Pôsteres Pré-IC 2012

“ANÁLISE COMPARATIVA DE EXPRESSÃO GÊNICA E DIFERENCIAÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS EM CÉLULAS ADIPÓSAS E OSTEÓCITAS” Lucas Eduardo Kava; Dimas Tadeu Covas; Evandra Strazza Rodrigues; Fernanda Ursoli de Melo; Katia Kaori Otaguiri; Mariana Tomazini Pinto; Mauricio Cristiano Rocha Junior; Mayra Dorigan de Macedo; Simone Kashima; Tathiane Maistro Malta Pereira; Virgínia Mara de Deus Wagatsuma.

Laboratório de Biologia Molecular, Hemocentro da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - FMRP.

Introdução Célula-tronco é um tipo de célula indiferenciada que possuí a função de originar e manter tecidos corporais a partir da concepção de auto renovação, proliferação e diferenciação. É encontrada em seu primeiro estágio – após a fecundação – no blastocisto, onde recebe o nome de Célula-tronco embrionária. As Células-tronco se encontram em seus respectivos nichos, onde ficam em estado de quiescência (repouso). Nosso estudo enfatizou as Células-tronco Mesenquimais (CTM), as quais foram induzidas à diferenciação in vitro em duas linhagens: uma de células adipócitas e outra de células osteócitas. Para responder ao questionamento: “Por que, com o mesmo material genético, uma célula se difere de outras?”, analisamos e comparamos a morfologia dos três tipos celulares – CTM, adipócito e osteócito, – por microscopia e realizamos a análise comparativa do perfil de expressão gênica, utilizando o método de PCR em Tempo Real (qPCR), comprovando a diferenciação da Célula-Tronco Mesenquimal em adipócitos e osteócitos.

Objetivos

Métodos

Verificar por meio de microscopia e PCR em tempo real a capacidade de diferenciação das Primeira etapa: cultura das CTMs. Realizamos células-tronco mesenquimais em adipócitos e osteócitos. Verificar alguns fatores que inicialmente o cultivo de CTMs, permitindo assim sua regulam esta diferenciação. proliferação e expansão. Estas células foram então divididas em 6 placas, todas contendo inicialmente o mesmo número de CTMs. As placas foram divididas em 3 grupos (cada grupo com 2 placas), sendo 1 grupo controle (CTMs), 1 grupo para diferenciação em adipócitos e outro para osteócito. Todos os ensaios foram realizados em duplicata. Incentivamos a proliferação das CTMs para que pudéssemos, por meio de diferenciação celular, obter três tipos de linhagens celulares: uma linhagem de CTM, uma de adipócito e outra de osteócito. O processo de diferenciação exige manutenção constate das células em cultura (troca do meio de cultivo) para evitar danos celulares decorrentes da perda de nutrientes.

Segunda etapa: análise morfológica dos três tipos celulares através da microscopia. Nesta etapa identificamos as diferenças morfológicas entre as três linhagens, como pode ser observado na Figura 1.

Terceira etapa: análise de expressão gênica através do método de PCR em tempo real (qPCR). Fizemos a Quantificação Relativa, isto é, comparamos os resultados obtidos das células após diferenciação (adipócitos e osteócitos) com uma amostra de referência, a CTM. Utilizamos também um gene normalizador e uma sonda (TaqMan), capaz de emitir A- Célula Tronco Mesenquimal , indifereciada, corada com corante para adipócito. uma luz que é captada pelo aparelho. Após os ciclos B- Célula Tronco Mesenquimal, indiferenciada, com corante para osteócito. e a análise de expressão gênica, utilizamos um C- Adipócito -ΔΔCt) para normalizar os cálculo matemático (2 D- Osteócito resultados.

A

B

C

D

Resultados e Conclusão Após a análise de expressão gênica, podemos concluir que apesar de todas as células terem o mesmo material genético, o que diferencia uma célula de outra é sua expressão gênica, isto é, uma determinada sequência de bases nitrogenadas que é utilizada para a produção de RNA mensageiro e posteriormente resultará em uma proteína. Tal processo é indispensável em uma célula. A partir dessa ideia, conseguimos comprovar também a capacidade de diferenciação da Célula-tronco Mesenquimal in vitro em dois diferentes tipos celulares.

