0,307-0,626 mg GAE/g de muestra fresca). Estos datos se encuentran dentro de los valores previamente citados en bulbo de ajos provenientes de Italia Allium sativum L. Blanco 0,32± 0,032 mg GAE/g de muestra fresca, Brasil Allium sativum L. var. Cristo 49 mg/100 g de muestra fresca, Tailandia Allium sativum L. 63,51± 3,6710, 15, 16. Con referencia a la concentración de fenoles totales (figura 1), se observa que la concentración de estos compuestos aumenta conforme la época de cosecha de los cultivares se retrasa, notándose una diferencia entre los cultivares de cosecha precoces, intermedia y tardía. Esto puede explicarse debido a que los bulbos de los cultivares tardíos están expuestos mayor tiempo a temperaturas elevadas en el periodo de cultivo, lo cual indica una influencia directa de la temperatura sobre estos compuestos, tal como lo indica Rivero17

0,4

0,626 0,491 0,409 0,339

0,330

0,307

0,3 0,2 0,1 0

Cultivares Figura 1. Concentración de fenoles totales en mg GAE/g de muestra fresca, de los seis cultivares de ajos. Determinación de fructanos La concentración de fructanos son mostrados en la figura 2. Entre los cultivares de ajos analizados, el cultivar Mapuri E1C6 presenta la mayor concentración de fructanos (22,50 g de fructanos/100 g de muestra fresca), seguido del cultivar Alfa suquia E1C4 (21,49 g de fructanos/100 g de muestra fresca), Barranquino precoz E1C5 (19,40 g de fructanos/100 g de muestra fresca), Cincomesino E1C2 (17,74 g de fructanos/100 g de muestra fresca), Barranquino tardío E1C3 (16,99 g/100 g de fructanos/g de muestra fresca), Pata de perro E1C7 (16.13 g de fructanos/100 g de muestra fresca)17. La concentración de fructanos varió en un rango de 16,13-22,50 g de fructanos/100 g de muestra fresca. Estos datos se encuentran dentro del rango previamente citado en ajos provenientes de California 12,5-21,6 g de fructanos/100 g de muestra fresca, ajos provenientes de China 18,023,5 g de fructanos/g de muestra fresca18. Con referencia a la concentración de fructanos se aprecia que los cultivares que tienen una época de cosecha intermedia son los que presentan una alta concentración de

fructanos, diferenciándose de los cultivares de cosecha precoz y tardía. La menor concentración de fructanos en los cultivares de cosecha precoz podría explicarse debido a que la concentración de la enzima sacarosa: sacarosa 1fructosiltransferasa (1SST) se mantiene constante durante todo el periodo de cultivo formando neokestosas; y dos meses antes de la cosecha la actividad de las enzimas fructano: fructano 6 glucosafructosiltransferasa (6G-FFT) y fructano: fructano 1-fructosiltransferasa (1FFT) aumenta, produciendo que las cadenas de neokestosas aumenten su longitud. Por este motivo los cultivares de menor periodo de cultivo contienen menos neokestosas que elongar y por ende menor concentración fructanos en su estructura19. La menor concentración de fructanos en cultivares de cosecha tardía Pata de perro E1C7 y Barranquino tardío E1C3 está influenciada por la temperatura, debido a que estos cultivares están expuestos más tiempo a altas temperatura se produce la hidrólisis de los fructanos de bajo grado de polimerización dando como resultado una menor concentración de fructanos20, 21. 25

22,50

(86,21 ì mol de ácido pirúvico/g de muestra fresca), (78,60 ì mol ácido pirúvico/g de muestra fresca), seguido de los cultivares Alfa suquia E1C4 (65,31 ì mol ácido pirúvico/g de muestra fresca), Mapuri E1C6 (61,98 ì mol ácido pirúvico/g de muestra fresca), Cincomesino E1C2 (60,39 ì mol ácido pirúvico/g de muestra fresca), Barranquino precoz E1C5 (55,13 ì mol ácido pirúvico/g de muestra fresca). Los niveles de ácido pirúvico varían en rango de 55,13-86,21 ì mol ácido pirúvico/g de muestra fresca). Estos datos se encuentran entre los valores previamente citados, En ajos provenientes de Argentina 64-97 ì mol ácido pirúvico/g muestra fresca, ajos provenientes de Estados Unidos 47-63 ì mol ácido pirúvico/g de muestra fresca, ajos provenientes de México 23,1-40,9 ì mol ácido pirúvico/g de muestra fresca12, 14, 22, 23. Con referencia a la concentración de pungencia, se observa que la concentración de estos compuestos aumenta conforme la época de cosecha de los cultivares se retrasa, notándose una diferencia entre los cultivares de cosecha precoses, intermedia y tardía. Esto puede explicarse debido a que los bulbos de los cultivares tardíos están expuestos mayor tiempo a temperaturas elevadas en el periodo de cultivo, lo cual indica una influencia directa de la temperatura sobre estos compuestos, tal como lo indica Randle24.

21,49 19,40

17,74

16,99

16,13

15 10

86,21 90

80 0

Cultivares

Figura 2.

