M63 by Consejo nacional De Áreas Protegidas

La Misión del CONAP se define como: Somos la institución rectora del sistema guatemalteco de áreas protegidas, y de la protección, regulación y fomento del uso sostenible de la biodiversidad en el ámbito nacional, con el propósito de asegurar la permanencia y equilibrio de los bienes y servicios del patrimonio natural para el beneficio de las presentes y futuras generaciones. Los fines principales del CONAP son: a. Propiciar y fomentar la conservación y el mejoramiento del patrimonio natural de Guatemala. b. Organizar, dirigir y desarrollar el Sistema Guatemalteco de Areas Protegidas, SIGAP. c. Planificar, conducir y difundir la Estrategia Nacional de Conservación de la Diversidad Biológica y los Recursos naturales Renovables de Guatemala. d. Coordinar la administración de los recursos de flora y fauna silvestre y de la diversidad biológica de la Nación, por medio de sus respectivos órganos ejecutores. e. Planificar y coordinar la aplicación de las disposiciones en materia de conservación de la diversidad biológica contenidos en los instrumentos internacionales ratificados por Guatemala f. Constituir un fondo nacional para la conservación de la naturaleza, nutrido con recursos financieros provenientes de cooperación interna y externa. (Artículo 62, de la Ley de Areas Protegidas)

www.conap.gob.gt

GEF Esta publicación fue posible gracias al apoyo financiero del Global Enviormental Facility (GEF) y United Nations Enviormental Program (UNEP).

Orozco, Carlos. 2004. Situación actual de la Biotecnología en Guatemala. Consejo Nacional de Áreas Protegidas. Guatemala. 86 p.

El presente documento es producto del proyecto GUA/02/G21 “Desarrollo del Marco Nacional de Seguridad de la Biotecnología para Guatemala”, ejecutado por el Consejo Nacional de Áreas Protegidas –CONAP-, a través de la Oficina Técnica de Biodiversidad –OTECBIO-, Financiado por ell Fondo Mundial para el Medio Ambiente (GEF por sus siglas en inglés) y el Programa de Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA). Las conclusiones e información expresadas en este documento son exclusiva responsabilidad del Proyecto y puede no coincidir con los del Programa de Naciones Unidas para el Medio Ambiente. Publicación patrocinada gracias al apoyo de: GEF-PNUMA

CONSEJO NACIONAL DE ÁREAS PROTEGIDAS Documento Técnico No. 17 (06-2004) Director Oficina Técnica de Biodiversidad:

Ing. Giovanni Fernando García Barrios

Coordinadora Nacional del Proyecto:

M. Sc. Ileana Catalina López Gálvez

Asistente de Proyecto:

Jacqueline Valeska Landaverde Leal

Asosores Comité Nacional Coordinador de Bioseguridad: Nidia Álvarez

MARN

Carlos Alfaro

CMVZ

Víctor Jiménez

MSPAS

Ileana Catalina López Gálvez

PNUMA-CONAP

Autor: Dr. Carlos Orozco Castillo Revisión de Texto:

M. Sc. Ileana Catalina López Gálvez Ing. Giovanni Fernando García Barrios Licda: Cecilia Isabel Cleaves Herrera

Diseño de Portada y Contraportada: Sara Chin Primera edición: 500 ejemplares Guatemala, Junio 2004 Consejo Nacional de Áreas Protegidas –CONAP5ª. Avenida 6-06, Zona 1, Edificio IPM, 5º, 6º, 7º. Nivel Teléfonos: (502) 253-2158, 230-4234, 238-0000, 238-1188 Fax: (502) 253- 4141 Pagina web: www.conap.gob.gt Oficina Técnica de Biodiversidad otecbio@conap.gob.gt Todos los derechos reservados: ©CONAP GEF-PNUMA GUATEMALA

Guatemala, C.A.

SITUACIÓN ACTUAL DE LA BIOTECNOLOGÍA EN GUATEMALA

Carlos Orozco Castillo, Ph.D.

índice LISTA DE ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS ...................................................................................................6 ¿DE DÓNDE SURGE ESTA PUBLICACIÓN ......................................................................................................8 RESUMEN EJECUTIVO .......................................................................................................................................9 ÍNDICE DE CUADROS .......................................................................................................................................15 ÍNDICE DE FIGURAS .........................................................................................................................................15 1. ANTECEDENTES ............................................................................................................................................21 2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................................21 3. OBJETIVOS 21 4. MARCO TEÓRICO ..........................................................................................................................................22 4.1. DEFINICIÓN DE BIOTECNOLOGÍA...............................................................................................22 4.2. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES..............................................................................................22 4.2.1. TÉCNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.........................................................22 4.3. EQUIPO Y PROCEDIMIENTOS........................................................................................................29 4.3.1. PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS .....................................................................................................................29 4.4. EMPLEO DE TÉCNICAS IN VITRO PARA LA MEJORA DE CULTIVOS: REQUISITOS EN EL LABORATORIO Y MÉTODOS GENERALES ......................................................................................................................................30 4.5. CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN ..............................................................................................33 4.5.1. FUENTES DE CONTAMINACIÓN.........................................................................................33 4.5.2. ESTERILIZACIÓN ...................................................................................................................34 4.5.3. PREPARACIÓN DEL EXPLANTE ..........................................................................................34 4.5.4. PROCEDIMIENTO PARA LA ESTERILIZACIÓN ................................................................34 4.5.5. ASEPSIA....................................................................................................................................36 4.5.6. ANTIBIÓTICOS........................................................................................................................37 4.6. CONSERVACIÓN DE GERMOPLASMA ............................................................................................39 4.6.1. TÉCNICAS PARA LA CONSERVACIÓN IN VITRO DE GERMOPLASMA......................................................................................................................39 4.7. MARCADORES BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES .......................................................................44 4.7.1. MARCADORES BIOQUÍMICOS ............................................................................................44 4.7.2. MARCADORES MOLECULARES .........................................................................................44 4.8. LA INGENIERIA GENÉTICA...............................................................................................................47 5. METODOLOGÍA .............................................................................................................................................49 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN........................................................................................................................50 6.1. LABORATORIOS, INSTITUCIONES Y/O CENTROS DE ESTUDIOS SUPERIORES VINCULADOS/RELACIONADOS AL USO DE LA BIOTECNOLOGÍA Y/O LA SEGURIDAD DE LA BIOTECNOLOGÍA .............................................................................................................................50

6.2. TIPOS DE INSTITUCIONES ................................................................................................................51 6.3. LABORATORIOS POR TIPO DE INSTITUCIÓN ............................................................................51 6.4. CAPITAL HUMANO PROFESIONAL ..............................................................................................52 6.5. CAPITAL HUMANO TÉCNICO Y DE APOYO ...............................................................................52 6.6. INFRAESTRUCTURA .......................................................................................................................53 6.7. RAMA DE LA BIOTECNOLOGÍA QUE TRABAJAN LOS LABORATORIOS ...............................................................................................................................54 6.8. ÁREA DE LA BIOTECNOLOGÍA QUE TRABAJAN LOS LABORATORIOS ...............................................................................................................................55 6.9. TÉCNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS QUE EMPLEAN LOS LABORATORIOS ...............................................................................................................................55 6.10. TÉCNICAS DE MARCADORES MOLECULARES QUE EMPLEAN LOS LABORATORIOS.......................................................................................................................56 6.11. TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA QUE EMPLEAN LOS LABORATORIOS ...............................................................................................................................57 6.12. OBJETIVOS DE LOS LABORATORIOS ...........................................................................................57

6.13. CIENCIAS CON LAS QUE SE RELACIONAN LOS LABORATORIOS ...............................................................................................................................58 6.14. COLECCIONES DE ESPECIES O VARIEDADES DE ANIMALES Y/O VEGETALES, TANTO VIVOS COMO PRESERVADOS .........................................................58 6.15. CONEXIONES A REDES GLOBALES ..............................................................................................59 6.16. LABORATORIOS QUE TRABAJAN CON ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS..................................................................................................................................60 6.17. OBJETIVOS DE TRABAJAR CON ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS..................................................................................................................................60 6.18. INTRODUCCIÓN DE ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS AL PAÍS

6.19. POSIBILIDAD DE INTRODUCIR ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS AL PAÍS...................................................................................................................61 6.20. PROGRAMAS Y/O EXPERIENCIA SOBRE EVALUACIÓN DEL IMPACTO SOCIAL QUE PUEDAN UTILIZARSE ANTE LA POSIBILIDAD DE INTRODUCCIÓN DE OVM’s EN PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN O PRODUCCIÓN .................................................................62

6.21. MEDIDAS DE SEGURIDAD DE LA BIOTECNOLOGÍA PARA LA REALIZACIÓN DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN Y/O PRODUCCIÓN....................................................................................................................................62 6.22. POBLACIÓN O GRUPO SOCIAL META BENEFICIARIO DE PROYECTOS DE BIOTECNOLOGÍA ..............................................................................................63 6.23. PLAZO DE LOS PROYECTOS PARA QUE LOS RESULTADOS LLEGUEN A LOS GRUPOS META ..................................................................................................63 6.24. RELACIÓN DE LOS PROYECTOS CON COMUNIDADES O PUEBLOS INDÍGENAS .....................................................................................................................64 6.25. EVALUACIÓN DE IMPACTO AMBIENTAL DE LOS PROYECTOS .............................................64 6.26. EVALUACIÓN DE IMPACTO SOCIAL DE LOS PROYECTOS......................................................65 6.27. RELACIÓN DE LOS TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN O PRODUCCIÓN DE LOS LABORATORIOS CON LAS CIENCIAS HUMANÍSTICAS ...............................................................................................................................65 6.28. PROGRAMAS, PROYECTOS Y FUENTE DE FINANCIAMIENTO...............................................66 6.29. SONDEO A EMPRESAS PRIVADAS AGRÍCOLAS QUE NO TIENEN LABORATORIO, PERO QUE TRABAJARON O PIENSAN TRABAJAR CON OVM’s A NIVEL DE ENSAYOS DE CAMPO ...................................................71 6.30. CONOCIMIENTO DEL PÚBLICO SOBRE LO QUE ES UN ORGANISMO VIVO MODIFICADO ................................................................................................73 6.31. CONOCIMIENTO SOBRE LO QUE ES UN ORGANISMO TRANSGÉNICO .................................................................................................................................74 6.32. CONOCIMIENTO DEL PÚBLICO SOBRE EL CONSUMO DE ALIMENTOS PROVENIENTES DE OVM’s ....................................................................................74 6.33. CONOCIMIENTO SOBRE LA UTILIZACIÓN DE LOS ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS .........................................................................................75 7. CONCLUSIONES ............................................................................................................................................76 8. RECOMENDACIONES ...................................................................................................................................79 9. BIBLIOGRAFÍA...............................................................................................................................................81 10. APÉNDICE

lista de acrónimos y abreviaturas empleadas

ABA ADN AFLP AGROCYT AID ANACAFÉ ARN BAP BCH oC CENGICAÑA CES CIAT CNCB CONAP 2,4-D EDTA ELISA FAUSAC Fe FMVZ FODECYT GEF g/l Ha HGSJDD ICTA INCAP INIA IPGRI LENAP LNS µM MAGA m2 m3 mg/l ml mM

Acido abscísico Acido desoxirribonucléico Amplified Fragment Length Polymorphism Fondo para la Investigación Agropecuaria en Ciencia y Tecnología Agencia Internacional para el Desarrollo Asociación Nacional del Café Acido ribonucléico Bencilaminopurina Mecanismo de Intercambio de Información de Bioseguridad Grados centígrados Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña deAzúcar Centro de Estudios en Salud de la UVG Centro Internacional de Agricultura Tropical Comité Nacional de Coordinación de Bioseguridad Consejo Nacional de Áreas Protegidas Ácido 2,4 diclorofenoxiacético Ácido etilendiaminotetraacético Enzime Linked Immunosorbent Assay Facultad de Agronomía de la USAC Hierro Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la USAC Fondo de Desarrollo para la Ciencia y Tecnología General Environmental Foundation Gramos por litro Hectáreas Hospital General San Juan de Dios Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas Instituto de Nutrición de Centroamérica y Panamá Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas de Chile International Plant Genetic Resources Institute Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología (Escuela de Biología de la USAC) Laboratorio Nacional de Salud del MSPAS Micromol Ministerio de Agricultura Ganadería y Alimentación. Metros cuadrados Metros cúbicos Miligramos por litro Mililitros Milimolar

m-2s-2 MS MSc MSPAS NaOCl No. ONG OMS OTECBIO OVM PCR pH Ph.D. PROMECAFE p/v RAPD RFLP RT-PCR SCAR SIDA SSR TDR UNEP UNR URL USAC UVG VIH v/v %

Metro cuadrado por segundo Murashige y Skoog Magister Scientieae Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social Hipoclorito de sodio Número Organización No Gubernamental Organización Mundial de la Salud Oficina Técnica de Biodiversidad del CONAP Organismo Vivo Modificado Polymerase Chain Reaction Potencial de hidrógeno Philosophy Doctor Proyecto de Mejoramiento de Café Peso sobre volumen Random Amplified Polymorphic DNA Restriction Fragment Length Polymorphism Reverse Transcryptase Polymerase Chain Reaction Sequence Characterized Amplified Region Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida Simple Sequence Repeat Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases Programa de las Naciones Unidad para el Medio Ambiente Unidad de Normas y Regulaciones del MAGA. Universidad Rafael Landívar Universidad de San Carlos de Guatemala Universidad del Valle de Guatemala Virus de Inmunodeficiencia Adquirida Volumen sobre volumen Porciento

¿De dónde surge esta publicación? El presente documento es producto del proyecto GUA/02/G21 “Desarrollo del Marco Nacional de Seguridad de la Biotecnología para Guatemala”, ejecutado por el Consejo Nacional de Áreas Protegidas –CONAP- a través de la Oficina Técnica de Biodiversidad –OTECBIO-, financiado por el Fondo Mundial para el Medio Ambiente (GEF por sus siglas en Inglés) y el Programa de Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA-UNEP). El período de ejecución del proyecto fue de noviembre del 2002 a julio del 2004. El “Desarrollo del Marco Nacional de Seguridad de la Biotecnología (MNSB) para Guatemala” es un proyecto impulsado por el GEF como una “Estrategia inicial para ayudar a los países a prepararse para la entrada en vigor del Protocolo de Cartagena sobre la seguridad de la biotecnología”, así como proveer un Marco regulatorio técnico administrativo, legal y de consulta pública que vele por la diversidad biológica y la salud de los guatemaltecos. La Agenda 21 acordada por la Conferencia de las Naciones Unidas para el Ambiente y Desarrollo (UNCED, por sus siglas en inglés) en 1992 en Río de Janeiro, establece previsiones para el manejo ambiental de la biotecnología. En la introducción al capitulo 16, se reconoce que “aunque la biotecnología no puede proveer soluciones a todos los problemas fundamentales de ambiente y desarrollo, si podría, sin embargo, contribuir sustancialmente a un desarrollo sustentable”.

El capítulo 12 de la referida Agenda también enfatiza que la comunidad mundial puede obtener muchos beneficios de la biotecnología si ésta la desarrolla y utiliza adecuadamente. El uso y liberación al ambiente de Organismos Genéticamente Modificados (OGM) resultantes de la biotecnología moderna podría tener impactos negativos para la conservación y uso sustentable de la diversidad biológica. Por lo tanto ésta agenda, busca garantizar la seguridad en el desarrollo, aplicación, intercambio y transferencia de la biotecnología, a través de acuerdos internacionales basados en la evaluación y manejo del riesgo. El uso seguro de la biotecnología moderna también es una preocupación en la Convención sobre Diversidad Biológica (CDB). Esta convención reconoce que, si es desarrollada y utilizada con adecuadas medidas de seguridad para el ambiente y la salud humana, la biotecnología puede contribuir al logro de los objetivos de la Convención. En sus artículos 8(g) y 19(3) exhorta a las partes a establecer medidas de control en la liberación de los OVM y la necesidad de establecer un protocolo apropiado para garantizar la conservación y uso sustentable de la diversidad biológica. El Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnología del Convenio sobre Diversidad Biológica, adoptado en enero del 2000 fue aprobado por el Honorable Congreso de la República de Guatemala el 17 de septiembre de 2003 y ratificado por el poder ejecutivo el 13 de octubre del mismo año. Actualmente el Protocolo de Cartagena está en Cancillería del Ministerio de Relaciones Exteriores pendiente de depositarse en el seno de la Secretaría de las Naciones Unidas.

El protocolo ha sido elogiado como un importante instrumento que proporciona un marco normativo internacional para reconciliar las necesidades respectivas de protección del comercio y del medio ambiente en la industria mundial en rápido crecimiento de la biotecnología moderna. De acuerdo con el principio precautorio contenido en el Principio 15 de la Declaración de Río sobre el Medio Ambiente y Desarrollo, el objetivo del Protocolo es: “Contribuir a garantizar un nivel adecuado de protección en la esfera de la transferencia, manipulación y utilización seguras de los organismos vivos modificados resultantes de la biotecnología moderna que puedan tener efectos adversos para la conservación y la utilización sostenible de la diversidad biológica, teniendo también en cuenta los riesgos para la salud humana, y centrándose concretamente en los movimientos transfronterizos”. El proyecto vino a consolidar las capacidades nacionales para la instrumentación del Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad. Uno de los principales logros del proyecto fue la creación del Comité Nacional de Coordinación de Bioseguridad –CNCB- mediante resolución No. ALC/14/2003 de Secretaría Ejecutiva del Consejo Nacional de Áreas Protegidas –CONAP-. El –CNCB- está conformado entre otros por el Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación –MAGA, el Ministerio de Economía -MINECO-, el Ministerio de Ambiente y Recursos Naturales -MARN-, el Ministerio de Relaciones Exteriores –MINEX-, el Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social –MSPAS-, el Ministerio de Educación –MINEDUC-, el Consejo Nacional de Áreas Protegidas –CONAP-, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONCYT-, Academia, Mesa Nacional Alimentaria y varios representantes de la Sociedad Civil. Durante la primera fase de ejecución del proyecto se realizaron cinco consultorías con el propósito de realizar un diagnóstico de la situación actual de la biotecnología en Guatemala, priorizar la diversidad biológica del país en riesgo potencial por la introducción de organismos vivos modificados, elaborar un inventario y análisis de normativa en el tema, establecer un análisis de competencias institucionales y una base de datos para organizar la información. Asimismo, se realizaron veintidós talleres a nivel metropolitano y regional con los diferentes actores de la sociedad civil y gobierno donde se socializaron los resultados de las cinco consultorías de la fase de diagnóstico con el propósito de sensibilizar e informar a los guatemaltecos en el tema. Posteriormente se procedió a consultar a los mismos grupos sobre los elementos para la elaboración de una propuesta de iniciativa de ley que regule los organismos vivos modificados. El resultado de este proceso de consulta es el anteproyecto de iniciativa Ley de Seguridad de la Biotecnología Moderna para Guatemala.

resumen ejecutivo La presente publicación se basa en un estudio referente a la situación actual de la Biotecnología en Guatemala. El mismo se derivó de la necesidad de cumplir con los acuerdos sobre el Protocolo de Cartagena, acerca de la seguridad de la biotecnología, cuyo propósito establece “Contribuir a garantizar un nivel adecuado de protección en la esfera de la transferencia, manipulación y utilización seguras de los OVM´s". El estudio contó con el apoyo de UNEP, GEP y CONAP. Dado que en Guatemala, además de la Biotecnología Moderna, se están usando otras técnicas biotecnológicas, en diferentes instituciones, con distintos propósitos, en las áreas de: salud humana, producción vegetal y animal, se consideró importante incluir también la situación actual en el país en el uso de todas estas herramientas y procedimientos biotecnológicos. Los objetivos del estudio en mención fueron: elaborar un diagnóstico actual de la biotecnología en Guatemala y realizar un inventario de recurso humano y físico con que cuenta el país en el campo de la biotecnología. Para ello, se reunieron datos e información sobre la situación actual de la Biotecnología en Guatemala, a través de una boleta de encuesta, la cual fue revisada y aprobada por la coordinación general de OTECBIO. Así también se hicieron entrevistas personales en empresas que no tienen laboratorio, pero que realizaron ensayos de campo con OVM´s. Paralelamente se hizo un sondeo en una muestra de la población para conocer su grado de conocimiento de la Biotecnología. Seguidamente se tabularon los resultados y se hizo el análisis y discusión de los mismos, de los cuales se derivaron las conclusiones y recomendaciones correspondientes. Los resultados, se presentan en forma resumida en la matriz de tabulación que incluye cuatro tablas, que se presentan en la parte final del resumen ejecutivo. De los resultados obtenidos, se infiere el análisis siguiente: de acuerdo al trabajo realizado, se encontraron 27 laboratorios vinculados o relacionados al uso de la Biotecnología y/o la seguridad de la Biotecnología, pertenecientes a 17 instituciones, de las cuales 4 son

gubernamentales (8 laboratorios), 8 privadas (10 laboratorios) y 5 académicas (9 laboratorios). Las capacidades existentes en materia de Biotecnología son: 199 ambientes (áreas de trabajo dentro de los laboratorios), con un área total de 12,597 m2, 28 cuartos de crecimiento con un área de 908 m2, 12 invernaderos, con un total de 2,718 m2, 39 autoclaves, 52 cámaras de flujo laminar y 14 termocicladores. En cuanto al número de expertos los resultados indican 70 profesionales con nivel de licenciatura, 18 con grado de maestría y 15 con grado de doctorado. Además, laboran en éste campo 87 técnicos y 66 personas de apoyo. El estudio indica que, hasta el momento, hay 106 proyectos y/o programas, tanto en ejecución como finalizados. De los 27 laboratorios, 18 trabajan en el área de Cultivo de Tejidos, 13 con Marcadores Moleculares y 2 con Ingeniería Genética. Algunos laboratorios trabajan varias áreas simultáneamente por lo que el número total es de 33 laboratorios. Existe una gran gama de ciencias relacionadas con los laboratorios de Biotecnología, tanto de la rama vegetal, animal, como humana, fundamentalmente la primera y la segunda con propósitos de mejoramiento genético y producción, y la tercera con fines de prevención de enfermedades y mejoramiento de la salud. Los laboratorios están en buena medida relacionados con algunas de las ciencias humanísticas, por ejemplo: Sociología (11 laboratorios), Economía (9 laboratorios), Pedagogía (8 laboratorios), Antropología (5 laboratorios) y Psicología (5 laboratorios). Esto demuestra que en los laboratorios están concientes de la importancia de la Biotecnología en el área humanística y social. En cuanto a inventarios/colecciones de especies/variedades/animales y vegetales, tanto vivos como preservados, 14 laboratorios indicaron que sí tienen colecciones y de éstos, 13 poseen bases de datos y 14 tienen conexiones a redes globales. La mayoría de proyectos trabajan con fondos propios o provenientes de donantes nacionales e internacionales y ONG´s. La mayoría de laboratorios trabajan en el ámbito de la diversidad biológica, tanto en la rama

animal, humana, como la vegetal; en donde se observa especialmente el uso de las áreas de Cultivo de Tejidos y Marcadores Moleculares para estudios de diversidad biológica; por ejemplo: genética de poblaciones, variabilidad genética, caracterizaciones, identificación de genotipos, etc. De los 27 laboratorios, 22 indican que tienen un grupo social meta beneficiario. Los laboratorios que respondieron positivamente mencionan a los siguientes grupos: caficultores, pequeños y medianos productores, estudiantes, granjeros y finqueros, productores y exportadores de berries, población centroamericana, población guatemalteca susceptible de contraer la enfermedad de Chagas, productores de caña de azúcar y consumidores. De acuerdo con los programas de Biotecnología encontrados, la participación del público de manera directa es nula. El público participa, pero de forma indirecta; por ejemplo, en el caso de la salud humana, hay grupos o poblaciones que son utilizadas como elementos para la prueba de tratamientos médicos, o en otros casos, como en el área de Cultivo de Tejidos, los agricultores llevan muestras de plantas para ser cultivadas y probadas en sus campos de producción.

De los 27 laboratorios, únicamente siete indican que sus proyectos tienen relación con comunidades o pueblos indígenas. Esto refleja que, en general, la Biotecnología no está dirigida, en especial, a los pueblos indígenas. Únicamente un laboratorio señala que hace estudio de impacto ambiental, específicamente en el campo de la Protección Vegetal en la UVG, y lo hace mediante la evaluación de daños producidos por enfermedades vegetales en cultivos y dispersión de sus vectores, a nivel de campo. En el caso de impacto social solamente dos laboratorios lo hacen, siendo éstos los del INCAP, con evaluación de tipo cualitativo, cuantitativo y sistematización. De 27 laboratorios encuestados, únicamente uno hace evaluación y/o gestión de riesgo a nivel de OVM´s, pero en el laboratorio. A nivel de campo sólo dos empresas indicaron haber realizado una evaluación de riesgo, de acuerdo con los requerimientos que les solicitó la UNR del MAGA. La situación actual del país indica que el uso de OVM´s es el siguiente: investigación (3 laboratorios), uso confinado (2 laboratorios) y evaluación de riesgo (1

laboratorio). A nivel de campo existen dos empresas que no tienen laboratorio, pero que realizaron ensayos de campo y cuya cosecha y rastrojos fueron incinerados. Siempre en términos de realidad de la situación de OVM´s, a nivel de laboratorios únicamente un laboratorio importó una bacteria recombinante, para uso confinado. Dos laboratorios han hecho sus propias transformaciones, clonaciones y transferencia de genes. A nivel de campo dos empresas introdujeron en el pasado intencionalmente 4 OVM´s, con fines de investigación, cumpliendo con los requisitos del Área Fitozoogenética de la UNR del MAGA. Al final del ciclo todos los materiales fueron incinerados, por lo que no se puso en riesgo, en ningún momento el patrimonio genético del país. El ámbito actual de los OVM´s refleja que sólo tres laboratorios están trabajando con ellos, perteneciendo dos a la UVG, y el otro al LENAP, y lo hacen básicamente con fines de investigación. En la UVG, un laboratorio hace transformación, clonación, y transferencia de genes resistentes al virus de papaya (Carica papaya); el cual es el laboratorio de Protección Vegetal. Otro Laboratorio de la UVG, que es un laboratorio del CES, hace aislamientos de genes de Plasmodium y tripanosomas; transformándolos, utilizando Escherichia coli, para ser clonados y transferidos a los vectores de las enfermedades malaria y dengue. En cuanto al LENAP, está produciendo Taq ADN polimerasa, usando una bacteria recombinante de E. coli introducida al país. Esto ratifica, que la Ingeniería Genética está incipiente en Guatemala, a nivel de laboratorio; pero sus fines son también claramente de carácter benéfico, desde el punto de vista social. Todos los laboratorios señalan que no tienen intención de importar o exportar OVM´s; sin embargo, dos laboratorios están, y piensan seguir produciendo OVM´s. De acuerdo al diagnóstico realizado, las prioridades nacionales, con relación a OVM´s son salud y protección vegetal. Los laboratorios de Microbiología y Virología del INCAP, son los únicos laboratorios, a nivel nacional, que cuentan con un programa o experiencia sobre evaluación de impacto social que se puede utilizar ante la posibilidad de introducción de un OVM. En cuanto a OVM´s, actualmente no existe ningún programa o experiencia sobre evaluación de impacto ambiental. Únicamente 22 laboratorios poseen medidas de seguridad de la Biotecnología para la realización de

G G A A A A P A P P P P P P A P A A A A G G G G 27

TOTALES

TIPO INST.

ICTA QUETZALTENANGO ICTA BÁRCENA (2) FMVZ URL FAUSAC MARC. MOLEC. FAUSAC CULT. TEJ. CENGICAÑA UVG- PROTEC. VEG INGENIO MAGDALENA INGENIO LA UNIÓN INGENIO PANTALEÓN INGENIO SANTA ANA ANACAFÉ JARDINES MIL FLORES USAC, ESC. BIOLOGÍA INCAP, MICROBIOLOGÍA Y VIROLOGÍA (2) UVG-ESTUDIOS DE GEN POBLACIONES UVG - LEISH MANIASIS UVG - ANÁLISIS DE AGUA UVG - CENT. DE EST. SALUD LAB. NAC. SALUD (2) HGSJDD LAB. CLÍNICO HGSJDD - MED. NUCLEAR HNA - UNIDAD QUEMADOS

LABORATORIO

3 2 2 3 2 1 1 16 4 2 2 2 10 2 5 3 2

1 1 3 1 1 1

LIC

4 2

1 1

2 1 1 1 1 2 1

2 1 1 2

3 2 3 2 13 2 37 3

2 2 5 1 2

1 1 1 4

2 2

1 2 18

1 2 6 12 6

2 3

MSc PhD Técnico Apoyo

CAPITAL HUMANO

199

5 22 2 4 1 6 8 4 8 25 25 10 4 6 4 10 2 6 3 16 8 7 11 5

# Ambiente

16 20 24 20 57.5 200 200 68 26 20 48

1 1 2 1 2 5 5 1 1 1 1

1 60 28

12597

907.5

20 100

1 4

900 800 325 72 81 63 800 200 255 2500 2500 315 52 60 100 1600 72 144 38 1200 118 252 90 2

Área Cuartos crecimiento

No. Cuartos crecimiento

Área Total

2718

138 250 300

1 1 1

40 400 480

200 210

100 600

Área invernadero

1 2 1

1 1

1 2

No. Invernadero

INFRAESTRUCTURA

Cuadro 1. de Resumen Ejecutivo. Síntesis de información de los laboratorios que formaron parte del estudio realizado.

sus proyectos de investigación y/o producción. La mayoría de estos laboratorios tienen niveles de seguridad 1 y 2. Solamente un laboratorio (LNS) tiene nivel de seguridad 3. El cuadro 1, en este resumen, muestra una síntesis de la investigación realizada.

El grado de conocimiento público sobre lo que es un OVM reflejó que la mayoría de las personas no conoce este tema.

TOTALES

2 1 2 1 5 2 1 1 5 3 3 1 3 1 1 1 3 3 4 1

1 1 1 1 2 1 2 2 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 2 2

3 5

Flujo Laminar

4 1

1 1 2 1

Termociclad

EQUIPO

1 5

Autoclaves

Cuadro 1. continuación...

