Manual Prático para Profissionais Biotecnologia Veterinária. by Consuitec

Manual Prático para Profissionais Biotecnologia Veterinária

INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM SUÍNOS COMO GANHAR EFICIÊNCIA NA REPRODUÇÃO DE SEU REBANHO SUÍNO

Equipe técnica Kubus

Anos de Experiência

INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM SUÍNOS COMO GANHAR EFICIÊNCIA NA REPRODUÇÃO DE SEU REBANHO SUÍNO

Traduzido pela Equipe Técnica Consuitec

ÍNDICE n Prólogo da terceira edição.....................................................................................................................5 n 1. Introdução.............................................................................................................................................7 1.1. Vantagens da inseminação artificial............................................................................8 n 2. O cachaço..............................................................................................................................................9 2.1. Anatomia do aparelho genital masculino.................................................................10 2.2. Fisiologia do aparelho genital do cachaço...............................................................11 2.3. Treinamento dos cachaços para a inseminação artificial.................................... 12 n 3. Produção de doses seminais.......................................................................................................... 15 3.1. Laboratório de I.A.: Equipamento mínimo necessário e opções........................ 16 3.2. Manutenção e cuidado com o material de laboratório....................................... 20 3.3. Coleta de sêmen...............................................................................................................21 3.4. Contrastação do sêmen................................................................................................. 24 3.5. Elaboração de doses seminais..................................................................................... 47 3.6. Características e propriedades do diluente..............................................................51 3.7. Conservação das doses seminais................................................................................ 52 3.8. Anexo.................................................................................................................................. 53 n 4. A porca................................................................................................................................................ 55 4.1. Anatomia do aparelho genital feminino.................................................................. 56 4.2. Puberdade......................................................................................................................... 57 4.3. Ciclo sexual....................................................................................................................... 59 4.4. Indução e controle do ciclo estral.............................................................................. 62

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ÍNDICE n 5. Detecção do cio................................................................................................................................ 63 n 6. Momento adequado para a aplicação da dose........................................................................ 67 n 7. Aplicação do sêmen......................................................................................................................... 73 7.1. Introdução do cateter.................................................................................................... 74 7.2. Método de inseminação convencional ou tradicional......................................... 74 7.3. Método de inseminação “mãos livres”...................................................................... 75 7.4. Método de inseminação pós-cervical....................................................................... 78 7.5. Inseminação com sêmen descongelado................................................................... 79 n 8. Uso de plasma seminal sintético em porcas nulíparas...........................................................81 n 9. Manejo da porca inseminada e diagnóstico precoce de gestação..................................... 85 n 10. Controle das condições ambientais na central de inseminação artificial suína.......... 89 n 11. Nutrição do cachaço..................................................................................................................... 99 n 12. Anexos............................................................................................................................................. 107 12.1. Protocolo para centrais de inseminação artificial............................................ 108 12.2. Fichas............................................................................................................................. 113 12.2.1. Ficha de controle individual do cachaço.................................................. 113 12.2.2. Ficha de acompanhamento da C.I.A.......................................................... 114 12.2.3. Cronograma de coletas................................................................................. 115 12.3. Tratamento da água utilizada na C.I.A................................................................. 116

Prólogo

Prólogo da terceira edição Entregamos a terceira edição do manual dedicado à reprodução assistida na espécie suína. Passaram-se muitos anos desde que, pela primeira vez, foi impresso o “Manual de Inseminação Artificial em Suínos”. Este livro, ilustrativo e cômodo para a leitura, idealizado pelo Dr. Santiago Martín Rillo (1952-2000), foi acolhido com tanto entusiasmo que, em seguida, foi traduzido para o inglês pela Dra. Cristian Glossop e para o polonês pelo Prof. Dr. Jerzy Strzezek. A segunda edição surgiu em 1999, um ano antes do falecimento do seu autor e serviu, no passado recente, como modelo para o livro do Dr. Stanimir Dimitrov e colaboradores, apresentado no ano de 2010 para os leitores búlgaros. O Dr. José Luís García Ferrero, o único veterinário que chegou a presidir o gabinete de titular do Ministério da Agricultura espanhol, em trecho de seu “in memoriam” (2001) para a ANAPORC, pronunciou-se do seguinte modo: “Somente sua vitalidade e sua abnegação foram capazes de projetar toda a ciência possível sobre a produção animal, enriquecida de tal modo que, desde suas ações tudo parece mais fácil, neste campo complicado. O mundo da produção de suínos tem um período anterior e um período pós Santiago Martín Rillo. Não há criador, nem profissional do setor, que não tenha aprendido com seus ensinamentos, seus conselhos e suas soluções. A capacidade e a força de Santiago Martín Rillo ultrapassaram o marco nacional para alcançar projeção internacional, a qual não tem comparação no campo das ciências agrárias.” Atualmente estão em uso as seguintes técnicas de reprodução assistida, na espécie suína: • Seleção dos futuros reprodutores • Manejo dos cachaços para I.A. • Seleção das futuras reprodutoras • Educação sexual da nulípara • Detecção de cio em nulíparas e porcas desmamadas • Inseminação • Manejo de granja de modo contínuo ou em bandas de três ou cinco semanas. 5

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Para que seja possível melhorar os resultados de uma granja de suínos servindose das vantagens da I.A. é preciso formatar e aplicar detalhadamente os protocolos que tratam de: • Obtenção de material - Coleta dos ejaculados - Coleta dos ovócitos mediante laparoscopia ou cirurgia - Coleta dos embriões mediante laparoscopia ou cirurgia • Tratamentos biotecnológicos - Preparação das doses seminais e envase/encapsulamento - Refrigeração e conservação das doses seminais - Congelamento e conservação das doses seminais - Descongelamento das doses seminais - Separação espermática por citometria de fluxo - Fecundação dos ovócitos in vitro - Conservação dos embriões - Vitrificação dos embriões • Técnicas de inseminação de porcas - Inseminação artificial standard - I.A. standard bifásica - I.A. standard “mãos livres” - Inseminação pós-cervical - Inseminação intrauterina profunda - Inseminação intra-oviduto com laparoscopia - Transplante dos embriões mediante cirurgia ou não Os autores do Manual que lhes entregamos fizeram de tudo para que o texto seja o mais próximo possível da linguagem do Dr. Santiago Martín Rillo. O Prof. Dr. José Manuel Sánchez Vizcaíno, recordando-se de seu amigo descreveu a sua forma de ensinar e divulgar, para “tentar tratar os temas de suinocultura de um modo didático e atualizado”. Esperamos que este esforço venha somar-se ao formidável trabalho profissional do nosso Mestre e que contribua com a melhora constante da produção de suínos. A Fundação “Dr. Santiago Martín Rillo” faz uma menção especial ao trabalho benéfico e livre de qualquer remuneração dos autores do livro. Mostramos nosso agradecimento à imediata resposta do Prof. Dr. Adam Ziecik (Capítulo 4), do Prof. Dr. Antonio Palomo (Capítulo 11) e do Prof. Dr. Enric Marco (Capítulo 9).

Introdução

Vantagens da inseminação artificial

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1.1. Vantagens da inseminação artificial n

Vantagens zootécnicas

• Diminuição do número de cachaços, com melhora em termos de espaço e de custos de manutenção. • Difusão rápida do progresso genético, melhorando os rendimentos ao se utilizar fornecedores de sêmen com maior valor genético e tornando mais ágil o resultado nas granjas suinícolas. • Produção de lotes destinados ao abate mais homogêneos. - Incremento na precisão da avaliação genética - Os machos destinados à I.A. produzem uma descendência mais numerosa - A informação medida na descendência e incluída em um índice de seleção aumenta a precisão na avaliação dos caracteres medidos • Incremento na intensidade da seleção por aumentar o número de concepções por cachaço através da I.A., em comparação com a monta natural, o que reduz o número de machos a ser selecionado. • Permite controlar a qualidade espermática dos cachaços, os quais estão sujeitos a múltiplos efeitos ambientais, de manejo e sanitários.

Vantagens sanitárias

• Redução do risco de transmissão e aparição de doenças infecto-contagiosas por via sexual. • Redução da entrada de animais portadores de doenças externas.

Vantagens de manejo

• Economia de tempo e esforço, evitando a monta natural e a movimentação dos reprodutores. • Permite usar animais de pesos distintos nos cruzamentos. • Reduz o estresse de animais com problemas cardíacos ou de claudicação, durante a monta.

O cachaรงo Anatomia e fisiologia

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2.1. Anatomia do aparelho genital masculino 1. Testículo 2. Cabeça do epidídimo 3. Cauda do epidídimo 4. Pênis 5. Divertículo prepucial 6. Glândula bulbo-uretral 7. Glândula vesicular 8. Músculo retrator do pênis 9. Bexiga urinária 10. Próstata 11. Uretra

O cachaço

2.2. Fisiologia do aparelho genital do cachaço Os principais hormônios reguladores do sistema reprodutivo do macho são: - O hormônio liberador de gonadotrofina ou gonadorrelina (Gn-RH), produzido no hipotálamo. - O LH, hormônio luteinizante e o FSH, hormônio folículoestimulante, que são produzidos no lóbulo anterior da hipófise e estão sob o controle do Gn-RH, através de mecanismos de retroalimentação negativa. - A Testosterona, principal esteróide produzido pelas células de Leydig.

Eixo Hipotálamo-Hipofisário-Testicular

O hormônio LH é o que estimula as células intersticiais e as células de Leydig, para que secretem testosterona. O hormônio FSH atua sobre as células de Sertoli. É o responsável pelo estimulo de crescimento junto aos túbulos seminíferos e pela espermatogênese, por influir no transporte dos andrógenos: testosterona procedente dos testículos e androstediona sintetizada pelas glândulas supra-renais. A testosterona marca os caracteres anatômicos do macho, controla seu comportamento sexual, a espermatogênese, a atividade das glândulas sexuais acessórias e o mecanismo de ereção. Considera-se que um cachaço atinge a puberdade quando aparecem espermatozóides livres em seus túbulos seminíferos e se inicia sua armazenagem no epidídimo, ou seja, entre quatro e cinco meses de idade. O ejaculado de um cachaço começa a ter parâmetros de qualidade seminal aceitáveis para a utilização em I.A. por volta dos oito meses de idade do macho e sempre que se obtenham ao menos seis a sete ejaculados, anteriormente à entrada do mesmo em produção. A qualidade seminal, tanto em volume como em concentração, aumenta até a idade de dois a três anos, começando a decrescer a partir dos três a quatro anos. 11

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Os testículos são formados por um conjunto de túbulos denominados “túbulos seminíferos” que contêm dois tipos de células: germinativas e de sustentação, estas últimas denominadas células de Sertoli. O tecido intersticial é formado por tecido conjuntivo e pelas células de Leydig, secretoras de andrógenos. A espermatogênese, processo de desenvolvimento de uma célula germinativa em espermatozóide maduro, dura – no caso do cachaço – aproximadamente 34 dias. A seguir, os espermatozóides passam através da rede testicular e dos condutos eferentes para o epidídimo, onde entram no processo de maturação final, durante um período de 14 dias. As glândulas sexuais acessórias contribuem com suas secreções para a incorporação de diferentes substâncias que constituirão o plasma seminal. As vesículas seminais incorporam ácido cítrico, inositol, ergotioneína, frutose-glicose, potássio, fósforo. A próstata incorpora, fundamentalmente, cloretos e uma baixa concentração de ácido cítrico. As glândulas de Cowper ou bulbo-uretrais incorporam grande quantidade de sialo-proteinas, além de cálcio, sódio e magnésio. A função de todas estas glândulas está relacionada com a secreção de testosterona, por parte do testículo. Contrações involuntárias da musculatura lisa impulsionam os espermatozóides, a partir da cauda do epidídimo e do conduto deferente, até a uretra, sendo as contrações desta última o que impulsiona o sêmen no momento da ejaculação. No momento da ejaculação o pênis se encontra totalmente estendido e ereto, graças à sua natureza fibro-elástica. Seu tamanho real muda pouco neste momento e a impressão de aumento aparente é devida ao relaxamento do músculo que regula a curvatura sigmóide. Isso permite a saída e o endurecimento do pênis. Durante a ejaculação ocorre a mistura – quase de modo instantâneo e na região da uretra pélvica – de uma massa densa de espermatozóides com o plasma seminal das glândulas acessórias, para formar o fluido seminal expulso a partir do pênis. O testículo e o epidídimo contribuem com 5% do ejaculado final, enquanto que as glândulas acessórias contribuem com até 95% do volume do mesmo.

2.3. Treinamento dos cachaços para a inseminação artificial O treinamento dos cachaços consiste em fazê-los saltar sobre um manequim (que imita a porca) para realizar a extração do sêmen. Para começar, o manequim precisa ser fácil de transportar e ligeiramente mais baixo que a altura dos olhos do cachaço, devendo ter aproximadamente as medidas de uma porca primípara. Deve ser suficientemente cômodo e firme, para que o animal não se machuque e mantenha a estabilidade durante o procedimento. 12

O cachaço

É preciso considerar que o comportamento sexual natural do cachaço diante da fêmea é precedido, de forma geral, dos atos de cheirar e aplicar golpes com o focinho nos flancos e na parte posterior da mesma, culminando finalmente com o salto – na maioria dos casos. Um cachaço pode começar a ser treinado a partir de seis a sete meses de idade. Os machos adultos que já tenham sido utilizados para a monta natural podem ser submetidos ao treinamento, ainda que – em certas ocasiões e com determinados machos – não se consiga o objetivo de fazê-los saltar sobre o manequim. É conveniente que os animais a serem treinados estejam alojados individualmente, uma vez que o processo de aprendizagem torna-se mais trabalhoso caso estejam agrupados. O amento pode ser realizado com manequins móveis ou diretamente em um manequim fixo situado na sala de coleta de sêmen, embora seja recomendável começar com o manequim móvel, para que os primeiros contatos sejam realizados na própria baia de cada macho. Assim o animal pode centralizar sua atenção no “novo objeto” ao qual está sendo apresentado. Também é importante que estes primeiros contatos sejam feitos na presença – exclusivamente – da pessoa encarregada do manejo do macho. O manequim deverá ser impregnado com odores que estimulem a libido do macho, o que se consegue aspergindo-o com urina de porca no cio ou com sêmen de outro cachaço. O operador deve realizar movimentos de vai e vem com o manequim, para posteriormente mantê-lo imóvel, simulando a imobilização da fêmea no cio. Dependendo das circunstâncias, o grunhido da porca poderá ser imitado durante o treinamento ou o operador poderá falar para chamar a atenção do macho, aproximando do seu focinho um recipiente contendo sêmen de outro cachaço, para estimulá-lo e atraí-lo para o manequim, colocando – na sequência – o recipiente

Desenho básico de um manequim para coleta 13

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sobre o mesmo, de modo a forçar o macho a montá-lo caso queira alcançá-lo. Este procedimento poderá ser realizado também com ração. As sessões deverão ter uma duração de 15 minutos, aproximadamente, com frequência diária pela manhã e à tarde. Uma vez conseguido que o cachaço salte sobre o manequim, estará cumprida a fase mais difícil. Na sequência deve-se habituar o macho com o manequim durante duas semanas, com intervalos de descanso de três a quatro dias entre os saltos e as coletas de sêmen. Terminado este período será implementado um sistema mais adequado no ritmo das coletas seminais, de acordo com a concentração espermática: concentrações das quais se obtenha menos de 15 a 18 doses, uma vez por semana; concentrações superiores, três vezes em duas semanas.

Manequim fixo de inseminação

Produção de doses seminais

Laboratório, coleta e contrastação

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3.1. Laboratório de IA: Equipamento mínimo necessário e opções A seguir enumeramos os equipamentos usuais para o laboratório e as opções existentes, dependendo do seu tamanho, do funcionamento da Central e do uso de material descartável ou de vidro. n Equipamento da sala de coleta e laboratório • Manequim para coleta • Tapete de borracha • Estufa para aquecimento e esterilização (de 40 a 121ºC) • Banho-maria • Placa de aquecimento para temperaturas entre 37 e 39ºC • Agitador eletromagnético com calefação • Sistema purificador de água • Microscópio binocular • Câmera de vídeo e monitor • Colorímetro • Balança eletrônica • Estufas de dupla temperatura do tipo Hot Cold (de 4ºC a 60ºC) • Tanque de diluição • Geladeira a 4ºC para material farmacêutico e soluções para contrastação • Bomba peristáltica para enchimento de doses • Seladora de tubos ou blister • Câmara fria a 16ºC (para armazenagem de doses) • Estufa de conservação a 16°C para a armazenagem de doses • Termômetros de máxima e mínima

Produção de doses seminais

n Material de laboratório Para a coleta dos ejaculados • Copos para precipitação, de vidro (250 a 400 mL) ou copos plásticos descartáveis • Bolsas plásticas com ou sem filtro incorporado • Recipiente térmico (garrafa térmica) para material coletado • Filtros • Borrachas (elásticos) • Luvas de látex ou vinil, sem talco • Luvas de plástico Para a avaliação da qualidade seminal • Lâminas • Lamínulas • Provetas graduadas • Câmara de Bürker • Pipetas Pasteur • Pipetas de 1 mL cristal ou automática • Pipetas de vidro de 10 mL • Balão volumétrico de 100 mL • Termômetros de álcool ou termômetro a laser • Grades e tubos de ensaio • Soro fisiológico formulado • Reagentes comuns: formaldeído a 40%, citrato de sódio, cloreto de sódio • Reagentes para tingimento

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Para a preparação das doses seminais • Balões do tipo Erlenmeyer de 2000 a 5000 mL • Jarras de plástico de 2000 a 5000 mL • Bolsas para diluição • Diluente para sêmen de cachaço • Água bidestilada ou purificada • Envases para doses seminais (frascos, tubos, blister, ...)

Laboratório: tanque de diluição

Para a limpeza do material de laboratório • Escorredor de material • Escovas para limpeza • Frasco lavador com cânula • Papel toalha ou secante para mesas • Sabão neutro para laboratório • Desinfetantes para superfícies

Produção de doses seminais

Para a inseminação • Refrigerador portátil para transporte a 16ºC alimentado por bateria recarregável • Cateteres de inseminação: de borracha ou descartáveis (espuma ou espiral) • Esterilizador de cateteres (no caso da utilização de cateteres de borracha) • Lenços impregnados com desinfetante (tipo lenços umedecidos) • Luvas de látex ou plástico • Alforjes para inseminação • Feromônios sintéticos em forma de spray • Banho-maria para aquecimento de doses seminais a 37ºC • Carrinho de inseminação

Para a gestão da central de inseminação artificial (C.I.A.) • Fichas para controle da rotina de coleta • Fichas individuais para controle de cachaços • Fichas para controle de inseminação • Software de Gestão de C.I.A. e equipamento básico de informática

Laboratório: setor de contrastação

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3.2. Manutenção e cuidado com o material de laboratório n Limpeza A limpeza do laboratório de inseminação artificial e do material utilizado para processar as doses seminais é imprescindível, para manter em perfeitas condições a higiene do material de laboratório e a conservação das doses seminais. O laboratório deve ser limpo depois de cada jornada de trabalho e sempre que seja necessário.