78,60 65,31

61,98

50 30 20 10 0

Determinación de ácido pirúvico (pungencia) La concentración de ácido pirúvico (pungencia) son mostrados en la figura 3. Los cultivares Pata de perro E1C7 y Barranquino tardío E1C3 son los cultivares de mayor concentración de ácido pirúvico

Cultivares Figura 3.

60,39

55,13

Los rangos promedio de variación de fenoles totales, fructanos, ácido pirúvico (pungencia) y pH son mostrados en la tabla 2.

Tabla 2. Rangos promedio de variación de fenoles totales, fructanos, ácido pirúvico (pungencia) y pH, de los seis cultivares ajos (Allium sativum L.) en conjunto.

Rangos promedios de Compuesto variación pH Fenoles Fructanos Ácido pirúvico

5,99 - 6,25 a 0,307,,0,626 b 16,13 22,50 c 55,13 86,21

c (mg GAE/g); (g/100g); (µmol/g).

El rango promedio de valores de pH varía en 5,99-6,25, estos valores varían ligeramente de los datos reportados en ajos españoles 6,12-6,47. Esto puede explicarse debido a la diferencia del cultivar analizado, así como la procedencia del ajo, tipo de suelo donde se realizó la siembra, tratamiento del cultivo y factores anbientales25. CONCLUSIONES - Los datos obtenidos de fenoles totales, fructanos, ácido pirúvico (pungencia) y pH de los seis cultivares de ajos se encuentran dentro de los rangos previamente citados por otros autores. - El cultivar Barranquino tardío E1C3 exibe la mayor concentración de fenoles

totales (0,626 mg GAE/g de muestra fresca). El cultivar Mapuri E1C6 presenta la mayor concentración de fructanos (22,50 g de fructanos/100 g de muestra fresca). El cultivar Pata de perro E1C7 presenta la mayor concentración de ácido pirúvico (pungencia), (86,21 ì mol de ácido pirúvico/g de muestra fresca). El cultivar Mapuri E1C6 es el que presenta las mejores características para el aprovechamiento industrial de fructanos. Los cultivares Pata de perro E1C7 y Barranquino tardío E1C3 presenta la mejor característica para la utilización como antioxidante debido a las altas concentraciones de ácido pirúvico y fenoles totales. BIBLIOGRAFÍA Haydar, H.; Özcan, M.; Demir, F. and Calisir, S. Some nutritional and technological properties of garlic (Allium sativum L.).Journal of Food Engineering. 2005; 68. 463469. Stoll, A. and Seebeck, E. Chemical investigations of alliin, and the specific principle of garlic, Adv. Enzymol. 1951; 11. 377-400. Schiwmmer, S.; Carson, F.; Makower, U.; Mazelis, M. and Wong, F. Experiential. 1960; 16. 449. Praznik, W.; Huber, A.; Cieslik, E. Fructans: Occurrence and application in food In: Tomasik, P. Chemical and Functional Properties of Food Saccharides. CRC Press, Boca Raton. 2003; Pag. 197-217. Coudray, C.; Tressol, J, C.; Gueux, E. and Rayssiguier, Y. Effects of inulin-type fructans of different chain length and type of branching on intestinal absorption of calcium and magnesium in rats. Europe Journal of Nutrition. 2003; 42. 91–98. Gibson, GR.; Beatty, ER.; Wang, X. and Cummings, JH. Selective estimulation of Bifidobacteria in the human colon by

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ESTIMULACIÓN DE ALGUNAS ENZIMAS RELACIONADAS CON LA DEFENSA EN PLANTAS DE ARROZ (Oryza sativa, L.) OBTENIDAS DE SEMILLAS TRATADAS CON QUITOSANA RESUMEN. La aplicación de elicitores es uno de los métodos más ecológicos y económicos para el control de plagas y enfermedades. La quitosana es un elicitor que tiene la capacidad de estimular mecanismos defensivos en las plantas, las cuales van a conferir resistencia a enfermedades. En el trabajo se presentan los primeros resultados logrados en Cuba en el empleo de elicitores quitinosos en el cultivo del arroz, en particular de la quitosana obtenida en el Departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). Durante la investigación se determinó in vivo el efecto de este compuesto aplicado a la semilla, en la estimulación de algunas enzimas defensivas como la PAL, glucanasa, quitinasa y quitosanasa en plantas de arroz (variedad J-104). Se observó el mayor incremento de la actividad de estas enzimas en las plantas tratadas con respecto al control. La mejor dosis utilizada fue 1000 mg.L Palabras clave: quitosana, semilla,glucanos, Oryza sativa, mecanismos de defensa ABSTRACT. The application of elicitors is one of the most ecological and economic methods for pest and disease control. The chitosan is an elicitor that stimulates defensive mechanisms in plants, which confer disease resistance. This work presents the first results obtained in Cuba by using chitinous elicitors in rice Crop, particularly the chitosan obtained in the Department of the crop Physiology and Biochemistry from the National Institute of Agricultural Sciences (INCA). During the investigation, the effect of this compound applied to seed was in vivo determined, to estimulate some defensive enzymes, such as PAL, glucanase, chitinase and chitosanase in rice plants (cv. J-104). The highest increment of enzymatic activity was recorded in treated plants compared to the control. The best dose used was 1000 mg.L -1. encuentran: β-1,3 glucanasas, quitinasas, quitosanasas, entre otras (2).