V VV An V V V V An V V V V V V V An HH AN H Am H H HH H H H

Rama Biotec.

12 18

1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1

1 1

ÁREA

1 1 1 1

DOC

1 2 1 1 1 1 2 1 1 1

1 1

1 2 1 1 1

INV

1 1 1 1

PROD. COM

OBJETIVOS

2 1 1 1

1 1

1 1 1

1 1

1 1 2 1 1 1 1 1

1 1 1

COLECCIONES

TOTALES

Cuadro 1. continuación...

1 1 2 1 1 1 1

1 1

1 2 1 1 1

1 1

1 1 1

1 2

1 1

2 1 1 1

1 1 1 1 1 1

1 2 1 1 1 1 1

1 2

1 1 1

TRABAJA OVM

REDES GLOBALES

BASE DE DATOS

2 1 1 1 1 2 1 1 1

1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

HA TRABAJADO OVM

1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 2 1 1 1

PIENSA INTRO OVM

15*

1 1 2 1 1 1 1 2 1 1 1

1 1 1

1 1

5 22

1 1

1 2

1 1

2 1 1 1

1 2 1 1 1

1 1 1 1

1 1

1 2 1 1

NO SI

16*

20 7

1 2 1 1 1

1 1

1 1 1 1

1 1 1 1 1

NO SI

17*

19*

1 1 1 1 2 1 1

1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

26 1 24 3

1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 2 1 1 1

1 2 1 1 1 1 1

NO SI NO SI

18*

ANT.

1 1

PED.

DER.

1 1

PSI.

1 1 1 1

ECO.

CIENCIAS HUMANÍSTICAS

2 1

1 2

SOC

* los números en la parte superior de las tablas de la matriz corresponden a los números de las respectivas preguntas en la boleta de encuesta (ver apéndice).

26 1

TOTALES

1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 2 1 1 1

1 2 1 1 1 1 1

NO SI NO SI

14*

Cuadro 1. continuación...

índice de cuadros y figuras CUADROS Cuadro 1. Relación entre presión, temperatura y tiempo de autoclaveado, cuando el autoclave tiene presión variable. ..........................................................................................................35 Cuadro 2. Tiempo mínimo de autoclaveado según volumen de medio de cultivo...................................35 Cuadro 3. Algunos ejemplos de los procedimientos que se usan para la desinfección de explantes.........................................................................................................................38 Cuadro 4. Otros ejemplos de soluciones desinfectantes usadas en la preparación de explantes. .............................................................................................................................................38 .................................................................................................................................................................. 66

FIGURAS Figura 1. Dos tipos de ambientes de dos laboratorios visitados. A. ambiente con medidas de bioseguridad en el Laboratorio Nacional de Salud; B. ambiente de laboratorio de marcadores moleculares en el ICTA. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................50 Figura 2. Número de instituciones, por sector, dedicadas a la Biotecnología en Guatemala. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...................................................................51 Figura 3. Número de instituciones, por sector, dedicadas a la Biotecnología (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...........................................51 Figura 4. Número de laboratorios por tipo de institución. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ................................................................................................................................51 Figura 5. Número de laboratorios por tipo de institución (expresado en porcentajes). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................52 Figura 6. Capital humano profesional (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................52 Figura 7. Número de profesionales, según grado académico, trabajando actualmente en Biotecnología. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). .........................................................52 Figura 8. Personal técnico y de apoyo que laboran en el campo de la Biotecnología. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................52 Figura 9. Personal técnico y de apoyo que laboran en el campo de la Biotecnología (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...........................................53 Figura 10. Ambiente de sala de preparación de medios en el laboratorio de Biotecnología del ICTA. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003) ...............................................53

Figura 11. Ambiente de cuarto de crecimiento en el laboratorio de cultivo de tejidos del ICTA. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)...........................................................53 Figura 12. Vista general de un invernadero en la URL. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................53 Figura 13. Equipo básico en un laboratorio de Biotecnología. A. Termociclador en el laboratorio de Marcadores Moleculares del ICTA; B. Cámara de Flujo Laminar en el laboratorio de Cultivo de Tejidos del ICTA; C. Autoclave en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la URL. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ..............54 Figura 14. Número de laboratorios por rama de la Biotecnología que trabajan. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................54 Figura 15. Número de laboratorios por rama de la Biotecnología que trabajan (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...........................................54 Figura 16. Número de laboratorios por área de la Biotecnología que trabajan. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................55 Figura 17. Número de laboratorios por área de la Biotecnología que trabajan (expresado en porcentaje). (Fuente: el autor, 2003). ................................................................................55 Figura 18. Número de laboratorios por técnica de Cultivo de Tejidos empleada. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................55

Figura 19. Número de laboratorios por técnica de Cultivo de Tejidos empleada (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...........................................56 Figura 20. Número de laboratorios que utilizan las técnicas de Marcadores Moleculares. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)..................................................................56 Figura 21. Número de laboratorios por técnica de Marcadores Moleculares empleada (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)............................56 Figura 22. Número de laboratorios por técnica de Ingeniería Genética empleada (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................57 Figura 23. Número de laboratorios por técnica de Ingeniería Genética empleada (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...........................................57 Figura 24. Número de laboratorios según sus objetivos. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................58 Figura 25. Número de laboratorios según objetivos que persiguen (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................58 Figura 26. Número de laboratorios y su relación con algunas de las ciencias más importantes. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ............................................58

Figura 27. Número de laboratorios y su relación con algunas de las ciencias más importantes (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................58 Figura 28. Número de laboratorios que poseen colecciones de especies o variedades de animales y/o vegetales, tanto vivos como preservados. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................59 Figura 29. Número de laboratorios que poseen colecciones de especies o variedades de animales y/o vegetales, tanto vivos como preservados (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................59 Figura 30. Número de laboratorios que poseen bases de datos de sus colecciones (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003) .......................................................................................59 Figura 31. Número de laboratorios que poseen bases de datos de sus colecciones (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...........................................59 Figura 32. Número de laboratorios que poseen conexiones a redes globales. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................59 Figura 33. Número de laboratorios que poseen conexiones a redes globales (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003) ............................................60 Figura 34. Número de laboratorios que trabajan con Organismos Vivos Modificados (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................60 Figura 35. Número de laboratorios que trabajan con Organismos Vivos Modificados (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...........................................60 Figura 36. Número de laboratorios por objetivos de trabajar con Organismos Vivos Modificados. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).......................................................61 Figura 37. Número de laboratorios por objetivos de trabajar con Organismos Vivos Modificados (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).......................61 Figura 38. Número de laboratorios que han introducido OVM´s al país. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................61 Figura 39. Número de laboratorios que han introducido OVM´s al país (expresado en porcentajes). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ............................................................61 Figura 40. Número de laboratorios que tienen planificado introducir OVM´s al país. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................61 Figura 41. Número de laboratorios que tienen planificado introducir OVM´s al país (expresado en porcentajes). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)...........................................61 Figura 42. Número de laboratorios con programas y/o experiencia sobre evaluación del impacto social que puedan utilizarse ante la posibilidad de introducción de OVM´s en proyectos de investigación o producción. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...............62

Figura 43. Número de laboratorios con programas y/o experiencia sobre evaluació del impacto social que puedan utilizarse ante la posibilidad de introducción de OVM´s en proyectos de investigación o producción (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................62 Figura 44. Número de laboratorios que aplican alguna medida de Bioseguridad. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................62 Figura 45. Número de laboratorios que aplican alguna medida de Bioseguridad (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...........................................62 Figura 46. Número de laboratorios que tienen una población o grupo social meta de sus proyectos. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)................................................................63 Figura 47. Número de laboratorios que tienen una población o grupo social meta de sus proyectos (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ....................63 Figura 48. Ejemplos de grupos sociales meta de algunos de los laboratorios encuestados. A. Finca “Esquipulas”, Guanagazapa, Escuintla ; B. Finca “Pretoria”, Guanagazapa, Escuintla. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ..............................................63 Figura 49. Número de laboratorios y plazo de proyectos para que los resultados lleguen a los grupos meta. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).............................................63

Figura 50. Número de laboratorios y plazo de proyectos para que los resultados lleguen a los grupos meta (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................64 Figura 51. Número de laboratorios cuyos proyectos tienen o no relación con comunidades o pueblos indígenas. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)................................64 Figura 52. Número de laboratorios cuyos proyectos tienen o no relación con comunidades o pueblos indígenas (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................64 Figura 53. Comunidades indígenas que reflejan la importancia de orientar los beneficios de la biotecnología hacia estas poblaciones. A. Finca “Pretoria”, Guanagazapa, Escuintla ; B. Finca “Pretoria”, Guanagazapa, Escuintla. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................64 Figura 54. Número de laboratorios que incluyen en sus proyectos una evaluación de impacto ambiental. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).................................65 Figura 55. Número de laboratorios que incluyen en sus proyectos una evaluación de impacto ambiental (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................65 Figura 56. Número de laboratorios que hacen evaluación de impacto social en sus proyectos...............65 Figura 57. Número de laboratorios que hacen evaluación de impacto social en sus proyectos (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)............................65

Figura 58. Número de laboratorios por ciencia humanística que se relacionan sus proyectos. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)......................................................................65 Figura 59. Número de laboratorios por ciencia humanística que se relacionan sus proyectos (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)............................66 Figura 60. Ensayo de campo de maíz del evento biotecnológico Yieldgard. Resistencia a Lepidópteros. A. Empresa Cristiani Burkard, finca “Las Vegas”, Tiquisate, Escuintla ; B. Empresa Cristiani Burkard, finca “Las Vegas”, Tiquisate, Escuintla. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................72 Figura 61. Ensayo de campo de algodón del evento biotecnológico Liberty. Resistencia a glufosinato de amonio. Empresa “Algodones Mayas S.A.”, finca “El Naranjo”, Masagua, Escuintla. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2001). ..............................73 Figura 62. Ensayo de campo de algodón del evento biotecnológico Liberty. Selección de progenies resistentes al herbicida Liberty (glufosinato de amonio). Empresa “Algodones Maya S.A.”, finca “El Naranjo”, Masagua, Escuintla. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2002). ......................................................................................73 Figura 63. Porcentaje del público que considera saber o no que es un OVM. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................73 Figura 64. Porcentaje del público que considera saber que es un Organismo Transgénico. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)..................................................................74 Figura 65. Porcentaje del público que considera saber o no si está consumiendo alimentos provenientes de OVM´s. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). .............................75 Figura 66. Porcentaje del público que considera saber o no sobre la utilización de los OVM´s. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)....................................................................75 Figura 67A. Identificación de muestras en el Laboratorio Nacional de Salud. (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003). ..............................................................................................83 Figura 68A. Cabinas de seguridad en el Laboratorio Nacional de Salud (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003). ..............................................................................................83 Figura 69A. Medidas de Bioseguridad en el Laboratorio Nacional de Salud. (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003). ..............................................................................................83 Figura 70A. Laboratorio con nivel 3 de seguridad en el Laboratorio Nacional de Salud. (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003). ...................................................................................83 Figura 71A. Condiciones mínimas de Bioseguridad en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la URL. (Fuente: Ing.Agr. Luis Aguirre, 2003). .....................................................................83 Figura 72A. Aspecto general de un ambiente de trabajo en el Laboratorio Nacional de Salud. (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003). ..............................................................................83

Figura 73A. Cuarto de crecimiento del laboratorio de Cultivo de Tejidos del ICTA. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003) .......................................................................................84 Figura 74A. Espectrofotómetro de luz ultravioleta en el laboratorio de Marcadores Moleculares del ICTA. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)..................................................84 Figura 75A. Detalle de cámara de flujo laminar en laboratorio de Cultivo de Tejidos de URL. (Fuente: Ing.Agr. Luis Aguirre, 2003).......................................................................................84 Figura 76A. Carga de gel de electroforesis en el laboratorio de Marcadores Moleculares de FAUSAC. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ...........................................84 Figura 77A. Estufa con agitación magnética y potenciómetro en laboratorio de Cultivo de Tejidos de URL. (Fuente: Ing.Agr. Luis Aguirre, 2003) ........................................................84 Figura 78A. Transiluminador en el laboratorio de Marcadores Moleculares de ICTA. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003) .......................................................................................84 Figura 79A. Enraizamiento de piña en laboratorio de Cultivo de Tejidos de ICTA. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003) .......................................................................................84 Figura 80A. Planta de chipe en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de ICTA. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). ......................................................................................84

Figura 81A. Planta cactácea in vitro en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de ICTA. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003) .......................................................................................84 Figura 82A. Planta de mora in vitro en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de URL. (Fuente: Ing.Agr. Luis Aguirre, 2003)......................................................................................................84 Figura 83A. Planta de camote in vitro en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la FAUSAC. .............84 Figura 84A. Plantas de café in vitro en laboratorio de Cultivo de Tejidos de ANACAFÉ. (Fuente: Ing.Agr. Amauri Molina, 2002) ............................................................................84 Figura 85A. RAPD en gel de agarosa en cultivo de café en laboratorio de FAUSAC. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 1997). ......................................................................................86 Figura 86A. SSR en gel de poliacrilamida (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 1999) ..................86 Figura 87A. AFLP en gel de poliacrilamida. (Fuente: manual del kit de AFLP, 2003). ..........................86 Figura 88A. Detección de colonias recombinantes en laboratorio de Marcadores Moleculares de FAUSAC. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 1999) ...........................................86

1. antecedentes A principios del año 2000 se definieron acuerdos sobre el Protocolo de Cartagena, acerca de la seguridad de la biotecnología, cuyo propósito establece “Contribuir a garantizar un nivel adecuado de protección en la esfera de la transferencia, manipulación y utilización seguras de los organismos vivos modificados resultantes de la biotecnología moderna que puedan tener efectos adversos para la conservación y la utilización sostenible de la diversidad biológica, teniendo también en cuenta los riesgos para la salud humana, y centrándose concretamente en los movimientos transfronterizos.” En la búsqueda de sistemas jurídicos-administrativos de adopción de decisiones y de participación popular de la población en la esfera de la seguridad de la

biotecnología que sean viables e idóneos, Guatemala necesita contar con una amplia perspectiva de lo que los científicos, agricultores y empresarios están llevando a cabo realmente en los sectores relacionados con la biotecnología y la seguridad de la biotecnología dentro de sus fronteras. En ese contexto, el estudio sobre la utilización y situación de la biotecnología y Organismos Vivos Modificados (OVM´s), en el país, proporcionará orientación sobre la forma de evaluar los mecanismos de seguridad en el uso de la biotecnología en el país y el estado del conocimiento y disponibilidad de información sobre la manipulación, transporte y utilización de los OVM´s de los diferentes grupos de opinión que tendrán que desempeñar un papel en la elaboración de un Marco Nacional de Seguridad.

2. introducción El presente estudio se enmarca dentro del proyecto No. GUA/02/G21, titulado “Desarrollo del Marco Nacional de Seguridad de la Biotecnología para Guatemala”, y fue realizado en forma conjunta con otros estudios, incluidos dentro de dicho proyecto, de una manera integral y paralela, tales como: “Análisis de la Priorización de la Diversidad Biológica Guatemalteca en Riesgo Potencial por la Introducción y Utilización de la Biotecnología, Especialmente la Biotecnología moderna, como lo es el uso de OVM´s”; así como el “Estudio del Sistema Jurídico Regulatorio del Uso de la Biotecnología en el País”; y la “Formulación y Organización de una Base de Datos para el Manejo y Consulta de la Información Generada”. Todos los estudios indicados, incluyendo el presente, tuvieron el apoyo institucional del Consejo Nacional de Áreas Protegidas (CONAP) por medio de la Oficina Técnica de Biodiversidad (OTECBIO), con el apoyo

financiero del Programa de las Naciones Unidas Para el Medio Ambiente (UNEP) y el Fondo Mundial para el Ambiente (GEF), cuyo objetivo principal es la preparación del Marco Nacional de Seguridad de la Biotecnología para Guatemala, de acuerdo a las disposiciones pertinentes del protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnología. Una de las primeras fases del proyecto consistió en reunir datos e información sobre la situación actual de la Biotecnología en Guatemala, y el análisis y discusión de estos resultados. Dado que en Guatemala, además de la Biotecnología Moderna, se están usando otras técnicas biotecnológicas, en diferentes instituciones, con distintos propósitos, en las áreas de: salud humana, producción vegetal y animal, se consideró importante incluir como esta también la situación actual en el país en el uso de todas estas herramientas y procedimientos biotecnológicos.

3. objetivos 3.1. Elaborar un diagnóstico actual de la Biotecnología en Guatemala

3.2. Realizar un inventario de recurso humano y físico con que cuenta el país en el campo de la Biotecnología.

4. marco teórico 4.1. DEFINICIÓN DE BIOTECNOLOGÍA La BIOTECNOLOGÍA se define como la: “utilización de organismos vivos, modificados o no, con aplicación de técnicas biológicas, para la producción de bienes y servicios”. La BIOTECNOLOGÍA se divide en tres grandes áreas que son: a) Cultivo de Tejidos Vegetales. b) Marcadores Moleculares. c) Ingeniería Genética. (George, 1993). 4.2. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES. El CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES se define como: “ciencia (o arte) de hacer crecer tejidos, órganos o células de plantas, aislados de una planta madre y cultivados sobre un medio artificial” (George, 1993).

Entre los USOS o APLICACIONES que tiene el Cultivo de Tejidos Vegetales podemos mencionar los siguientes: • Mejoramiento Genético. Mediante la aplicación individual o conjunta de las siguientes técnicas: cultivo de embriones, cultivo de anteras, variación somaclonal, cultivo de callos, cultivo de suspensiones celulares, cultivo de protoplastos, ingeniería genética (transformaciones o transferencia de genes).

• Conservación de Germo-plasma. Para lo cual se utilizan las técnicas de: microtuberización, crioconservación y mínimo crecimiento. • Limpieza de Patógenos. Mediante la utilización del cultivo de meristemos. • Propagación Masiva. Utilizando las técnicas: germinación de semillas, microinjertación, cultivo de ápices (brotes o puntas), cultivo de nudos (microesquejes) e inducción de brotes.

4.2.1. TÉCNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES Algunos cultivos importantes no se reproducen sexualmente debido a que son altamente heterocigóticos y a que sus descendientes son atípicos; por otra parte, la reproducción asexual permite mantener plantas genéticamente idénticas al cultivar padre. En el caso de las plantas de cultivo, tales como los árboles frutales, los plátanos, los tubérculos, las legumbres y los ornamentales que producen pocas semillas o ninguna, la multiplicación vegetativa es la única forma de reproducción. Como puede verse en el ejemplo de los claveles, la horticultura tradicional se basa en el empleo de grandes propágulos como medio de multiplicación, éste método tiene dos grandes desventajas, a saber: • Un bajo coeficiente de multiplicación. • Transmisión de enfermedades, particularmente virus, a través de las partes vegetativas de las plantas (FAO-OIEA, 1985). A. Cultivo de puntas de brotes (ápices y meristemos), propagación de clones y eliminación de agentes patógenos. Las técnicas de cultivo de tejidos brindan un nuevo enfoque a la reproducción clonal de las plantas de cultivo. El cultivo de puntas de vástagos aislados, el llamado cultivo meristemático, es una tecnología importante de la reproducción in vitro, frecuentemente denominada microreproducción. La punta del vástago se extrae quirúrgicamente de la planta y se utiliza como explante en el cultivo in vitro. De las plantas sanas se pueden extraer “explantes” más grandes, de hasta 5 milímetros, que se utilizan para la reproducción; mientras que para la eliminación de patógenos se utilizan pequeñas estructuras meristemáticas de hasta 0.5 milímetros. La estructura meristemática consiste en una cúpula meristemática y varios primordios de hojas. La pequeña punta del vástago se corta cuidadosamente bajo el estereomicroscopio. Para evitar que se seque se transfiere inmediatamente, con una aguja fina, a la superficie de los medios nutrientes. El meristemo aislado es una estructura autónoma que, en

un ambiente nutritivo adecuado, da origen a un vástago. Generalmente, se inducen yemas axilares en medios de citoquinina y durante el subcultivo el vástago forma un conjunto de ramas. La mayoría de los cultivos reproducidos vegetativamente están sistemáticamente contaminados con uno o más patógenos. Las vides, por ejemplo, pueden ser atacadas por 15 virus distintos que reducen drásticamente su rendimiento. La termoterapia se ha utilizado eficazmente para obtener plantas sin virus. Este método se basa en la inactivación térmica de los virus causando poco o ningún daño en la planta huésped. A veces se requiere una exposición a altas temperaturas durante largo tiempo. En las plantas contaminadas, el meristemo apical, generalmente, no contiene virus o es portador de bajas concentraciones. Para obtener plantas sin virus las puntas de los meristemos pueden ser aisladas y cultivadas in vitro. Los vástagos se extraen en condiciones asépticas de las plantas en crecimiento activo. El procedimiento se realiza bajo el estereomicroscopio, ya que para la eliminación de los virus se necesitan explantes muy pequeños. La estructura misma consiste en una cúpula meristemática y una parte de primordios de hojas. Dependiendo de su concentración, los reguladores de crecimiento determinan la reproducción de las puntas de los vástagos. La dominancia apical está controlada por la interacción de las hormonas vegetales (reguladores del crecimiento). La punta de un meristemo da origen a un vástago con bajas concentraciones de hormonas. Las concentraciones de hormonas no equilibradas, y elevadas, promueven la formación de callos. Las citoquininas intensifican, generalmente, la ramificación axilar. La regeneración de yemas adventicias tiene lugar en medios ricos en citoquininas. Los vástagos desarrollados en presencia de una citoquininina carecen, generalmente, de raíces. Para obtener plantas completas, los vástagos deben transferirse a un medio de enraizamiento que contiene, generalmente, auxina. Las plantas bien enraizadas están en condiciones de ser transplantadas al suelo. Se extrae el medio de las raíces y se cultivan las plántulas en varios sustratos. La humedad debe mantenerse a niveles elevados durante varios días después del transplante. Las plantas sin virus, derivadas de las puntas de los vástagos, son vigorosas y crean la base para la obtención de clones de rendimiento elevado. Actualmente, las técnicas in vitro pueden utilizarse para la reproducción de plantas, la fitotecnia con fines de man-tenimiento y la eliminación de patógenos de

numerosas especies hortícolas, éste es el caso de los árboles frutales. Estas técnicas también constituyen un instrumento potencial para la mejora de cultivos tropicales (FAO-OIEA, 1985). B. Cultivo de embriones cigóticos. La extracción y cultivo de embriones de plantas superiores fue uno de los primeros métodos eficaces de aplicación de técnicas in vitro. Con embriones aislados es posible desarrollar estructuras de plantas completas. Esta técnica tiene importantes aplicaciones en la fitotecnia. Un embrión maduro puede cultivarse fácilmente en medios nutrientes sencillos. La principal ventaja del cultivo de embriones es, sin embargo, la posibilidad de obtener plantas, a partir de embriones inmaduros, en una etapa temprana del desarrollo. El medio de cultivo proporciona los nutrientes necesarios, simulando así la función del endosperma. Durante el desarrollo in vitro el embrión tiene la capacidad metabólica de sintetizar las hormonas vegetales endógenas y, por consiguiente, no es necesario que el medio nutriente contenga un regulador de crecimiento exógeno. Entre otros, los aminoácidos, las sustancias complejas, o los extractos vegetales naturales, pueden promover el desarrollo de vástagos y raíces. Las plantas derivadas de embriones constituyen un valioso material de cultivo, especialmente en el caso de los cereales. La aplicación más útil del cultivo de embriones cigóticos, es la hibridación remota. La fertilización y el desarrollo inicial del embrión tienen lugar en muchos cruces interespecíficos e intergenéricos. Como consecuencia del desarrollo endospérmico anormal, el embrión híbrido muere prematuramente, pero los embriones deben cortarse antes de que se produzca el aborto y cultivarse in vitro. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para producir híbridos económicamente útiles tales como el triticale, que es la primera especie cereal artificialmente creada por el hombre (FAOOIEA, 1985). C. Cultivo de callos y células. En las plantas, las células diferenciadas conservan su capacidad para volver a entrar en la fase meristemática y formar una masa no organizada del tejido llamada callo. Prácticamente todas las partes de la planta pueden formar el callo en ambientes nutrientes y hormonales favorables. La médula del tallo del tabaco es un sistema

modelo para estudiar el desarrollo y la diferenciación del callo. Los explantes se colocan sobre la superficie del medio de cultivo que contiene cantidades exactamente equilibradas de auxinas y citoquininas. En el plazo de dos a tres semanas, el callo se reproduce sobre la superficie del explante. El subcultivo continuo sobre medios que poseen la misma composición hormonal garantiza el desarrollo continuo del callo. La diferencia entre los distintos tipos de callos reside en las necesidades hormonales durante el cultivo a largo plazo. Algunos de ellos son independientes de las hormonas, lo que es típico de los tejidos habituados. El régimen de cultivo influye sobre la contextura del callo. Existen dos tipos de callos, a saber: friables y compactos. Los callos friables pueden dispersarse fácilmente en el medio líquido para obtener una suspensión celular. Los trozos de callos en el medio líquido se colocan en un agitador. Para dispersar completamente éstos agregados y grupos celulares, así como las células separadas, hay que pasar la suspensión por tamices de acero inoxidable. La suspensión celular se cultiva en el medio líquido agitado. Básicamente existen dos tipos de cultivos: los efectuados por lotes y los efectuados por agitación. Se prefieren los agitadores giratorios. La suspensión celular en desarrollo se subcultiva en medios frescos. Se necesitan subcultivos de crecimiento rápido para mantener la dispersibilidad de la suspensión y reducir la agregación celular. El material vegetal, el régimen de cultivo y la composición hormonal de los medios influyen sobre la forma de crecimiento de los cultivos. La densidad celular elevada favorece el crecimiento rápido y la producción de biomasa. Los agregados celulares se producen, comúnmente, en cultivos más viejos. El desarrollo de los cultivos de células vegetales en suspensión se mide, generalmente, contando las células; para ello es sumamente útil un hematocitómetro. La magnitud del crecimiento en suspensión también puede expresarse como volumen celular total o incremento del peso con agua. Inicialmente, el cultivo atraviesa por una fase de retardo, seguida de una fase de crecimiento exponencial y, después de tres a cuatro generaciones celulares, los cultivos entran en una fase estacionaria. La viabilidad de las células cultivadas puede estimarse mediante varios métodos de coloración. Existen numerosas técnicas de cultivo en placas que pueden utilizarse para cultivar una variedad de células vegetales. La suspensión celular puede cultivarse en una placa fina sobre el medio sólido. La técnica

corriente para obtener colonias de células separadas consiste en mezclar las alícuotas del cultivo líquido y el agar fundido que se enfrían a una temperatura de 35oC. La mezcla se vierte rápidamente en una placa Petri. La suspensión celular y la técnica del cultivo en placa son medios útiles demostrados para aislar mutantes en las plantas superiores (FAO-OIEA, 1985). D. Regeneración de plantas. Muchos cultivos de tejidos vegetales pueden regenerar plantas completas. Existen dos procesos morfogenéticos que conducen a la regeneración de la planta, a saber: la organogénesis y la embriogénesis somática. La diferenciación organogenética supone la formación de yemas de vástagos en el tejido cultivado, que puede inducirse cambiando la razón auxina/citoquinina; sin embargo, las necesidades de reguladores de crecimiento exógenos varían en los distintos sistemas de cultivo de tejido. El ciclo de la regeneración de la planta completa termina con el enraizamiento del vástago. A condición de que se coloque en el medio apropiado la célula vegetal somática, puede convertirse en una planta completa de la misma forma que un embrión cigótico. El fenómeno de la embriogénesis asexual está controlado por los factores de crecimiento que dependen de las características del material vegetal. Los embriones somáticos maduros se convierten en plantas completas que se pueden transplantar al suelo. La transferencia de tejidos a las condiciones que contribuyan a la organogénesis conduce, en primer lugar, a la diferenciación de estructuras localizadas semejantes a los meristemos. Estos meristemoides son unidades monopolares, generalmente vascularizadas. Las hormonas del crecimiento determinan si los explantes o los callos regeneran vástagos o raíces. Ambos órganos, es decir, los vástagos y las raíces, rara vez se producen simultáneamente. Por éste motivo se separan los vástagos diferenciados y se transfieren a los medios de enraizamiento que tienen una composición hormonal distinta. Las plantas enraizadas se trasplantan a medios no estériles. La morfogénesis in vitro está controlada principalmente por la razón auxina/citoquinina. Cuando los niveles de ambos reguladores son iguales se produce, generalmente, un desarrollo no organizado de callos. Las concentraciones relativamente elevadas de auxinas favorecen la diferenciación radicular y, cuando las cantidades de citoquininas son más elevadas, se promueve la

regeneración de vástagos. Muy frecuentemente los vástagos se enraizan sobre medios de auxina, sin embargo, éste modelo no puede generalizarse. El fenómeno de la embriogénesis en la suspensión celular cultivada constituye una excelente prueba de la totipotencia de las células de las plantas superiores. Es muy probable que cada embrión se derive de una sola célula. Los embriones somáticos pasan por etapas en las que adquieren forma globular y de torpedo. Una característica típica de las poblaciones de embriones somáticos es la amplia gama de tamaños y de etapas de desarrollo por las que atraviesan; además, la embriogénesis somática es, algunas veces, repetitiva, y de los embriones en maduración surgen otros nuevos. La capacidad morfogenética del cultivo celular es extremadamente elevada. Los embriones asexuales maduran y comienzan a germinar inmediatamente en el cultivo. Dado que los embriones son unidades bipolares, se forman vástagos y raíces. Las plantas derivadas de embriones se trasplantan al suelo después de un corto período de cultivo in vitro. Recientemente, se ha conseguido regenerar plantas a partir de células somáticas en muchos cultivos económicamente importantes. Esta técnica constituye un nuevo instrumento para la reproducción vegetal y la fitotecnia. En el caso del maíz, al igual que en el de otros cereales, el callo embriogénico puede inducirse sobre medios de auxina. Este nuevo sistema ofrece excelentes posibilidades de regeneración en masa de plantas. Los regenerantes del maíz pueden convertirse en un valioso material de reproducción (FAO-OIEA, 1985). E. Inestabilidad genética de las células cultivadas. Los cultivos in vitro son objetos adecuados para los estudios citogenéticos. La heterogeneidad citológica es una característica típica de los cultivos de callos y células de la mayoría de las especies vegetales. El origen de la variación cromosómica está relacionada con el tipo de explante y las condiciones de cultivo. Algunos componentes del medio nutriente, como por ejemplo 2-4-D, influyen sobre la formación de las células que tienen un nivel más elevado de ploidía. La

poliploidización es el proceso más común durante la inducción y el desarrollo de callos. La poliploidía in vitro está relacionada con la endomitosis o la endoreduplicación. Las células poliploides representan una fracción permanente de tejidos no organizados. Algunas de ellas alcanzan un grado extremadamente elevado de poliploidía. La presencia de aneuploidía en células cultivadas también está bien documentada. La fragmentación nuclear es frecuente. En diferentes cultivos de callos y células se han observado cambios careotípicos como consecuencia de aberraciones cromosómicas. A veces hay fragmentos tricéntricos, cromosomas rezagados y puentes cromosómicos. Actualmente el análisis detallado de las estructuras cromosómicas se realiza mediante las pruebas técnicas de coloración, tales como: la formación de Bandas de Gimpsa y el intercambio de cromatidios hermanos (FAO-OIEA, 1985). F. Variabilidad genética de los regeneradores. En las plantas regeneradas in vitro también puede encontrarse una notable variabilidad. En la población de regenerantes se producen cambios fenotípicos en las características morfológicas, fisiológicas y agronómicas. La transmisión de las características a la generación siguiente se ha demostrado, tanto en las progenies reproducidas en forma sexual como en las reproducidas en forma vegetativa. La variabilidad genética en el sistema in vitro, que se denomina variación somaclonal, puede aplicarse al cultivo de plantas reproducidas en forma vegetativa, como en el caso del ajo. Se dice que las plantas reproducidas por semillas, tales como el maíz, también pueden modificarse genéticamente in vitro. En la población de regenerantes de cultivos de tejidos se han observado variantes morfológicas parecidas a mutantes de un solo gen. Mediante la manipulación in vitro puede inducirse una nueva variabilidad genética. Las posibilidades del sistema aumentan con los métodos de selección de células. Ya se está demostrando la aplicabilidad de la genética de las células somáticas y las técnicas de cultivo de células para la mejora de cultivos (FAOOIEA, 1985).