Para que o ambiente no laboratório seja o mais asséptico possível, o material deve permanecer sujo o menor tempo possível. Os passos para sua limpeza e esterilização são os seguintes: 1

Ensaboar e lavar o material de vidro com escova de laboratório, para eliminar a sujeira hidro e lipossolúvel. O sabão utilizado no laboratório deve ser neutro em termos de pH e não deixar nenhum resíduo que atue como espermicida.

Enxaguar com água em abundancia para retirar restos de sabão.

Re-enxaguar posteriormente com água destilada para eliminar os restos de água corrente e os sais minerais.

Escorrer o material de laboratório.

Uma vez seco, o material de vidro deve ser colocado na estufa de esterilização, por no mínimo 20 minutos a 121º C.

Depois da esterilização o material deve ser tampado com papel de alumínio e guardado em um armário fechado, para isolá-lo do ambiente exterior.

Limpeza de mesas e locais de trabalho, ao término da jornada: limpar com água e sabão os restos de diluente, sêmen, etc., que haja sobre as superfícies e – posteriormente – secar com papel limpo, pulverizar álcool etílico a 70% e deixar evaporar. Desinfetantes de superfícies para laboratórios também podem ser usados.

Produção de doses seminais

n Manutenção • Controle das temperaturas dos aparelhos: comprovação periódica das oscilações da estufa de conservação, banho-maria, etc. …, através do uso de termômetro de máxima e mínima ou mediante a utilização de registradores de temperatura (data-loggers) • Limpeza periódica do banho-maria • Ajuste e limpeza periódica do microscópio • Limpeza e desinfecção das borrachas da bomba peristáltica • Verificação periódica da calibragem dos aparelhos de medição: balanças, termômetros, pipetas automáticas

3.3. Coleta de sêmen Quando os cachaços estão habituados a saltar sobre o manequim, a extração do sêmen deve ser realizada em um manequim fixo, localizado na sala de coleta. A sala de coleta deve assegurar condições de higiene e de segurança, tanto para o animal como para o funcionário, durante a coleta. Por “segurança do cachaço” entendemos toda a ação e/ou procedimento que evite as quedas e escorregões do animal, assim como sua exposição à presença de outro macho. Todo o material que vá receber e estar em contato com o sêmen deve observar algumas condições indispensáveis: • Estar aprovado como não espermicida • Estar limpo e esterilizado • Estar previamente aquecido a 37ºC O ejaculado deve ser recolhido diretamente no copo de precipitado ou em outros recipientes descartáveis (copo ou bolsa plástica) situados dentro de uma caixa térmica, para que a temperatura próxima de 37ºC seja mantida. Sobre esse recipiente se coloca um filtro, para que durante a coleta se impeça a mistura da fração espermática do ejaculado com sua porção gel ou com outras partículas estranhas. Atualmente estão disponíveis no mercado bolsas de coleta plásticas que têm um filtro incorporado. A técnica mais correta para a extração do sêmen é a da “luva dupla”, onde a segunda luva ou luva externa mantém limpo, primeiramente, o interior, até o momento imediatamente anterior ao início da sujeição do pênis para começar a coleta propriamente dita.

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Quando o animal está sobre o manequim deve-se realizar um esvaziamento da bolsa prepucial, pressionando-se a mesma para eliminar os restos de urina e líquidos prepuciais que houver. Com certa frequência se aproveita este momento (do salto) para o corte dos pelos presentes na abertura do prepúcio. Se limpa a região com as toalhas contendo desinfetantes, as quais – na sequência – serão descartadas juntamente com a primeira luva, das duas que protegem a mão do responsável pela coleta. Ao se exteriorizar a glande, o responsável deverá sujeitar o pênis do cachaço sem exercer uma pressão muito grande e, de tal forma que os seus dedos cheguem à borda da espiral da glande ou “caracol”. Isto permitirá, a través de suaves tracionamentos, a extensão de todo o pênis e a sua colocação em posição horizontal, a qual deverá ser mantida ao longo do tempo de ejaculação. No caso de ejaculados que tenham problemas de aglutinação é conveniente realizar a coleta e incorporá-la a 100 mL de diluente MR-A a 37ºC. Ao término da coleta deve-se descartar o filtro e a segunda luva. Então, imediatamente, passar o recipiente com o ejaculado coletado para o laboratório, através da janela de comunicação. As vantagens da coleta de sêmen incorporada aos 100 mL de diluente previamente aquecido são: - O sêmen é colocado em um meio adequado - O diluente começa a “trabalhar” imediatamente

Coleta de sêmen

- O líquido tem menor variação de temperatura que um objeto de plástico ou outro material inerte (recipiente térmico, bolsa ou copo de coleta)

- Permite estender o tempo entre a coleta e a diluição do ejaculado. Sem o diluente, esse tempo não deverá ser maior que 15 minutos - Diminui a aglutinação dos ejaculados

ATENÇÃO! Não é preciso fazer mudanças nos cálculos da concentração espermática do ejaculado; usar, caso, o volume da coleta (volume de sêmen + volume de diluente) em vez de apenas o volume de sêmen. Coleta em sistema de contenção 22

Produção de doses seminais

n Frações do ejaculado O ejaculado do cachaço é composto de três frações: A fração pré-espermática é a primeira emissão do ejaculado. Não interessa recolhe-la, já que não contém espermatozóides e costuma ter uma carga altamente contaminante. É transparente, muito líquida e de volume escasso (10 a 15 mL, aproximadamente). A fração espermática ou rica em espermatozóides vem em seguida da primeira fase e sai rapidamente, devido à primeira contração que sofre a cauda do epidídimo. É de cor branca e muito densa, de aspecto “leitoso”. Tem grande concentração de espermatozóides e um volume próximo de 100 mL. Esta é a fração que mais nos interessa coletar, para a I.A. A fração pós-espermática ou pobre em espermatozóides é constituída por secreções das glândulas acessórias do aparelho reprodutivo do cachaço e contém escassos espermatozóides. É de cor esbranquiçada transparente, com grumos gelatinosos ao longo de sua emissão, com volume aproximado de 200 mL. Pode estar intercalada com emissões intermitentes da fração rica, por isso convém estar atento para aproveitá-las durante a coleta. Esta fração, por conter grande quantidade de plasma seminal, atua estimulando os espermatozóides. Por isso não é recomendada a sua utilização em I.A., no caso de se querer conservar o sêmen por mais de 24 horas. Recomenda-se apenas recolher a parte mais leitosa dessa fração, deixando escorrer a sua parte que é totalmente transparente para fora do recipiente térmico. Durante todo o processo da ejaculação, particularmente na primeira e terceira fases, são expulsos alguns grumos gelatinosos conhecidos vulgarmente como “tapioca”, procedentes das glândulas de Cowper e que atuam como tampão para a cérvix da porca em condições de monta natural. Não nos interessa a coleta desse gel ou “tapioca”, já que ele provoca a gelificação do líquido seminal; ele deverá ser eliminado com a ajuda do filtro situado no copo ou bolsa de coleta. Uma vez coletado o sêmen, deve-se levá-lo imediatamente ao laboratório, para sua contrastação e processamento. Quando a concentração for elevada e o número de doses previsto nos indique que a diluição (sêmen-diluente) poderá ser superior a 1:25, deverá ser realizada a coleta da fração rica, ou de uma fração intermediária de 150 mL ou mais. O grau de diluição de um ejaculado indica a relação entre o volume de sêmen e o de diluente. Deverá estar situado sempre entre 1:4 e, no máximo, 1:25 e deve-se ter em mente que a melhor conservação das doses é obtida quando o grau de diluição se situa ao redor de 1:10. 23

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A fórmula para o cálculo do grau de diluição é a seguinte:

*Atenção: Para conhecer o volume de sêmen adicionado ao diluente será preciso descontar o volume de diluente adicionado, do volume total da coleta.

3.4. Contrastação do sêmen n Introdução A contrastação ou avaliação do sêmen é fundamental para detectar problemas de sub-fertilidade e infertilidade no cachaço, consequência de fatores distintos que influenciam a qualidade seminal, entre eles os fatores ambientais, o estado nutricional, as condições sanitárias, etc. As técnicas de contrastação seminal, na prática, devem cumprir três requisitos: simplicidade, rapidez e economia.

Contrastação seminal

A avaliação do sêmen coletado, valendo-se de diversas técnicas laboratoriais, permite a obtenção atualizada de informações – através de espermograma – com as quais se pode determinar a qualidade espermática com muita precisão, o que é fundamental para a máxima otimização do potencial reprodutivo dos fornecedores de sêmen. Por um lado, estas técnicas de avaliação seminal permitem identificar aqueles cachaços que podem estar produzindo sêmen de má qualidade, prevenindo um decréscimo nos resultados de fertilidade e/ou prolificidade; por outro lado, permitem identificar os machos com sêmen de melhor qualidade, otimizando assim o uso daqueles que têm maior capacidade fecundante.

Produção de doses seminais

Podemos resumir as técnicas de contrastação no seguinte esquema: n Avaliação macroscópica • Cor • Odor • Volume

n Métodos microscópicos • Motilidade • Grau de aglutinação • Concentração espermática • Morfologia dos espermatozóides • Integridade dos acrossomas • Funcionalidade espermática • Grau de contaminação

n Análises bioquímicas Análises enzimáticas • Determinação de AAT (aspartato aminotransferase) • Determinação de acrosina Composição do plasma seminal • Proteínas • Cálcio • Zinco • Magnésio Composição fosfolipídica da membrana espermática Estudos do nível metabólico espermático

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n Análises microbiológicas Para controle da presença e do crescimento de bactérias no sêmen diluído e identificação de germens, através de cultivos bacteriológicos.

n Determinação do estado do núcleo espermático • Determinação da fragmentação do DNA através das provas TUNEL ou COMET • Uso de cromomicina A3 • SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay ou prova da estrutura cromatínica espermática) • SCDt (Sperm Chromatin Dispersion Test ou teste de dispersão da cromatina espermática)

n Provas de interação espermatozóide-ovócito-oviduto • Teste de união do espermatozóide com a zona pelúcida • Teste de penetração de ovócitos de hamster livres de zona pelúcida (SPA) • Teste de Fertilização In Vitro FIV homólogo • Ensaio da união espermatozóide-oviduto

Produção de doses seminais

2 Avaliação seminal

Uma vez que o ejaculado chegue ao laboratório, os parâmetros que podem ser avaliados são os seguintes:

1. Cor e odor: Observa-se se a cor esbranquiçada do sêmen é nítida ou se está enturvada com outros tons, como marrom, avermelhado ou amarelado. A aparição de cores ou odores anômalos pode ser devido a alterações patológicas do aparelho genital ou à mistura do sêmen com urina, durante a ejaculação.

2. Temperatura: A temperatura do sêmen deve ser medida no copo de coleta, antes de colocá-lo dentro do banho-maria (ou na estufa de conservação) a uma temperatura entre 33 e 37ºC, dependendo do modo de trabalhar. Comprovar que a diferença de temperatura entre o ejaculado recolhido e o banho-maria não seja superior a 2ºC. Caso isso ocorra, ajusta-se sempre a temperatura do banho-maria à temperatura do sêmen, nunca o contrário. Também se pode manter o ejaculado nestas mesmas temperaturas, porém em uma estufa de calor seco. Não manter nunca o sêmen puro por mais de 15 minutos no banhomaria, antes da diluição, para evitar danos na membrana espermática. Como já se comentou, esta é uma das vantagens de coletar adicionando a 100 mL de diluente, uma vez que essa prática permite alongar o tempo entre a coleta e a diluição.

3. Volume do ejaculado (fração rica) É quantificado em mL ou em centímetros cúbicos (cc). Para se determinar sua medida utilizam-se provetas graduadas ou uma balança, pesando-se o ejaculado (descontando previamente o peso do copo de coleta). Considera-se 1grama = 1cc. O volume normal da fração rica do ejaculado oscila entre 50 e 150 cc, aproximadamente. Varia segundo a idade, o tamanho testicular, a raça e o estado fisiológico de cada cachaço.

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4. Motilidade: • 4.1 Mediante visualização através de microscópio Avalia-se colocando uma gota pequena do ejaculado em uma lâmina aclimatada a 38/39ºC, colocando-se sobre ela uma lamínula. Para fazer chegar o material a ser analisado na temperatura indicada, é necessário usar uma placa aquecida. Observa-se a amostra através de microscópio com 100 a 200 aumentos, avaliando-se o movimento geral (estabelecendo um valor percentual) e o tipo de movimento individual (pontuação de zero a cinco). No caso da avaliação da motilidade do sêmen conservado, devem-se realizar duas observações distintas: uma delas através de uma gota de sêmen diluído e aclimatado e a outra com uma gota de sêmen diluído, à qual se adiciona uma gota de solução de cafeína (ver o Anexo, no final do capítulo), o que servirá para determinar a real capacidade de movimento dos espermatozóides. • 4.2 Através de sistemas automáticos de análise de imagens CASA (Computer Assisted Semen Analysis ou análise seminal assistida por computador) Permitem uma avaliação objetiva da motilidade. Realizam uma análise das trajetórias dos espermatozóides e sua classificação percentual por: • Progressividade (estáticos, móveis não progressivos, móveis progressivos) • Velocidade (rápidos, médios, lentos, estáticos) • Classificação da Organização Mundial da Saúde ou OMS (progressivo rápido ou tipo a; progressivo lento ou tipo; não progressivo ou tipo c; imóvel ou tipo d)

5. Aglutinação: Ao se avaliar a motilidade espermática, às vezes se observa acúmulos de células maiores ou menores: é a aglutinação espermática. Estabelecese, para essa avaliação, uma pontuação de zero a +++, sendo três cruzes uma aglutinação muito evidente. Ao se avaliar a motilidade da amostra as Detalhe da aglutinação células aglutinadas não devem ser consideradas, na porcentagem total de células em movimento. 28

Produção de doses seminais

Classificação do movimento individual Espermatozóides sem movimento. Espermatozóides com movimento pobre, suas cabeças permanecem fixas e somente as caudas se movem, podendo girar sobre si mesmos. Não há movimento progressivo. Espermatozóides com movimentação em círculos, alguns de modo progressivo. Movimentos progressivos e sinuosos. Movimentos progressivos rápidos. Movimentos progressivos muito rápidos.

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6. Concentração do ejaculado: Seu cálculo é fundamental, uma vez que em função da concentração e do volume do ejaculado será possível calcular o número de doses a preparar. Consiste na determinação do número de espermatozóides por unidade de volume, a qual pode ser realizada por diferentes métodos, sendo os mais usuais: • Câmaras de contagem celular (Bürker, Neubauer, Thoma, …). • Colorimetria. • Sistema integrado de contagem de espermatozóides, mediante microscopia de fluorescência (Nucleocounter). • Sistemas automáticos de análise de imagens CASA.

• 6.1. Contagem de espermatozóides com câmara de Bürker A contagem, com o auxílio da câmara de Bürker, é o método mais recomendado para as pequenas Centrais de I.A., por sua simplicidade e baixo custo.

Câmara de Bürker

Balão volumétrico

O procedimento é o seguinte:

Misturar bem o ejaculado antes de tomar 1 mL de sêmen puro com a ajuda de uma pipeta

Realizar uma diluição de 1:100 em uma solução de soro fisiológico formulado a 3% (ver anexo), utilizando para tanto um balão volumétrico de 100 mL; caso utilize um balão volumétrico de 50 mL, adicionar então somente 0,5 mL de sêmen, para manter a mesma proporção de diluição

Produção de doses seminais

Homogeneizar suavemente a mistura e retirar dela, com o auxílio de uma pipeta Pasteur, uma gota para encher a câmara de Bürker

Ajustar bem a lamínula na câmara de Bürker

Posicionar a pipeta Pasteur entre a cobertura e a câmara, deixando que o retículo da mesma se encha por capilaridade

Observar ao microscópio em campo claro, com aumento de 400x

Realizar a contagem dos espermatozóides presentes em 40 quadrados do retículo da câmara (A).

Contaremos aqueles espermatozóides cujas cabeças estejam situadas dentro dos quadros da retícula e aqueles cuja cabeça toque o lado superior, o lado direito e as esquinas superiores e inferiores direitas do quadro. A área dos quadros pequenos da retícula vem especificada na câmara de Bürker, correspondendo a 0,0025 Vista da Câmara de Bürker através do mm2. A altura entre a câmara e a microscópio cobertura é de 0,1 mm2. Portanto, o volume contido em cada quadro é de: 0,0025 mm2 x 0,1 mm2 = 0,00025 mm3 O volume contido nos 40 quadros será: 0,00025 mm3 x 40 = 0,01 mm3 A é o número de espermatozóides em 0,01 mm3. Para transformá-lo em cm3:

A x 100 = nº de espermatozóides em 1 mm3 x 1.000 (A x 100) x 1000 = nº de espermatozóides em 1 cm3

Como se parte de uma diluição 1:100, o conteúdo de espermatozóides do sêmen sem diluir será:

A x 100 x 1.000 x 100 = A x 107 espermatozóides/cm3 de sêmen puro 31

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Para determinar o número total de espermatozóides do ejaculado multiplica-se este valor pelo volume do ejaculado V em cm3. Total de espermatozóides por ejaculado (C) = V x A x 107

Vista real ampliada de um quadradinho da câmara de Bürker (3 esperm.)

Vista da câmara de Bürker 32

Detalhe da recontagem espermática com a câmara de Bürker

Produção de doses seminais

• 6.2. Colorimetria A determinação da concentração através do espectrofotômetro ou colorímetro é uma metodologia bastante utilizada em grandes Centrais de I.A., onde se requer a realização de re-contagens de um grande número de ejaculados. A colorimetria consiste em registrar a quantidade de luz absorvida por Colorímetro uma amostra. O colorímetro contém uma célula foto-elétrica que reage à passagem da luz através de pequenos cubos, medindo a densidade óptica das amostras seminais e registrando seus respectivos valores de absorbância. Este método de estimativa da concentração baseia-se na correlação existente entre o número de espermatozóides por unidade de volume e a opacidade do sêmen. Esta metodologia, contudo, tem o inconveniente de apresentar erros importantes na determinação da concentração de espermatozóides (spz) presentes, devido à opalescência imprevisível do plasma seminal e porque a concentração de proteínas presentes no referido plasma é muito variável. O colorímetro deve ser calibrado com certa frequência, para evitar desajustes no mesmo.