30 25 20 15 10 5 0

Adiponectina normalizado

ACTB

Adiponectina 24,4 24,2 24 23,8 23,6 23,4 23,2 23 22,8 22,6 22,4 22,2

16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0

Estudo Protêomico de linhagens celulares U87MG e T98G – derivadas de Glioblastoma Multiforme 1ROSSATO,

M. H. L.; 1GRINE, N. C.; 2VIDA, R. C. S.; 2LAURE, H. J.; 2ROSA, J. C. 1Alunos

do programa de Pré-iniciação Científica.

2Centro de Química de Proteínas e Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto

Introdução Gliomas são os tumores cerebrais primários mais comuns do Sistema Nervoso Central. Um deles é o Astrocitoma, classificado de I a IV segundo a OMS, dependendo do grau de agressividade. O Astrocitoma IV é o mais agressivo e é geralmente chamado de Glioblastoma

Multiforme . Ao logo do ano, acompanhamos a equipe do Centro de Química de Proteínas do Hemocentro de Ribeirão Preto, que tem como objetivo avaliar as mudanças do proteoma nas linhagens celulares T98G e U87MG derivadas de glioblastoma, utilizando métodos de cultura celular, separação de proteínas por eletroforese e espectrometria de massa. Através do conhecimento do proteoma dessas linhagens poderá contribuir para um melhor entendimento do processo biológico envolvido da progressão tumoral e criando novas margens para a intervenção terapêutica.

Mas por quê Proteoma e não Genoma?

O genoma é toda a informação hereditária de um organismo que está codificada no DNA, isto inclui tanto os genes como as sequências não-codificadoras. Já o proteoma é o conjunto de proteínas que pode ser encontrado numa célula específica quando ela está sujeita a um certo estímulo. Sendo assim, ela é o produto final da tradução do RNA mensageiro. Em relação ao citado projeto, o genoma apresenta o fato de que ele pode trazer falsas hipóteses em comparação ao proteoma, que fornece o produto final, que é a proteína. Mas um estudo pode complementar o outro. Ou seja, as duas áreas são importantes para o estudo do câncer.

Figura 1. Representação linhagens T98G e U87MG.

dos métodos utilizados para os estudos das

Resultados Com o objetivo de determinar a quantidade de proteína das amostras U87MG e U87MG + rapamicina, usamos o método de Bradford, que se baseia no deslocamento do pico de absorvância do Coomassie Blue G 250 de 465nm para 595nm quando este se liga às proteínas presentes na amostra.

A dosagem de Bradford é útil para quantificar misturas de proteínas (sempre com base em uma curva padrão com quantidades conhecidas de proteína) e para o acompanhamento de cromatografias, sendo rápida e sensível.

Conclusão

Figura 2. As amostras foram colocadas em tubos teste de 1,5mL, completando para 100µL com dH₂O, e em seguida, foi adicionado 1 parte do Reativo de Bradford mais 4 partes de água e homogenizado em Vortex. Elas foram incubadas a temperatura ambiente durante 15 minutos e a absorvância foi determinada com leitura de 595nm no espectrofotômetro. A curva padrão é realizada com BSA 0,1mg/mL e possui 5 pontos com 0,0µg, 0,5µg, 1,0µg, 1,5µg, e 2,0µg.

Os ensaios apresentados são importantes para o estudo global de proteínas (proteômica), pois é através da quantificação das proteínas (apresentada pelo método de Bradford) podemos nivelar a quantidade de proteínas a ser inserida (loading) em um ensaio mais complexo, como cromatografia, eletroforese de duas dimensões e espectrometria de massas. A espectrometria de massas constitui o método mais preciso para mensuração e elucidação da estrutura linear das proteínas, e através desses métodos os diferentes processos biológicos envolvidos na progressão de um tumor (como no caso do glioblastoma multiforme) podem ser elucidados, visando a descoberta de potenciais marcadores prognósticos e contribuindo para a ciência como um todo.

Figura 3: Espectro de massa da proteína soroalbumina obtida através de Eletrospray QTOF (ESI-Q-TOF). Após digestão da proteína com tripsina os peptídeos foram submetidos a separação através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) liga ao espectrômetro de massas para caracterização da amostra. Cada pico no gráfico acima corresponde a um peptídeo que compõe a proteína, cuja estrutura original também é mostrada. A partir destes dados uma tabela de informações é gerada e os dados são submetidos ao banco de dados online para interpretação. Gráfico representativo de uma amostra contendo uma única proteína (mistura simples).