G. Androgénesis in vitro y producción de haploides.

En el cultivo de anteras, la androgénesis es sumamente importante para la producción haploide de muchas especies de cultivos. El tabaco fue la segunda especie, después de la Datura, en la que se utilizó eficazmente el cultivo de anteras para la producción haploide en masa. Las anteras sólo son sensibles en ciertas fases del desarrollo que dependen del genotipo y las condiciones del cultivo. Los signos externos, tales como la aparición de la corola del cáliz, pueden utilizarse para seleccionar la fase adecuada de las yemas. Tras la esterilización de la superficie, se abren los capullos y se retiran cinco estambres. Cada antera debe separarse de su filamento para evitar la formación de callos a partir de los tejidos somáticos. Las anteras intactas se colocan sobre la superficie de los medios nutrientes. En el caso del tabaco, la androgénesis tiene lugar en medios sencillos. El carbón es útil para absorber inhibidores del agar. En los últimos años se han realizado progresos en la mejora de la técnica de cultivo de anteras en los cereales, especialmente en el arroz, la cebada y el trigo; sin embargo, los procedimientos todavía son muy empíricos y los resultados no pueden aún generalizarse. El éxito del cultivo de anteras, en el caso de los cereales, depende, predominantemente, del genotipo de las plantas donantes. Las condiciones de cultivo podrían mejorarse en el caso de cada genotipo, pero ésta labor es bastante tediosa. El estado fisiológico de la planta en el momento de la excisión de las anteras también influye sobre las posibilidades de desarrollo de las microsporas. Un factor descisivo es el aislamiento de las anteras en la fase adecuada de desarrollo del polen. Muy frecuentemente se utilizan medios específicos, en forma líquida, complementados con hormonas del crecimiento y otros componentes. Existen suficientes indicios del importante papel que corresponde a la pared de las anteras en el desarrollo del embrión polínico. En el caso de la mayoría de las especies vegetales la fase polínica adecuada para la inducción de la androgénesis es la comprendida entre inmediatamente antes de la primera mitosis del polen y durante la misma. En las primeras fases del cultivo de anteras del tabaco las microsporas embriogénicas inician la división repetitiva, forman estructuras multicelulares en la cavidad de las anteras que pasan por todas las fases del desarrollo embrionario y dan origen a cientos de embriones polínicos. Durante las

etapas ulteriores del cultivo, las paredes de las anteras se rompen y dentro de la cavidad polínica germinan embriones polínicos. Después de 20 a 40 días, aparecen en el cultivo de anteras plántulas verdes. El desarrollo directo del polen que da origen a plantas completas sólo se produce en algunas especies, mientras que en otras, se produce el proceso de androgénesis indirecta, que abarca la proliferación de microsporas en el callo y la regeneración de plantas por organogénesis. Este fenómeno se observó, por ejemplo, en los cereales. Las plantas haploides se trasplantan al suelo, donde continúan desarrollándose hasta alcanzar la madurez. Una característica típica de los haploides es la esterilidad, debida a meiosis irregulares. Para obtener plantas fértiles es necesario duplicar el número de cromosomas, lo que se realiza, generalmente, mediante un tratamiento de colchicina. La diploidización da lugar a líneas plenamente homo-cigóticas que constituyen un material de reproducción sumamente valioso. Dado el creciente aumento de la población mundial, la necesidad de producir cada vez más alimento se ha convertido en un gran desafío. La técnica del cultivo de tejidos vegetales es un instrumento poderoso que, en manos de botánicos fitotécnicos, puede ayudar a solucionar el problema del hambre en el mundo (FAO-OIEA, 1985). H. Micropropagación. Si el cultivo de tejidos consiste en cultivar asépticamente diferentes explantes constituidos por fracciones de un tejido u órgano que se extrae de la planta, la micropropagación es prácticamente una multiplicación masiva in vitro. Actualmente, la micropropagación se practica con éxito en especies hortícolas (Murashige, 1978) ornamentales (Hughes, 1981) y, en especies leñosas (Thorpe, 1983). En general las ventajas de la micropropagación son las siguientes: • Incremento acelerado del número de plantas derivadas por genotipo. • Reducción del tiempo de multiplicación. • Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie reducida, a bajos costos y en tiempos económicamente costeables. • Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga. • Facilidad para transportar el material in vitro de un país a otro, con menos restricciones aduaneras.

• Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual sólo existan pocos individuos. I. Manejo de plantas, producidas por cultivo de tejidos, en el vivero. El cultivo de tejidos o micro-propagación se ha tornado importante para la producción de plantas ornamentales en Florida. El cultivo de tejidos permite la rápida multiplicación de nuevos híbridos y cultivares, y es la mejor forma de producir, uniforme y libre de enfermedades, material madre de propagación vegetativa. La micropropagación es, actualmente, ampliamente utilizada también para la producción de plantas de follaje. Muchos viveros de plantas de follaje regularmente compran plantas provenientes de cultivo de tejidos, que han crecido a un tamaño comercial. Las plántulas producidas por cultivo de tejidos requieren especial atención durante la transcisión desde el laboratorio al invenadero y muchas pérdidas ocurren durante éste período crítico. El ambiente en el cual los tejidos han estado cultivados es de baja intensidad de luz, relativamente libre de plagas y enfermedades, cerca del 100% de humedad relativa y estéril, muy diferente de las condiciones típicas de un invernadero o casa sombreada (Universidad de Florida, 1995b). El proceso del cultivo de tejidos se divide en cuatro etapas. La etapa I ocurre completamente en el laboratorio. Los procesos del vivero relacionados con el material de cultivo de tejidos conciernen únicamente a las etapas II a IV. Los materiales de la etapa II, o microesquejes, son brotes no enraizados o parcialmente enraizados, cosechados de cultivos proliferados. Las plántulas en etapa III tienen ambos, brotes y raíces. Las plántulas en etapa IV son plantas provenientes de cultivo de tejidos que ya están completamente establecidas y que se cultivan en un medio de crecimiento stándard y que, por lo tanto, reciben las condiciones típicas para esas condiciones. Los lineamientos de la etapa IV son los más caros en la producción del material de cultivo de tejidos, pero necesita menos cantidad de cuidados especiales. Los microesquejes en la etapa II son los menos caros, pero son muy delicados. Plántulas enraizadas en la etapa III representan un rango medio, tanto en costo como en atención especial requeridos para cultivarlos en el vivero. De especial atención es la sanidad durante el proceso de plántulas provenientes de cultivo de tejidos,

ya que este material vegetal ha sido producido bajo cuidadosas y controladas condiciones, libres de plagas y enfermedades (Universidad de Florida, 1995b). Plántulas o microesquejes, recibidos del laboratorio de cultivo de tejidos, deben ser atendidos lo más pronto posible. Las pérdidas pueden ser reducidas si el material es establecido en el ambiente de transición, lo más pronto posible. Deben lavarse las manos muy bien antes de manejar el material. El área de trabajo debe prepararse antes de manejar el material vegetal. Los contenedores deben ser llenados con medio para plántulas y con la ayuda de herramientas para un acceso fácil. Contenedores especiales, como bandejas, son a menudo usadas para enraizar microesquejes o establecer plántulas provenientes de cultivo de tejidos. Comprimidos (pellets) de musgo (peat moss) y bloques de espuma (foam) también pueden ser usadas para enraizar microesquejes. La mezcla de suelo más comúnmente usada para establecer plántulas provenientes de cultivo de tejidos o enraizar microesquejes debe contener, al menos, 50% de musgo (peat moss), combinado con materiales variados como vermiculita, broza, perlita o ceniza. Fertilizantes de liberación lenta y micronutrientes son comúnmente mezclados con el medio. El pH del suelo necesita ser ajustado de acuerdo a las necesidades del material vegetal. Es también importante que la mezcla esté libre de partículas demasiado grandes, una mezcla fina es más fácil de colocar en los pequeños contenedores y disminuye la posibilidad de daños a las tiernas plántulas o microesquejes. Las bandejas se sobresaturan con agua y se deja drenar el exceso. Es más fácil plantar en un medio húmedo que en uno seco. Las plántulas enraizadas, a menudo se reciben con el medio de agar en el cual han crecido. Los microesquejes deben ser enjuagados con agua limpia a temperatura ambiente. Los microesquejes no enraizados deben llegar en bolsas plásticas o recipientes con la mayoría del agar removido, los cuales deben ser lavados con agua limpia a temperatura ambiente. Es importante que la humedad alrededor de las plántulas o microesquejes permanezca arriba del 75% durante el proceso de transferencia, ya que estas plántulas han estado en una humedad relativa cercana al 100% en el laboratorio. Los microesquejes pueden, también, ponerse a flotar en recipientes con agua. El ambiente en el cual la siembra toma lugar debe ser diseñado para disminuir el stress de las plántulas provenientes del cultivo de tejidos. Una baja

intensidad de luz y una moderada temperatura debe ser mantenida mientras se trabaja. Un dispositivo simple para plantar pequeñas plántulas en pequeños recipientes, y que funciona muy bien, es una navaja, haciendo una depresión poco profunda en el medio del recipiente, lo suficientemente profundo para poner el sistema radical de las plantas en etapa III o los tallos de los microesquejes en etapa II. Cuidadosamente se toma una plántula o microesqueje del recipiente de manejo, teniendo cuidado de no aplastar el tallo o las hojas, colocando la plántula enraizada en el agujero lo suficientemente profundo para asegurar la planta. La yema del dedo puede ser usada para acomodar el sustrato en el agujero para cubrir las raíces. No se debe compactar demasiado el sustrato alrededor de las raíces, ya que se dañará la plántula. Un microesqueje sin raíces puede ser sembrado un poco más profundo pero sólo lo suficiente para mantenerlo en su lugar durante el período de enraizamiento. Es importante trabajar rápido cuando se manejan plántulas de cultivo de tejidos recién llegadas para reducir la posibilidad de que sufran stress. Al mismo tiempo, el material debe ser manejado con el suficiente cuidado para evitar daños a los tejidos de las plantas. Las bandejas para plántulas se colocan en una banca con microaspersión (niebla o neblina). La disponibilidad de condiciones de crecimiento iniciales son determinantes y se le deben proveer durante los primeros días críticos que siguen al transplante. En el laboratorio, el material de cultivo de tejidos está expuesto a un nivel bajo de luz, usualmente entre 100 y 1000 pies candela. Estas plantas deben ser expuestas gradualmente a niveles más altos en el invernadero. Muchas cubiertas para sombreado necesitan ser erigidas directamente sobre el área del invernadero usado para plantas provenientes de cultivo de tejidos. Una buena regla que puede seguirse es doblar el nivel de luz cada una a dos semanas, hasta que las plantas se ajusten a las condiciones típicas de invernadero. Bandejas fabricadas especialmente para plántulas provenientes de cultivo de tejidos vienen equipadas con tapas de plástico que actúan como invernaderos miniaturizados, manteniendo una alta humedad alrededor de las plántulas. Una neblina fina o sistema de propagación por neblina es probablemente la mejor forma de establecer plántulas de cultivo de tejidos, así como también para enraizar microesquejes. La microaspersión debe ser frecuente, en primer lugar, para prevenir la deshidratación de las plántulas. El

intervalo de la frecuencia puede ser lentamente incrementada conforme el material madura. Debe ser suministrado sombreado. El contenedor del sustrato no debe mantenerse demasiado mojado, ya que causa daños. Los sistemas de neblina son caros pero útiles, porque mantienen la humedad alta pero el sustrato no se satura directamente por las gotas de agua. En cultivo de tejidos, las plantas no son sometidas a cambios extremos de temperatura. Material tropical en cultivo, usualmente se mantiene a cerca de 78 grados Fahrenheit (25.5 grados centígrados). El rango de fluctuación de temperatura encontrado en la mayoría de invernaderos puede ser demasiado extremo para plántulas frescas de cultivo de tejidos. Una temperatura diurna de 80 a 85 grados (26.6 a 29.˚C) y una caída de 5 grados en la noche (2.8˚C) es recomendable. Un programa regular de aplicación de fungicidas durante la primera semana de establecimiento ayuda a prevenir pérdidas de plántulas por enfermedades de las raíces. Sobre todo, los niveles de humedad en el contenedor del sustrato debe ser pareja. Los pequeños contenedores usados para plántulas de cultivo de tejidos mantienen un pequeño volumen de sustrato y pueden secarse muy rápido. Es necesario monitorear el material varias veces al día, al principio. En unas pocas semanas, vigorosas plántulas de cultivo de tejidos o microesquejes, deberán llenar los pequeños contenedores con raíces saludables. A éste tiempo ya están listas para ser tratadas como otra planta producida por cualquier método tradicional de propagación. La mayoría de plantas provenientes de cultivo de tejidos son uniformes, ocasionalmente aparecen variantes, las cuales deberán ser removidas de la bandeja. En resumen, los pasos para el apropiado establecimiento de plántulas de cultivo de tejidos o microesquejes son: estar preparado para sembrar las plántulas provenientes de cultivo de tejidos tan pronto se reciban del laboratorio; enjuagar cualquier remanente de medio de agar del material antes de sembrar; mantener altos niveles de sanidad cuando se manejen plantas de cultivo de tejidos; mantener alta humedad, moderada temperatura y baja luminosidad durante el proceso de siembra; durante la primera semana crítica de establecimiento, proteger las plántulas o micro-esquejes de la luz intensa, extrema temperatura y stress por humedad. Con solo algunos pequeños esfuerzos la micropro-pagación puede proveer un cultivo con plantas

vigorosas, libres de enfermedades y uniformes, que rápidamente pueden crecer a un tamaño comercial (Universidad de Florida, 1995b). 4.3. EQUIPO Y PROCEDIMIENTOS 4.3.1. PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS Cada año, millones de plantas leñosas y herbáceas son producidas por cultivo de tejidos o micropropagación. Este procedimiento de alta tecnología involucra el cultivo de una nueva planta a partir de un ápice o sección de tallo de una planta preexistente. El cultivo de tejidos ha venido incrementando su importancia en la producción de viveros en los últimos 15 años. Existen más de 100 laboratorios comerciales en los Estados Unidos, con más de 30 de ellos localizados en Florida. Estos laboratorios, rutinariamente, producen plantas frutales, flores, follajes y ornamentales, utilizando cultivo de tejidos (Universidad de Florida, 1995a). El cultivo de tejidos permite la rápida multiplicación de una gran gama de especies y es la mejor forma de producir material vegetal uniforme y libre de enfermedades. El material vegetal es una parte o pedazo de una planta. El cultivo de tejidos es tanto una ciencia, como un arte. Como ciencia, el cultivo de tejidos requiere un laboratorio y exactitud y cuidado en la preparación del medio de crecimiento formulado. También requiere la precisa manipulación del material vegetal bajo condiciones controladas. Como arte, el cultivo de tejidos requiere habilidad manual para trabajar con pequeñas y delicadas porciones de material vegetal, mientras se previene la contaminación de los cultivos. El alto grado de sanidad necesario es denominado como condiciones asépticas. El cultivo de tejidos difiere de los métodos convencionales de propagación de plantas, no solamente en los métodos asépticos usados, sino también por el tipo de equipo necesario. La cámara de flujo laminar es la estación de trabajo para el procedimiento de cultivo de tejidos. El aire ingresa a través de ductos situados por debajo de la superficie de trabajo. Contaminantes como: polvo, suciedad, esporas de hongos y bacterias, son filtrados y el aire limpio es soplado hacia el trabajador. Toda la cristalería, sujetadores de instrumentos, toallas de papel, agua e inclusive el medio de cultivo debe ser esterilizado a alta presión y alta temperatura, en una “limpiadora

a vapor” llamada autoclave. Las herramientas más frecuentemente utilizadas en cultivo de tejidos son pinzas y bisturí. Mientras trabaja, las herramientas deben ser esterilizadas en un el incinerador, colocando las pinzas y bisturí en el él por cerca de 5 segundos. La temperatura del aire en el incinerador está entre 1500 y 1600 grados Fahrenheit. Deben esterilizarse 4 juegos de herramientas, de tal manera que un juego siempre esté frío. Después de la esterilización las herramientas deben colocarse en un soporte, a menudo una gradilla de tubos de ensayo, la cual debe ser esterilizada en un autoclave. También se utilizan toallas de papel y alcohol para esterilizar (Universidad de Florida, 1995a). Técnica de asepsia. La técnica de asepsia empieza con la limpieza personal, sencillamente con el lavado de manos, uñas y antebrazos, con agua y jabón, antes de empezar el trabajo en la cámara. Debe mantenerse a mano una botella de etanol al 70% en la estación de trabajo, para la limpieza de manos y área de trabajo mientras se está trabajando. Casi siempre se usan batas de laboratorio. El cabello largo debe recogerse hacia atrás y colocarse dentro de un gorro. Si la cámara de flujo laminar se encuentra apagada, debe encenderse por lo menos 15 minutos antes de empezar a trabajar. También debe lavarse el área de trabajo con alcohol y colocar una toalla de papel esterilizada. Las herramientas deben colocarse de tal forma que no se crucen los brazos sobre el área de trabajo cuando se les alcanza. No deben tocarse las toallas de papel estéril o el material vegetal con las manos mientras se trabaja. Al hablar, la cabeza debe moverse hacia afuera de la cámara y se debe evitar, por todos los medios, estornudar o toser dentro de la cámara (Universidad de Florida, 1995a). Procesos de cultivo de tejidos. La etapa I es la etapa inicial de establecimiento del material vegetal en el medio de cultivo estéril. El material vegetal puede, o no, estar establecido. En cultivo de tejidos se usa un medio especial a base de agar. El medio contiene: agar, azúcar, nutrientes para plantas y un balance especial de hormonas vegetales (reguladores del crecimiento) que estimulan el crecimiento. El medio es cuidadosamente mezclado, colocado en recipientes de cultivo y esterilizado en el autoclave. Diminutos ápices o secciones de tallo son removidos del material madre sano, éstos son llamados explantes. Los explantes son desinfectados en una solución diluida de cloro y

transferidos cuidadosamente al medio especial. Estos cultivos deben ser mantenidos en un ambiente cuidadosamente controlado, llamado cuarto de crecimiento. El balance de las hormonas vegetales en el medio, induce a las plantas a producir muchos nuevos brotes. Estos cultivos proliferados se encuentran en la etapa II. El material obtenido de la etapa II ser dividido en subcultivos, lo cual resultará en posteriores proliferaciones de la etapa II; o bien, puede cosechar los brotes individuales, también llamados microesquejes y colocarlos en un medio que estimule la formación de raíces. Una vez se formen las raíces, los microesquejes se encuentran en la etapa III. La importancia de mantener una técnica aséptica debe ser reenfatizada cuando se trabaja con cultivo de tejidos de plantas en la cámara de flujo laminar, ya que el medio estéril de agar usado en micropropagación ayuda al crecimiento de bacterias y hongos, al igual que los cultivos de plantas (Universidad de Florida, 1995a).

Los cultivos de tejidos en la etapa II pueden ser divididos y colocados de nuevo en el mismo tipo de medio que se usó en los explantes o bien, colocados en un medio con diferente balance de hormonas vegetales para estimular el enraizamiento. Cuidadosamente, se remueve la tapadera y se pone a un lado. Posteriormente se remueve el grupo de brotes con la ayuda de una pinza estéril y se coloca sobre una de las toallas de papel estéril. Se debe señalar que es importante trabajar rápido para que el material vegetal no se deshidrate. Con su bisturí estéril, cuidadosamente se separan los brotes más grandes en grupos más pequeños. Sobre los brotes grandes la tendencia también puede de ser mantenerlos del mismo tamaño. Siempre debe mantenerse enfrente de la cámara mientras se trabaja, con las manos hacia enfrente y el material vegetal enfrente de las mismas, para prevenir su contaminación. Deben esterilizarse las herramientas en el incinerador después de cada operación. El recipiente que contiene el medio fresco, debe desinfectarse con alcohol, previo retirársele cuidadosamente la tapa la cual, si es lo suficientemente pequeña para hacerlo cómodamente, debe mantenerse en las manos mientras se trabaja. De lo contrario, debe colocarse sobre una toalla de papel estéril. Con una pinza también estéril se toma una de las divisiones más pequeñas y, cuidadosamente, se inserta en el medio fresco, justamente lo suficientemente profundo para mantenerla estable, teniendo cuidado de no tocar con

la pinza el medio o la pared del recipiente. Posteriormente, se vuelve a colocar la tapa del tubo o frasco. Debe etiquetarse el nuevo subcultivo de acuerdo con el sistema seguido por cada laboratorio. Después de que los subcultivos se han establecido, deben ser enviados al vivero como cultivos no enraizados multiplicados en la etapa II, microesquejes no enraizados, microesquejes enraizados en la etapa III o plántulas en etapa IV, que son enraizadas en sustrato con medio típico de condiciones de vivero. Una vez más, es importante recordar las reglas de la técnica aséptica, ya que con sólo unos pocos segundos de descuido en la cámara, meses de trabajo pueden ser fácilmente destruidos (Universidad de Florida, 1995a). 4.4. EMPLEO DE TÉCNICAS IN VITRO PARA LA MEJORA DE CULTIVOS: REQUISITOS EN EL LABORATORIO Y MÉTODOS GENERALES. Desde tiempos inmemoriales el ser humano se ha esforzado por mejorar las plantas de cultivo y aumentar su rendimiento mediante la selección de variedades con características ventajosas. Antiguamente la selección era más bien un proceso accidental que dependía, en cierta medida, de la habilidad y la intuición humana. El descubrimiento, en 1865, de las leyes de Mendel, fue el acontecimiento decisivo; sin embargo, fue sólo a comienzos del presente siglo que se tomó conciencia de su importancia y, desde entonces, la fitotecnia (fitomejoramiento) se considera sobre una base científica. Los métodos de fitotecnia actuales han permito aumentar espectacularmente los rendimientos de la mayoría de las plantas de cultivo. El procedimiento de fitotecnia comienza con la selección de progenitores apropiados para realizar cruzamientos. El fitotécnico selecciona dentro de la descendencia resultante del cruce las plantas que poseen las características deseadas, las cuales dependen de una cierta combinación de genes. Además del cruzamiento, el fitotécnico utiliza otros métodos genéticos para aumentar la variabilidad de las plantas. El método de la mutagénesis inducida, por ejemplo, permite producir cultivares de rendimiento elevado. Actualmente, los fitotécnicos trabajan, no sólo en el terreno, sino también en el laboratorio con un medio ambiente controlado. Los progresos realizados en las disciplinas científicas, como la fisiología vegetal y la fitogenética, permiten realizar manipulaciones genéticas con las plantas, a nivel de células y partes aisladas (FAO-OIEA, 1985).

Un laboratorio corriente de cultivo de tejidos debe disponer de los instrumentos y aparatos necesarios para lavar y almacenar la vidriería (cristalería), preparar y esterilizar medios nutrientes, realizar manipulaciones asépticas, efectuar cultivos en condiciones controladas y evaluar los cultivos. El primer paso importante de la técnica general de cultivo de tejidos es el lavado adecuado de la vidriería. Después de lavarse con detergente, la vidriería se enjuaga cuidadosamente, primero con agua del grifo y luego con agua destilada. Las lavavajillas automáticas son muy útiles, especialmente en los laboratorios grandes. Los tubos de ensayo (tubos de cultivo), las pipetas y los objetos pequeños, tales como: los portafiltros, los tamices y los instrumentos de laboratorio se lavan en la lavadora ultrasónica. El agua de tubería convencional no es adecuada para los medios de cultivo de los tejidos vegetales, ni para ser utilizada en el laboratorio. Mediante métodos de purificación se obtiene agua exenta de pirógenos, gases y materias orgánicas. El método más común, y preferido, para purificar el agua es el tratamiento por desionización, seguido de una o dos destilaciones del agua, en alambique de vidrio (destilador). Para la preparación de medios nutrientes es necesario utilizar productos químicos de alta calidad. Las sustancias se pesan, preferiblemente, en balanzas de laboratorio (balanzas analíticas o de precisión). En matraces aforados se preparan, regularmente, soluciones con una concentración 10 veces superior a la normal. Las soluciones se almacenan en un refrigerador o congelador para su futura utilización. La fusión del agar es el primer paso en la preparación de medios sólidos. El agar se disuelve, generalmente, para obtener concentraciones comprendidas entre el 0,6 y el 1,2%. El agar se calienta, corrientemente, al baño de María, pero, para ahorrar tiempo, se recomienda el empleo de un horno de microondas. Los cultivos de tejidos vegetales requieren una fuente de carbón en los medios nutrientes. La más comúnmente utilizada es la sucrosa (sacarosa), con una concentración del 2 al 5% (FAO-OIEA, 1985). Los elementos minerales son esenciales para el desarrollo de partes aisladas de las plantas. Los principales macronutrientes son: el nitrógeno, el fósforo, el azufre, el calcio, el potasio y el magnesio. Para un desarrollo in vitro adecuado el medio debe contener, por lo menos, 25 mM de nitrato y potasio. Todas las especies de plantas necesitan seis

microelementos esenciales que son: magnesio, zinc, cobre, boro, molibdeno y cloro. Las concentraciones de los macro y micronutrientes varían en función de las distintas composiciones de los medios. Los medios, actualmente utilizados, contienen hierro, ligado por quelatos (mezcla de Fe y EDTA). El EDTA férrico (ácido etilendiaminotetraacético) continúa disponible independiente del pH de los medios. La tiamina es, con mucho, el aditivo vitamínico más importante. El ácido nicotínico, la piridoxina y el pantotenato, así como otras vitaminas del complejo B, también son útiles para el crecimiento in vitro. El inositol, con una concentración de aproximadamente 100 miligramos por litro estimula, generalmente, el crecimiento del trozo extraído de una planta, denominado explante (FAO-OIEA, 1985). Se sabe que hay varias clases de hormonas del crecimiento (reguladores del crecimiento) que son importantes para el cultivo de tejidos vegetales. La característica común de las auxinas (ácido indolbutírico, ácido naftalenacético, ácido indolacético, ácido 2-4 diclorofenoxiacético, etcétera) es que estimulan la división celular y la iniciación radicular. Las citoquininas (kinetina, bencil aminopurina, zeatina, 2 isopentil adenina, etcétera) son derivados de la adenina, que desempeñan un papel importante en la inducción de vástagos. Algunas citoquininas son útiles para la reproducción in vitro. Las giberelinas también pueden estimular un nuevo crecimiento. Por lo regular, los reguladores de crecimiento no se utilizan solos, sino en combinaciones, que dependen del material vegetal y las pautas de crecimiento. Ya existen medios nutrientes empaquetados, listos para su uso. Estos medios permiten ahorrar tiempo y evitar, durante la preparación, los errores. Los medios comunes, tales como: Murashigue y Skoog, Nitch y otras composiciones, ya se encuentran en el mercado. El agar, la sucrosa y todos los demás nutrientes, se mezclan en el recipiente aforado, que se llena, con agua destilada, hasta la marca de calibración. El pH de los medios se ajusta, generalmente, antes del autoclaveado, utilizando hidróxido de sodio (NaOH) poco concentrado. El pH determina la solubilidad y disponibilidad de iones minerales y afecta las propiedades gelificantes del agar. El pH varía, generalmente, entre 5 y 6, y puede calcularse con la ayuda de un medidor de pH (potenciómetro) o de papeles indicadores del pH. El medio de agar caliente

se vierte en recipientes de cultivo, que se sellan con papel de aluminio. Para los cultivos de tejidos vegetales se utilizan recipientes de distintas formas. Los tubos de ensayo (tubos de cultivo) son apropiados para los cultivos de meristemos o embriones, mientras que los matraces, o recipientes de plástico, se utilizan para el cultivo de callos y células. El autoclavado es un procedimiento corriente de esterilización a alta presión. El tiempo de exposición varía en función del volumen del líquido que ha de esterilizarse, por ejemplo, 15 minutos son suficientes para esterilizar 20 mililitros del medio, a una temperatura de 121 grados centígrados y a una presión de 0,122 megapascales (15 libras por pulgada cuadrada). Si no se dispone de una autoclave puede utilizarse una olla a presión de uso doméstico. La esterilización por filtración es otro método de esterilización de líquidos. Para este procedimiento se utilizan membranas filtrantes a prueba de bacterias y con poros de 0,22 µm (micrómetros). Las membranas se ajustan a los portafiltros y todo el equipo es autoclaveado. La solución se vierte, gradualmente, a través de la membrana en el recipiente estéril. El paso siguiente se realiza, en condiciones estériles, sobre un banco transportador (cámara de flujo laminar). La solución esterilizada se añade directamente al medio de agar líquido o en solidificación. La esterilización por filtración es el método que se prefiere para tratar compuestos termolábiles. Algunos reguladores de crecimiento, mutágenos químicos, toxinas, etcétera, no deben ser autoclaveados (FAO-OIEA, 1985). Los experimentos continúan, luego, en un invernadero. Prácticamente todas las partes de una planta pueden utilizarse como fuente de explantes. Los explantes deben ser esterilizados (desinfectados) a fondo antes de ser cultivados. Para ello se sumerge el material en una solución desinfectante, como por ejemplo, 70% de etanol o hipoclorito sódico, etcétera. Unas pocas gotas de un agente superficie activo, como por ejemplo Tween 80, aumenta la eficacia desinfectante. Todas las operaciones de cultivo de tejidos deben realizarse en condiciones estrictamente asépticas, por ejemplo, en una habitación sin polvo, dotada de un ventilador impelente, con un filtro a prueba de bacterias. La zona de transferencia (cuarto de transferencia) está equipada con luces ultravioletas. Actualmente, la mayoría de laboratorios de cultivo de tejidos cuenta con cámaras de flujo de aire laminar, que se pueden obtener en varias formas y tamaños.

