APROLI BARI by nico cantatore

VALUTAZIONE DEGLI EFFETTI QUANTI-QUALITATIVI DEI RESIDUI PRESENTI NELLE OLIVE DA TAVOLA E NELL'OLIO D'OLIVA SULLE FUNZIONI DIGESTIVE: GLI ANTICRITTOGAMICI

PROF. LUCANTONIO DEBELLIS Università degli Studi di Bari Dipartimento di Fisiologia Generale e Ambientale

Hanno collaborato

CARMEN LO VERDE ROBERTO SUMMO Progetto grafico e Stampa

INDICE Introduzione

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L'olio extravergine d'oliva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Obiettivi dell'analisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Gli agrofarmaci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 I residui degli agrofarmaci nei prodotti destinati al consumo alimentare umano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Gli agrofarmaci e la funzionalitĂ gastrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Metodica di analisi

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Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 SOLFATO RAMEICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 DODINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 PROCIMIDONE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 SIMAZINA

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Conclusioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 INDICAZIONI PER I FUNGICIDI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 INDICAZIONI PER GLI ERBICIDI

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INTRODUZIONE

L'olio extravergine d'oliva Da alcuni decenni si va sempre più diffondendo il concetto che il cibo non debba più essere inteso semplicemente come nutrimento, bensì come alimento promotore di benessere. Diverse indagini svolte nell'ultimo decennio tra i consumatori hanno evidenziato come un corretto regime alimentare, insieme all'esercizio fisico, sia percepito come il più importante fattore per il mantenimento di un soddisfacente stato di salute. Questa concezione sta fortemente influenzando il mercato dei prodotti alimentari che oggi in molti casi punta sull'aspetto "salutistico" dell'alimentazione. In questa ottica sono state identificate alcune classi di alimenti che, oltre alle loro proprietà nutrizionali convenzionali, sono caratterizzati da effetti salutistici addizionali. Tali alimenti sono oggi definiti con il termine alimenti funzionali. Le caratteristiche funzionali sono dovute alla presenza di componenti, generalmente non-nutrienti, che interagiscono più o meno selettivamente con alcune funzioni fisiologiche dell'organismo influenzandole positivamente (biomodulazione). Ne possono derivare effetti positivi per lo sviluppo dell'organismo, il mantenimento dello stato di salute e la prevenzione di patologie, in particolare di quelle correlate al regime alimentare. I più importanti alimenti funzionali sono tutti quelli che contengono le vitamine, indispensabili per il corretto sviluppo e mantenimento dell'organismo. Altrettanto rilevanti sono gli alimenti prebiotici e probiotici, ovvero i cibi di origine vegetale e lo yogurt, che consentono lo sviluppo della flora batterica intestinale essenziale per garantire il funzionamento del sistema digerente e ostacolare lo sviluppo incontrollato di batteri patogeni. Un ruolo notevole va attribuito anche agli alimenti ricchi di antiossidanti. Tali molecole contribuiscono notevolmente a ridurre i danni cellulari prodotti

dai radicali liberi, responsabili in parte dei processi di invecchiamento e dell'insorgenza di patologie, tra vitamina E (α-tocoferolo) le quali quelle tumorali. L'aspetto salutistico dell'alimentazione è uno dei punti di forza della dieta mediterranea. Un regime alimentare che ha la caratteristica peculiare di comportare l'introduzione quotidiana di un quantitativo preponderante di zuccheri complessi o amidacei e di una quota prossima al 30% di lipidi, caratterizzati da un elevato contenuto in acidi grassi polinsaturi di origine vegetale, adeguatamente protetti da agenti antiossidanti tra i quali in particolare la vitamina E. A questi nutrienti si accompagna una quota molto minore di proteine di origine animale e vegetale in equilibrato rapporto. La larga presenza olio d'oliva, vegetali, frutta, prodotti ittici e vino garantisce un apporto giornaliero delle migliori classi di nutrienti e di elementi funzionali come vitamine, prebiotici, probiotici e antiossidanti. L'importanza della dieta mediterranea nel favorire la qualità della salute e nella prevenzione di una serie di patologie è ormai largamente riconosciuta. Gli studi epidemiologici di Ancel Keys negli anni 50' e le indagini successive, mostrano come patologie cardiovascolari, arteriosclerosi e cancro del digerente abbiano un'incidenza più bassa nell'area mediterranea. Buona parte degli effetti salutari della dieta mediterranea può essere correlata all'uso dell'olio d'oliva quale principale fonte di grasso. Questo prodotto fondamentale dell'agricoltura mediterranea ha un indiscusso valore nutrizionale associato a caratteristiche organolettiche che ne hanno favorito l'uso come principe dei condimenti sin dall'antichità. Oltre ad essere dotato di un elevato rapporto tra acidi grassi saturi e insaturi, l'olio d'oliva è ricco di composti fenolici dotati di notevole potere antiossidante che, secondo numerosi studi, può essere messo in relazione con la riduzione dell'incidenza di arteriosclerosi e cancro. Questa caratteristica peculiare permette di annoverare a pieno titolo l'olio extra vergine tra gli alimenti funzionali.