Agradecimentos Somos muito gratos a equipe do Centro de Química de Proteínas e da Casa da Ciência, que nos proporcionaram uma experiência incrível, e agradecemos pelo apoio dos professores da rede Estadual.

Apoio:

Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto iba Programa de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada -/TLR2 durante

Avaliação do infiltrado inflamatório em animais experimental por Leishmania infantum chagasii

a infecção

PEDRO L. B. P. FERREIRA (1); LAÍS A. SACRAMENTO; MANUELA S. L. NASCIMENTO(1); DJALMA S. LIMA-JUNIOR(1); DIEGO L. COSTA(1); VANESSA CARREGARO.(1); JOÃO S. SILVA(1) 1Departamento

de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil. pedroleopoldo@live.com

INTRODUÇÃO Os parasitos pertencentes ao gênero Leishmania causam um amplo espectro de doenças humanas, sendo a de maior morbidade e mortalidade a leishmaniose visceral (VL) – onde há comprometimento principalmente do fígado e baço. Uma das principais espécies causadoras dessa patologia é a Leishmania infantum chagasi, presente no Brasil e na América do Sul. O controle desta doença está relacionado com a resposta imunológica gerada pelas células CD4+T helper (Th1) produtoras de IFN-γ. A IL-12, citocina comumente produzida por células dendríticas (DCs) e macrófagos, é importante na indução e manutenção da resposta Th1. Diversos estudos indicam que a capacidade das DCs produzir IL-12 está diretamente condicionada à capacidade do reconhecimento de produtos patogênicos. Os receptores padrões do tipo Toll (TLRs) são as principais moléculas envolvidas no reconhecimento dos patógenos e, dependendo do tipo de receptor e a intensidade de ativação, podem atuar em conjunto no controle da LV. Dados obtidos por nós demonstraram que, dentre os TLRs testados, o TLR2 apresentou alta susceptibilidade à infecção quando comparados aos selvagens, dados obtidos pelo número de parasitos presentes no baço e fígado dos animais.

Entretanto não analisamos se a susceptibilidade estava diretamente relacionada com a composição do infiltrado inflamatório presente nesses órgãos. Dentro deste contexto, o presente estudo tem como objetivo avaliar o infiltrado inflamatório presente no baço e fígado dos animais TLR2-/- na susceptibilidade à infecção por Leishmania infantum chagasi. A elucidação desses mecanismos pode levar ao desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas que auxilie na proteção ao hospedeiro.

METODOLOGIA fígado WT or TLR2-/-

4e6 semanas p.i.

Eutanazia dos animais

Carga Parasitária Diluição limitante

Histopatologia

Infecção 1 x107 formas promastigotas de Leishmania infantum chagasii (Lic)

RESULTADOS

Fig 1. TLR2-/- apresenta maior número de parasitos no fígado durante a infecção por Lic. C57BL/6 wild type (WT) e TLR2-/- foram infectados com 1 x 107 formas promastigotas de Lic e os parasitos foram quantificados no fígado na 6º semana p. i. por meio de diluição limitante. Diferenças estatisticamente significantes foram observadas entre os grupos.

Quando *p < 0.05 foi comparado com WT.

Figura 2- Animais TLR2-/- apresentam menor infilrado inflamatório durante a infecção por Leishmania infantum chagasi. Camundongos C57BL/6 e geneticamente deficientes para TLR2 (TLR2-/-) foram desafiados com 1 x106 formas promastigotas metacíclicas do parasita. Na 4ª e 6ª semana pós-infecção, os animais foram eutanizados e, então, as amostras dos fígados foram coletadas, fixadas em paraformaldeído, e inclusas em blocos de parafina.

Secções dos fígados de animais C57BL6 (A/C) e de TLR2-/- (B/D) foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E).

Resultados obtidos de 3-4 animais por grupo experimental. Aumento original de 200X.

CONCLUSÃO Esses dados em conjunto demonstram que a ativação do TLR2 leva ao recrutamento de células inflamatórias para o local de infecção e, dessa forma, controlam o crescimento do parasita, tornando-os mais resistentes.

APOIO :