Esencialmente en una cámara de flujo de aire laminar el aire pasa primero por un filtro de polvo, donde se filtran las partículas de gran tamaño, después, el aire se extrae a través de un filtro fino, que elimina las partículas de tamaño superior a 0,3 µm. El aire, exento de contaminantes fungosos y bacterianos, circula por la zona de trabajo. Es necesario fregar la superficie de trabajo del banco con desinfectantes. Aunque la mayoría de los instrumentos se esterilizan con aire seco y caliente, es necesario reesterilizarlos constantemente durante la manipulación aséptica. El calentamiento con soplete se utiliza comúnmente para los instrumentos en metal y de vidrio. Es conveniente comprobar la esterilidad de los objetos tocando la superficie de los medios de ensayo, por ejemplo, la mezcla de bactopeptona y agar. Muchos lugares de las instalaciones de cultivo de tejidos pueden ser fuentes permanentes de microorganismos contaminantes. Este problema se ve agravado en los ambientes tropicales, por la mayor temperatura y humedad del aire. La humedad continua, cerca del autoclave, genera millones de esporas bacterianas y fungosas que, inevitablemente, agravan los problemas de contaminación en un laboratorio de cultivo de tejidos. La principal fuente de contaminación en la zona de transferencia, son los propios seres humanos. El equipo, el material vegetal y otros objetos llevados a la zona de transferencia, pueden estar muy infestados. Los propios cultivos contaminados son una posible fuente de esporas microbianas. Dicha contaminación debe eliminarse siempre mediante autoclaveado, antes de abrir el recipiente para lavarlo. Se preparan explantes apropiados a partir del material esterilizado en su superficie, utilizando instrumentos desinfectados. Las partes de las plantas se cortan en placas de Petri estériles. Todo el equipo que se encuentra en el banco de operaciones, como el estereo-microscopio, debe ser esterilizado en su superficie antes de utilizarse. El inóculo estéril se coloca dentro de recipientes de cultivo sobre la superficie de los medios nutrientes. Los recipientes se sellan hermé-ticamente como medida de protección contra la contaminación por partículas en suspensión en el aire. El cultivo de tejidos vegetales debe incubarse en condiciones controladas. La luz de lámparas fluorescentes es el tipo de luz principal que se prefiere para el cultivo de plantas in vitro. Factores tales como: la temperatura durante el día y durante la noche, la intensidad de la luz, la calidad y fotoperíodo de la luz, influyen sobre el desarrollo y la reacción de

diferenciación de los cultivos. La temperatura oscila, generalmente, entre los 20 y 28 grados centígrados. Todo el ciclo del cultivo de tejidos vegetales termina con la regeneración y transplante a un sustrato no estéril de la planta completa. Sin embargo, las plántulas cultivadas in vitro son, generalmente, más sensibles a las condiciones ambientales, especialmente a la fuerza del agua y a las enfermedades. El sustrato inerte, como la perlita, es la mezcla adecuada para la primera fase del transplante a macetas. En condiciones de invernadero, o de campo, los regenerantes continúan creciendo y desarrollándose, hasta alcanzar la madurez. El fenómeno único de la diferenciación de las plantas es un punto clave que permite aplicar las técnicas in vitro a la reproducción vegetal, la fitotecnia y la ingeniería genética (FAO-OIEA, 1985). 4.5. CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN. Uno de los requisitos básicos para el éxito de la técnica de cultivo de tejidos es mantener los cultivos libres de microorganismos contaminadores. Los microbios más comunes que contaminan los tejidos vegetales son: nemátodos, hongos, bacterias, virus, micoplasmas y rikettsias. Los microbios pueden encontrarse en la superficie del explante, en cuyo caso se les denomina exógenos, o en el interior de las células o en los espacios intercelulares, en cuyo caso se les denomina endógenos (George, 1993). 4.5.1. FUENTES DE CONTAMINACIÓN. Las siguientes son las fuentes de donde proceden los contaminadores; cada una requiere diversas medidas de prevención: Los tejidos. Pueden llevar contaminadores en su superficie o en su interior, o en ambas partes. Los que lleva el explante sobre su superficie se pueden eliminar mediante la desinfección, pero los que se encuentran dentro del tejido son difíciles de eliminar. En este último caso puede ser útil la inclusión de fungistáticos o bacteriostáticos en el medio de cultivo; el sulfato de gentamicina, la penicilina y el sulfato de estreptomicina (10 a 50 mg/l), son algunos de los productos de amplio espectro que se pueden usar. El tratamiento de las plantas donantes del explante por medio de altas temperaturas (35 a 40˚C) también es efectivo para la obtención de segmentos de tejidos libres de bacterias y hongos

sistémicos (CIAT, 1991). El área de trabajo. Los contaminadores más comunes son las bacterias y las esporas de hongos que habitan en el ambiente. La utilización de cabinas o cuartos adaptados con un sistema de flujo laminar de aire, el cual penetra a través de filtros a prueba de microbios, permite mantener la asepsia durante el trabajo. Si el área de trabajo carece de estas instalaciones, se hace necesario limpiar las paredes y las mesas con desinfectantes y trabajar en lo posible durante cortos períodos de tiempo (CIAT, 1991). Los instrumentos. Los instrumentos de trabajo se deben esterilizar antes de usarlos. Se debe tener en cuenta, sin embargo, que los instrumentos inicialmente estériles pueden contaminarse con microbios del aire, de superficies vegetales mal desinfectadas, de las manos o de la exhalación del investigador. Lo más aconsejable es trabajar con varios juegos de las mismas herramientas y mantener la asepsia de las que se han usado, colocando los instrumentos en alcohol etílico al 70% de 2 a 3 minutos y “flameándolos” luego cuidadosamente. La exposición excesiva a la llama (flameo) hace que el metal pierda temple y se oxide; además, se propicia la acumulación en el metal de materia orgánica carbonizada difícil de remover. Por lo tanto, se debe alternar el flameo hecho después de la inmersión de los instrumentos en alcohol, con la colocación de los mismos contra la corriente de aire de la cabina de trabajo para mantener su esterilidad mientras que el alcohol residual se evapora (CIAT, 1991). El exterior de los recipientes de cultivo. Existe la posibilidad de que, durante el tiempo transcurrido entre la esterilización de los recipientes con los medios de cultivo y el momento de usarlos, se localicen en su exterior ciertos contaminadores, de tal manera que se mantenga estéril sólo el interior de los tubos; por lo tanto, se debe flamear obliga-toriamente la boca de cada tubo antes y después de sembrar el explante (CIAT, 1991). El investigador. El investigador es una fuente primaria de contaminadores. El uso de batas de laboratorio y de guantes limpios y la protección del cabello, la boca y la nariz reducen la contaminación. Las batas limpias y las máscaras son necesarias, sobre todo cuando se trabaja en un laboratorio sin flujo laminar de aire. Es esencial

que el investigador se limpie bien las manos y los brazos (lavándolos con jabón y agua y enjuagándolos con alcohol al 70%) antes de iniciar una sesión de trabajo (CIAT, 1991). 4.5.2. ESTERILIZACIÓN. La esterilización es el proceso mediante el cual cualquier material, sitio o superficie se libera completamente de cualquier microorganismo vivo o espora. Se dice que tales materiales o sitios son estériles o se han esterilizado. En la terminología médica se utiliza generalmente la palabra asepsia para designar la condición en la que están ausentes los microorganismos patógenos; quienes trabajan en el cultivo de tejidos de plantas utilizan la palabra aséptico como sinónimo de estéril. La desinfección se limita generalmente al proceso de destrucción de los microorganismos mediante métodos químicos; la esterilización se refiere a menudo al método físico para la destrucción de los microorganismos. Se utiliza la palabra axénico para las preparaciones que están libres de virus, viroides o micoplasmas (George, 1993).

4.5.3. PREPARACIÓN DEL EXPLANTE. Generalmente se considera que los tejidos de las plantas intactas y sanas son asépticos internamente y que la principal tarea de limpieza del material para explantes está limitada a la esterilización superficial. Si esta generalización se justifica o no, es debatible, pero en esta breve discusión se supone que tal es el caso. La solución de hipoclorito de sodio (NaOCl), en concentraciones de 1% a 3%, es una de las preparaciones más útiles como germicida y agente oxidante. Sirve para la esterilización superficial de materiales de todo tipo, siempre y cuando no se produzcan lesiones debido a su acción blanqueadora. Durante muchos años se ha utilizado el NaOCl como un esterilizante superficial en los tejidos de las plantas (Wilson, 1915). Se supone que tiene la ventaja de que se enjuaga más fácilmente de las superficies después de la esterilización y así se eliminan los residuos oxidantes indeseables. A causa de la indeseable alcalinidad de cualquier hipoclorito residual, en algunas situaciones podría ser útil un enjuague rápido con agua acidulada (HCl en una solución muy diluida y en cantidad suficiente para neutralizar cualquier exceso de bases). Como esterilizante superficial también se utiliza la solución

de bicloruro de mercurio (HgCl2). Sin embargo, este producto es altamente tóxico y se debe utilizar con mucha cautela; generalmente, basta con una solución acuosa entre 0.1% a 1.5% (p/v) y una exposición de 3 a 10 minutos para que la esterilización tenga efecto. El problema principal del bicloruro de mercurio no sólo es su naturaleza altamente venenosa y corrosiva, sino la dificultad para removerlo mediante el enjuague; a pesar de esto, tiene su valor en la esterilización (Yao et al., 1981). 4.5.4. PROCEDIMIENTO PARA LA ESTERILIZACIÓN. El calor es uno de los agentes que se utiliza con más frecuencia en la esterilización. Se puede usar en forma de llama directa, de calor húmedo (vapor) o de calor seco (aire caliente); cuando se utiliza el calor húmedo, puede ser en forma de vapor abierto o de vapor bajo presión. Ocasionalmente se puede usar agua caliente pero no hirviendo. Como es bien conocido, el éxito en el logro de esterilidad en cualquier preparación depende de muchos factores, como son la naturaleza de la sustancia que se esteriliza, el volumen contenido en cada unidad, el tamaño del recipiente y el número de unidades que se pueden manejar en una sola operación. Por consiguiente, no se pueden dar instrucciones específicas relacionadas con el método de esterilización que se utiliza para una preparación individual; en contraposición, se presentan sugerencias generales relacionadas con los procedimientos de esterilización (CIAT, 1991). Calor seco. Los recipientes de vidrio secos que se utilizan para operaciones estériles se pueden esterilizar por medio de aire caliente; para el efecto se colocan en una estufa de aire caliente a una temperatura mínima de 170ºC, preferiblemente durante dos horas, pero nunca menos de una hora. El algodón (debidamente envasado) a menudo se esteriliza por intervalos más largos, ya que tiende a contener esporas altamente resistentes; puesto que tanto el algodón como el papel toman un color marrón a temperaturas de 190ºC o superiores, para estos materiales se debe usar una temperatura menor de 170ºC, manteniéndolos bajo ella por lo menos durante una hora. Es obvio que todos los materiales esterilizados mediante calor seco deberán estar limpios, e incluso libres de trazas de materia orgánica (CIAT, 1991).

Vapor bajo presión (autoclave). El vapor bajo presión es muy eficiente para destruir todas las formas de bacterias y hongos y sus esporas, y es el método más utilizado para esterilizar diferentes materiales incluyendo los medios de cultivo (siempre y cuando no contengan componentes termolábiles). El autoclave más utilizado actualmente en el laboratorio es la contraparte de mayor tamaño de la olla de presión común. Al utilizarlo, es necesario extraer todo el aire antes de empezar el proceso de esterilización ya que, a presiones iguales, la temperatura de una mezcla de aire y vapor no es tan alta como la del vapor puro; la extracción del aire se logra automáticamente al permitir que el vapor expulse el aire del aparato, antes de cerrar la válvula correspondiente. La temperatura dentro del autoclave se regula mediante la presión y es

directamente proporcional a ésta. La presión se lee en un manómetro que forma parte del autoclave.Para esterilizar los materiales relacionados con el cultivo de tejidos se acostumbra usar una presión de 15 libras por pulgada cuadrada durante 20 minutos; a esta presión, la temperatura del vapor es aproximadamente 121ºC, suficiente para matar virtualmente todas las formas de vida en cinco minutos. Sin embargo, se debe recalcar que el tiempo de exposición requerido dependerá tanto del tipo del material que se va a esterilizar como de su cantidad. Si se desea que la esterilización sea completa, el calor debe penetrar en cada porción del material; ninguna sustancia es estéril si queda en ella un organismo viable o espora. La siguiente es una guía para presiones variables: (CIAT, 1991).

Cuadro 1. Relación entre presión, temperatura y tiempo de autoclaveado, cuando el autoclave tiene presión variable PRESIÓN (LIBRAS POR PULGADA CUADRADA) 10 15 20

Para las operaciones mayores se recomienda colocar detectores de esterilización en diferentes puntos dentro del autoclave o dentro de la masa de material que se trata, para asegurarse de que todas las partes han alcanzado la temperatura deseada (CIAT, 1991).

TEMPERATURA(˚C)

TIEMPO (MINUTOS)

115.5 121.5 126.5

30 20 15

El tiempo de esterilización (a presión constante de 15 libras por pulgada cuadrada) depende del volumen del medio a esterilizar, como guía se sugiere la siguiente tabla: (CIAT, 1991).

Cuadro 2. Tiempo mínimo de autoclaveado según volumen de medio de cultivo. VOLUMEN DE MEDIO (MILILITROS)

TIEMPO MÍNIMO DE AUTOCLAVEADO (MINUTOS

100

250

500

1000

2000

4000

Calor húmedo a 100 º C. Con este método probablemente sea suficiente una sola exposición de 15 minutos al calor vivo (100ºC) para matar todas las formas vegetativas microbianas. Sin embargo, así no se matan necesariamente todas las formas de esporas y puede ser práctico, por consiguiente, efectuar la esterilización intermitente, siempre y cuando se disponga de cierto equipo. En este caso, la exposición puede ser de 30 a 60 minutos y se repite diariamente durante tres días consecutivos, conservando el material a la temperatura del cuarto o en una incubadora entre una exposición y otra. Teóricamente la primera exposición destruye todas las formas microbianas; durante las próximas 24 horas, generalmente germinan las esporas convirtiéndose en formas vegetativas que mueren en la segunda exposición; la tercera exposición es simplemente un medio de prevención para destruir las esporas vivas que hayan podido tener una germinación lenta. A veces, el procedimiento se modifica utilizando temperaturas inferiores a la del agua hirviendo y aumentando el número de las exposiciones hasta cuando haya una seguridad razonable de esterilidad. Se utilizan temperaturas de 60 a 80ºC y se repiten sucesivamente las exposiciones durante 4 a 7 días. Este método del calor húmedo a 100ºC, conocido como “método de Koch” se utiliza en la esterilización de medios que contienen componentes capaces de soportar la exposición a temperaturas de vapor vivo, pero no a las temperaturas mayores que tiene el vapor bajo presión. No obstante, este método no está exento de problemas; las esporas pueden no desarrollarse en las soluciones no nutritivas como el agua corriente, por lo cual se recomienda reemplazarlo, cuando sea posible, por el método de filtración. Sin embargo se menciona, incluso en este caso, como una alternativa cuando no se dispone de las instalaciones o medios para esterilizar por filtración (CIAT, 1991). Filtración. La esterilización de líquidos va acompañada rutinariamente de la filtración a través de filtros especiales a prueba de hongos y bacterias. Es claro que los filtros y otros aparatos se deben esterilizar antes de tratar de utilizarlos para remover los contaminantes de un líquido. Obviamente el tamaño del poro es el principal factor en la capacidad de retención de bacterias de estos filtros; otros factores que afectan la penetrabilidad del filtro por los microorganismos son el pH, la carga eléctrica del

material filtrado, la temperatura, la presión y la duración del procedimiento de filtración así como el efecto de la absorción de proteínas y otras sustancias en el filtro. También puede haber contaminación en el filtrado a causa de una presión excesiva en el filtro o de fugas de las líneas al vacío cuando se utiliza presión negativa. En el mercado se encuentra una amplia gama de aparatos de filtración entre los cuales está el “Millipore”. Se encuentran disponibles además, los filtros desechables que, aunque costosos, pueden ahorrar tiempo y son preesterilizados (CIAT, 1991). 4.5.5. ASEPSIA. La asociación explante-medio y las condiciones físicas en que normalmente se incuban los cultivos conforman un ambiente propicio para la proliferación de microorganismos (bacterias, hongos), los cuales pueden destruir tales cultivos, competir con el explante por el medio de cultivo o modificarlo. Evitar las contaminaciones con microorganismos es un aspecto básico que se debe tener en cuenta para el éxito, no solamente en el establecimiento de los cultivos sino en su ulterior incubación y manipulación. Es difícil lograr cultivos completamente estériles en el estricto sentido de la palabra; por ejemplo, es probable que los virus presentes en el explante persistan en los cultivos. Hecha esta salvedad, para establecer cultivos asépticos es conveniente o necesario: a) trabajar en ambientes adecuados; b) esterilizar los medios de cultivo; c) desinfectar superficialmente los explantes, liberándolos de bacterias y hongos exógenos y d) realizar los cultivos respetando ciertas normas de asepsia. Existe una vasta gama de compuestos químicos que se pueden utilizar como desinfectantes para los explantes, pero en la actualidad es casi generalizado el empleo de etanol (70% v/v) y de hipoclorito de sodio (NaOCl) del 1% al 3% contenido en productos de uso doméstico (Clorox®, Magia Blanca®, etc.). Con menor frecuencia se usan el hipoclorito de calcio [Ca(Ocl)2, 6% a 12%] y el cloruro de mercurio (HgCl2, 0.1% a 1.5%), aunque hay que recalcar que este compuesto es altamente tóxico y que no es fácilmente removible del explante. En algunos casos resulta útil el agregar algún agente tensoactivo (por ejemplo, Tween-20, del 0.001% al 0.1%; es decir, unas dos a tres gotas por cada 50 ml), pero puede ser innecesario en los procedimientos de desinfección que incluyan un primer paso con etanol al 70%. Asimismo, es conveniente agitar (80-150 rpm)

el explante conjuntamente con la solución desinfectante. Después de tratar el explante con las soluciones desinfectantes, es necesario remover de él los restos del producto, mediante varios lavados con agua destilada estéril y operando en la cámara de flujo laminar o cámara de transferencia. Es aconsejable lavar los explantes con un volumen por lo menos 10 a 20 veces mayor de agua estéril haciendo un mínimo de tres enjuagues sucesivos. El procedimiento para la desinfección superficial de los explantes debe permitir eliminar los microorganismos con el menor daño posible para los explantes. No es factible recomendar un procedimiento general para este propósito, y se deben considerar de manera especial las especies vegetales y el tipo de explante. En el cuadro 3 se incluyen varios procedimientos utilizados para la desinfección de explantes. Es interesante observar que, si bien en ocasiones se emplea sólo etanol o solamente NaOCl, lo más frecuente es la utilización de ambos; es decir, una inmersión (generalmente de corta duración) en etanol al 70%, seguida de una en NaOCl y de varios lavados con agua estéril (George, 1993). Otros procedimientos incluyen una doble desinfección, como ocurre con el cultivo de hojas jóvenes del maní (Arachis hypogea) (Mroginski et al., 1981c). En este caso las semillas se sumergen en etanol al 70% (10 segundos), luego en NaOCl al 1.2% (10 minutos) y después se lavan con agua destilada estéril; luego se retiran de ellas las hojas jóvenes para los cultivos. Un procedimiento similar se utilizó en arveja (Pisum sativum) (Mroginski et al., 1981b). Algunos procedimientos emplean la preincubación de los explantes. En el caso de las hojas del café, se desinfectan con Ca(OCl)2 al 1% (15 minutos), se lavan con agua estéril y se cortan en pequeños trozos que se incuban en una solución salina (sales de Murashige et al, 1962, diluidas a la mitad) y sacarosa. Al cabo de 48 horas se seleccionan los explantes no contaminados y que mantienen la coloración normal, para establecer los cultivos (Sondahl et al, 1979). Litz et al. (1979) emplearon un procedimiento similar para la desinfección de pecíolos de Carica stipulata. Los ápices caulinares del manzano utilizados en micropropagación se desinfectan levemente, se incuban por 24 horas en el medio de cultivo, se desinfectan de nuevo y se cultivan (Jones et al, 1977).

Los explantes provenientes de vegetales que crecen en invernaderos o en cuartos climatizados son relativamente más fáciles de desinfectar que los provenientes de plantas que crecen en el campo; también es más fácil la desinfección de explantes de órganos jóvenes que la de explantes provenientes de materiales adultos. El uso de fungicidas o bactericidas, aplicados previamente a las plantas, puede ser de utilidad (George, 1993). 4.5.6. ANTIBIÓTICOS. Los antibióticos aplicados al medio de cultivo pueden ser de utilidad para la desinfección de los explantes. Sin embargo, en general, su empleo solamente se justifica en casos de excepción y en cultivos de corta duración, ya que la alta especificidad de los antibióticos implica que no previenen la proliferación de todos los microorganismos. Además, tales productos modifican la composición del medio de cultivo y pueden ser metabolizados por los explantes. Los antibióticos pueden ser efectivos, rociados sobre las plantas madre, en reducir el nivel de contaminación (George, 1993). Algunos ejemplos de antibióticos que han sido utilizados para la eliminación directa de microbios del material usado como explante son: • 0.15% de estreptomicina + 0.01% de mertiolate agregado a una solución de NaOCl al 4% para la desinfección superficial de frutos de Euterpe (12 horas de exposición) (Guerra y Handro, 1988). • 100 µg/l de una mezcla de penicilina/estreptomicina por 15 minutos bajó la contaminación en ápices de árboles de melocotón en crecimiento activo a niveles más bajos que los logrados con NaOCl. Ápices tomados al inicio de la etapa de crecimiento fueron dañados por los antibióticos (Hammerschlag, 1980, 1982a). • 17% de Alcide por una hora, seguido por el antibiótico rifampicina (50 µg/ml) fue el mejor tratamiento para remover contaminantes superficiales de tallos y nudos de la madera dura tropical, Nauclea (Mathias et al, 1987). En los cuadros 3 y 4 se muestran algunos ejemplos de los procedimientos que se usan para la desinfección de explantes y soluciones desinfectantes usadas en la preparación de explantes.

Cuadro 3. Algunos ejemplos de los procedimientos que se usan para la desinfección de explantes. (Fuente: George, 1993). PARTE VEGETAL

EXPLANTE

ESPECIE

DESINFECTADA

CULTIVADO Meristemo

ETANOL 70%

NaOCl

REFERENCIA

(seg.)

(%)

(min.)

Lycopersicum esculentum

1.2

Kartha, 1977

Ápices

Meristemo

Manihot esculenta

0.8

Rey, 1978

Caulinares

Hoja joven

Ilex paraguariensis

2.0

Rey, no publicado

Antera

Arachis hypogaea

0.8

Mroginski, 1979

Antera

Oryza sativa

Oono, 1981

Ovario

Paspalum almum

0.8

Bovo, 1983

Óvulo

Carica papaya

2.0

Litz, 1981

Inflorescencias

Frutos Hojas Semillas

Nucela

Citrus spp.

0.5

Evans, 1981

Lam. foliar

Stylosanthes guianensis

1.2

Mroginski, 1981a

Lam. foliar

Lycopersicon esculentum

1.2

Kartha, 1976

Cotiledón

Lotononis bainesii

1.6

Bovo, no publicado

Meristemo

Coffea arabica

1.2

Kartha, 1981a

Tallo

Médula

Nicotiana tabacum

2.0

Reinert, 1982

Raíz

Raíz Tuberosa

Daucus carota

2.0

Reinert, 1982

Cuadro 4. Otros ejemplos de soluciones desinfectantes usadas en la preparación de explantes. CONCENTRACIÓN EXPOSICIÓN (%)

MATERIAL

(min)

PARTE DE UNA

REFERENCIA

SECUENCIA O TRATAMIENTO?

NaOCl

0.26

Yemas de Anthurium

Kunisaki (1980)

0.50

Inflorescencias jóvenes de Typha

Zimmermann y Read (1986)

0.53

Yemas de Populus

Garton y Moses (1986)

0.53

Yemas de Trillium

Pence y Soukup (1986)

0.53

Ápices y nudos de Sophora

No*

Froberg (1986)

0.8

Brotes de Elaeagnus

No*

Economou y Spanoudaki (1988)

0.53

15-20

0.5

1.6

1.5

Sí

Bennet (1987)

Nudos con yemas de Persea

Sí

Cooper (1987)

Tejidos subterráneos

Duncan y Lineberger (1981)

Yemas de coníferas

Sí

Kurz (1986)

1.05

Semillas sin testa de Corylus

Sí

Pérez et al, (1985)

Ca(OCl)2 2.75

Hojas de Armoracia

Sí

Gorecka (1987)

Semillas sin pericarpio de Quercus

Sí

Bellarosa (1988)

0.16-14 h

Semillas de orquídeas

Van Waes y Debergh (1986)

Yemas de árboles forestales

Sí

Chalupa (1979)

Raíces de Stangeria

Sí

Osborne y Van Staden (1987)

0.05

Yemas dormantes de manzana

Sí

Hennerty et al, (1988)

Nudos de Simmondsia

Jacoboni y Standardi (1987)

0.1

Cormos de Crocus

Homes et al, (1987)

0.05

Segmentos de brotes de Pinaceae

Sí

Gupta y Durzan (1985)

0.1

Yemas florales de Echinochloa

Wang y Yan (1984)

0.1

Brotes de Eucalyptus crecidos en campo

Lakshmi Sita y Shoba Rani (1985)

0.2

Semillas de alfalfa

Secciones de nudo de Quercus

HgCl2

* = Planta madre tratada con antibióticos.