L'importanza riconosciuta dei suoi effetti salutari rende l'olio extra vergine oggetto di notevoli attenzioni nei campi scientifico, nutrizionistico ed agroalimentare, e spinge nutrizionisti e produttori a promuoverne il consumo. Un aspetto fondamentale della produzione e commercializzazione di questo prodotto è la possibilità di garantire ai consumatori che si tratti di un alimento oltre che gustoso e dotato di caratteristiche salutari, anche sicuro.

Obiettivi dell'analisi Il lavoro descritto di seguito è stato finalizzato ad acquisire informazioni sulle sostanze, presenti a vario titolo nelle olive da tavola e nell'olio d'oliva, che possono alterare il corretto svolgimento delle funzioni digestive o peggiorare le caratteristiche bromatologiche dei prodotti. Durante le fasi della filiera di lavorazione delle olive sono presenti alcuni momenti critici quali: • trattamento con fitofarmaci • lavaggio delle olive • produzione e lavorazione delle paste durante la frangitura o la gramolatura • estrazione dell'olio nel corso dei quali è possibile che alcune sostanze estranee alla composizione normale dell'olio extravergine possano lasciare residui riscontrabili nel prodotto avviato al consumo alimentare. Si è inteso, pertanto, effettuare una ricognizione di tali sostanze ed ottenere una valutazione del loro effetto sulla funzione gastrica che rappresenta il primo processo del sistema digerente direttamente interessato dalla qualità degli alimenti. La prima fase dell'analisi, condotta nel periodo 2006/2007, è stata orientata a valutare l'impatto sulla funzionalità gastrica di alcuni tra gli agrofarmaci più comunemente utilizzati nell'olivicoltura.

n particolare, i test hanno riguardato gli effetti dei residui degli erbicidi Glifosato e Terbutilazina e degli insetticidi Carbaryl, Diazinone e Fenthion. L'analisi ha evidenziato che tutte le sostanze saggiate, in maniera minore o maggiore, alterano la funzionalitĂ gastrica. Fatta eccezione per l'insetticida Diazinone che sulla base dei risultati ottenuti sembra essere il meno nocivo, tutte le altre sostanze determinano principalmente una significativa riduzione della funzione secretoria con picchi di inibizione anche alle concentrazioni piĂš basse. L'erbicida Glifosato presenta in assoluto un potentissimo effetto tossico in quanto blocca completamente la secrezione acida. In questa seconda fase dell'analisi, condotta nel periodo 2007/2008, ci si Ă¨ occupati soprattutto dei fungicidi ed in particolare del SOLFATO DI RAME, quale elemento comune dei fungicidi cuprici, del DODINA e del PROCIMIDONE, quali fungicidi acuprici. A riguardo del procimidone, il cui impiego non trova riscontro tecnico in olivicoltura, l'analisi scaturisce dal frequente reperimento di tale agrofarmaci nell'olio quale conseguenza di contaminazione ambientale. Sono stati inoltre riportati in questo fascicolo i risultati dell'analisi relativa ad un ulteriore erbicida, la SIMAZINA, ad integrazione dei risultati ottenuti in precedenza. I risultati delle analisi e la loro divulgazione sono volti a fornire riferimenti utili per apportare opportune modifiche nel ciclo di produzione e trasformazione delle olive, finalizzando gli interventi atti ad evitare la presenza e/o la formazione di sostanze che possano peggiorare le caratteristiche bromatologiche dei prodotti e garantire un elevato livello di tutela dei consumatori con riguardo alla sicurezza alimentare.

Gli agrofarmaci Uno dei fattori critici nell'uso della maggior parte dei prodotti alimentari provenienti da coltura intensiva, e tra questi l'olio extravergine d'oliva, Ă¨ rappresentato dalla presenza di residui di agrofarmaci. Tali sostanze

tossiche dovrebbero essere completamente assenti, o presenti in livelli molto bassi. Il sovra dosaggio ed il mancato rispetto del tempo di carenza determina la presenza di livelli talvolta anche molto superiori a quelli considerati tollerabili per la salute. Per l'olio extravergine d'oliva più genuino, ottenuto direttamente dalla frangitura a freddo e senza ulteriori trattamenti chimici di depurazione, il problema si presenta particolarmente critico. Per agrofarmaci o prodotti fitosanitari s'intendono i preparati contenenti una o più sostanze attive destinate a: • proteggere i vegetali utili o i loro prodotti dagli organismi nocivi • favorire o regolare i processi vitali dei vegetali • eliminare le piante indesiderate • eliminare parti di vegetali, frenare o evitare un loro indesiderato accrescimento. Esistono, pertanto, molecole attive contro erbe infestanti (erbicidi), funghi patogeni (fungicidi), insetti (insetticidi) ed altri agenti infestanti. • Gli erbicidi sono fitofarmaci dotati presumibilmente di selettività, vale a dire capaci di manifestare i loro effetti tossici soltanto nei confronti delle malerbe, nelle quali agiscono interferendo sul metabolismo vegetale sfruttando le differenze fisiologiche e biochimiche esistenti tra le varie specie, con lo scopo di produrre esiti letali solo sulle infestanti. Alcuni erbicidi, ad esempio, sono specifici per le dicotiledoni, ossia le piante con seme doppio e genericamente con le foglie larghe. Altri erbicidi interessano le piante monocotiledoni, a singolo seme e con la foglia stretta. La differenza è basata sulla capacità di assorbire e detossificare il principio attivo che hanno le une ma non le altre. Alcuni principi attivi, come il glifosato, colpiscono indistintamente mono e dicotiledoni. La maggior parte degli erbicidi interferisce con il meccanismo della fotosintesi a vari livelli provocando la morte dei vegetali. Tali sostanze non agiscono sulle piante da frutto