INTRODUCCIÓN Los elicitores son moléculas de origen biótico, capaces de estimular mecanismos defensivos en las plantas, que pueden ser aplicados de forma preventiva o directa a las plantas (1). Estas sustancias desencadenan en las plantas una serie de mecanismos defensivos, que provocan una resistencia sistémica ante el ataque de los patógenos. Dentro de estos mecanismos se incluyen el incremento en la activación de enzimas tales como la fenilalanina amonio liasa (PAL), la cual es clave en la síntesis de metabolitos defensivos importantes, donde se destacan las fitoalexinas. También se inducen otras enzimas defensivas entre las que se

Ms.C. Aida T. Rodríguez, Investigador; Ms.C. M. A. Ramírez y Elizabeth Cristo, Investigadores Agregados de la Estación Experimental de Arroz “Los Palacios”; Ms.C. A. B. Falcón, Investigador Agregado del Departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, La Habana, CP. 32 700; Dr.C. F. Guridi, Profesor Auxiliar del Departamento de Química, Universidad Agraria de La Habana. atania@inca.edu.cu

Entre los elicitores se encuentran los oligómeros de glucano, ácido galacturónico y quitosana (3). En cuanto a la quitosana se le ha prestado especial interés en los últimos años por su doble efecto: inhibir el crecimiento micelial de algunos hongos fitopatógenos y activar mecanismos defensivos en las plantas, lo cual brinda la posibilidad de utilizar estos principios activos en el control de enfermedades en cultivos de interés económico (1). Este elicitor y sus derivados han demostrado que con la aplicación preventiva de estos a las plantas, se logra además de la estimulación en algunas de las enzimas defensivas, una disminución de los síntomas de la enfermedad (4, 5). En este sentido, se ha demostrado que la quitosana aplicada a plántulas de tabaco y posteriormente infectadas con Phytophthora parasítica se logra una inducción de la actividad de las enzimas PAL y glucanasa, además de observarse protección (4). También en hojas de maní se aplicó quitosana, se infectó con Puccinia arachidis, observándose una estimulación en la actividad quitinasa y glucanasa y una disminución de las lesiones (1). En cuanto al cultivo del arroz (Oryza sativa, L.) se puede plantear, que es el alimento básico

cubanos y la demanda interna sólo se satisface aproximadamente el 33 %. Una de las causas de los bajos rendimientos de este cultivo son los daños causados por enfermedades y en especial, las de origen fungoso (6), siendo en el estado de plántulas, entre los 25 y 35 días después de germinada la semilla, donde la planta muestra la mayor susceptibilidad. Las pérdidas oscilan entre un 10-30 %, pero su capacidad destructiva en condiciones favorables llega a ser hasta un 80 % (6, 7). Resulta importante destacar, que una de las vías de transmisión de este patógeno es por semillas contaminadas, siendo el tratamiento a la semilla con fungicidas químicos uno de los métodos más usado para el control de la piriculariosis, pero los mismos son muy costosos y tóxicos al ambiente. Toda esta situación conduce a la necesidad de utilizar nuevos métodos, muchos más económicos y ecológicos, que se unan a los tradicionales para el control integrado de las enfermedades fungosas. Teniendo en cuenta estos antecedentes el objetivo del trabajo es determinar la dinámica de algunos indicadores de resistencia sistémica inducida: fenilalanina amonio liasa, β-1,3 glucanasa, quitinasa y quitosanasa estimulada por la quitosana en una variedad

Aida T. Rodríguez, M. A. Rodríguez, A. Falcón, F. Guridi y Elizabeth Cristo de arroz (J-104) . de más del 65 % de la población mundial. En Cuba constituye el 60 % de la dieta de los MATERIALES Y METODOS Elicitor utilizado. La quitosana con grado de acetilación 36.5 % (Q-63), obtenida en el Laboratorio de Oligosacarinas del Departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), por desacetilación alcalina de quitina de langosta, calidad farmacéutica (8). Estimulación de los mecanismos de defensa por la quitosana. Las semillas de arroz variedad J-104 después de desinfectadas con hipoclorito de sodio al 3 % durante tres minutos y lavadas con agua destilada estéril, fueron tratadas con disoluciones de quitosana a las concentraciones 100, 500 y 1000 mg.L -1 mediante imbibición durante 15 minutos. Posteriormente, fueron secadas a temperatura ambiente y más tarde sembradas en bandejas plásticas con suelo Gley Nodular Ferralítico concrecionario (9), esterilizado previamente durante una hora en autoclave a 121 oC, por tres días consecutivos. Se