Brown (1988)

4.6. CONSERVACIÓN DE GERMOPLASMA. El material vegetal es conservado para futuro insumo, y como fuente para posterior propagación. Reservas son necesarias con los siguientes objetivos: • Plantarlas cuando las condiciones son favorables o haya una renovada demanda del cultivo. • Conservar stocks de especies o variedades hortícolas de interés. • Para retener genotipos hasta que sean necesitados en programas de fitomejoramiento. • Para preservar el mayor rango posible de genes (germoplasma) para posible uso en el futuro (especies, variedades, cultivares o ecotipos). • Para hacer intercambio de germoplasma en forma “segura” entre países (George, 1993). 4.6.1. TÉCNICAS PARA LA CONSERVACIÓN IN VITRO DE GERMOPLASMA. A. Conservación a corto plazo a. Desecación de embriones de semillas Desde 1982, muchos investigadores se han dedicado a desarrollar métodos por medio de los cuales los embriones somáticos puedan ser sembrados directamente en el suelo, pero ha habido éxito limitado en sembrar embriones deshidratados, o embriones rodeados por una cápsula protectora (George, 1993). Intentos de inducir dormancia en embriones somáticos encapsulados han incluido el uso del ácido abscísico (ABA) y deshidratado. Embriones no deshidratados han sido almacenados por períodos cortos, pero se ha encontrado que embriones deshidratados de varias plantas tienen un período de vida relativamente corto. Gray (1987b); por ejemplo, encontró que cuando embriones de grama fueron deshidratados hasta un 13% de contenido de agua, el 18% germinó después de 7 días, pero solamente un 4% después de 14 días. Sin embargo, embriones de Medicago sativa madurados

en presencia de ácido abscísico y deshidratados hasta un contenido de humedad de entre 8-15%, permanecieron completamente viables a humedad y temperatura ambiente por 12 meses (Redenbaugh et al., 1991). Embriones deshidratados pueden sobrevivir por períodos de tiempo más largos si son encapsulados con una cubierta de polímero (Kitto y Janick, 1985a,b). B. Conservación de corto a mediano plazo. Tomando las debidas precauciones, el genotipo de plantas propagadas por nudos o cultivo de brotes puede ser preservado sin cambios. Este tipo de cultivo in vitro puede, por lo tanto, ser usado para mantener genotipos por largos períodos. Sin embargo, el costo y riesgo de pérdidas por contaminación o errores es alto. Afortunadamente se han desarrollado métodos para reducir la tasa de crecimiento del material cultivado y así poder conservarlo, sin atención, por un moderado período de tiempo. Las especies varían en tiempo durante el cual los cultivos pueden ser conservados: períodos entre 6 y 24 meses son frecuentemente descritos. Brotes individuales, grupos de brotes no enraizados, embriones somáticos o plantas enraizadas son factibles de conservar. La conservación de plántulas es frecuentemente la más satisfactoria (George, 1993). Hay varias técnicas por medio de las cuales la vida de los cultivos de tejidos u órganos puede ser extendida, éstas técnicas se conocen como técnicas de mínimo crecimiento. Entre éstas técnicas se encuentran las siguientes: a. Libre crecimiento Es la técnica más simple, consiste en dejar que los cultivos crezcan libremente en el cuarto de crecimiento. Su crecimiento disminuye conforme el medio es consumido: brotes o tejidos se mantienen vivos hasta que se deshidratan; o hasta que el medio se agota o se convierte en tóxico. Gunning y Lagerstedt (1986) registraron los siguientes tiempos de conservación: • • • •

Mentha spp. 6-13 meses. Rubus spectabilis 12-15 meses. Mora 13-16 meses. Vaccinium ovatum 17 meses.C

b. Control de temperatura y luminosidad. Los intervalos entre transferencias pueden, a menudo, ser reducidas manteniendo los cultivos en luz débil (o en oscuridad) y a una temperatura menor a la óptima para crecimiento activo. La preferencia de luz u oscuridad y el uso de la temperatura más adecuada para la conservación, depende del genotipo. c. Conservación a baja temperatura

Brotes y plántulas. Brotes y plántulas de muchas especies han sido reportadas como conservadas exitosamente a temperaturas cercanas al congelamiento, por ejemplo: puntas de brotes de manzana, a temperaturas entre 1 a 4oC, se han conservado durante un año en oscuridad, dando buenas tasas de proliferación de brotes cuando se regresaron a 26ºC. Cultivos que contienen brotes iniciados directamente de Pinus radiata pudieron ser almacenados por al menos, 8 meses a 2oC y reasumieron su crecimiento normal cuando se les retornó a entre 23 y 27ºC; de papa pudieron ser conservados a 3oC durante 1 año; Drosera se pudo conservar 18 meses cuando se conservó entre 1 y 8oC; Prunus se pudo conservar durante 10 meses cuando se puso a –3 o C y en oscuridad; Populus se conservó entre 1 y 2 años cuando se colocó entre 3 y 4oC y en oscuridad; Chrysanthemum se conservó durante 6 meses a una temperatura de 2oC; Trifolium repens se conservó durante 10 meses a una temperatura de 5oC y en oscuridad (George, 1993). Embriones somáticos. Embriones somáticos pueden ser conservados a temperaturas justo debajo del congelamiento. Santalum album y coníferas se han reportado conservadas durante 45 días a 4o. Embriones somáticos de zanahoria se pueden conservar, por al menos 120 días a 10oC sin efectos deletéreos (George, 1993). Callos. Callos de Lithospermum erythrorhizon, Phytolacca americana y Bupleurum falcatum fueron conservados durante 6 meses a 4ºC, mientras que callos de tabaco fueron conservados durante 2 meses a 4ºC (George, 1993).

d. Conservación a altas temperaturas. Cultivos de brotes y plántulas de algunas plantas de zonas templadas, y muchas especies tropicales y subtropicales, pierden su viabilidad si se almacenan a bajas temperaturas. Para muchas de estas especies un mínimo crecimiento es mejor cuando se conservan entre 14 y 20oC. Cultivo de brotes de camote se deterioran a temperaturas menores de 20oC y son beneficiados cuando son iluminados entre 500 y 1000 lux. Una colección internacional de germoplasma de Musa spp. se mantiene como cultivo de brotes a 15oC bajo una iluminación de 1000-2000 lux, pudiéndose conservar entre 13 y 17 meses, dependiendo del genotipo. Cultivos de Musa mueren en 6 semanas si se mantienen a 5ºC, y dentro de 3 meses a 10ºC. Algunas plantas leñosas que son tolerantes al frío durante la etapa de descanso, requieren relativamente altas temperaturas para la conservación de brotes vegetativos. Cultivos de brotes de Actinidia chinensis pueden ser conservados en oscuridad por 1 año a 8oC; almacenado a 4ºC fue menos exitoso. Se ha encontrado que brotes de Vitis mantienen su viabilidad por al menos 11 meses entre 9 y 12oC en un medio diluido, la sobrevivencia no fue satisfactoria a 2 o 7 º C. Remolacha y papa son ejemplos de plantas de clima frío que se conservan mejor a temperaturas intermedias. Plantas de papa solamente requieren subcultivos a intervalos de cada 18 semanas si se mantienen a 12oC. Cultivo de brotes de papa y de especies emparentadas han sido mantenidas a entre 6 y 10oC hasta por 1 año. La temperatura mínima es crítica y varía de acuerdo al genotipo; a 2ºC hay muy pobre sobrevivencia (George, 1993). e. Reducción de la tensión de oxígeno. Colocar los cultivos en un ambiente con una baja presión parcial de oxígeno parece tener potencial para limitar su crecimiento in vitro, y la reducción en la tensión de oxígeno indudablemente tiene un rol para la exitosa conservación de cultivos en recipientes sellados. Una forma muy simple para reducir el suministro de oxígeno en tejidos y órganos es colocarlos en recipientes largos y estrechos, en los cuales la distancia entre el cultivo y el punto de intercambio de gases con la atmósfera externa es máxima. Conforme

la distancia es incrementada, la tasa de crecimiento del tejido decrece y esto permite que la frecuencia de subcultivos sea reducida (George, 1993). f. Alteración de los constituyentes de cultivo.

del medio

Reducción del suministro de carbohidratos y nutrientes. El crecimiento de un cultivo disminuye conforme los constituyentes del medio son utilizados; pero un medio gastado, el cual puede contener productos tóxicos y tener un pH desfavorable, no puede ser un substrato ideal para conservar brotes o plántulas por un período considerable. Cultivos de brotes de café pueden ser conservados efectivamente durante 2 años a 26ºC, con un fotoperíodo de 16 horas de luz (7500 lux) en un medio MS modificado a la mitad de su concentración sin sacarosa. La yuca fue mejor conservada al mantenerla entre 20 y 22ºC en un medio con 20-40 mM de nitrógeno (iones de nitrato y amonio) y 4% de sacarosa. El crecimiento de embriones somáticos es inhibido por la ausencia de azúcar (George, 1993). Reducción del suministro de nutrientes inorgánicos. El crecimiento restringido de plántulas de café puede deberse en parte, al reducido suministro de sales inorgánicas. Experimentos en tomate mostraron que al subcultivar brotes de tomate, se formaron raíces; pero el crecimiento de brotes fue considerablemente reducido cuando fueron puestos en un medio •'5f MS con 5% de sacarosa. La reducción en crecimiento fue causado por la baja concentración de sales, debido a que brotes en un medio MS completo fue cuatro veces más alto. Una significante reducción en crecimiento de plántulas de clavel requirió la reducción en el nivel de las sales MS a 25 o 50% del normal. Las condiciones estándar de un cultivo de brotes de Vitis en un medio MS, modificado para contener una concentración reducida de nitrato de amonio, fueron de 28ºC, 35-40 mol m-2s-1. Nudos subcultivados de tres especies sobrevivieron mejor cuando la cantidad de NH4NO3 agregada al medio MS fue 6-25% de la normal. Los cultivos fueron suplidos con 3% de sacarosa y 1 µM BAP (George, 1993).

Cambios en el potencial osmótico. Conforme la concentración de un medio alto en sales es incrementada arriba de un 4-5%, la sacarosa empieza a tener un efecto inhibitorio, pero no tóxico, sobre el crecimiento de las células de las plantas. Niveles altos de sacarosa pueden, por lo tanto, ser usados para mantener cultivos en una condición dormante por largos períodos. Esto parece ser un efecto osmótico debido a que se ha demostrado que el manitol (200-385 mM), agregado al medio de cultivo, crea una solución hipertónica que puede prevenir la muerte rápida de células que, de otra forma, ocurre cuando células que requieren auxina son cultivadas en un medio sin auxina. Algunos autores sugieren que el manitol es capaz de preservar la integridad de la membrana y prevenir la pérdida de solutos. Agregando 1-4% de manitol a un medio, mejoró la viabilidad de brotes de Cinchona ledgeriana almacenados a 12ºC, a pesar de que a entre 26 y 28ºC fue inhibitorio. El azúcar en altas concentraciones previene el crecimiento de embriones somáticos. Se ha reportado la conservación de cultivos de algunas plantas leñosas de forma más satisfactoria en medio líquido que en sólido. En contraste, en cultivos de brotes de mora “Merton Thornless”, Mentha x dunetorum, Vaccinium ovatum y V. uliginosum se encontró que retuvieron mejor su viabilidad en un medio con 8 o 10 g/l de agar, que en un medio con 6 g/l. Varias plantas leñosas australianas sobrevivieron mejor en un medio gelificado con Gelrite, en lugar de agar, particularmente cuando los cultivos fueron mantenidos a 22oC, el pH del medio fue decreciendo progresivamente conforme fueron mantenidos los cultivos por más tiempo (George, 1993). Uso de reguladores del crecimiento. Normalmente son agregados reguladores del crecimiento al medio de cultivo para promover y regular el crecimiento de las plantas in vitro. El retiro de éstos químicos puede ayudar en el almacenamiento de ciertas plantas. Dos cultivares de fresa continuaron proliferando cuando se mantuvieron a temperaturas normales, a pesar de que los cultivos fueron transferidos a un medio sin reguladores del crecimiento, cuando se produjeron brotes delgados con pecíolos largos y los cultivos permanecieron viables por más de 5 meses. Algunos tratamientos químicos pueden ayudar a reducir el crecimiento de los cultivos in vitro, por ejemplo:

• actuando directamente para inducir la dormancia de órganos, reducir el metabolismo celular o prevenir la división celular o nuclear. • haciendo que las células sean menos susceptibles al frío. Esto puede permitir que los cultivos sean almacenados por períodos largos a bajas temperaturas (posiblemente permitiendo reducir la temperatura del almacenaje).

El regulador del crecimiento ácido abscísico (ABA) (y algunos otros compuestos con estructura relacionada), es capaz de inducir dormancia en los meristemos de las plantas. En Carum, se encontró que 0.1 mM de ABA detuvieron el crecimiento de embriones somáticos en etapas tardías. Embriones formados en cultivos en suspensión permanecieron dormidos cuando el ABA estuvo presente, pero continuaron creciendo y desarrollando una vez fue removido. El almacenamiento de cultivos embriogénicos en un estado de dormancia inducida, por lo tanto, provee otro método por medio del cual pueden preservarse genotipos de plantas in vitro. Embriones somáticos pueden ser almacenados durante muchas semanas en un medio que contenga ABA sin germinar o deteriorarse. Agregando bajas concentraciones de ABA al medio se incrementa la viabilidad de esquejes de un solo nudo de papa almacenado a 8-10ºC. Sin embargo, este regulador tuvo un efecto detrimental sobre la viabilidad cuando fue combinado con altas concentraciones de sacarosa y baja temperatura. A una concentración de 10mM, el retardante del crecimiento clormequat (CCC) puede prolongar la vida de algunos cultivos de brotes. La tolerancia al químico es muy específica. Cultivos de brotes de Prunus avium, los cuales fueron mantenidos en obscuridad a 0.5 º C, se recuperaron más efectivamente cuando se le agregó al medio 0.2 mg/l de paclobutrazol durante el almacenamiento. Agregando 50 mg/l de daminozide a cultivos de brotes de papa, éstos fueron exitosamente almacenados durante dos años a 10ºC en sales de similar concentración a los del medio MS (George, 1993). Combinación de tratamientos. El crecimiento mínimo puede ser efectivamente inducido mediante la combinación de tratamientos. Por ejemplo, cultivos de brotes de plantas madre de

Pelargonium fueron mantenidos a 12ºC en un medio sin reguladores del crecimiento. La sobrevivencia de cultivos de brotes de papa a temperaturas frías es mejorada agregando ABA (5-10 mg/l), alta sacarosa (hasta 8%) y/o manitol (3-6%) al medio y el período de almacenamiento puede ser extendido al menos 57 meses. Se ha podido almacenar satisfactoriamente ápices de brotes de papa en un medio MS con 0.5% de sacarosa y 220 mM de manitol. EL incremento del volumen del medio puede resultar en un incremento en la sobrevivencia del material vegetal después de largos períodos de almacenamiento (George, 1993). C. Conservación a largo plazo. A pesar de que el almacenamiento con mínimo crecimiento puede ser usado para mantener colecciones de material vegetal clonal, es claro que no es una técnica ideal para almacenamiento a largo plazo de plantas de alto valor genético, debido a que las colecciones necesitan atención frecuente. Las semillas secas permanecen dormantes debido a que las células vivas son metabólicamente inertes cuando se les priva de agua en la fase líquida. Las reacciones bioquímicas que cuales dependen de la presencia de agua son entonces suspendidas, especialmente si las semillas son también almacenadas a baja temperatura. Los embriones de semillas almacenados a baja humedad (cerca del 5%) retienen su viabilidad por largos períodos, el período de almacenamiento efectivo puede ser extendido si también se mantienen a baja temperatura (por ejemplo, -20ºC). El almacenamiento de semillas desecadas es ahora ampliamente usada en bancos de germoplasma como un medio efectivo de almacenamiento de un gran número de genotipos de plantas. Sin embargo, para plantas que tienen semillas que no toleran la desecación y para plantas que normalmente son de propagación vegetativa, puede ser claramente deseable tener un método alternativo confiable para almacenar genotipos importantes (George, 1993). a. Crioconservación. Congeladores convencionales son insuficientemente fríos para ser utilizados en el almacenamiento a largo plazo. En criogenia experimental, especímenes biológicos son usualmente almacenados en nitrógeno líquido a menos 196ºC o, menos frecuentemente, en

el vapor arriba del nitrógeno líquido (cerca de -150oC). Intentos de almacenar tejidos de plantas a muy bajas temperaturas se han encontrado con dificultades. Algunas semillas pueden ser criopreservadas exitosamente, pero es más difícil congelar y después recuperar sin causar daños. El éxito solamente resulta de congelar y descongelar rápidamente los especímenes, el almacenamiento debe ser limitado a unas pocas células, pequeños pedazos de tejido o pequeños órganos. Técnicas de asepsia y contenedores estériles deben ser usados en todos los procesos. Células compactas y con citoplasma denso (como las células meristemáticas de crecimiento activo), tienen un mayor potencial de sobrevivencia que las células largas, de paredes delgadas y altamente vacuoladas, las cuales son más susceptibles al daño por hielo. Esto ha sido demostrado en varias especies, por ejemplo: zanahoria, sicómoro, clavel y papa andina. El principal objetivo de los protocolos de crioconservación es cambiar el estado físico del agua dentro de las células a condiciones congeladas (como vidrio) pero sin cristalización. La transformación del agua de líquido a una fase sólida (como vidrio) es llamada vitrificación. Varias precauciones deben ser tomadas durante el congelamiento y descongelamiento para prevenir la aparición de cristales de hielo intracelular. Entre los crioprotectores más comúnmente utilizados podemos mencionar los siguientes: dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, manitol, sorbitol y polietilenglicol (PEG), ya sea solos o en combinación. El DMSO es el más popular, pero puede ser tóxico a altas concentraciones. Concentraciones de entre 5-15% son comúnmente usadas para congelamiento lento de meristemos de brotes apicales. Un crioprotector eficiente debe tener las siguientes propiedades: • • • • •

no tóxico. peso molecular bajo. debe fácilmente mezclarse con agua. habilidad de permear las células rápidamente. habilidad de ser lavado fácilmente de las células.

Los tejidos más frecuentemente utilizados en la crioconservación son los siguientes: suspensiones celulares, callos, ápices, meristemos, semillas completas, embriones de semilla, embriones somáticos, anteras y polen (George, 1993). Entre las técnicas de crioconservación más utilizadas tenemos las siguientes:

Congelamiento lento Un método efectivo de crioconservación es enfriar el material a ser congelado a ultra-baja temperatura (–30ºC y –60ºC) de forma controlada, antes de introducirlo en nitrógeno líquido. El enfriamiento lento da un incremento en la deshidratación celular, la cual progresivamente concentra los constituyentes celulares y disminuye su punto de congelamiento (George, 1993). Enfriamiento por pasos. Como una alternativa al preenfriamiento gradual lento, los especímenes tienen que ser tratados con crioprotectores químicos y sujetos a una serie de temperaturas a bajo de cero (cada una progresivamente más baja que la anterior), antes de ser introducidos en nitrógeno líquido. Por ejemplo, células de cultivos en suspensión de Acer pseudoplatanus en glucosa al 5% y 12% de DMSO fueron mantenidos durante 3 minutos en cada una de las siguientes temperaturas: -10, -15, -20, -30 y –40ºC, antes de ser colocadas en nitrógeno líquido. Un protocolo para crioconservación de meristemos apicales de Trifolium repens involucran el congelamiento a –7ºC a 0.5ºC por minuto, después a –40ºC a 0.3ºC por minuto, antes de que los especímenes sean puestos en nitrógeno líquido (George, 1993). Congelamiento rápido. El alto costo de los aparatos necesarios para controlar las tasas de enfriamiento lento ha limitado la aplicación de la crioconservación a pocos laboratorios especializados. Sin embargo, células que tienen un citoplasma denso y un contenido relativamente bajo de agua, pueden ser preservados si son enfriados lo suficientemente rápido para que el contenido de agua interno sea directamente vitrificado sin previo enfriamiento lento. Así, pequeños meristemos de plantas han sido algunas veces almacenados en una condición viable cuando han sido enfriados en el vapor sobre el nitrógeno líquido (tasa de enfriamiento de 10ºC por minuto) y sumergidos en nitrógeno líquido (tasa de enfriamiento de 300 a 1000ºC por minuto). La tasa de enfriamiento que puede ser alcanzada por éstos métodos, cuando grandes muestras son puestas en contenedores de pared delgada, es insuficiente para prevenir el daño celular. Tejidos con alto contenido de agua son dañados

por éste tratamiento. Experimentos recientes han mostrado que muestras de pequeñas plantas pueden ser transferidas inmediatamente a menos 196oC sin daño, proveyendo a sus tejidos de crioprotectores químicos, y puestos en un contenedor, como por ejemplo: pajilla plástica, la cual presenta una mínima interferencia a la transferencia de calor (George, 1993). 4.7. MARCADORES BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES.

En estudios de biodiversidad de microorganismos, plantas y animales en colecciones vivas, la caracterización se hace para caracteres morfológicos, que son de interés para los usuarios de las colecciones. Sin embargo, esta metodología tiene algunas limitantes por ejemplo, los caracteres altamente heredables generalmente muestran poca variación, aún y cuando se evalúe una gran cantidad de materiales, y por otra parte, la expresión del carácter está sujeta a la variación ambiental y puede ser difícil de medir. Estas limitaciones han motivado el desarrollo de técnicas bioquímicas y moleculares. En el primer caso se puede mencionar, por ejemplo, el uso de isoenzimas y electroforesis, y en el segundo, análisis de polimorfismo direc-tamente al nivel de ADN. Los marcadores bioquímicos y moleculares están siendo usados en muchos aspectos de la conservación y caracterización de la biodiversidad. Entre otros usos, pueden señalarse estudios básicos de taxonomía, variabilidad genética en poblaciones y la caracterización y mejoramiento de colecciones y germoplasma. Actualmente se han establecido esquemas de mejoramiento que permiten aprovechar los marcadores moleculares como genes indicadores a través de ligamiento, facilitando la transferencia de genes de especies silvestres a variedades comerciales. El mismo esquema es utilizado también en la aceleración de los programas de mejoramiento, haciendo selecciones tempranas de los materiales favorables. Los marcadores bioquímicos como las isoenzimas y los marcadores moleculares, como las secuencias de ADN, tienen la ventaja de que ocurren de manera natural, no tienen ningún efecto sobre el fenotipo, son en general codominantes y no están sujetos a efectos del ambiente.

4.7.1. MARCADORES BIOQUÍMICOS. Los marcadores bioquímicos se basan en las técnicas de electroforesis, en combinación con métodos citohistológicos de coloración, lo que permite el estudio de isoenzimas, las cuales pueden ser utilizadas como marcadores para revelar la información contenida en un gen. La aplicación de métodos cuantitativos a esta información permite a su vez, el cálculo de diversos parámetros utilizados en la determinación de la estructura genética y reproductiva de una población natural. Las enzimas son proteínas que ejercen una función catalítica específica, es decir, aceleran las reacciones bioquímicas que ocurren dentro de la célula. Las isoenzimas son diferentes formas moleculares de una misma enzima que tienen afinidad por el mismo sustrato. La técnica de la electroforesis consiste en situar un extracto protéico obtenido del tejido de una planta en un medio de soporte, generalmente geles de almidón o poliacrilamida, y someterlo a un campo eléctrico durante varias horas, el cual hace que las diferentes isoenzimas migren en el medio según sus cargas eléctricas. Después de esta operación, el gel se incuba en una solución que contenga tanto el sustrato sobre el que actúa la enzima que se desea separar, como los cofactores necesarios, además de un tinte que se acople al producto de la reacción. Las isoenzimas se visualizan como bandas de color que aparecen en el gel. Los análisis de isoenzimas, aún y cuando son relativamente fáciles de manejar y menos costosos económicamente, tienen algunas limitantes: son regulados a través del desarrollo, es decir, solo serían expresados fenotípicamente en estados específicos del desarrollo y en órganos o tejidos específicos. Además, los caracteres morfológicos pueden tener efectos pleiotrópicos en características de interés. Por otra parte, los marcadores bio-químicos no son tan útiles como los marcadores de ADN, debido al bajo nivel de polimorfismo y el limitado número de loci. 4.7.2. MARCADORES MOLECULARES. Un marcador molecular es un fragmento o secuencia de ADN correspondiente a una característica, y la cual

podemos utilizar para diferentes propósitos, tales como: caracterización y mejoramiento de especies; determinar estudios de biodiversidad y entender la estructura, evolución e interacción de poblaciones, ya sea en microorganismos, plantas o animales. Los marcadores basados en el uso de fragmentos de ADN, permite superar las limitantes de los marcadores bioquímicos, ya que pueden detectarse en cualquier tejido y en cualquier fase de desarrollo, presentan un alto nivel de variación y una cantidad ilimitada de loci. Los marcadores moleculares más usados incluyen el Polimorfismo en el Largo de los Fragmentos de Restricción (RFLP, iniciales de Restriction Fragments Length Polymorphism), Polimorfismo del ADN amplificado aleatoriamente (RAPD, derivado de Randomly Amplified Polymorfic DNA), Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos Amplificados (AFLP iniciales de Amplified Fragment Length Polymorphism) y Mirosatélites (SSR, derivado de Single Sequence Repeat) y Regiones Amplificadas de Secuencias Caracterizadas (SCAR, derivado de Sequence Characterized Amplified Region). A. POLIMORFISMO EN EL LARGO DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN (RFLP). Los marcadores RFLP se basan en el uso de enzimas de restricción. Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas del ADN y lo cortan en los sitios en que éstas se hallan adyacentes. Cuanto más frecuente sea ese sitio de reconocimiento para la enzima, el ADN será cortado con más frecuencia. Los fragmentos de ADN producidos de esta manera pueden separarse por medio de la elec-troforesis, y los fragmentos más pequeños se moverán mas rápidamente en el gel. Cuando el ADN de un organismo superior es digerido por una enzima de restricción, se producen muchos fragmentos de diferentes longitudes que, al separarse a lo largo del gel, formarán una mancha continua, visible cuando el gel se sumerge en una solución de bromuro de etidio y es observado en un transiluminador de luz ultravioleta (Devos et. al., 1993). Un fragmento específico sólo puede detectarse con una sonda apropiada, es decir, con un fragmento de ADN que ya ha sido clonado y que sea homólogo de

aquél que se desea visualizar. Los diferentes fragmentos presentes en el gel se deben transferir a un soporte sólido, donde serán expuestos a una sonda marcada radioactivamente en condiciones que favorezcan la hibridación ADN-ADN. El soporte se usa entonces para exponer una película fotográfica la cual, después de ser revelada, hará visible el fragmento de ADN que se hibridó con la sonda. Utilizando este tipo de sonda de ADN único, puede detectarse un fragmento de rara ocurrencia (uno en un millón o menos frecuente). Las sondas de ADN utilizadas para los RFLPs no necesitan ser homólogas de genes conocidos. Cualquier secuencia de ADN puede servir para los RFLPs, siempre y cuando pueda hibridarse con algunos de los fragmentos producidos después del proceso de restricción (Devos y Gale, 2000). Cualquier cambio ocasionado por mutaciones puntuales en el ADN puede alterar la secuencia de reconocimiento típica de una enzima de restricción, en particular eliminando o creando nuevos sitios de reconocimiento. De manera similar, supresiones o trans-posiciones de grandes fragmentos de ADN pueden originar cambios simultáneos en los patrones de restricción de diferentes enzimas. En consecuencia, una enzima de restricción determinada no cortará el ADN de dos individuos por el mismo lugar. Por tanto, se formarán fragmentos de diferente longitud cuando el ADN de los dos individuos sea cortado por la misma enzima. A causa de su diferencia en longitud, esos fragmentos se localizarán en posiciones diferentes una vez concluidas la electroforesis, la hibridación y la autoradiografía (Hartl y Jones, 1999). Los marcadores de ADN basados en el polimorfismo del largo de los fragmentos de restricción tienen un número ilimitado de loci y muestran un alto nivel de variación. Esta clase de marcadores genéticos, son entonces una valiosa herramienta para establecer las relaciones taxonómicas en plantas y acelerar los procesos de mejoramiento en la transferencia de genes de especies silvestres. Los mismos principios pueden aplicarse en estudios de microorganismos y animales. Sin embargo, tienen algunas limitantes, especialmente su alto costo y el uso de radioactividad. Para superar estas limitantes, se han estado desa-rrollando métodos no radioactivos (Ishii et. al., 1990)

