Chương 5: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
Chuẩn bị mẫu • Thu mẫu ngẫu nhiên, tại nhiều vị trí để có tính đại diện • Mẫu chứa trong bình nhựa hay bao nilon • Bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển • Bảo quản -200C cho đến khi phân tích hoặc 040C trong vòng 36h • Giải đông ở 2-50C trong 18h hoặc 450C trong 15 phút • Đồng nhất mẫu trước khi phân tích
• Phương pháp MPN (most probable number): phương pháp định lượng theo số lượng VSV có xác xuất cao nhất dựa vào kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau
Các loại môi trường nuôi cấy VSV • -
Về bản chất của thành phần môi trường: Môi trường tự nhiên Môi trường tổng hợp Môi trường bán tổng hợp Mt tổng hợp hoặc bán tổng hợp dưới dạng đông khô thương phẩm của các hãng MERCK, OXOID,DIFCO, BBL, HIGH-MEDIA
• -
Về tính chất vật lý: Môi trường lỏng Môi trường rắn Môi trường bán rắn (xốp)
• -
Về công dụng: Môi trường tiền tăng sinh Môi trường tăng sinh Môi trường chọn lọc Môi trường thử nghiệm sinh hóa
QUI TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT
1. TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ • Chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh giá chất lượng của mẫu về VSV, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm. • Xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc • Biểu diễn bằng đơn vị CFU/g hay CFU/ml
Mẫu Dung dịch nước muối pepton Lắc đều, ít nhất 2 phút Đồng nhất mẫu Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào các đĩa petri vô trùng ( mỗi nồng độ 2 đĩa) Cấy mẫu bằng pp hộp đổvới 10-15ml mt Plate Count Agar Ủ 300C, 72h Đếm khuẩn lạc
QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
Cách tính kết quả • Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 • Mật độ VK trong 1g hay 1ml mẫu:
A=
N n1Vf1 + …+ niVfi
A: số tế bào VK trong 1g hay 1ml mẫu N: số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ I V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng
• Mt nước muối pepton (SPW) - 8,5g NaCl - 1g pepton - Nước cất cho đủ 100ml
2. COLIFORMS VÀ E.COLI • Coliforms là nhóm VK Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, lên men lactose sinh hơi trong 24- 48h ở 350C • Nhóm Coliforms bao gồm 4 giống là Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae và Citrobacter
• Coliforms chịu nhiệt là những coliforms có khả năng lên men sinh hơi khi ủ 440C trong mt EC (E.coli medium) • Coliforms phân là những coliform chịu nhiệt có khả năng sinh Indol trong mt trypton • E.coli là coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC (++--) • Nhóm Coliform sinh hơi khi nuôi trong mt canh thang lactose mật bò BGBL (Brilliant Green Bile Broth Lactose) và LSB ( Lauryl Sulphate Broth) • Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, MPN (Most Probable Number)
• Thử nghiệm Indol: - Vi khuẩn được cấy vào trong môi trường canh thang tryptophan, để ở 35° - 37°C trong 18 – 24h. - Nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử Kovac vào trong ống nghiệm. Quan sát kết quả. Phản ứng (+) sẽ xuất hiện vòng màu đỏ phía trên dung dịch nuôi cấy • Cơ sở khoa học: Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy phân acid amin tryptophan sinh indol, acid pyruvic và NH3+. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm (CHO) của p – dimetthylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ.
• Thử nghiệm MR (Methyl-Red) - Kiểm tra khả năng tạo và duy trì acid được tạo ra từ quá trình lên men glucose của vi sinh vật
- Thực hiện: Nuôi VSV trên canh thang (broth) MR-VP, thêm 5 giọt dung dịch đỏ methyl 0,2% (chỉ thị pH), phản ứng (+) khi mt có màu đỏ
• Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer): - Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật.
- Thực hiện: nuôi VSV trên MR-VP Broth, nhỏ 6 giọt dung dịch a-napthol 5%, 2 giọt KOH 40%. Phản ứng (+) khi có màu đỏ xuất hiện sau 15-20 phút
• Thử nghiệm citrate: - Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất trong quá trình biến dưỡng của vi sinh vật. - Môi trường (Simmons citrate) có chứa muối ammonium vô cơ. Vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn Carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối Amonium làm nguồn Nitơ và sinh NH3 làm môi trường trở nên kiềm. Trong mt có Bromthymol blue – chất chỉ thị pH, chuyển từ xanh lục sang xanh dương khi mt kiềm. - Thực hiện: nuôi VSV trên mt Simmons citrate, ủ 24h, phản ứng (+) khi mt chuyển từ màu xanh lục sang xanh dương.
