NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN TRONG TRANSFEROSOME BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO by Dạy Kèm Quy Nhơn Official

ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN TRONG TRANSFEROSOME

vectorstock.com/24597468

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN TRONG TRANSFEROSOME BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

OF FI

HỌC VIỆN QUÂN Y

NH ƠN

TRẦN THANH MAI

QU Y

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN TRONG TRANSFEROSOME BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

DẠ Y

KÈ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

HÀ NỘI - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

OF FI

HỌC VIỆN QUÂN Y

NH ƠN

TRẦN THANH MAI

QU Y

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN TRONG TRANSFEROSOME BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Dược học

DẠ Y

KÈ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Người hướng dẫn khóa luận: TS. Nguyễn Văn Bạch

HÀ NỘI - 2022

LỜI CẢM ƠN

OF FI

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, ban Giám đốc Học viện Quân y, phòng Đào tạo, hệ quản lý học viên Dân sự, trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược, các khoa, phòng ban chức năng đã hết sức quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập trong suốt 5 năm qua cũng như thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Bạch – Giảng viên Bộ môn Kiểm nghiệm – Độc chất. Cảm ơn các thầy vì trong suốt thời gian làm khóa luận đã luôn quan tâm và hướng dẫn tận tình giúp tôi hoàn thành khóa luận.

NH ƠN

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Trịnh Nam Trung và toàn thể các thầy giáo, cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Kiểm nghiệm – Độc chất cũng như các bộ môn khác thuộc trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân y đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được tiến hành nghiên cứu, học tập để hoàn thành khóa luận này.

QU Y

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã đồng hành, ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày

tháng năm 2022

DẠ Y

KÈ

Sinh viên

Trần Thanh Mai

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................. 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ KETOPROFEN ................................................ 2

OF FI

1.1.1. Công thức hoá học .................................................................... 2 1.1.2. Tính chất vật lý, hóa học........................................................... 2 1.1.4. Dược động học .......................................................................... 6 1.1.5. Tác dụng dược lý ...................................................................... 6 1.1.6. Chỉ định và liều dùng ................................................................ 6

NH ƠN

1.1.7. Tác dụng không mong muốn và chống chỉ định ...................... 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ............... 7 1.2.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................... 7 1.2.2. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký ............................ 7 1.2.3. Cấu tạo về hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................ 8

QU Y

1.2.4. Xây dựng phương pháp định lượng .......................................... 8 1.2.5. Thẩm định phương pháp định lượng bằng HPLC .................. 12 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ............................................ 16 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 16

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ................................................................... 16

KÈ

2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất nghiên cứu................................. 16 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................. 17 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu........................................... 17

DẠ Y

b. Thời gian thực hiện khóa luận: ................................................. 17 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 17 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng ........................................ 17

2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng ...................................... 19 2.2.3. Định lượng KETO trong transferosome ................................. 23

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................... 24 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ............... 25

OF FI

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................ 25 3.1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng ........................... 25 3.1.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng phân tích ............................. 25 3.1.1.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động ............................ 26

NH ƠN

3.1.1.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng........................................... 28 3.1.1.4. Kết quả khảo sát dung môi hòa tan mẫu thử ................... 30 3.1.2. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng bằng HPLC ...... 32 3.1.2.1. Tính tương thích của hệ thống ......................................... 32 3.1.2.2. Độ đặc hiệu ...................................................................... 33 3.1.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ................................. 35

QU Y

3.1.2.4. Độ đúng............................................................................ 36 3.1.2.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng .......................... 37 3.1.2.6. Độ lặp lại, độ chụm trung gian ........................................ 38 3.1.3. Kết quả định lượng KETO trong transferosome .................... 40

3.2. BÀN LUẬN ................................................................................... 41

KÈ

KẾT LUẬN ........................................................................................... 46 1. Về xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong transferosome .............................................................................................. 46

DẠ Y

2. Về thẩm định phương pháp đã xây dựng theo hướng dẫn của ICH ..................................................................................................................... 46 KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 47

DẠ Y

KÈ QU Y NH ƠN

OF FI

STT

Tên bảng

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang

Tổng hợp một số nghiên cứu về định lượng KETO bằng HPLC

2.1

Các nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

2.2

Dãy dung dịch chuẩn KETO

2.3

Dãy dung dịch thử thêm chuẩn

3.1

Lựa chọn thành phần pha động

3.2

Lựa chọn tốc độ dòng

3.3

Kết quả khảo sát dung môi hòa tan mẫu

3.4

Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký

3.5

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của Spic vào nồng độ dung dịch