B. RAPD.

Con el surgimiento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), se generaron nuevas técnicas que permitieron superar las limitaciones de RFLP, especialmente los procedimientos de hibridación y uso de sondas. La tecnología de PCR permite la amplificación de fragmentos específicos del total de ADN genómico, basándose en la ADN polimerasa, la cual es capaz de sintetizar una molécula doble de ADN a partir de una cadena simple. El producto de duplicación de la hebra original pasa a ser una segunda hebra para generar otra nueva duplicación. Actualmente se usa la Taq ADN polimerasa, que permite que el ciclo de PCR pueda ser automatizado, ya que es necesario una sola adición de la enzima. La duplicación repetitiva conduce a un incremento exponencial de la acumulación de productos de ADN. La reacción de PCR es conducida por ”primers” o ”iniciadores” que se unen a sus secuencias homólogas, para iniciar la amplificación de la polimerasa. Los primers son secuencias cortas de ADN que son homólogas a los extremos de una secuencia de ADN específica. En algunos casos, estos iniciadores no necesariamente son complementarios a determinadas secuencias, por lo que pueden amplificar cualquier región del genoma donde el iniciador encuentra su secuencia homóloga. En este caso, dado que el producto amplificado no es conocido, los iniciadores se conocen como aleatorios y su uso ha generado nuevos procedimientos basados en PCR (Devos y Gale, 1992). Una de estas técnicas es la conocida como RAPDs (Ramdom Amplified Polymorphic DNA), en la cual primers aleatorios son utilizados para la amplificación de productos de ADN, los cuales son separados en geles de agarosa en la presencia de bromuro de etidio y visualizados en luz ultravioleta. El polimorfismo es detectado por la presencia o ausencia de bandas, las cuales resultan de los distintos puntos en donde el iniciador se une a su región homóloga en el ADN genómico. Algunas de las principales ventajas de este método es que no requiere el uso de sondas ni hibridaciones de ADN. Por otra parte la técnica es rápida, simple y eficiente, demanda pequeñas cantidades de ADN (10 ng por reacción) y requiere únicamente la compra de un termociclador y un aparato de preparación de geles y electroforesis. Su principal

desventaja es la baja consistencia en los resultados, especialmente por la susceptibilidad de la reacción de PCR a la contaminación, sin em-bargo esta limitante puede ser superada, tomando en cuenta todos los cuidados necesarios para uniformizar las condiciones, laboratorio, equipo y personal para la ejecución del trabajo (William et al., 1990). C. AFLP. Los marcadores moleculares AFLPs se basan en la combinación de las técnicas RFLP y RAPD. En el procedimiento, se usa ADN crudo, el cual se corta con dos enzimas de restricción al mismo tiempo, lo que se conoce como doble digestión, para producir fragmentos de ADN que se amplifican usando dos iniciadores especiales, uno de los cuales va marcado con fósforo radioactivo para poder visualizar las bandas en una radiografía. La gran ventaja que presenta esta metodología radica en que se obtiene un número muy alto de bandas y polimorfismos en muy corto tiempo, y a la vez, los polimorfismos son altamente repetitivos. Su limitante estriba en el requerimiento de radioactividad. Su aplicación, al igual que los otros marcadores moleculares es también en la caracterización de germoplasma, estudios de relaciones filogenéticas y mapeo de genes (FAO-OIEA, 2002). D. MICROSATÉLITES (SSR). Se define como microsatélite (SSR) cualquiera de una serie de muy cortas a medianas secuencias repetidas de ADN, distribuidas en grupos, y altamente variables; las cuales se encuentran dispersas en ADN de hongos, plantas, animales y genomas humanos (Kahl, 2001). Secuencias Simples Repetidas (SSR) o microsatélites son una clase de nucleótidos en el ADN repetidos. El número de nucleótidos que se pueden repetir, ya sea dos, tres o cuatro, se arreglan en grupos, que consisten de cinco a diez copias, por ejemplo (AT)29, (CAC)16 o (GACA)32. Los SSRs son abun-dantes en plantas y ocurren en promedio cada 6-7 kilobases (kb). Estas secuencias repetidas están en sus puntos terminales flanqueadas por secuencias de nucleótidos altamente conservadas, de las cuales pueden diseñarse iniciadores (primers) en sentidos opuestos de la dirección de las cadenas de ADN, y consecuentemente estas secuencias repetidas pueden ser amplificadas por PCR. Sus

aplicaciones son amplias, entre las cuales se pueden mencionar: identificación de huellas genéticas, identificación de geno-tipos, mapas genéticos, estudios de biodiversidad, clonación de genes basados en mapas genéticos, etc (FAO-OIEA, 2002). E. SCAR. Las Regiones Amplificadas de Secuencias Caracterizadas -SCAR-(derivado de Sequence Characterized Amplified Region) , como su nombre lo indica, se refiere a la secuenciación de fragmentos de ADN, que pueden ser derivados de cualquier técnica de amplificación de ADN, basada generalmente en PCR, y seguida del diseño de iniciadores (primers) específicos para una determinada banda secuenciada Finalmente, mediante la técnica de PCR, utilizando los iniciadores previamente diseñados, se amplifica la banda de interés, que generalmente está asociada con una característica fenotípica. Entre otras, sus aplicaciones pueden ser, etiquetado de genes, análisis de poblaciones segregantes, diseño de sondas para alelos específicos, estudios de poblaciones y diversidad y selección de características favorables en organismos, asistidas por este tipo de m a r c a d o r m o l e c u l a r ( FA O - O I E A , 2 0 0 2 ) . 4.8. LA INGENIERÍA GENÉTICA. La Ingeniería Genética es una técnica de la Biotecnología que plantea nuevos elementos de análisis a nivel de las moléculas, las células y los tejidos para comprender mejor las características de los organismos, de tal manera que puedan manipularse. También es conocida como Biotecnología Moderna o Tecnología del ADN Recombinante. Se considera como ADN Recombinante el que involucra el reordenamiento in vitro de material genético, mediante la Manipulación Genética Enzimática. La Ingeniería Genética permite la introducción y perpetuación de fragmentos de ADN extraño o ajeno, con un contenido de genes del más diverso origen, en bacterias o más recientemente, en células de organismos superiores mantenidas en cultivo, lográndose en muchos casos el funcionamiento o expresión de este material genético. Tanto la Ingeniería Genética como la biología molecular se están desarrollando actualmente en los distintos ámbitos biológicos, a nivel de microorganismos, vegetales y animales; cuyos objetivos en principio pretenden ser de aplicación benéfica en la salud y la alimentación

humana y animal, como también en el mejoramiento de la agricultura en general. Para el desarrollo de la Ingeniería Genética, se han necesitado previamente avanzar en otras técnicas biotecnológicas, tales como el cultivo de tejidos y el uso de marcadores moleculares, que son herramientas útiles para la aplicación de la tecnología del ADN recombinante. La Ingeniería Genética puede definirse, de una manera general, como la técnica con que se forman artificialmente combinaciones nuevas de material hereditario (ADN, ARN) mediante la inserción de moléculas de ácidos nucleicos (producidas fuera de la célula) dentro de virus, plásmidos bacterianos u otro vector de ácidos nucleicos. Estos vectores incorporan las nuevas moléculas de ácido nucléico dentro de un organismo hospedante, en el cual éstas no se hallan presente en condiciones naturales, pero pueden ser replicadas. En el contexto vegetal, que es donde mas aplicación tiene la tecnología del ADN recombinante, posee un gran potencial para la introducción de características deseables en las plantas. Así por ejemplo, se busca incorporar genes de resistencia a virus e insectos, generar plantas tolerantes o resistentes a los herbicidas y cultivos con un mayor contenido nutricional. Esta técnica biológica ha permitido entonces la formación de nuevas variedades agrícolas, a través de la obtención de plantas con nuevos genes, los cuales pueden provenir de la misma planta, de plantas diferentes, de bacterias, virus, hongos o mamíferos. Estas nuevas plantas son conocidas como “Plantas Transgénicas”, las cuales poseen nuevas características y pueden no tener contraparte en la naturaleza, ya que fueron diseñadas y obtenidas por el hombre sin recurrir a los mecanismos naturales de transferencia de material genético, razón por la cual las barreras naturales para el intercambio de material genético desaparecen. No obstante, esta tecnología no debe considerarse como un fin sino como un instrumento adicional para alcanzar el objetivo final de modificar y mejorar las plantas y animales. Actualmente, se aplica el término “Organismos Vivos Modificados”, (OVM´s) a todos aquellos organismos generados por las técnicas del ADN recombinante. En ese contexto, en un OVM, el material genético ajeno se perpetua en la otra especie (organismo o célula huésped) sin variaciones en la progenie de la célula receptora, pero dando origen a nuevas características”. Actualmente, han surgido diferentes métodos para la generación de OVMs, pero los dos sistemas más utilizados son la transferencia directa y la transferencia

mediada por bacterias del género Agrobacterium. El primero consiste en la introducción directa de genes empleando técnicas como el bombardeo de partículas de oro o tungsteno con un acelerador de partículas. El segundo utiliza las propiedades biológicas de la bacteria del suelo Agrobacterium sp. para introducir el ADN foráneo. La Ingeniería Genética puede coadyuvar a los programas de mejoramiento de los cultivos tanto

nativos como introducidos. Genes importantes de plantas nativas, como resistencia a enfermedades, pueden ser introdu-cidos en los cultivos alimenticios, como también genes favorables, especialmente los relacionados con calidad nutricional,pueden ser incorporados en los cultivos alimenticios nativos (Magnien y De Nettancourt, 1985).

5. metodología El procedimiento metodológico incluyó las siguientes etapas: 5.1. Se preparó un anteproyecto del estudio, que incluyó los lineamientos de trabajo y se elaboró una boleta de encuesta, que fue utilizada como insumo y base de datos para el análisis de la información y ejecución del estudio. La boleta preparada, fue sometida a consideración del equipo de trabajo de la institución que coordinaba los distintos estudios que se estaban ejecutando simultáneamente, y luego de las sugerencias recibidas, se elaboró la boleta final, la cual se adjunta (total 24), provenientes de 27 laboratorios, que representan el inventario realizado para ser ingresado a la base de datos de OTECBIO. En algunos casos, por ejemplo INCAP, ICTA, y el Laboratorio Nacional de Salud, incluyeron en una sola boleta todos los laboratorios que poseen, ya fuesen de cultivo de tejidos, o marcadores moleculares. La encuesta cubrió todos los temas que se requerían en la ejecución de la consultoría. 5.2. Además de la boleta de encuesta a los laboratorios, se elaboró un sondeo entre una muestra representativa de la población guatemalteca, específicamente la que habita en la capital y áreas aledañas. Este sondeo se hizo para determinar el conocimiento público sobre los organismos vivos modificado y su utilización. La muestra fue de sesenta y tres personas. Las características de las personas entrevistadas, debían cumplir con el único requisito de ser mayor de edad. El sondeo fue realizado totalmente al azar. 5.3. Se realizaron las encuestas, visitando instituciones, y centros de investigación gubernamentales, no gubernamentales y privados, así como entrevistas personales. En algunos casos, los responsables de los laboratorios se encontraban fuera del país, cuando se les visitó, por lo que se procedió a dejar la boleta para que fuese llenada a su retorno. En este último caso, nos comunicamos nuevamente

con los responsables, para aclarar dudas de la boleta y seguidamente fueron enviadas vía fax a mi oficina profesional. En el caso de entrevistas personales, estas se hicieron también con profesionales de instituciones privadas, que no tienen laboratorios específicos de biotecnología, pero que en algún momento realizaron ensayos de campo con organismos vivos modificados con fines exclusivos de investigación. 5.4. Durante el desarrollo del estudio, se trabajó en estrecha coordinación con la Directora Nacional del Proyecto, y con los consultores que estaban realizando los otros estudios paralelos con el de situación actual de la biotecnología en Guatemala. Se tuvieron varias reuniones de trabajo con la Coordinación de la Oficina Nacional de Ejecución (NEA) para un mejor control de los avances y dificultades que se identificaron durante el desarrollo de la consultoría. Así también se presentó un avance del trabajo realizado en un seminario especial para el efecto. 5.5. Se procedió al análisis de la información, tomando en cuenta todos los detalles de la boleta de datos, y revisando nuevamente que cubrieran los aspectos considerados como requisitos fundamentales para la elaboración del diagnóstico de la situación actual de la biotecnología en el país. Dentro del análisis se elaboró una matriz de datos para la tabulación de la información recabada. 5.6. Se procedió entonces a la preparación del diagnóstico de la situación actual de la Biotecnología en Guatemala, incluyendo todas las categorías y temas requeridos como producto del estudio. 5.7. Seguidamente se preparó el informe final para su respectiva aprobación por el CNCB, incluyendo tres ejemplares del informe final en versión impresa y electrónica en formato de Word, Excel y Power Point.

5.8. Se entregaron las boletas de datos productos de los inventarios realizados como insumo previo, con carácter de anexo, para ser ingresadas bases de datos en Access de acuerdo a los formatos del Mecanismo de Intercambio de Información de Bioseguridad. (BCH).

5.9 Finalmente se procedió a la presentación de los resultados finales de la consultoría al CNCB, utilizando Power Point, e incluyendo los insumos obtenidos anexos al documento final con su respectiva opinión.

6. resultados y discusión 6.1. LABORATORIOS, INSTITUCIONES Y/O CENTROS DE ESTUDIOS SUPERIORES VINCULADOS/RELACIONADOS AL USO DE LA BIOTECNOLOGÍA Y/O LA SEGURIDAD DE LA BIOTECNOLOGÍA.

Para la realización del estudio del cual deriva la presente publicación, se visitaron 27 laboratorios de Biotecnología, pertenecientes a 17 instituciones, con un promedio de 1.6 laboratorios por institución. Los laboratorios visitados incluyeron el área vegetal, humana y animal. La figura 1 muestra dos de los ambientes de los laboratorios visitados. Es importante mencionar que algunas instituciones, como por ejemplo, la Universidad del Valle de Guatemala, posee varios laboratorios dedicados a diferentes tipos de investigación, tanto vegetal como humana. Sin embargo,

están comunicados por una red interna de Internet. Por otra parte, hay instituciones que tienen tanto laboratorios de Marcadores Moleculares como de Cultivo de Tejidos, tal es el caso de ICTA y la Facultad de Agronomía de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Es importante mencionar también el caso del laboratorio de Fitopatología de la Universidad del Valle de Guatemala, que trabaja, en forma paralela Marcadores Moleculares, Cultivo de Tejidos e Ingeniería Genética. A pesar de que el énfasis de ésta investigación estaba orientada hacia Organismos Vivos Modificados, se consideró fundamental, además, la visita a laboratorios de Marcadores Moleculares y Cultivo de Tejidos, pues son herramientas indispensables para poder llevar a cabo la Ingeniería Genética.

Figura 1. Dos tipos de ambientes de dos laboratorios visitados. A. ambiente con medidas de bioseguridad en el Laboratorio Nacional de Salud (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003), B. ambiente de laboratorio de marcadores moleculares en el ICTA (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

A B

Las instituciones visitadas y/o encuestadas fueron las siguientes: 1. 2.

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas (ICTA). Gubernamental. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la Universidad de San Carlos de Guatemala (USAC). Académica. Universidad Rafael Landívar (URL). Académica. Facultad de Agronomía de la Universidad de San Carlos de Guatemala (FAUSAC). Académica. Centro Guatemalteco de Investigación de la Caña (CENGICAÑA). Privada. Universidad del Valle de Guatemala (UVG). Académica. Ingenio Magdalena. Privada. Ingenio La Unión. Privada. Ingenio Pantaleón. Privada. Ingenio Santa Ana. Privada. Asociación Nacional del Café (ANACAFÉ). Privada. Jardines Mil Flores. Privada. Escuela de Biología de la USAC. Académica. Instituto de Nutrición de Centroamérica y Panamá (INCAP). Privada. Laboratorio Nacional de Salud. Gubernamental. Hospital General San Juan de Dios (HGSJDD). Gubernamental. Hospital Nacional de Amatitlán (HNA) (Unidad de Quemados). Gubernamental.

6.2. TIPOS DE INSTITUCIONES. Como puede observarse en la figura 2, de las 17 instituciones visitadas, 8 son de carácter privado, 5 académicas y 4 gubernamentales. Aparentemente, se esperaba que la mayor parte de los laboratorios estuviera en el sector académico o gubernamental; sin embargo, se observó que existe una tendencia del sector privado a invertir en la Biotecnología, pues es el mayor número. Pero también es importante mencionar que el sector privado se apoya, en cierta medida, en colaboraciones con instituciones académicas y gubernamentales. La figura 3 muestra la misma tendencia expresada en porcentajes.

Figura 2. Número de instituciones, por sector, dedicadas a la Biotecnología en Guatemala. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

23.5 47.7

Privada Académica Gubernamental

29.4

Figura 3. Número de instituciones, por sector, dedicadas a la Biotecnología (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 8 8 7 6

5 4

3 2 1 0

Privada

Académica

Gubernamental

6.3. LABORATORIOS POR TIPO DE INSTITUCIÓN. La figura 4 refleja los laboratorios de acuerdo al tipo de institución. Se nota nuevamente, aunque no significativamente, que el sector privado tiene el mayor número (10) de laboratorios; pero como se indicaba anteriormente, casi todos trabajan en forma estrecha, independientemente del sector. Figura 4. Número de laboratorios por tipo de institución. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 10 10

8 7 6 5 4 3 2 1 0

Privada

Académica

Gubernamental

La figura 5 refleja, en porcentaje, la misma tendencia, en donde el sector privado supera de manera mínima a los otros sectores en cuanto al número de laboratorios. Figura 5. Número de laboratorios por tipo de institución (expresado en porcentajes). Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

29.6

La figura 7 refleja, en números, ésta situación. Es importante indicar que, relativamente, el número de profesionales con maestría y doctorado ha crecido ostensiblemente comparativamente con el número de profesionales que trabajaban en ésta rama pocos años atrás. Por ejemplo, actualmente se encuentran trabajando 15 Ph.D. y 18 MSc. Por otra parte, se considera que en la actualidad se encuentran profesionales formándose en éste campo, por lo que futuro mediato estas cantidades pueden variar.

37.1

Figura 7. Número de profesionales, según grado académico, trabajando actualmente en Biotecnología. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 33.3

70 70 60 50 40 30 20 10 0

Privada Académica Gubernamental

Licenciatura

Maestría

Doctorado

6.4. CAPITAL HUMANO PROFESIONAL. Puede observarse en la figura 6 el capital humano profesional que trabaja en Biotecnología. Resalta el hecho de que la mayoría tiene nivel de licenciatura, siendo los porcentajes a nivel de maestría y doctorado muy similares. Figura 6. Capital humano profesional (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

14.5

6.5. CAPITAL HUMANO TÉCNICO Y DE APOYO. El personal técnico y de apoyo es relativamente alto en Biotecnología, se puede observar 87 técnicos (con cierta formación o experiencia en el trabajo que realizan, vg. Marcadores Moleculares o cultivo de tejidos) y 66 elementos de apoyo (por ejemplo: apoyo secretarial, limpieza, etc.), como se puede observar en la figura 8.

17.5

Figura 8. Personal técnico y de apoyo que laboran en el campo de la Biotecnología. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 68

100

87 66

80 60

Licenciatura Maestría Doctorado

40 20 0

Técnico

Apoyo

La presencia de un mayor número de personal laborando en este sector puede deberse a que es una mano de obra de menor inversión respecto al capital humano profesional (ver figura 9, expresado en porcentaje).

total de 908 m2 y un promedio de 32.4 m2 por cuarto (ver figura 11). Al igual que en el caso anterior, el tamaño de los cuartos de crecimiento en la mayor parte de laboratorios es apropiado.

Figura 9. Personal técnico y de apoyo que laboran en el campo de la Biotecnología (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 11. Ambiente de cuarto de crecimiento en el laboratorio de cultivo de tejidos del ICTA (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

43.1

56.9 Técnico Apoyo

6.6. INFRAESTRUCTURA. De acuerdo al número de instituciones visitadas, el número de ambientes totales es de 199, con un área total de 12,597 m2, con un promedio de 7.4 ambientes por laboratorio y 63.3 m2 por ambiente. La figura 10 muestra un ambiente de sala de preparación de medios en uno de los laboratorios visitados. Es importante acotar que, en promedio, la mayoría de laboratorios tienen un área adecuada en sus ambientes de trabajo. Figura 10. Ambiente de sala de preparación de medios en el laboratorio de Biotecnología del ICTA (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

53 En cuanto a invernaderos, en las instituciones visitadas se encontró un total de 12, con un área total de 2,718 m2 y un promedio de 227 m2 por invernadero. Es importante mencionar que no todos los laboratorios tienen facilidades de invernadero y más que todo corresponden a aquellos laboratorios que trabajan especialmente con cultivo de tejidos vegetales (figura 12). Figura 12. Vista general de un invernadero en la URL (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

En el caso de laboratorios de Cultivos de Tejidos, Células o Bacterias, se determinó que el número de cuartos de crecimiento, en total era de 28, con un área

En cuanto a equipo básico, entre todos los laboratorios poseen 39 autoclaves, 52 cámaras de flujo laminar y 14 termocicladores. Aquí es importante acotar que, en la mayoría de instituciones, los laboratorios comparten el uso de algunos de estos equipos básicos, por ejemplo: termocicladores, cámaras de flujo laminar y autoclaves (figura 13). Por otro lado, llama la atención el hecho de que los laboratorios se han equipado con aparatos modernos provenientes, en un buen número de casos, de proyectos y convenios de cooperación con instituciones internacionales, por ejemplo la UVG, INCAP e ICTA.

Figura 13. Equipo básico en un laboratorio de Biotecnología. A. Termociclador en el laboratorio de Marcadores Moleculares del ICTA (Fuente: el autor, 2003), B. Cámara de Flujo Laminar en el laboratorio de Cultivo de Tejidos del ICTA (Fuente: el autor, 2003), C. Autoclave en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la URL (Fuente: Ing.Agr. Luis Aguirre).

6.7. RAMA DE LA BIOTECNOLOGÍA QUE TRABAJAN LOS LABORATORIOS. En cuanto a la rama de la Biotecnología que trabajan los laboratorios puede observarse, en la figura 14, que el mayor número se encuentra en la rama vegetal (14) y muy de cerca la rama humana (10). La rama animal está iniciándose y la rama ambiental es mínima. Posiblemente esto se deba a que los programas de cooperación internacional han apoyado más ramas de la Biotecnología relacionada con la salud humana y seguridad alimentaria. Otro argumento podría ser que la mayoría de profesionales que más trabajan en la Biotecnología se relacionan con las ramas mencionadas y, consecuentemente, tienen la oportunidad de elaborar más proyectos que son aprobados en las instituciones internacionales que proporcionan apoyo a estos programas. Figura 14. Número de laboratorios por rama de la Biotecnología que trabajan.(Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 14

10 8 6

4 2

0 Vegetal

Humana

Animal

Ambiente

La situación indicada anteriormente puede reflejarse también en porcentajes, notándose que la rama vegetal es la más significativa con un 48.3 por ciento y la rama humana con un 34.5 por ciento (figura 15).

Figura 15. Número de laboratorios por rama de la Biotecnología que trabajan (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 13.8

3.4

48.3

34.5

Vegetal Humana Animal Ambiente

6.8. ÁREA DE LA BIOTECNOLOGÍA QUE TRABAJAN LOS LABORATORIOS.

6.9. TÉCNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS QUE EMPLEAN LOS LABORATORIOS.

En cuanto al área de la Biotecnología que trabajan los laboratorios, la mayoría realiza Cultivo de Tejidos (18) y Marcadores Moleculares (13). Únicamente dos laboratorios trabajan lo que es Ingeniería Genética, perteneciendo ellos a la Universidad del Valle de Guatemala (ver figuras 16 y 17). Se considera que la Ingeniería Genética en Guatemala es incipiente debido a que, para lograr su completo desarrollo, es indispensable primero desarrollar las otras áreas de la Biotecnología; es decir, el Cultivo de Tejidos y los Marcadores Moleculares. Estos aún se encuentran en una fase de desarrollo, por lo que se apoyan frecuentemente en programas de cooperación con instituciones internacionales (Organismo Internacional de Energía Atómica, OMS, JICA –Japan International Cooperation Agency-, etc.) y universidades de países desarrollados; como por ejemplo, los Estados Unidos, Alemania y Canadá, tanto en obtención de equipo, como en la formación de capital humano especializado.

Entre las principales técnicas de Cultivo de Tejidos que emplean los laboratorios podemos mencionar las siguientes: cultivo de células o callos (10 laboratorios); cultivo de meristemos (9 laboratorios); diversas técnicas de conservación, especialmente de germoplasma vegetal y un caso de semen de animales (8 laboratorios) (figuras 18 y 19). Otras técnicas menos utilizadas son: cultivo de nudos (3 laboratorios); cultivo de brotes (3 laboratorios); uso de anticuerpos monoclonales (3 laboratorios), cuyo objetivo no es cultivo de tejidos, sino su uso en análisis clínicos, especialmente en salud como en el caso del Hospital San Juan De Dios, INCAP y el laboratorio Nacional de Salud, que lo usa como diagnóstico de de las enfermedades de dengue y tuberculosis. Otras técnicas utilizadas son: mutagénesis inducida (3 laboratorios), cultivo de anteras (2 laboratorios), cultivo de embriones (2 laboratorios), embriogénesis somática (2 laboratorios) y producción de parasitoides (2 laboratorios) para control de insectos en campos de cultivo (caña de azúcar). Es importante resaltar que un laboratorio emplea dos o más técnicas al mismo tiempo. En el caso de las últimas técnicas mencionadas, como por ejemplo, mutagénesis inducida, cultivo de anteras y embriogénesis somática los usan, básicamente, para el mejoramiento genético de plantas. En el caso de parasitoides su uso es para el control biológico de insectos.

Figura 16. Número de laboratorios por área de la Biotecnología que trabajan. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 18 18 16

14 12 10 8 6 2

4 2 0

Ingeniería Genética

Figura 17. Número de laboratorios por área de la Biotecnología que trabajan (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 18. Número de laboratorios por técnica de Cultivo de Tejidos empleada. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

10 10

6.1

9 8

54.5

3 2

ito

gé

od Pr

s ne

nt A

ag ut M

is es én

na lo oc

on A

co rio

te ro B

ón va er

se on C

Ingeniería Genética

ce pi

ió A

ac rv

al /c

er M

ul él

Marcadores Moleculares

0 Cultivo de Tejidos C

39.4

Marcadores Moleculares

Cultivo de Tejidos

8 8 7 6 5 4 3 2 1 0

7 6 4 3

3 2 1

A c. M

S LE A

TPC R

N LO

R SC

1 S

Cé

6.10. TÉCNICAS DE MARCADORES MOLECULARES QUE EMPLEAN LOS LABORATORIOS. Entre las principales técnicas de Marcadores Moleculares que emplean los laboratorios, podemos mencionar las siguientes: kits de detección de presencia de virus por medio de pruebas ELISA (8 laboratorios). Las pruebas ELISA se utilizan tanto en el sector vegetal como humano; por ejemplo, en el sector vegetal, para identificar plantas o genotipos con presencia de virus y en el caso humano para diagnóstico de enfermedades. La técnica de análisis de proteínas y/o isoenzimas (7 laboratorios), RAPD (6 laboratorios) y RFLP (4 laboratorios), SSR o microsatélites (3 laboratorios), SCAR (3 laboratorios) y AFLP (2 laboratorios); son otras técnicas reportadas, cuyos usos se reflejan tanto en el campo vegetal como en el campo de la salud humana. En el caso de vegetales, su uso o aplicación principal es para estudios de diversidad, identificación de genotipos, análisis de poblaciones, entre otros, para mejoramiento genético. De estas técnicas las más precisas son: SSR, SCAR y AFLP; mientras que proteínas y/o isoenzimas y RAPD son menos reproducibles y menos utilizadas actualmente. En el caso de anticuerpos monoclonales (1 laboratorio), el Centro de Estudios e Investigación en Salud, específicamente el laboratorio de Leishmaniasis lo clasifica dentro del área de marcadores moleculares. Dicho laboratorio usa los anticuerpos monoclonales como antígenos para diagnóstico de enfermedades. Es importante mencionar que en este último caso, los antígenos que utilizan para el diagnóstico de Leishmaniasis son derivados de bacterias

Figura 20. Número de laboratorios que utilizan las técnicas de Marcadores Moleculares. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

3.5 3.5 3.5 3.5

5.3 5.3 5.3 5.3

IS A

10.5

ZI M

15.8

17.5

lu la s / M e c a ll ris os Co te ns mo er va s c ió Cr n io c o Ap ns ice er s va c ió n Nu do Ac .M B s on rot oc es l Mu ona ta les gé ne s An i s Em tera Em bri s Pr bri one od og s .P é n ar es a s is ito id es

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

recombinantes, pero el laboratorio únicamente utiliza los antígenos, que los importa de otros países. Otra técnica molecular utilizada es PCR de transcriptasa reversa o RT-PCR, específicamente por el Laboratorio Nacional de Salud para convertir ARN en ADN copia (ADN de doble cadena a partir de ARN). El laboratorio de Leishmaniasis de la Universidad del Valle, utiliza la técnica de secuenciación de ADN para la identificación de genes. La técnica de secuenciación es una técnica molecular moderna que refleja, en este caso, el avance del uso de éstas técnicas por instituciones guatemaltecas, tal el caso de la UVG (ver figuras 20 y 21).

IS O

Figura 19. Número de laboratorios por técnica de Cultivo de Tejidos empleada (expresada en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 21. Número de laboratorios por técnica de Marcadores Moleculares empleada (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 25 20 15

21.6 18.9

16.2 10.8 8.1

8.1 5.4 2.7

2.7

0 AS APD RFLP ISA R EL NZIM E O IS

AR SC

R ION LP STP LES PC AF S NA RT - CIAC LO N C E NO CU SE .M O Ac

6.11. TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA QUE EMPLEAN LOS LABORATORIOS. En Guatemala únicamente se emplean tres técnicas de Ingeniería Genética que son: a) transformación (insertación de un gen en un vector, generalmente E. coli) y clonación de ADN, es decir, multiplicación de fragmentos de ADN que ya han sido transformados (dos laboratorios), b) transferencia de genes a otros organismos (dos laboratorios); por ejemplo, el caso de papaya, en donde se ha transferido un gen de resistencia a virus a genotipos comerciales, y c) ensayos de campo de Organismos Vivos Modificados (un laboratorio), que es el mismo que trabaja con papaya, y que tiene sus ensayos confinados en laboratorio y campo. Es relevante mencionar que estos laboratorios pertenecen a la Universidad del Valle en cooperación con instituciones internacionales. Es importante señalar también que aparecen 5 laboratorios, pero lo que ocurre es que un laboratorio utiliza las tres técnicas al mismo tiempo (laboratorio de Fitopatología) y otro, que usa dos técnicas simultáneamente (CDC), por lo que en términos de laboratorios son únicamente dos, pero en función del uso de las técnicas se refleja como cinco laboratorios por la polifuncionalidad de los mismos (véanse figuras 22 y 23). Figura 22. Número de laboratorios por técnica de Ingeniería Genética empleada. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

1 1

enes ción y ncia G N forma Trans ción de AD Transfere Clona

mp o os C a Ensay

Figura 23. Número de laboratorios por técnica de Ingeniería Genética empleada (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

20 40

Transformacion y Clonación ADN Transferencia Genes Ensayos Campo

6.12. OBJETIVOS DE LOS LABORATORIOS. El principal objetivo de la mayoría de laboratorios es investigación (21 laboratorios). En menor cantidad (9 laboratorios) se dedican a la docencia y una cantidad menor hacen una producción comercial (6 laboratorios). Es importante hacer la observación de que algunos laboratorios persiguen dos, e inclusive tres objetivos al mismo tiempo; es decir investigación, docencia y producción comercial simultáneamente (ver figuras 24 y 25). Por esa razón, aparentemente, se muestran más laboratorios que los encuestados. Por otra parte, esto refleja la claridad de los propósitos que persiguen los laboratorios en cuanto a que, en nuestro país es necesario fomentar la investigación en el campo de la Biotecnología, formar recurso humano especializado y, finalmente, aplicarlo en actividades de beneficio social, ya sea de carácter salud, seguridad alimentaria y uso sostenible de los recursos naturales.

Figura 24. Número de laboratorios según sus objetivos. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

genético y producción y la tercera con fines de prevención de enfermedades y mejoramiento de la salud (ver figuras 26 y 27). Es importante hacer la observación de que algunos laboratorios están relacionados con dos o más ciencias, al mismo tiempo; por esa razón, aparentemente, se muestran más laboratorios que los encuestados. Figura 26. Número de laboratorios y su relación con algunas de las ciencias más importantes. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Investigación

Docencia

Producción Comercial

12 11

Figura 25. Número de laboratorios según objetivos que persiguen (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

6 5 4

16.7

2 1

58.3

Investigación

Docencia

Producción Comercial

Figura 27. Número de laboratorios y su relación con algunas de las ciencias más importantes (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 18 17.6 16

6.13. CIENCIAS CON LAS QUE SE RELACIONAN LOS LABORATORIOS.

14 12 10 8 6 4 2

11.8 8.8 8.8 7.4 5.9 4.4 2.9 2.9 2.9 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

bio Ag log ro ía En nom tom ía olo Bo gía Ne táni Ge ma ca to n Ta étic logí xo a V a no eg mí et al a Fit Veg o e Ge pat tal o n Ge étic logí né a A a tic ni a H ma um l Zo ana olo g Vi ía He rolo ma gía to Bi logí oq a Inm uím un ica olo gí En Uro a l Me doc ogía r dic ino ina log Hu ía ma na

cro

Entre las principales ciencias con las que se relacionan los laboratorios tenemos las siguientes: Microbiología (12 laboratorios), Agronomía (11 laboratorios), Entomología (8 laboratorios), Botánica y Nematología (6 laboratorios), Genética Vegetal (5 laboratorios), Taxonomía Vegetal (4 laboratorios) y Fitopatología (3 laboratorios). En menor cantidad se encontraron en relación con las siguientes ciencias: Genética Animal y Humana (2 laboratorios) y Zoología (2 laboratorios). Únicamente se encontró un laboratorio relacionado con cada una de las siguientes ciencias: Virología, Hematología, Bioquímica, Inmunología, Urología, Endocrinología y Medicina Humana. Como se puede apreciar, existe una gran gama de ciencias relacionadas con los laboratorios de Biotecnología, tanto de la rama vegetal, animal como humana, fundamentalmente la primera y la segunda con propósitos de mejoramiento

16.2

Ag r

Mi cro

bio

log ía o En nom tom ía olo g B ía Ne otán i Ge mato ca n lo Ta ética gía xo no Veg mí et a a Fit Veg l o Ge pat etal né olo Ge tica gía né A tic nim aH a um l an Zo a olo Vi gía ro l He ogía ma tol Bi og oq ía Inm uími un ca olo U gí En rol a og d Me ocri ía dic nol o ina g Hu ía ma na

6.14. COLECCIONES DE ESPECIES O VARIEDADES DE ANIMALES Y/O VEGETALES, TANTO VIVOS COMO PRESERVADOS. En cuanto a colecciones de especies o variedades de animales y/o vegetales, tanto vivos como preservados, 14 (52%) laboratorios sí las poseen, mientras que 13 (48%) laboratorios no las poseen (ver figuras 28 y 29). Es importante indicar que las colecciones son fundamentales, como fuente potencial para su utilización

posterior en programas de mejoramiento genético o de salud humana y animal. Sería deseable entonces que un mayor número de laboratorios tuvieran colecciones.

