Lựa chọn công nghệ nào? 2
MỞ ĐẦU • Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật tách chất và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu từ đa lượng đến vi lượng mà sắc ký cổ điển không đáp ứng được • Ngày nay, kết hợp với một số các phương pháp sắc ký hiện đại khác như sắc ký khí, điện di, điện. Sự phát triển và ứng dụng của kỹ thuật phân tích hiện đại đã đi vào nhiều lĩnh vực trong cuộc sống: Công nghiệp, môi trường, vệ sinh an toàn thực phẩm, sinh học, hình sự,..đặc biệt là trong Y – Dược học. • Cơ sở của sắc ký lỏng cao áp HPLC dựa trên sự tương tác của các thành phần chất phân tích, pha tĩnh và pha động
Nội dung 1 2 3
Nguyên tắc – Phân loại Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 4
Các thông số đặc trưng
4
Kỹ thuật sắc ký HPLC
5
Tối ưu hóa quá trình sắc ký
6
Ứng dụng sắc ký HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Nguyên tắc – phân loại
5
1. Nguyên tắc – Phân loại 1.1. Nguyên tắc * HPLC là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột ( pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách. * Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan bị lưu giữ ít. Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký.
F lo w o f M o b ile P h a s e
I n je c to r
D e te c to r
T= 0
T= 10’
T= 20’
M ost
I n t e r a c t io n w it h S t a t io n a r y P h a s e
Least
Các chất được tách ra với thời gian lưu tương ứng
CHẤT PHÂN TÍCH
F1
F2
CỘT TÁCH
PHA TĨNH
PHA ĐỘNG F3 Ft = F1 + F2 + F3
1.2. Phân loại * Phân loại HPLC dựa vào kỹ thuật sắc ký Sắc ký phân bố Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn
Phân bố
Sắc ký trao đổi ion Sắc ký loại trừ kích thước
Trao đổi ion
Sàng lọc
* Phân loại HPLC dựa vào vật liệu nhồi Pha tĩnh được nhồi trong cột Pha động ở trạng thái lỏng: Các dung môi, hỗn hợp dung môi hoặc nước Pha thông thường (Normal phase): vật liệu nhồi là silica đơn giản Trao đổi ion: silica biến tính (modified silica) Pha đảo (reverse-phase): silica biến tính
Silica Backbone Quaternary Amine anion exchanger Acetate counter ion (Standard anion exchanger carries Cl- )
Silica biên tính C18
Sử dụng pha đảo trong tách các vitamin tan trong dầu
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Cấu tạo máy HPLC
13
Cấu tạo máy HPLC 1 Pha động 2. Bơm 3. Hệ tiêm mẫu 4. Cột 5. Detecter
6. Máy tính
2.1. Pha động (Dung môi) •
Nhiệm vụ: Cung cấp dung môi cho quá trình sắc ký, đưa chất phân tích ra khỏi cột sắc ký 2.1.1. YÊU CẦU VỚI DUNG MÔI
Có một hoặc nhiều bình chứa dung môi ( Thể tích 500 ml) Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi giảm độ rộng của peak (band spreading) và ảnh hưởng đến chất lượng detector Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơ (sparger) Lựa chọn chế độ tách rửa (elution) cho dung môi Trang bị các loại valves tỷ lệ (proportionating valves) cho phép đưa dung môi từ hai bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục
2.1.2. Lựa chọn dung môi Chủ yếu dựa vào sự phân cực của cấu tử phân tích, pha động, pha tĩnh Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) của cấu tử cần phân tích và pha động là tương đương còn pha tĩnh có độ phân cực khác biệt → thời gian phân tích ngắn Khi độ phân cực của cấu tử và pha tĩnh quá giống nhau: tương tác mạnh giữa cấu tử cần phân tích và pha tĩnh ⇒ thời gian phân tích kéo dài Độ phân cực của một số dung môi sử dụng trong HPLC Polar Solvents Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile Non-polar Solvents N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane
2.1.3. Chế độ chạy - Quá trình tách rửa (Elution)
Sử dụng một dung môi đơn giản có thành phần không đổi: isocratic Sử dụng hai hay nhiều hơn các hệ dung môi có độ phân cực (polarity) khác nhau nhiều: gradient elution Tỷ lệ các loại dung môi được chương trình hóa liên tục hoặc theo từng bậc
Gradient elution: tăng chất lượng của quá trình tách (improve
seperation efficiency)
Tính chất một số loại dung môi sử dụng trong HPLC
Giới hạn dưới đo UV (nm)
Chỉ số khúc xạ
Điểm sôi (oC)
Độ nhớt CP, 25oC
Độ phân cực (Theo Snyder)
n-hexan
190
1,372
69
0,3
0,1
Benzen
280
1,498
80
0,6
2,7
Metylen clorit
233
1,421
40
0,4
3,1
n-propanol
240
1,385
97
1,9
4,0
Tetrahydrofuran
212
1,405
66
0,46
4,0
Etyl axetat
256
1,370
77
0,43
4,4
Clorofom
245
1,443
61
0,53
4,1
Axeton
330
1,456
56
0,30
5,1
Etanol
210
1,359
78
1,08
4,3
Axit axetic
-
1,370
188
1,1
6,0
Axetonitril
190
1,341
82
0,34
5,8
Metanol
205
1,326
65
0,54
5,1
Nước
190
1,333
100
0,89
10,2
Tên dung môi
• Ảnh hưởng của dung môi khác nhau
Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi thay đổi
• Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi
Chế độ chạy: Đẳng dòng Gradien
Tách một số các hợp chất hữu cơ
2.1.4. Chương trình trộn dung môi * Chương trình trộn dung môi ở áp suất thấp DUNG MÔI 1
DUNG MÔI 2
BỘ PHẬN HÒA TRỘN
BƠM
VAN MẪU
DUNG MÔI 3
Ưu điểm: Chỉ dùng một bơm Nhược điểm: Hệ thống 3 van lấy 3 dung môi phức tạp, chi phí ko cao
* Chương trình dung môi ở áp suất cao
DUNG MÔI 1
BƠM 1
DUNG MÔI 2
BƠM 2
DUNG MÔI 3
BƠM 3
BỘ PHẬN HÒA TRỘN
Ưu điểm: Độ đúng và độ lặp lại cao hơn Nhược điểm: Tốn kém và cồng kềnh
VAN MẪU
2.2. Hệ thống bơm * Nhiệm vụ: Để bơm pha động (dung môi rửa giả chất) qua cột tách thực hiện quá trình sắc ký của các chất mẫu đã được nạp vào cột sắc ký * Yêu cầu hệ thống bơm Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào 5000psi trở lên Bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 – 5ml/phút Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi
BƠM ĐẨY MỘT PITTONG
BƠM ĐẦY NHANH
BƠM ĐẨY KÉO
• Ảnh hưởng của tốc độ dòng
2.3. Hệ tiêm mẫu
* Chế độ tiêm
* Nhiệm vụ: Để nạp (bơm) chính xác một lượng mẫu nhất định (hỗn hợp chất phân tích) vào cột tách sắc ký * Nguyên lý: Hệ bơm mẫu cho
Tiêm mẫu bằng xylanh
sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý cơ bản là mẫu ban đầu được nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xi lanh ở áp suất thường
Tiêm mẫu tự động
Tiêm mẫu bằng xylanh
Mặt trước
Sử dụng valve 6 cổng
Tiêm mẫu
Có thể thay thể sampling loops từ 5 µl đến 500 µl Sai số của lượng mẫu nạp dưới 1%
27
Tiêm mẫu tự động
Step 1
Step 2
Step 3 28
2. 4. Cột tách
• Ảnh hưởng của kích thước hạt nhồi
• Ảnh hưởng của loại cột khác nhau
* Nhiệm vụ: Tách các mẫu chất ra khỏi nhau * Cấu tạo: Cột nhồi và cột bảo vệ Cột thông thường: L = 10 – 30 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn ID = 4 – 10 mm, kích thước hạt nhồi: 3, 5 và 10µ µm 40.000 – 60.000 đĩa/m cột Cột tốc độ cao và hiệu quả hơn L = 3 - 7 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn ID = 1 – 4,6 mm, kích thước hạt nhồi: 3 hoặc 5 µm 100.000 đĩa/m cột
2.4.3. Ổn định nhiệt độ của cột (Column Thermostats)
Phần lớn ứng dụng của HPLC được thực hiện ở nhiệt độ phòng Tuy vậy chất lượng của sắc ký đồ sẽ tốt hơn nếu duy trì nhiệt độ của cột không thay đổi (sai số < 0,05°C) Thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm lò gia nhiệt cho cột (Column heater) ổn định nhiệt độ ở gần 150°C với sai số < 0,05°C Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh (water jackets fed) từ bể ổn nhiệt để khống chế chính xác nhiệt độ
