Bài giảng 1

Sàng lọc và đánh giá hoạt tính dược liệu Nội dung:

MECHANISM OF ACTION

DRUG DISCOVERY BIO SCREENING

Chương I: Giới thiệu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Chương II: Sinh tổng hợp các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Chương III: Sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất thiên nhiên Chương IV: Nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính sinh học

Chương III: Sàng lọc hoạt sinh sinh học Mục tiêu Chương: Chương này giới thiệu về các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học chính và các chất ức chế enzym và thụ quan.

Các khái niệm tích lũy trong Chương • Con đường phát triển một thuốc mới từ nguồn thiên nhiên • Phân loại các thử nghiệm sinh học • Thử nghiệm tế bào • Vai trò của enzym và các chất ức chế enzym • Vai trò của thụ quan và các chất ức chế thụ quan • Thử nghiệm biểu hiện gien.

Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học (Bioactive Compound Screening) Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học sử dụng một phép thử sinh học đã được thiết lập để thử nghiệm các phần chiết hoặc các phân đoạn có hoạt tính sinh học để phân lập các hoạt chất quyết định cho tác dụng sinh học này.

• Các thử nghiệm sàng lọc phần lớn được thực hiện trên tế bào, các enzym được phân lập, hoặc các thụ quan được nhân dòng.

•

Sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

F. E. Koehn and G. T. Carter; Nature 2005, 4, 206-220

Phương pháp sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học • Phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học (bioassayguided fractionation) các dịch chiết có hoạt tính sinh học.

• Thử nghiệm hiện đại, nhanh và trực tiếp online - sàng lọc sinh học hiệu năng cao (high-throuput biological screening) các hợp chất sinh học.

Thư viện mẫu hợp chất thiên nhiên

• Thư viện mẫu chiết thô

• Thư viện mẫu chiết được phân tách

• Thư viện mẫu sạch

Phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học Với thử nghiệm sinh học truyền thống, con đường duy nhất để xác định hoạt chất sinh học trong một phần hỗn hợp được chiết và phân tách là phân lập định hướng hoạt tính sinh học liên tục đến khi hợp chất được tinh chế cho nhận dạng.

Frank E. Koehn & Guy T. Carter, Nature Reviews Drug Discovery 4, 206-220 (2005)

Phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học

Ví dụ mimh họa

Sàng lọc hiệu năng cao (HTS)

Mục đích của HTS là tăng tốc độ phát hiện thuốc bằng cách sàng lọc các thư viện lớn thường chứa hàng trăm nghìn hợp chất ở tốc độ có thể đến 20.000 hợp chất một tuần. So với các thử nghiệm truyền thống trong các phòng thí nghiệm, sử dụng robot, máy tính với các phần mềm kiểm tra và xử lý số liệu nhanh, các dụng cụ sử dụng chất lỏng và các detector nhạy, HTS cho phép thực hiện đồng thời hàng nghìn thậm chí hàng triệu thử nghiệm hóa sinh, gien hoặc dược lý.

Jason W. Armstrong, Combinatorial Chemistry Review (1999)

Sàng lọc hiệu năng cao (HTS)

Sàng lọc các hợp chất thiên nhiên Ưu thế: Hợp chất thiên nhiên có cấu trúc đặc quyền cho tương tác với các đích sinh học.

Thách thức: • Nguồn các hợp chất thiên nhiên • Giá thành và Thời gian tạo thư viện mẫu và tối ưu hóa chất dẫn đường.

Chiến lược phát triển: • Tạo các thư viện mẫu hóa tổ hợp: tổng hợp toàn phần, tổng hợp các chất tương tự, tổng hợp dựa trên khuôn hợp chất thiên nhiên, các thư viện chất dựa trên tính toán…

• Tạo các thư viện mẫu tổng hợp định hướng đa dạng (DOS – diversity oriented synthesis) tương thích với sàng lọc hiệu năng cao (HTS).