Figura 31. Número de laboratorios que poseen bases de datos de sus colecciones expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 7.1

Figura 28. Número de laboratorios que poseen colecciones de especies o variedades de animales y/o vegetales, tanto vivos como preservados. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 14

92.9

8 6

6.15. CONEXIONES A REDES GLOBALES.

4 2 0 NO

Figura 29. Número de laboratorios que poseen colecciones de especies o variedades de animales y/o vegetales, tanto vivos como preservados (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). NO

BASES DE DATOS Como puede observarse en las figuras 30 y 31, de las instituciones que poseen colecciones de especies o variedades de animales y/o vegetales, tanto vivos como preservados (14), la mayoría de instituciones poseen bases de datos (13 en número y 92.9 en porcentaje). Esto refleja el interés de las instituciones que tienen colecciones de mantener la información computarizada, lo cual facilita el trabajo de la institución y, aún más importante, la disponibilidad de información para las instituciones que estén interesadas en las actividades que realiza cada una de ellas. Figura 30. Número de laboratorios que poseen bases de datos de sus colecciones. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 13

En cuanto a conexiones a redes globales, 14 (52%) laboratorios sí pertenecen a ellas, mientras que 13 laboratorios (48%) no pertenecen a ninguna (figuras 32 y 33). Las conexiones a redes reportadas fueron las siguientes: Proyecto de Mejoramiento del Café (PROMECAFÉ), Red Latinoamericana de Biotecnología (REDBIO), International Consortium of Sugarcane Biotechnology (ICSB), REDMESO, Red Latinoamericana de Laboratorios de Polio (OPS/CDC), Red Metrópica para ETEC y Federación Latinoamericana de Quemaduras (FELAQ). Sería deseable que todos los laboratorios estuviesen conectados a redes globales ya que, de manera general, únicamente la mitad tiene esta conexión. Algunas instituciones indicaron que estaban conectadas a Internet, sin embargo, en este trabajo, no se tomó esta circunstancia como una conexión a redes globales, únicamente se consideró las redes globales de trabajo temático conjunto, propiamente dicho.

Figura 32. Número de laboratorios que poseen conexiones a redes globales. Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 14

12 10 8

0 NO

4 2

0 NO

Figura 33. Número de laboratorios que poseen conexiones a redes globales (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

laboratorios no se relacionan con OVM´s (24 laboratorios), que son la mayoría. Esto ratifica, nuevamente, que la Ingeniería Genética está incipiente en Guatemala, a nivel de laboratorio; pero sus fines son también claramente de carácter benéfico, desde el punto de vista social.

Figura 34. Número de laboratorios que trabajan con Organismos Vivos Modificados.(Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

6.16. LABORATORIOS QUE TRABAJAN CON ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS.

De los laboratorios visitados, únicamente tres están trabajando con organismos vivos modificados (OVM´s), perteneciendo dos de ellos a la Universidad del Valle de Guatemala y el otro a la Escuela de Biología de la USAC (figuras 34 y 35). Estos laboratorios lo hacen fundamentalmente con propósitos de investigación. En el caso de la Universidad del Valle, un laboratorio está trabajando con transformación, clonación y transferencia de genes resistentes al virus de papaya (Carica papaya), que es el laboratorio de Protección Vegetal; habiéndose hecho el aislamiento de genes, transformación, clonación y transferencia en Guatemala. Otro Laboratorio de la Universidad del Valle, específicamente el laboratorio del Centro de Estudios en Salud del Instituto de Investigación está trabajando en el aislamiento de genes de Plasmodium, parásito causante de la malaria, y tripanosomas, flagelado relacionado con la enfermedad de Chagas. Seguidamente los transforman, usando E. coli y finalmente los clonan. En el caso de Plasmodium el objetivo es identificar genotipos asociados con P. vivax y P. falciparum, asociados con susceptibilidad/resistencia a antibióticos, como un criterio para definir un tratamiento nacional contra la malaria. En el caso de Trypanosoma, el laboratorio está desarrollando una estrategia para determinar como se dispersan los genes vectores de la enfermedad de Chagas. En cuanto a la Escuela de Biología de la USAC, el laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología (LENAP), está produciendo Taq ADN polimerasa, utilizando para ello una bacteria recombinante de E. coli introducida al país. Los demás

24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Figura 35. Número de laboratorios que trabajan con Organismos Vivos Modificados (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 11.1

88.9

6.17. OBJETIVOS DE TRABAJAR CON ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS. Los objetivos de trabajar con OVM´ son básicamente de investigación, como se ha indicado anteriormente en detalle. Así también, en una menor medida, los objetivos son uso confinado, es decir utilización del organismo únicamente en el laboratorio y totalmente aislado, con las medidas de Bioseguridad correspondientes y, en un caso específico, el objetivo es evaluación de riesgo, que consiste en hacer un análisis de los riesgos potenciales del uso del organismo transformado. Este último propósito, lo señala el laboratorio de Protección Vegetal de la Universidad del Valle (Figuras 36 y 37).

Figura 36. Número de laboratorios por objetivos de trabajar con Organismos Vivos Modificados. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 39. Número de laboratorios que han introducido OVM´s al país (expresado en porcentajes). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

3.7

3 2 2

1 NO

96.3

Investigación

Uso Confinado

Evaluación de Riesgo

Figura 37. Número de laboratorios por objetivos de trabajar con Organismos Vivos Modificados (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

E. coli Recombinante

6.19. POSIBILIDAD DE INTRODUCIR ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS AL PAÍS.

50 33

Investigación

Uso Confinado

Evaluación de Riesgo

6.18. INTRODUCCIÓN DE ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS AL PAÍS. De acuerdo con el número de laboratorios visitados, únicamente el laboratorio de Entomología y Parasitología (LENAP), de la Escuela de Biología de la USAC, reporta haber introducido un OVM, en este caso una cepa transformada de E. coli. (figuras 38 y 39). El objetivo de la introducción de la cepa transformada es la producción de Taq ADN polimerasa para uso en PCR. Los demás laboratorios no reportan ninguna introducción de OVM´s al país.

En este caso, todos los coordinadores de los laboratorios respondieron enfáticamente que no piensan, por el momento, introducir OVM´s al país (ver figuras 40 y 41). Esto demuestra que, a nivel de laboratorios, los especialistas están concientes de que para trabajar con Ingeniería Genética necesitan más equipo y mayores medidas de Bioseguridad.

61 Figura 40. Número de laboratorios que tienen planificado introducir OVM´s al país. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 27 28 24 20 16 12 8 4

0 NO

Figura 38. Número de laboratorios que han introducido OVM´s al país. Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 28

Figura 41. Número de laboratorios que tienen planificado introducir OVM´s al país (expresado en porcentajes). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

24 20

16 12

8 SI

4 0 NO

E. coli Recombinante

100

6.20. PROGRAMAS Y/O EXPERIENCIA SOBRE EVALUACIÓN DEL IMPACTO SOCIAL QUE PUEDAN UTILIZARSE ANTE LA POSIBILIDAD DE INTRODUCCIÓN DE OVM’s EN PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN O PRODUCCIÓN. Los laboratorios de Microbiología y Virología del INCAP, son los únicos laboratorios a nivel nacional que cuentan con un programa o experiencia sobre evaluación de impacto social que se puede utilizar ante la posibilidad de introducción de un OVM en un determinado proyecto de investigación o producción (figuras 42 y 43). Las evaluaciones de impacto social que hacen son de tipo cuantitativo y cualitativo y se encuentra sistematizado. Figura 42. Número de laboratorios con programas y/o experiencia sobre evaluación del impacto social que puedan utilizarse ante la posibilidad de introducción de OVM´s en proyectos de investigación o producción. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 28

24 20 16

12 8 2

4 0 NO

6.21. MEDIDAS DE SEGURIDAD DE LA BIOTECNOLOGÍA PARA LA REALIZACIÓN DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN Y/O PRODUCCIÓN. La mayoría de los laboratorios (22 de 27) poseen medidas de seguridad de la Biotecnología para la realización de sus proyectos de investigación y/o producción. Entre las principales medidas de Bioseguridad encontradas se pueden mencionar las siguientes: uso de cámara de flujo laminar, bunkers de reactivos y desechos, tratamiento de residuos químicos, destrucción de bacterias y desinfección de cristalería mediante autoclave. En algunos casos se encuentran niveles de seguridad 2 (Centro de Estudios en Salud y laboratorio de Leishmaniasis de la UVG) y el único laboratorio con nivel de seguridad 3 es el Laboratorio Nacional de Salud, los cuales están diseñados para trabajar con protocolos que utilizan ADN recombinante y microorganismos potencialmente peligrosos para el ambiente, salud humana o animal (figuras 44 y 45). Es importante señalar que, de acuerdo a la información proporcionada, es necesario mejorar las medidas de Bioseguridad en la mayoría de laboratorios de Biotecnología en Guatemala, y de esto están consientes los coordinadores de los laboratorios y están haciendo sus mejores esfuerzos por mejorar las medidas de Bioseguridad, siendo uno de los factores limitantes el aspecto financiero. Figura 44. Número de laboratorios que aplican alguna medida de Bioseguridad. Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 43. Número de laboratorios con programas y/o experiencia sobre evaluación del impacto social que puedan utilizarse ante la posibilidad de introducción de OVM´s en proyectos de investigación o producción (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

24 20 16 12

3.7

8 4 0

SI 96.3

Figura 45. Número de laboratorios que aplican alguna medida de Bioseguridad (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 18.5

SI 81.5

6.22. POBLACIÓN O GRUPO SOCIAL META BENEFICIARIO DE PROYECTOS DE BIOTECNOLOGÍA. Únicamente cinco laboratorios de 27, no tienen un grupo social meta beneficiario de sus proyectos biotecnológicos (figuras 46, 47 y 48). Entre los grupos sociales meta de los 22 laboratorios que sí los poseen se pueden mencionar los siguientes: caficultores, pequeños y medianos productores, estudiantes, granjeros y finqueros, productores y exportadores de berries, población centroamericana, población guatemalteca susceptible de contraer la enfermedad de Chagas, productores y consumidores de caña de azúcar. Las poblaciones meta beneficiarias abarcan tanto el área vegetal, animal y de salud humana. Lo anterior demuestra nuevamente que la Biotecnología en Guatemala persigue, en los diferentes proyectos, beneficiar a la población, tanto a nivel de mejoramiento de la salud, como producir más alimentos, conservación y multiplicación de especies vegetales comerciales y en peligro de extinción y un uso racional de los recursos naturales.

Figura 46. Número de laboratorios que tienen una población o grupo social meta de sus proyectos. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

5 NO

Figura 47. Número de laboratorios que tienen una población o grupo social meta de sus proyectos (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

18.5

Figura 48. Ejemplos de grupos sociales meta de algunos de los laboratorios encuestados. A. Finca “Esquipulas”, Guanagazapa, Escuintla (Fuente: el autor, 2003), B. Finca “Pretoria”, Guanagazapa, Escuintla

6.23. PLAZO DE LOS PROYECTOS PARA QUE LOS RESULTADOS LLEGUEN A LOS GRUPOS META. La mayoría de laboratorios trabaja para que los resultados de sus proyectos lleguen a sus grupos meta, a mediano (11 laboratorios) y corto (10 laboratorios) plazo. Un menor grupo de laboratorios trabaja con proyectos a largo plazo (7 laboratorios) (figuras 49 y 50). Es importante señalar que el plazo de los proyectos en los laboratorios depende de los objetivos de los mismos, como también de las instituciones financiantes. Cabe indicar también que, por la naturaleza de algunos de los proyectos, necesitan un tiempo prudencial para mostrar sus resultados, que por supuesto pretenden ser positivos. Figura 49. Número de laboratorios y plazo de proyectos para que los resultados lleguen a los grupos meta. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 12

10 7

8 6 o

81.5

2 0 Mediano

Corto

Largo

Figura 50. Número de laboratorios y plazo de proyectos para que los resultados lleguen a los grupos meta (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 52. Número de laboratorios cuyos proyectos tienen o no relación con comunidades o pueblos indígenas (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 25.9

25 39.3

74.1

35.7

Mediano

Corto

Largo

6.24. RELACIÓN DE LOS PROYECTOS CON COMUNIDADES O PUEBLOS INDÍGENAS.

Figura 53. Comunidades indígenas que reflejan la importancia de orientar los beneficios de la biotecnología hacia estas poblaciones. A. Finca “Pretoria”, Guanagazapa, Escuintla , B. Finca “Pretoria”, Guanagazapa, Escuintla. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

La mayoría de los laboratorios (20) no tienen proyectos relacionados con comunidades o pueblos indígenas, sin embargo, siete laboratorios mencionaron que sí tienen relación sus proyectos con comunidades o pueblos indígenas (figuras 51, 52 y 53). Puesto que la mayoría de la población guatemalteca es indígena (70% aproximadamente), debiera probablemente ponerse mayor énfasis en relacionar los proyectos de Biotecnología con estas poblaciones. La biotecnología podría ayudar a las comunidades o pueblos indígenas en el campo de la salud, la agricultura, la zootecnia y la forestería, incluyendo todas las técnicas biotecnológicas.

B Figura 51. Número de laboratorios cuyos proyectos tienen o no relación con comunidades o pueblos indígenas. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 20 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

7 o

6.25. EVALUACIÓN DE IMPACTO AMBIENTAL DE LOS PROYECTOS. Únicamente el laboratorio de Protección Vegetal, de la Universidad del Valle de Guatemala, incluye dentro de sus proyectos de Biotecnología una evaluación de impacto ambiental, y lo hace mediante la evaluación de daños producidos por enfermedades vegetales en cultivos y dispersión de sus vectores, a nivel de campo. El resto de laboratorios no hacen ningún tipo de evaluación de impacto ambiental (figuras 54 y 55).

Figura 54. Número de laboratorios que incluyen en sus proyectos una evaluación de impacto ambiental. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 57. Número de laboratorios que hacen evaluación de impacto social en sus proyectos (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 7.4

26 28 24 20 16 12 8 1

92.6

0 NO

Figura 55. Número de laboratorios que incluyen en sus proyectos una evaluación de impacto ambiental. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 3.7 NO

6.27. RELACIÓN DE LOS TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN O PRODUCCIÓN DE LOS LABORATORIOS CON LAS CIENCIAS HUMANÍSTICAS.

96.3

6.26. EVALUACIÓN DE IMPACTO SOCIAL DE LOS PROYECTOS. De los 27 laboratorios, únicamente tres indican que hacen evaluación de impacto social en sus proyectos, consistiendo éstos en: evaluaciones cuantitativas, cualitativas y sistematización. Es obvio que los demás laboratorios necesitan incluir, de alguna manera, algún mecanismo que les permita evaluar el impacto social de sus proyectos (figuras 56 y 57). Figura 56. Número de laboratorios que hacen evaluación de impacto social en sus proyectos. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Los trabajos de investigación de los laboratorios encuestados están bastante relacionados con algunas de las ciencias humanísticas tales como: Sociología (11 laboratorios), Economía (9 laboratorios), Pedagogía (8 laboratorios), Antropología (5 laboratorios) y Psicología (5 laboratorios); tal y como se puede apreciar en las figuras 58 y 59. Esta situación refleja que los coordinadores o directores de los laboratorios han compenetrado la importancia de la biotecnología en el área humanística y social, y de ahí que la orientación de sus proyectos es generar un impacto positivo en la sociedad. Es importante mencionar que la Biotecnología no debe tratarse como una ciencia aislada y pura, sino que se debe interrelacionar con las demás ciencias, en este caso las humanísticas, para que su efecto sea mucho más aplicado, su conocimiento más popular y de mayor beneficio para la población guatemalteca en general. Figura 58. Número de laboratorios por ciencia humanística que se relacionan sus proyectos. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

25 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

11 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

ía

og Ps

lo po A

da Pe

gí

a go

om on Ec

ol ci

gí

ía

Figura 59. Número de laboratorios por ciencia humanística que se relacionan sus proyectos (expresado en porcentaje). (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 13.2

28.9

13.2

21.1

Sociología

Economía

23.7

Pedagogía

Antropología

Psicología

6.28. PROGRAMAS, PROYECTOS Y FUENTE DE FINANCIAMIENTO. Los programas de trabajo, con sus proyectos, así como también su fuente de financiamiento se resumen en el cuadro 5. Cuadro 5. Programas, proyectos y fuente de financiamiento. PROGRAMA Marcadores

Micropropagación

Conservación de Germoplasma Limpieza de virus Micropropagación Combate de la Enfermedad de Chagas

Biotecnología

Combate de Enfermedades

PROYECTOS MolecularesUso de marcadores moleculares para el mejoramiento de plantas resistentes a los geminivirus en Guatemala. Resistencia genética a enfermedades de importancia económica en el cultivo de tomate en Guatemala. Banano, plátano, izote pony, loroco, pinabete, Prunus, ave del paraíso, papa, persimón, zarzaparrilla, mora silvestre, fresa, orquídeas. Yuca, camote, zarzaparrilla, caña de azúcar, crisantemo, violeta africana, naranja de Rabinal, limón persa. Ajo. Papa. Micropropagación de pinabete Aclimatación de plántulas de papa en invernadero.

FUENTE DE FINANCIAMIENTO

Estudio entre poblaciones del vector de la enfermedad de Chagas, estudios de morfometría, abejas sin aguijón (PCR).

ESCUELA DE BIOLOGIA DE LA USAC-OMS-METROPICADIGICENGICAÑA

Micropropagación de caña de azúcar. Caracterización de variedades de caña de azúcar mediante microsatélites. Detección de genes asociados a defectos del tubo neural en familias con más de un miembro afectado (PCR Diagnóstico).

FAUSAC-USAID

FAUSAC-AGROCYT FAUSAC

FAUSAC ICTA-AGROCYT ICTA-AGROCYT ICTA-FODECYT ICTA

CENGICAÑA-ICTA INCAP-DUKE UNIVERSITY (EEUU)

Evaluación de una vacuna oral para la prevención de diarrea causada por Escherichia coli enterotoxigénica (PCR Diagnóstico).

INCAP-UNIVERSIDAD JOHNS HOPKINS (EEUU)

Vigilancia de poliovirus en Centroamérica (PCR, cultivo viral).

INCAP-OPS

Marcadores de virulencia de Escherichia coli enterotoxigénica en niños guatemaltecos (PCR Diagnóstico).

INCAP-OMS

Genes de virulencia de Salmonella typhi (PCR Diagnóstico).

INCAP-Hospital Roosevelt

Detección de Cyclospora cayetanensis, Microsporidium y Cryptosporidium parveanum por PCR

INCAP-AGEXPRONT-USFDA

PROGRAMA Enfermedades Infecciosas Humanas de Importancia en Guatemala

Protección Vegetal

PROYECTOS

FUENTE DE FINANCIAMIENTO

Malaria: estudios de genética de poblaciones en Anopheles (SSR, RFLP; clonación, transformación y transferencia de genes en Plasmodium)

UVG-TDR (Special Program for Research and Training ) in Tropical Diseases

Dengue: genética de poblaciones de Aedes (SSR, RFLP, RAPD, marcadores mitocondriales,)

UVG (Centro de Estudios en Salud, Estudios de Genética de Poblaciones de Anopheles y Aedes) -UVG –OMS

Leishmaniasis: estudio de eficacia y seguridad para el uso de antígenos de bacterias recombinantes administradas en pacientes; Leishmaniasis cutánea, respuesta a antígenos Th1 y Th2 (ELISA, SCAR, proteinas/isoenzimas, Anticuerpos Monoclonales, PCR diagnóstico, Secuenciación)

UVG-TDR-OMS

Chagas: estrategia para dispersión de genes en los vectores causantes de la enfermedad; análisis de genética molecular de los patrones de dispersión de Triatoma dimidiata; variabilidad genética de Trypanosoma cruzi (SSR, AFLP, RFLP, transformación, clonación con E. coli y transferencia de genes, clonación, transformación y transferencia de genes en Trypanosoma).

UVG-NIH-TDR-OMS

Enfermedades transmitidas por alimentos y agua (Análisis de Riesgo); Análisis de agua para coliformes totales E. coli y otras bacterias (PCR diagnóstico).

UVG-NCID (International Food Safety Infectious Diseases)

HIV/SIDA (PCR diagnóstico, Dips Ticks, Western Blot, VDRL -anticuerpos monoclonales-, RPR).

UVG-USAID

Resistencia a virus en papaya (RFLP, transformación, clonación de ADN, transferencia de genes, ensayos de campo).

UVG-Universidad de Carolina del Norte y otras tres Universidades de EEUU

Evaluación de especies cítricas cultivadas en Guatemala para determinar la ausencia/presencia de virus y viroides importantes, su saneamiento y caracterización previo a su propagación (ELISA, PCR diagnóstico).

UVG-AGROCYT

Determinación del agente causal del llamado “mal de chocolate” en tomates en diferentes regiones de Guatemala (ELISA, PCR diagnóstico).

UVG-AGROCYT

Vigilancia epidemiológica del Amarillamiento letal del cocotero en los departamentos de Izabal y Petén: búsqueda de medidas locales para su control (Monitoreo).

UVG-AGROCYT

Estudio de la enfermedad conocida como Amarillamiento letal del Cocotero y búsqueda de semillas nativas en la costa sur del país.

UVG-FACYT

Confirmación de insectos plaga y enfermedades, estudios de manejo integrado de plagas y desarrollo de plantas resistentes a PRSA en papayas hawaianas tipo “solo”.

UVG-IPM/CRSP

Inmunoimpresión como técnica rápida, específica y confiable para la detección del complejo de virus psorosis en las áreas citrícolas más importantes de Guatemala (ELISA).

UVG-FODECYT

PROGRAMA

PROYECTOS Genética de poblaciones de Aedes aegypti en Chiapas, México, y C.A. (SSR, RAPD, marcadores mitocondriales)

FUENTE DE FINANCIAMIENTO UVG (Centro de Estudios en Salud, Estudios de Genética de Poblaciones de Anopheles y Aedes) -UVG –OMS

Monitoreo del virus del oeste del Nilo (West Nile Virus) en aves y caballos (PCR diagnóstico)

UVG (Centro de Estudios en Salud, Estudios de Genética de Poblaciones de Anopheles y Aedes)-CDC.

Estudios de poblaciones de Anopheles albimanus de Guatemala (sondas de DNA6 y fragmentos de IGS)

UVG (Centro de Estudios en Salud, Estudios de Genética de Poblaciones de Anopheles y Aedes)-OMS. (Finalizados).

Estudios de poblaciones de Anopheles albimanus de América Latina (sondas de DNA6 y fragmentos de IGS)

Estudios de poblaciones de Anopheles albimanus de Centroamérica, Sur América y El Caribe (RAPD)

Estudios de poblaciones de Anopheles albimanus de América y El Caribe (marcadores mitocondriales)

68 Estudios de poblaciones de Anopheles albimanus de América y El Caribe (microsatélites) Papiloma Virus Humano y su relación con cáncer de cérvix, en mujeres guatemaltecas (ELISA)

Tratamiento de Quemaduras

UVG-OMS

Mejoramiento del Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica para VIH-SIDA (pruebas rápidas para diagnóstico: Dips Ticks, Western Blot; VDRL y RPR para Sífilis).

UVG-Centro de Estudios en Salud (CES), MERTU-G (Medical Entomolgical Research Taxonomy Unit – Guatemala)

Análisis de parásitos con heces de grupos sociales población San Marcos.

UVG-Centro de Estudios en Salud (CES), MERTU-G (Medical Entomolgical Research Taxonomy Unit – Guatemala)- CDCP (Center for Desease Control and Preventium). Hospital Nacional de Amatitlán (HNA)-CONCYTFundación Rafael Castillo

Tratamiento aleatorizado de quemaduras de espesor total entre membrana Ixclul I y membrana porcina/EZ deim. Tratamiento de quemaduras de espesor parcial superficial y profundo aleatorizado con membrana Ixclul II y/o hidrocoloide (duo-derm).

HNA-CONCYT -Fundación Rafael Castillo

PROGRAMA

PROYECTOS Capacitación en área de investigación y quirúrgica; transferencia tecnológica entre Guatemala y Hospital del Quemado de Buenos Aires, Argentina. A mediano plazo: cultivo celular humano (piel). Desbridamiento con larvas de Phenicia sericatta en escaras y pie diabético.

Medicina Nuclear

Análisis Clínico

FUENTE DE FINANCIAMIENTO HNA-CONCYT -Hospital del Quemado BsAs.

HNA

Proyecto Nacional para detección de hipotiroidismo congénito (anticuerpos monoclonales).

HGSJDD Laboratorio de Medicina Nuclear-OIEA

Cuantificación de hormonas, marcadores tumorales y drogas terapéuticas.

HGSJDD Laboratorio de Medicina Nuclear

Resistencia a antimicrobianos (cultivo de células y bacterias).

HGSJDD Laboratorio Clínico

Clasificación de enterobacterias (cultivo de células y bacterias).

Validación de pruebas diagnósticas para VIH y Hepatitis por pruebas ELISA

Electroforesis de proteínas como prueba diagnóstica (hemoglobina A, S y F). Micropro-pagación

Micropropagación de ornamentales de reproducción vegetativa.

Jardines Mil Flores

Micropropagación de caña de azúcar.

Ingenio Magdalena

Control Biológico

Producción de Metarrizium y parasitoides para control de insectos.

Ingenio Pantaleón

Control Biológico

Producción de Metarrizium y parasitoides para control de insectos.

Ingenio La Unión

Produción de virus entomopatógenos.

Ingenio Santa Ana

Control Biológico de Insectos

Producción de nemátodos entomopatógenos. Conservación de Germoplasma

Micropropagación de caña de azúcar.

CENGICAÑA

Micropropagación

Conservación de germoplasma y evaluación de híbridos de café.