2.5. Detector * Nhiệm vụ: Phát hiện và đo nồng độ các chất phân tích theo tính chất hóa lý bằng cách chuyển các tín hiệu không điện thành tín hiệu điện 2.5.1. Yêu cầu
Đáp ứng nhanh và lặp lại Độ nhạy cao, phát hiện chất phân tích ở nồng độ thấp Vận hành ổn định, dễ sử dụng Khoảng tuyến tính rộng Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng
* Một số đặc điểm của detector trong HPLC Độ nhạy (mg/ml)
Khoảng tuyến tính
Đặc điểm
Rửa giải gradient
5.10-7 5.10-7 > 2.10-7
10+4 10+5 10+5
Sử dụng phổ biến, chọn lọc với các chất có cấu trúc hoặc nhóm chức chưa bão hòa. Ít thay đổi với tốc độ dòng và nhiệt độ
+
Huỳnh quang
10-9
104
Đặc biệt rất nhạy, chọn lọc
+
Chỉ số khúc xạ
5.10-4
104
Vạn năng, độ nhạy vừa phải. Thay đổi nhiều theo nhiệt độ
-
Tán xạ bay hơi
2.10-4
104
Vạn năng, độ nhạy vừa phải, đáp ứng với khối lượng
+
-
-
Loại Detecter Hấp thụ UV-VIS - Đo quang (kính lọc) - Đo quang phổ - Mảng diod
Đo độ dẫn
10-5
104
Có thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng. Không dùng cho gradient, chỉ thích hợp với chất tan ion
Đo ampe
10-9
105
Rất nhạy, chọn lọc, điện cực dễ bị nhiễm bẩn
* Detector UV-VIS Đây là loại được sử dụng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS ( bước sóng 190-800nm) của các chất phân tích.
3 cấu hình của detector hấp thụ UV-VIS Detector đo ở bước sóng cố định Detector đo ở bước sóng thay đổi Detector mảng diod UV-DAD
* Detecter huỳnh quang Sử dụng thiết bị huỳnh quang kính lọc hoặc quang phổ huỳnh quang cho detector huỳnh quang. Độ chọn lọc và độ nhạy có thể hơn đến 1000 lần detector hấp thụ UV Áp dụng: Hợp chất thơm đa vòng, dẫn chất quinolin, steroid, ancaloid.. Do độ nhạy cao nên sử dụng cho phân tích lượng vết, mẫu sinh học, giám định pháp y,…
Khối phổ Phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Là một kỹ thuật cao, áp dụng cho phân tích được hầu hết các loại chất, chất bền nhiệt hay không bền nhiệt Độ nhạy cao, có thể phát hiện được chất có LOD < 1pg
2.6. Máy tính • Thể hiện thời gian lưu của chất • Tách chất và xác định hàm lượng của chất thông qua độ hấp thụ
Phổ UV
Sắc ký đồ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
5
2
mAU
3 4
1
6
time
Các đại lượng đặc trưng HPLC
40
3.1. Hệ số phân bố Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như sau:
Hằng số K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố
Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh. CM : nồng độ cấu tử trong pha động. Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.
3.2. Thời gian lưu
Thông số quan trọng để tách chất, tối ưu hóa quá trình sắc ký
tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột. tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết. tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.
3.3. Hệ số dung lượng k’ k’ được định nghĩa theo công thức sau:
Với VS : thể tích pha tĩnh VM : thể tích pha động Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại. Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù. Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20.
3.4. Hiệu năng ( Số đĩa lý thuyết) Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ. Hay
Với W1/2 là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí ½ chiều cao pic (phút) W là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí đáy pic (phút) Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách sắc ký của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.
3.5. Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.