3.6

Kết quả độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn

3.7

Kết quả khảo sát độ đúng

3.8

Kết quả khảo sát LOD và LOQ

3.9

Kết quả khảo sát độ lặp lại

QU Y

NH ƠN

OF FI

1.1

16 21 22 26 28

3.11 Hàm lượng KETO xác định được trong 2 ngày

3.10 Kết quả khảo sát độ chụm trung gian

DẠ Y

KÈ

3.12 Kết quả định lượng KETO trong transferosome

Tên hình

Trang

STT

DANH MỤC CÁC HÌNH

Công thức cấu tạo của ketoprofen

1.2

Đồ thị phương pháp thêm đường chuẩn

3.1

Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch KETO 20 µg/ml

3.2

Sắc ký đồ KETO chuẩn pha động Mb 2

3.3

Sắc ký đồ KETO chuẩn pha động Mb 3

3.4

Sắc ký đồ KETO chuẩn pha động Mb 1

3.5

Sắc ký đồ KETO chuẩn với tốc độ dòng 1,2 ml/phút

3.6

Sắc ký đồ KETO chuẩn với tốc độ dòng 0,8 ml/phút

3.7

Sắc ký đồ KETO chuẩn với tốc độ dòng 1,0 ml/phút

3.8

Sắc ký đồ dung môi hòa tan mẫu thử MeOH

3.9

Sắc ký đồ dung môi hòa tan mẫu thử EtOH 96%

NH ƠN

OF FI

1.1

2 11

27 27

3.11 Sắc ký đồ mẫu trắng MeOH

3.12 Sắc ký đồ dung dịch KETO chuẩn 20 µg/ml

3.13 Sắc ký đồ dung dịch KETO thử 20 µg/ml

3.14 Sắc ký đồ dung dịch placebo

QU Y

3.10 Sắc ký đồ dung môi hòa tan mẫu thử ACN

Đồ thị biểu thị sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của KETO

KÈ

DẠ Y

3.15

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitril

ADR

Adverse Drug Reaction (tác dụng không mong muốn của thuốc)

AOAC

Association of Official Analytical Chemists (hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống)

EtOH

Ethanol

HPLC

High – performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao)

ICH

The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human use (hội nghị Quốc tế và Hài hòa hóa các Thủ tục đăng ký Dược phẩm sử dụng cho người)

KETO

LOD

LOQ

Mobile phase (pha động)

MeOH

Methanol

RSD

USFDA

USP

DẠ Y

OF FI

QU Y

NH ƠN

Dung dịch

KÈ

Viết tắt

Viết đầy đủ

Ketoprofen

Limit of Detection (giới hạn phát hiện ) Limit of Quantifitation (giới hạn định lượng)

Phụ lục Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương đối) U.S Food and Drug Administration (cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ) United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

ĐẶT VẤN ĐỀ

QU Y

NH ƠN

OF FI

Ketoprofen là dẫn chất của acid propionic thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs). Hiện nay, ketoprofen là một trong những thuốc được dùng để điều trị viêm xương khớp với nhiều dạng bào chế: viên nén, viên nang, viên nang giải phóng kéo dài, gel, … Tuy nhiên, trên những bệnh nhân dùng liều cao hoặc dùng thuốc kéo dài, thuốc có thể gây tác dụng không mong muốn. Vì vậy, để giảm tác dụng phụ cũng như tránh chuyển hóa qua gan lần đầu thì một phương pháp đang được các nhà khoa học mong đợi đó là đưa thuốc qua da. Tuy nhiên, đây là dược chất kém tan và bị hạn chế bởi khả năng thấm qua hàng rào bảo vệ của da. Để cải thiện khả năng hấp thu và tăng cường điều trị hướng đích, trách ảnh hưởng đến các mô lành xung quanh, người ta dành sự quan tâm cho việc thiết kế các chế phẩm chứa ketoprofen ở dạng transferosome. Transfersome là hệ thống mang thuốc được thiết kế đặc biệt để có ít nhất một nhân nước được bao bọc bởi một lớp kép lipid, cùng với một chất diện hoạt. Nhân nước được bao bọc bởi một lớp lipid kép giúp cho cấu trúc Transfersome có tính chất siêu biến dạng nên có khả năng tự tối ưu hóa và tự điều chỉnh hình dạng khi đi qua màng. Theo đó, transfersome có tính chất đàn hồi và vì vậy có thể dễ dàng biến đổi hình dạng và giữ nguyên tính chất khi co lại khi đi qua các lỗ chân lông hẹp hoặc chỗ co thắt của da có đường kính nhỏ hơn nhiều lần so với kích thước của transfersome. Tuy nhiên, trong DĐVN V và Dược điển các nước chưa có chuyên luận về định lượng ketoprofen trong transferosome.