Qui trình định lượng Coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms phân và E.coli bằng pp MPN Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 370C, 48h Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng
Cấy vào ống canh BGBL
Cấy vào ống canh EC
ủ 37 + 10C, 48h
ủ 44,5 + 0,20C, 24h
Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng
Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng
Coliforms
Coliforms chịu nhiệt
Cấy lên thạch EMB, ủ
Chọn khuẩn lạc điển hình (tròn, dẹt hình đĩa, có ánh kim tím), cấy vào canh Trypton, ủ 44,5 + 0,20C, 24h
Thử nghiệm Indol
Đếm số ống canh EC(+) và Indol (+), tra bảng MPN
Coliforms phân
370C,
24h
Eosin Methylene Blue Agar: phân biệt có lên men lactose hay không? Sinh acid phản ứng thuốc nhuộm tạo màu ánh kim tím
Chọn khuẩn lạc điển hình (tròn, dẹt hình đĩa, có ánh kim tím), cấy vào canh Trypton, MR- VP, SC Citrate ủ 44,5 + 0,20C, 24h
Thử nghiệm IMViC
Đếm số ống canh EC(+) và IMViC (++--), tra bảng MPN
E.coli
• -
Mt LSB Trypton: 20g Lactose: 5g KH2PO4: 2,75g K2HPO4: 2,75g NaCl:5g Sodium lauryl sulfate:0,1g Nước cất: 1 lít pH cuối 6,8 + 0,2. Phân phối vào các ống nghiệm có ống Durham
• -
Mt BGBL Peptone: 10g Lactose: 10g Mật bò: 20g Brilliant green: 0,0133g Nước cất: 1 lít Hòa tan từng loại rồi trộn chung. pH cuối 7,2 + 0,2. Phân phối vào các nghiệm chứa ống Durham.
• -
Mt EC Trypton: 20g Muối mật: 1,5g Lactose: 5g KH2PO4: 1,5g K2HPO4:4g NaCl: 5g Nước cất: 1 lít pH cuối 6,9 + 0,2. Rót vào các ống nghiệm có chứa ống Durham.
• Mt canh Trypton - Trypton :10g - Nước cất: 1 lít pH 6,9 + 0,2
Qui trình định lượng Coliforms, coliforms phân và E.coli bằng pp đếm khuẩn lạc Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đỉa petri bổ sung 5ml mt TSA, lắc đều, để yên 1-2h
Tryptone casein soy agar
Rót 10-15ml mt thạch VRB, để đông ủ 370C, 24- 48h
Violet Red Bile
Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, dk > 0,5mm, chọn 5 khuẩn lạc
Cấy vào ống canh BGBL
Cấy vào ống canh EC
ủ 370C, 24- 48h
ủ 440C, 24-48h
Đếm số ống canh (+) (sinh hơi), tính mật độ Coliforms
Chọn ống canh (+)( sinh hơi)
Thử nghiệm Indol
Thử nghiệm IMViC
Đếm số ống canh EC(+) và Indol (+)
Đếm số ống canh EC(+) và IMViC (++--), tra bảng MPN
Coliforms phân
E.coli
• -
Mt TSA (Tryptic Soy Agar) Trypticase pepton: 15g Phytone pepton: 5g NaCl:5g Agar: 15g Nước cất:1 lít pH 7,3 + 0,2
• -
Mt VRB (Violet Red Bile Agar) Cao nấm men: 3g Pepton: 7g NaCl: 5g Muối mật: 1,5g Lactose: 10g Neutral red:0,03g Crystal violet: 0,002g Agar: 15g Nước cất: 1 lít pH 7,4 + 0,2
3. Staphylococcus aureus • VK hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, hình cầu, Gram dương, có thử nghiệm coagulase, có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, sucrose. • Sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy 1000C trong 30 phút. • Gây triệu chứng nôn mữa, tiêu chảy kéo dài
Qui trình định lượng Staphylococcus aureus Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 370C, 48h Chọn ống (+) (mt chuyển từ đỏ sang vàng) ở mỗi độ pha loãng
Trải lên đĩa thạch BPA, ủ 370C, 24- 48h, trải lên đĩa thạch máu, ủ 370C, 24h
Ria lên đĩa thạch BPA, ủ 370C, 48h Chọn khuẩn lạc đặc trưng (lồi, đen bóng có vòng sáng rộng bao quanh)
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng
Đếm số khuẩn lạc không đặc trưng
Cấy vào TSA, ủ 37 + 10C, 24h
