HPLC CƠ SỞ LÝ THUYẾT & ỨNG DỤNG by Dạy Kèm Quy Nhơn Official

MỤC LỤC PHẦN I : CƠ SỞ LÝ THUYẾT ............................................................................................. 3 I.1. Khái niệm ............................................................................................................... 3 I.2. Phân loại sắc ký : .................................................................................................... 3 I.3. Đặc điểm và ứng dụng của mỗi loại: ....................................................................... 4 I.4. Các quá trình tách trong cột sắc ký ......................................................................... 5 X(MP) + SP = X(SP) + MP ............................................................... 6 I.5. Các đại lượng đặc trưng trong HPLC ...................................................................... 9 I.6. Cơ chế tách trong phương pháp HPLC: ................................................................ 14 PHẦN II: HỆ THỐNG HPLC .............................................................................................. 15 II.1. Bình chứa dung môi giải ly cột ............................................................................. 15 II.2. Bộ khử khí (Degasse ) .......................................................................................... 17 II.3. Bơm cao áp : ........................................................................................................ 17 II.4. Bộ phận tiêm mẫu ( injection)............................................................................... 18 II.5. Cột sắc ký :........................................................................................................... 19 II.6. Detector ( đầu dò) ................................................................................................. 20 II.6.1. Đầu dò hấp thu tia tử ngoại (UV (Ultraviolet detector). ................................. 22 II.6.2. Đầu dò mạng diod quang (Photodiode array spectrophotometer). .................. 22 II.6.3. Đầu dò phát huỳnh quang (Fluorescence detector). ....................................... 22 II.6.4. Đầu dò chỉ số khúc xạ (Refractive index detector)......................................... 23 II.6.5. Đầu dò đo độ dẫn điện ( Conductivity detector) ............................................ 23 II.6.6. Đầu dò ampe kế (Amperometric detector). .................................................... 23 II.6.7. Đầu dò LC – IR ............................................................................................ 23 II.6.8. Đầu dò LC – MS ........................................................................................... 23 II.7. Bộ phận ghi tín hiệu. ............................................................................................ 24 II.8. In kết quả: ............................................................................................................ 24 Phần III : CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ............................................................................... 25 III.1. Pha tĩnh ............................................................................................................ 25 III.1.1. Các yêu cầu của pha tĩnh sử dụng trong HPLC.............................................. 25 III.1.2. Các nguyên liệu sử dụng làm pha tĩnh. .......................................................... 25 III.1.3. Các loại pha tĩnh trong HPLC ....................................................................... 25 III.2. Pha động........................................................................................................... 29 III.3.1. Vai trò và ảnh hưởng của pha động: ............................................................. 29 III.3.2. Các yêu cầu của pha động sử dụng trong HPLC ............................................ 30 III.3.3. Các loại pha động: ........................................................................................ 31 III.3. Một số yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trình sắc kí ........................................... 32 III.3.1. Ảnh hưởng của cấu trúc mẫu phân tích ......................................................... 32 III.3.2. Ảnh hưởng của thể tích nạp mẫu ................................................................... 32 III.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................ 33 PHẦN IV : TIẾN HÀNH SẮC KÍ ....................................................................................... 34 IV.1. Các cách tiến hành sắc kí .................................................................................. 34 IV.1.1. Phương pháp tiền lưu .................................................................................... 34 IV.1.2. Phương pháp rửa giải .................................................................................... 34 IV.1.3. Phương pháp rửa đẩy .................................................................................... 35 IV.2. Chuẩn bị máy ................................................................................................... 35 IV.3. Chuẩn bị pha động ............................................................................................ 36 IV.4. Chuẩn bị mẫu ................................................................................................... 36 PHẦN V : CÁC LĨNH VỰC ỨNG DỤNG .......................................................................... 41 V.1. Phân tích hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong thủy sản bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao. .................................................................................................................. 41 V.1.1. Phạm vi áp dụng ........................................................................................... 41 V.1.2. Phương pháp tham chiếu ............................................................................... 41 1

V.1.3. Nguyên tắc.................................................................................................... 41 V.1.4. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử ...................... 42 V.1.5. Phương pháp tiến hành.................................................................................. 44 V.1.6. Tính kết quả .................................................................................................. 46 V.2. Xác định hàm lượng Vitamin C trong mẫu ớt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ...... 47 V.3.1. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................... 47 V.3.2. Hoá chất ....................................................................................................... 47 V.3.3. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử ................................................................ 47 V.3.4. Chuẩn bị mẫu................................................................................................ 47 V.3.5. Tiến hành phân tích trên HPLC ..................................................................... 48 V.3.6. Tính Kết Quả ................................................................................................ 48 V.3. Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng HPLC. ....................................................................................................... 50 V.3.1. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................... 50 V.3.2. Hóa chất ....................................................................................................... 50 V.3.3. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử ................................................................ 50 V.3.4. Phương pháp tiến hành.................................................................................. 51 V.3.5. Tính kết quả .................................................................................................. 53

PHẦN I : CƠ SỞ LÝ THUYẾT HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng. I.1. Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn ,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử). I.2. Phân loại sắc ký : Trong HPLC, tùy bản chất của qúa trình sắc ký của pha tĩnh (SP) trong cột tách mà người ta chia thành: I.2.1 Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC). I.2.2 Sắc ký hấp phụ, có 2 loại: + Pha thường (Normal phase: NP-HPLC), + Pha ngược hay pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC), I.2.3 Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC). I.2.4 Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC).

- Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000). - Trong 4 loại này,loại thứ 4 là chỉ để tách các chất có phân tử lượng lớn hơn 1000 đvC. 3

I.3. Đặc điểm và ứng dụng của mỗi loại: I.3.1

Sắc ký phân bố (PC-HPLC) hay chiết a) Đặc điểm

+ Pha tĩnh: chất lỏng, không hay rất ít phân cực + Pha động: dung môi không và ít phân cực + Cơ chế tách: Sự phân bố (sự chiết) + Độ ổn định và lặp lại kém. b) Phạm vi ứng dụng + Tách và phân tích cả chất không phân cực và phân cực + Các chất vô cơ và hữu cơ. I.3.2

Sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC) a) Đặc điểm:

+ Pha tĩnh: Phân cực, ái nước. + Pha động: Dung môi không hay ít phân cực, kị nước. + Cơ chế tách: Sự hấp phụ. + Bị ảnh hưởng nhiều bởi độ ẩm. b) Phạm vi ứng dụng: + Tách và phân tích các chất ít và không phân cực. + Chủ yếu là các chất hữu cơ. I.3.3 Sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC) a) Đặc điểm + Pha tĩnh: Không hay rất ít phân cực + Pha động: Dung môi phân cực, và nước + Cơ chế tách: Sự hấp phụ. + Độ ổn định và lặp lại cao. b) Phạm vi ứng dụng + Tách và phân tích cả chất không phân cực và phân cực. + Các chất vô cơ và hữu cơ, amin, aminoaxit, HCBVTV. I.3.4 Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) a) Đặc điểm + Pha tĩnh: Cấu tạo ion, và bề mặt phân cực + Pha động: Dung dịch nước, đệm pH, chất tạo phức,... 4

+ Cơ chế tách: Sự trao đổi ion + Độ ổn định và lặp lại tốt. b) Phạm vi ứng dụng + Tách và phân tích các dạng ion, hay phân li thành ion + Các chất vô cơ và hữu cơ. I.3.5 Sắc ký trao đổi dạng cặp ion (IPE-HPLC) a) Đặc điểm + Pha tĩnh: Dùng loại RP-HPLC, + Pha động: Dung dịch nước, đệm pH, chất tạo phức,...Phải có chất tạo cặp (ví dụ SDS). + Cơ chế tách: Sự trao đổi kiểu cặp ion, + Độ ổn định và lặp lại không cao. b) Phạm vi ứng dụng + Tách & phân tích các dạng ion, hay phân li thành ion. + Các chất vô cơ và hữu cơ. I.3.6 Sắc ký rây phân tử (GEL-HPLC hay F-HPLC) a) Đặc điểm + Pha tĩnh: Cấu tạo loại NP- và RP-HPLC. + Pha động: Dung môi hữu cơ. + Cơ chế tách: Sự rây (hay lọc) theo độ lớn phân tử. b) Phạm vi ứng dụng + Tách và phân tích các chất phân tử lớn (>1000 đv.C). + Trong lĩnh vực Polime. I.4. Các quá trình tách trong cột sắc ký

I.4.1

Sự tương tác Xi -SP-MP trong cột tách

- Nếu gọi : Chất phân tích : Xi, Pha tĩnh: SP, Pha động: MP. Khi chạy sắc ký, quá trình hấp phụ và giải hấp liên tục xẩy ra, từ lúc nạp chất mẫu vào cho đến lúc các chất đi ra khỏi cột sắc ký, trong cột tách luôn luôn có 3 tương tác: + Tương tác pha tĩnh (SP) với chất phân tích (Xi), có lực F1. + Tương tác pha động (MP) với chất phân tích (Xi), có lực F2. + Tương tác pha động (MP) với pha tĩnh (SP), có lực F3. - Chúng ta có thể mô phỏng như trong hình sau : 5

- Trong 3 tương tác này : + F3 là không đổi (trong 1 hệ pha). + F1 và F2 ngược chiều nhau. + F1 giữ chất phân tích Xi lại trên pha tĩnh (SP). + F2 kéo chất phân tích Xi vào pha động (MP). Như vậy lực lưu giữ của các chất trong quá trình sắc ký là tổng đại số của 3 lực tương tác đó, nghĩa là ta có : F = ( F1 + F2

+ F3 )

Do đó trong một hỗn hợp mẫu, chất phân tích nào: + Có lực F nhỏ nhất sẽ được ra khỏi cột tách trước tiên. + Có lực F lớn nhất sẽ ra sau cùng. Vì thế mà tạo ra quá trình sắc ký tách các chất. + Những chất có F bằng nhau, hay gần nhau thì không tách được khỏi nhau, chúng trùng nhau, hay chen lấn nhau . I.4.2

Các cân bằng động học trong cột tách

- Quá tình sắc ký trong cột tách là các cân bằng động học. Có dạng chung: X(MP) +