perché la dimensione di tali vegetali permette l'inattivazione e la metabolizzazione della sostanza chimica prima che provochi danni, al contrario di quanto avviene nelle erbe infestanti di taglia piccola che soccombono. • I fungicidi o anticrittogamici sono utilizzati per prevenire o combattere i parassiti di origine vegetale (Crittogame o "Funghi"). I fungicidi agiscono principalmente in due maniere, ossia interagendo con la membrana cellulare o permeando nel micelio, nelle spore e nei conidi. Nella membrana i fungicidi denaturano le proteine strutturali ed enzimatiche della membrana alterandone la funzione. All'interno delle cellule, invece, i fungicidi interferiscono con la respirazione cellulare dei funghi impedendo alle cellule di produrre l'energia necessaria per svilupparsi attraverso. Questo meccanismo, tipico dei prodotti cuprici, produce il blocco della germinazione delle spore fungine. Alcuni anticrittogamici, come le dicarbossimidi, inducono il rigonfiamento e la distruzione del micelio. • Gli insetticidi più diffusi (organofosforici o carbammici) hanno azione neurotossica e agiscono sul sistema nervoso dell'insetto bersaglio disorganizzandolo e soprattutto inducendo paralisi muscolare con conseguenze letali. Nella maggior parte dei casi i fitofarmaci sono introdotti in un mezzo liquido nel quale si sciolgono o si sospendono o si emulsionano, costituendo rispettivamente una soluzione, una sospensione ed un'emulsione (per materiali oleosi). La forma più comune d'impiego è quella della sospensione, soprattutto a causa della sua maggiore persistenza. Nelle sospensioni ha grande importanza la velocità di sedimentazione, ovvero la capacità delle particelle di antiparassitario di rimanere a lungo sospese nel mezzo liquido in cui sono immerse; questa caratteristica è determinante per realizzare una uniforme distribuzione del principio attivo. Un'altra caratteristica importante per l'insetticida è la capacità del principio attivo di restare in superficie o penetrare nei tessuti vegetali per agire sulle diverse classi di infestanti.

A tale riguardo i fitofarmaci si possono definire: • citotropici: quando sono in grado di penetrare nei tessuti vegetali, rimanendo attivi nei tessuti adiacenti al punto di applicazione. • citotropici translaminari: riescono a spostarsi dalla pagina superiore a quella inferiore della foglia. • di copertura: quando agiscono per contatto superficiale creando una barriera protettiva contro gli infestanti • sistemici: quando vengono assorbiti dai tessuti, passando dalle foglie alle radici e viceversa, e difendono la pianta dall'interno. L'efficacia dei fitofarmaci è essenzialmente la risultante di due parametri caratteristici: la biodisponibilità e la tossicità intrinseca. • La biodisponibilità consiste nella capacità di un fitofarmaco di raggiungere il suo sito attivo dell'organismo bersaglio (pianta, fungo, insetto, ecc) ad una concentrazione sufficiente per sviluppare l'azione tossica. • La tossicità intrinseca riguarda la capacità del fitofarmaco di svolgere il suo effetto tossico tramite un meccanismo peculiare di ogni classe di composti ed in stretta relazione con l'organismo vegetale o animale bersaglio. In genere l'azione tossica consiste nell'interferenza con particolari funzioni del metabolismo cellulare; l'effetto risultante è la disorganicazione di tutte le funzioni biochimiche e fisiologiche collegate. L'inibizione anche di una sola funzione può, pertanto, alterare un intero processo metabolico con conseguenze letali per l'organismo bersaglio.

I residui degli agrofarmaci nei prodotti destinati al consumo alimentare umano Per residuo di un prodotto fitosanitario s'intende la quantità di sostanza che viene rilevata nei vegetali, nei prodotti trasformati, nei pro-

dotti animali destinati al consumo umano o nell'ambiente e che deriva dall'impiego di un prodotto fitosanitario. Prima della commercializzazione tutti i prodotti fitosanitari ed i relativi principi attivi devono essere verificati al fine di stabilire il "limite di tolleranza", cioè la quantità massima di residuo di fitofarmaco che può essere presente nel prodotto destinato al consumo, con particolare riferimento alle ripercussioni sulla salute umana; tale quantità è espressa in mg/Kg di prodotto ovvero in ppm, (parti per milione). I limiti di tolleranza sono stabiliti attraverso test condotti su animali da esperimento. Il grado di tossicità di un antiparassitario è definito mediante due parametri: • DL50, quantità di principio attivo in mg, rapportato al peso corporeo