Giá trị chọn lọc luôn lớn hơn 1. Giá trị lớn hay nhỏ đều tác động đến quá trình tách sắc ký
3.6. Độ phân giải Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Kỹ thuật tách HPLC 50
4. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký phân bố (partition chromatography) Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn (adsorption or liquid-solid chromatography) Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography) VD: nguyên lý sắc ký trao đổi ion (acide amine) pH2
SO3
-
+
Na
H3 N
+
COOH
Ion-exchange Resin
SO3
-
H3 N Na
+
+ -
COO
pH4.5
Sắc ký loại trừ kích thước
4.1. Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn (adsorption or liquid-solid chromatography) * Nguyên lý: Là quá trình hấp phụ chất phân tích trên bề mặt chất rắn. Pha tĩnh là chất rắn phân cực. Chất phân tích tranh chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh. Lưu giữ chất phân tích bằng lực hấp phụ * Ứng dụng: Các chất phân tích có khối lượng phân tử dưới 5000, ít tan trong nước hoặc trong hỗn hợp nươc-dung môi hữu cơ không thích hợp với sắc ký pha đảo. Có thế mạnh trong việc tách các đồng phân vị trí các hợp chất hữu cơ, Phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm..
4.2. Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) * Nguyên lý: Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh. Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích dương trên pha tĩnh hút anion chất tan. Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích âm sẽ hút cation chất tan. Chất trao đổi cation và anion là polymer không tan trong nước mang các nhóm trao đổi ion * Ứng dụng: Dùng để tinh chế nguyên liệu loại tạp chất ; Tăng nồng độ các thành phần vi lượng trong dung dịch đủ để phân tích ; Áp dụng cho săc ký hiện đại
4.3. Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)
* Nguyên lý: Sự tách ở đây dựa theo kích thước của phân tử của các chất mẫu được phân bố khác nhau vào trong các lỗ xốp của pha tĩnh. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui vào bên trong lỗ xốp của hạt pha tĩnh nên được rửa giải ra sau. Các phân tử có kích thước lớn nằm ở ngoai nên được rửa giải ra trước * Ứng dụng: Tách các mẫu
có khối lượng phân tử lớn:
polyme, protmaauxo enzyme, xenlulo,...
4.4. Sắc ký phân bố * Nguyên lý: Sự tách loại săc ký này tuân theo các quy luật phân bố của chất tan giữa 2 pha không trộn lẫn là pha động và lớp màng pha tĩnh * Ứng dụng: Sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000)
4.4.1. Chọn pha tĩnh và pha động: Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan Với pha động: Dựa vào độ phân cực, độ nhớt, giới hạn đo,… Với chất phân tích: Dựa vào nhóm chức Hydrocacbon mạch thẳng < olefin < hydrocacbon thơm < dẫn chất halogen < sunfid < ete < dẫn chất nitro < este ≈ andehyd ≈ xeton < ancol ≈ amin < sunfo < sunfoxid < axit cacboxylic < nước * Nguyên tắc lựa chọn: 1. Độ phân cực của chất phân tích hợp với độ phân cực của pha tĩnh và khác xa độ phân cực của pha động 2. Độ phân cực của chất phân tích hợp với độ phân cực của pha động và khác nhiều với độ phân cực của pha tĩnh
Pha tĩnh
Mặc dầu có nhiều lý thuyết nghiên cứu về việc sử dụng pha đảo nhưng phần lớn các chương trình HPLC pha đảo đều thu được từ phương pháp thử và sai (by trial and error).
4.4.2. Phân loại * SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT và sắc ký pha đảo – SKPĐ * Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm. * SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực..
4.4.3. Sắc ký pha đảo a, Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo * Nhiệm vụ: Tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích * Yêu cầu: + Phải trơ và bền dưới tác dụng của các điều kiện môi trường sắc ký, không có các phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích, đảm bảo cơ chế tách theo đúng bản chất của pha tĩnh và không làm mất chất phân tích cần tách + Có tính chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định của hệ pha HPLC + Tính chất bề mặt phải ổn định, độ xốp không bị biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rã dưới áp suất cao của quá trình sắc ký + Cân bằng động học của sự tách sắc ký phải xẩy ra nhanh, thuận nghich và lặp lại tốt + Cỡ hạt tương đối đồng nhất để cột tách có hiệu lực tách cao
* Phân loại
Pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography) Sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng
Sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích. Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi
* Thành phần cấu tạo Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo HPLC chính là chất nhồi cột, nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, diện tích bề mặt riêng lớn Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8
Bề mặt silica đã thủy phân
µmol SiOH/m2 bề mặt) Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
•
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (noctyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên sử dụng nhiều nhất.