= X(SP) + MP Kt

Trong đó: + Kt: Hấp phụ chất X lên SP. + Kn : giải hấp chất X vào MP. + X(MP) và X(SP) : Biểu thị chất X trong MP và SP. - Cân bằng động học phân bố của chất trong cột sắc ký : + Theo quy luật phân bố nhiệt động học Lang-Mua. + Xảy ra liên tục + Chất Xi bị hấp phụ vào pha SP, rồi lại bị rửa giải vào MP 6

+ Làm chất Xi có hàng ngàn lần bị SP hấp phụ, bị MP rửa giải. + Cứ như thế diễn biến từ đầu cột đến cuối cột tách. + Cuối cùng chất Xi được chảy ra khỏi cột tách. - Cân bằng phân bố này có 3 dạng: + Dạng tuyến tính, khi nồng độ chất Xi nhỏ (hình 1) dạng này cho: * Pic sắc ký cân đối, không doãng chân. *Hiệu quả tách cao (tức là H nhỏ). + Dạng không tuyến tính, khi nồng độ chất lớn (hình 1b và 1c). Dạng này: * Pic sắc ký không cân đối, pic sắc ký doãng chân. * Hiệu quả tách nhỏ (tức là H lớn). Trường hợp này có 2 kiểu: - Phân bố lồi, chân pic SK doãng phía trước (hình 1c). - Phân bố lõm, chân pic sắc ký doãng phía sau (hình 1b). Như vậy nếu quá trình tách tốt : Hỗn hợp mẫu có bao nhiêu chất, thì chúng ta sẽ thu được sắc đồ có bấy nhiêu píc sắc ký riêng biệt. (hình 2 là ví dụ về sự tách và không tách được của 5 chất). - Các cân bằng tương tác trong cột tách có thể là: Có 3 loại Cân bằng động học tương tác: + Tương tác hấp phụ (Rắn-Lỏng), đó là: Hấp phụ pha thường (NP), và Hấp phụ pha ngược (RP). + Tương tác tĩnh điện (tương tác ĐL. Cu-Lông), + Tương tác phân bố Lỏng-Lỏng (Sắc ký chiết).

(a)

(b)

(c)

Hình 1.Quy luật phân bố chất và pic sắc ký

Hình 2: Sơ đồ tách sắc ký 5 chất Loại 1. Tương tác hấp phụ (NP- & RP-HPLC), gồm có: + Sự hấp phụ: + Sự rửa giải:

(SP)

+ Xi

(SP).Xi + (MP)

= (SP).Xi = (MP).Xi + (SP)

Loại 2 : Tương tác tĩnh điện ion (IE- và IPE-HPLC) Gồm có: - Trao đổi ion (IE -HPLC): 8

+ Trao đổi:

(SP)-Na + Xi+

= (SP)-Xi

Na+

+ Rửa giải: (SP)-Xi + (MP)-H = (SP)-H + (MP)-Xi - Trao đổi kiểu cặp ion (IPEx-HPLC): + Tạo cặp:

(SP) + R-SO3Na = (SP).R-SO3Na

+ Trao đổi: (SP).R-SO3Na + Xi+ = (SP).R-SO3-Xi + Na+ + Rửa giải: (SP).R-SO3Xi +(MP)-H = (SP).R-SO3Na + (MP)-Xi Trong đó: -SO3Na : Chất tạo cặp, ví dụ: SDS (Na-Dodecyl-SO3). Loại 3. Tương tác chiết Lỏng-Lỏng (L-LP-HPLC) + Phân bố vào SP:

Xi + (SP)

= (SP).Xi

+ Phân bố vào MP: Xi + (MP)

= (MP).Xi

(SP).Xi

= (MP).Xi

+ Và chúng có CB:

có Kpb

Loại 4. Tương tác theo độ lớn Phân tử (GEL-HPLC) Là tương tác hấp phụ vào lỗ xốp của hạt SP, và theo theo độ lớn của chất Xi như sau. + Sự hấp phụ: + Sự rửa giải:

(SP)

+ Xi

(SP).Xi + (MP)

= (SP).Xi = (MP).Xi + (SP)

Của quá trình rây phân tử chất phân tích Xi. I.5. Các đại lượng đặc trưng trong HPLC I.5.1.

Các phương trình lưu giữ

- Thời gian lưu giữ : Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc ký , chúng sẽ bị lưu giữ ở trong một cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Đó là thời gian lưu của nó trong hệ cột đã cho. Thời gian này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rữa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Như vậy, nếu gọi tRi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có :

Trong đó: t0 : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chế. t’Ri : là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc ký. Nếu hai chất A và B kế tiếp nhau trong sắc đồ thì chúng ta có : α = ( t’B / t’A ) α được gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B, hay hệ số tách của hai chất đó. Đại lượng α càng lớn thì sự tách của hai chất A và B càng rõ ràng. Còn khi đại lượng này bằng 1, thì không có sự tách sắc ký của hai chất A và B, lúc này hai chất A và B nằm trong một pic sắc ký. Còn nếu α gần bằng 1, thì pic sắc ký của hai chất A và B có chung một vùng. Nghĩa là chúng chập nhau không thể tách thành hai pic riêng biệt đặc trưng cho hai chất đó. - Thể tích lưu : thể tích lưu của một chất là thể tích của pha động chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian kể từ lúc mẫu được bơm vào cột cho đến khi chất tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại; nghĩa là tương đương với thời gian lưu t’Ri. Nếu chất tan không bị lưu giữ trong cột tách thì thể tích lưu của nó sẽ bằng thể tích Vm của pha động chảy qua cột. Như vậy, nếu gọi F (ml/pH) là tốc độ của pha động được bơm qua cột sắc ký, thì chúng ta có: VRo = Vm = tRo . F VRi = F . tRi Hay

VRi = VRo ( 1 + K’i)

Mặt khác ta có : ( Vs + V m ) = V0 10

Trong đó V0 là thể tích trống toàn phần của cột sắc ký, Vs là thể tích thực của pha tĩnh trong cột. Nhưng vì Vm = F . tRo nên chúng ta có : Vs = ( V – F.tRo ) Như vậy, nhờ công thức này chúng ta có thể tính được thể tích thực Vs của pha tĩnh ở trong cột sắc ký. I.5.2.

Hệ số phân bố và hệ số dung tích

Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong quá trình sắc ký. Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng đươc gọi là hệ số phân bố Ki của chất i. Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha động và được tính bằng công thức : Ki = Ci (sp) / Ci Trong đó Ci (sp) và Ci

(mp)

là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và trong pha động.

Hệ số Ki cho ta biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh). Nhưng hệ số Ki chưa nói lên được sức chứa (dung tích) của cột sắc ký. Vì thế người ta phải đưa thêm vào hệ số dung tích K’i . Hệ số dung tích K’i (hay hệ số dung lượng: Capacity coefficient) là chỉ cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố trong mỗi pha là bao nhiêu nghĩa là ta có : K’i = m(Sp) / m(Mp) Nếu trong hỗn hợp mẫu có hai chất A và B thì cũng tương tự như trong khái niệm lưu giữ chúng ta cũng có : α = K’B / K’A = ( tB – t0 ) / ( tA – to ) Như vậy, từ tỷ số của hệ số dung tích (α) của hai chất cũng cho ta biết khả năng tách của hai chất kề nhau trong một hệ sắc ký đã chọn. Ở đây khi α khác càng nhiều thì sự tách của hai chất càng rõ ràng. I.5.3.

Tốc độ tuyến tính của pha động

Trong kĩ thuật HPLC, tốc độ thể tích F ( ml/phút) của pha động luôn liên quan đến tiết diện của cột tách. Vì thế người ta ít dùng khái niệm này, khi xem xét sự di chuyển của một đĩa chất tan trong cột tách, mà thường dùng tốc độ tuyến tính (cm/giây). Khái niệm tốc độ này cho ta biết trong một đơn vị thời gian ( 1 giây hay 1 phút ), thì pha động, hay một đĩa sắc ký của chất tan dịch chuyển được bao nhiêu cm trong cột. Tốc độ này không phụ thuộc vào tiết diện của cột tách và cũng không phụ thuộc vào độ 11

giảm áp trong cột tách theo chiều dài từ đầu cột đến cuối cột. Tốc độ này được tính theo công thức: u = L / t0 Hay ta có : u = F/ ( r2.ET.π) Trong đó L là chiều dài (cm), r là bán kính của cột sắc ký (mm), ET là hệ số về độ xốp của pha tĩnh. I.5.4.

Độ thấm dung môi của pha tĩnh

Để đánh giá một cột tách HPLC có tốt hay không, sau khi nạp người ta phải kiểm tra lại cột theo ba yếu tố: - Số đĩa của cột (hay chiều cao một đĩa). - Độ cân đối của pic sắc ký. - Độ thấm dung môi của hệ pha. Khác với độ cân đối của pic, độ thấm dung môi (pha động) của một hệ pha lại cho chúng ta biết độ ổn định, tính cân bằng và tính lặp lại của hệ pha đó trong quá trình sắc ký. Đồng thời cũng một phần nào mô tả sự diễn biến của các cân bằng phân bố trong hệ pha tốt hay không tốt. Tất nhiên đó chỉ là một tham số, mà thực tế còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến vấn đề này. I.5.5.

Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký

Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm số đĩa N. Đây là một đại lượng, về hình thức có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H. Đây là lớp có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như : - Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh. - Độ xốp, kích thước lỗ xốp của pha tĩnh. - Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (chất phân tích ). - Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký. - Độ nhớt của pha động. Vì thế với một hệ pha nhất định, và trong những điều kiện sắc ký đã chọn thì chiều cao H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan, Chiều cao H này được xác định theo công thức : H = ( L/ 16) . ( W/ tRi )2 12

Đây chính là chiều cao lý thuyết của một đĩa. I.5.6.