ANACAFÉ-PROMECAFÉ, BIOFONTAGRO

Micropro-pagación

Arándano, piña, Hoffmania, Drosera, chipe, cactáceas, papa, pitaya, Dioneae, camote, anturios, vainilla, orquídeas, Spathiphyllum, alcachofa, ajo, hoja de cuero. (Cultivo de ápices, meristemos, nudos, brotes, geminación de semillas in vitro)

ICTA

Caracterización de germoplasma de maíz (SSR)

ICTA-AGROCYT

Marcadores Moleculares

Selección de líneas de maíz con alta calidad de proteína (SCAR) Caracterización de germoplasma de ajo (AFLP)

PROGRAMA

Micropropagación Inseminación artificial

PROYECTOS Caracterización de variedades de frijol liberadas por el ICTA (AFLP)

FUENTE DE FINANCIAMIENTO ICTA-FODECYT

Caracterización de variedades y mutantes de frijol (SSR)

ICTA

Mora (cultivo de brotes)

URL

Evaluación de semen de diferentes especies y de pajillas de inseminación artificial en bovinos (crioconservación de semen, espermiogramas)

FMVZ

Elaboración de dosis seminales en porcinos (crioconservación, espermiograma)

FMVZ-Sector Privado

Como puede observarse, existen 106 proyectos que involucran el uso de la Biotecnología, tanto en la rama humana, vegetal, animal y microbiológica; sin embargo, aparentemente, según el cuadro, es menor, pero lo que ocurre es que en algunos de los programas se ubicaron varios proyectos en la misma casilla, por ejemplo, el caso de los proyectos de ICTA y FAUSAC en donde se consideró que cada cultivo es un proyecto. Se nota claramente que sus objetivos son de carácter benéfico para la sociedad guatemalteca, cubriendo aspectos como: salud humana, seguridad alimentaria, producción comercial, especialmente en ornamentales y mejoramiento de la producción animal así como protección animal en el caso de aves y caballos Monitoreo del virus del oeste del Nilo (West Nile Virus) . Llama la atención el énfasis de algunos laboratorios como los del INCAP, UVG, Laboratorio Nacional de Salud y Hospital San Juan de Dios, que están dedicados de una manera directa al uso de las técnicas biotecnológicas en el combate y prevención de enfermedades como el Dengue, Malaria, Chagas, Leishmaniasis, Tuberculosis, HIV/SIDA, que afectan severamente a la población guatemalteca y centroamericana, especialmente la de escasos recursos. Así también sus programas están siendo respaldados, técnica y financieramente, por instituciones internacionales de reconocido prestigio, que refleja, aún más, la seriedad y avance de estos proyectos, que a juicio particular están teniendo un impacto positivo en nuestra sociedad. Adicionalmente, es necesario resaltar el trabajo del Laboratorio Clínico de Quemados del Hospital Nacional de Amatitlán, que con recursos locales, tanto del hospital, como de los programas

nacionales que financian investigaciones de este tipo, como el caso de FODECYT, han realizado y pretenden seguir realizando investigaciones aplicadas que ayuden al tratamiento y recuperación más inmediata de éste tipo de pacientes. Es notable, también, la aplicación de las técnicas biotecnológicas de los laboratorios nacionales en el campo vegetal, pues coadyuvan al mejoramiento genético de cultivos y producción nacional. Por ejemplo, la micropropagación de papa y especies nativas alimenticias, y uso de marcadores moleculares en frijol, maíz, ajo, café, etc. En ese sentido están contribuyendo a la seguridad alimentaria del país, una de las necesidades más sentidas de la población guatemalteca. Por otra parte, hay laboratorios que se dedican a la producción comercial de plantas, especialmente ornamentales y caña de azúcar, contribuyendo a la economía del país y al ingreso de divisas. En el caso de la Biotecnología en animales, se encuentra en una fase de desarrollo incipiente, al menos en los laboratorios a los cuales se tuvo acceso. Pudo observarse, por ejemplo, en inseminación artificial y espermiogramas en cerdos y bovinos, y aún con sus limitaciones económicas están contribuyendo al desarrollo de la Biotecnología en ésta rama, con propósitos de beneficio social y económico (FMVZ). Así también se observó la realización de un programa en aves y caballos (control de enfermedades virales), que está siendo ejecutado por la UVG. Así también, las áreas Biotecnológicas que se usan; abarcan el Cultivo de Tejidos, Marcadores Moleculares

e Ingeniería Genética. Las técnicas en cada una de las ramas son usadas en su mayoría, en al menos uno de los proyectos; lo cual depende de muchos factores, entre otros, los factores económicos y eficiencia de las técnicas. Por ejemplo, aún y cuando RAPD es una técnica que casi ya no se usa actualmente a nivel mundial por su baja reproducibilidad, en Guatemala se sigue utilizando debido a que es una técnica de bajo costo. Pero, por otra parte, se puede observar también que muchos laboratorios están usando técnicas avanzadas (en las tres ramas). Por ejemplo, Embriogénesis Somática en Cultivo de Tejidos de Plantas; en Marcadores Moleculares se están utilizando microsatélites, AFLP y RFLP, aún y cuando su costo es más alto, pero su reproducibilidad es mayor. Se nota también que, en el caso del uso de Organismos Vivos Modificados (área de la Ingeniería Genética), algunos laboratorios (tres) están usando todas las técnicas necesarias, tanto las convencionales (transformación, clonación y transferencia de genes), como también técnicas avanzadas que apoyan el proceso, tal es el caso de la secuenciación de ADN. Se pudo notar que el propósito es de carácter benéfico, pero necesitan mejorar los sistemas de Bioseguridad y los programas de evaluación de impacto social y ambiental. 6.29. SONDEO A EMPRESAS PRIVADAS AGRÍCOLAS QUE NO TIENEN LABORATORIO, PERO QUE TRABAJARON O PIENSAN TRABAJAR CON OVM’s A NIVEL DE ENSAYOS DE CAMPO. Después de las visitas y encuestas a los laboratorios que están trabajando en Biotecnología, se consideró importante también visitar empresas que no tienen laboratorio, pero que, sin embargo, realizaron hace relativamente poco tiempo ensayos de campo con Organismos Vivos Modificados. Específicamente estas empresas son Cristiani Burkard y Algodones Mayas S.A. En este caso fueron entrevistas personales, sin llenar boleta. Es importante acotar que estas empresas realizaron dichos ensayos de campo cumpliendo con todos los requisitos exigidos por la regulación que en el momento de solicitar los ensayos existía relacionada con OVM´s. Por ejemplo, al momento en que Cristiani Burkard planteó la realización de su primer ensayo de este tipo, no existía una regulación como tal, por lo

que la autorización se dio, de acuerdo a las fuentes entrevistadas, en función de un comité integrado por personal de diferentes instituciones que podrían tener relación con el tipo de ensayo propuesto. A raíz de este ensayo, se planteó la necesidad de hacer algo al respecto, por las autoridades correspondientes, por lo que se redactó y aprobó el Acuerdo Ministerial 393-98 (que posteriormente pasó a ser el Acuerdo Ministerial 47698) en donde se le atribuía la responsabilidad de la aprobación de la importación de transgénicos a la Unidad de Normas y Regulaciones del Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación y la aprobación del ensayo técnico de campo al Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas. En el caso de la empresa Cristiani Burkard, trabajó en cooperación con Monsanto, en un ensayo de campo en maíz (figura 60) con el evento biotecnológico “Yielgard”, que contiene el gen yieldgard. Este gen codifica una proteína (endotoxina) que actúa específicamente sobre las larvas de insectos de lepidópetros al destruir su sistema digestivo. El organismo donador del gen es la bacteria Bacillus thuringiensis, subespecie Kurstaki, y dicho gen confiere a la planta resistencia a ciertos lepidópteros, en este caso específico al gusano cogollero (Spodoptera frujiperda). De acuerdo con las fuentes entrevistadas, este ensayo se realizó durante los años 1998 y 1999 en Finca “Las Vegas”, Tiquisate, Escuintla y finca “San Nicolas”, San Jerónimo, Baja Verapaz, realizando 3 ciclos anuales, por lo que el evento se realizó durante dos años. De este ensayo, existe la información correspondiente en las fuentes que participaron activamente en dicho trabajo. El ensayo de yieldgard fue supervisado técnicamente por profesionales del ICTA y visitado, para su evaluación en campo, por el comité que aprobó el proyecto. Los detalles de los resultados del trabajo son de tipo privado, y según el personal de la empresa Cristiani Burkard la semilla de la cosecha y los rastrojos del cultivo, fueron incinerados al finalizar el ensayo. Por razones que competen únicamente a las empresas involucradas en los ensayos, la continuación de los mismos fueron suspendidos. Así también, la misma empresa planteó en el año el evento biotecnológico “Roundup Ready” que contiene el gen (RR) que confiere resistencia al glifosato,

ingrediente activo del herbicida Roundup Ready de la Empresa Monsanto. El ensayo se presentó, para su aprobación, en el año 2000 a la Unidad de Normas y Regulaciones del MAGA y al ICTA, lo cual fue efectivo. Sin embargo el evento biotecnológico en mención ya no se estableció en el campo por razones que competen directamente a la empresa solicitante y que son de carácter interno.

considerando la posibilidad de trabajar otros eventos biotecnológicos, siempre en la búsqueda de genes de resistencia a lepidópteros y a herbicidas; pero en este nuevo caso en convenio con la empresa Syngenta. La decisión final de las empresas involucradas sobre este posible evento está pendiente, considerando especialmente la actual regulación sobre OVM´s en el país.

El proceso de obtención del gen RR, en términos generales, se generó de la siguiente manera: la línea de maíz transformada, designada como NK603 contiene un gen que codifica la sintasa EPSPS tolerante a glifosato, la cual fue aislada de la cepa CP4 de Agrobacterium sp. La cepa CP4 de Agrobacterium fue identificada, en principio, por su capacidad para crecer en un medio conteniendo glifosato. La enzima EPSPS (5-enolpiruvil siskimato-3-fosfato sintetasa) que está presente en la bacteria común del suelo Agrobacterium sp. cepa CP4 mostró una alta tolerancia a la inhibición del herbicida Roundup. El gen de tolerancia a glifosato (CP4) fue introducido en el plásmido vector PV-ZMGT32, usando técnicas moleculares estandarizadas. Posteriormente, se aisló del Vector PV-ZMGT32 el fragmento de restricción Mlul conteniendo el gen CP4. Este fragmento se impregnó en micropartículas de tungsteno, las cuales fueron utilizadas, a través del método de biobalística (aceleración de partículas), para transformar tejidos del material parental de maíz denominado líneas AW y CW, de donde se generó la línea NK603, conteniendo el gen de tolerancia a glifosato (denominado comercialmente, Gen Roundup Ready –RR-). El gen RR codifica entonces la enzima EPSPS, tolerante a glifosato.

Figura 60. Ensayo de campo de maíz del evento biotecnológico Yieldgard. Resistencia a Lepidópteros. A. Empresa Cristiani Burkard, finca “Las Vegas”, Tiquisate, Escuintla (Fuente: Cristiani Burkard, 1998-1999), B. Empresa Cristiani Burkard, finca “Las Vegas”, Tiquisate, Escuintla (Fuente: Cristiani Burkard, 1998-1999).

Posteriormente la línea NK603, se utilizó para transferir el gen RR a las líneas comerciales de maíz MO17 y B73, por medio de métodos convencionales de mejoramiento (retrocruzamiento y selección) Después de seis a ocho retrocruzas, fue posible seleccionar plantas con alto rendimiento con el nuevo gen en su genoma, ofreciendo la posibilidad de controlar malezas a menor costo. La semilla de la línea comercial transformada MO17 fue utilizada en los ensayos de campo de Cristiani Burkard, importándose la semilla directamente de los Estados Unidos. Actualmente la Empresa Cristiani Burkard está

En cuanto a la empresa Algodones Mayas S.A., presentó en agosto del 2000 a la UNR y al ICTA la solicitud para importar semilla y establecer un ensayo de campo en cooperación también con Monsanto, pero en este caso en Algodón, con el evento biotecnológico “Roundup Ready”, que como se indicó anteriormente, contiene el gen RR, resistente al glifosato, ingrediente activo del herbicida Roundup Ready. El sistema de obtención del gen RR, fue similar en términos generales al utilizado en maíz, con la diferencia que se usaron distintos vectores (PV-GHGO7) y el método de transferencia fue el de Agrobacterium tumefaciens. Así también la línea parental de algodón original transformada fue la variedad Cooker 312, de donde se derivó la línea de algodón 1445, línea de la cual se derivó la semilla utilizada en el ensayo de algodón en

Guatemala. El ensayo se llevó a cabo en Finca El Naranjo, Masagua, Escuintla y fue observado por UNR. Según personeros de la empresa, el ensayo fue incinerado. Posteriormente, Algodones Mayas S.A., en el año 2001, presentó una solicitud a UNR para importar y establecer un ensayo de campo en Finca El Naranjo, Masagua, Escuintla, con un transgénico. Este trabajo se planteó en cooperación con la empresa Aventis, en el evento biotecnológico “Lyberty” que contiene el gen LL que confiere resistencia a la planta de algodón a glufosinato de amonio, agente activo del herbicida Liberty. En este primer ensayo se trabajó con variedades que contenían el gen de resistencia a glufosinato de amonio (figura 61). En el siguiente año, se presentó una segunda solicitud a las mismas instancias para importar semilla y establecer un ensayo, con poblaciones segregantes de las semillas del primer evento (figura 62). En ambos casos, según personeros de la empresa, la semilla y los rastrojos de los cultivos fueron incinerados. Las semillas, para la realización de los ensayos, fueron enviadas directamente desde la sede de Aventis, en Estados Unidos. En este caso, los ensayos también contaron con la supervisión de UNR. En cuanto a la evaluación y/o gestión de riesgo o evaluación de impacto ambiental, las dos empresas indicaron que lo único que hicieron fue seguir los procedimientos y medidas de bioseguridad que, según sus contrapartes generadoras de los genes, se utilizaban para prevenir el escape y diseminación de los OVM´s.

Figura 61. Ensayo de campo de algodón del evento biotecnológico Liberty. Resistencia a glufosinato de amonio. Empresa “Algodones Mayas S.A.”, finca “El Naranjo”, Masagua, Escuintla (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2001).

Figura 62. Ensayo de campo de algodón del evento biotecnológico Liberty. Selección de progenies resistentes al herbicida Lyberty (glufosinato de amonio). Empresa “Algodones Maya S.A.”, finca “El Naranjo”, Masagua, Escuintla (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2002).

6.30. CONOCIMIENTO DEL PÚBLICO SOBRE LO QUE ES UN ORGANISMO VIVO MODIFICADO. En el conocimiento del público sobre lo que es un OVM, el estudio, tomando como base una muestra de 63 personas entrevistadas, reflejó que la mayoría no tiene conocimiento sobre este tema (73 %), mientras que un 27% considera que sí conoce el tema (figura 63). Este resultado se muestra lógico, puesto que la mayoría de la población no tiene acceso a este tipo de información. Figura 63. Porcentaje del público que considera saber o no que es un OVM.(Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

80 70 60 50 40 30 20 10 0

Del 27% que consideran que sí saben que es un OVM, tienen los siguientes conceptos al respecto: • “Son aquellos organismos que se les ha hecho un cambio y por lo tanto tenemos una nueva función”. • “Organismo que ha sufrido modificaciones genéticas”.

• • • • • • • • • • •

“El que tiene cambio en sus genes originales”. “Es un transgénico”. “Producto transgénico”. “Organismo vivo que ha sido modificado por medio de cruzamientos (o híbridos)”. “Cambio genético en plantas para su mejoramiento”. “Es aquel que ha sido modificado para ampliar algunas de sus características”. “Un organismo cambiado genéticamente”. “Organismo al que se le ha introducido o modificado un gen”. “Un organismo clonado o mutado artificialmente”. “Cambio de material genético en algún producto vegetal”. “Una función nueva”.

Todos los conceptos o ideas de lo que es un OVM se consideran aceptables, por lo que se puede decir que al menos una parte relativamente mediana de la población entrevistada tiene un conocimiento de lo que es un OVM. 6.31. CONOCIMIENTO SOBRE LO QUE ES UN ORGANISMO TRANSGÉNICO.

Tratando de ahondar un poco más sobre el tema de la Biotecnología moderna, se cuestionó a la misma población, sobre si conocía que era un organismo transgénico. Los porcentajes de las personas que no conocen el concepto, y los que lo conocen de manera aceptable, son parecidos a la pregunta sobre lo que es un OVM, que son un 70 y un 30 %, respectivamente (figura 64). Figura 64. Porcentaje del público que considera saber que es un Organismo Transgénico. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 70 70 60 50 40 30 20 10 0

Del 30% que consideran que sí saben que es un Organismo Transgénico, tienen los siguientes conceptos al respecto:

• • • • • • • • • • • • • • • •

“Incorporación de material en bases moleculares”. “Un organismo que se altera alguna secuencia genética”. “Células que han sido alteradas genéticamente”. “Un organismo que tiene variaciones en su ADN”. “Es aquel que ha sido modificado”. “Son aquellos que tienen una nueva función modificada”. “Incorporación de material genético a moléculas”. “Es un organismo vivo que ha sido alterado su código genético”. “Producto con genes de otro”. “Es un ser vivo modificado”. “El que tiene genes que son de otro organismo”. “Organismo genéticos cambiados o modificados”. “Organismo que ha sido alterado genéticamente”. “ADN modificado”. “Organismo modificado y mejorado”. “Que le agregan un gen que beneficia a la planta (organismo) a la resistencia o rendimiento”.

Se hicieron las dos preguntas debido a que algunos podían conocer el término OVM y otros talvez estaban más familiarizados con el término Organismo Transgénico. Sin embargo, las respuestas en éste caso fueron similares a las del conocimiento sobre OVM, indicándonos esto que en la población muestreada, se conocen en igual proporción ambos términos y que, por sus respuestas, los consideran como sinónimos, lo cual puede considerarse apropiado, dadas las limitaciones de conocimientos sobre este tema, en la población muestreada. 6.32. CONOCIMIENTO DEL PÚBLICO SOBRE EL CONSUMO DE ALIMENTOS PROVENIENTES DE OVM’s. Al respecto, un 83% de la población muestreada, en general, considera que no sabe si está consumiendo alimentos provenientes de OVM´s, mientras que un 17% considera que sí (figura 65). Esto reafirma, nuevamente, que hay un escaso conocimiento popular sobre la Biotecnología y sus productos alimenticios derivados.

Figura 65. Porcentaje del público que considera saber o no si está consumiendo alimentos provenientes de OVM´s. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003). 83 90 80 70

84 100 80 60

40 20 0

60 50 40 30

20 10 0

Figura 66. Porcentaje del público que considera saber o no sobre la utilización de los OVM´s. (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

De las personas que respondieron que sí saben, se les preguntó ¿Cuál? y su respuesta fue la siguiente: tomate, cereales, harinas, verduras, vegetales, carnes, frutas, hongos, maíz, maíz dulce, arroz y soya. En el caso de frutas y hongos no se tiene conocimiento de que se haya liberado algún OVM. En el caso de algunos que respondieron vegetales, probablemente se referían a verduras. Aquí se evidencia un poco más el desconocimiento del público sobre si está consumiendo productos provenientes de OVM´s o no, mencionando los productos que mayor publicidad reciben por prensa y televisión. Evidentemente la mayor posibilidad de consumir productos elaborados con OVM´s es al consumir productos alimenticios importados, especialmente de los Estados Unidos de Norteamérica, país que es uno de los mayores productores de OVM´s en el mundo. 6.33. CONOCIMIENTO SOBRE LA UTILIZACIÓN DE LOS ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS. En cuanto a la utilización de los OVM´s, se repite la misma tendencia del desconocimiento popular de este tema, ya que un 84% de la población encuestada, en general, no conoce ninguna utilización de los OVM´s, y solamente un 16% considera que sí (figura 66). Lo anterior consolida la necesidad de popularizar los conocimientos sobre la Biotecnología y sus medidas de Bioseguridad.

Del 16% que respondieron que sí saben, se les preguntó ¿Cuál es su utilidad? y su respuesta fue la siguiente: • “Alimentar a las masas”. • “Mejoramiento del rendimiento y la producción”. • “Introducción de genes para enfermedades de tomate”. • “Alteración en el rendimiento de maíz”. • “Fertilizantes”. • “Defensas a ataques de plagas”. • “Medicamentos”. • “Comestibles”. • “En plantas como por ejemplo maíz”. • “Mejoramiento de alimentos”. • “Variedades de organismos para prolongar su vida contra enemigos naturales”. Un pequeño porcentaje de la población muestreada parece tener un relativo conocimiento de la utilidad de los OVM´s, sin embargo, cuando se les preguntó si sabían de alguna utilización en el país su respuesta fue la siguiente: • “En cultivos, variedades o híbridos resistentes, en cultivos de importancia económica”. • “Se han hecho experimentos en el ICTA”. La primera respuesta puede ser aceptable, considerando que se han hecho experimentos con OVM´s en maíz, algodón, y algunas hortalizas en el país, sin embargo, la segunda respuesta es dudosa, ya que ICTA no ha hecho experimentos con OVM´s como institución per se, sino únicamente ha participado aprobando protocolos de investigación y dando sugerencias sobre el desarrollo de los mismos en las visitas de campo que hacían a los ensayos experimentales.

7. conclusiones 7.01. De acuerdo al trabajo realizado, se encontraron 27 laboratorios vinculados o relacionados al uso de la Biotecnología y/o la seguridad de la Biotecnología, pertenecientes a 17 instituciones, de las cuales 4 son gubernamentales (8 laboratorios), 8 privadas (10 laboratorios) y 5 académicas (9 laboratorios). 7.02. En cuanto al número de expertos los resultados indican 70 profesionales con nivel de licenciatura, 18 con grado de maestría y 15 con grado de doctorado. Además, laboran en éste campo 87 técnicos y 66 personas de apoyo. 7.03. El estudio indica que, hasta el momento, hay 106 proyectos y/o programas, tanto en ejecución como finalizados.

7.04. De 27 laboratorios encuestados, únicamente uno hace evaluación y/o gestión de riesgo, pero a nivel de laboratorio. A nivel de campo únicamente dos empresas indicaron que hicieron una evaluación de riesgo, de acuerdo con los requerimientos que les solicitó la UNR del MAGA. 7.05. De los 27 laboratorios encuestados 18 trabajan en el área de Cultivo de Tejidos, 13 con Marcadores Moleculares y 2 con Ingeniería Genética. Algunos laboratorios trabajan varias áreas simultáneamente por lo que el número total es de 33 laboratorios. 7.06. Existe una gran gama de ciencias relacionadas con los laboratorios de Biotecnología, tanto de la rama vegetal, animal, como humana, fundamentalmente la primera y la segunda con propósitos de mejoramiento genético y producción, y la tercera con fines de prevención de enfermedades y mejoramiento de la salud. 7.07. Los laboratorios están en buena medida relacionados con algunas de las ciencias humanísticas; por ejemplo: Sociología (11 laboratorios), Economía (9 laboratorios), Pedagogía (8 laboratorios), Antropología (5 laboratorios) y Psicología (5 laboratorios). Esto

demuestra que en los laboratorios están concientes de la importancia de la Biotecnología en el área humanística y social. 7.08. Las capacidades existentes en materia de Biotecnología son: 199 ambientes (áreas de trabajo dentro de los laboratorios), con un área total de 12,597 m2, 28 cuartos de crecimiento con un área de 908 m2, 12 invernaderos, con un total de 2,718 m2, 39 autoclaves, 52 cámaras de flujo laminar y 14 termocicladores. 7.09. En cuanto a inventarios/colecciones de especies/variedades/animales y vegetales, tanto vivos como preservados, 14 laboratorios indicaron que sí tienen colecciones, y de estos 13 poseen bases de datos y 14 tienen conexiones a redes globales. 7.10. La mayoría de proyectos trabajan con fondos propios y fondos provenientes de donantes nacionales e internacionales y ONG´s. 7.11. La mayoría de laboratorios trabajan en el ámbito de la diversidad biológica, tanto en la rama animal, humana, como la vegetal; en donde se observa especialmente el uso de las áreas de Cultivo de Tejidos y Marcadores Moleculares para estudios de diversidad biológica; por ejemplo: Genética de Poblaciones, variabilidad genética, caracterizaciones, identificación de genotipos, etc. 7.12. De los 27 laboratorios, 22 indican que tienen un grupo social meta beneficiario. Los laboratorios que respondieron positivamente mencionan a los siguientes grupos: caficultores, pequeños y medianos productores, estudiantes, granjeros y finqueros, productores y exportadores de berries, población centroamericana, población guatemalteca susceptible de contraer la enfermedad de Chagas, productores de caña de azúcar y consumidores. 7.13. De acuerdo con los programas de Biotecnología encontrados, la participación del público, de manera directa es nula. El público participa pero

de forma indirecta, por ejemplo, en el caso de la salud humana, hay grupos o poblaciones que son utilizados elementos para la prueba de tratamientos médicos, o en otros casos, como en el área de Cultivo de Tejidos, los agricultores llevan muestras de plantas para ser cultivados y probados en sus campos de producción. 7.14. De los 27 laboratorios, únicamente siete indican que sí tienen relación sus proyectos con comunidades o pueblos indígenas. Esto refleja que, en general, la Biotecnología no está dirigida, en especial, a los pueblos indígenas. 7.15. Únicamente un laboratorio indica que hace estudio de impacto ambiental, específicamente en el campo de la Protección Vegetal en la UVG, y lo hace mediante la evaluación de daños producidos por enfermedades vegetales en cultivos y dispersión de sus vectores, a nivel de campo. En el caso de impacto social solamente dos laboratorios lo hacen, siendo éstos los del INCAP, siendo la evaluación de tipo cualitativo, cuantitativo y sistematización. 7.16. La situación actual del país indica que el uso de OVM´s es el siguiente: investigación (3 laboratorios), uso confinado (2 laboratorios) y evaluación de riesgo (1 laboratorio). A nivel de campo existen dos empresas que no tienen laboratorio pero que realizaron ensayos de campo y cuya cosecha y rastrojos fueron incinerados. 7.17. Siempre en términos de realidad de la situación de OVM´s, a nivel de laboratorios, únicamente un laboratorio importó una bacteria recombinante, para uso confinado. Dos laboratorios han hecho sus propias transformaciones, clonaciones y transferencia de genes a nivel de laboratorio. A nivel de campo dos empresas introdujeron en el pasado de manera oficial, OVM´s, con fines de investigación, cumpliendo con los requisitos que en su momento existían para cada solicitud. 7.18. El ámbito actual de los OVM´s refleja que sólo tres laboratorios están trabajando con ellos, perteneciendo dos a la UVG, y el otro al LENAP, y lo hacen básicamente con fines de investigación. En la UVG, un laboratorio hace

transformación, clonación y transferencia de genes resistentes al virus de papaya (Carica papaya) que es el laboratorio de Protección Vegetal. Otro Laboratorio de la UVG, que es un laboratorio del CES hace el aislamiento de genes de Plasmodium y tripanosomas, transformándolos, usando E. coli, para finalmente clonarlos. En cuanto al LENAP, está produciendo Taq ADN polimerasa, usando una bacteria recombinante de E. coli introducida al país. Esto ratifica, que la Ingeniería Genética está incipiente en Guatemala, a nivel de laboratorio; pero sus fines son también claramente de carácter benéfico, desde el punto de vista social. 7.19. Todos los laboratorios señalan que no tienen intención de importar o exportar OVM´s, sin embargo, dos laboratorios están, y piensan seguir produciendo OVM´s. 7.20. De acuerdo al diagnóstico realizado, las prioridades nacionales, con relación a OVM´s son salud y protección vegetal. 7.21. Los laboratorios de Microbiología y Virología del INCAP, son los únicos laboratorios, a nivel nacional, que cuentan con un programa o experiencia sobre evaluación de impacto social que se puede utilizar ante la posibilidad de introducción de un OVM. 7.22. En cuanto a OVM´s, actualmente no existe ningún programa o experiencia sobre evaluación de impacto ambiental. 7.23. Únicamente 22 laboratorios poseen medidas de seguridad de la Biotecnología para la realización de sus proyectos de investigación y/o producción. La mayoría de estos laboratorios tienen niveles de seguridad 1 y 2. Solamente un laboratorio (LNS) tiene nivel de seguridad 3. 7.24. El grado de conocimiento público sobre lo que es un OVM, en el presente estudio, reflejó, de acuerdo a la población muestreada, que la mayoría de las personas no conoce este tema.

8. recomendaciones 8.1. Establecer una política nacional para la utilización de la Biotecnología, de una manera racional, de tal manera que se oriente a beneficios concretos para la población guatemalteca, considerando los riesgos de la misma para que no ponga en peligro el patrimonio genético, tanto en flora, como en fauna y la salud humana y animal.

8.6. Propiciar la cooperación interinstitucional a nivel nacional para el uso de la Biotecnología en todas sus ramas, áreas y técnicas.

8.2. Fortalecer el desarrollo de programas de investigación básica y aplicada en la Biotecnología. En ese sentido, debe trabajarse coordinadamente con instituciones gubernamentales, no gubernamentales y académicas, para la ejecución de estos programas.

8.8. Popularizar el conocimiento del uso de la Biotecnología, sus riesgos y beneficios.

8.3. Propiciar la creación de un fondo económico y una cartera de proyectos, de apoyo a los programas de la Biotecnología.

8.10. Fortalecer, apoyar y facilitar la implementación de más infraestructura para el uso de la Biotecnología.

8.4. Promover el uso de la Biotecnología en la conservación y utilización de especies nativas, tanto alimenticias, medicinales, ornamentales e industriales, considerando los riesgos potenciales.

8.11. Promover la transferencia de tecnología, de países más avanzados en este campo, hacia Guatemala, en donde se está iniciando el desarrollo de estas técnicas.

8.5. Establecer programas de cooperación recíproca con otros países e instituciones internacionales, tanto en aspectos generales de desarrollo, como técnicos y científicos en el uso de la Biotecnología.

8.12. Implementar una base de datos de las instituciones y programas que están utilizando Biotecnología en Guatemala.

8.7. Fomentar la formación y capacitación de recurso humano en el uso de la Biotecnología en todos sus campos de acción de carácter benéfico.

8.9. Promover los efectos positivos del uso de la Biotecnología en la utilización sostenible de los recursos naturales del país.

9. bibliografía ASHMORE, S.E. 1997. Status report on the development and application of in vitro techniques for the conservation and use of plant genetic resources. International Genetic Resources Institute, Rome, Italy.

-----------. 1986. Bananos y Plátanos: Su Propagación y Mejoramiento Genético. Laboratorio de Biotecnología Agrícola, Seibersdorf, Viena, Austria. Video de 30 minutos.

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10. apéndice Figura 67A. Identificación de muestras en el Laboratorio Nacional de Salud (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003).

Figura 68A. Cabinas de seguridad en el Laboratorio Nacional de Salud (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003).

Figura 69A. Medidas de Bioseguridad en el Laboratorio Nacional de Salud (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003).

Figura 70A. Laboratorio con nivel 3 de seguridad en el Laboratorio Nacional de Salud (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003).

Figura 71A. Condiciones mínimas de Bioseguridad en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la URL (Fuente: Ing.Agr. Luis Aguirre, 2003).

Figura 72A. Aspecto general de un ambiente de trabajo en el laboratorio Nacional de Salud (Fuente: Licda. Eyda de Campollo, 2003).

Figura 73A. Cuarto de crecimiento del laboratorio de Cultivo de Tejidos del ICTA (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 74A. Espectrofotómetro de luz ultravioleta en el laboratorio de Marcadores Moleculares del ICTA (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 75A. Detalle de cámara de flujo laminar en laboratorio de Cultivo de Tejidos de URL (Fuente: Ing.Agr. Luis Aguirre, 2003).

Figura 76A. Carga de gel de electroforesis en el laboratorio de Marcadores Moleculares de FAUSAC (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 77A. Estufa con agitación magnética y potenciómetro en laboratorio de Cultivo de Tejidos de URL (Fuente: Ing.Agr. Luis Aguirre, 2003).

Figura 78A. Transiluminador en el laboratorio de Marcadores Moleculares de ICTA (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 79A. Enraizamiento de piña en laboratorio de Cultivo de Tejidos de ICTA (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 80A. Planta de chipe en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de ICTA (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003)

Figura 81A. Planta cactácea in vitro en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de ICTA(Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 82A. Planta de mora in vitro en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de URL (Fuente: Ing.Agr. Luis Aguirre, 2003).

Figura 83A. Planta de camote in vitro en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la FAUSAC (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 2003).

Figura 84A. Plantas de café in vitro en laboratorio de Cultivo de Tejidos de ANACAFE (Fuente: Ing.Agr. Amauri Molina, 2002).

Figura 85A. RAPD en gel de agarosa en cultivo de caf茅 en laboratorio de FAUSAC (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 1997).

Figura 86A. SSR en gel de poliacrilamida (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 1999)

Figura 87A. AFLP en gel de poliacrilamida (Fuente: manual del kit de AFLP, 2003).

Figura 88A. Detecci贸n de colonias recombinantes en laboratorio de Marcadores Moleculares de FAUSAC (Fuente: Orozco Castillo, Carlos, Ph.D., 1999).