CONSERVACION IN VITRO DE CINCO ESPECIES DE CACTACEAS EN PELIGRO DE EXTINCION DE GUATEMALA, DISTRIBUÍDAS EN LOS DEPARTAMENTOS DE EL PROGRESO Y ZACAPA. Informe de Avance Ing. Agr. Luis Gerardo Molina Monterroso Ing. Agr. MSc. Héctor Alfredo Sagastume Mena Licda. MSc. Aura Elena Suchini Farfán
Investigador Principal Investigador Asociado Investigadora Asociada
1. PALABRAS CLAVE Conservación, in vitro, biodiversidad, cactaceae, Cephalocereus maxonii, Melocactus ruestii, Myrtillocactus eichlamii, Nyctocereus guatemalensis, Stenocereus eichlamii. 2. RESUMEN Las cactáceas se encuentran en el índice 2 de la Lista Roja de Flora Silvestre que publicó el Consejo Nacional de Areas Protegidas en enero del año 2002 y en el apéndice II de CITES. El propósito de este proyecto fue encontrar los medios de cultivo apropiados para la propagación y la conservación in vitro de cinco diferentes especies de cactáceas en peligro de extinción, distribuídas en los departamentos de El Progreso y Zacapa. Este proyecto sería el inicio para la creación de un banco de germoplasma de especies de cactaceas con potencial ornamental, alimenticio y/o de exportación en peligro de extinción en el país. 3. INTRODUCCION El crecimiento de las poblaciones rurales y su alto índice de marginalidad, la oportunidad de tener acceso a recursos limitados a través de la venta de ejemplares colectados en los ecosistemas naturales y el cambio de uso del suelo, son las principales causas de presión sobre las especies que consideramos amenazadas o en peligro de extinción. Poco podemos hacer por medio de la legislación para la conservación de los recursos bióticos, porque la presión para la explotación está asociada a la marginalidad, al crecimiento de la población y al desinterés por los recursos naturales. En diversas partes del mundo existe afición por el cultivo de cactáceas, afición que radica en su diversidad de formas, como en la belleza de sus flores efímeras. Las cactáceas no sólo tienen importancia económica por sus cualidades como plantas ornamentales, las hay también alimenticias, forrajeras e industriales. Aparte de la importancia comercial que puedan tener, tanto para el desarrollo económico de las regiones donde abundan, es importante considerar el rol ecológico que desempeñan. En los ecosistemas de las regiones áridas y semiáridas del continente americano, las cactáceas son cruciales en la estabilidad de los mismos, por lo que se hace necesario investigar y desarrollar tecnologías que permitan su preservación, pues debido a sus características fisiológicas especiales, las cactáceas son susceptibles a la extinción cuando ocurren cambios bruscos en su medio. Con éstas tecnologías se puede proteger su diversidad y así preservar el recurso para su aprovechamiento. -1-
Conservar especies vegetales requiere de mecanismos ex situ. Uno de los más exitosos es la propagación “artificial”; tanto por los medios tradicionales, por semilla y vegetativos, así como por las técnicas de cultivo in vitro o micropropagación. Las técnicas de propagación vegetativa inclusive por cultivo in vitro permiten incrementar rápidamente el numero de individuos pero disminuye la variabilidad. Recurrir a la técnica de cultivo in vitro o micropropagación ha mostrado que disminuye el tiempo que requiere la planta para alcanzar una talla comercial o para que pueda sobrevivir al transplante en su medio original. Cualquier planta de este planeta posee diferencias de todo tipo que se perderán al extinguirse, por esto cualquier planta en peligro o endémica, debe protejerse, estudiarse y reproducirse en sus hábitats. Actualmente existen muchas especies de cactus en peligro de extinción, en los listados CITES (organismo compilador de especies en peligro) aparecen de todos los desiertos del planeta. Algunas que no estaban en riesgo hace unos años, lo están actualmente y dichos listados aumentan con los años. La conservación in vitro tiene muchas ventajas: permite el almacenamiento de gran número de especies en un espacio reducido, se elimina el riesgo de daños por plagas y enfermedades, es posible producir y mantener plantas libres de virus con altas tasas de multiplicación y todo esto independiente de las condiciones climáticas. Con este proyecto no sólo se estarán conservando, a mediano plazo, especies en peligro de extinción del país, como las cactáceas, sino que también se estará generando información valiosa para aquellas personas que quieran dedicarse a su cultivo y exportación, evitando con ello la extinción de especies. Además, este proyecto dará inicio a la formación de un banco de germoplasma de especies en peligro de extinción del pais. 4. OBJETIVOS 4.1. General •
Contribuir a la conservación de cinco especies de cactáceas en peligro de extinción existentes en los departamentos de El Progreso y Zacapa.