Reta-padrão do colorímetro: A construção de uma reta-padrão consiste na obtenção de um valor de concentração espermática (milhões de spz/mL) para cada valor de absorbância. Este valor pode ser obtido através de contagem com a câmara de Bürker ou por intermédio de outros sistemas, como o Nucleocounter. Essa construção é possível, uma vez que existe uma correspondência entre os valores de absorbância com as distintas concentrações de espermatozóides. Com os dados obtidos é possível delinear uma retapadrão no programa Excel, através de um gráfico de dispersão que inclui a equação da reta e o valor de coeficiente de regressão ou R2. A equação será mais confiável quanto mais próximo de 1 for o valor de R2. O colorímetro é uma ferramenta que nos permitirá determinar rapidamente a concentração do sêmen, uma vez obtida uma boa reta de calibragem.

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Medida da absorbância pelo colorímetro No colorímetro, selecionar um filtro de 560 ηm de longitude de onda (entre 520 e 590ηm); então: • Introduzir o tubo com a solução “branco” (diluente), estabelecendo o valor 0 (zero) de absorbância para a mesma • Retirar o tubo da solução “branco” e introduzi-lo na próxima amostra, registrando a medida da absorbância

• 6.3. Sistema integrado de microscopia fluorescente (Nucleocounter) O Nucleocounter consiste em um microscópio de fluorescência com um software integrado, capaz de ler e contar os sinais luminosos que se desprendem dos núcleos das células espermáticas, depois de terem sido tingidas com iodeto de propídio e após a sua excitação com luz, a uma determinada longitude de onda. Desta forma, o Nucleocounter pode medir a concentração do sêmen de cachaços, tanto puro como diluído em uma dose seminal. Para realizar a contagem os espermatozóides precisam ser previamente diluídos em um meio que provoca a ruptura das membranas plasmáticas, para expor o DNA das células espermáticas ao iodeto de propídio (fluoro cromo com afinidade pelos ácidos nucléicos). O aparelho emite uma luz verde sobre a amostra, a qual faz com que o DNA – unido ao iodeto de propídio de cada espermatozóide – se excite e emita uma luz fluorescente que será detectada individualmente pelo sistema. O software só reconhece como espermatozóide os sinais luminosos que correspondam a espermatozóides e não a outros tipos de células, bactérias, ou demais artefatos, dando assim um resultado mais exato. O resultado aparece como milhões de espermatozóides/mL.

7. Formas anormais: O cálculo do percentual de formas anormais poderá ser realizado: • No momento da re-contagem de espermatozóides na câmara de Bürker • Após tingir o total de células e observá-las ao microscópio de campo claro, com objetiva de 40 ou 100 aumentos, identificando as formas anormais existentes a cada 50 a 100 células contadas

Produção de doses seminais

• Em seguida da fixação de uma amostra com solução de formolcitrato (ver Anexo), observando as anomalias morfológicas existentes em um microscópio de contraste de fases a cada 50 a100 células contadas, com objetiva de 40 ou 100 aumentos

Formas anormais: Cabeça piriforme, duplo trato intermédio, cauda em chicote e gota citoplasmática proximal 35

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8. Estado do acrossoma: O acrossoma é uma estrutura do espermatozóide situada na parte anterior da cabeça e que tem um papel fundamental na fecundação, uma vez que contém as enzimas necessárias para atuar no processo de penetração no cumulus oophurus e na zona pelúcida do óvulo. Alterações do acrossoma ou do referido processo inibem a capacidade fecundante da célula espermática. No princípio, a análise do estado do acrossoma dependia de laboratórios especializados que dispusessem de microscópios de contraste de fases e de pessoal mais qualificado, que realizava e interpretava esse tipo de análise; no entanto, é cada vez mais freqüente a realização desse tipo de avaliação nos laboratórios próprios das Centrais de inseminação, principalmente nas de grande porte.

• 8.1. Técnica de avaliação do estado do acrossoma através do contraste de fases 1

Colocar em uma grade pequena, tubos de ensaio com aproximadamente 2 mL de solução de formol-citrato ou solução de glutaraldeído (ver Anexo)

Tomar, com uma pipeta, uma a duas gotas de amostras de sêmen

Em uma lâmina limpa, pingar uma gota e, sobre a mesma, colocar uma lamínula. Adicionar uma gota de óleo de imersão

Observar a integridade dos acrossomas com o microscópio de contraste de fases a 1.000 aumentos (objetiva de imersão 100x)

Realizar a contagem dos acrossomas normais e alterados, observando o mínimo de 50 a 100 espermatozóides

Quando o acrossoma está íntegro, observase uma espécie de meia lua escura na parte mais externa da cabeça do espermatozóide. O acrossoma normal tem a membrana com bordas bem nítidas, sem nenhuma irregularidade. Quando o acrossoma começa a corromper-se, se observa pequenas rugosidades na referida membrana e, à medida que avança a deterioração, aparecem pequenas rachaduras e irregularidades, cada vez mais visíveis. Acrossoma íntegro

Produção de doses seminais

Acrossoma normal

Acrossomas alterados Alterado

Em fase de deterioração

Perdido

Acrossoma alterado, em fase de deterioração e perdido

Para a obtenção de um percentual fidedigno de acrossomas normais, deve-se realizar uma contagem mínima de 50 a 100 células. • 8.2. Técnica de avaliação do acrossoma através de tinturas não fluorescentes Coloração de Giemsa Este método de tintura permite avaliar o estado do acrossoma. Reagentes: • Giemsa: 3 mL • Solução de Sorensen: 2 mL • Água destilada: 45 mL Procedimento:

Coloração de Giemsa

Fixar a amostra com solução salina em formol (5%) durante 15 minutos. Cobrir a extensão com o reagente Giemsa durante 90 minutos. Lavar e secar. 37

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Coloração com Azul de Anilina Permite diferenciar morfologicamente as células espermáticas, com acrossoma íntegro e/ou não íntegro, usando microscópio óptico simples. Reagentes: • Solução de PBS com pH 7,2 • Glutaraldeído a 3% em PBS • Solução a 2% de ácido acético

Coloração com Azul de Anilina

• Azul de anilina Procedimento: • Centrifugar 10 mL de sêmen diluído. Eliminar o sobrenadante, agregar igual volume de diluente MRA® e homogeneizar • Gotejar em lâmina e secar à temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos • Fixar em glutaraldeído a 3% por imersão, durante 15 minutos • Escorrer e deixar secar à temperatura ambiente, durante 15 minutos • Submergir de cinco a seis vezes em água destilada, escorrendo o excesso sobre papel de filtro • Submergir em azul de anilina, durante 30 min. Cobrir com água destilada até eliminar os restos de corante; em seguida lavar com o frasco lavador, por ambos os lados da lâmina e deixar secar à temperatura ambiente • Observar a tintura com microscópio óptico em objetiva de imersão de 100x.

Produção de doses seminais

• 8.3. Técnica de avaliação do acrossoma através de tinturas fluorescentes Por intermédio de lectinas unidas a fluorocromos: • PSA-FITC (conjugado de Pisum sativum com isotiocianato de fluoresceína): une-se à glicoproteína na parte externa da membrana acrossomal • PNA-FITC (conjugado de Arachis hypogea com isotiocianato de fluoresceína): une-se aos glicoconjugados da matriz acrossomal • SBTI-Alexa Fluor 488 (conjugado de Soybean Trypsin Inhibitor com o fluorocromo Alexa Fluor 488): une-se à acrosina, protease acrossomal • Outros compostos como o Lysotracker Green, que penetra no acrossoma íntegro (com pH ácido = 5) mantendo a fluorescência se sua membrana estiver íntegra; ou mediante a imunofluorescência indireta por anticorpos monoclonais ou policlonais unidos a corantes fluorescentes, uma vez que estes se unem a Acrossomas tingidos pelo PSA-FITC com antígenos de membrana ou permeabilização prévia de membrana da matriz acrossômica.

9. Contaminação: Pode ser avaliada através de contraste de fases ou mediante tinturas do tipo Panóptico Rápido. De forma geral, o grau de contaminação (presença de bactérias, células de descamação, plasma seminal, …) varia entre 0 (zero) e 3 cruzes (+++).

10. Tinturas vitais: As tinturas vitais são utilizadas para colocar em evidência a integridade estrutural da membrana espermática, mediante o uso de corantes impermeáveis, os quais penetrarão no interior da célula apenas se a membrana não estiver íntegra. Pode-se aplicar essas técnica através do uso de tinturas não fluorescentes (exemplo: azul tripán) e/ou mediante tinturas fluorescentes (iodeto de propídio)

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• 10.1. Coloração de Azul Tripán Reagentes: • 2 g de Azul Tripán • 100mL de diluente Procedimento: • Diluição do Azul Tripán no mesmo meio de diluição que os espermatozóides • Mistura da amostra espermática com igual volume de solução de Azul Tripán 1:1 v/v • Incubação da diluição durante 15 minutos a 37°C • Extensão sobre uma lâmina aclimatada e seca ao ar. Serão observados ao microscópio de campo claro: espermatozóides com a cabeça branca (sem tingir), os quais corresponderão aos espermatozóides vivos e espermatozóides com a cabeça azulada (tingidos), os quais serão classificados como espermatozóides mortos.

Coloração com Azul Tripán

• 10.2. Coloração com Hancock Stain (eosina-nigrosina) Reagente: • Corante Hancock Stain (corante à base de eosina-nigrosina) Procedimento: • Aquecer as lâminas a 37ºC • Colocar em um extremo da lâmina aquecida, uma gota do corante Hancock (aproximadamente 0,1 mL)

Produção de doses seminais

• Com a pipeta Pasteur, adicionar sobre o corante uma gota de sêmen puro recém coletado (aproximadamente 0,1 mL); misturar suavemente • Cobrir a lâmina com uma placa de Petri e incubar durante 30 minutos • Com outra lâmina em posição de bisel a 45º, realizar um esfregaço • Secar o esfregaço à temperatura ambiente • Observar as células espermáticas com microscópio óptico em aumento de 100x • Contar um total de 100 células, entre células não coloridas e brilhantes (células vivas) e células coloridas (células mortas); realizar uma contagem por lâmina • Calcular o percentual de células vivas e células mortas

Coloração com eosina-nigrosina (Hancock Stain)

11. Provas de funcionalidade da membrana espermática: Ajudam a determinar não só a integridade estrutural da membrana do espermatozóide, como também a sua funcionalidade. • 11.1. Através de testes osmóticos A) Teste Hipo-Osmótico ou THA (em inglês, HOST ou hypo-osmotic swelling test) Avalia o percentual de espermatozóides com membrana sem alteração estrutural, mas que sofrem enrolamento de cauda após a incubação em meio hipo-osmótico.

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Para tanto, incuba-se em banho Maria a 37°C, 100 μl de sêmen diluído em 1 mL de uma solução hipo-osmótica (150 mOsm/kg). Após uma hora de incubação fixa-se a amostra em uma solução a 0.2% de formaldeído ou glutaraldeído. Existe um tipo de teste THA com redução no tempo de incubação. Teste hipo-osmótico (THA ou HOST)

B) Teste de resistência osmótica (ORT, em inglês) Este teste permite avaliar a resistência das membranas do espermatozóide através de algumas provas envolvendo temperatura, durante um período prolongado de incubação e frente a um choque osmótico, com as quais a resistência da membrana espermática – especialmente a acrossômica – fica aparente. Material necessário: • Tubos de ensaio de 5 mL • Frascos-ampola de 2 mL • Grades • Pipetas de 1 mL • Solução iso-osmótica (MR-A®) • Solução hipotônica (adicionar 50 mL de água destilada a 50mL de diluente MR-A®) • Solução para fixação (glutaraldeído ou formaldeído) (ver Anexo) • Lâminas • Lamínulas • Contador de células • Microscópio de contraste de fases

Produção de doses seminais

Técnica: Colocar 3 mL de diluente iso-osmótico em um tubo de ensaio e 3 mL de diluente hipotônico a 37ºC no outro. Adicionar 0,2 mL da fração espermática do ejaculado em cada tubo com os diluentes preparados anteriormente e incubálos em banho Maria a 37ºC. Aos 15 minutos de incubação tomar uma amostra da diluição do diluente iso-osmótico e fixá-la com a solução de formaldeído ou glutaraldeído (ver Anexo); calcular o percentual de acrossomas normais (a) Às 2 horas de incubação, tomar uma amostra da diluição do diluente hipotônico, fixá-la do mesmo modo e calcular o porcentual de acrossomas normais (b) O cálculo do valor ORT é realizado calculando-se a média das duas contagens: % de acrossomas (a) + % de acrossomas (b)

A categoria de ORT é obtida com base na tabela seguinte:

A categoria 1 corresponde às classes 4 e 5, a categoria 2 corresponde à classe 3 e a categoria 3 aos grupos 1 e 2, da classificação de Schilling (1986):

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Essa prova tem um valor bastante elevado para um laboratório de inseminação artificial, uma vez ter sido demonstrado que tem correlação com:

• A capacidade de conservação

• Os resultados de fertilidade e prolificidade

• A formação de grupos para o uso de sêmen heterospérmico

• 11.2. Através de tinturas fluorescentes Utiliza-se corantes do tipo membrana-permeáveis fluorescentes, os quais – ao passar para o interior do espermatozóide – são hidrolisados pelas esterases do interior da célula, liberando um composto químico que apresenta fluorescência e que fica retido no interior do citoplasma, caso a membrana esteja íntegra (como, por exemplo, o DCF ou diacetato de carboxifluoresceína e o SYBR-14. Coloração vital através do SYBR-14-PI (iodeto de propídio) Utiliza-se esta combinação de fluorocromos, avaliando-a através do microscópio de fluorescência ou do citômetro de fluxo. Seu uso permite determinar se a membrana espermática está estruturalmente íntegra e funcionalmente ativa.

Coloração vital através do SYBR-14-PI (iodeto de propídio)

Protocolo para o microscópio:

Diluir o sêmen a uma concentração de 5 a 10 milhões de espermatozóides por mL

Adicionar uma alíquota de 1 μL de SYBR-14 em DMSO, a 1000 μL de sêmen diluído

Incubar por 10 minutos a 37ºC

Adicionar 5 μL de iodeto de propídio

Incubar por 5 minutos a 37ºC

Observar com microscópio de fluorescência. Os espermatozóides verdes são aqueles com a membrana estrutural e funcionalmente ativa. Os vermelhos correspondem a espermatozóides mortos. Os que se tingem com os dois corantes, correspondem a espermatozóides moribundos. Contar 300 espermatozóides.

Produção de doses seminais

12. Outras técnicas de avaliação seminal: • Estado da bainha mitocondrial Usa-se corantes fluorescentes, os quais se unem especificamente aos lipídeos da membrana das mitocôndrias funcionais. Eles não se retêm em membranas não funcionais ou com o seu potencial alterado (ex.: Rodamina 123, MitoTracker® Green, …). • Testes combinados Esta técnica nos permite avaliar a vitalidade do espermatozóide e o estado de sua estrutura acrossômica. A aplicação dessa coloração permite classificar os espermatozóides em quatro grupos: mortos não reagentes, mortos reagentes (falsa reação acrossômica), vivos não reagentes e vivos reagentes (verdadeira reação acrossômica). Reagentes: • Azul de Tripán (2%) • Marrom de Bismark Y (pH 2,8) • Rosa de Bengala (pH 4,3) • Tampão cacodilato com 3% de glutaraldeído (pH 7,4) O azul de Tripán tinge os espermatozóides mortos. O marrom de Bismark tinge a região pós-acrossomal, servindo para dar contraste e prevenir que o rosa de Bengala não se fixe na referida região. O rosa de Bengala tinge o acrossoma com a cor rosa. Tríplice coloração fluorescente Esta técnica permite avaliar a integridade da membrana, o estado do acrossoma e a funcionalidade da mitocôndria. Reagentes: • Bisbenzimida • Iodeto de Propídio (PI) • SBTI-Alexa Fluor® 488 • MitoTracker® Green

Tríplice coloração fluorescente (filtro FITC)

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Avaliação do dano oxidativo das membranas espermáticas A produção de sustâncias reativas ao oxigênio (ROS) é indicativa do dano oxidativo sofrido pelas membranas espermáticas, sendo frequente esse tipo de situação nos espermatozóides conservados. A produção de ROS pode ser avaliada através de coloração fluorescente (CM-H2DCFDA/PI). Avaliação do início da capacitação espermática • Ensaio de transposição de fosfolipídios: a fosfatidilserina (PS) passa para o exterior da membrana com padrões distintos, seja provocado por choque térmico ou pelo início da capacitação. Nesse caso se usa a Anexina V-FITC combinada com o PI. • Monitoria de mudanças precoces na permeabilidade da membrana: SNARF/Yo-Pro1/HE. • Avaliação da capacitação e reação acrossômica através do uso de CTC (clortetraciclina), que monitora as mudanças de cálcio intracelular associadas à capacitação. • Mudanças na organização estrutural dos lipídeos através da Merocianina 540: se há desordem no componente lipídico e incremento da fluidez da membrana, ocorre um incremento da fluorescência emitida pela Merocianina. Estado do núcleo espermático • Determinação da fragmentação do DNA através da técnica de marcação in situ da fragmentação do genoma, ou TUNEL: identificação de grupos 3-OH em terminais de nucleotídeos livres. • Detecção de fragmentação através do teste do COMETA: preparase um lisado de espermatozóides, seguido de eletroforese em gel de agarose; a maior cauda obtida, revelada através de sonda de DNA, corresponderá à maior fragmentação. • Uso de Cromomicina A3 (CMA3): detecta a deficiência de protamina em cromatina condensada de modo deficiente. • SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay): detecta defeitos na condensação da cromatina. Submete-se os espermatozóides a um tratamento desnaturante, tingindo-os em seguida com AO (laranja de Acridina), o qual se une ao DNA de cadeia dupla (laranja) ou simples (verde). A leitura deve ser realizada em citômetro de fluxo. • SCDt (Sperm Chromatin Dispersion Test): submete-se os espermatozóides a um tratamento de lise, dispersa-se o DNA em uma matriz com agarose, visualizando-se a fragmentação do mesmo através da coloração de Wright, ou mediante a aplicação de corante que contenha um fluorocromo com afinidade por ácidos nucléicos. 46

Produção de doses seminais

Provas de interação espermatozóide-ovócitooviduto • Teste de união do espermatozóide com a zona pelúcida. • Teste de penetração de ovócitos de hamster, livres de zona pelúcida (SPA). • Teste de fertilização in vitro ou FIV homólogo (avalia a união e a penetração na zona pelúcida).