in Kg, che provoca la morte del 50% della popolazione di cavie sottoposta a trattamento • NOAEL, livello di principio attivo che non produce effetti avversi osservabili Il limite di tolleranza è esattamente la dose massima giornaliera accettabile di sostanza tossica che può essere assunta dall'uomo, sempre in mg/Kg, senza rischio di danno e rappresenta un centesimo del NOAEL, cioè della dose massima che non determina l'insorgere di danni apprezzabili negli animali da esperimento, né a livello cellulare né tissutale. Nell'analisi della tossicità sono prese in considerazione anche le diverse modalità con le quali il veleno può venire a contatto con l'organismo e per ogni prodotto si conoscono, di norma, la tossicità orale (per ingestione), dermale e per inalazione. Oltre alla tossicità acuta, cioè all'effetto di una singola somministrazione, è valutata anche la tossicità cronica, vale a dire l'eventuale danno dovuto al sommarsi di più dosi nel tempo. In questo caso si analizzano effetti quali l'azione cancerogena ed i fenomeni di accumulo in particolari organi e tessuti. Sulla base della tossicità i fitofarmaci sono classificati in quattro classi: A) molto tossici, B) tossici, C) nocivi, D) non classificati o a rischio trascurabile.

Parallelamente all'analisi della tossicità sono valutati i tempi di degradazione degli antiparassitari nei vegetali e nell'ambiente. Stimare la quantità di residuo presente sulla pianta o sui frutti dopo un certo intervallo di tempo serve a stabilire la velocità di metabolizzazione o degradazione del fitofarmaco e quindi fissare il tempo minimo necessario affinché il prodotto sia da considerarsi non più pericoloso. La quantità massima accettabile di residuo rappresenta, come detto in precedenza, il limite di tolleranza, mentre il tempo intercorso tra il trattamento ed il raggiungimento del limite tollerato prende il nome in tempo di carenza. Si tratta dei parametri usati normalmente nella legislazione sugli antiparassitari. In materia di prodotti fitosanitari, il Ministero della Salute fissa, con proprio decreto, i limiti massimi di residuo delle sostanze attive contenute nei prodotti destinati all'alimentazione. Attualmente, i limiti massimi di residuo sono stabiliti dal D.M. 27 agosto 2004 e dai suoi aggiornamenti annuali che contengono le disposizioni comunitarie ed i provvedimenti nazionali in materia. I valori dei limiti massimi di residuo sono riportati nell'allegato 2. Per alcune sostanze è presente l'indicazione specifica del residuo per l'olio d'oliva, per altre solo quella per le olive. Nell'allegato 1 al D.M. le olive sono incluse nel gruppo f) Frutta varia. In mancanza di indicazioni specifiche, pertanto, si fa riferimento al valore di residuo indicato per tale gruppo di prodotti. Per la maggior parte degli agrofarmaci il residuo massimo consentito si attesta su valori che variano tra 0,02 e 3 mg/Kg. Per gli oli provenienti da coltura biologica, il limite massimo per tutte le sostanze è pari a 0,01 mg/Kg che, peraltro, rappresenta il valore più basso rilevabile con le comuni tecniche analitiche. Il residuo massimo consentito rappresenta, come detto in precedenza, un centesimo della quantità di fitofarmaco in grado di produrre effetti avversi apprezzabili negli animali da esperimento. Di conseguenza ci si dovrebbe attendere la mancanza di effetti su qualunque parte dell'organismo che possa venire a contatto con tali residui.

In realtĂ non ci sono molte informazioni a riguardo degli effetti che la maggior parte dei prodotti fitosanitari potrebbe avere sugli organi del sistema digerente. E' noto che molte delle sostanze assorbite nell'intestino raggiungono il fegato dove sono metabolizzate o accumulate, ma gli effetti prodotti dal contatto degli agrofarmaci con le superfici interne del sistema digerente sono poco conosciuti. Tra i vari organi del sistema digerente esposti all'azione di agenti tossici introdotti con gli alimenti sicuramente lo stomaco rappresenta uno dei principali. La ragione va ricercata nella modalitĂ di funzionamento di quest'organo cavo che assolve essenzialmente a due funzioni: â&#x20AC;˘ accumulare il cibo introdotto durante i pasti per poterlo poi far passare gradualmente nell'intestino per le fasi successive di digestione ed assorbimento dei nutrienti â&#x20AC;˘ produrre quantitativi rilevanti di succhi gastrici destinati a disgregare i cibi e ad iniziare la digestione degli alimenti. La capacitĂ dello stomaco di trattenere per alcune ore i cibi, soprattutto quelli solidi, comporta un contatto prolungato con le pareti dell'organo ed in particolare con la superficie ghiandolare destinata a produrre l'acido cloridrico, il principale componente del succo gastrico. Gli alimenti che contengono sostanze tossiche, pertanto, permanendo a lungo nello stomaco potrebbero provocare danni o alterazioni funzionali.