4.2. Específicos •
Determinar la influencia de diferentes concentraciones de auxinas y citocininas sobre el desarrollo de callos en las cinco especies de cactáceas.
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Determinar el medio de cultivo más adecuado para la regeneración de plántulas a partir de callo en las cinco especies de cactáceas.
•
Determinar el medio más adecuado para la conservación in vitro a mediano plazo de las cinco especies de cactáceas estudiadas.
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5. METODOLOGIA 5.1. Colecta de especies. Se realizaron cuatro viajes de colecta, de tres días cada uno, a los departamentos de El Progreso y Zacapa, sitios reportados con presencia de cactáceas en Guatemala por la Flora de Guatemala. Los viajes se realizaron en los meses de marzo, abril y mayo del año 2004. Para la toma de los datos de altitud, latitud y longitud se utilizó un altímetro y un posicionador geográfico GPS. 5.2. Tratamiento de plantas vivas. Las plantas se trasladaron al Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas –ICTA- para su determinación taxonómica, posteriormente los brotes se sembraron en macetas conteniendo tierra abonada y arena, en proporción 1:1, previamente esterilizadas con agua hirviendo. Las plantas se colocaron en el invernadero del laboratorio de Biotecnología del ICTA, donde se trataron dos veces por semana con una solución 2.5% v/v del funguicida Derosal 50 SC (Metil-2-benzimidazol-carbamato 50%) y con una solución 0.5 g/L de Agrymicin 16.5 WP (Estreptomicina sulfato 15%, Oxitetraciclina 1.5%, 0.5 g/l) durante dos meses. 5.3. Determinación taxonómica de plantas colectadas. Para determinar taxonómicamente las especies de cactáceas colectadas se utilizó la clave dicotómica de la Flora de Guatemala con el auxilio de estereoscopio y pinzas. 5.4. Desinfección de explantes. Se extrajeron las semillas contenidas en los frutos colectados y se desinfectaron de la siguiente manera: inicialmente se lavaron con jabón desinfectante y agua de chorro en movimiento, posteriormente se colocaron en una solución 0.1 % v/v de Derosal (Metil-2-benzimidazol-carbamato 50%) por 20 minutos, seguidamente se colocaron en alcohol al 70% durante un minuto, por último se desinfectaron en una solución de hipoclorito de calcio al 10%, durante 30 minutos. Finalmente, se trasladaron a la cámara de flujo laminar donde, luego de tres lavados con agua esterilizada, se procedió a la siembra. 5.5. Siembra de semillas. Las semillas de las diferentes especies se sembraron en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) para su germinación. Se mantuvieron en el cuarto de crecimiento a 30°C, humedad del 80% e iluminación 1000 lux. 5.6. Desarrollo de callo. Se prepararon los medios T1 y T1 modificado (16,20). En ellos se sembraron porciones de tallo de las siguientes especies Cephalocereus maxonii Rose, Melocactus ruestii Schumann, Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose, Nyctocereus guatemalensis Britt y Rose y Stenocereus eichlamii (Quehl) D.R. Hunt. Especies de las que se poseían un mayor número de plántulas germinadas.
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Cuadro 1. Componentes del medio T1 y T1 modificado. REACTIVO Medio T1 Macroelementos MS/2 Microelementos MS/2 Fe EDTA MS/2 Tiamina 10 mg Myoinositol 100 mg Acido nicotínico 1 mg Piridoxina HCl 1 mg Glicina 1 mg Extracto de malta 400 mg Caseína hidrolizada 100 mg AIB 1 mg 2 iP 2 mg 2,4 D 0.5 mg Sacarosa 30 g Phytagel 3g pH 5.6
Modificación de T1 MS/2 MS/2 MS/2 10 mg 100 mg 1 mg 1 mg 1 mg 400 mg 100 mg -------0.5 mg 1 mg 30 g 3g 5.6
Posteriormente, luego de transcurridos dos meses, se procedió a la propagación del callo, sembrando porciones de callo en los mismos medios. 5.7. Variables de respuesta. Las variables de respuesta analizadas fueron las siguientes: porcentaje de inducción de callo y peso fresco de callo (medido en gramos). 5.8. Análisis Estadístico. Para las variables de respuesta porcentaje de inducción de callo y peso fresco de callo se efectuó un análisis de varianza. El diseño experimental utilizado fue completamente al azar, con 10 tratamientos (cinco especies y dos medios de cultivo) y 20 repeticiones por tratamiento. 5.9. Regeneración de plántulas. Porciones de callo de las especies Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose y Stenocereus eichlamii fueron sembradas en medio Murashige y Skoog conteniendo diferentes concentraciones de ANA (0.5, 1, 1.5 y 1.7 mg/l). Otro grupo contenía 3 mg/l de 2,4-D, con la finalidad de inducir la regeneración de plántulas. 5.10. Variables de respuesta. Las variables de respuesta analizadas fueron las siguientes: porcentaje de regeneración de plantas y número de plantas por callo. 5.11. Análisis estadístico. Para las variables porcentaje de regeneración de plantas y número de plantas por callo no se efectuó análisis de varianza debido a que únicamente uno de los dos tratamientos produjo regeneración de plantas en la especie Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose.