Fragmentação SCDt

• Ensaio da união entre espermatozóide e oviduto.

3.5. Elaboração de doses seminais n 3.5.1 Preparação do diluente 1

Medir o volume de água destilada a 37ºC (com uma proveta ou através de uma balança), segundo o formato de envase do diluente e introduzi-la em um recipiente (balão de Erlenmeyer ou bolsa).

Adicionar o diluente necessário para cada litro de água purificada.

Misturar durante 5 minutos, manualmente ou através de um agitador eletromagnético, até a completa dissolução do pó do diluente.

Preparação do diluente

Atualmente, existe no mercado diluente líquido pronto para uso, o que facilita a produção das doses seminais, sobretudo em Centrais de pequeno ou médio porte. As vantagens da utilização de diluente líquido são: • “Pronto para usar” • Rápido • Econômico • Evita problemas com a qualidade da água • Fácil de usar: dispõe de torneira reguladora • Higiênico, evita contaminações

Diluente líquido

• Estável à temperatura ambiente 47

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n 3.5.2 Preparação de doses seminais Uma vez avaliada a qualidade do sêmen e tendo o mesmo sido considerado apto para uso em I.A., conhecida a concentração espermática por mm3 passamos a calcular o nº de doses que se pode obter desse ejaculado. Podemos considerar a dose mínima recomendada para a inseminação convencional como tendo uma concentração de 2 x 109 espermatozóides; no entanto, um sêmen de boa qualidade espermática (que tenha níveis baixos de anomalias morfológicas e outras alterações) e de uso mais corrente, tem a concentração de 3 x 109 espermatozóides. n 3.5.3 Cálculo da dose (Ver contagem em câmara de Bürker, no item 6.1)

Nº de doses (N)

Nº total de espermatozóides

V x A x 107

Nº de espermatozóides/dose

3 x 109

Forma simplificada:

(A) x (V) 300

O cálculo da quantidade de diluente necessária para a preparação das doses seminais é realizado da seguinte forma: Doses seminais de 90 mL:

N x 90 = Volume total (volume de diluente + volume de ejaculado) (N x 90) - V = Volume de diluente necessário a adicionar

V = Volume da coleta. Obs.: há de se considerar que, no caso de coleta sobre diluente, 50 ou 100 mL, o volume da coleta é igual ao volume de diluente que se adiciona previamente, mais o volume do ejaculado coletado. Exemplo: Temos um ejaculado com um volume de 125 mL e coletamos sobre 100 mL de diluente; logo, o volume V será de 225 mL. A contagem total da câmara de Bürker, A, é de 37 espermatozóides. 48

Produção de doses seminais

Se trabalharmos com uma concentração de 3.000 milhões de espermatozóides por dose, o número de doses que poderemos produzir será: Nº de doses a 3 x 109 =

VxA 300

225 x 37 300

= 27 doses

Quer dizer, (27 doses x 90) - 225 = 2.205 mL de diluente a ser adicionado. Em resumo, as fórmulas que teríamos que aplicar – dependendo da concentração usada – seriam estas: Nº de doses a 3 x 109 =

Volume de coleta × Nº de spz. contados na câmara

Nº de doses a 2,5 x 109 =

Volume de coleta × Nº de spz. contados na câmara

300

250

Antes de misturar sêmen e diluente deve-se comprovar que não haja diferença de temperatura entre ambos, o que é facilitado se – durante todo o procedimento de contrastação – tanto o sêmen como o diluente forem mantidos aquecidos. Adicionar suavemente o ejaculado sobre o diluente, permitindo uma mistura homogênea. Uma vez realizada a diluição, comprovar a motilidade da mistura. Finalmente, envasa-se as doses de sêmen diluído nos frascos de inseminação, tubos ou blisters, os quais deverão ser – no mínimo – identificados com uma etiqueta contendo os seguintes dados: Nº do cachaço / Raça / Data de preparação-data de validade Reservar uma amostra em um tubo de ensaio com tampa, para analisar os acrossomas no mesmo dia da coleta e a motilidade em dias sucessivos. A forma mais adequada de conservação das amostras é em tubos de ensaio pequenos – de 3 a 4 mL – cheios até a borda, de forma que a câmara de ar formada seja mínima, ou em micro tubos de centrífuga tipo Eppendorf de 1,50 a 2,00 mL (um por dia de avaliação, de forma que nenhuma amostra regresse à geladeira de conservação, uma vez retirada e aberta). Uma vez envasadas as doses seminais devem permanecer à temperatura ambiente (20 a 25ºC), durante pelo menos de 1,5 a duas horas, para que a temperatura decresça do modo mais gradual possível. Passado esse tempo, podemos armazenálas na geladeira de conservação a 16ºC ou em local resfriado. 49

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n 3.5.4 Utilização de sêmen heterospérmico A utilização de doses que contenham espermatozóides procedentes de dois ou mais ejaculados (heterospermia), é uma prática habitual em Centrais de inseminação e que permite a obtenção de melhores resultados reprodutivos. Quando se começou a trabalhar com essa técnica, era necessário classificar previamente os ejaculados segundo o teste de resistência osmótica (ORT) (García e col., 1989), misturando-os dentro da mesma categoria.

Posteriormente, antes de misturar os ejaculados, era necessário realizar uma diluição prévia a 1:10 (sêmen:diluente), incubá-la por meia hora à temperatura ambiente e, finalmente, preparar o sêmen heterospérmico (Martín Rillo e col., 1988). Atualmente, todo esse processo não é mais estritamente necessário, tendo sido comprovada igualmente a obtenção de bons resultados quando se mistura ejaculados de qualidade seminal similar (motilidade, formas anormais, aglutinação e acrossomas), sem a necessidade da realização do teste de ORT. É importante não misturar ejaculados de baixa qualidade com outros de alta, já que os de baixa não melhoram por efeito dos melhores, mas sim os de melhor qualidade se vêem empobrecidos pelo efeito dos de qualidade inferior. Com a utilização de sêmen heterospérmico devemos esperar os seguintes resultados: • A fertilidade não é afetada • Melhora da prolificidade, aumentando o número de leitões nascidos vivos • Não há nenhum efeito sobre o número de nascidos mortos • Incremento no número total de leitões nascidos • Diminuição do percentual de leitegadas de nº reduzido (nascidos total ≤ 8)

Produção de doses seminais

Método de preparação de doses heterospérmicas Em resumo, o processo de preparação de doses heterospérmicas é o seguinte: 1

Contrastação individual de cada um dos ejaculados

Em um recipiente ou bolsa de tamanho adequado, adicionar o diluente necessário para cada um dos ejaculados

Adicionar, de forma lenta e um em seguida do outro, todos os ejaculados que compõem o lote, normalmente de três a cinco machos

Homogeneizar a mistura

Tomar uma amostra para avaliar, ao microscópio, o resultado da mistura

Iniciar o processo de envase das doses

3.6. Características e propriedades do diluente Os diluentes devem cumprir os dois objetivos seguintes: a) Permitir o grau máximo de extensão ou aumentar o volume do ejaculado sem afetar a qualidade seminal. b) Conservar a capacidade fecundante dos espermatozóides durante o maior tempo possível. Os diluentes de sêmen de cachaço usados na inseminação artificial das porcas são uma mistura de produtos químicos, organizada de modo a assegurar a vida e a funcionalidade dos espermatozóides, ou seja, sua capacidade fecundante, desde o momento de sua extração até a inseminação e a fecundação. • A composição do diluente e da água na qual ele será reconstituído, tem que assegurar a correção dos seguintes parâmetros: • Pressão osmótica do meio de suspensão dos espermatozóides • pH, pKa e força iônica de interação entre os espermatozóides e seu meio • Controle da precipitação das proteínas e das aglutinações • Controle da ação enzimática sobre o sêmen, em particular da que influi no metabolismo e apoptose dos espermatozóides • Preservação da membrana celular dos espermatozóides • Capacidade de suavizar as mudanças dos valores químicos, conhecida por efeito “tampão” 51

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Espera-se que os diluentes também exerçam um controle sobre a contaminação microbiana. O Departamento Técnico da KUBUS, em parceria com a CONSUITEC, é partidário de que esse controle seja exercido contra as contaminações secundárias e nunca sirva de “cobertura e solução” para possíveis problemas sanitários da Central de I.A. e dos cachaços. Os diluentes, à parte de sua função como meio de conservação, têm que servir também como meio de transporte dos espermatozóides pelas vias reprodutivas da porca, assegurando-lhes a fonte de energia necessária para tal esforço. As novas técnicas e ferramentas de colocação dos espermatozóides em um ou em outro ponto do aparelho reprodutivo, inclusive na região próxima ao ovário, assim como o volume cada vez menor da dose seminal, reduzem a importância dos componentes dos diluentes que influenciam no estado das mucosas e dos cornos uterinos. Os diluentes são apresentados na forma de pó para reconstituição em água purificada ou já reconstituídos – na forma líquida e pronta para uso – sendo necessário uma prévia elevação da sua temperatura no nível da temperatura dos ejaculados. Dependendo da capacidade dos diluentes em tornar mais lento o metabolismo dos espermatozóides, as doses seminais são classificadas em: curta, média e longa conservação (dependendo do tempo em que os mesmos se conservam sem que haja diminuição de suas propriedades fecundantes na hora da utilização). Para permitir a ação correta dos componentes do diluente sobre os espermatozóides indica-se a utilização de água purificada, no mínimo bidestilada, não sendo recomendado o uso de qualquer outro tipo de água que contenha minerais em sua composição (Ver anexo 12.3).

3.7. Conservação das doses seminais Para que o sêmen diluído mantenha sua capacidade fecundante ao longo de sua armazenagem sob refrigeração a 16ºC, é indispensável cumprir as seguintes condições: • O material que esteja em contato com o sêmen deve estar previamente limpo e esterilizado, sem resíduos químicos nem biológicos • Utilizar água comprovadamente purificada e que não esteja alterada bioquímica ou microbiologicamente • Utilizar diluente de longa conservação • Coletar a fração espermática do ejaculado para reduzir os sais presentes no plasma seminal • Diluir o sêmen em um período inferior a 15 minutos, desde a coleta do mesmo, 52

Produção de doses seminais

numa proporção sêmen:diluente entre 1:4 e 1:25 (grau de diluição ótimo: 1:10) a 37ºC. Concentração mínima por dose: 2 x 109 espermatozóides em 100 mL e máxima: 8 x 109 espermatozóides em 100 mL. • Baixar lentamente a temperatura de 37ºC para 23ºC (durante 1,5 a 2 horas), à temperatura ambiente do laboratório (entre 20 e 25ºC) e, posteriormente, introduzi-lo na estufa a 16º C • Conservar em anaerobiose a 16ºC; para tanto não deixar nos frascos um espaço de ar superior a 20% Geladeira de conservação de seu volume a 16ºC • Comprovar a temperatura no interior da mesma mediante termômetro de máxima e mínima ou pela utilização de “data-loggers” • Não expor o sêmen à luz direta durante períodos longos de tempo • O sêmen armazenado deve ser agitado (misturado) suavemente a cada 12 horas, com o objetivo de manter os espermatozóides em suspensão no diluente • As doses seminais armazenadas antes de serem utilizadas devem ser observadas ao microscópio (motilidade) para comprovar se mantêm a viabilidade suficiente para serem utilizadas • No caso de ejaculados com concentração espermática elevada, que produzam um número muito grande de doses seminais – por exemplo, superior a 30 – é recomendável, quando se prepara doses de 85 a 90 mL, realizar uma coleta com mais volume de sêmen (entre 100 e 150 mL de fração rica, no mínimo), para manter uma diluição próxima de 1:20 a 1:25, evitando diluições superiores, as quais diminuem o período de conservação.

3.8. Anexo n Soluções utilizadas no processo de contrastação Solução de glutaraldeído: Glicose..........................................................................2,9 g Citrato de sódio.........................................................1,0 g Bicarbonato de sódio...............................................0,2 g Glutaraldeído (25% de pureza).............................8 mL Água destilada...........................................................até 100 mL

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Solução de citrato-formol: Citrato de sódio....................................................................2,9 g Formaldeído (40% de pureza)..........................................4 mL Água destilada......................................................................até 100 mL

Solução de soro fisiológico formolado: Cloreto de sódio....................................................................9 g Formaldeído (40% de pureza)...........................................3 mL Água destilada.......................................................................até 1.000 mL

Solução de cafeína: Citrato de sódio....................................................................2,9 g Cafeína....................................................................................0,45 g Água destilada.......................................................................até 100 mL

A porca

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4.1. Anatomia do aparelho genital feminino 1. Ovário 2. Mesovário 3. Oviduto 4. Corno uterino 5. Corpo uterino 6. Vagina 7. Orifício uretral 8. Vestíbulo vaginal 9. Bexiga 10. Lábios vulvares

A porca

O aparelho genital da porca caracteriza-se por ter os cornos uterinos muito longos, sinuosos e móveis, o que implica na necessidade de um grande volume de ejaculado para assegurar a chegada dos espermatozóides ao oviduto. No assoalho da vagina encontra-se o orifício uretral externo, o qual deve ser levado em conta na hora de inseminar, já que é frequente a introdução do cateter de inseminação por esse orifício, provocando a saída de urina pelo mesmo. Esta é a razão de se inseminar dirigindo o cateter na direção do teto da vagina. O colo uterino tem uma série de pregas nas quais se adapta e enrosca perfeitamente o pênis do cachaço ao se girar para a esquerda, devido ao seu formato espiral.

4.2. Puberdade O período pré-púbere é uma fase pouco estudada na porca, mas como na maioria dos mamíferos, o funcionamento das estruturas onde ele ocorre (ovário e complexo hipotálamo- hipofisário), inicia-se na vida fetal. Tem sido demonstrado que existem descargas hormonais desde as primeiras semanas de idade e que a presença dessas pulsações indica uma preparação evidente para a puberdade, desde o segundo mês de vida. O termo puberdade é utilizado para definir o início da vida reprodutiva. Na fêmea a puberdade está associada, geralmente, com a primeira aparição de estro e a ovulação. Na porca a puberdade coincide com o início da capacidade reprodutiva, uma vez que a primeira ovulação vem acompanhada pela receptividade sexual. O controle do início da puberdade se da através de processos neuroendócrinos. A regulagem endócrina do início da puberdade implica em mudança na frequência do pulso do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), que controla o padrão de secreção do hormônio luteinizante (LH) na hipófise anterior. Normalmente a puberdade se inicia, nas porcas, ao redor dos 160 a 190 dias de idade, quando elas têm um peso corporal aproximado de 100 Kg. Há diversos fatores que podem exercer um efeito estimulante ou inibitório sobre a chegada à puberdade e esses fatores se agrupam em: A) Genéticos • A raça e, dentro dela, as diferentes linhas • Efeito de heterose nos cruzamentos

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B) Ambientais • Alojamento: as porcas criadas individualmente tornam-se púberes aproximadamente 15 dias mais tarde que as criadas em grupo • Ambiente: as instalações sujas ou com fossas cheias têm efeito negativo sobre o início da puberdade, devido principalmente às altas concentrações de gases, que interferem com o feromônio do macho • Presença do macho: esse fator é importante no caso de fêmeas isoladas e mostra-se eficaz após o estresse do transporte. O contato com o cachaço é interessante por causa de seu hormônio, o feromônio 3-androstenol, embora o seu efeito dependa também da libido demonstrada pelo macho • Estresse do transporte: conhecido pelos suinocultores por seu efeito sobre a fêmea já púbere • Idade, peso vivo, nutrição e taxa de crescimento: existe, nesse caso, uma relação estreita entre o consumo energético, cujos níveis altos permitem a manifestação precoce da puberdade • Estímulo com hormônios exógenos: através de tratamentos gonadotrópicos ou estrogênicos • Época (do ano) de nascimento: há resultados contraditórios a respeito, considerando-se que a presença do macho anula esse fator O conhecimento desses fatores tem permitido utilizar diferentes técnicas de manejo para estimular a chegada da puberdade. Utiliza-se, com frequência, a mistura

Eixo Hipotálamo-Hipofisário-Ovariano

A porca

de fêmeas multíparas com machos maduros ou a mudança para novos ambientes. Os estímulos são mais efetivos em porcas de aproximadamente 180 dias de idade. Em fêmeas mantidas isoladas, em dias de curta duração ou com a incidência de altas temperaturas, a puberdade costuma atrasar. Em consequência, ela pode aparecer com uma grande dispersão, dependendo das condições de manejo e ambientais, tanto em fêmeas jovens (135 dias de idade), até com 250 dias ou mais.

4.3. Ciclo sexual O ciclo sexual, na porca, tem uma duração média de 21 dias e compreende duas fases: folicular e lútea. n A. Fase folicular A fase folicular dura desde o término da luteolise e do início do crescimento folicular (dias 14 a 16) até a ovulação e a formação posterior de novos corpos lúteos.

Ciclo estral: fatores intra-ovarianos inibidores e ativadores

Os folículos se originam do conjunto proliferativo. Seu crescimento é contínuo, se não há atresia, até alcançar um diâmetro > 6 mm, momento em que podem seguir dois caminhos: a ovulação ou a atresia. Sabe-se que só alguns poucos folículos, ao redor de 25% dos que começam seu crescimento, alcançam o tamanho préovulatório e amadurecem. Tem sido sugerido que aqueles maiores e os que produzem mais estrógenos durante a seleção sejam os que ovularão, enquanto que os menores e os menos ativos (estrogenicamente falando) se transformarão em atrésicos. 59

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Os principais reguladores de desenvolvimento folicular são, por um lado o hormônio folículo estimulante (FSH) e por outro lado, o luteinizante (LH), responsável pela madures; além dos estrógenos, o 17-β estradiol (E2) facilita a ação das gonadotrofinas e da prolactina (PRL) exercendo um efeito modulador.