Gli agrofarmaci e la funzionalità gastrica Allo scopo di valutare se la presenza di residui di agrofarmaci negli alimenti, ed in particolare nell'olio extravergine di oliva, possa alterare la funzione gastrica, sono state condotti alcuni test su modelli sperimentali di stomaco esposti a varie concentrazioni di insetticidi o diserbanti utilizzati direttamente in olivicoltura o presenti a causa di un effetto deriva da altre colture (quali ad esempio vigneti e/o coltivazioni arboree) In particolare sono stati utilizzati gli anticrittogamici SOLFATO DI RAME, DODINA e PROCIMIDONE, e l'erbicida SIMAZINA.

Metodica di analisi Misure di funzionalità gastrica: Il modello sperimentale utilizzato per la valutazione degli effetti prodotti dall'esposizione acuta agli agrofarmaci è stato lo stomaco di anfibio (Rana esculenta) isolato e montato in un apposito dispositivo di misura. La rana, peraltro, è uno degli animali che vengono comunemente utilizzati per i test tossicologici di inquinamento ambientale. L'utilizzo di un organo isolato rispetto all'animale intero rappresenta una scelta dettata da motivazioni di carattere tecnico ed etico. Lo stomaco di mammifero quando viene isolato dall'animale da esperimento (topi, conigli) perde in brevissimo tempo la capacità di funzionare, al contrario di quello di anfibio che presenta la capacità di restare funzionale per diverse ore; in tal modo l'organo isolato permette di simulare esposizioni di durata paragonabile a quella di una normale digestione.

Per quanto concerne la trasferibilità dei risultati al mammifero esistono nella letteratura scientifica centinaia di studi che hanno evidenziato la similarità funzionale tra lo stomaco delle due specie. La funzionalità gastrica è stata valutata mediante il rilevamento di alcuni parametri bioelettrici e mediante la misura della secrezione acida effettuata utilizzando una autoburetta automatica ed applicando il metodo del pH stazionario. Il sistema permette di valutare quantitativamente l'entità della secrezione acida del campione di tessuto gastrico aggiungendo opportuni volumi di alcali che neutralizzano l'acido prodotto dalle ghiandole gastriche e riportano il sistema al pH di partenza. Questo apparato permette di condurre i test in condizioni controllate e riproducibili.

Schema funzionale del sistema di misura utilizzato per la valutazione dei parametri bioelettrici e della secrezione acida nei campioni di stomaco esposti a diverse concentrazioni di agrofarmaci. Il frammento di stomaco (epitelio) separa due vaschette (camera di Ussing) contenenti soluzione fisiologica. Una simula la composizione del sangue e l'altra quella del contenuto gastrico. Protocolli: L'effetto degli agrofarmaci sui parametri funzionali della mucosa gastrica è stato valutato utilizzando le sostanze in concentrazioni stabilite in base ad una valutazione del possibile grado di diluizione che si potrebbe determinare durante un pasto, stimando che il volume

totale del cibo, sommato alle secrezioni gastriche, raggiunga mediamente i 3 litri. La scelta degli agrofarmaci da esaminare e stata effettuata tenendo presenti quali sostanze sono utilizzate con maggiore frequenza il olivicoltura o quelle la cui presenza residuale Ă¨ rilevata frequentemente nell'olio anche in assenza di trattamenti specifici. Le concentrazioni utilizzare nei test sono state stabilite in base ai limiti massimi consentiti riportati nel Decreto Ministeriale del 27 agosto 2004, o in base a considerazioni riportate di volta in volta in maniera specifica. Analisi statistica: I dati sono espressi come media Âą errore standard delle misure condotte su n tessuti. La significativitĂ statistica dei risultati Ă¨ stata determinata con il test del t di Student per dati appaiati tra i valori rilevati in condizioni di controllo al tempo t = 0 e quelli rilevati durante l'esposizione agli agrofarmaci, considerando valori di p â&#x2030;¤ 0.05 come indicativi di differenza significativa di tra le medie.

RISULTATI

SOLFATO RAMEICO (CuSO4)

Il solfato rameico è il composto principale degli anticrittogamici a base di rame, detti cuprici o rameici, genericamente noti come verderame. Il solfato rameico è il sale puro che, essendo tossico per le piante, deve essere preventivamente neutralizzato con l'idrossido di calcio (Ca(OH)2). Comunemente viene utilizzata una miscela, la poltiglia bordolese, contenente oltre al solfato rameico l'idrossido di rame (3Cu(OH)2) ed il solfato di calcio (3CaSO4). Altri composti cuprici ad azione anticrittogamica sono gli ossicloruri di rame, composti da combinazioni idrate di ossido rameico (CuO) e un cloruro di rame o di calcio. Rispetto al solfato gli ossicloruri sono meno tossici per le piante. Il rame agisce sulle crittogame per contatto fogliare come ione rameico in grado di penetrare nella membrana semipermeabile e nella parete chitinosa dei funghi, in particolare delle loro spore e conidi. Essi vanno così a sostituire alcuni cationi della parete chitinosa (idrogeno, calcio, magnesio) e denaturano le proteine strutturali ed enzimatiche della membrana cellulare. L'effetto fungicida del rame è anche dovuto alla sua interferenza con la respirazione cellulare dei funghi interferendo con la formazione dell'acetil coenzima A e quindi con il Ciclo di Krebs. In altri termini il rame impedisce alle cellule di produrre l'energia necessaria per svilupparsi impedendo la germinazione di spore e conidi; quindi il suo meccanismo d'azione è più che altro preventivo. I composti rameici in olivicoltura sono usati particolarmente contro l'occhio di pavone e la rogna dell'olivo. I prodotti a base di rame sono indicati soprattutto dopo la slupatura e la potatura in quanto proteggono il legno vivo messo a nudo e le ferite prodotte con la potatura. I prodotti cuprici genralmente hanno un tempo di carenza di almeno 20 giorni.