Thư viện mẫu hợp chất thiên nhiên Crude Library x Minor metabolites may go undetected x False positives

Pure Library – 1700 compounds Address many of the disadvantages of other natural product libraries  Easier to identify hit

Thử nghiệm sinh học cho sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học và đánh giá chức năng thuốc thảo dược Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học và đánh giá chức năng thuốc thảo dược là hai khái niệm khác nhau.

Phương pháp: Các thử nghiệm sinh học và dược lý - Nghiên cứu phát triển thuốc mới.

- Phân lập các hoạt chất sinh học từ các dịch chiết.

- Phát hiện các hoạt chất đơn.

- Chấm dứt nếu nhận được kết quả âm tính.

- Giải thích vì sao thuốc thảo dược có tác dụng điều trị.

- Nghiên cứu một thuốc thảo dược nhiều thành phần.

- Tiếp tục các thử nghiệm hoạt tinh theo cơ chế khác nếu nhận được kết quả âm tính.

Cơ chế tác dụng của thuốc dược thảo Hai yếu tố ảnh hưởng đến sự mở rộng các sản phẩm thương mại từ dịch chiết dược thảo trên thị trường quốc tế 1) Không có sự liên hệ tốt giữa các mô tả các chức năng cổ truyền và các cơ chế tác dụng và dược lý học hiện đại 2) Sự thiếu kiểm tra chất lượng của nguyên liệu thô và qui trình sản xuất của dịch chiết thảo dược, dẫn đến chất lượng không đồng nhất giữa các mẻ khác nhau và sự kiểm soát yếu đối với các chất gây bẩn độc.

Cơ chế tác dụng của thuốc thảo dược (Functional evaluation of Herbal Medicine) Thuốc thảo dược: các bộ phận của thực vật như hạt, trái cây, lá, hoa và vỏ được sử dụng cho các mục đích y học.

1) Phần lớn các thuốc cổ truyền đã được sử dụng thực hành trong dân gian một thời gian dài; do đó, các tác dụng điều trị và tác dụng phụ đã được các thầy thuốc cổ truyền biết đến.

2) Các cơ chế của chúng cần được đánh giá bằng dược lý và sinh học hiện đại.

3) Rất ít thuốc thảo dược được chứng tỏ hiệu quả và sự an toàn qua các nghiên cứu độc tính và lâm sàng được kiểm soát tốt và thử mù kép (double blind).

4) Phần lớn thuốc thảo dược có dải rộng các ứng dụng điều trị.

Chúng thường hoạt động đồng thời lên các mục tiêu khác nhau trong cơ thể, nhưng cho hiệu quả chậm hơn các thuốc hiện đại.

Cơ chế tác dụng của thuốc thảo dược Các vấn đề chính: 5) Hiếm gặp các tác dụng phụ không mong muốn của thảo dược, nhưng các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên được kiểm tra tốt cho thấy là chúng có tồn tại.

6) Các dịch chiết thảo dược chứa nhiều hợp chất hóa học và các thành phần hoạt chất thường chưa được biết.

7) Sự chuẩn hóa, độ ổn định, và kiểm tra chất lượng của thuốc thảo dược có thể thực hiện được, nhưng khó hơn vì sự phức tạp thành phần hóa học của chúng.

8) Sự sẵn có và chất lượng nguyên liệu thô cho thử nghiệm dược lý đôi khi là vấn đề vì các loài mọc ở các vùng khác nhau hoặc được thu thập vào các thời điểm khác nhau có thể biến đổi đáng kể về nồng độ chất và thành phần hóa học vì chúng khác biệt nhau về môi trường và mùa.

Cơ chế tác dụng của thuốc thảo dược • Nghiên cứu cơ chế tác dụng của một thuốc thảo dược là sử dụng các phương pháp sinh học và dược lý khác nhau in vivo, in vitro hoặc đôi khi là in situ để giải thích vì sao vì sao một thảo dược có tác dụng điều trị đã biết.