Concentrações hormonais durante a fase folicular

Nos suínos, os estrógenos secretados pelos folículos dominantes estimulam a maturação dos folículos menores, hierarquicamente. Os folículos ovulatórios podem variar em tamanho (embora oscilem ao redor dos 2 mm de diâmetro) e apresentar diferenças estruturais e bioquímicas marcantes. Esta heterogeneidade é produzida também dentro do conjunto ovulatório levando, como consequência, a uma assincronia na maturação dos ovócitos, o que gera grandes diferenças no desenvolvimento embrionário da espécie. Regulagem hormonal da fase folicular Na figura seguinte se representa, esquematicamente, as concentrações hormonais sanguíneas durante a fase folicular. O hormônio 17-β estradiol (E2): durante as etapas foliculares média e tardia, 90% dos pulsos estão associados ao FSH e, contudo, o conteúdo de todos os esteróides no fluido folicular diminui significativamente na ovulação. O hormônio luteinizante (LH): a frequência dos pulsos aumenta de 1,1 para 2,5/6 horas na etapa folicular inicial, até de 2,5 a 6 horas; simultaneamente, a amplitude diminui de 2 ηg/mL até 0,9 ηg/mL. Durante a etapa folicular média e tardia, entre 93 e 100% dos pulsos de LH estão associados com os de FSH. O aumento da secreção de E2 pelos folículos em crescimento estimula o pico de LH pré-ovulatório, 60

A porca

o que pode ocorrer desde sete até oito horas depois da concentração máxima de estrógeno pré-ovulatório. O pico de LH dura aproximadamente 20 horas e tem sido demonstrado que a estreita relação entre o início do pico, o comportamento estral e o pico de E2, podem estar associados com a fertilização e o aumento da sobrevivência embrionária antes da implantação. O hormônio folículo-estimulante (FSH): a concentração média de FSH diminui, coincidindo com o aumento da concentração de E2. Na porca percebe-se um pequeno pico de FSH, apenas no momento da concentração pré-ovulatória máxima do LH. Sua secreção é controlada pela inibina, peptídeo ovariano, cuja principal função é a retro-inibição da liberação de FSH. A inibina, produzida em concentrações crescentes pelos folículos em crescimento, exerce essa função durante toda a etapa folicular (da fase inicial, até a tardia). O hormônio prolactina (PRL): Observa-se dois picos de PRL durante a fase folicular da porca, o primeiro deles começando quatro ou cinco dias antes da aparição do cio e o segundo ao redor do dia 1, antes do pico pré-ovulatório do LH e durando três dias. A destruição dos folículos, nas porcas, durante a fase folicular produz anovulação e degeneração ovariana cística. É evidente que o estresse prolongado eleva as concentrações plasmáticas dos glicocorticóides, que são a causa direta da degeneração ovariana cística. n B. Fase lútea A fase lútea caracteriza-se pela presença do corpo lúteo, que é uma mini-glândula endócrina, desenvolvida depois da ovulação, a partir da parede folicular. As células da granulosa se hipertrofiam e – nos ruminantes – um pigmento carotenóide, a luteína, é que dá uma coloração amarelada ao corpo lúteo. Nas porcas, o corpo lúteo tem uma cor rosa arroxeada. O corpo lúteo secreta principalmente progesterona. O início da função do corpo lúteo nas porcas e sua capacidade de produção de esteróides dependem basicamente do LH. A secreção de LH durante a fase lútea do ciclo estral das porcas pode ser dividida em três períodos: inicial (dias 2 a 8), médio (dias 9 a 12) e tardio (dias 13 a 15). A vida média do corpo lúteo na porca é de aproximadamente 14 dias. Durante o período inicial a concentração sanguínea de LH é baixa e constante (1,4 ηg/mL). O período intermediário caracteriza-se por variações consideráveis de LH (0,5 a 5 ηg/mL) e o terceiro período pela diminuição do nível de LH (0,5 a 1 ηg/mL). Durante o período intermediário o LH é liberado em pulsos curtos (75 min. de duração) e de grande amplitude (50% do pico pré-ovulatório), a cada 2 a 3 horas. A alta concentração de LH durante o período intermediário da fase lútea, em porcas, pode estar relacionada com a demanda de seu tecido luteal (corpo lúteo), entre os dias 6 e 12 do ciclo estral. O caráter pulsátil das mudanças de LH no sangue está, provavelmente, relacionado com a seleção de folículos ovarianos que – em parte – sofrem atresia, embora o restante se desenvolva e amadureça. 61

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4.4. Indução e controle do ciclo estral A forma natural mais efetiva de indução do cio em fêmeas pré-púberes é o contato com machos adultos. De acordo com a experiência da KUBUS, em parceria com a CONSUITEC, as nulíparas podem ser estimuladas por contato com o macho desde a idade de 150 dias e 80 a 85 kg de peso vivo. Na média, a estimulação de fêmeas um pouco mais velhas, com 170 dias de idade, induz a aparição do cio no 7º dias após o início do contato. No entanto, para otimizar o número de leitões desmamados por porca, por ano e reduzir o número de dias não produtivos, podem ser usados diferentes hormônios naturais ou sintéticos no controle do cio e da ovulação. Na reprodução da espécie suína se usa tanto progestágenos como gonadotrofinas. Entre as gonadotrofinas mais frequentemente usadas encontramos a PMSG (Gonadotrofina Sérica de Égua Gestante) e a HCG (Gonadotrofina Coriônica Humana). A PMSG é biologicamente similar à FSH e à LH (70% de atividade FSH e 30% de atividade LH) e a HCG é um agonista natural da LH. Durante muitos anos a combinação de 400 UI de PMSG e 200 UI de HCG vem demonstrando ser efetiva e mais fácil de aplicar, do que duas injeções seguidas de PMSG e HCG. A combinação PMSG/HCG pode ser usada para indução de cios férteis em fêmeas pré-púberes entre 5,5 e 7 meses de idade. Uma injeção intramuscular dessa combinação induz o cio na maioria das fêmeas tratadas nos sete dias seguintes à injeção. O melhor método para a sincronização de fêmeas púberes é a aplicação oral de altrenogest, agonista da progesterona. As nulíparas devem ser alimentadas individualmente com 15 a 20 mg de altrenogest durante um período de 15 a 18 dias. O cio aparece em 90% das fêmeas tratadas, entre quatro e sete dias do fim do tratamento, podendo as mesmas ser inseminadas duas vezes em um intervalo de 24 horas, começando entre 6 e 12 horas após o início do cio. A combinação de 400 UI de PMSG e 200 UI de HCG pode também ser usada para sincronizar o cio de fêmeas desmamadas. As gonadotrofinas devem ser aplicadas por via subcutânea ou intramuscular, atrás da orelha, no dia seguinte ao desmame (zero a dois dias). O uso de gonadotrofinas induz o cio entre quatro e seis dias pós-tratamento.

Detecção do cio

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É um dos fatores mais importantes para a realização, com êxito, da inseminação artificial. De acordo com o momento de aparição do cio, determinaremos o momento adequado para realizar a inseminação artificial. Para a detecção do cio na porca pode-se usar diversos métodos, que variam quanto à sua exatidão:

1. Observação de sinais externos

• Edema e hipertermia vulvar

• Secreção vaginal abundante e espessa

• Atitude inquieta e perda de apetite

• Orelhas eretas

• Grunhidos característicos

• Urinar com frequência

Sinais externos de cio

2. Observação do comportamento sexual • Buscam o cachaço • Montam e se deixam montar por outras fêmeas • Reflexo de imobilidade n Desencadeamento do reflexo de imobilidade Pelo cachaço: • Passando o cachaço pelas baias das fêmeas • Passando o cachaço pelo setor de maternidade • Passando a fêmea pelo setor dos machos

Detecção do cio

Desencadeando o reflexo de imobilidade

Pelo homem • Pressão sobre o lombo das porcas Por estímulos simuladores do cachaço • Aerossóis com feromônios • Peso das mochilas de inseminação Área de Detecção de Cio ou ADC • Local fechado para concentração de machos • Proporciona maior oferta sexual • Maior concentração de odor e feromônios • Maior estimulação da fêmea • Permite inseminar no momento de maior aceitação, evitando os períodos refratários • São necessários dois a três machos por porca, por confirmação, trabalhando em grupos de três em três fêmeas

Detecção de cio no corredor das baias

Desenho de uma Área de Detecção de Cio

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É conveniente realizar a detecção de cio duas vezes ao dia, para assegurarse de modo mais concreto do momento do início do cio e, consequentemente, do momento mais indicado para realizar a inseminação artificial, sendo recomendável distanciar o intervalo entre a primeira e a segunda detecção do cio o máximo possível, o que significa que a primeira tentativa de detecção deverá ser efetuada no primeiro horário da manhã e a segunda, no último horário da tarde. De qualquer forma, se não for possível realizar as duas detecções de cio por dia do modo recomendado, é melhor realizar uma só, mas de modo correto. A detecção do cio deve ser mantida até o final do mesmo; é tão importante detectar o inicio quanto o final do cio, sendo esse procedimento necessário em algumas ocasiões para determinar a causa de um processo de diminuição de fertilidade e – sobretudo – do tamanho de leitegada. Com relação às porcas desmamadas, deve-se iniciar o seu contato com o cachaço imediatamente após o desmame, já que esta prática não serve somente se descobrir porcas em cio, mas também para estimulá-las a entrarem em cio. Com as nulíparas se obtém melhor resposta quando o macho visita o local das fêmeas e estas estão alojadas em grupos não muito numerosos (seis a oito fêmeas). Além disso, é conveniente que o macho não esteja alojado na mesma instalação das fêmeas, já que dessa forma há a vantagem do “efeito surpresa”, que produz um maior estímulo em nulíparas. No caso de fêmeas desmamadas, entretanto, funciona melhor se elas realizarem a visita à cela dos machos, de uma em uma, estando o macho alojado em frente ao local onde se mantém as fêmeas desmamadas, de forma que elas possam ouvir, ver e sentir o odor dos mesmos constantemente. Seja qual for o sistema de tentativa de detecção adotado, é importante que o mesmo permita o contato focinho-focinho entre fêmea e macho. As características dos machos destinados a detectar cio devem ser as seguintes: • Machos adultos produtores de saliva com alta concentração de feromônios: um ou vários, segundo o tamanho da granja (1 macho/100 a 150 fêmeas em produção) • Machos com forte odor sexual, boa libido, não agressivo e fácil de manejar • De tamanho adequado com relação ao das fêmeas que serão detectadas: isto é de vital importância quando se trata de nulíparas • Vasectomizado ou epidídimo-estomizado

Momento adequado para a aplicaĂ§ĂŁo da dose

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A determinação do momento mais adequado para se realizar a I.A. implica em ajustar os períodos relativos à produção da ovulação com o momento do início do cio. A ovulação é produzida entre 30 e 70 horas após o pico pré-ovulatório de LH. Se o momento dessa descarga pré-ovulatória (e, portanto, da ovulação) não mostra uma estreita relação com a aparição dos sintomas de cio, pode ocorrer um decréscimo nos percentuais de fertilidade e prolificidade, devido ao fato das coberturas não serem levadas a cabo no momento adequado. A ovulação máxima é produzida entre 36 e 44 horas após o início do processo de imobilização, havendo pouca ovulação nas primeiras 24 horas. No geral, a aplicação da dose seminal deve estar próxima do terço final de duração do cio, momento este mais próximo da ovulação. A vida média de um óvulo é de 10 a 20 horas, embora já seja considero envelhecido um óvulo que tenha mais de 8 horas e vida; por isso, o contato entre o óvulo e os espermatozóides deve ser anterior às 8 horas de vida do óvulo. Uma vez que se realizam duas detecções de cio por dia, podemos atrasar a 1ª I.A. para a manhã ou para a tarde seguinte (seja qual for o caso) da detecção do cio e também as inseminações sucessivas, realizadas a cada 24 horas. Sendo a sobrevivência dos espermatozóides – dentro do trato genital da fêmea – de 22 a 24 horas, devemos trabalhar para que a separação entre duas inseminações consecutivas seja, pelo menos, de 10 a 12 horas; caso contrário corremos o risco de ver a sua eficácia reduzida, já que estaremos sobrepondo uma e outra. Realizar coberturas antes das seis primeiras horas após o início da imobilização pode resultar em redução no tamanho da leitegada, uma vez que essa cobertura poderia não ser efetiva, no período de máxima ovulação. No outro extremo, realizar a cobertura demasiado tarde, no segundo dia do reflexo de imobilidade, poderia não somente aumentar a dificuldade em cobrir uma porca que perdeu a fase do estro, como também comprometer a viabilidade dos óvulos lançados em estágios precedentes, além de existir ainda o risco de gerar descargas vaginais. No geral, em uma granja de suínos, cerca de 70% de todas as fêmeas têm cios normais, com duração de 48 a 72 horas, havendo outros 20% que apresentam cios anormalmente curtos, com menos de 40 horas; há ainda um terceiro grupo de fêmeas, os 10% restantes, que apresentam cios anormalmente longos, com mais de 72 horas. Por lógica, cada um desses grupos de fêmeas necessitará de um protocolo de inseminação diferente.

Momento adequado para a aplicaĂ§ĂŁo da dose

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n Situações que nos levam a determinar o momento mais adequado para a inseminação Nulíparas Inseminação artificial para nulíparas com duas inseminações

Inseminação artificial para nulíparas com três inseminações

Multíparas O melhor método para predizer a duração do cio é ter em mente o intervalo desmame – saída para o cio: A) Fêmeas que ciclam entre quatro e sete dias pós-desmame Esse grupo de fêmeas, aproximadamente 70% de todas as fêmeas de uma granja, apresenta cios de duração normal (48 a 72 horas). Aqui encontramos dois protocolos distintos, na dependência da tentativa de detecção ser realizada uma ou duas vezes no dia. UMA detecção de cio no dia (com dificuldade para se realizar o manejo reprodutivo da tarde): Em termos práticos, se fazemos a detecção do cio somente pela manhã e há dificuldade para a realização do manejo reprodutivo à tarde, a 1ª I.A. deverá ser feita nessa mesma manhã e a 2ª I.A., na manhã seguinte.

Momento adequado para a aplicação da dose

DUAS detecções de cio por dia: Se realizarmos a detecção de cio duas vezes por dia, uma porca que esteja no cio pela manhã será inseminada pela primeira vez nessa tarde e pela 2ª vez na manhã seguinte. Se mostrar sinais de cio à tarde, faremos a 1ª I.A. na manhã seguinte e a 2ª I.A 12 horas após a 1ª.

B) Fêmeas que ciclam com menos de quatro dias pós-desmame A maioria das porcas que entram em cio no 3º e 4º dias pós desmame são as que se mantêm em cio durante um período de tempo mais prolongado, cios de mais de 72 horas; por isso normalmente não são inseminadas no primeiro dia do cio, começando-se no segundo dia pela manhã, com repetição a cada doze horas. Convém prestar maior atenção a essas fêmeas na detecção do terceiro dia de cio, inseminando-as novamente pela manhã, sempre e quando a manifestação do cio seja clara.

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C) Fêmeas que ciclam depois do 7º dia pós-desmame De modo contrário, aquelas porcas que atrasam sua entrada em cio por mais de sete dias depois do desmame costumam ter cios de menor duração, com menos de 40 horas e com ovulações mais adiantadas, por isso convém prestar maior atenção nas duas primeiras inseminações.

Aplicação do sêmen

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7.1. Introdução do cateter Sempre, o primeiro passo desse processo é a limpeza dos lábios da vulva com uma toalha de papel impregnada em um anticéptico não espermicida. Não é recomendável usar água ou esponjas, nem limpar unicamente com papel. Posteriormente, lubrificar a ponta do cateter com um gel lubrificante não espermicida.

Limpeza da vulva

Introdução correta do cateter

Na base da vagina está localizado o orifício uretral e por isso, na hora de inseminar, teremos que introduzir o cateter inclinado em direção ao dorso da vagina em um ângulo de 45º, para não introduzi-lo por engano pela uretra (nesse caso, sairia urina pelo cateter, que teria de ser descartado). Uma vez evitado o orifício, posicionamos o cateter horizontalmente e o introduzimos, realizando giros em direção à esquerda (se estivermos utilizando um cateter em forma de espiral), até que o mesmo se enganche no colo do útero, o que comprovaremos puxando-o suavemente para fora. Uma vez fixado o cateter, se introduz lentamente a dose seminal através do mesmo, devendo essa operação durar de 3 a 5 minutos. Finalizada a introdução da dose seminal é recomendável que se retire o envase vazio, tampe o cateter e o deixe por alguns minutos, para incrementar a estimulação da fêmea e facilitar o progresso dos espermatozóides dentro do trato genital da mesma.

7.2. Método de inseminação convencional ou tradicional A aplicação do sêmen tem que simular – o máximo possível – a monta natural do cachaço, tendo sido demonstrado que a estimulação da cérvix ajuda de alguma forma a descarga pré-ovulatória do LH, acelerando o processo de ovulação, o que é importante para o percentual final de fertilidade. Por essa razão é conveniente introduzir o cateter de inseminação e deixá-lo no local de 2 a 3 minutos antes da aplicação do sêmen, o qual precisa ser introduzido lentamente, entre três e cinco minutos. Há que se considerar que, na monta natural, a última fração do ejaculado é constituída pelo gel ou tapioca, cuja finalidade é formar um tampão no colo do útero e, assim, evitar o refluxo seminal. Na I.A., por não haver tapioca, é necessário 74

Aplicação do sêmen

introduzir o sêmen lentamente, evitando assim que reflua parte da dose. Da mesma forma, sendo 37ºC a temperatura corporal, se antes da dose seminal introduzimos 10 mL de diluente somente, a 42ºC (inseminação bifásica), provocamos um estímulo das contrações uterinas, cujo resultado é uma melhor aceitação do sêmen quando inseminamos a 37ºC. Tudo isso será ainda mais favorecido se a inseminação for realizada na presença de um cachaço, para ajudar no processo de estimulação da porca. n Fases de aplicação 1. Técnica rápida • Introdução do cateter • Aplicação da dose seminal a 37ºC, durante 2 a 3 minutos. Esta mesma técnica pode ser usada a frio, com o sêmen aclimatado unicamente à temperatura ambiente 2. Técnica lenta (estímulo do aparelho genital) • Introdução do cateter (manter por 2 minutos) • Introdução de 10 mL de diluente a 42ºC (estímulo das contrações) • Introdução da dose seminal entre 35 e 37ºC, durante 5 minutos • Introdução de 25 a 30 mL de diluente a 42ºC (estímulo de contrações); na técnica bifásica de inseminação este ponto não é realizado A técnica lenta permite melhorar os resultados de fertilidade e prolificidade, particularmente quando o momento da inseminação é o correto.