L'impiego di questo fungicida Ă¨ consentito anche in agricoltura biologica nel limite massimo di 6 kg di rame per ettaro per anno. La DL50 orale del solfato rameico per i mammiferi Ă¨ di 1 g/Kg. Il D.M. del 27 agosto 2004 non indica un limite massimo consentito per le olive e per l'olio, in questa analisi ci siamo riferiti al valore 20 mg/Kg indicato per frutta e ortaggi. I test sono stati condotti su 19 tessuti utilizzando le concentrazioni di: 20 ng/l - corrispondente al limite massimo ministeriale 2 ng/l - valore ridotto al 10% rispetto a quello massimo consentito 200 ng/l - pari a 10 volte il limite massimo ministeriale

I risultati hanno evidenziato che a tutte le concentrazioni utilizzate il SOLFATO RAMEICO riduce significativamente la secrezione acida entro mediamente del 50 %. Sebbene dal punto di vista tossicologico il rame ed i suoi composti non siano considerati particolarmente tossici, tanto Ă¨ che sono consentiti nell'agricoltura biologica, l'effetto inibitorio sulla funzione gastrica, osservato anche a concentrazioni molto basse, suggerisce la necessitĂ di un accurato lavaggio delle olive sia per il loro uso da tavola che per la produzione di olio. Lupa da infezione fungina (Fomes sp., Polyporus sp.)

DODINA (acetato di 1-dodecilguanidina)

E' un fungicida alifatico con caratteristiche citotropiche, in altri termini la sostanza penetra nelle foglie e previene lo sviluppo del fungo. Sul micelio, l'attività fungitossica è presumibilmente associata alla capacità della lunga catena carboniosa laterale lipofila di alterare la funzionalità della membrana fosfolipidica, nella quale la catena stessa si inserisce. Sulle spore fungine, invece, il dodina inibisce gli enzimi amino- e solfidril- dipendenti. La selettività è legata alla differente velocità di assorbimento della dodina da parte delle spore fungine. Il dodina è commercializzato come sale monoacetato ed utilizzato soprattutto per la difesa di olivo, alberi da frutto e ortaggi. Nell'olivo controlla in particolar modo l'infezione da cicloconio o "occhio di pavone" (Spilocaea oleagina). La permanenza nel suolo di questo fungicida è di qualche mese, con un tempo di dimezzamento pari a 10 giorni che rappresenta il tempo di carenza consigliato. Il dodina può costituire un elemento di inquinamento della falda acquifera. Dal punto di vista tossicologico il dodina può causare gravi irritazioni agli occhi, sebbene sia riportato che l'intossicazione per inalazione o ingestione non presenta particolari rischi e non produce reazioni irritanti sulla pelle. La DL50 per ingestione nei mammiferi è di 1 g/kg. Limite massimo consentito dal D.M. del 27 agosto 2004: 1 mg/kg (drupacee) I test sono stati condotti su 13 tessuti utilizzando le concentrazioni di: 10 ng/l - corrispondente al limite massimo ministeriale

1 ng/l - valore ridotto di 10 volte rispetto a quello massimo consentito 100 ng/l - pari a 10 volte il limite massimo ministeriale

I risultati hanno evidenziato che l'esposizione al DODINA induce la riduzione della secrezione acida a tutte le concentrazioni saggiate ma tale riduzione Ă¨ statisticamente rilevante solo alla concentrazione piĂš elevata. Questi risultati indicano che gli effetti di questo anticrittogamico pur essendo non particolarmente rilevanti non sono trascurabili ed il suo uso dovrebbe essere ridotto per Infezione da "occhio di pavone" (Cycloconium oleaginum o Spilocaea oleagina) quanto possibile.

PROCIMIDONE (N-(3,5-diclorofenil)-1,2-dimetilciclopropano-1,2-dicarbossimide)

Il procimidone è un fungicida organoclorurato sistemico appartenente alla classe dei dicarbossimidi, in grado di attaccare il micelio fungino e resistere all'azione degli agenti atmosferici. Come per altri anticrittogamici organici sistemici il procimidone è dotato di una spiccata specificità di azione dovuta essenzialmente alla elezione del sito bersaglio che gli permette di attaccare gli agenti patogeni insediatisi nei tessuti vegetali senza influenzare il metabolismo della pianta ospite. Le dicarbossimidi interferiscono con la risposta allo stress osmotico dei funghi stimolando la sintesi di glicerolo che induce un rigonfiamento incontrollato e la distruzione del micelio. Nel terreno il procimidone persiste persiste per parecchie settimane in relazione alla composizione del suolo e rappresenta un pericolo di contaminazione delle falde acquifere. Il procimidone è un prodotto antiperonosporico particolarmente indicato per le infezioni fungine della vite, dell'actinidia e di numerosi alberi da frutta e ortaggi ma il cui utilizzo è vietato sull'olivo. Nell'ultimi anni, tuttavia, è stata frequentemente rilevata la presenza ingiustificata di questo anticrittogamico nell'olio extra vergine di oliva in misura tale da non poter ricevere la certificazione. Tale presenza, dovuta soprattutto al fenomeno di deriva nel caso in cui le piante di olivo sono localizzate vicino a vigneti, determina non solo il declassamento dell'olio da agricoltura biologica a convenzionale, ma non risulta commestibile perché inquinato da un principio attivo il cui utilizzo non è consentito sull'olivo. La normativa non fissa il limite massimo dei residui di procimidone specifico per olive e per l'olio di oliva, pertanto per le olive vale il limite