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6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1. Especies Colectadas En el cuadro 2 se listan las diferentes especies colectadas, su distribución y el porcentaje de germinación de cada una. Cuadro 2. Especies de cactaceas colectadas, distribución geográfica y porcentaje de germinación Parte colectada
Distribución
Acanthocereus pentagonus (L.) Britt y Rose
Brotes
América
Cephalocereus maxonii Rose
Frutos, brotes
Guate, Hond.
Brotes
Guate, Mex, Salv
Brotes
Guate, Hond, Salv
Melocactus ruestii Schumann
Frutos
Guate, Hond.
Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose
Frutos, brotes
Endémica
Nyctocereus guatemalensis Britt y Rose Opuntia decumbens SalmDyck
Frutos, brotes Frutos, brotes Frutos, brotes
Guate, Mex
Brotes
Endémica
Frutos
Guate, Salv, Hon, Nic
Frutos, brotes
Endémica
Especie
Hylocereus undatus (Haworth) Britt, Rose y Britton Lemaireocereus eichlamii Britt y Rose
Opuntia eichlamii Rose Pachycereus lepidanthus (Eichlam)Britt y Rose Pereskia autumnalis (Eichlam)Rose Stenocereus eichlamii Britt y Rose
Endémica
Endémica
Sitio de colecta Km 74 al Atlántico 14°52´00.5´´, 90°04´00.5´´ Km 74 al Atlántico 14°52´00.5´´, 90°04´00.5´´
Germinación (%)
92
Km 150.5 al Atlántico 14°55´29.0´´, 89°31´39.5´´ Km 74 al Atlántico 14°52´00.5´´, 90°04´00.5´´ 14°56´04.5´´, 89°57´33.9´´ Km 101 Aldea manzanal 14°55´57.4´´, 89°51´07.9´´ Km 93.5 al Atlántico 14°55´17.4´´, 89°56´23.5´´ Km 96 al Atlántico 14°56´04.3´´, 89°57´33.3´´ Km 169 al Atlántico 15°07´12.3´´, 89°23´17.4´´ Km 88 al Atlántico 14°55´35.8´´, 89°59´07´´ Km 88 al Atlántico 14°55´35.8´´, 89°59´07´´ Km 74 al Atlántico 14°52´00.5´´, 90°04´00.5´´ Km 91 al Atlántico 14°55´08.6´´, 89°57´43.9´´ Km 85 al Atlántico 14°55´14.7´´, 90°00´02.6´´
71
56
83 56 42
58 55
Se colectaron un total de doce especies, de ocho de ellas se colectaron frutos y se tienen plántulas in vitro en el laboratorio. De las otras cuatro se colectaron brotes los cuales se mantienen en el invernadero. Cinco especies colectadas son endémicas de Guatemala. 6.2. Formación de Callo 6.2.1. Porcentaje de inducción de callo El análisis de varianza para la variable de respuesta porcentaje de inducción de callo detectó diferencias significativas para las fuentes de variación genotipo y medio de
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cultivo (cuadro 3). Se observa que en cuanto al genotipo las especies Myrtillocactus eichlamii y Nyctocereus guatemalensis produjeron un mayor porcentaje de callo respecto de las otras tres especies (cuadro 4). El medio de cultivo T1 modificado produjo una mayor formación de callo (70%) respecto al medio T1 (52%), como se puede apreciar en el cuadro 5. Cuadro 3. Análisis de varianza para el porcentaje de inducción de callo porciones de tallo en cinco especies de cactaceas. Grados de Suma de Valor Fuente de variación libertad cuadrados de Fc Genotipo 4 15876.3513 11.09 Medio de Cultivo 1 2372.8395 6.63 Interacción Genotipo por 4 1809.6846 1.26 Medio de Cultivo Error 15 5366.6666 Total 24 25984.0000
a partir de Pr > Fc 0.0002 ** 0.0211 * 0.3270 NS
Coeficiente de variación = 31.11%
Cuadro 4. Efecto del genotipo sobre el porcentaje de inducción de callo. Agrupamiento Duncan al 5% Media Genotipo A 98.33 Myrtillocactus eichlamii A 82.50 Nyctocereus guatemalensis B 46.67 Cephalocereus maxonii B 36.67 Melocactus ruestii B 33.33 Stenocereus eichlamii
Cuadro 5. Efecto del medio de cultivo sobre el porcentaje de inducción de callo. Agrupamiento Duncan al 5% Media Medio de Cultivo A 70.00 T1 modificado B 52.31 T1
6.2.2. Peso fresco de callo El análisis de varianza para la variable de respuesta peso fresco de callo (cuadro 6) detectó diferencias altamente significativas para la fuente de variación genotipo y también para la interacción genotipo por medio de cultivo. El análisis de la interacción genotipo por medio de cultivo nos indica que todas las especies, con excepción de Myrtillocactus eichlamii, produjeron igual peso fresco de callo en los dos medios de cultivo (T1 y T1 modificado). La especie Myrtillocactus eichlamii produjo un mayor peso fresco de callo en el medio de cultivo T1 que en el medio de cultivo T1 modificado (figura 1).