Khả năng phân giải

Hai đại lượng H và N đã nói ở trên là các hằng số đặc trưng cho một loại cột tách,nhưng chúng chưa chỉ rõ cho chúng ta biết, hai chất A và B được tách ra khỏi nhau đến mức nào, khi nó được rữa giải ra khỏi cột sắc ký. Vì thế để đánh giá độ tách của các chất trong một hệ pha, người ta còn phải cần thêm đại lượng độ phân giải R và nó được xác định theo công thức : RAB = 2.( t’RA – t’RB )/ ( WA + WB ) ở đây t’RA và t’RB là thời gian lưu hiệu lực của hai chất A và B; còn WA và WB là chiều rộng đáy của pic sắc ký của hai chất A và B. I.5.7.

Độ phát hiện

Độ phát hiện của một chất trong một hệ pha đã chọn là phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau của quá trình sắc ký, cụ thể như : - Thể tích hay lượng mẫu được nạp vào cột tách. - Tính chất và các thông số đặc trưng của pha tĩnh. - Tính chất và thành phần của pha động (có khi cả giá trị pH). - Tốc độ của pha động và kĩ thuật rữa giải. - Độ nhạy của phát hiện của Detectơ và các đặc trưng của nó. - Hệ thống đường ống dẫn (từ van mẫu đến flowcell của Detectơ). - Tính chất của chất phân tích đối với kĩ thuật phát hiện. - Thiết bị để ghi đo tín hiệu của chất phân tích,.... Các yếu tố này đều ảnh hưởng trong những mức độ khác nhau đến độ phát hiện của một chất phân tích. Như vậy, nếu ta chọn được các yếu tố trên ở điều kiện thích hợp nhất, thì chúng chúng ta sẽ có độ nhạy và độ phát hiện tốt nhất, và lúc này độ phát hiện chỉ còn do bản chất của chất phân tích quyết định. I.5.8.

Nồng độ chất tan trong quá trình sắc ký

Trong quá trình sắc ký, nếu ta nạp vào cột tách một thể tích mẫu là VS ml, thì lượng chất phân tích i được nạp vào cột tách đò sẽ là : Qi = VS . Ci S Như thế nồng độ cực đại của chất tan i được rửa giải ra ứng với thời gian lưu tRi sẽ là: Ci, max = Qi / (√2.π.∂vl) 13

Trong đó ∂vl là độ lệch chuẩn theo thể tích của chất tan Xi . I.5.9.

Độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn là một đại lượng đặc trưng cho một pic sắc ký và một quá trình

tách sắc ký của một hỗn hợp. Theo qui luật phân bố Gauxơ, độ lệch chuẩn này được xác định bởi chiều rộng của pic sắc ký ứng với 0,607 chiều cao của pic sắc ký Hmax ... I.6. Cơ chế tách trong phương pháp HPLC: Dựa vào bản chất của pha tĩnh mà có 4 cơ chế : I.6.1

Cơ chế phân bố:

- Pha tĩnh là chất lỏng - Được phủ trên bề mặt của chất mang trơ - Tạo thành một lớp màng mỏng có độ dày 2 – 3 mm trong loại này người ta tiến hành theo hai cách ngược nhau. I.6.2

Cơ chế hấp phụ:

- Pha tĩnh là chất rắn. - Tiến hành theo hai cách ngược nhau. I.6.3

Cơ chế trao đổi ion:

- Pha tĩnh là các chất rắn có chứa các nhóm chức có khả năng trao đổi ion với mẫu phân tích. I.6.4

Cơ chế rây phân tử :

- Pha tĩnh là các hạt chất rắn có kích thước lỗ xốp khác nhau. - Các phân tử mẫu có kích thước nhỏ sẽ chui sâu vào bên trong của lỗ xốp nên được pha động rữa giải ra sau. - Các phân tử mẫu có kích thước lớn nằm ở ngoài nên được rữa giải ra trước.

PHẦN II: HỆ THỐNG HPLC Máy HPLC gồm : bình đựng dung môi , bộ khử khí, Pump cao áp, bộ phận tiêm mẫu ,cột sắc ký , detector, bộ phận ghi tín hiệu , in kết quả.

Van nhiều cổng

He Nơi chích mẫu vào Bình chứa dung môi

Cột bảo vệ Cột sắc ký

Hộp trộn dung môi

Máy in

Đầu dò (Detector)

Bộ khử khí

Máy bơm

Sắc ký đồ

Hệ thống điều khiển

II.1. Bình chứa dung môi giải ly cột Hệ dung môi giả ly cột được hút ra từ hai bình chứa dung môi. Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh. Bình luôn có nắp bảo vệ để không cho bụi rơi vào trong bình, nắp có lỗ hở để bình luôn thông với khí trời. Trong bình có một ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc kí, ở đầu này có gắn ống lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng. Các nhà sản xuất có những bình chuyên dùng để cho nút lọc bằng kim loại nói trên lọt vào một lỗ giếng, bảo đảm đầu ống luôn chạm sát đáy bình, có thể sử dụng đến giọt dung môi cuối cùng trong bình. Trước khi lắp một bình dung môi vào vị trí hoạt động, cần phải loại bỏ phần không khí đã hòa tan vào dung môi trước đó, gọi là khử bọt khí , bởi vì nếu còn lẫn nhừng bọt không khí vào trong luồng dung môi đi vào máy sẽ làm cho máy bơm và đầu dò hoạt động kém hiệu quả.

Nối vào máy bơm

Nút lọc bằng kim loại đặt lọt trong giếng

• Dung môi dùng cho HPLC: Máy HPLC thường sử dụng hỗn hợp 2 loại dung môi hoặc 4 loại dung môi (cần có thiết bị phụ trợ thích hợp có bán sẵn). Tỉ lệ của mỗi dung môi trong hỗn hợp được điều khiển bằng hệ thống điều khiển. Máy bơm hút hai dung môi trong hai bình, đưa vào hợp phối trộn. Dung môi dùng cho HPLC có thể là nước, các loại dung dịch đệm (pha trong nước), metanol, acetonnitril hoặc hỗn hợp các loại trên. Nếu máy sử dụng đầu dò UV, dung môi sử dụng phải trong suốt đối với bước sóng mà đầu dò UV đang hoạt động để phát hiện mẫu chất. Lưu ý : -

Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn HPLC, không có lẫn bụi bẩn. Trước khi gắn vào máy HPLC, dung môi phải được khử không khí và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích.

Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích.

Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền,tạo ra các pic tạp trong quá trình phân tích . Bảng một số dung môi và tính chất của chúng. Tên dung môi

Nhiệt độ sôi

Độ nhớt

Bước sóng hấp thu

(oC)

(mN.S.m-2)

UV (nm)

Pentan

0,24

210

Cyclohexan

0,98

210

Tetraclorur cacbon

0,97

265

Toluen

111

0,59

286

Dietyl eter

0,25

218

Cloroform

0,57

245

Diclorometan

0,44

235

Tetrahidrofuran

0,55

220

2-Butanon

0,32

330

Aceton

0,32

330

1,4-Dioxan

107

1,44

215

Etyl acetat

0,45

255

Dietylamin

115

0,33

275

Acetonitril

0,37

190

2-Propanol

2,50

210

Etanol

1,20

210

Metanol

0,59

210

Nước

100

1,00

II.2. Bộ khử khí (Degasse ) Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra : -

Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian

lưu của pic thay đổi. -

Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có

thể Pump sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động . → Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai. II.3. Bơm cao áp : Mục đích là để bơm một dung môi (pha động) đi xuyên ngang qua một pha tĩnh (được nhồi thật chặt bởi những hạt thật mịn) với một vận tốc không đổi thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Loại bơm của máy HPLC là loại bom đặc biệt với áp suất rất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại 17

Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar). Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút. Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục. Bơm được cấu tạo bằng chất liệu để chịu đựng được dung môi hữu cơ và các dung dịch đệm. Lối ra pha động đến cột Các điệm niêm

Các van kiểm soát Piston Buồng chứa dung môi Lối vào pha động từ bình chứa Bánh cam lệch tâm

Bơm thuận nghịch II.4. Bộ phận tiêm mẫu ( injection) Cho mẫu vào một pha động ở vị trí trên đầu cột là một vấn đề kĩ thuật của máy HPLC vì lúc đó hệ thống đang ở áp suất cao , hơn nữa pha động có thể làm hư hại nút ngăn làm bằng cao su. Máy HPLC có hệ thống chích mẫu đặc biệt: ống chứa mẫu (sample loop), là van có hai cổng, giúp định hướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong hai con đường khác nhau. Khi máy đang hoạt động đều, pha động lỏng đi xuyên ngang qua cột sắc ký nhờ một máy bơm tạo áp suất cao. Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với dung tích của loop là 5- 100 µl.

Có 2 cách đưa mẫu vào trong cột : tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay ) và tiêm mẫu tự động (Autosample). Mẫu khảo sát (ở bên ngoài máy, áp suất thường), được chích vào máy nhờ một kim tiêm (hình 3a). Gạt van theo chiều quy định (hình 3b), ống chứa mẫu được nối thông vào bên trong máy, pha động lỏng thổi ngang qua đoạn ống chứa mẫu, cuốn hết các chất mẫu nằm trong ống đi vào trong máy. Trong khi con đường (A) hoạt động thì đường (B) thông ra không khí bên ngoài máy, được khí thổi sạch để sẵn sang chứa một mẫu mới cho lần phân tích sau. Vào cột

Từ máy bơm

Vào cột Ống chứa mẫu

Từ máy bơm

(A)

(B)

Gió

Gió Ống chứa mẫu

Kim tiêm bơm mẫu vào

II.5. Cột sắc ký : Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. - Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ ,chiều dài cột khoảng 10 -30cm đường kính trong 2,1 – 4,6 mm, cột sắc ký được nhồi thật chặt bởi những hạt nhỏ đường kính ≤ 5µm, đạt tiêu chuẩn > 10.000 mâm lý thuyết/mét (ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt....). -

Với chất nhồi cột cỡ 1.8 -5 µm có thể dùng cột ngắn ( 3-10 cm ) và nhỏ (đường

kính trong 1 - 4.6 mm) lọai cột này có hiệu năng tách cao. - Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký ( trong các dược điển USP 23 ,24 có tiêu chuẩn hóa các lọai cột ). -

Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo) ngoài ra người ta còng dùng các loại hạt khác như: Nhôm Oxit, Polyme xốp, chất trao đổi ion. 19

* Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column).