di 0.01 mg/kg stabilito dall'art. 4 comma 7 del D.M. 27 agosto 2004, applicabile nel caso in cui la sostanza attiva non è autorizzata sulla coltura. Per calcolare il limite nell'olio di oliva occorre considerare l'eventuale diluizione o concentrazione secondo quanto previsto dall'art. 4 comma 9 del suddetto decreto. La resa della produzione di olio può essere stimata al 20% ovvero da 5 kg di olive si ottiene 1 kg di olio di oliva. Considerando la solubilità del procimidone in olio, molto superiore a quella in acqua, si può dire che la totalità del procimidone si concentra nell'olio di oliva. Sulla base di queste considerazioni il limite massimo consentito nell'olio d'oliva sarebbe pari a 0.05 mg/kg. La DL50 per ingestione negli animali è abbastanza elevata, mediamente paria a 7 mg/kg. VA notato, tuttavia che questo fitofarmaco negli anuimali ha effetti cancerogeni procurando problemi riproduttivi. Fortunatamente è rapidamente metabolizzato ed escreto con le urine e feci. I test sono stati condotti su 15 tessuti utilizzando le concentrazioni di: 1 ng/l - valore corrispondente a quello massimo consentito per le olive 10 ng/l - corrispondente al doppio del limite massimo per l'olio 100 ng/l - pari a 50 volte il limite massimo per l'olio

I risultati hanno evidenziato che il PROCIMIDONE produce effetti molto simili a tutte le concentrazioni utilizzate. Il primo effetto consiste nella riduzione della secrezione acida, mediamente del 22%, entro i

primi 60 minuti di applicazione. Tale riduzione, tuttavia, è temporanea perché nelle due ore successive la secrezione acida torna prima ai valori normali e poi subisce un incremento medio del 20%. L'effetto di questo fungicida sulla secrezione acida è di difficile interpretazione soprattutto perché le variazioni osservate sebbene evidenti oltre ad essere bipolari non sono significative dal punto di vista statistico. Sulla base di questi risultati, tuttavia, si può escludere che il PROCIMIDONE abbia effetti notevolmente dannosi sulla funzione gastrica e riteniamo, pertanto, che la sua presenza come residuo nell'olio d'oliva non costituisce un reale problema per la salute dei consumatori.

SIMAZINA (2-cloro-4,6-bis(etilamino)-s-triazina)

Si tratta di un erbicida clorotriazinico appartenente alla classe delle clorotriazine usate in pre-emergenza nelle colture di agrumi, vite, olivo ecc. La simazina agisce inibendo la fotosintesi mediante il blocco del trasferimento di elettroni nel cloroplasto ciò induce un'ossidazione che si conclude con la distruzione della clorofilla. Agisce sulle infestanti dicotiledoni e monocotiledoni per assorbimento radicale, pertanto l'erbicida viene distribuito sul terreno, dove rimane negli strati superficiali, essendo poco idrosolubile, questo permette una sua piena utilizzazione senza rischio per la coltura. Ha una notevole attività residua poiché ha un tempo di dimezzamento di 30 - 180 giorni e resiste per circa un anno alla degradazione. La simazina non è particolarmente tossico per l'uomo e gli animali in genere. I danni sono causati principalmente dall'utilizzo di una quantità troppo elevata di prodotto a livello delle radici, in seguito ad un dosaggio non appropriato al tipo di suolo. In Italia, a livello locale, ci sono delle notevoli restrizioni per l'uso della simazina e in molti comuni non l'uso non è più consentito dagli anni '90. Tale sostanza, peraltro, è spesso rilevata nell'olio d'oliva in concentrazioni superiori al limite consentito per la certificazione di biologico. La DL50 orale per i mammiferi è di 5 g/kg. Limite massimo consentito dal D.M. del 27 agosto 2004: 0,1 mg/kg (nelle olive) Considerando una resa della produzione di olio può pari al 20% il limite massimo consentito nell'olio d'oliva sarebbe pari a 0,5 mg/kg. I test sono stati condotti su 13 tessuti utilizzando le concentrazioni di:

5 ng/l - valore corrispondente al limite massimo stimato per l'olio d'oliva 0,5 ng/l - valore ridotto di 10 volte rispetto a quello massimo consentito 50 ng/l - valore pari a 10 volte il limite massimo

I risultati hanno evidenziato che la SIMAZINA mostra degli effetti che si differenziano da quelli rilevati per la terbutilazina e per il glifosato. Mentre questi ultimi determinano una significativa inibizione della funzione gastrica, la SIMAZINA mostra un lieve effetto stimolante transitorio. Nel corso delle prime due ore dalla somministrazione la secrezione appare stimolata mediamente del 30% a tutte le concentrazioni saggiate. Successivamente l'effetto decresce. Sulla base a queste osservazioni non Ă¨ possibile definire la presenza di un chiaro effetto dannoso, tuttavia appare evidente che il tessuto gastrico Ă¨ sensibile alla SIMAZINA e che gli effetti dell'erbicida richiedono ulteriori approfondimenti.