incubaron las bandejas en cuarto de crecimiento con alternancia de luz (16 horas) y oscuridad (8 horas) a una temperatura de 22-24oC y a los 18, 25, 32 y 39 días de germinadas las semillas se determinaron las diferentes actividades enzimáticas: fenilalanina amonio liasa (PAL), β 1,3 glucanasa, quitinasa, quitosanasa, que se compararon con un control (tratado con agua). Extracción de enzimas. El material vegetal utilizado para la extracción fue hojas de arroz de las cuales se tomaron 2 g y maceraron en mortero con nitrógeno líquido. Se procedió a la extracción con una solución tampón de acetato de sodio 0.1 mol.L -1 a pH 5,2 para la determinación de las actividades: β-1,3 glucanasa, quitinasa y quitosanasa y para determinar la actividad PAL se utilizó como solución tampón tetraborato de sodio 0,1 mol.L 1 y ácido bórico 0.1 mol.L-1 a pH 8.8. Para ambas extracciones se usó 1 g de tejido por cada 2 mL de solución tampón. Determinación de las actividades enzimáticas Determinación de la actividad PAL. Se tomó 0.9 mL de L-Fenilalanina 1 mg.mL-1 (Merck calidad bioquímica) se le adicionó 0,1 mL de extracto enzimático, se incubó a 40oC durante 30 minutos. La reacción se detuvo con 0.25 mL de ácido clorhídrico 5 N, se colocaron las muestras en baño helado y se le adicionó 5 mL de agua destilada. Los valores de absorbancia se determinaron a 290 nm. Se definió como una unidad de actividad enzimática equivalente a la producción de 1 mmol de ácido transcinámico producido por minuto por mg de proteínas (10). Determinación de la actividad β- 1,3 glucanasa. A 0.2 mL de sustrato laminarina 1 mg.mL-1 (Sigma para análisis) (11) se le adicionó 0,1 mL de tampón acetato de sodio 0.1 mol.L -1 a pH 5,2 y 0,1 mL de extracto enzimático, las muestras se incubaron a 40 oC durante 30 minutos. Se determinó la actividad enzimática por medición del nivel de producción de azúcares reductores (12) y se expresó en términos de actividad específica como ìmol de glucosa producido minutos-1.mg-1 de proteínas. Determinación de la actividad quitinasa. Para este ensayo se procedió adicionando 2 mL de tampón de ácido cítrico 0,1 mol. L-1 e hidrógeno fosfato de sodio 0,1 mol.L-1 pH 5,2 a 1 mL de extracto enzimático y a un 1 mL de quitina coloidal 0.5 % (Sigma con fines analíticos). Se incubaron las muestras a 37 oC durante 20 minutos con agitación continua. La reacción se detuvo al calentarla a ebullición por 5 minutos. Se determinó el incremento de azúcares reductores (2) se leyó la absorbancia a 420 nm. La actividad enzimática se expresó como ìmoles de azúcares reductores por minuto por mg de proteínas. Determinación de la actividad quitosanasa. A 0.5 mL de quitosana al 0.5 % en buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5.2, se le añadió 0.5 mL de muestra. La mezcla se incubó a 37oC durante 24 horas, posteriormente para detener la reacción se colocaron las muestras en baño María a 100oC durante cuatro minutos (2). Se leyó la absorbancia a 420 nm. La actividad enzimática se expresó como µmoles de azúcares reductores por minuto por mg de proteínas. En todos los casos se registraron las actividades específicas de las enzimas para ello se determinó la concentración de proteínas presente en los extractos (13). Análisis estadístico. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado y con tres repeticiones por tratamientos. Las medias se compararon con el empleo de la prueba de Rangos Múltiples de Duncan para un 5 % de significación, así como se determinaron los errores estándar para cada momento evaluativo. El experimento se repitió dos veces con resultados coincidentes. Estimulación de algunas enzimas relacionadas con la defensa en plantas de arroz obtenidas de semillas tratadas con quitosana

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La enzima PAL es una de las primeras que se activa en el metabolismo secundario y a partir de ella se desencadena rápidamente una serie de mecanismos como la vía de los fenilpropanoides que da lugar a la síntesis de fitoalexinas, ligninas, ácido benzoico, ácido salicílico, siendo este último considerado una importante señal en la amplificación de las respuestas defensivas sistémicas (14, 15). Los resultados de la actividad de la enzima PAL en plántulas de arroz provenientes de semillas tratadas con quitosana se muestran en la Figura 1. Figura 1. Actividad de la enzima PAL en plántulas de arroz provenientes de semillas tratadas con diferentes concentraciones de quitosana 0.15