• Nhiều thuốc thảo dược có các chức năng bảo vệ và điều trị khác nhau vì cây thuốc thường có chứa một vài dạng chất có các tính chất dược lý với các cơ chế tác dụng khác nhau.

Do đó, đánh giá chức năng của thảo dược cần có một vài dạng thử nghiệm cơ chế khác nhau. Với thử nghiệm vi chíp (microarray) một mẫu có thể được thử đồng thời trên nhiều thụ quan và enzym điều này làm tăng nhanh đáng kể tốc độ nghiên cứu cơ chế của các cây thuốc.

Ví dụ minh họa: Hoạt tính estrogen của Actaea racemosa L. (Ranunculaceae) • Khi nghiên cứu các thảo dược được sử dụng cho triệu chứng mãn kinh, hoạt tính estrogen (hoạt tính gây tác động lên hocmon estrogen) được thử nghiệm đầu tiên.

• Actaea racemosa (trước kia được biết đến là Cimicifuga racemosa) được dân gian thường sử dụng, không cho bất kỳ hoạt tính dương tính nào trong các thử nghiệm sử dụng các thụ quan estrogen (ER).

• Nhưng phần chiết lại có thể liên kết mạnh với các thụ quan serotonin 5-HT1 và 5-HT7, cho thấy nó tác dụng qua sự điều chỉnh hệ thần kinh trung ương.

Cimicifuga racemosa

estrogen receptor

serotonin

Thử nghiệm hoạt tính sinh học Thử nghiệm các hợp chất có hoạt tính sinh học là phương pháp chính để phát hiện các thuốc mới trong các hãng dược.

Thử nghiệm sinh học: Thử nghiệm sinh học có thể được định nghĩa là các thử nghiệm được sử dụng để phát hiện các hoạt tính sinh học của một phần chiết, hoặc của một chất sinh học nhận được từ một sinh vật sống hoặc được tổng hợp cần thiết cho việc phát triển một thuốc mới.

Các thử nghiệm dược 1) Các thử nghiệm chống ung thư 2) Các thử nghiệm chống virus 3) Các thử nghiệm chống lao 4) Các thử nghiệm chống viêm 5) Các thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa 6) Các thử nghiệm chống sốt rét 7) Các thử nghiệm độc tính gan và bảo vệ gan 8) Các thử nghiệm điều chỉnh miễn dịch 9) Các thử nghiệm bệnh Alzheimer 10) Các thử nghiệm liên quan đến bệnh Parkinson và bệnh Graves

Các thử nghiệm dược 8) Các thử nghiệm chống đông máu 9) Các thử nghiệm chống loãng xương 10) Các thử nghiệm liên quan đến ngẽn mạch (cục huyết khối) 11) Các thử nghiệm giảm đau 12) Các thử nghiệm động kinh 13) Các thử nghiệm tiểu đường 14) Các thử nghiệm độc tố từ các vi sinh vật 15) Các thử nghiệm độc tính cho hóa chất 16) Các thử nghiệm estrogen 17) Các thử nghiệm liên quan đến huyết áp 18) Các thử nghiệm enzym và thụ quan di truyền tế bào.

Thử nghiệm sinh học Thử nghiệm in vitro: Các kỹ thuật này sử dụng một sự nuôi cấy tế bào của một hệ sinh học để nghiên cứu tác dụng của hợp chất dưới điều kiện tiêu chuẩn không giống như của môi trường sống. Sự nuôi cấy tế bào tồn tại do sử dụng dinh dưỡng trong môi trường.

Ví dụ, sử dụng các tế bào gốc, nuôi cấy tế bào, các vi khuẩn ...

Thử nghiệm in vivo: Các kỹ thuật này sử dụng một động vật sống được cho phép sử dụng cho mục đích thử nghiệm. Các kỹ thuật này có mục đích nghiên cứu tác dụng sinh học hoặc sự đáp ứng của hợp chất trong một hệ sống. Ví dụ, chuột, thỏ, mèo, chó ... thường được sử dụng trong các thử nghiệm dược lý.