KÈ

Với thực trạng đó, cần xây dựng phương pháp định lượng cụ thể, khoa học, góp phần đánh giá chất lượng các thuốc có chứa ketoprofen trong transferosome trên thị trường. Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu định lượng ketoprofen trong transferosome bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện nhằm những mục tiêu sau:

DẠ Y

1. Xây dựng được phương pháp định lượng ketoprofen trong transferosome. 2. Thẩm định được phương pháp đã xây dựng theo hướng dẫn của ICH

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ KETOPROFEN

1.1.1. Công thức hoá học

OF FI

- Công thức cấu tạo:

NH ƠN

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ketoprofen - Công thức phân tử: C16H14O3. - Khối lượng phân tử: 254,28.

- Tên khoa học: (±)-m-benzoylhydratropic acid [1, 2]. 1.1.2. Tính chất vật lý, hóa học

- Bột kết tinh trắng hoặc gần trắng, nhiệt độ nóng chảy 93-96°C [3].

QU Y

- Độ tan: Ketoprofen (KETO) thuộc nhóm II với độ tan kém và khả năng thấm tốt [4]. KETO thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, ethanol 96% và methylen clorid [5]. Độ tan trong nước ở 22-24°C là 0,01mg/ml [6]; ở 37°C là 0,253 mg/ml [7]. KETO có bản chất là acid yếu, trong môi trường nước ở 25°C có pKa 4,39 [8]. Độ tan tăng khi tăng pH môi trường hòa tan, độ tan trong dung dịch đệm pH 7,4 > 1,4 mg/mL [9].

DẠ Y

KÈ

- Độ ổn định: KETO không bền bởi độ ẩm và ánh sáng, ổn định ở nhiệt độ phòng. Khi hòa tan KETO trong ethyl acetat, bảo quản vài tuần ở 4°C hoặc đun nóng trong dung dịch acid pH 1 ở 98°C trong 30 phút không phát hiện thấy sự phân hủy [10]. 1.1.3. Một số phương pháp định lượng Ketoprofen - Phương pháp chuẩn độ thể tích: Có thể định lượng KETO bằng phương pháp chuẩn độ acid – base, phát hiện điểm tương đương bằng phương

pháp đo điện thế hoặc bằng chỉ thị đỏ phenol. Phương pháp này thường áp dụng trong định lượng KETO nguyên liệu [11].

OF FI

- Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến: KETO có bước sóng hấp thụ cực đại ở 258 nm trong methanol 75%. Nên có thể định lượng KETO trong chế phẩm bào chế bằng cách hòa tan hoàn toàn một lượng chế phẩm trong methanol 75% sao cho đạt nồng độ KETO 0,005 mg/ml và đo độ hấp thụ tại bước sóng 258 nm [11]. - Phương pháp điện di mao quản: Phương pháp này ứng dụng để định lượng KETO trong huyết tương và tách đồng phân của KETO [12].

NH ƠN

- Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ: Nguyên tắc nghiên cứu các chất bằng các đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định, với KETO sử dụng kỹ thuật ion hóa điện tử. Phương pháp này được sử dụng để phân tích định lượng các chất đối quang KETO trong nước bọt [13].

DẠ Y

KÈ

QU Y

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: KETO ít phân cực, cần chọn pha động phân cực mạnh để rửa giải, phù hợp với kỹ thuật HPLC pha đảo. Một số công trình công bố về định lượng KETO bằng phương pháp HPLC được thể hiện ở bảng 1.1.

L A I C I F

Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu về định lượng KETO bằng HPLC Mẫu nghiên cứu Gel 25 mg/ 1 g

Cột

Pha động

HP ODS Hypersil (100 × 3,9 mm, 5 µm)

Đệm phosphat (pH 2,2; 0,01 M) : ACN (60/40)

Viên nang profenid 50 mg

C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm)

Viên nang giải phóng kéo dài

IC Chiralpak (250 × 4,6 mm, 5 μm)

75mg

Viên nang 50mg

LOD

LOQ

1,2 ml/phút

0,05

0,16

1ml/phút

MeOH 0,1 M : đệm amoni acetat pH 6,9 : ACN : tetrahydrofuran (73/20/5/2)

µg/ml

0,031 0,500

10 µl

0,1

0,5

20 µl

µg/ml

Thời gian lưu

Detector

Tác giả

UV 261nm

Özlü C. và CS [14]

Andraws G. và CS [15]

9,414 phút

254 nm

14,8

phút

268 nm

3,49

phút

230 nm

mg/ml 0,025 0,5 mg/ml

1ml/phút

F O

µg/ml

0,8 ml/phút -

Khoảng tuyến tính 7,5 - 75 µg/ml

N Ơ H N

20µl

Y U

n-hexan : isopropanol (90/10, 0,1% acid trifluoroacetic)

M È K

LiChrosorb C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm)

Y Ạ D

Cetrimid 10-3 M : ACN (50/50) điều chỉnh pH 10,0 với NH4OH

Tốc độ dòng, thể tích tiêm

5,00100,0 μg/ml

Zhou J. và CS [16]