a b c

a a a b

Como se puede observar, se apreciaron mayores niveles de actividad PAL en las c c plantas suplementadas con las diferentes 0.05 d dosis de elicitores que en el control, con 0 diferencia significativa entre los 18 25 32 39 tratamientos aplicados. Este Días después de germinada comportamiento se mantuvo desde la Control 100 500 1000 primera evaluación realizada a los 18 días después de germinada la semilla de arroz y hasta los 39 días, tiempo en que se realiza la última evaluación. Se debe destacar que los mayores valores de actividad PAL se alcanzaron aproximadamente entre 0,12 y 0.14 µmoles de ácido transcinámico producido.mg-1 de proteínas.minuto-1 con la dosis de 1000 mg.L-1 para todas las evaluaciones, mientras que a las concentraciones de 100 y 500 mg.L-1 fueron significativamente inferiores, aunque mejores que el tratamiento control. Los resultados sugieren que la tendencia al mayor incremento de la actividad PAL ocurre entre los 25 y 32 días, después de germinada la semilla. El hecho de que a la mayor concentración de quitosana se encontró la mayor actividad PAL pudiera explicarse teniendo en cuenta que a 1000 mg.L-1 la solución es más viscosa, por lo que debe adherirse mejor a la semilla y su liberación debe ser más lenta que el resto de las concentraciones cuya viscosidad es menor. Esto trae como consecuencia que las sustancias activas se mantengan más tiempo en contacto con las semillas y plántulas de arroz (16). En cuanto a los resultados de la actividad de la enzima β-1,3 glucanasa se muestran en la Figura 2. 0.1

a a a

7 6

c 4

b 2 1

Co ntrol

Q-1 00

Q-500

Q-1000

0 18

Días después de germinada

Figura 2. Actividad de la enzima β 1,3 glucanasa en plántulas de arroz provenientes de semillas tratadas con diferentes concentraciones de quitosana Como se puede apreciar la estimulación provocada por los elicitores en la actividad de la enzima β-1,3 glucanasa fue significativamente superior que la encontrada en los tratamientos controles para la mayor parte de las evaluaciones realizadas. La dosis 1000 mg.L-1 y en menor medida la de 500 mg.L-1 de quitosana fueron las que provocaron la mayor estimulación enzimática, con diferencias significativas con el resto de los tratamientos. Se debe destacar que a los 25 días después de germinada la semilla se alcanzó la mayor estimulación de la actividad β−1,3 glucanasa para la concentración 1000 mg.L-1. Algunos autores (1), en trabajos relacionados con la actividad de esta enzima ante la aplicación de quitosana, han observado un incremento de la actividad de la misma en el tiempo. Por ejemplo, en hojas de maní encontraron un incremento de la actividad enzimática a partir del segundo día después de la aplicación del elicitor y el máximo de inducción se mostró a los 10 días después del tratamiento. Sin embargo, en otras investigaciones realizadas (4) se observó que a las 24 horas después del tratamiento a plántulas de tabaco a través de la raíz, provocó un aumento de la actividad β-1,3 glucanasa cuatro veces mayor respecto al control. En la Figura 3 se pueden apreciar los resultados de actividad quitinasa, otra de las enzimas analizadas, en las plántulas de arroz obtenidas de semillas tratadas con quitosana. Como se puede observar las plantas tratadas con las diferentes dosis del elicitor mostraron una mayor actividad quitinasa que las correspondientes a las plantas controles en la mayoría de las evaluaciones realizadas. Cuando se aplica la quitosana, se evidencia que la mayor estimulación de la actividad de la enzima se produce con la dosis de 1000 mg.L-1 para todas las evaluaciones y 500 mg.L -1 en la última evaluación, con diferencias significativas con el resto de los tratamientos. Se debe señalar que los mayores valores de actividad enzimática se encontraron a los 39 días después de germinada la semilla de arroz para todos los tratamientos.

1.2 Control Q-500

Q-100 Q-1000

a a

0.8

0.6

b b

0.4

0.2

0 18

Días después de germinadas

Aida T. Rodríguez, M. A. Rodríguez, A. Falcón, F. Guridi y Elizabeth Cristo Figura 3. Actividad quitinasa en plántulas de arroz obtenidas de semillas tratadas con quitosana Estos resultados concuerdan con lo planteado por otros investigadores (15), quienes al tratar semilla de soya con quitosana a las dosis de 250, 500 y 1000 mg.L -1 observaron que a los 17 días después de germinadas las semillas hubo una estimulación de la actividad quitinasa y que a medida que aumentaba la concentración se incrementaba la actividad, siendo 1000 mg.L-1 la mejor concentración utilizada. Estos resultados son similares a los obtenidos en este trabajo, con el mismo elicitor y la misma concentración, por lo que nos sugiere la capacidad que presenta la quitosana obtenida en el Laboratorio de Oligosacarinas de estimular los mecanismos defensivos en cultivos como la soya y el arroz. En otros trabajos (16) donde se trataron semillas de arroz con quitosana y uno de sus oligómeros durante pocos segundos y se observó también que había inducción de la actividad quitinasa a los 8 días después germinada la semilla, lo cual reafirma los resultados obtenidos. Los resultados de actividad quitosanasa se muestran en la Figura 4. 1 a 0.9 a a

0.4

a a

0.8

0.7

0.6 0.5

Control Q-500

0.1

0.3 0.2

Q-100 Q-1000

0 18

Días después de germinada

Figura 4. Actividad quitosanasa en plántulas de arroz obtenidas de semillas tratadas con quitosana