Conclusioni L'analisi degli effetti di sostanze estranee eventualmente presenti nell'olio extravergine d'oliva sul sistema digerente, ed in particolare sulla funzionalità gastrica, continua in questa fase con la valutazione dell'azione di alcuni fungicidi e di un ulteriore erbicida, comunemente utilizzati nel trattamento delle infezioni fungine e nel limitare le erbe infestanti nell'uliveto. La valutazione degli effetti degli agrofarmaci è stata condotta mediante l'esposizione topica di un modello sperimentale di mucosa gastrica a concentrazioni che riproducono l'assunzione di fitofarmaci eventualmente presenti come residui sulle olive da tavola o nell'olio d'oliva. I risultati dell'analisi hanno evidenziato che tutte le sostanze, in maniera minore o maggiore, influenzano la funzionalità gastrica, quando sono utilizzate in maniera tale che i loro residui raggiungano livelli pari, superiori o inferiori ai livelli massimi consentiti dalla normativa. INDICAZIONI PER I FUNGICIDI Nel test di questa analisi sono stati inclusi tre fungicidi dei quali due ampiamente utilizzati in olivicoltura, il SOLFATO RAMEICO ed il DODINA, ed uno il cui uso non è previsto in olivicoltura: il PROCIMIDONE. Quest'ultimo da qualche anno rappresenta un problema per gli olivicoltori in quanto la presenza di residui di questo anticrittogamico rendono l'olio non commerciabile. Per quanto concerne i nostri test con il SOLFATO RAMEICO i risultati hanno evidenziato che a tutte le concentrazioni utilizzate questo fungicida riduce significativamente la secrezione acida. Sebbene i derivati del rame non siano composti particolarmente tossici l'effetto inibitorio sulla funzione gastrica, osservato anche a concentrazioni molto basse, suggerisce la necessità di trattamenti che riducano al minimo la presenza di residui sia sulle olive per uso da tavola sia su quelle usate per la produzione di olio. Le prove con il DODINA hanno messo in evidenza la presenza di un

effetto significativamente inibitorio sulla secrezione acida, ma solo alla concentrazione più elevata che corrisponde a 10 volte il residuo massimo consentito. Alla luce di questo risultato è evidente che i trattamenti con questo anticrittogamico devono essere fatti in maniera tale da rispettare i tempi di carenza e non superare i limiti consentiti. Il risultati ottenuti con il PROCIMIDONE sono notevolmente positivi nell'ottica che potrebbe portare a non considerare critica la presenza di residui minimi di questo fungicida, il cui uso non è attualmente consentito in olivicoltura. L'effetto bipolare, transiente e non statisticamente significativo suggerisce che il PROCIMIDONE probabilmente non ha effetti notevolmente dannosi sulla funzione gastrica e riteniamo, pertanto, che la sua presenza come residuo nell'olio d'oliva non costituisce un reale problema per la salute dei consumatori.

INDICAZIONI PER GLI ERBICIDI Normalmente gli erbicidi sono considerate sostanze dotate di tossicità moderata per i mammiferi, a causa della loro DL50 compresa tra 600 e 10000 mg/kg, sebbene alcuni di essi siano in grado di indurre la formazione di tumori. Per quanto concerne i nostri test, ricordiamo che nell'analisi condotta nel 2006/2007 avevamo osservato che il GLIFOSATO riduce in maniera notevolmente efficiente la secrezione gastrica fino a bloccarla completamente quando la sua concentrazione nell'olio e pari o superiore al massimo consentito dalla normativa. Tale potente effetto inibitorio suggerisce un uso limitato di questo erbicida o la sostituzione con prodotti analoghi. La TERBUTILAZINA appare meno tossica del GLIFOSATO ma la sua pericolosità è sempre elevata e giustifica il fatto che il suo utilizzo, come quello di altri erbicidi triazinici, non sia consentito.

Per quanto concerne la SIMAZINA, i test hanno messo in evidenza degli effetti che si differenziano da quelli rilevati per la terbutilazina e per

il glifosato. A differenza di questi erbicidi la SIMAZINA mostra un lieve effetto stimolante e transitorio sulla funzionalità gastrica, seguito da un ritorno alla funzionalità normale e da una successiva lieve inibizione. Sulla base a queste osservazioni non è possibile definire la presenza di un chiaro effetto dannoso, tuttavia appare evidente che il tessuto gastrico è sensibile alla SIMAZINA e che gli effetti dell'erbicida richiedono ulteriori approfondimenti.

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