II.6. Detector ( đầu dò) Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Hoạt động của đầu dò là để theo dõi dòng chảy dung môi giải ly cột để biết khi nào thì các hợp chất đi ra khỏi cột. Mỗi loại đầu dò có một nguyên tắc hoạt động khác nhau nhưng đều phải đạt đến mục đích cuối cùng bằng một tín hiệu điện tử và tín hiệu này phải tỉ lệ với một số tính chất của chất phân tích như: mức hấp thu UV, chỉ số khúc xạ…Mức độ đáp ứng đầu dò phải tỉ lệ với số lượng của mỗi chất phân tích hiện diện trong hỗn hợp mẫu phân tích. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích. A=k.C Trong đó: A : tín hiệu đo được. Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; cường độ phát xạ ,cường độ điện thế ,độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất C : Nồng độ chất phân tích k : hằng số thực nghiệm của detector đã chọn. Sự lựa chọn loại đầu dò tùy vào việc nhà phân tích muốn làm việc nghiên cứu 20

những loại hợp chất nào và các hợp chất đó có các đặc trưng hóa học nào. Từ tính chất các hợp chất muốn phân tích, chọn lọa pha tĩnh của cột sắc kí, loại dung môi giải ly và loại đầu dò tương ứng. Một đầu dò HPLC lí tưởng phải đạt một số tiêu chuẩn sau: -

Độ bền cao, không làm hư hại mẫu phân tích.

Có độ nhạy cao và cho kết quả có tình lặp lại.

Cho đáp ứng tương đồng đối với những chất phân tích có cấu trúc hóa học tương đồng.

Không thay đổi khi có sự thay đổi nhiệt độ, áp suất.

Có thời gian đáp ứng ngắn, độc lập với vận tốc của dòng chảy và dung môi giải ly.

Dễ sử dụng. Thực tế không có một loại đầu dò nào thỏa mãn hết các yêu cầu của một đầu dò

HPLC lí tưởng. Chỉ có đầu dò khối phổ và đầu dò điện hóa là tương đối đạt một số tiêu chuẩn trên. Các loại đầu dò HPLC có thể sắp xếp thành một số loại sau: Đầu dò theo dõi một tính chất hóa học đặc trưng của các chất phân tích mà dung môi giải ly không có tính chất này, nhờ vậy có thể phát hiện sự hiện diện của chất tan khi nó hiện diện ở trong dòng chảy của dung môi giải ly. Các tính chất đó là: sự hấp thu UV (ultraviolet absorbance), hiện tượng huỳnh quang (fluorescence). Đầu dò theo dõi sự hiện diện của một khối vật chất trong dung môi giải ly, khối vật chất đó là hợp chất phân tích: chỉ số khúc xạ (refactive index), hằng số điện môi (dielectric constant). Ví dụ: do sự hiện diện của hợp chất phân tích trong dung môi mà dòng dung môi tại vị trí lúc đầu dò phát hiện sẽ có giá trị chỉ số khúc xạ khác với giá trị chỉ số khúc xạ của dung môi giải ly lúc không có mẫu. Đầu dò kết hợp: tại thời điểm phát hiện, một lượng dung môi có chứa màu được loại bỏ bớt , tiếp theo chất phân tích được phát hiện bằng phương pháp ion hóa ngọn lửa (FID) hoặc bằng khổi phổ ( masse spectroscopy). Thực hiện phản ứng hóa học để điều chế chất dẫn xuất của hợp chất phân tích. Có hai cách: điều chế trước khi mẫu phân tích đi vào cột( precolumn derivatisation) hoặc sau khi mẫu ra khỏi cột (postcolumn derivatisation). 21

II.6.1.

Đầu dò hấp thu tia tử ngoại (UV (Ultraviolet detector).

Lúc khởi đầu, pha động di chuyển ra khỏi cột, sắt ký đồ vạch một đường thẳng còn được gọi là đường nền với mức hấp thu bằng zero. Khi dòng dung môi có mang chất phân tích, chất phân tích sẽ hấp thu UV khiến cho sự hấp thu dòng dung môi thay đổi, ống quang điện làm xuất hiện một pic trên sắc ký đồ. Hệ thống đầu dò gồm: Nguồn sáng. Thiết bị lựa chọn bước sóng. Ống quang điện. Ống chứa dung dịch mẫu phân tích. Bước sóng thường được sử dụng là 245nm. Có thể sử dụng các bộ lọc khác để có bước sóng 220, 313, 334, 365, 436 và 546nm. Việc lựa chọn để đầu dò hoạt động ở bước sóng nào tùy vào sự phân tích loại hợp chất hữu cơ có mức hấp thu mạnh, vượt trội so với những hợp chất khác ở bước sóng đó. → Loại đầu dò này được sử dụng nhiều nhất trong máy HPLC. Ưu điểm: - Không nhạy với nhiệt độ. - Có sự đáp ứng tuyến tính giữa sự hấp thu UV với lượng mẫu chất. Nhược điểm: khá kén chọn loại hợp chất phân tích vì một số loại hợp chất hấp thu UV rất kém. Ví dụ: babiturat, các loại thuốc trừ sâu,... II.6.2.

Đầu dò mạng diod quang (Photodiode array spectrophotometer).

Cho phép quét một cách liên tục quang phổ hấp thu của một chất phân tích đang hiện diện trong dòng chảy của dung môi giải ly, nên không cần phải làm ngưng dòng chảy. II.6.3.

Đầu dò phát huỳnh quang (Fluorescence detector).

Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang. So với đầu dò hấp thu tử ngoại, đầu dò huỳnh quang nhạy hơn, có thể phát hiện hợp chất hiện diện ở hàm lượng 1ng/ml. Có độ chọn lọc cao. Không thông dụng cho máy HPLC. 22

II.6.4.

Đầu dò chỉ số khúc xạ (Refractive index detector).

Ưu điểm: Loại đầu dò này thường thông dụng, vì tất cả hợp chất điều có chỉ số khúc xạ đặc trưng riêng → hiếm khi gặp trường hợp một dung dịch chứa hỗn hợp hợp chất mà không ghi được tín hiệu nào. - Không làm hư hại mẫu phân tích. Nhược điểm: - Độ nhảy cảm trung bình, khoảng 1ppm mẫu trong dung môi. - Không phân tích được hợp chất ở dạng vết. - Nhạy cảm với sự thay đổi nhỏ về nhiệt độ. - Rất khó làm việc khi giải ly cột sắc ký với pha động. II.6.5.

Đầu dò đo độ dẫn điện ( Conductivity detector)

Loại đầu dò này đặc biệt hữu dụng khi thực hiện với loại sắc ký tro đổi ion, với hợp chất được giải ly ra khỏi cột là loại hợp chất ion. Đầu dò cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ. II.6.6.

Đầu dò ampe kế (Amperometric detector).

Đầu dò điện hóa được thông dụng vì nó nhạy, có thể áp dụng để phân tích nhiều loại hợp chất có điện tử linh động. II.6.7.

Đầu dò LC – IR

II.6.8.

Đầu dò LC – MS

Bảng tính chất đặc trưng của một số loại đầu dò Loại đầu dò

Giới hạn

Mức

Nhạy

Hữu ích

Loại mẫu phân tích

Tỉ lệ

phát hiện

tuyến

cảm

với dung

phù hợp

sử

lượng

tính

với tốc

với

môi pha

dụng

mẫu

độ

nhiệt

động

vói

(g/ml)

dòng

độ.

tăng

HPL

phân cực

gradient

(%)

chảy UV

5.10-10

104- 105 Không

Thấp

Có

Hợp chất thơm, dị hoàn. Hợp chất có

nhiều nối đôi liên hợp Photo – diod

> 2.10-10

104- 105 Không

Thấp

Có

Hợp chất thơm, dị

hoàn. Huỳnh quang

10-12

104- 105 Không

Thấp

Có

Vitamin, steroid

Hồng ngoại

10-6

104- 105 Không

Thấp

Có

Hợp chất cacbonyl,

(IR)

Hydrocacbon.

Chỉ số khúc xạ

5.10-7

104- 105 Không

±10-4 0

Đo độ dẫn

Không

Tất cả các loại hợp

chất.

10-8

104- 105

Có

± 10C

Không

Hợp chất ion

10-12

104- 105

Có

± 10C

Không

Hợp chất có độ âm

(điện) Điện hóa

điện mạnh, Catecholamin 10-10

Khối phổ

104- 105 Không Không

Có

Tất cả các loại hợp

chất. Chuyển qua

5.10-7

104- 105 Không Không

Có

FID

Hydrocacbon có thể oxid hóa

II.7. Bộ phận ghi tín hiệu. Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang. Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,thời gian lưu,diện tích của Peak ,chiều cao,... Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứng, hệ số phân giải .... trong quá trình phân tích đồng thời sử lý ,tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: Nồng độ, RSD,... II.8.

In kết quả:

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ.

Phần III : CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký. Chỉ khi lựa chọn điều kiện sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính, định lượng được các mẫu đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quả cao. Trong sắc kí có 3 thành phần tương tác với nhau: pha tĩnh, pha động và chất phân tích. Để có thể tách bằng sắc kí thành công cần chọn điều kiện để cân bằng lực tương tác giữa ba thành phần này. Độ phân cực của các thành phần là chỉ tiêu mô tả định tính lực tương tác. + Với pha tĩnh: dựa vào nhóm thế R của dẫn xuất siloxan. + Với pha động: dựa vào trị số P. + Với chất phân tích: dựa vào nhóm chức. III.1. Pha tĩnh III.1.1.

Các yêu cầu của pha tĩnh sử dụng trong HPLC.

Trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.

Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong điều kiện sắc ký nhất định.

Tính chất bề mặt phải ổn định.

Có độ tinh khiết cao.

Nhanh đạt các cân bằng động học.

Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.

III.1.2.

Các nguyên liệu sử dụng làm pha tĩnh.

Cũng giống như sắc kí khí, có nhiều loại pha tĩnh để nhồi cột HPLC, tuy nhiên đối với HPLC thì pha tĩnh được sử dụng đa dạng hơn. -

Pha tĩnh trên nền Silicagel Si(OH)4.

Pha tĩnh trên nền oxit Nhôm.