7.3. Método de inseminação “mãos livres” Um dos passos difíceis de realizar com precisão, durante a I.A., é a aplicação do sêmen. Na hora de realizar a I.A. é muito importante o estímulo sexual da porca, durante a aplicação do sêmen. O método de aplicação, nesse sistema, consiste em: 1

Colocar o alforje na região lombar. O peso do alforje de inseminação “mãos livres” é de 8 a 10 kg de peso, para as porcas nulíparas e de 12 a 14 kg para as multíparas; o desenho do alforje de inseminação aparece na ilustração seguinte

Aplicação de feromônio diante do focinho da porca ou inseminar na presença do cachaço 75

Manual de inseminação artificial em suínos Kubus

Limpar os lábios vulvares

Lubrificar o cateter

Introduzir o cateter

No caso de porcas nulíparas introduzir, por pressão, 30 mL de Predil MR-A a 35°C

Acoplar o recipiente da dose seminal, a 35°C, no cateter

Pendurar a dose seminal na cinta

Furar a parede do recipiente que contém a dose seminal

10 Observar o processo de absorção da dose seminal, enquanto coloca o alforje nas porcas seguintes 11 Terminado o processo de absorção se retira o cateter, ou então se mantém o mesmo acoplado, impedindo a entrada de ar; manter o alforje sobre a porca durante 2 minutos 12 Retirar o alforje

Introdução correta do cateter

Aplicação do sêmen

O tempo de absorção da dose varia entre 2 e 10 minutos, segundo a capacidade de absorção da porca (ver Tabela 1). Com a técnica de inseminação artificial do tipo “mãos livres” a porca é inseminada mais facilmente e de modo mais natural, o que permite que ela absorva a dose seminal no ritmo de suas contrações uterinas, com melhora consequente da fertilidade e da prolificidade (ver Tabela 2). Além disso, com essa técnica se incrementa a produtividade por funcionário, já que o tempo dedicado à inseminação por uma pessoa ou grupo de funcionários (quando se trata de grandes bandas de manejo) diminui. Atualmente, em substituição aos alforjes, existe a possibilidade da utilização de arcos de pressão para a inseminação.

Desenho de um alforje para uso em inseminação do tipo “mãos livres”

Porca ibérica inseminada com a técnica das “mãos livres”

Tabela 1. Resposta individual de 15 porcas nulíparas durante a I.A. “mãos livres”

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Tabela 2. Resultados de fertilidade e prolificidade com a I.A. “mãos livres”

7.4. Método de inseminação pós-cervical Nos últimos anos a técnica de inseminação pós-cervical tornou-se popular, como método para melhorar a eficiência reprodutiva e o progresso genético. Essa técnica consiste em depositar o sêmen no corpo do útero, através da utilização de uma cânula que flui pelo interior do cateter e que, quando a cérvix se abre completamente, pode ser introduzida até o referido local. Nesse tipo de inseminação se utiliza volume e concentração de doses reduzidas. Ainda que em alguns casos se utilize menos, é aconselhável não deixar o volume da dose baixar de 40 a 45 mL, mantendo 1.500 x 106 espermatozóides viáveis e nunca “fracionar” doses, mas sim utilizar doses especificamente preparadas para a inseminação pós-cervical. Quando se aplica esse tipo de técnica é preciso prestar especial atenção à qualidade seminal, já que quanto menor for a concentração de espermatozóides usada, maior será a necessidade de ter uma melhor qualidade seminal. De fato, alguns fracassos observados em granjas quando se inicia a utilização dessa técnica são devidos muito mais a problemas com a qualidade seminal, do que com defeitos da técnica de inseminação propriamente dita. n Fases de aplicação

Limpar bem os lábios vulgares da porca com uma toalha descartável impregnada com anti-séptico não espermicida.

Retirar o cateter de sua embalagem plástica individual, sem tocar o extremo anterior e nem a ponta da cânula.

Romper a embalagem plástica individual pressionando no sentido externo até que a parte de espuma ou espiral fique fora do saco plástico.

Lubrificar a ponta do cateter com gel lubrificante não espermicida.

Introduzir o cateter de forma habitual, sem que a cânula interior se exteriorize.

Fixar o cateter na cérvix da porca.

Introduzir a cânula interior até notar a primeira resistência das pregas cervicais.

Aplicação do sêmen

Infundir de 15 a 25 mL de Predil ® aquecido entre 38 e 42ºC.

Esperar alguns segundos para que a porca relaxe, antes de iniciar a introdução da cânula.

Iniciar a introdução da cânula capturando-a suavemente com os dedos polegar e indicador e fazendo uma leve pressão em direção ao interior, para superar as pequenas resistências dos anéis cervicais. Continuar com esse processo até alcançar o corpo do útero.

Introduzir a dose seminal à temperatura ambiente, de uma só vez: 30 a 45 mL com uma concentração de 1.000 a 1.500 milhões de espermatozóides.

A realização correta da operação é comprovada quando não há refluxo.

Retirar então a cânula interior, deixando o cateter dentro da porca durante 3 a 5 minutos.

Retirar o cateter da forma habitual. Introdução da sonda intra-uterina

7.5. Inseminação com sêmen descongelado O maior inconveniente no uso do sêmen congelado de cachaço é a sua alteração ao descongelar, o que faz com que, apesar de suas vantagens potenciais, essa técnica seja muito pouco implantada a nível comercial. Na realidade, tanto a fertilidade como a prolificidade têm melhorado, graças a novos métodos e avanços em todos os aspectos da tecnologia de congelamento.

Recipientes para sêmen congelado

Ainda que, ao longo da história, tenham sido utilizados diferentes tipos de recipientes para armazenar o sêmen congelado, como maxi-palhetas de 5,0mL e 3 000 milhões de espermatozóides, ou recipientes planos denominados Flat Pack, com volume variando entre 2,5 e 5,0mL, o recipiente mais utilizado atualmente é a mini-palheta de 0,25 ou 0,5mL e 500 milhões de espermatozóides. Por isso, a partir de agora, nos referiremos somente a ela. 79

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n Protocolo de descongelamento e aplicação O protocolo a ser seguido, no processo de descongelamento, é o seguinte:

Extrair rapidamente a palheta do tambor de nitrogênio líquido: evitar que as palhetas sejam expostas ao ar por tempo desnecessário.

Introduzi-las no banho Maria a 37ºC durante 20 segundos: aqui podem ser aplicados diversos protocolos de tempo e temperatura (42ºC durante 20 segundos; 55ºC durante 20 segundos; 60 ou 70ºC durante 8 segundos), embora recomendemos este pela segurança de que, ainda estendendo um pouco o tempo de permanência da dose dentro do banho Maria, nunca a temperatura do sêmen ultrapassará os 37ºC.

Secar a palheta.

Comprovar a identificação do macho.

Sacudir a palheta para que todo o sêmen se desloque a uma das extremidades da mesma.

Cortar as extremidades e verter o conteúdo em 5,0 mL de diluente de descongelamento MRA R Thaw, na mesma temperatura de 37ºC.

Repetir o processo para cada uma das palhetas que compõe a dose seminal: no caso de inseminação intra-uterina, a concentração final da dose deve ser de 2 500 a 3 000 milhões de espermatozóides (05 ou 06 palhetas); no caso de inseminação tradicional, a concentração deve ser o dobro (10 ou 12 palhetas).

Completar até o volume final Tambor de nitrogênio da dose com diluente específico para descongelar, MRA R Thaw, na mesma temperatura: 35 a 45 mL para inseminação intra-uterina e 70 a 85 mL para inseminação tradicional.

Comprovar a qualidade da dose após o descongelamento: mínimo de 50% de acrossomas normais e 65% de espermatozóides móveis.

Inseminar em período inferior à 1 hora após o descongelamento: o cio da fêmea deve estar bem identificado, para tentar levar a cabo as inseminações o mais próximo possível do início da ovulação.

Uso de plasma seminal sintĂŠtico em porcas nulĂparas

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n Introdução Com o uso das técnicas de I.A. no lugar da monta natural elimina-se a utilização do cachaço, reduzindo-se muitos dos estímulos associados com a cobertura, os quais influenciam na atividade fisiológica da fêmea, sendo necessários para se conseguir uma boa fertilidade. Além disso, reduz-se consideravelmente o volume de plasma seminal por porca, devido ao grande número de doses produzidas por ejaculado. Por isso é considerado necessária a incorporação de outros componentes do processo de monta natural, para otimizar os resultados de taxa de parto e tamanho de leitegada. O manejo das nulíparas de reposição e a adaptação das mesmas no plantel produtivo é uma das atividades mais importantes na granja de suínos. Com muita frequência o tamanho da leitegada no primeiro parto é inferior ao da porca adulta e, uma vez que a taxa anual de reposição situa-se entre 40 e 50% do plantel de fêmeas, é necessário maximizar a eficiência reprodutiva das primíparas obtida com a I.A. O conhecimento adquirido com relação à sensibilização do trato genital da porca permitiu estabelecer técnicas para incrementar o porcentual de fertilidade, diminuir a mortalidade embrionária e melhorar o tamanho de leitegada. Tem sido comprovado que o pré-tratamento com plasma seminal antes da inseminação melhora a taxa de fertilização, o que pode ocorrer devido a um incremento da concentração espermática no istmo do oviduto, motivado pelo aumento das contrações uterinas e devido ao efeito de relaxamento no istmo conferido pelo plasma seminal (dilatando a união útero-tubárica), aumentando assim o transporte espermático em direção ao oviduto. O plasma seminal parece exercer vários graus de atividade imunossupressora na fêmea, melhorando a proteção dos espermatozóides e dos embriões nas fases precoces de pré-implantação. O plasma seminal induz uma resposta inflamatória aguda no endométrio, provocando mudanças no tecido endometrial que são benéficas na preparação do útero para a implantação e que podem contribuir com o êxito do estabelecimento da gestação. A importância do plasma seminal deve-se à sua composição, onde há diferentes componentes que exercem efeitos importantes sobre o espermatozóide, o trato reprodutivo da fêmea (útero e oviduto) e na sobrevivência e implantação embrionária, os quais estão resumidos a seguir:

Uso de plasma seminal sintético em porcas nulíparas

n Efeitos do plasma seminal • Meio de transporte para espermatozóides: 1. Efeito sobre o metabolismo espermático 2. Efeito sobre a motilidade espermática • Mudanças na fisiologia uterina: 1. Estímulo das contrações uterinas 2. Efeito de relaxamento no istmo do oviduto 3. Resposta inflamatória do endométrio 4. Antecipação da ovulação 5. Atividade antimicrobiana Foi desenvolvido em nosso laboratório um plasma seminal sintético (PSS), baseado na composição do plasma seminal. De acordo com nossa experiência prática, as técnicas de utilização do PSS em porcas nulíparas são as seguintes: n 1. Uso de PSS em porcas nulíparas com o método de inseminação bifásico Este método consiste em administrar um volume de 30 mL de PSS aclimatado a 37oC (mesma temperatura que a dose), previamente à aplicação das doses seminais, seguindo-se a pauta de I.A. para nulíparas.

Martín Rillo, S. e col., 1996

n 2. Sensibilização de porcas nulíparas com PSS no ciclo estral prévio à inseminação Este método consiste em administrar um volume de 100 mL de PSS a 37oC durante o cio, previamente ao processo de inseminação das porcas nulíparas; para no cio seguinte inseminar segundo a pauta de I.A. para nulíparas, ou seja, 30 mL de PSS previamente à introdução da dose, em cada uma das inseminações que sejam realizadas nesse cio. 83

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n Resultados

García Ruvalcaba, J.A. e col., 1997

N.R. = Taxa de não retorno LNT = Leitões nascidos total LNV = Leitões nascidos vivos

Manejo da porca inseminada e diagnĂłstico precoce de gestaĂ§ĂŁo

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A fêmea, uma vez inseminada, deve ser mantida no setor de cobertura, para controle, por um período ideal de 35 a 42 dias. Durante esse período a fêmea não deverá ser submetida a nenhum manejo ou reagrupamento que lhe possa provocar estresse e que lhe ocasione uma possível reabsorção ou perda embrionária. Especialmente crítico, dentro desse período, é a segunda semana pós-cobertura, que coincide com a data de implantação dos embriões no endométrio. A partir de quinze dias pós-cobertura deverão ser realizados os controles de retorno ao cio e confirmação do diagnóstico de gestação. O controle de retorno ao cio deverá ser efetuado com a ajuda de cachaços rufiões, devendo-se fazer com que o os mesmos passem pela frente das porcas duas vezes ao dia, durante 15 minutos cada vez – no mínimo – sob a atenta vigilância do funcionário, sempre nos mesmos horários e sem coincidir com a hora do arraçoamento, ou com outros períodos em que os animais ou os funcionários possam se distrair. Durante as passagens do rufião deverá se prestar especial atenção às porcas que se encontrem entre o 18º e o 24º dia pós-cobertura, período em que pode ocorrer a maior frequência de retornos ao cio de tipo regular e quando as fêmeas deverão ser checadas. As porcas que retornarem ao cio, ou as negativas, passarão novamente pela área de cobertura para voltarem a ser inseminadas ou serem eliminadas, segundo seus antecedentes reprodutivos. As porcas que não retornarem ao cio, ou as positivas, deverão ser confirmadas posteriormente através de algum dos métodos de diagnóstico de gestação disponíveis: • a partir do 22º dia pós-coberitura, com um aparelho de ultra-sonografia do tipo B (ecógrafo de tela), onde se observa as vesículas embrionárias e a condição de gestante da fêmea. • entre os dias 28 e 35 pós-cobertura, com um aparelho de ultra-sonografia do tipo A (ultra-som), no qual se observa uma luz e/ou se escuta um som indicando positividade; ou com um equipamento de efeito Doppler, o qual permite ouvir o som característico da atividade da artéria uterina na fêmea gestante, ou as batidas dos corações fetais em um segundo controle. Posteriormente se voltará a comprovar – entre os 35 e 42 dias pós-coberitura – com qualquer dos métodos de diagnóstico disponíveis, considerando-se gestante toda a fêmea que resulte positiva durante o mesmo e trasladando-se, então, as referidas fêmeas para o setor de gestação da granja. n Manejo da porca gestante: São três os objetivos principais, no manejo da porca gestante: chegar ao parto com uma condição corporal correta; manter a gestação maximizando o tamanho da leitegada (evitar, na medida do possível, a mortalidade embrionária); conseguir um peso adequado e uniforme dos leitões. Para alcançar esses objetivos, há que se levar 86

Manejo da porca inseminada e diagnóstico precoce de gestação

em conta o manejo da porca durante a fase embrionária da gestação (primeiros 35 dias) e o manejo relativo à sua alimentação. Manejo da fêmea: Submeter porcas ou primíparas ao estresse durante a fase embrionária da gestação pode resultar em um aumento da mortalidade embrionária, o que levará a uma redução no tamanho da leitegada ou, inclusive, à perda total da gestação. Para evitar que isso aconteça seria recomendável: • Manter separadas as porcas primíparas do restante das fêmeas. • No caso do alojamento de porcas em jaulas individuais, as primíparas deveriam ser submetidas a um período da adaptação às mesmas, anterior à cobertura. • Evitar a movimentação de porcas e primíparas durante os primeiros 35 dias da gestação, inclusive aqueles procedimentos que possam parecer pouco importantes, como a reordenação das fêmeas. • Manter sempre as fêmeas em condições de termo-neutralidade, evitando temperaturas inferiores a 15°C e superiores aos 28°C. Superada esta primeira fase, a gestação será mais estável e as fêmeas resistirão melhor às situações de estresse; não se deve esquecer, porém, que fortes episódios de estresse podem chegar a ser causa de abortos, o que deve ser considerado, especialmente, quando as porcas são manejadas em grupo. Manejo da alimentação: Um manejo adequado durante a gestação permitirá a redução da mortalidade embrionária, uma vez que assegurará as condições ideais para a porca e o correto crescimento fetal, preparando-a para encarar a futura fase de lactação. Na alimentação há que se considerar quatro fases: A) Primeira semana de gestação: alimentar com cuidado, sem exceder as quantidades de ração recomendadas, para maximizar a sobrevivência embrionária, particularmente no caso de primíparas. Como sugestão, podemos falar de 1,6 a 2,0 kg/dia para primíparas e de 2,0 a 2,3 kg/dia para multíparas, com nutrientes de baixa densidade na dieta (13 Mj de EM/kg e 0,55 a 0,6% de lisina). B) Da primeira semana até o 35º dia de gestação: alimentar tanto as primíparas como as multíparas em função de sua condição corporal. O objetivo é conseguir a condição desejada para o parto (20 a 22 mm em P2, no parto), neste período de tempo. C) Dos 35 aos 95 dias de gestação: manter o estado corporal das fêmeas, evitando que percam peso. 87

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D) Dos 95 dias até o dia anterior ao parto: suplementar com 1,5 kg ração/dia a ração anterior, tanto para primíparas como para multíparas.

As restrições pré-parto sugeridas não serão necessárias, uma vez seguidas as normas determinadas. Tão somente no dia anterior à data prevista para o parto a ração deverá ser reduzida à metade, com a finalidade de evitar a limpeza dos comedouros no dia do parto.

Controle das condições ambientais na central de inseminação artificial suína

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Para se conseguir uma expressão máxima do potencial genético nas granjas de suínos, é preciso lhes proporcionar um meio ambiente adequado. No caso das C.I.A. suínas, a manutenção e o controle das condições ambientais dos cachaços são fundamentais para a obtenção de uma produção de sêmen homogênea e de alta qualidade. O controle ambiental (temperatura, umidade, ventilação, concentração de gases, luz, ...) mantendo algumas variações que assegurem o bem-estar e o conforto dos cachaços, ajudará a melhorar os índices técnicos (produtividade) e econômicos (custo/dose) da Central.

1. Influência dos fatores ambientais sobre a capacidade reprodutiva do cachaço Existe uma série de fatores externos, ao próprio cachaço, que podem afetar tanto a sua aptidão reprodutiva (libido e qualidade seminal), como a sua aptidão física (aprumos e funcionamento do seu aparelho genital).