Không sử dụng được trong môi trường quá acid (pH < 2) hoặc trong môi trường bazơ (pH > 7)
Cấu trúc của cột ODS
• Dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này. Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính bazơ (cột LC-DB của hãng SUPELCO).
Cấu trúc cột LC-DB
• Thế bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –OH với chất cần phân tích.
Cấu trúc cột có gốc isopropyl
Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity). Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 – 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và bazơ mạnh.
* Cơ chế: Khi tiến hành chạy sắc ký trên bề mặt pha tĩnh xảy ra các cân bằng động như sau: Sr
+
SrXi
+
Xi M
↔
SrXi
↔
MXi + Sr
( Quá trình hấp phụ ) ( Quá trình giải hấp )
Trong đó: Sr là pha tĩnh Xi là chất phân tích SrXi chất phân tích hấp phụ trên pha tĩnh M là pha động MXi chất phân tích trong pha động.
b, Pha động trong RP- HPLC * Nhiệm vụ: Là dung môi dung để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký * Yêu cầu: Hòa tan mẫu phân tích Phải trơ với pha tĩnh Phải bền vững theo thời gian Có độ tinh khiết cao Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký Phù hợp với loại detecter để phát hiện chất phân tích Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao Có tính chất kinh tế, không quá đắt, quá hiếm
•
* Thành phần: Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất
•
Thông thường pha động kết hợp một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ. Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng
4.4.4. Sắc ký pha thuận NP-HPLC: Thành phần pha tĩnh và pha động ngược lại với RP-HPLC Pha tĩnh: Là các chất phân cực như triethylen, glycol, nước.. Pha động: Dung môi ít phân cực như hexan, iso propyl ether Ứng dụng: Phân tích dược phẩm, y học, môi trường,….
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Tối ưu hóa qt sắc ký
71
5.Tối ưu hóa quá trình sắc ký lỏng cao áp Mục đích của quá trình tối ưu hóa là có được sự tách hoàn toàn các chất cần phân tích trong thời gian ngắn nhất khi đi qua cột
5.1.Tính cân đối của píc sắc ký + Sắc ký đồ rửa giải của một pic có dạng giống với biểu đồ phân bố Gauss + Phương trình Gauss có đồ thị là một đường cong đối xứng, đồ thị đi qua 2 điểm uốn tại x = +1 và x = -1 ( chiều cao pic tương ứng tại điểm uốn là 60%). Độ rộng tại điểm uốn là 2s. + Trong sắc ký đồ w1/2 là ký hiệu cho độ rộng tại ½ chiều cao pic (w = 2,35s). Độ rộng của pic tính tại nền và được đo ở chiều cao đạt được là 13,5% so với chiều cao cực đại là w = 4s
Pic thực tế thu được từ sắc đồ thường sai lệch với pic trong trường hợp lý tưởng của phân bố Gauss do nhiều lý do như sai lệch về nồng độ giữa các lần tiêm, tốc độ dòng pha động không đều tại các vị trí trong cột
5.2 Đĩa lý thuyết + Đĩa lý thuyết của Craig được coi là thuyết giải thích quá trinh di chuyển và phân tách các cấu tử chất tan trong cột là hợp lý nhất Trong sắc ký lỏng – rắn các tiến trình cơ bản này là tuần hoàn của sự hấp phụ và giải hấp phụ. Các bước này tái lập lại tuần hoàn theo sự di chuyển của các cấu tử trong cột + Mỗi bước tương ứng với một trạng thái cân bằng mới gọi là đĩa lý thuyết + Các đĩa xếp dọc theo chiều dài của cột. Mỗi một chất khi di chuyển trong cột sẽ có số lần tái tổ hợp khác nhau (hấp phụ / giải hấp phụ) nên số đĩa khác nhau + Nếu gọi chiều cao tương ứng của một đĩa lý thuyết là H ta có: H = L/N
+ Nếu tính lượng chất trên đĩa thứ J tại thời điểm I ta có: Tổng lượng chât tan mT là tổng số lượng chất tan được pha động di chuyển tới từ đĩa thứ (j -1) nằm cân bằng tại thời điểm (i-1) và lượng chất tan thực sự có sẵn ở đĩa thứ j tại thời điểm (i-1) có
Hạn chế của đĩa lý thuyết: Không giải thích được hiện tượng giãn rộng pic do không tính đến phân tán trong cột do sự khuyêch tán của các hợp chất
5.2. Phương trình Vandemter Phương trình mô tả sự ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động đến hiệu quả tách.