Thử nghiệm sinh học in vitro và in vivo Thử nghiệm in vitro: - Ưu điểm: nhanh, cần lượng mẫu nhỏ, có thể thực hiện các thử nghiệm lặp lại.

- Nhược điểm: hoạt tính có thể bị mất trong thử nghiệm in vivo do một cơ chế khác với cơ chế được thử nghiệm – chất chuyển hóa có thể có hoạt tính hơn là các chất có ban đầu trong các dịch chiết hoặc phân đoạn.

Thử nghiệm in vivo: - Ưu điểm: các kết quả thích hợp nhất với điều kiện lâm sàng, các tác dụng phụ thường được thể hiện.

- Nhược điểm: giá thành cao, thiếu chỉ định cho cơ chế tác dụng của hoạt chất, khó sử dụng trong phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học, cần các thiết kế cẩn thận và phân tích xử lý số liệu phù hợp các kết quả.

Thử nghiệm lâm sàng • Các thử nghiệm trên động vật (in vivo) và thử nghiệm lâm sàng được sử dụng cơ bản để nghiên cứu hiệu quả và độc tính của các chất đã được chứng tỏ là có hoạt tính bằng các thử nghiệm sàng lọc in vitro.

• Thử nghiệm lâm sàng là các nghiên cứu y sinh hoặc hành vi trên con người được thiết kế để trả lời các câu hỏi cụ thể về sự can thiệp y sinh hoặc hành vi (các vaccin, thuốc, điều trị, thực phẩm chức năng mới hoặc các cách mới để sử dụng các sáng chế cũ), tạo ra các dữ liệu về an toàn và hiệu lực.

Các pha của thử nghiệm lâm sàng

Pha I: Các nhà nghiên cứu thử nghiệm một thuốc mới lần đầu tiên trong một nhóm người nhỏ để đánh giá độ an toàn, xác định một khoảng liều an toàn, và nhận dạng các tác dụng phụ.

Pha II: Sự điều trị thuốc được tiếp nhận cho một nhóm người lớn hơn để xem nó có hiệu quả không và đánh giá tiếp sự an toàn.

Pha III: Sự điều trị thuốc được tiếp nhận cho một nhóm người lớn hơn để khẳng định hiệu quả, điều chỉnh các tác dụng phụ, so sánh nó với các điều trị được sử dụng thông thường, và thu thập thông tin cho phép thuốc hoặc điều trị được sử dụng an toàn.

Pha IV: Các nghiên cứu được thực hiện sau thuốc hoặc điều trị được thương mại hóa để thu thập thông tin về tác dụng của thuốc trong người dân và bất kỳ tác dụng phụ liên quan với việc sử dụng dài hạn.

Phát triển thuốc mới và thương mại hóa sản phẩm 335 467 95

10 000 Compounds

?

1 FDA approved drug

Thử nghiệm lâm sàng VergegenTM • WHO: khoảng 4 tỷ người trên thế giới được điều trị bằng các thuốc từ thực vật.

• 6/2004, Hướng dẫn cho Công nghiệp cho sản phẩm thuốc thực vật (Guidance for Industry-Botanical Drug Products) được công bố bởi FDA. •5/11/2005, MediGen AG từ bỏ tự nguyện các thử nghiệm lâm sang giai đoạn I và II chỉ một năm sau khi có sự thực thi Guidance và đăng ký trực tiếp cho thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III của thuốc Vergegen để điều trị Condyloma acuminate ở Hoa Kỳ và các nước khác.

•2006: FDA chấp nhận thuốc mỡ VergegenTM là thuốc thực vật đầu tiên cho kê đơn được chấp nhận ở Hoa Kỳ.

• Đó là lần đầu tiên FDA chấp nhận một thuốc từ thực vật nhiều thành phần trong gần như nửa thế kỷ.

Im Jahr 2001 wurde die Firma Medi-Gen Technology Ltd. mit dem Ziel gegründet, den Menschen zu helfen, die Verantwortung für ihre Gesundheit selbst zu übernehmen.