Los resultados muestran que los elicitores fueron capaces de estimular la actividad de la enzima quitosanasa de forma significativamente mayor que los tratamientos controles en la mayoría de las evaluaciones. Las plantas obtenidas de semillas tratadas con quitosana con la dosis de 1000 mg.L -1 exhibieron un mayor valor de actividad quitosanasa que el resto de los tratamientos alcanzando los valores mayores de actividad enzimática a los 39 días después de germinada la semilla de arroz, con un comportamiento ascendente en todas las evaluaciones. La concentración de 500 mg.L-1 tuvo un comportamiento más regular que 100 mg.L-1. Estos resultados confirman la capacidad estimuladora de estos compuestos sobre la enzima quitosanasa, lo cual está relacionada con la resistencia a los patógenos (17, 18). De forma general, se puede plantear que las plantas obtenidas de semillas de arroz tratadas con quitosana a la dosis de 1000 mg.L -1 lograron la mayor estimulación en todas las actividades enzimáticas evaluadas (PAL, β- 1,3 glucanasa, quitinasa y quitosanasa) desde los 18 hasta los 39 días después de germinada la semilla. Por lo que se demostró la capacidad que presenta la quitosana de estimular la actividad de algunas enzimas relacionadas con la defensa y que esta estimulación se diferencia en cuanto a la magnitud, rapidez en alcanzar los valores mayores de actividad y la dosis utilizada. Lo cual sugiere, la posibilidad de que este elicitor pueda ser empleado en la protección de plántulas de arroz contra algunos patógenos fúngicos. REFERENCIAS 1.

3. 4.

Sathiyabama, M. y Balasubramanian, R. Chitosan induces resistance components in Arachis hypogaea against leaf rust caused by Puccinia arachidis Speg. Crop Protection, 1998, vol. 17, no. 4, p. 307-313. Inui, H.; Yamaguchi, Y. y Hirano, S. Elicitor actions of Nacetylchitooligosaccharides and laminarioligosaccharides for chitinase and L-phenylalanine ammonia- lyase induction in rice suspension culture. Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, vol. 61, no. 6, p. 975-978. Takeshi, Y.; Ito, Y. y Shibuya, N. Oligosaccharide elicitors and their receptors for plant defense responses. Trends in Glycosc. Glycotech, 2000, vol. 12, no. 64, p. 113-120. Falcón, A.; Ramírez, M. A.; Márquez, R. y Hernández, M. Chitosan and its hydrolysate at tobacco-Phytophthora parasítica interaction. Cultivos Tropicales, 2002, vol. 23, no. 1, p. 61-66. Pospieszny, H. Potential use of chitosan in plant protection. En: Chitin and chitosan. Polish-Russian Monograph. Eds: Struszczyk, H. Pospieszny, H. and Gamzazade, A., 1999, p. 115-130. Cárdenas, R., Cristo, E. y Pérez, N. Variedades cubanas de arroz promisorias para la provincia de Pinar del Río tolerantes al tizón de la hoja (Pyricularia grisea Sacc.). Cultivos Tropicales, 2002, vol. 23, no. 1, p. 53-56. Prado, G. A. /et al./. Hipótesis de exclusión de linajes. Una alternativa para el desarrollo de cultivares de arroz con resistencia durable a Pyricularia grisea (Sacc.) en Colombia. Libro Resumen. En: Encuentro Internacional del Arroz (1:1998, junio 9-10, La Habana), 1998. Ramírez, M. A.; Cabrera, G.; Gutiérrez, A. y Rodríguez, T. Metodología de obtención de quitosana a partir de quitina de langosta. Cultivos Tropicales, 2000, vol. 21, no. 1, p. 8184. Cuba. MINAGRI. Instituto de Suelos. Nueva versión de clasificación genética de los suelos de Cuba, La Habana : AGROINFOR, 1999, 64 p. 20

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OBTENCION DE HIDROGENO, OXIGENO, NITROGENO Y ANHIDRIDO CARBONICO” Nombre: Vanessa Vivanco, Egda. Jessica Chamorro Primero “A” Bioquímica FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERIA EN ALIMENTOS (FCIAL). UNIVERSIDAD TECNICA DE AMBATO (UTA). Ciudadela Huachi, Casilla 18-01-0334. E-mail: fcial@uta.edu.ec AMBATO-ECUADOR