B H = A + + Cu u Trong đó: A là hệ số khuyêch tán xoáy B là hệ số khuyếch tán dọc theo cột C là hệ số truyền khối Nếu H có đơn vị là cm thì A là cm, B là cm2/s ; C là s
Hiệu quả cột cao nhất khi H nhỏ nhất tương ứng tốc đọ tối ưu
B u= C
5.4. Các phương pháp nâng cao độ phân giải trong HPLC Tăng chiều dài của cột (Increase column length) Giảm đường kính của cột (Decrease column diameter) Giảm lưu lượng pha động (Decrease flow-rate) Pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng nhất (Uniform stationary phase (packing)) Giảm thể tích bơm mẫu (Decrease sample size) Lựa chọn pha tĩnh sạch hơn (Select proper stationary phase) Lựa chon pha động tinh khiết hơn (Select proper mobile phase) Sử dụng áp suất ổn định hơn (Use proper pressure) Thành phần của pha động thay đổi hợp lý (Use gradient elution)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
Ứng dụng của HPLC
81
6.1. HPLC sử dụng làm gì ? Tách và phân tích chủ yếu các hợp chất khó bay hơi hoặc không bền nhiệt Loại hợp chất không bền nhiệt Dược phẩm : aspirin, ibuprofen, acetaminophen (Tylenol)…. Muối: sodium chloride, potassium phosphate…. Proteins: Lòng trắng trứng, protein, enzym…. Hợp chất hữu cơ: polymers (e.g. polystyrene, polyethylene) Hydrocarbon nặng: Dầu mỏ Sản phẩm tự nhiên: Sâm, thuốc chiết xuất từ cây cỏ,… Ngoài ra có thể xác định với các hợp chất bền nhiệt, tuy nhiên dùng GC thích hợp hơn
Phạm vi ứng dụng Sinh học proteins peptides nucleotides
Hóa học
Hình sự
polystyrenes dyes phthalates
Dược phẩm Môi trường polyaromatic hydrocarbons Inorganic ions herbicides
tetracyclines corticosteroids antidepressants barbiturates
Sản phẩm tiêu dùng lipids antioxidants sugars
Sinh hóa amino acids vitamins homocysteine
83
Vì sao HPLC được chọn trong phân tích dược liệu.... Sắc ký lỏng cao áp có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng. Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng cao áp là có thể phân tích được rất nhiều loại hợp chất khác nhau, khả năng phân tích của nó rộng GC. Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích các chất từ chất phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly. Tính linh hoạt của sắc ký lỏng cao áp cũng cao hơn các phương pháp khác nhờ các cơ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng, phong phú. Với hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như vậy, sắc ký lỏng cao áp hiện vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất.
Dược động học •Thiết bị HPLC và HPLC/MS là một trong những công cụ hỗ trợ rất lớn cho nghiên cứu thực nghiệm (trên động vật như: chuột, thỏ) về mặt đánh giá một số thông số dược động học. •LC-MS được ứng dụng rất nhiều trong nghiên cứu về dược phẩm. Những nghiên cứu trên HPLC cung cấp một cách nhanh chóng các thông tin về lưu lượng, chu kỳ phân hủy của một loại thuốc ở trong máu, gan hay các bộ phận của cơ thể •Xác định được các sản phẩm chuyển hóa trung gian, biến tính của dược phẩm trong cơ thể: sàng lọc thuốc, kiểm tra sự ổn định, nhận dạng các chất chuyển hóa, xác định tạp chất, định lượng và kiểm soát chất lượng.
Dược phẩm Định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu Có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt. Phân tích điểm chỉ xác định nguồn gốc xuất xứ của dược liệu, phân biệt dược liệu với các loài tương cận, xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định các sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn hiệu… Xác định và phân tích tính chất của các loại thuốc được sản xuất bởi các hợp chất hóa học hay được chiết xuất từ sản phẩm thiên nhiên. Kiểm tra chất lượng hợp chất trong thuốc suốt quá trình sản xuất. Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các thiết bị ghép nối LC-MS-NMR để phân tích thành phần các dịch chiết và xác định cấu trúc các chất trong hỗn hợp mà không cần tách riêng các chất.