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Cuadro 6. Análisis de varianza para la variable de respuesta peso fresco de callo, en gramos por explante, en cinco especies de cactaceas. Grados de Suma de Valor de Fuente de variación Pr > Fc libertad cuadrados Fc Genotipo 4 8.7094 39.29 0.0001 ** 0.1335 Medio de Cultivo 1 0.1262 2.28 NS Interacción Genotipo por Medio de 4 0.8788 3.96 0.0045 ** Cultivo Error 134 7.4258 Total 143 18.5807 Coeficiente de variación = 48.52%.
1 0.9 0.8 P 0.7 e 0.6 s 0.5 o 0.4 0.3 (g)0.2 0.1 0
T1 T1 modif
Melo
Myrt
Nycto
Cephal
Steno
Genotipo Figura 1. Interacción genotipo por medio de cultivo para la variable de respuesta peso fresco de callo, en gramos por explante.
6.3. Regeneración de Plantas De las dos especies de las cuales se sembraron callos, en cinco medios de cultivo para inducir la regeneración de plántulas, únicamente la especie Myrtillocactus eichlamii produjo una respuesta positiva. El callo proveniente del medio de cultivo T1 fue el único que regeneró plántulas, razón por la que no se realizó un análisis de varianza, únicamente se reportan porcentajes de regeneración de plantas y número de plantas por callo. Se observó que el medio MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 0.5 ó 1 mg/L de ácido naftalenacético (ANA), fueron los medios que propiciaron los mayores porcentajes de regeneración de plantas (20%). El medio MS, suplementado con 1 mg/L de ANA, fue el que indujo el desarrollo de un mayor número de plantas por callo (1.75), como se puede apreciar en el cuadro 7.
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Cuadro 7. Regeneración de plantas, en medio MS, a partir de porciones de callo provenientes del medio de cultivo T1, para la especie Myrtillocactus eichlamii. 2,4-D ANA ANA ANA ANA Variable (3.0 mg/L) (0.5 mg/L) (0.7 mg/L) (1.0 mg/L) (1.5 mg/L) PRP 10 20 15 20 10 NPC 1.0 1.0 1.0 1.75 1.5 PRP = Porcentaje de regeneración de plantas NPC = Número de plantas por callo
7. CONCLUSIONES •
Se colectaron un total de 12 especies de cactaceas; cinco de ellas endémicas de Guatemala.
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El medio de cultivo T1 modificado mostró mayor respuesta en cuanto a porcentaje de explantes que produjeron callo en las cinco especies.
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Todas las especies, con excepción de Myrtillocactus eichlamii, produjeron igual peso fresco de callo en los dos medios de cultivo (T1 y T1 modificado). La especie Myrtillocactus eichlamii produjo un mayor peso fresco de callo en el medio de cultivo T1 que en el medio de cultivo T1 modificado.
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El medio MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 0.5 ó 1 mg/L de ácido naftalenacético (ANA), fueron los medios que propiciaron los mayores porcentajes de regeneración de plantas (20%).
•
El medio MS, suplementado con 1 mg/L de ANA, fue el que indujo el desarrollo de un mayor número de plantas por callo (1.75).
•
La regeneración de plántulas se obtuvo únicamente cuando los callos se produjeron en el medio de cultivo T1.