Pha tĩnh trên nền hợp chất cao phân tử hữu cơ.(VD: polistiren)

Pha tĩnh trên nền mạch cacbon.

Pha tĩnh trên nền Silicagel và oxit nhôm.

Silicagel được sử dụng nhiều nhất vì có nhiều ưu điểm, khả năng chịu áp suất cao, độ trương nở nhỏ khi thay đổi dung môi, bền nhiệt. III.1.3.

Các loại pha tĩnh trong HPLC 25

a. Pha tĩnh của hệ NP – HPLC Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực. Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước. + Silicagel trung tính. + Bề mặt phân cực (nhóm – OH). + Cỡ hạt: 5-10 µm. + Diện tích xốp: 100-500 m2/g. + Chịu áp: 600 bar. + Ưa nước độ ẩm làm hỏng bề mặt Silicagel này. + Cấu trúc

Pha tĩnh của NP-HPLC

b. Pha tĩnh của hệ RP-HPLC. Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp Ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch Carbon thẳng ( C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay các mạch Carbon vòng (Phenyl- tương đương cột Phenyl )vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít . + Silicagel trung tính đã bị alkyl hóa hởi: ● CH3, -C8H17-, -C18H37● Nhân phenyl (-C6H5-), nhóm –CN… + Bề mặt không hay ít phân cực. 26

+ Cỡ hạt: 5-10 µm. + Diện tích xốp: 100-500 m2/g. + Chịu áp: 600 bar. + Kị nước. + Cấu trúc

Pha tĩnh của RP-HPLC c. Pha tĩnh hệ Iex-HPLC Nền silicagel. Các loại silicagel RP có thêm nhóm chức trao đổi ion như: Nhóm: -SO3H, -NO2H, -RCOOH… trao đổi Cation. Nhóm: -NH2Cl, -R(NH2OH)… trao đổi Anion. Bề mặt có phân cực (ion). Cỡ hạt: 5-10 µm. Diện tích xốp: 100-500 m2/g. Chịu áp: 600 bar. Ưa nước. Cấu trúc:

Các dạng hạt và kiểu xốp của pha tĩnh Nền cao phân tử hữu cơ. + Cũng có trao đổi Cation và Anion + Cỡ hạt: 5-15 µm. + Diện tích xốp: 100-500 m2/g. + Chịu áp: 400 bar. + Cấu trúc:

Pha tĩnh

nền Polime hữu cơ, trao đổi ion (-SO3H) Dạng trao đổi ion axit mạnh

Pha tĩnh nền Polime hữu cơ, trao đổi ion (-SO3H) Dạng trao đổi ion axit mạnh d. Pha tĩnh hệ GEL-HPLC. Pha tĩnh của hệ này thường là: + Silicagel trung tính. + Silicagel đã alkyl hóa. + Cao phân tử hữu cơ, các dầu Silicon… + Cỡ hạt: 5-15 µm. + Diện tích xốp: 100-500 m2/g. + Chịu áp: 400 bar. III.2. Pha động III.3.1.

Vai trò và ảnh hưởng của pha động:

a) Vai trò Sử dụng dung môi có vai trò pha động để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách. b) Ảnh hưởng của pha động Pha động có thể làm thay đổi: + Độ chọn lọc. + Thời gian lưu. + Hiệu năng tách của cột. + Độ phân giải. 29

+ Tính đối xứng của Peak. III.3.2.

Các yêu cầu của pha động sử dụng trong HPLC

Trơ với pha tĩnh và không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học.

Phải hòa tan được mẫu phân tích (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột).

Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column) -

Phải bền vững theo thời gian (không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu).

Có độ tinh khiết cao

Nhanh đạt đến cân bằng trong quá trình tách

Phù hợp với detector sử dụng

Ví dụ: UV - VIS thì dung môi không được hấp thụ quang ( acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang) -

Phải mang lại giá trị kinh tế cho người sử dụng.

Các dung môi được sử dụng làm pha động trong HPLC: -

Dung môi đơn: metanol, acetonitil, benzen, n-hexan, H2O.

Hỗn hợp 2 hay 3 dung môi theo tỉ lệ thích hợp:

+ Hỗn hợp:

MeOH/H2O : 65/45 cho hệ RP

+ Hỗn hợp:

ACN/ H2O : 80/20 cho hệ RP

+ Hỗn hợp:

MeOH/ACN/H2O : 45/25/30 cho hệ RP

+ Hỗn hợp:

n-hexan/ACN : 75/25 cho hệ NP

Dung môi nước có chứa các chất đệm pH, chất tạo phức, chất làm chậm (thường dùng trong HPLC trao đổi ion.)

Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải của dung môi theo bảng sau :

STT

Tên dung môi

Độ phân cực(P)

n-Hexan

0.1

Benzen

2.7

Methylen clorid

3.1

n-propanol

4.0

Tetrahydrofuran

4.0

Ethyl acetat

4.4

Clorofom

4.1

Aceton

5.1

Ethanol

4.3

Acid acetic

6.0

Acetonitril

5.8

Metanol

5.1

Nước

10.2

III.3.3.

Các loại pha động:

a. Cho hệ NP-HPLC + Là các pha động không hay ít phân cực. + Kị nước, không tan trong nước. + Là các dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của chúng. Vd: n-hexan, CH3Cl3, CCl4, Benzen, Etyl-Axetat… b. Cho hệ RP-HPLC + Là các pha động phân cực. + Ưa nước tan tốt trong nước. + Nước là một dung môi của pha động. + Là các dung môi hữu cơ phân cực và hỗn hợp của chúng. + Hỗn hợp của nước và dung môi hữu cơ. + Vd: H2O, MeOH, axeton, ACN… c. Cho hệ IEx-HPLC + Dung dịch đệm PH, có chất tạo phức, thuốc thử hữu cơ. + Dung dịch Axit hay kiềm loãng. 31

+ Là các dung dịch muối của kim loại kiềm. + Vd: ● Dd HNO3 2,5M cho tách các kim loại nặng. ● Dd KCl 0,1M PH = 7, cho tách các kim loại kiềm thổ. d. Cho hệ Gel-HPLC + Là các dung môi hữu cơ hòa tan chất phân tích như : Cl2CH2, Toluen, … III.3. Một số yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trình sắc kí III.3.1.

Ảnh hưởng của cấu trúc mẫu phân tích

Cùng với hai yếu tố quyết định kết quả sự tách là pha tĩnh và pha động thì cấu trúc của mẫu phân tích là yếu tó thứ ba đóng góp vào việc quyết định kết quả tách sắc kí. Trong cấu trúc của mẫu phân tích thì các nhóm thế, số nhóm thế và vị trí của nhóm thế trong phân tử cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự tách sắc kí trong một pha nhất định. Nghĩa là việc này quyết định thời gian lưu của chất phân tích trong cột sắc kí. Xét một cách tổng quát, chúng ta thấy thời gian lưu của một chất tan phụ thuộc vào các yếu tố sau: -

Loại cấu trúc phân tử của chất tan

Nhóm thế, độ lớn và cấu trúc của nhóm thế.

Vị trí nóm thế tỏng phân tử chất tan.

Số nhóm thế trong phân tử chất tan.

Các chất dị tố có trong phân tử chất tan.

Tuy nhiên các yếu tố này ảnh hưởng thế nào đến kết quả phân tích thì còn phải dựa vào mối tương quan giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động trong những điều kiện thí nghiệm nhất định (ví dụ: nếu cùng một chất tan nhưng sử dụng sắc kí pha thường sẽ cho kết quả hoàn toàn khác với sắc kí pha đảo). Một trong các yếu tố quan trọng giúp người tiến hành sắc kí có thể lựa chọn pha động và pha tĩnh phù hợp đó là độ phân cực của các nhóm chức. Nhìn chung độ phân cực của nhóm chức hữu cơ tăng dần theo thứ tự: Hydrocacbon mạch thẳng < olefin < hydrocacbon thơm < dẫn xuất halogen < sunfid < ether < dẫn chất nitro < ester ≈ aldehyd ≈ ceton < alcol ≈ amin < sunfon < sunfoxid < amid < acid cacboxylic < nước. III.3.2.

Ảnh hưởng của thể tích nạp mẫu

Nghiên cứu vấn đề này chúng ta thấy rằng, khi nạp vào cột một thể tích mẫu nhất định nhỏ hơn thể tích giới hạn Vo thì khi lượng mẫu được nạp vào cột tăng thì chiều 32

cao của cột sắc kí cũng tăng thoe tuyến tính. Còn khi lượng mẫu nạp vào là V>Vo thì lúc này xảy ra hiện tượng: -

Chiều cao pic sắc kí không tăng tuyến tính với lượng mẫu.

Độ rộng của pic sắc kí lại tăng rõ rệt khi lượng mẫu tăng vượt quá giới hạn nào đó. Do đó ảnh hưởng rõ rệt đến độ phân giải (sự tách) của hai chất cạnh nhau. Đồng thời lúc này thời gian lưu của chất bị thay đổi chút ít (lớn hơn).

Làm thay đổi chiều cao của đĩa H.

III.3.3.

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ cũng là một yếu tố góp phần ảnh hưởng đến kết quả tách sắc kí của hỗn hợp chất. Nói chung khi tăng nhiệt độ trong một phạm vi nhất định thường làm tốt hơn qua trình tách sắc kí của một hỗn hợp chất trong những điều kiện đã chọn. -

Tác dụng nhiệt làm giảm độ nhớt của pha động, có lợi cho hiệu lực của cột tách.

Khi nhiệt độ tăng thúc đẩy sự diễn biến của các cân bằng trong cột tách.

Khi nhệt độ tăng sẽ làm thay đổi khả năng hấp phụ của pha tĩnh đối với chất tan, nghĩa là làm thay đổi sự lưu giữ của chất tan.

Khi nhiệt độ tăng thường làm tăng độ tan của chất tan trong pha động. Do đó làm thay đổi các cân bằng trong cột tách, ảnh hưởng đến đọ chọn lọc của hệ pha.

