“ANÁLISE COMPARATIVA DE EXPRESSÃO GÊNICA E DIFERENCIAÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS EM CÉLULAS ADIPÓSAS E OSTEÓCITAS” Lucas Eduardo Kava; Dimas Tadeu Covas; Evandra Strazza Rodrigues; Fernanda Ursoli de Melo; Katia Kaori Otaguiri; Mariana Tomazini Pinto; Mauricio Cristiano Rocha Junior; Mayra Dorigan de Macedo; Simone Kashima; Tathiane Maistro Malta Pereira; Virgínia Mara de Deus Wagatsuma. Laboratório de Biologia Molecular, Hemocentro da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - FMRP.
Introdução Célula-tronco é um tipo de célula indiferenciada que possuí a função de originar e manter tecidos corporais a partir da concepção de auto renovação, proliferação e diferenciação. É encontrada em seu primeiro estágio – após a fecundação – no blastocisto, onde recebe o nome de Célula-tronco embrionária. As Células-tronco se encontram em seus respectivos nichos, onde ficam em estado de quiescência (repouso). Nosso estudo enfatizou as Células-tronco Mesenquimais (CTM), as quais foram induzidas à diferenciação in vitro em duas linhagens: uma de células adipócitas e outra de células osteócitas. Para responder ao questionamento: “Por que, com o mesmo material genético, uma célula se difere de outras?”, analisamos e comparamos a morfologia dos três tipos celulares – CTM, adipócito e osteócito, – por microscopia e realizamos a análise comparativa do perfil de expressão gênica, utilizando o método de PCR em Tempo Real (qPCR), comprovando a diferenciação da Célula-Tronco Mesenquimal em adipócitos e osteócitos.
Objetivos
Métodos
Verificar por meio de microscopia e PCR em tempo real a capacidade de diferenciação das Primeira etapa: cultura das CTMs. Realizamos células-tronco mesenquimais em adipócitos e osteócitos. Verificar alguns fatores que inicialmente o cultivo de CTMs, permitindo assim sua regulam esta diferenciação. proliferação e expansão. Estas células foram então divididas em 6 placas, todas contendo inicialmente o mesmo número de CTMs. As placas foram divididas em 3 grupos (cada grupo com 2 placas), sendo 1 grupo controle (CTMs), 1 grupo para diferenciação em adipócitos e outro para osteócito. Todos os ensaios foram realizados em duplicata. Incentivamos a proliferação das CTMs para que pudéssemos, por meio de diferenciação celular, obter três tipos de linhagens celulares: uma linhagem de CTM, uma de adipócito e outra de osteócito. O processo de diferenciação exige manutenção constate das células em cultura (troca do meio de cultivo) para evitar danos celulares decorrentes da perda de nutrientes. Segunda etapa: análise morfológica dos três tipos celulares através da microscopia. Nesta etapa identificamos as diferenças morfológicas entre as três linhagens, como pode ser observado na Figura 1. Terceira etapa: análise de expressão gênica através do método de PCR em tempo real (qPCR). Fizemos a Quantificação Relativa, isto é, comparamos os resultados obtidos das células após diferenciação (adipócitos e osteócitos) com uma amostra de referência, a CTM. Utilizamos também um gene normalizador e uma sonda (TaqMan), capaz de emitir A- Célula Tronco Mesenquimal , indifereciada, corada com corante para adipócito. uma luz que é captada pelo aparelho. Após os ciclos B- Célula Tronco Mesenquimal, indiferenciada, com corante para osteócito. e a análise de expressão gênica, utilizamos um C- Adipócito -ΔΔCt) para normalizar os cálculo matemático (2 D- Osteócito resultados.
A
B
C
D
Resultados e Conclusão Após a análise de expressão gênica, podemos concluir que apesar de todas as células terem o mesmo material genético, o que diferencia uma célula de outra é sua expressão gênica, isto é, uma determinada sequência de bases nitrogenadas que é utilizada para a produção de RNA mensageiro e posteriormente resultará em uma proteína. Tal processo é indispensável em uma célula. A partir dessa ideia, conseguimos comprovar também a capacidade de diferenciação da Célula-tronco Mesenquimal in vitro em dois diferentes tipos celulares.
30 25 20 15 10 5 0
Adiponectina normalizado
ACTB
Adiponectina 24,4 24,2 24 23,8 23,6 23,4 23,2 23 22,8 22,6 22,4 22,2
16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0