Thử nghiệm ngưng kết coagulase
Ghi nhận số coagulase(+) ở mỗi nồng độ pha loãng
Lấy 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào TSA, ủ 37 + 10C, 24h
Lấy 5 khuẩn lạc không đặc trưng cấy vào TSA, ủ 37 + 10C, 24h
Thử nghiệm ngưng kết coagulase
Tỉ lệ khuẩn lạc đặc trưng, coagulase (+)
Tỉ lệ khuẩn lạc không đặc trưng, coagulase (+)
Tra bảng MPN
Mật độ S.aureus (MPN/g hoặc MPN/ml)
Mật độ S.aureus (CFU/g hoặc CFU/ml)
• Thử nghiệm coagulase: VSV tiết ra enzym coagulase làm kết tụ các thành phần huyết tương tạo thành các khối đông làm đông huyết tương - Huyết tương người hay dạng đông khô thương phẩm hoặc tự điều chế bằng cách ly tâm máu chứa chất chống đông (citrate) để thu huyết tương - Cho vào ống nghiệm 0,5ml huyết tương, bổ sung 0,5ml dịch nuôi cấy chủng thuần. Trộn đều, ủ 370C. Kết quả (+) khi có xuất hiện khối kết tụ
• -
Mt MSB (Mannitol Salt Broth) Cao thịt: 1g Polypeptone:10g NaCl:75g Mannitol: 10g Phenol red: 0,025g Nước cất: 1 lít pH: 7,4 + 0,2
• -
Mt Baird- Parker (BPA), pH:7,0 Trypton:10g Cao thịt: 5g Cao nấm men: 1g Sodium pyruvate: 10g Glycine: 12g Lithium chloride.6H2O: 5g Agar: 20g Đem hấp vô trùng. Bảo quản tủ lạnh dùng trong 1 tháng. Trước khi sử dụng, đun nóng chảy, thêm 5ml Bacto EY tellurite enrichment ấm vào 95ml mt trên. Đổ đĩa, sử dụng.
4. Streptococcus phân • Liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân, Gram dương, không di động không sinh bào tử, sống hiếu khí tùy ý nhưng tốt nhất trong đk kỵ khí. • Chỉ thị chất lượng vệ sinh thực phẩm
Qui trình định lượng Streptococcus phân Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Trải lên mt Enterococcus Agar, ủ 440C, 48h
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 5ml canh Azide Glucose, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 370C, 48h
Đếm khuẩn lạc đặc trưng (màu hồng đến đỏ đậm, có thể có vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc)
Ria các ống (+) lên thạch Bile Esculin, ủ 44 + 0,50C trong 48h
Lấy 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào TSA, ủ 370C, 24h Khẳng định (+): BHI chịu muối 6,5% (+), chịu pH 9,6 (+), catalase (-), oxidase (-)
Khuẩn lạc đặc trưng ( nâu đen) Thử nghiệm catalase (-) Số ống nghiệm (+) cho mỗi độ pha loãng: AG (+), BE (+), Catalase (-)
Mật độ Streptococcus phân
Mật độ Streptococcus phân
(CFU/g hay CFU/ml)
(MNP/g hay MNP/ml)
• Thử nghiệm catalase: Trên phiến kính hoặc nhỏ trực tiếp H2O2 30% trực tiếp lên sinh khối VSV. Ghi nhận (+) nếu có bọt khí sủi quanh sinh khối • Thử nghiệm oxidase Giấy lọc nhúng dung dịch 1% tetramethyl –pphenylenediamin dihydrochloride hoặc oxalate. Dùng que cấy lấy sinh khối dàn đều lên miếng giấy lọc tại vị trí có thuốc thử, ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương
• -
Mt BHI (Brain Heart Infusion) Dịch não dê: 200g Dịch tim bò: 250g Polypepton: 10g NaCl: 5g Na2HPO4:2,5g Dextrose: 2g Nước cất:1 lít
• -
Mt Bile Esculin agar Cao thịt:3g Pepton: 5g Esculine:1g Oxgall:40g Fe citrate:0,5g Agar:15g Nước cất: 1 lít pH: 6,6 + 0,2
• Mt Azide Glucose - Trypton : 20g - Dextrose: 5g - K2HPO4: 4g - KH2PO4: 1,5g - NaCl: 5g - Sodium azide: 0,5g - Bromocresol purple:0,032g - Nước cất: 1 lít pH: 6,9 + 0,2
4. Salmonella • Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indol, không phân giải ure, hầu hết đều sinh H2S. • Gây ngộ độc thực phẩm với các triệu chứng tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn
Qui trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mt tăng sinh (BPW), ủ 370C, 18-24h Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang mt tăng sinh chọn lọc (RV), ủ 420C, 18-24h Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mt chọn lọc phân biệt (XLD,BS), ủ 370C, 24h Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không. Urease (-), Indol (-), VP(-), Manitol (+), Sorbitol (+) Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh: Poly: O, Poly: H
Kết luận Salmonella (+) hay (-) trong 25 g mẫu
• Trên mt XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen • Trên mt BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím. Môi trường chung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó thành đen nếu kéo dài thời gian ủ
• Thử nghiệm KIA/TSI - KIA chứa 2 loại đường glucose và lactose - TSI chứa 2 loại đường trên cùng với sucrose + chỉ sử dụng glucose: mt đỏ bề mặt, vàng phần sâu + dùng hết các đường: mt vàng toàn bộ + không sử dụng: đỏ trên bề mặt, phần sâu không đổi màu • Thử nghiệm H2S - Sử dụng chính loại mt trên do trong thành phần có sodium thiosulphate - VSV khử sulphate sinh H2S kết hợp ion Fe2+ của chỉ thị ferric ammonium citrate tạo kết tủa đen FeS
• Thử nghiệm urease: Mt urea lỏng chứa chỉ thị đỏ phenol. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc chủng thuần cho vào ống nghiệm chứa 3ml mt. Ủ 370C, 48h. Thử nghiệm (+) khi mt trở thành màu đỏ tím và (-) khi mt giữa màu vàng cam • Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh (thực hiện song song chứng âm để loại ngưng kết giả). Phản ứng (+) khi tạo ngưng kết với kháng huyết thanh Poly O và Poly H
4. Shigella • Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý,cho thử nghiệm catalase (+), oxidase (-), lên men glucose không sinh hơi, không lên men và sinh acid từ lactose, không sinh H2S. • Tác nhân gây bệnh lỵ. Biểu hiện bệnh lý từ nhẹ tiêu chảy đến mức nặng đi tiêu ra máu, mất nước, sốt cao, bị co rút thành bụng.
Qui trình phát hiện Shigella trong thực phẩm Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mt tăng sinh (TSB), pH 7,2, ủ 370C, 16-20h Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang 10ml mt tăng sinh chọn lọc (GN), ủ 370C, 16-20h Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mt chọn lọc phân biệt (HE,DC), ủ 370, 24h Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm 370C Thử nghiệm sinh hóa: Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S (-), sinh hơi(-) Không di động trong thạch mềm, Oxydase (-) Thử nghiệm sinh hóa khẳng định
Kết luận Shigella (+) hay (-) trong 25 g mẫu
• Trên mt thạch HE: khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt, trong suốt • Trên mt thạch DC: khuẩn lạc Shigella có màu đỏ nhạt • -
Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Urease (-) MR (+) VP (-) Thử nghiệm kháng huyết thanh dương tính : A,B,C,D
4. Vibrio • Phẩy khuẩn, Gram âm, di động, sống kỵ khí tùy ý, catalase và oxidase (+), lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S, • Tác nhân gây bệnh tả do tạo độc tố tả là chlorae-toxin, có độ tính mạnh, chỉ cần 5µg có thể gây tiêu chảy ở người trưởng thành. • Triệu chứng ngộ độc là đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột và tiêu chảy.