Các yếu tố trên làm thay đổi hệ số dung tích Ki của mỗi chất tan trong hỗn hợp mẫu, để cuối cùng làm thay đổi hiệu quả tach sắc kí ứng với mỗi nhiệt độ khác nhau. Qua nhiều thực nghiệm, người ta thấy rằng khi nhiệt đọ cột tách tăng lên 30oC, thì hệ số dung tích Ki của chất tan thường giảm đi từ 1,5-2 lần. Trong thực tế không phải bất kì trường hợp nào khi tăng nhiệt độ ta cũng có thể tách tốt hơn. Bởi vì, nhiệt độ có ảnh hưởng đến sựu tồn tại của chính bản thân chất tan trong hỗn hợp mẫu. Vì thế khi muốn tăng nhiệt độ của quá trình sắc kí cần xem xét cẩn thận theo từng trường hợp cụ thể. Nếu không chúng ta sẽ làm mất chất mẫu hay thành phần của pha động bị phân hủy hay bay hơi, làm sai kết quả sắc kí. Thông thường trong kĩ thuật phân tích HPLC nhiệt độ cao nhất cũng chỉ đến 80oC.

PHẦN IV : TIẾN HÀNH SẮC KÍ IV.1. Các cách tiến hành sắc kí Tuỳ thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc ký cũng như các thao tác tiến hành sắc ký, người ta chia cách tiến hành sắc ký thành ba loại:

IV.1.1.

Phương pháp tiền lưu

Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất. Người ta cho hỗn hợp, ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ. Người ta xác định nồng độ các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột. Đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả gọi là đường cong xuất). Do các cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên trước hết từ cột chỉ chảy ra dung môi. Sau đó trong dung dịch thoát sẽ có cấu tử bị hấp phụ yến hơn trên cột, ví dụ cấu tử A, sau đó đến phần dung dịch chứa hỗn hợp A+B, đường cong thoát theo phương pháp tiền lưu cho trên hình dưới. Trong phương pháp tiền lưu, ta chỉ thu được dung dịch thoát có cấu tử A tinh khiết ở lúc đầu, sau đó là hỗn hợp A+B. Phương pháp tiền lưu không cho phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nên thực tế ít được dùng vào mục đích phân tích các chất.

IV.1.2.

Phương pháp rửa giải

Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột. Các cấu tử A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột. Sau đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột. Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới. Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía dưới 34

nhanh hơn B. Nếu cột đủ dài và chế độ chảy của dung dịch rửa thích hợp thì sau một thời gian cho chảy dung dịch rửa, các cấu tử tách ra thành từng vùng. Các vùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một phần dung môi. Hình bên dưới biểu diễn đường cong thoát của quá trình rửa giải. Trong phương pháp rửa giải, người ta cũng hay dùng những dung dịch chứa một cấu tử có ái lực với cột nhưng phải nhỏ hơn ái lực của các cấu tử cần tách với cột.

IV.1.3.

Phương pháp rửa đẩy

Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách. Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần. Khác với phương pháp rửa giải, nồng độ các cấu tử không giảm qua quá trình sắc ký. Một nhược điểm quan trọng của phương pháp rửa đẩy là rất khó phân biệt các phần riêng của các cấu tử trong dung dịch thoát vì ở đây giữa các phần dung dịch thoát chứa các cấu tử không tách nhau bằng các thể tích dung dịch rửa. IV.2. Chuẩn bị máy Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, 35

năng lượng đèn ....đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra. Đặc biệt, cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký. Ví dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: Rửa bằng MeOH không rửa bằng nước Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước. Trước khi mở máy phải kiểm tra các bình chứa dung môi pha động, nếu mực dung dịch trong bình còn ít quá thì cần thêm dung môi. Đồng thời kiểm tra bình nước thải, nếu đầy thì phải đem đổ. IV.3. Chuẩn bị pha động Pha động trong HPLC được đưa liên tục vào hệ thống. Dung môi sử dụng cho pha động cần phải sạch, có độ tinh khiết nhất định. Trước khi gắn vào máy HPLC, dung môi phải được khử bọt khí, bởi vì nếu còn lẫn bọt khí vào trong luồng dung môi đi vào máy sẽ làm cho máy bơm và đầu dò hoạt động kém hiệu quả. Có thể khử khí bằng cách cho một luồng khí helium xục mạnh vào bình với vận tốc 300ml/phút trong vài phút, bong bóng khí helium sẽ đuổi bọt khí ra khỏi bình. Dung môi bão hòa helium không ảnh hưởng gì đến quá trình sắc kí. Cũng có thể khử khí bằng cách đặt bình đã mở nắp vào bồn siêu âm và cho máy hoạt động trong 5 – 10 phút. Dung môi và đệm cần lọc thật kỹ (dưới lỗ lọc 0,45 µm) đuổi khí pha động; hạn chế dùng đệm, nếu có dùng thì dùng đệm acetate tốt hơn là đệm phosphate. Nếu sử dụng dung môi là nước thì cần phải cẩn thận vì trong môi trường nước vi khuẩn có thể sinh sản, cần thường xuyên thay nước (phòng tránh các hạt gây ra hỏng máy hay tắc đầu cột), có thể dùng sodium azid 0,04 làm chất diệt khuẩn trong nước. Dung môi của Merck có những ưu điểm sau: khi sử dụng không cần phải lọc, không dùng chất ổn định trong dung môi (vì chất ổn định thường tạo tạp), không chứa clo trong dung môi (vì nếu có clo dưới tác dụng của ánh sáng sẽ xảy ra phản ứng làm hỏng cột). Nếu sử dụng dung môi có chất lượng thấp khi chạy máy sẽ xuất hiện những peak lạ và có thể làm nghẹt cột hoặc hỏng máy, vì vậy đối với pha động phải sử dụng dung môi thật sạch và có độ tinh khiết cao. IV.4. Chuẩn bị mẫu

Xử lí mẫu là quá tình hòa tan và phân hủy, phá hủy cấu trúc mẫu ban đầu lấy từ đối tượng cần phân tích, để giải phóng và chuyển hóa chất cần xác định về một dạng đồng thể phù hợp cho một phép đo đã chọn để xác định hàm lượng của chất mà chúng ta mong muốn. Xử lí mẫu có hai quá trình xảy ra đồng thời là: - Phá hủy cấu trúc ban đầu của mẫu. - Hòa tan giải phóng chất cần xác định. Tại sao phải xử lí mẫu phân tích

Để đưa các chất cần xác định về một trạng thái thích hợp cho phép đo, theo phương pháp phân tích đã chọn.

Các kết quả phân tích phải phản ánh và đại diện đúng cho đối tượng cần nghiên cứu, theo dõi.

Với bất kì một phương pháp xác định, mỗi chất cần phân tích chỉ có thể được xác định chính xác khi nó tồn tại ở một trạng thái nhất định và đồng nhất phù hợp với kĩ thuật phân tích.

Mẫu phân tích có nhiều chủng loại, đa dạng, có thành phần đơn giản đến loại có thành phần phức tạp. Chúng có thể tồn tại ở các dạng khác nhau như rắn từng cục, từng mảnh, hay lỏng, khí, huyền phù. Không thể cho nguyên mẫu như thế vào máy để đo và xác định được. Phải xử lí để đưa các chất phân tích về trạng thái phù hợp nhất cho một phưong pháp đã được chon để xác định nó.

Các chất cần xác định tồn tại ở trạng thái liên kết hóa học khác nhau, trong các hợp chất vô cơ, hữu cơ khác nhau, có khi rất bền vững, lượng chất ở mỗi vị trí trong mẫu cũng không đồng đều, nên không thể xác định đúng hàm lượng của nó trong một tổ hợp phức tạp, bền vững và bị các nguyên tố, các chất liên kết khác cản trở, do đó cần phải xử lí mẫu để phá vỡ các hợp chất mà chất phân tích đang tồn tại, đưa chúng sang một dạng phù hợp để định lượng tốt và đúng theo phương pháp đã chọn.

Vậy muốn phân tích một đối tượng nào, chúng ta phải lấy mẫu, xử lí phù hợp để có được một trạng thái hay một dung dịch mẫu phân tích xác định các chất mong muốn. Việc xử lí mẫu theo cách nào, là tùy thuộc vào:

Đối tượng mẫu, matrix của mẫu.

Bản chất, tính chất của các chất cần phân tích 37

Trạng thái tồn tại, cấu trúc vật lí hóa học của các chất trong mẫu.

Phương pháp phân tích được lựa chọn để xác định chúng.

Hàm lượng chất cần phân tích ở mức nào trong mẫu.

Một số kĩ thuật xử lí mẫu phân tích đựơc sử dụng là:

Kĩ thuật vô cơ hóa khô (xử lí khô).

Kĩ thuật vô cơ hóa ướt (xử lí ướt).

Kĩ thuật vô cơ hóa khô – ướt kết hợp.

Các kĩ thuật chiết (lỏng-lỏng, chiết rắn – lỏng, chiết rắn – khí,...)

Các kĩ thuật sắc kí,....

Quy trình xử lí mẫu theo nguyên tắc :

Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường

hợp dung môi pha động được dùng để hòa tan hoạt chất mẫu.

Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động họăc không rửa giải được bằng

cách chiết, lọc. Phải lọc và li tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45µm.

Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể

gây ra ngẽn cột.

Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi,

riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần. Sơ đồ hoạt động của máy sắc kí lỏng

Recorder (7)

1 4

(2) 5 Detector (6)

(3)

Trong đó: (1) Bình đựng dung môi (2) Hệ thống Gradient (3) Bơm cao áp (4) Bộ phận tiêm mẫu (5) Cột sắc kí (6) Detector (7) Bộ phận ghi tín hiệu Nguyên tắc hoạt động: • Hệ thống dung môi (1) đóng vai trò dung môi động được trộn với nhau theo tỉ lệ thích hợp (điều kiển bằng máy tính) và có thể thay đổi thành phần bởi hệ thống Gradient (2) • Pha động được bơm liên tục qua cột tách bằng hệ thống bơm cao áp (3) • Mẫu phân tích được đưa vào cột tách bằng bộ phận tiêm mẫu (4), sau đó được pha động đẩy vào cột tách (5), quá trình tách xảy ra ở đây. • Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào detector (6) thích hợp và được chuyển thành thế hiệu điện rồi được khuếch đại và chuyển đến bộ phận tự ghi và xử lí kết quả ở (7) Khi vận hành máy sắc kí cần lưu ý một số vấn đề sau: Đưa mẫu vào: bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao. Thời gian lưu của mẫu: Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến khi đỉnh (pic) hiển thị rõ nét. Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố: + Áp suất đầu vào + Tính chất của pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt) + Thành phần dung môi + Nhiệt độ cột. Máy dò (Detector): Có nhiều phương pháp để nhận biết các thành phần trong hỗn hợp sau khi đi qua cột. Phương pháp hay được sử dụng là phương pháp hấp thụ tia cực tím (tia UV). Các hợp chất hữu cơ thường hấp thụ tia UV, mỗi chất hấp thụ mạnh nhất đối với một bước sóng nhất định. Chiếu tia UV xuyên qua dòng hỗn hợp ở đầu ra, ở phía đối diện đặt một máy dò ta có thể đo được mức độ hấp thụ tia UV.

Từ đó có thể tính toán nồng độ các chất. Nên nhớ dung môi cũng hấp thụ tia UV, vì vậy nên lựa chọn các bước sóng sao cho thích hợp. Dịch kết quả từ máy dò: Kết quả ra thường gồm một dãy pic, mỗi pic đại diện cho một hợp chất trong hỗn hợp đi qua cột hấp phụ và hấp thụ tia UV. Ta có thể điều khiển điều kiện của cột hấp phụ và thời gian lưu để xác định sự có mặt của các hợp chất. Những tham số điều khiển này đã được đo trước với các mẫu thử. Tuy nhiên, từ các peak này ta còn có thể định lượng được các hợp chất. Giả sử có một hợp chất X. Chúng ta đưa một dung dịch có một lượng hợp chất X đã biết trước vào máy. Từ đó, có thể xác định được thời gian lưu cũng như sự tương ứng giữa khối lượng chất X và hình ảnh của peak. Diện tích bên dưới peak ứng với số lượng chất X đi qua máy dò và diện tích này có thể tính được nhờ máy tính nối với màn hình (như hình sau):

Nếu nồng độ chất X nhỏ hơn trong mẫu, nếu ta vẫn giữ nguyên các tham số máy ta sẽ thu được một peak nhỏ hơn (như hình sau):

Kết quả này là sự so sánh tương đối với mẫu thử nên cũng có nghĩa ta có thể điều chỉnh máy đo để có thể nhận ra các chất có hàm lượng rất nhỏ. Kết hợp với một máy ghi phổ khối: Một máy ghi phổ khối sẽ biến đổi các peak thành các vạch. Từ đó so sánh với dữ liệu có sẵn, chúng ta sẽ biết được sự có mặt của nhiều hợp chất mà không cần quan tâm đến thời gian lưu của chất đó khi đi qua cột hấp phụ.

PHẦN V : CÁC LĨNH VỰC ỨNG DỤNG Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong hầu hết các lĩnh vực với mục đích phân tích định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược phẩm, thực phẩm, môi trường, hóa chất,…Cụ thể là: Phân tích đa lượng vitamin, kháng sinh, kháng khuẩn, chất bảo quản phụ gia thực phẩm, các loại đường,… trong thực phẩm, dược liệu, hóa chất, phân bón, thức ăn gia súc,… Phân tích vi lượng các vitamin trong trái cây, sữa, bánh kẹo, nước, thủy hải sản. Phân tích độc tố sinh học biển trong nghêu (ASP). Phân tích các hoạt chất, tạp chất trong dược phẩm theo các dược điển BP, USP, EP, JP,… Phân tích các acid hữu cơ. Đặc biệt, hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang có độ nhạy và tính chọn lọc cao có thể phân tích các độc tố Mycotoxin trong thực phẩm, nguyên liệu chế biến và thức ăn gia súc như Aflatoxin, Orchatoxin, Zearalenone,… V.1.

Phân tích hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong thủy sản bằng sắc

kí lỏng hiệu năng cao. V.1.1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 µg/kg. V.1.2. Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp số 995.09 Chlortetracyclin, Oxytetracycline, and Tetracycline trong phần ăn được của động vật, quyển I, chương 23, trang 19 - 23 (23.1.17), phương pháp chuẩn của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) ban hành năm 1997. V.1.3. Nguyên tắc Kháng sinh nhóm tetracyclin bao gồm 3 kháng sinh chính sau: tetracyclin (gọi tắt là TC), oxytetracyclin (gọi tắt là OTC) và clortetracyclin (gọi tắt là CTC). Các kháng sinh này trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH 4). Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep - Pak Cartrige C18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết 41

được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn. V.1.4. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử a) Thiết bị, dụng cụ Hệ thống HPLC với đầu dò UV. Cột sắc ký pha đảo C8, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm. Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút (sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml). pH kế ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml. Bình định mức dung tích 10 ml, 100 ml và 1 000 ml. Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml. Phễu Buch-ner đường kính 5,5 cm. Pipet tự động điều chỉnh được từ 2 đến10 ml. Bể siêu âm. b) Hoá chất Ðinatri hidrophotphat khan (Na2HPO4) tinh khiết, loại dùng cho phân tích. Nước cất loại dùng cho HPLC. Axit citric ngậm 1 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích. Ethylenđiamintetraaxetic (viết tắt là EDTA) ngậm 2 phân tử nước tinh khiết, loại dùng cho phân tích. Axít oxalic ngậm 2 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích. Metanol loại dùng cho HPLC. Acetonitril loại dùng cho HPLC. c) Dung dịch chuẩn và dung dịch thử Dung dịch đệm McIlvaine (pH 4,0) gồm:

- Dung dịch A: hoà tan 28,4 g Na2HPO4 khan bằng nước cất trong bình định mức dung tích 1 000 ml. Ðịnh mức tới vạch. - Dung dịch B: hoà tan 21,0 g axít citric bằng nước cất trong bình định mức. Ðịnh mức tới vạch.

Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 1 000 ml dung dịch B. Chỉnh pH tới 4,0 (+/0,05) bằng cách cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1M hoặc dung dịch NaOH nồng độ 0,1M (sử dụng pH kế để xác định pH). Chú ý: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng. Dung dịch đệm McIlvaine – EDTA Hoà tan 60,5 g EDTA vào 1625 ml dung dịch đệm McIlvaine. Chú ý: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng. Dung dịch axit oxalic-metanol: hoà tan 1,26 g axít oxalic bằng metanol trong bình định mức 1000 ml. Ðịnh mức tới vạch. Chú ý: Dung dịch chiết không bền, chỉ pha trước khi sử dụng. Pha động cho HPLC: hoà tan 1,26 g axít oxalíc bằng nước cất trong bình định mức 1000 ml. Ðịnh mức tới vạch. Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril và 166 ml metanol . Lọc và đuổi khí. Chú ý: Dung dịch pha động không bền, chỉ pha trước khi sử dụng. Dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/ml: cân 108 mg mỗi loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC và CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi trong giấy chứng nhận) vào 3 bình định mức dung tích 100 ml riêng biệt. Hòa tan và định mức tới vạch 100 ml bằng metanol. Chú ý: Bảo quản dung dịch tại nhiệt độ -20 0C. Dung dịch bền trong vòng 3 tháng. Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml: hút chính xác 10 ml các dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml. Ðịnh mức tới vạch bằng metanol. Dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml: hút chính xác 2,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức tới vạch bằng metanol. Chú thích: Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần. Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 và 1,00µg/ml: hút chính xác 20, 40, 100, 200, 400 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml vào các bình định mức 10 ml. Thêm 6 ml dung dịch axít oxalic-metanol vào mỗi bình. Ðịnh mức tới vạch bằng nước cất. Chú ý: Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần. 43

V.1.5. Phương pháp tiến hành a) Chuẩn bị mẫu thử Cân 5,00 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh thứ 1. Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống rồi nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể. Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Gạn dịch trong của ống thứ 1 vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2. Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều, ly tâm ống trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút rồi lại gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2. Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều rồi ly tâm ống trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Tiếp tục gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2. Ly tâm ống thủy tinh thứ 2 trong 20 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Sau đó, lọc dịch trong qua giấy lọc trên phễu Buch-ner. Rửa ống ly tâm 2 lần, mỗi lần rửa sử dụng 2 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA. b) Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có các kháng sinh thuộc nhóm TC. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử. c) Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 100 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml vào 5,00 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể.Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử. d) Làm sạch dịch chiết Chuẩn bị cột Nối cột Sep - Pak C18 vào đầu ra của một xi lanh thủy tinh dung tích 100 ml. Thêm lần lượt 20 ml metanol, 20 ml nước cất vào xi lanh thủy tinh. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột. Làm sạch dịch chiết Cho lần lượt các dịch chiết trong ống ly tâm vào các cột Sep - Pak đã được chuẩn bị. Tráng rửa bình chứa bằng 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA. Trong 44

giai đoạn này, các kháng sinh nhóm tetracyclin sẽ được hấp phụ lên bề mặt các hạt rắn chứa trong cột. Chú ý: Không được để cho cột Sep - Pak khô ở giữa hai giai đoạn chuẩn bị cột và làm sạch dịch chiết. Ðiều chỉnh cho dịch chảy ra khỏi cột từng giọt. Cho 20 ml nước cất vào xi lanh thủy tinh và cho chảy qua cột. Loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. Làm khô cột bằng dòng không khí sạch trong 2 phút. Giải hấp các kháng sinh nhóm tetracyclin bằng cách cho 6,0 ml dung dịch axít oxalic-metanol chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/phút. Thu dịch ra khỏi cột vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức tới vạch (thể tích V) bằng nước cất. Tiến hành phân tích dịch thu được trên HPLC. e) Chạy máy Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký :

Cột pha đảo C8, L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.

b. Nhiệt độ cột:

Nhiệt độ trong phòng.

c. Pha động:

Hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitrile.

d. Tốc độ dòng:

1,2 ml/phút.

đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV là 350 nm. e. Thể tích tiêm:

60 µl.

Ổn định cột sắc ký trong 30 phút bằng pha động.

Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính chiều cao pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ (µg/ml) từng loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. Chú ý: Sau khi phân tích xong, làm sạch hệ thống HPLC (bao gồm cả cột sắc ký) bằng hỗn hợp: nước cất - metanol - axetonitrile theo tỷ lệ về thể tích là 7-1-2 trong 30 phút. f)

Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo chiều cao pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. Ðộ thu hồi (R) 45

Ðộ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải lớn hơn 80 %. Ðường chuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995. Ðối với các mẫu chứa ít hơn 0,5 µg/g kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn trên cột C18 chạy cùng chế độ như cột C8 và so sánh thời gian lưu của píc mẫu và píc chuẩn. V.1.6. Tính kết quả Hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.3). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính theo công thức sau: C (µg/kg) = (Y-b)/a.F.1000 Trong đó: - C là nồng độ các kháng sinh có trong mẫu, tính theo µg/kg. - Y là hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết và chiều cao pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài. - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, - F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V và khối lượng mẫu m sử dụng.

V.2.

Xác định hàm lượng Vitamin C trong mẫu ớt bằng sắc ký lỏng hiệu năng

cao V.3.1. Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống máy HPLC với đầu dò UV - Cột RP-18e, kích thước cột LxID: 150x4.6mm, kích thước hạt 5 µm - Cân phân Tích có độ chính xác 0.1 mg - Bình định mức 10ml - Pipet các loại 0.1ml;0.5ml,1ml, 2ml, 5ml, 10ml,… - Ống Hatch - Dụng cụ thuỷ tinh các loại : becher, erlen,… V.3.2. Hoá chất - Nước dùng cho HPLC - Metanol, HPLC - Acid phosphoric , tinh khiết phân tích - Chuẩn Vitamin C V.3.3. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử - Dung dịch acid phosphoric pH = 3: lấy 900ml nước cất, chỉnh pH=3 bằng acid phosphoric. Lọc qua bộ lọc dung môi và đuổi hết bọt khí bằng bể siêu âm. - Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml:cân 10mg (±0.1mg) vitaminC chuẩn vào bình định mức dung tích 10ml. Hoà tan và định mức tới vạch bằng Metanol. - Dung dịch chuẩn 10µg/ml : hút chính xác 0.1ml dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml vào bình định mức 10 ml. Định mức tới vạch bằng dung dịch pha động . - Dung dịch chuẩn 0.5, 1, 5 µg/ml hút chính xác 0.5,1,5 ml dung dịch chuẩn 10µg/ml vào các bình định mức 10ml. Định mức tới vạch bằng dung dịch pha động . V.3.4. Chuẩn bị mẫu Mẫu thuốc: - Nghiền nhuyễn - Cân chính xác khoảng 10mg thuốc đã nghiền cho vào bình định mức 50ml, định mức bằng H2O (pH3), Vorex 1 phút . Lọc (0.45µm). Pha loãng 50 lần dung dịch sau khi lọc rồi tiến hành định lượng trên HPLC. 47

Mẫu ớt: Cân khoảng 1.0g (±0.1g) mẫu thử đã được đồng nhất cho vào bình định mức 50ml. Định mức bằng H2O(pH 3), Vortex 1 phút. Dung dịch thu được sau khi lọc qua giấy lọc 0.45 µm được định lượng trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. V.3.5. Tiến hành phân tích trên HPLC Điều kiện phân tích : - Cột sắc ký : cột pha đảo (3.1.2) - Pha động: Hỗn hợp (metanol: acid phosohoric pH3/5:95) - Tốc độ dòng : 0.7ml/phút - Bước sóng cài đặt cho đầu dò : 254nm Tiêm các dung dịch mẫu thử nghiệm theo thứ tự : - Các dung dịch chuẩn. Dựng đường chuẩn giữa nồng độ các vitamin C và diện tích của các chuẩn Vitamin C. Tính toán hệ số tương quan hồi quy tuyến tính. - Các dung dịch mẫu thử nghiệm. Tính hàm lượng Vitamin C trong dịch chiết (Co) thông qua đường chuẩn xây dựng ở bước trên. Đảm bảo chất lượng : Đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quang hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 99. V.3.6. Tính Kết Quả Hàm lượng Vitamin C (mg/kg) có trong mẫu ớt được tính theo công thức sau:

C  C =  0 .Vdd . f m Trong đó : - C là hàm lượng Vitamin C có trong mẫu, tính theo mg/kg - C0: Hàm lượng Vitamin C Có trong dịch chiết ( Co) thông qua đường chuẩn( mg/l) - f: hệ số pha loãng (nếu có) - m: khối lượng mẫu thử (g) Hàm lượng Vitamin C có trong mẫu , tính theo mg.

 C .V  C =  o dd .Vdd . f  1000  - C : Hàm Lượng Vitamin C có trong mẫu , tính theo mg - Co: Hàm lượng Vitamin C Có trong dịch chiết ( Co) thông qua đường chuẩn, tính theo mg/l - f: hệ số pha loãng (nếu có) - m: khối lượng mẫu thử (g) - M: khối lượng ban đầu của viên thuốc (mg).

V.3.

Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng HPLC.

V.3.1. Thiết bị, dụng cụ Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang. Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ 5 đến 10 [NAD1] µm. Màng lọc mao quản kích thước 0,4 µm. Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút. Bể siêu âm. Hệ thống cô quay chân không. Cột thủy tinh có khóa teflon, kích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8 mm. Ống ly tâm thủy tinh dung tích 250 ml. Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml và 250 ml. Bình định mức dung tích 5 ml và 10 ml. V.3.2. Hóa chất Nước cất loại dùng cho HPLC. Metanol loại dùng cho HPLC. Clorofom loại dùng cho HPLC. Axetonitril loại dùng cho HPLC. n-hexan tinh khiết loại dùng cho phân tích. Ete etylic tinh khiết. Sulfat natri khan. Silicagel cỡ hạt từ 60 đến 200 mesh. Silicagel đã được hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết (4.2.8) để vào tủ sấy trong 2 giờ ở nhiệt độ 110oC. Sau đó để nguội về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm và ngâm trong clorofom 15 phút trước khi nhồi cột. V.3.3. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử - Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 µg/l), B2 (nồng độ 20,0 µg/l), G1 (nồng độ 100 µg/l) và G2 (nồng độ 20 µg/l). 50

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin có nồng độ (như Ðiều 4.3.1) trong metanol từ các ống chuẩn. Tùy theo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng metanol thích hợp. - Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l) và G2 (2,0 µg/l): hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 10 ml rồi định mức tới vạch bằng metanol . - Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian vào các bình định mức 10 ml rồi định mức tới vạch bằng metanol. Các dung dịch chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần lượt như sau:

Chuẩn 1 : B1 (0,0 µg/l), B2 (0,0 µg/l), G1 (0,0 µg/l), G2 (0,0 µg/l).

Chuẩn 2 : B1 (1,0 µg/l), B2 (0,2 µg/l), G1 (1,0 µg/l), G2 (0,2 µg/l).

Chuẩn 3 : B1 (2,0 µg/l), B2 (0,4 µg/l), G1 (2,0 µg/l), G2 (0,4 µg/l).

Chuẩn 4 : B1 (4,0 µg/l), B2 (0,8 µg/l), G1 (4,0 µg/l), G2 (0,8 µg/l).

Chuẩn 5 : B1 (8,0 µg/l), B2 (1,6 µg/l), G1 (8,0 µg/l), G2 (1,6 µg/l).

Chuẩn 6 : B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l), G2 (2,0 µg/l). - Dung dịch pha động: pha hỗn hợp các dung môi axetonitril, metanol và nước

cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 6. V.3.4. Phương pháp tiến hành. a.

Chuẩn bị mẫu thử − Dùng cân phân tích (4.1.5) cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.10). − Thêm 100,0 ml clorofom (4.2.3) vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.1.6) trong khoảng 5 phút ở tốc độ 5 000 vòng/phút. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom rồi cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.11).

Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có aflatoxin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử.

Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

- Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể. Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử . Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng. d.

Làm sạch dịch chiết − Chuẩn bị cột − Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon. Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g sulfat natri khan, 20,0g silicagel đã hoạt hóa, 15 g sulfat natri khan. Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm. − Làm sạch dịch chiết

Cô dịch chiết thu được trên hệ thống cô quay chân không còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40 oC. Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu vào cột làm sạch đã chuẩn bị và tráng rửa bình cầu bằng clorofom. Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel. Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan, 50,0 ml ete etylic. Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 1,0 ml/phút. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc dộ 1,0 ml/phút. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml. Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không ở nhiệt độ 40o C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml dung dịch pha động trong bình định mức 5 ml. Tiến hành phân tích hàm lượng các aflatoxin trên HPLC. Tiến hành làm sạch mẫu trắng và mẫu để xác định độ thu hồi giống như với mẫu thử. Tiến hành phân tích trên HPLC

− Ðiều kiện phân tích:

Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt 5 - 10 [NAD2] µm.

Nhiệt độ cột : 35oC. 52

Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol và nước cất.

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm.

Thể tích tiêm : 20 µl.

* Các bước: − Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). − Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng và dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. f.

Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

− Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm − Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. − Ðộ thu hồi (R) − Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã cho vào một lượng dung dịch aflatoxin chuẩn đã biết hàm lượng chính xác (5.3). Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %. − Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. V.3.5. Tính kết quả Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được. Với đường chuẩn ở dạng y = ax +b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công thức sau: C (µg/kg) =[ (Y- b)/a]*F Trong đó: - C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu, tính theo µg/kg

- Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b - F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V và khối lượng mẫu m sử dụng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.

Phương pháp cô lập hợp chât hữu cơ – Nguyễn Kim Phi Phụng – ĐHQGTPHCM

Hóa phân tích tập 2 – Phân tích dụng cụ - Nhà xuất bản y học

http://www.youtube.com/watch?v=BYg2xcESAKs&feature=related

http://www.bme.vn/bmevn/bme/trac-nghiem/huong-dan/96

http://kiemnghiemthucpham.blogspot.com/2011/01/28-tcn-177-2002-ham-luongthuoc-khang.html

Tailieu.vn

www.violet.com.vn

Phân tích hóa lí – Hồ Viết Quý