Sistemas de condicionamento ambiental Para selecionar o sistema mais idôneo para a C.I.A. é preciso levar em conta diversos fatores, entre os quais: • Situação geográfica da Central de inseminação • Dimensões e disposição da instalação • Condições de isolamento térmico • Número e tipo de animais alojados • Tipo de alojamento 90

Controle das condições ambientais na central de inseminação artificial suína

Durante os períodos de calor intenso, a diferença de temperatura entre o exterior e o interior da instalação se reduz e, além disso, é preciso adicionar o calor que se desprende dos animais, o qual faz com que não se consiga manter uma temperatura inferior a 5ºC no interior da instalação, com relação ao exterior. Isso torna imprescindível o uso de sistemas de refrigeração. A refrigeração da instalação pode ser feita por meio de sistemas evaporativos por baixa de temperatura (parede úmida) ou de evaporação por alta pressão (coolings). O sistema do tipo parede úmida só é eficaz em regiões que têm baixa umidade relativa durante o verão. É importante que o jato de ar fresco seja disperso e que não sopre diretamente sobre os animais. Em certas regiões geográficas, que apresentam temperaturas baixas durante o inverno, pode ser necessário incorporar um sistema de calefação (através de ar ou água quente). Entre os fatores ambientais que afetam a capacidade reprodutiva do cachaço, temos:

Saída de ar do “cooling”

n 1. Temperatura Temperatura ótima recomendada: de 16 a 22ºC É um dos fatores de maior influência sobre a fertilidade do cachaço. No testículo existem mecanismos fisiológicos de termo-regulação, para manter a temperatura intra-testicular ótima, já que a espermatogênese (produção de espermatozóides) é muito sensível às altas temperaturas. O plexo pampiniforme é uma estrutura vascular em forma de rede entrelaçada, especializada no controle da temperatura nos testículos, através de um sistema de intercâmbio de temperatura. O calor do sangue (39ºC) procedente do corpo é transferido até os vasos venosos que retornam com sangue venoso, mais frio e procedente da superfície testicular. Esse sangue venoso vai se esfriando, ao percorrer a superfície do escroto. O músculo cremaster ajuda a sustentar os testículos e participa no controle da temperatura testicular. Quando a temperatura ambiental é baixa ele se contrai, aproximando os testículos do corpo do animal. Se a temperatura é elevada, o músculo cremaster se relaxa, permitindo que os testículos se separem do corpo, facilitando assim a sua aeração. A função da pele escrotal é muito importante, já que ela possui sensores de temperatura, os quais regulam o ritmo das respirações do animal (arquejo) favorecendo a eliminação do calor através da evaporação, no nível da mucosa respiratória. 91

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Outro mecanismo de termo-regulação no nível testicular diz respeito à contração e ao relaxamento da túnica dartos. Durante os períodos frios ela se contrai, enrugando a superfície da pele escrotal e minimizando a perda de calor. Nas épocas de calor, a túnica dartos relaxa e a superfície do escroto aumenta consideravelmente, facilitando o resfriamento. No cachaço, devido à disposição do escroto e à sua escassa capacidade de sudorese, existe uma relação direta entre a temperatura corporal e a temperatura intra-testicular. A temperatura intra-testicular é de 35 a 36,5ºC, normalmente 2,5ºC a menos que a temperatura retal. Altas temperaturas Quando a temperatura da instalação supera a zona de termo-neutralidade do cachaço (temperatura crítica máxima = 29ºC), são produzidas algumas alterações devidas ao estresse térmico. Consequentemente altera-se a funcionalidade da hipófise, havendo redução da liberação de gonadotrofinas, as quais agem sobre a espermatogênese, que então altera a produção de sêmen, levando a: • Incremento de formas anormais • Decréscimo da motilidade • Redução do porcentual de acrossomas normais • Alteração na viabilidade espermática • Diminuição da capacidade de conservação das doses seminais, ao longo do tempo Os efeitos do estresse térmico são muito variáveis, podendo-se observar variações individuais e devidas às raças ou linhas genéticas. Certos cachaços conseguem se adaptar às altas temperaturas, se sua elevação for gradual. Quando as diferenças de temperatura entre o dia e a noite supera os 10ºC e a umidade relativa é muito elevada (superior a 90%), a capacidade de adaptação se torna mais difícil, aumentando a sensibilidade ao estresse. Quando as temperaturas ambientais são altas e persistem por mais de 48 horas, a diferença entre a temperatura intra-testicular e a corporal se reduz, provocando os problemas já citados na produção espermática. O intervalo de tempo entre o início do estresse térmico e a aparição de alterações espermáticas pode ser um indicativo de, a que nível do ciclo da espermatogênese se produz a alteração.

Controle das condições ambientais na central de inseminação artificial suína

Vários estudos têm demonstrado que o estresse térmico incide, especialmente, sobre a fase final da espermatogênese. Assim, pois, as espermátides e os espermatozóides jovens imaturos são mais sensíveis aos efeitos negativos das altas temperaturas, comparativamente aos espermatozóides maduros armazenados no epidídimo e às espermatogônias (fases iniciais da espermatogênese).

Esquema da espermatogênese

É por isso que a queda na qualidade seminal só é detectada duas ou três semanas após a exposição a altas temperaturas. Segue-se de cinco a seis semanas com a qualidade seminal reduzida, que é o período de recuperação, até que se complete o ciclo espermático, o qual dura um total de sete semanas. Baixas temperaturas As baixas temperaturas (nunca abaixo dos 10ºC) são menos críticas na produção ou qualidade seminal, sempre e quando se aumente – de forma adequada – o aporte de ração, para que o macho não se veja obrigado a recorrer às suas reservas corporais. Um dos efeitos mais diretos produzidos pelas baixas temperaturas da instalação sobre o cachaço é a diminuição da libido do mesmo. Por isso, em certas áreas geográficas de clima frio, é Cachaço alojado em cama de palha necessário o uso de sistemas de calefação. O uso da cama de palha abundante (preferencialmente de cevada) nos alojamentos dos cachaços ajuda a elevar a temperatura na área de descanso dos 93

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mesmos, entre 3 e 4ºC. Comprovou-se ainda seu efeito positivo sobre a qualidade seminal já que, além de reduzir a umidade do solo, diminuem também os problemas de patas nos cachaços.

n 2. Umidade relativa Umidade relativa recomendada = 60 a 75% O grau higrométrico tem influência direta sobre a eficácia reprodutiva do cachaço, devendo a umidade relativa do ar recomendada ficar entre 60 e 75%. A relação entre umidade e temperatura é denominada índice de calor. Este valor faz referência à sensação térmica que tem o corpo, quando se combina altas temperaturas com a umidade ambiental. A influência a umidade começa a ser notada a partir dos 26ºC. Na ilustração seguinte, na área sombreada em azul podem ser vistos os índices de calor inferiores a 29ºC, o que seria a zona de conforto do cachaço:

A umidade relativa elevada agrava o estresse pelo calor, ao reduzir a capacidade de eliminação do calor corporal por evaporação através do aumento do ritmo respiratório (arquejo). Além disso, o ar excessivamente úmido é menos isolante que o ar seco, o que faz com que o local seja mais frio quando as temperaturas baixam. Se, ainda, a instalação não tiver um sistema de isolamento adequado, o excesso de umidade se condensará nas paredes, favorecendo a deterioração da mesma. 94

Controle das condições ambientais na central de inseminação artificial suína

Outro problema relacionado à umidade elevada diz respeito ao favorecimento da proliferação de microrganismos. Nos pisos úmidos ocorre grande proliferação de bactérias de diversas origens (água, fezes, ração, ...). Daí a importância de uma limpeza eficaz e do uso de desinfetantes e produtos secantes, que reduzam a umidade do alojamento. Muitos microorganismos transmitidos por via aerógena necessitam também de um nível determinado de umidade. O nível de umidade relativa ideal para reduzir a proliferação de bactérias, vírus, fungos, estaria entre 40 e 60%. A redução no grau de umidade relativa de 90 para 80% pode levar a uma redução da transmissão aérea de microrganismos patógenos da ordem de 50%. O encharcamento dos pisos pode provocar também um sensível aumento da população de larvas de moscas e outros insetos, aumentando a incidência de parasitoses. O excesso de umidade no piso também tem um efeito negativo sobre os cascos dos cachaços, favorecendo o amolecimento dos mesmos e, consequentemente, aumentando a incidência de problemas locomotores. n 3. Ventilação Para se conseguir temperatura e umidade adequadas é necessário uma correta ventilação. A corrente de ar de um sistema de ventilação dinâmica deve ser calculada de acordo com as circunstâncias particulares da instalação. Normalmente, para os cachaços, ela oscila entre 36 m3/hora no inverno até 360 m3/hora no verão. Também é importante conhecer a velocidade do ar, já que ela influencia na perda de calor dos animais e nas patologias respiratórias. Assim, pois, a temperatura de conforto para os cachaços pode ser inadequada, se a velocidade do ar for excessiva na de entrada de ar fresco do sistema. Velocidade de ar recomendada = 0,2 a 0,7 m/segundo A ventilação é necessária para a renovação do ar e: • para a provisão de oxigênio • para ajudar o intercâmbio de CO2 com o exterior • para eliminar o excesso de umidade produzida no interior do alojamento, consequência da respiração dos animais e da evaporação de urina e da água utilizada na limpeza • para a eliminação dos maus odores • para a eliminação de gases nocivos • para a eliminação de pó e de partículas em suspensão

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n 4. Concentração de gases

Produzida em consequência da respiração dos animais (CO2) e da fermentação da matéria orgânica dos dejetos (amoníaco e ácido sulfídrico). Concentrações elevadas destes gases podem afetar o bem estar dos cachaços.

Assim, pois, concentrações elevadas de amoníaco podem originar desde leve irritação nos olhos, até irritação de fossas nasais e garganta. No caso do ácido sulfídrico, pode ocorrer perda de apetite e – inclusive – dificuldade respiratória e problemas neurológicos. Os níveis elevados de dióxido de carbono são indicativos de problemas na ventilação da instalação.

n 5. Luz e fotoperíodo

Certos problemas de produtividade e qualidade seminal observados nos cachaços podem estar associados a um efeito estacional, que combina mudanças de temperatura e de fotoperíodo. O volume e o pH do ejaculado são muito dependentes da atividade secretora das glândulas acessórias, as quais são muito influenciadas pelas mudanças no fotoperíodo. A exposição dos cachaços a dias mais longos melhora a função testicular, aumentando a concentração de testosterona. Segundo diversos autores, a concentração e o número de doses se reduzem no caso de fotoperíodo decrescente. O grau de alteração depende da raça e do indivíduo. Quanto à iluminação, estudos revelam que ela também afeta a concentração de espermatozóides, a produção de esteróides e a libido. É importante ter acesso a uma boa fonte de luz natural, que garanta um período de 10 a 12 horas diárias de luz, suplementando com luz artificial quando for necessário. A luz fluorescente é melhor que a incandescente, porque evita sombras e distribui melhor a luz. A luminosidade recomendada para a C.I.A. é de 250 a 300 luxes, na altura da cabeça dos cachaços. 96

Controle das condições ambientais na central de inseminação artificial suína

2. Estudo sobre diferenças na qualidade seminal segundo o tipo de controle ambiental Foram realizados diversos estudos sobre a influência do controle ambiental sobre a qualidade seminal, nas Centrais de Inseminação Artificial:

Super índices distintos: significativo para p < 0,05

3. Controle ambiental na c.I.A.: Níveis recomendados O controle das condições ambientais, em uma C.I.A., melhora o bem estar dos cachaços e favorece uma maior produção de sêmen, de forma estável, ao longo do ano e com qualidade seminal superior.

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Nutrição do cachaço

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As publicações sobre requerimentos nutricionais de cachaços adultos são limitadas, então podemos nos basear em algumas que fazem uma boa revisão sobre esta fase da reprodução, entre elas as de Kemp & den Hartog (1989), Colenbrander & Kemp (1990), Close & Roberts (1993), Brown (1994), Patience (1995), Mateos (1997), Cameron (1997), NRC (1998), Close & Cole (2000), Wilson (2000), Palomo (2001), Kemp & Soede (2001), Quiles (2004), Abrahão et al. (2006) e USB (2010). O custo da alimentação dos cachaços, associado ao custo final de produção é mínimo (0,10 a 0,15%), enquanto que sua influência potencial sobre a quantidade e a qualidade seminal/ cachaço/vida produtiva, é elevada. Isso nos situa – em condições práticas – nos dois extremos, tendo acesso a dietas deficitárias ou com excesso de nutrientes, cuja utilização – em qualquer um dos casos – será contraproducente. Como é óbvio, o cachaço tem necessidades próprias em termos de nutrientes, diferenciadas do restante das reprodutoras (reposição, gestantes e lactantes), uma que alguns deles são determinantes e influentes nos fatores de eficácia do cachaço (libido, qualidade e quantidade de sêmen, capacidade fecundante dos espermatozóides, bem estar, qualidade dos aprumos e longevidade). Baseado no tempo necessário para completar o ciclo da espermatogênese e a maturação espermática, a resposta à alimentação poderá ser observada entre a 6ª e a 7ª semanas posteriores à modificação nos níveis de nutrientes. Para se fixar nas necessidades diárias, dentro das especificações nutricionais para os cachaços, devemos levar em consideração os seguintes pontos de referência: • Genética • Peso: determina as necessidades energéticas de manutenção • Ambiente: umidade relativa e temperatura • Frequência de saltos • Tipo de alojamento

n Energia

Como pilar central da nutrição dos cachaços, durante a sua vida reprodutiva devemos considerar a sua condição corporal adequada, segundo os pontos anteriores e, para tanto, nos basear no seu grau de crescimento (dos oito meses de vida até o início de sua atividade sexual) e no restante de sua vida produtiva, fatores estes que determinarão a sua longevidade. Como ponto básico da sua regulamentação nutricional, temos a concentração energética da dieta que, em sua grande parte destina-se a satisfazer as necessidades de manutenção e crescimento e – em menor grau – é dirigida para a produção seminal e a atividade sexual.

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Nutrição do cachaço

Tanto os excessos como as deficiências de energia darão lugar a problemas de produção espermática e transtornos locomotores. Sabemos que 80% dos cachaços descartados de uma C.I.A. o são por excesso de peso e/ou por problemas de aprumos. A título de orientação, pode-se adotar como referência as necessidades de energia estabelecidas por Kemp:

* = energia metabolizável; 1 MJ = 238,85 Kcal

n Proteína O segundo grande grupo de nutrientes, na alimentação do cachaço, são as proteínas e os aminoácidos, cujas particularidades podemos sintetizar da seguinte maneira: • Severas restrições de proteína e de lisina reduzem o volume seminal e a libido, que se refletem na redução do tempo de ejaculação e no incremento do tempo necessário para iniciá-la • Suplementação, mesmo em alto grau, de lisina e metionina não melhoram a libido • Os níveis de treonina não estão bem definidos, embora haja estudos que lhes dêem maior atenção, estabelecendo uma relação mínima com a lisina, da ordem de 65%. As últimas recomendações sobre aminoácidos publicadas pelo USB-US Pork Center (2010), para cachaços a partir de 10 meses de idade e expressas em percentual total da dieta são:

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n Fibra Baseado no fato dos cachaços permanecerem em racionamento durante toda a sua vida reprodutiva é importante que aportemos à dieta dos mesmos um mínimo de fibra neutra detergente (de 19 a 20%), que favoreça o seu conforto digestivo e bem estar, através da incorporação de fibras dietéticas na ração. A manutenção do equilíbrio da flora digestiva reverterá tanto na saúde do animal, como na melhora da qualidade e da quantidade seminal, estendendo – ainda – a sua longevidade. Considerar que a fibra também tem um papel adicional sobre a regulação hormonal, através da absorção e reciclagem dos esteróides do intestino pela circulação enterohepática. n Minerais Os minerais que têm impacto na vida reprodutiva do cachaço são apenas o cálcio, o fósforo, o zinco e o selênio. O efeito dos níveis de cálcio e fósforo, assim como a relação entre ambos na mineralização óssea são essenciais. As últimas recomendações nutricionais para cachaços adultos, com relação ao total da dieta, são de: Cálcio total........................................0,85 % Fósforo total......................................0,75 % Fósforo digestível.............................0,35 % O zinco está envolvido no desenvolvimento do tecido parenquimatoso e das células de Leydig, aumentando a sensibilidade ao hormônio luteinizante e intervindo na gênese dos esteróides e na produção de testosterona. Seus níveis recomendados, tanto de fontes inorgânicas como orgânicas, estão entre 100 e150 ppm. O selênio intervém na espermatogênese, desenvolvendo as células de Sertoli, o que melhora a maturação espermática. Seu efeito está ligado ao da vitamina E, que atua como antioxidante. Deficiências de selênio dão lugar a um aumento das anomalias morfológicas espermáticas e a uma menor concentração de ATP nos espermatozóides, o que reduz a capacidade fecundante. O uso de 0,3 a 0,6 ppm de selênio na forma orgânica determina variações positivas na qualidade seminal, segundo a maioria dos estudos. n Vitaminas Dentro das vitaminas a serem consideradas na vida reprodutiva dos cachaços, devemos nos ater, sobretudo, ao ácido ascórbico (vitamina C), vitaminas A, E, D3 e biotina. A vitamina A está implicada na libido e na síntese das glicoproteínas que controlam a diferenciação celular do tecido testicular. 102

Nutrição do cachaço

A vitamina D3, em conjunto com o cálcio e o fósforo, intervém no desenvolvimento ósseo favorecendo a absorção de ambos, o que significa, indiretamente, ter uma função chave na qualidade dos aprumos. A vitamina E intervém na espermatogênese e na regeneração testicular, além de – por seu efeito antioxidante – aumentar a motilidade e a capacidade fecundante dos espermatozóides. A biotina, como vitamina sulfurada, tem efeito direto sobre a integridade dos cascos, reduzindo indiretamente a incidência de problemas locomotores. As necessidades de ácido ascórbico, nos cachaços, estão cobertas – em condições normais – pela síntese do mesmo no nível intestinal. Entretanto, nos estados de estresse (sanitário, ambiental, de manejo, …) ocorrem carências e, nessas situações, a suplementação estaria justificada. Da mesma forma se incluem aqui a L-carnitina e certos ácidos graxos essenciais. Como referência de uma ração específica para cachaços de Centrais de inseminação, foi desenvolvida a seguinte tabela:

* fibra em detergente ácido ** fibra em detergente neutro 103

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n Água Este é o nutriente que ocupa o maior percentual do corpo do cachaço, correspondendo a 60 - 65% de seu peso adulto em, praticamente, todos os tecidos. Por isso, o aporte de água de máxima qualidade físico-química e microbiológica, com nível e vazão adequados, limpa e fresca, é essencial para o bom rendimento reprodutivo do cachaço e a quantidade e qualidade do sêmen produzido. Devemos nos assegurar de que nossos cachaços estejam bebendo acima de 10% de seu peso vivo, com consumos médios – a temperaturas neutras – da ordem de 15 a 20 litros por dia e com variações que vão de 10 a 40 litros. Para tanto, devemos ter registros do consumo médio de água da Central, com os medidores correspondentes. Do mesmo modo e como norma geral do manejo da alimentação dos cachaços, devemos saber com precisão que quantidade diária de ração eles consomem e se esta corresponde à quantidade que queremos que consumam; para tanto, o controle mensal de peso/volume de ração e a pesagem dos cachaços é recomendável. n Uso do adaptador nutricional ADAPBOAR® Os cachaços constituem uma população pequena dentro do conjunto de animais da suinocultura. Entretanto, embora sua importância com relação à produção global da granja seja enorme, os cuidados proporcionados a eles não correspondem a essa situação. Por isso é necessário fornecer ao cachaço condições gerais de nutrição adequadas, além de bem estar e sanidade que o ajude a expressar todo o seu potencial genético, permitindo a obtenção de ejaculados de máxima qualidade. De todos os fatores que favorecem a expressão genética nos cachaços, um dos de maior influência é o fator nutricional, que afeta de forma direta o parênquima testicular, envolvido com a produção celular espermática, além dos tecidos relacionados indiretamente na produção seminal. Muitas Centrais de Inseminação (C.I.A.) usam rações inadequadas para os cachaços de alta seleção genética. É preciso levar em conta que as necessidades nutritivas dos machos provenientes de linhas genéticas selecionadas não são conhecidas profundamente, devido talvez a pouca importância que se tem dado a esses animais, desde tão somente os últimos 25 anos. Podemos encontrar no mercado tratamentos diretos, do tipo hormonal e/ou mineral, disponíveis para administração oral ou parenteral. São produtos voltados ao incremento da libido e da produção seminal, embora apenas paliativos e com ação temporária, para uso em curtos períodos e de forma individual, o que aumenta a utilização de mão de obra e custos. Além disso, esses produtos costumam conter níveis diários maiores que os necessários para os cachaços, resultando em super dosagens, as quais podem implicar em perigo para a saúde dos mesmos. Em algumas C.I.A. se utiliza produtos complementares ou suplementos nutricionais que contêm aminoácidos sintéticos e oligoelementos. 104