“

RESUMEN En el experimento que hemos llevado a cabo, necesitábamos tubos de ensayo, capsula, vaso de precipitación, trípode, mechero bunsen, reactivos tales como: bicarbonato de sodio, vinagre, ácido sulfúrico, basura orgánica, limaduras de hierro y zinc, agua oxigenada para observar la obtención de hidrogeno, oxigeno, nitrógeno y anhídrido carbónico. Determinamos las diferentes reacciones al colocar bicarbonato de sodio, vinagre y agua oxigenada Para la obtención del oxígeno hemos colocado en el tubo de ensayo permanganato de potasio luego agregamos el agua oxigenada y acercamos un fósforo prendido a la boca del tubo de ensayo, detenidamente observamos que el hidrogeno se fue a la parte inferior del tubo de ensayo. En la obtención del nitrógeno, colocamos en la capsula de porcelana pequeña cantidad de basura orgánica, sometemos al fuego sobre el trípode dejando hasta que se calcine, inmediatamente prendemos un fosforo junto a la capsula y detenidamente observamos que se prende la basura orgánica y desprende nitrógeno. Obtención de hidrogeno colocamos en tubo de ensayo limaduras de hierro o zinc, agregamos unas gotas de ácido sulfúrico acercamos un fosforo a la boca del tubo de ensayo, observamos detenidamente que el oxígeno baja a la parte inferior del tubo formando burbujas. Obtención del anhídrido carbónico en el vaso de precipitación colocamos bicarbonato de sodio, consecuentemente agregamos una cucharada de vinagre y prendemos un fosforo en la boca del tubo del vaso, observamos que el bicarbonato de sodio se desprende. Observar detenidamente cada procedimiento y tener mucho cuidado con algunos reactivos.

INTRODUCCION

mayor

OXÍGENO

parte

las

plantas

necesitan para vivir compuestos de

En 1777, como parte del más

nitrógeno contenidos en el suelo.

famoso experimento en la historia

Más del 80% de la producción

de la química, Lavoisier calentó

mundial de nitrógeno (unos 40

mercurio en una cantidad conocida

millones de toneladas al año) se

de aire por 12 días y sus noches,

emplea por tanto en la fabricación

separando sus dos principales

de fertilizantes.

componentes que son el nitrógeno y el oxígeno. Este gas representa

HIDRÓGENO

alrededor del 21% del volumen del

El hidrógeno era conocido por los

aire y un 23% de su peso, siendo

alquimistas de la Edad Media como

inodoro y sin sabor.

«aire inflamable», fue bautizado por

NITRÓGENO

Lavoisier como «hidrógeno» dado

Es el más abundante de los gases

que significa «el que engendra

del aire, representa alrededor del

agua».

78% del volumen del aire y un 76%

Es un gas incoloro, inodoro e

de su peso. Es un gas incoloro,

insípido, altamente inflamable y el

inodoro, sin sabor y casi totalmente

más liviano de todos los gases

inerte.

DIOXIDO DE CARBONO

Como componente esencial de

los aminoácidos, el nitrógeno es un

proceso

ligeramente

siendo

pesado que el aire y no sostiene la

dos

vida.

kilogramos del peso de un adulto de 70 kg.

picante

es aproximadamente un 53% más

animales y en las plantas. El casi

concentraciones en la atmósfera,

ADN en las personas, en los

constituye

por

inflamable ni tóxico. Existe en bajas

metabolización, ni proteínas, ni

nitrógeno

formado

Es incoloro e inodoro, con sabor

Sin este elemento (con símbolo N), habría

gas

combinación de carbono y oxígeno.

elemento fundamental para la vida.

(INDURA; 2007)

El nombre científico,

nitrogenium, procede del griego nitros, que significaba «salitre»,

OBJETIVOS 

General



Obtener

que era de donde se obtenía antes de la invención del fraccionamiento

Oxígeno,

del aire. El 99% del nitrógeno de la

Hidrógeno, Nitrógeno

Tierra se encuentra en el aire. La

y Anhídrido Carbónico 23

reaccionando químicamente elementos cambios

     

estos y

los

que

producen

Permanganato de potasio KmnO4 Basura orgánica Limaduras de hierro o zinc Ácido sulfúrico Bicarbonato de sodio Vinagre

IV. PROCEDIMIENTO

Obtención del oxigeno 

Específicos 1. Observar

cambios

Tubo de ensayo

Verter

Gotas de H2O2

Agregar

Fósforo

Acercar

KmnO4

los en

sus

propiedades físicas

Al tubo de ensayo

como químicas

Obtención del nitrógeno

2. de cada una de las reacciones producidas

En la capsula

Verter

Someter

Malla de Asbesto Esperar a que Se calcine

Acercar

Y ver el gas que Se desprende

laboratorio 3. Determinar

Basura orgánica

Al fuego la reacción Capsula Sobre elcombustionante trípode

que

tienen

gases

estos Fósforo Encendido

desprenderse de las Obtención del hidrógeno

reacciones químicas producidas

Tubo de ensayo Introducir

Limaduras de Hg y ZN

Gotas de ácido Agregar Sulfúrico

III.MATERIALES Y METODOLOGIA Materiales:  tubos de ensayo  Trípode  Malla de asbesto  Mechero Bunsen  Capsula de porcelana  Pinza  Espátula  Vaso de precipitación  Fósforos Reactivos  Agua oxigenada H2O2