6.2. Phương pháp định tính
Phương pháp định lượng
Định lượng
Phương pháp cơ bản Thêm Chuẩn
Đường Chuẩn
Chuẩn hóa diện tích
• Sắc ký lỏng với detecter khối phổ RT: 0.00 - 18.04
NL: 2.60E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS mix 500ppb
RT: 8.87 MA: 38708909
100
RelativeAbundance
50 1.07
0
2.82
4.23
100
9.57 6.15 6.68 7.29 RT: 8.88 MA: 3668940
10.97
11.85 13.43
NL: 2.57E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 500ppb
50 0.73
0
2.31 3.01
4.41 5.02
7.13
9.23
7.92
12.03
13.35
16.15
16.77
50 0.83 1.88 3.02 4.25
0
5.04
7.40 7.93 9.15
100
12.75 10.82 RT: 10.93 AA: 1923068
13.97
16.25
16.95 NL: 1.36E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS ICIS mix 500ppb
50
2
4
6
8 10 Time (min)
12
14
16
Carbaryl Fenobucarb
0 0
Propoxur
NL: 2.15E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 500ppb
RT: 9.86 MA: 3127832
100
Carbofuran
16.67 17.72
18
Sắc đồ chuẩn hỗn hợp carbamat 500ng/g (Điều kiện chạy: Cột C18, Pha động:acid focmic 0,1% : MeOH (chạy gradien), Tốc độ dòng 0,5ml/phút, Detector MS) Carbofuran #954 RT: 13.85 AV: 1 NL: 4.38E5 F: + c ESI Full ms2 222.00@48.00 [ 60.00-230.00] 100
164.90
Phổ khối ion con của Carbofuran
90 80
RelativeAbundance
70
Carbamat
Ion mẹ
Năng lượng bắn phá
Ion con
Carbofuran
222
48
165
60 50 40 30 20 10 70.69
0 60
84.38 80
98.52 100
113.06
123.21 120
133.29
149.33
140
161.09 160
m/z
182.94 191.31 200.32 210.77 180
200
226.40
220
Phương pháp đường chuẩn Đường chuẩn Fenobucarb
y = 3990x - 5018.5 R2 = 0.9994
4500000
9000000 8000000
3500000 3000000
7000000 6000000
Diện tích Diệ
Diện tích Di
4000000
2500000
5000000
2000000
4000000
1500000 1000000
3000000 2000000
500000
1000000
0 0
500
1000
0
1500
0
Nồng độ (ppb)
500
1000
1500
2000
Nồng độ (ppb)
Nồng độ (ppb)
20
50
100
200
500
1000
1500
Diện tích (mAu)
1818155
4323952
8848970
17287122
38708909
75531554
95077738
Phương pháp thêm chuẩn Tên hoạt chất
400000
∆C
Diện tích S (mAu.s)
Cx
0
200921
2,14
1
298341
2
389561
3
478932
350000
S (mAu.s)
300000
200000
Y=A+B*X Thong so Gia tri Sai so ----------------------------------------------------------A 201954,33333 2310,60358 B 94320 1789,78583 -----------------------------------------------------------
0 -2,0
-1,5
-1,0
C3
3,18
150000
50000
-2,5
C2
250000
100000
-3,0
Cs
-0,5
0,0
CPEN (mg/l)
0,5
1,0
1,5
2,0
PEN G
4,15 5,17
6.3. Sự phát triển từ HPLC lên UPLC HPLC
UPLC
Tốc độ phân tích
HPLC
UPLC
Lựa chọn phương pháp sắc ký
Lựa chọn kỹ thuật
102
Loại chất
Kỹ thuật
Pha tĩnh
Pha động
Neutrals Weak Acids Weak Bases
Reversed Phase
C18, C8, C4 cyano, amino
Water/Organic Modifiers
Ionics, Bases, Acids
Ion Pair
C-18, C-8
Water/Organic Ion-Pair Reagent
Compounds not soluble in water
Normal Phase
Silica, Amino, Cyano, Diol
Organics
Ionics Inorganic Ions
Ion Exchange
Anion or Cation Exchange Resin
Aqueous/Buffer Counter Ion
High Molecular Weight Compounds Polymers
Size Exclusion
Polystyrene Silica
Gel FiltrationAqueous Gel PermeationOrganic
•THANK YOU…
6.2. Ứng dụng trong phân tích dược liệu Sắc ký lỏng cao áp có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng. Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng cao áp là có thể phân tích được rất nhiều loại hợp chất khác nhau, khả năng phân tích của nó rộng GC. Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích các chất từ chất phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly. Tính linh hoạt của sắc ký lỏng cao áp cũng cao hơn các phương pháp khác nhờ các cơ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng, phong phú. Với hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như vậy, sắc ký lỏng cao áp hiện vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất.