Nutrição do cachaço

A maioria destes produtos é recomendada para utilização por curto período de tempo e de forma individual, com intervalos entre doses de trinta dias ou mais. Esse sistema de dosagem de “altos níveis em curto espaço de tempo” não é o mais adequado do ponto de vista nutricional, já que a eficiência da utilização dos nutrientes administrados é menor; por outro lado, existe o risco dos oligoelementos serem eliminados em alto percentual através das excretas, contribuindo assim para uma maior contaminação ambiental através das purinas e elevando o custo dos produtos. Existem outros aspectos importantes a levar em conta nas C.I.A., como o bem estar animal e o baixo nível de atividade física praticada pelos cachaços durante os dias em que não se realiza coleta de sêmen. Essas situações originam problemas como obesidade, alterações em cascos, extremidades e mudanças no estado de ânimo, as quais podem levar a estereotipias do tipo agressivo ou depressivo. Há trabalhos publicados sobre comportamento desse tipo de animais, indicando que em 81% do tempo eles estão relegados ao repouso, sendo o consumo de água e alimento o único estímulo que os faz ter atividade. Daí o grande interesse em favorecer as condições de saúde e bem estar dos cachaços através de elementos físicos que os distraiam, entretenham e os obrigue a estarem ativos. O uso de ADAPBOAR®, produto em forma de biscoito desenvolvido pela Kubus e delineado especificamente para os cachaços de C.I.A., favorece a melhora dos níveis nutritivos da ração. Seu conteúdo de oligoelementos e vitaminas essenciais para a reprodução ajuda a otimizar a produção do ejaculado (em qualidade e quantidade). A oferta desse tipo de produto aos cachaços também faz com que aumente a atividade física dos mesmos, reduzindo o tempo em que os animais se encontram em repouso, ajudando assim a fortalecer o aparelho locomotor e proporcionando maior bem estar. Além disso, o uso do ADAPBOAR® municia o pessoal da C.I.A. com uma ferramenta que facilita o manejo e o treinamento dos cachaços, quando o produto é empregado como premio.

Adapboar

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Anexos

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12.1. Protocolo para centrais de inseminação artificial n Exemplo de protocolo diário (lista de verificações) para o laboratório Primeira hora da manhã • Verificar a temperatura da estufa e dos recipientes de coleta. A temperatura dependerá da distância até a sala de coleta e da temperatura ambiente da instalação dos cachaços. • Verificar a temperatura da água do banho-maria: 35 a 37ºC. • Ligar a placa de aquecimento, regular sua temperatura para 38 a 39ºC e colocar nela as lâminas e lamínulas. • Amornar o diluente a 35 - 36ºC, em seu recipiente (jarro, balão, frasco Erlenmeyer, bolsa). • Colocar os recipientes de coleta na janela dupla da sala de coleta. A temperatura na referida janela deve ser de 37ºC, aproximadamente. O nº de recipientes na janela dependerá do nº de pessoas trabalhando na coleta. Caso haja um setor pré-laboratório não será necessário colocar os recipientes na janela dupla, devendo o material ser recolhido diretamente da Hot-Cold (estufa de temperatura dupla, de 5 a 37ºC). • Colocar uma grade contendo tubos de ensaio com tampa para guardar algumas amostras de sêmen diluído dos machos, para verificar a motilidade e a condição dos acrossomas. Deixá-la junto da bomba peristáltica. • Se necessário, ajustar a bomba peristáltica. • Já no setor de coleta do sêmen e na janela de comunicação com o laboratório, apanhar o recipiente de coleta tampado e identificado. Medir a temperatura e dar entrada na identificação do macho no computador. • Cuidar para que a temperatura do ejaculado não baixe mais de 3ºC durante o processamento. Para tanto a temperatura ambiente do laboratório deverá estar em torno de 23 a 25ºC. Se a temperatura do ejaculado chegar até abaixo dos 34ºC, será necessário incorporar um banho-maria pequeno ou uma estufa, para a manutenção da temperatura durante a avaliação do sêmen. • Pesar o ejaculado no recipiente de coleta, em uma balança que tenha sido previamente tarada. • Inserir todos os dados da análise seminal no programa de informática utilizado. • Verificar as características organolépticas, observando a presença de odores ou coloração anômalos. • Observar a motilidade (percentual de movimento e tipo) em campo claro, com aumento de 10 ou 20 vezes. 108

Anexos

• Monitorar a concentração, através da câmara de Bürker: misturar bem o ejaculado, antes de tomar uma amostra de 1 mL de sêmen puro. Diluir a amostra a 1:100 em um balão já completado com solução salina formolada. Misturar suavemente, tomar uma gota da solução, com uma pipeta Pasteur e preencher a câmara de Bürker. Realizar a contagem de espermatozóides, incluindo o porcentual de formas anormais. O cálculo da concentração também pode ser realizado, com o colorímetro. • O programa de informática indicará o nº de doses que poderão ser elaboradas e a quantidade necessária de diluente. • Tarar a balança com a bolsa e/ou o recipiente a ser usado para a diluição. • Pesar o diluente. A temperatura deverá oscilar entre 34 e 36ºC. A bolsa poderá ser dependurada em um suporte, para facilitar o seu enchimento com as doses, através da bomba. • Conferir a temperatura do diluente e do ejaculado. Elas não deverão diferir em mais de 1 a 2ºC. • Adicionar suavemente o ejaculado, permitindo a mistura homogênea do sêmen e do diluente. Se necessário, adicionar algumas gotas de corante para diferenciar as distintas linhas de cachaços. • Conferir a motilidade da mistura. • Reservar 3 a 4 mL da amostra em 1 a 2 tubos de ensaio com tampa. Identificar os tubos e anotar a data da coleta. • Puncionar a bolsa plástica pelo canto inferior ou introduzir o tubo para dosificar no interior do jarro de coleta. Dosificar com a bomba peristáltica para encher os tubos com sêmen diluído. Coordenado com a pessoa que faz a coleta, ir preparando as grades com os tubos para o envase seguinte. • Selar os tubos com as doses, etiquetando-os com sua identificação e a data de vencimento. Separar em embalagens, por linhas ou por clientes. • Deixar os tubos por 1 hora, no mínimo, à temperatura ambiente de 22 a 25ºC, até que a temperatura desça a 23ºC. • Colocar os tubos na geladeira de conservação a 16ºC, onde devem permanecer por – pelo menos – 1 hora, antes de despachá-los para os clientes. • Despachar os pedidos diariamente. • Avaliar o percentual de acrossomas normais, ao finalizar a produção de doses do dia. • Controlar a conservação das amostras de machos coletados em dias anteriores, através de testes de motilidade com e sem cafeína e pelo percentual de acrossomas normais. • Imprimir o informativo diário de produção, para monitorar possíveis incidências. 109

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• Realizar a gestão das vendas do dia. • Limpar o laboratório: limpeza do material usado ao longo do dia e esterilização da vidraria. • Preparar e empacotar pedidos que ficaram pendentes para o dia seguinte. • Começar a consultar o protocolo de “Tarefas organizadas para a jornada de trabalho seguinte”. Deixar organizado para a jornada de trabalho seguinte • Preparar diluente: a quantidade dependerá do planejamento da produção de doses do dia seguinte. • Preparar recipientes de coleta com 100 mL de diluente normal: calcular o nº previsto de cachaços a coletar. Incorporar os filtros nos recipientes com os 100 mL de diluente. Colocá-los na Hot-Cold, que deverá estar a 5ºC. Programar o aquecimento a 37 - 38ºC, para 3 horas antes da coleta. • Preparar balões já completados com 99 mL de solução salina formolada (S.S.F.). • Verificar e ajustar o nível do banho-maria e o funcionamento do destilador, de tal maneira que o nível da água seja constante. Programar o início e o desligamento do banho-maria. • Verificar se há solução de citrato formol e solução de cafeína suficientes (conservação a 5ºC). n Procedimentos para as instalações dos cachacos Controles no interior da instalação • Controle diário de bebedouros e comedouros. • Controle de temperaturas máximas e mínimas na área de coleta. • Controle de horas de luz. • Controle de moscas e roedores. Limpeza • Limpar diariamente as salas de coleta após o uso, tanto o piso, como os manequins. • Substituir a cama de palha pelo menos uma vez por semana. Duas vezes por semana, no caso dos cachaços mais sujos. 110

Anexos

• Se não se usa palha, retirar os excrementos das baias. • Lavar as mãos depois de cada coleta. • Lavar a roupa de trabalho depois de cada jornada de trabalho. Normas de biossegurança • Cercar completamente o recinto. • O silo deve estar localizado próximo da cerca, para permitir a descarga da área externa. • Entrada única para as pessoas. • Entrada única para os animais. • Restringir a passagem de pessoas ou veículos pelo interior do recinto: Registrar todas as entradas no livro de visitas, implantado para essa finalidade. • Instalar rodolúvio e sistema de spray de passagem, obrigatório para qualquer veículo que precise entrar na Central. • Banhar-se antes de entrar na instalação e no laboratório, trocando a roupa e o calçado pelos próprios, da Central. • Estabelecer um programa de desinfecção, desratização e de controle de insetos. • Estabelecer um programa higiênico-sanitário para a Central, onde estejam descritos os protocolos de aplicação de vacinas e controle de parasitas previstos, assim como os trabalhos de limpeza ordinários e extraordinários. • Estabelecer uma quarentena efetiva, afastada da Central e exigir duas análises, com resultado negativo prévio, para permitir a entrada de animais na Central. • Realizar controles sanitários periódicos para garantir o bom status sanitário dos animais. • Controlar e higienizar a água de bebida dos animais. • Controlar os sintomas ou sinais de doenças nos animais. • Esvaziar periodicamente o fosso dos dejetos e/ou as esterqueiras, quando da utilização de cama de palha ou serragem. • Controlar os funcionários quanto ao tipo de alimentos introduzidos na Central e a proibição de ter em casa ou de trabalhar com outros animais. • Controlar os prestadores de serviço. • Controlar os transportadores de ração, animais de reposição, animais para o abate, esterco, lixo, cadáveres, materiais para eliminação ou reciclagem, palha, … 111

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Controle dos cachaços • Identificação do cachaço, através de cartão, em cada baia ou box. • Identificação de cada linha ou quadra de baias ou boxes de cachaços, para facilitar a localização dos mesmos. • Alimentar os cachaços uma vez ao dia, com tantos quilos de ração quanto seja necessário, para manter uma boa condição corporal. • Cortar os pelos do prepúcio dos cachaços, sempre que seja necessário.

Central de Inseminação Artificial Suína

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Anexos

12.2 Fichas

* cauda em chicote

** gota proximal

*** gota distal

n 12.2.1. Ficha de controle individual do cachaรงo

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Manual de inseminaĂ§ĂŁo artificial em suĂnos Kubus

* cauda em chicote

** gota proximal

*** gota distal

n 12.2.2. Ficha de acompanhamento da C.I.A.

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Anexos

n 12.2.3. Cronograma de coletas

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12.3. Tratamento da água utilizada na C.I.A. A qualidade da água é um fator fundamental na hora de se preparar o diluente. O diluente é o meio que permite preservar a viabilidade das células espermáticas durante o processo de conservação. As células espermáticas são sensíveis às impurezas do meio, daí a importância do uso de água da máxima qualidade possível. Os parâmetros de qualidade que podem ser medidos na água tratada são, principalmente: • Condutância (micro Siemens/cm) / Resistividade (mega Ohms/cm) • Presença de silicatos (mg/L) • Presença de metais pesados (mg/L) • Unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) • Presença de partículas maiores que 0,2 micra (partículas/L) • pH n Contaminantes presentes na água corrente Partículas As mais grossas são eliminadas graças a um processo de pré-filtragem (10 a 20 micros), anterior aos demais processos de ultra-filtração. Solutos inorgânicos São: • Íons Ca 2+, Mg 2+ (mg/L) • CO (mg/L) 2

• Silicatos (mg/L) • Fe 2+, Fe 3+ - • Cl , Fl Esses solutos estão carregados positivamente (cátions) ou negativamente (ânions). Transmitem a corrente elétrica quando se aplica uma voltagem a dois eletrodos introduzidos na água. Assim, quanto maior a presença de íons na água, maior será a medida de condutividade da mesma.

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Anexos

Solutos orgânicos São: • Pesticidas • Herbicidas • Gasolina • Tecidos de origem animal e vegetal • Plásticos, monômeros de estireno (de tanques) e resinas de deionização São procedentes de sistemas de purificação desenhados incorretamente. Microrganismos Amebas, rotíferos, diatomáceas, algas e, sobretudo, as bactérias. Os sistemas de purificação de água: • Eliminam as bactérias presentes na água corrente • Asseguram a ausência de bactérias na água produzida As bactérias se multiplicam exponencialmente na água parada. Subsistem em muitos substratos, inclusive em água purificada que contenha solutos orgânicos e inorgânicos (enxofre, ...). Uma vez presentes no sistema de purificação, as bactérias secretam algumas substâncias poliméricas que aderem nas superfícies dos tanques de armazenagem, cartuchos de deionização, bombas e outras superfícies de onde são difíceis de serem eliminadas. Para a limpeza desses sistemas pode-se usar desinfetantes como o peróxido de hidrogênio, o hipoclorito ou o formaldeído (depende do equipamento). n Métodos de purificação de água A) Destilação Processo de purificação que contempla uma mudança no estado da água – de líquido para vapor – e de novo para liquido, deixando para trás certas impurezas. Costuma vir combinado, no caso de águas com muito calcário, de descalcificadores ou agentes anti-calcáreo. Tem o inconveniente de ser um processo lento, exigindo que a água seja armazenada para uso posterior. Se o depósito não for feito de material inerte, pode ocorrer contaminação da água. Além disso, as bactérias crescerão com facilidade na água armazenada. Quando se abre os recipientes que contêm a água, a mesma fica exposta à contaminação bacteriana. É um sistema que gasta muita água e energia, requerendo ainda limpezas regulares para eliminar os depósitos calcários que poderiam ser produzidos.

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B) Deionização É um sistema que contém um núcleo de resinas, por onde a água passa. Funciona intercambiando íons H+ e OH- por cátions e anions contaminantes. Passado algum tempo, quando todos os íons tiverem sido substituídos, os cartuchos deverão ser trocados e regenerados. C) Osmose inversa Baseado no movimento da água através de membranas semipermeáveis, por osmose. O movimento da água flui da parte mais diluída para a mais concentrada, até igualar as concentrações. Se for aplicada uma pressão maior sobre a força osmótica, através de uma bomba instalada na parte mais concentrada, as moléculas de água retornarão à parte mais diluída, concentrando ainda mais a outra parte. Este sistema elimina entre 90 e 99% dos contaminantes; é muito eficiente, porém muito caro. Deve ser usado em combinação com um deionizador, para que se prolongue a sua vida útil. D) Filtro de carvão ativado Elimina, por absorção, o cloro livre e os solutos orgânicos por adsorção. Usado como complemento para outros sistemas de filtração. E) Ultrafiltração Usa uma membrana parecida com a de osmose inversa, porém, com poros um pouco maiores. Com esse processo se obtém água purificada de muito boa qualidade. F) Filtração por microporos Trata-se de uma membrana com poros de 0,2 micra, que impede a passagem de contaminantes de maior tamanho, como restos de partículas dos cartuchos e bactérias que tenham entrado no sistema. Pode ser combinado com a ultrafiltração e a deionização. G) Sistema de ultravioleta Usa ondas de longitude muito curta, as quais podem exercer atividade bacteriostática ou bactericida, dependendo da intensidade, tempo e fluxo dos raios ultravioletas. n Qualidade da água purificada Os íons e cátions transferem a corrente elétrica, quando se aplica uma voltagem a dois eletrodos inseridos na água. Quanto maior a quantidade de íons presentes, maior será a condutividade (e menor a resistividade). 118

Anexos

A condutividade é expressa em microSiemens/cm, sendo inversa à resistividade, cuja unidade de medida é o megaOhms/cm. A qualidade máxima obtida para uma água purificada, referente aos parâmetros anteriores, é de aproximadamente 18 megaOhms/cm (0,06 microSiemens/cm). Quanto aos microrganismos, normalmente a água corrente já vem tratada contra alguns deles, como amebas, algas, diatomáceas, sendo necessário – porém – um sistema de purificação acessório para eliminar a maior parte das bactérias. A presença de bactérias pode ser detectada através da realização de cultivos, para se determinar o número de unidades formadoras de colônias (UFC). As características da água purificada do tipo ultra pura (UPW) dificultam a medida exata do pH, pelo fato da mesma ser um solvente excelente e possuir uma força iônica muito baixa. Teoricamente, a água de extrema pureza tem um pH neutro. Ao entrar em contato com o ar, ocorre a rápida absorção de CO2 e de outros contaminantes, podendo o pH baixar até 5 ou 6. Dependendo dos valores dos diferentes parâmetros de qualidade da água obtida, podemos classificá-la como: • Tipo I • Tipo II • Tipo III

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Os padrões de classificação da água variam, dependendo dos grupos científicos consultados. Estes grupos são: • ASTM (American Society for Testing and Material) • NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) • CAP (College of American Pathologists) As águas recomendadas, para uso em I.A. de suínos são as do tipo I e II. Os parâmetros da água utilizada na preparação das doses seminais devem se aproximar, o máximo possível, destas variações: condutividade = 1 microSiemens/cm (máximo 1,5); pH = entre 5,5 e 7,0; crescimento bacteriano = 10 UFC/mL (máximo). Estes padrões se aplicam para a água recém produzida, já que com o tempo ela vai se deteriorando. Recomenda-se produzir somente a água que irá ser consumida. Se for necessário armazenar, deve-se fazê-lo em depósitos de material inerte e que sejam opacos, ou então armazenar em locais com ausência de luz solar.

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