8. RECOMENDACIONES •
Se recomienda utilizar el medio de cultivo T1 modificado para la inducción de callo en las especies Cephalocereus maxonii Rose, Melocactus ruestii Schumann, Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose, Nyctocereus guatemalensis Britt y Rose y Stenocereus eichlamii (Quehl) D.R. Hunt.
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Para regenerar plántulas, a partir de porciones de callo, en la especie Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose, se recomienda el medio MS conteniendo 1 mg/L de ANA.
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9. BIBLIOGRAFIA 1. Abdelnour-Esquivel, A.; Escalant, J.V.. 1994. Conceptos básicos del cultivo de tejidos vegetales. CATIE, Turrialba, Costa Rica. 36 pp. 2. Amador, D. 1999. Manual de Prácticas de Laboratorio: Curso de Técnicas de Cultivo de Tejidos Vegetales. Maestría en Biotecnología de Plantas. Facultad de Agronomía. 3. Azurdia, C. 1997. Colección Nuclear, una alternativa para el manejo de colecciones de germoplasma: caso del zapote en Guatemala. En: Ciencia y Tecnología, Enero/Junio, No. 1, USAC. 4. Castillo, L.M. 1992. Proyecto de Biotecnología. ICTA Guatemala. Trifoliar. 5. Consejo Nacional de Areas Protegidas –CONAP-. 2002. Lista Roja de Especies de Flora. Diario de Centroamérica Número 27, 9 de enero. Pg. 5-12. 6. Davis, S. 1986. Plants in Danger. What do we know? International Union of Conservation of Nature and Natural Resources, Switzerland. 7. George, E.F.; Puttock, D.J.M.; George, H.J. 1987. Plant Culture Media. Vol. 1. Formulations and Uses. Exegetics Limited. Inglaterra. 8. International Plant Genetic Resources Institute –IPGRI-. 1997. conservation technologies and strategies. Annual Report. pp 53.
Ex situ
9. Jones, S. B. 1987. Sistemática Vegetal. 2da. Ed. McGraw-Hill, Inc. México. 511 pp. 10. Montoya, L.M. 1991. Cultivo de Tejidos Vegetales. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agronomía. 77 pp. 11. Ordoñez, A. 2002. Evaluación de diferentes niveles y combinaciones de los reguladores de crecimiento bencilaminopurina (BAP) y ácido naftalenacético (ANA) en la propagación in vitro de Mammillaria woburnensis Scheer, Lond. Tesis licenciatura, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala. Guatemala. 12. Orozco, C. 1996. Cultivo de tejidos; su aplicación en agricultura. En: Memoria I Simposio nacional sobre cultivo de tejidos vegetales. ICTA. 129 p. 13. Oxford University Press. 1993. Flowering Plants of the World. USA. 325 pp.
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14. CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical). 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. Roca, W.M. y Mroginski, L.A. (eds.). Cali, Colombia, p xii, 970. 15. SIGMA. 2001. Biochemicals and Reagents for Life Sciencie Research. USA. 2848 pg. 16. Sondahl, M.R.; Nakamura, T. ; Medina-Filho, H.P.; Carvalho, A.; Fazuoli, L.C.; Costa, W.M. 1987. Coffe. En: Handbook of Plant Cell Culture; V.3. Cap. 21. Macmillan Publishing Company. p. 564-590. 17. Soto, G.J. 1992. Objetivos y Planes Generales del Proyecto de Biotecnología. ICTA. 10 p. 18. Standley, P.; Steyermark, J. 1958. Flora of Guatemala. Fieldiana Botany. 13 volúmenes. 19. Suchini, A.E. ; Coronado, L.E.; Rosales, A.C.; Cazali, G.M.; Lou, S.; De Poll, E.; Véliz, M.E.; Marroquín, A.E.; Castillo, N.A.; Ordóñez, N. 2000. Evaluación y Conocimiento del Patrimonio Florístico del país. DIGI (Dirección General de Investigación), Universidad de San Carlos de Guatemala. Guatemala. 92 p. 20. Suchini, A.E. 2002. Respuesta de una especie endémica de Guatemala (Hoffmania sessilifolia L.) a la micropropagacion. Tesis de graduación Maestría Biotecnología de Plantas. Fac. de Agronomía, USAC. 21. Usui, K.; Okabe, K.; Víctores, R.; Ramírez, A.E. 1996. Principios Básicos del Cultivo de Tejidos Vegetales. ICTA-JICA-Voluntarios japoneses en Cooperación Técnica con el Extranjero. 166 p.
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