Sắc ký lỏng cao áp thường được sử dụng nhất trong định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu khi so sánh diện tích đỉnh với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích. Có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt. Sắc ký lỏng cao áp hiện nay cũng đang được quan tâm trong phân tích điểm chỉ các chất trong hỗn hợp. Với sắc ký điểm chỉ, người ta có thể xác định nguốn gốc xuất xứ của dược liệu, phân biệt dược liệu với các loài tương cận, xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định các sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn hiệu… Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các thiết bị ghép nối LC-MSNMR-CD để phân tích thành phần các dịch chiết và xác định cấu trúc các chất trong hỗn hợp mà không cần tách riêng các chất.
Phân lập các chất tinh khiết (HPLC điều chế). Về nguyên tắc, sắc ký lỏng cao áp điều chế chia sẻ mọi nguyên lý của HPLC phân tích. Điểm khác biệt duy nhất là hệ thống sử dụng cột sắc ký lớn hơn, với lượng pha tĩnh nhiều hơn để có thể phân tích được nhiều mẫu hơn và các chất tách ra khỏi cột được thu lại để có được các chất tinh khiết. Theo truyền thống, các cột có đường kính trong lớn hơn 4,7mm có thể được xem là cột bán điều chế. Các cột chế điều chế quy mô phòng thí nghiệm có kích thước thay đổi từ 1 – 10 cm. Trong quy mô công nghiệp, các cột sắc ký lỏng cao áp điều chế có thể có đường kính trong tới 100 cm. So với sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp có chi phí cao hơn nên thường chỉ sử dụng trong các trường hợp không tác được bằng các phương pháp sắc ký cột thông thường hay MPLC
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH BỘ MÔN: HÓA HỌC
XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN
GV: LẠI THỊ THU TRANG
Triển khai sắc ký
? Xây dựng quy trình phân tích một chất hoặc một nhóm chức bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Quy trình phân tích 1
Xác định mục tiêu phân tích
2
Chọn kỹ thuật xử lý mẫu
3
Chọn cột tách phù hợp
4 5 6
Chọn detecter thích hợp Chọn điều kiện sắc ký Đánh giá phương pháp phân tích
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU DƯỢC PHẨM Nghiền mịn, cân 20mg
20mg thuốc + metanol
Lắc, siêu âm 15’ , lọc qua cartrig 0,45µm
Dung dịch 20mg/20ml
BƠM MỘT PITTONG
Có 1 pitong bằng lam ngọc, đường kính 3-4mm, dài khoảng 4cm, di chuyển trong xi lanh thép không gỉ, dung tích thay đổi tùy theo đường kính cột Lưu lượng dòng 0,02-2,00ml/phút hoặc 0,20-10,0ml/phút ở áp suất 6000psi Nhược điểm: Trong dòng chảy xuất hiện xung
BƠM ĐẦY NHANH
Bơm có 2 xi lanh dùng chung 1 pitong Hoạt động: Khi Khi dung môi pha động đang vào cột, pittong đang di chuyển về trái, pha động đang được bơm vào cột, cùng lúc đó pha động từ hệ cấp đi vào buồng bên phải Khi pittong di chuyển trở lại về bên phải, lượng pha động buồng phải được đẩy về buồng trái với tốc độ lớn hơn 100 lần so với tốc độ pha động đi vào cột Ưu điểm: Giảm xung ở chu kỳ làm đầy buồng bên trái
BƠM ĐẨY KÉO
Đây là hệ thống kết nối 2 bơm 1 pittông. Hai bơm nối đầu với nhau, đường pha động vào và đường đến cột chung nhau. Khi pitong của bơm bên trái tiến lên đẩy pha động vào cột, đồng thời pittong của bơm bên phải hút pha động từ hệ cấp vào đầy bơm. Sau đó, khi pittong bơm bên phải tiến lên đẩy pha động vào cột, đồng thời kéo pittong bơm bên trái lùi lại lấy pha động vào. Quá trình đẩy kéo diễn ra liên tục.