Fósforo Encendido

Acercar

A la boca del Tubo de ensayo

Obtención del oxigeno Vaso de Precipitación

Verter

Cucharada de Bicarbonato de Sodio

práctica se las podría enlistar de la Vinagre

Añadir

Fósforo

Acercar

siguiente manera A la boca del Tubo de ensayo



Reacciones exegonicas



Expulsión

V.DATOS OBTENIDOS Tabla 1: obtención de diferentes gases

Gas

característicos reacciones

Reacción

olores de

estas

(para

las

personas “desagradables”) Oxigeno

Nitrógeno

S e produjo chispitas y la llame presento un aumento en su intensidad



Cambios de color



Liberaciones

Por ser un gas inflamable provoco que la llama reavivara



gases

(objetivo de la practica) Reacciones de combustión inmediatas

Hidrogeno

Reacción exotérmica

Al reaccionar al bicarbonato de

Anhídrido carbónico

CO2

Reacción efervescente, al acercar el fosforo encendido se apaga por la presencia de CO2

sodio

con

vinagre

inmediatamente poner en presencia el fosforo, este se apaga por tal motivo de que libera el llamado “dióxido de Carbono”, esto se debe a que este gas va ocupar el lugar del

Fuente: laboratorio de Química General Elaborado por: Vanessa Vivanco

oxígeno del aire, y se sabe que la combustión únicamente se produce

VI.CALCULOS Y DISCUCIONES

El Oxígeno, Hidrogeno, Nitrógeno,

bajo presencia de oxígeno.

son

Si se habla del nitrógeno en sus

desprenderse como gas; estos se

propiedades químicas se puede

caracterizan por ser flamables, es

conceptuar que

decir que su combustión es rápida

disociación de las moléculas de

y pueden resultar o no nocivos para

nitrógeno es de -171,14 Kcal por

la salud humana.

mol de N2 (calor absorbido),

En la práctica realizada en el

siendo

laboratorio de química básica se

cualesquiera

pudo observar que cada uno de esto

diatómica. A 3500 ºC únicamente

una

un 5% de las moléculas de

como

nitrógeno están disociadas en

elemento

elementos

característica

volátiles

posee propia

mayor

que otras

molécula

elemento, las reacciones que se

átomos.

observaron

nitrógeno es el elemento más

realizar

dicha

el calor de

consecuencia,

inactivo, con excepción de los

estos compuestos tienden a ser

gases inertes.

volátiles a presentarse como gas.

El hidrogeno Químicamente, 

es capaz de combinarse con

observó

la mayoría de los elementos

propiedades

cuando

químicos

tienen

las

cambios

las

físicas

cambios

encada una de las

condiciones adecuadas. El

reacciones

hidrogeno

gran

distinguir sus características, como

afinidad con el oxígeno, con

olor, calor, liberación de energía,

el cual se combina en frío

etc

tiene

muy lentamente, pero en



presencia de una llama o de

esto,

manejarse

por el contario el CO2 es un gas que

con

repele la combustión, sabiendo que la

Reacciona

los

cualquier

produce bajo

presencia de oxigeno

comburente. con

combustión

elemento solo se

oxígeno

combustionan fácil y rápidamente,

mucha precaución. El

reacción

estos gases son compuestos que se

las

mezclas de hidrógeno y aire deben

al liberarse, llegando a concluir que

casi instantáneamente con Por

Determinamos

logrando

combustión que tienen estos gases

una chispa eléctrica lo hace explosión.

hechas

metales para formar óxidos ácidos

VIII.CUESTIONARIO

anhídridos.

3. Reacciona con los metales

¿Cuál es la función del agua en la obtención del oxígeno?

para formar óxidos básicos.

El agua oxigenada es agua con una molécula extra de oxígeno que causa su inestabilidad cuando se agrega al agua, creando cierto nivel de ozono

4. Reacciona con muchos de sus compuestos. VII.CONCLUSIONES



El ozono a su vez teniendo la oportunidad reacciona a cualquier componente presente y este proceso se llama oxidación.

Se obtuvo con éxito los gases de los elementos

mencionados

Por este simple medio, mata las bacterias en el agua y agrega oxígeno a su sistema. Los niveles altos de oxígeno en el agua han probado aumentar considerablemente la rapidez de crecimiento de las plantas.

anteriormente mediante reacciones químicas

estos

elementos

pudiéndose observar los cambios

¿Cuál es la función del bicarbonato de sodio en la obtención del anhídrido carbónico?

inmediatos que se producen ya que

No arde ni sufre combustión, por lo que se emplea en extintores de fuego. El extintor de CO2 es un cilindro de acero lleno de dióxido de carbono líquido que, cuando se libera, se expande repentinamente y produce una bajada de temperatura tan enorme que se solidifica en polvo. ¿Qué aplicaciones industriales se podrían dar en cada caso de obtención? En las industrias química y petroquímica, el oxígeno se utiliza como reactivo para mejorar el rendimiento de un gran número de procesos. En metalurgia y en siderurgia, también se emplea para la combustión y para ajustar el contenido de carbono de los aceros. El nitrógeno es utilizado para el petróleo, laboratorios, envasados de alimentos o bebidas. Aprovechamiento del Gas de Síntesis: La producci ón de hidrógeno a partir de hidrocarburos conduce a una mezcla degases formada principalmente por hidrógeno y m onóxido decarbono. Esta mezcla de gases se denomina Gas de Síntesis IX.REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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