Qui trình phát hiện và định danh Vibrio trong thực phẩm Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml APW hoặc Colistine Ủ canh khuẩn ở
370C
Sau 6-8h
Phân lập trên TCBS
Sau 16-24h Phân lập trên TCBS
Ủ 370, 24h Chọn khuẩn lạc đặc trưng (V.parahaemolyticus :xanh; V.cholerae: vàng), ria trên TSA chứa 1% NaCl hay BHI , ủ qua đêm 370C Thử nghiệm sơ bộ: Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S (-), sinh hơi(-), di động trong thạch mềm, Oxydase (+), Gram (-) Thử nghiệm sinh hóa khẳng định
Kết luận: V.parahaemolyticus hay V.cholerae
• Mt TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-Salt- Sucrose) - Cao nấm men: 5g - Sucrose: 20g - Sodium thiosulfate.75H2O:10g - Sodium citrate.72H2O:10g - Sodium cholate:3g - Oxgall: 5g - NaCl:10g - Ferric citrate:1g - Bromothymol blue: 0,04g - Thymol blue: 0,04g - Agar: 15g - Nước cất: 1 lít Để vừa sôi nhấc ra, không hấp khử trùng
Qui trình định lượng Clostridium Đồng nhất và pha loãng mẫu theo dãy thập phân, xử lý mẫu 800C, 15-20 phút Cấy 1ml vào đĩa petri, đổ 10-15ml mt ISA, 450C, lắc đều
Cấy 1ml vào ống nghiệm vô trùng. Đổ 10-15ml ISA 450C, lắc đều
Đổ lớp ISA thứ 2 khi lớp thứ 1 đã đông đặc
Đổ lớp ISA thứ 2 cao 1-2cm sau khi phần dưới đông đặc
Ủ trong bình kín, ủ 370C, 24-48h
Ủ 370C, 24-48h
Đếm tất cả khuẩn lạc có màu đen, đường kính > 0,5mm
Đếm tất cả khuẩn lạc màu đen xuất hiện trong ống
Tính kết quả
Tính kết quả
Qui trình định tính nấm mốc
Đống nhất mẫu trong SDB thành độ pha loãng 10-1, ủ 300C, 1-7 ngày
Cấy canh trường có nấm mốc mọc lên đĩa SDA, MEA hay PDA, ủ 300C trong 7 ngày
Kết luận có hay không có nấm mốc
• -
Mt SDB (Sabouraud’s Dexrotrose Broth) Polypepton: 10g Dextrose: 40g Nước cất: 1 lít
• -
Mt PDA (Potato Dextrose Agar) Khoai tây: 200g Dextrose: 20g Agar: 15-20g Nước cất: 1 lít
• -
Mt MEA (Malt Extract Agar) Cao malt: 30g Agar: 15-20g Nước cất: 1 lít
Qui trình định lượng tống số nấm men nấm mốc Đồng nhất và pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc DG18, ủ ngửa đĩa ở 250C, 5-7 ngày
Đếm khuẩn lạc nấm men, nấm mốc, tính mật độ (CFU/g)
Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ 300C, 7 ngày
Định danh
• -
Mt DG 18 (Dichloran 18% glycerol) Glucose: 10g Pepton: 5g KH2PO4: 1g MgSO4: 0,5g Dichloran (0,2% trong etanol): 1ml Glycerol: 220 ml Agar: 15g Choramphenicol: 0,1g Nước cất: 1 lít
Các phương pháp hiện đại • • • •
Phương pháp phát quang ATP Phương pháp ELISA Phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR
Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh • ATP là dấu hiệu nhận biết sự tồn tại của vật chất sống • Có thể phát hiện nhanh ATP bởi lượng ánh sáng phát ra khi ATP kết hợp với enzym luciferase E + LH2 + ATP + O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + PPi (E: Luciferase, LH2:luciferin)
• Oxyluciferin phát ra ánh sáng vàng xanh và được ghi nhận trị số ánh sáng phát ra bằng một máy đo ánh sáng • ATP của eukaryote được tách chiết bởi các chất tẩy không ion như Triton X-100. ATP này được tách ra trước và bị thủy phân bởi ATPase được bổ sung vào. Sau đó mới trích ly ATP từ VSV bằng trichloacetic acid 5%.
Quệt trên bề mặt kiểm tra
Thực hiện phản ứng
Đọc kết quả trên máy đo sáng
Qui trình phát hiện VSV bề mặt bằng dụng cụ Clean-Track
Phương pháp ELISA (Enzyme- Linked ImunoSorbent Assay) • Phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. • Tín hiệu của phản ứng miễn dịch được nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên- kháng thể hoặc bằng cách sử dụng các kháng thể đã đánh dấu bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym)
Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzym (ELISA) sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài các đĩa giếng. Khi có kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, nó sẽ gắn kết với kháng thể đã có trong giếng. Sau đó phức hợp này được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn enzym horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase. Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzym vào giếng, enzym xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Từ đó định lượng kháng nguyên
Phương pháp lai phân tử
• Dựa trên phản ứng bắt cặp giữa một mẫu dò (oligonucleotit) với DNA/RNA mục tiêu trong mẫu. Mẫu dò luôn được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang để có thể được nhận biết khi có phản ứng bắt cặp xảy ra.
• Trình tự: - Phá vỡ tế bào thu nhận DNA hoặc RNA - Mẫu dò có gắn đuôi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate (F) ở đầu 5’ và 3’ của phân tử được đặt vào phản ứng. - Que thử được bao bọc với polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò - Que thử được đặt vào ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh dấu bằng enzym - Sau khi rửa loại phần enzym thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu - Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450nm
Phương pháp PCR • Khuyếch đại 1 trình tự DNA nhờ mồi chuyên biệt và nhận biết sản phẩm khuyếch đại bằng điện di sau khi nhuộm với ethidium bromide