Tsvetkova B. và CS [17]

Viên nang ketoprofen, omeprazol

Phenomenex Luna C18 (150 × 4,6 mm, 5 μm)

KH2PO4 0,01 M (đệm phosphat) + 3 ml triethanolamin (điều chỉnh pH 7,0 bằng H3PO4)

Viên nang giải phóng kéo dài

250 × 4,6 mm, 5 μm

ACN : H2O : acid acetic băng (90/110/1)

Gel 2,5%

Kromasil 100 C18 (250 × 4 mm, 5 μm)

ACN : đệm phosphat 0,01 M điều chỉnh đến pH 1,5 bằng H3PO4 85% (60/40)

Y Ạ D

M È K

0,048

µg/ml

0,8ml/phút 10 µl

N Ơ H N

0,14 – 0,58 μg/ml

F O

25,73

phút

233 nm

1,2 ml/phút

1 ml/phút 100 µl

0.003 µg/ml

0.02 µg/ml

Koppala S. và CS [18]

UV -

20 µl

Y U

0,015

L A I C I F

USP 41 [2] 254 nm

0,02 - 40 μg/ml

3,72

phút

260 nm

De Jalón E. G. và CS [19]

1.1.4. Dược động học

- Hấp thu: KETO hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa. Nồng độ đỉnh trong huyết thanh tương ứng theo thứ tự xuất hiện ở khoảng 0,5-2 giờ, thức ăn không làm thay đổi sinh khả dụng nhưng làm chậm tốc độ hấp thu của KETO.

OF FI

- Phân bố: KETO gắn vào albumin với tỉ lệ trên 99%, phân bố nhiều vào dịch khớp, đạt tối đa 30% nồng độ so với trong huyết tương, dạng tự do trong dịch khớp cao hơn trong huyết tương. - Chuyển hóa: KETO bị chuyển hóa ở gan thông qua phản ứng liên hợp với acid glucuronic và được bài tiết chủ yếu qua nước tiểu.

1.1.5. Tác dụng dược lý

NH ƠN

- Thải trừ: Nửa đời thải trừ sau khi uống viên nang thông thường và viên nang giải phóng kéo dài theo thứ tự là 2 – 4 giờ và 5,5 – 8 giờ [20].

QU Y

- KETO là thuốc chống viêm không steroid, dẫn xuất của acid propionic có hai dạng đồng phân đối quang. Đồng phân dạng S-(+) dexketoprofen có tác dụng giảm đau mạnh hơn gấp hai lần KETO. KETO ức chế COX không chọn lọc (COX-1, COX-2) nên làm giảm tổng hợp prostaglandin. - Thuốc ức chế COX-2 nên có tác dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt. KETO còn ức chế COX-1 gây ra các tác dụng không mong muốn trên tiêu hóa, thận, thời gian chảy máu [20]. 1.1.6. Chỉ định và liều dùng

KÈ

- Viêm khớp dạng thấp cấp hoặc mạn hoặc viêm xương khớp hoặc những bệnh cơ xương: Người lớn: 50mg/lần, ngày 4 lần hoặc 75mg/lần, ngày 3 lần. Có thể tăng liều tới 75 mg/lần, nhưng không được vượt quá 75 mg/lần.

DẠ Y

- Đau và thống kinh: Đau nhẹ, đau vừa hoặc thống kinh: Mỗi lần 25 hoặc 50 mg, cách 6 - 8 giờ uống một lần nếu thấy cần thiết, có thể tăng liều tới 75 mg/lần, nhưng không được vượt quá 75 mg/lần [20, 21].

1.1.7. Tác dụng không mong muốn và chống chỉ định

- Tác dụng không mong muốn: rối loạn tiêu hóa, bất thường các giá trị xét nghiệm chức năng gan, đau đầu, khó tiêu, chướng bụng, đau thượng vị, buồn nôn, ...

OF FI

- Chống chỉ định: Quá mẫn với KETO hoặc bất cứ thành phần nào của thuốc. Không được dùng KETO cho những người loét dạ dày, loét hành tá tràng, co thắt phế quản, hen, … [20,21]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao

NH ƠN

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động là chất lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà phương pháp này phù hợp với các chất không bền với nhiệt, không bị phân hủy khi sắc ký.

QU Y

1.2.2. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký * Thời gian lưu (tR): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó. Thời gian lưu của mỗi chất hằng định và các chất khác nhau thì giá trị này sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký [11].

KÈ

* Hệ số phân bố (k): là tỷ số nồng độ chất phân tích giữa hai pha. Khi k càng lớn, thì nồng độ chất ở trong pha tĩnh càng nhiều, chất di chuyển càng chậm và ngược lại [2].

DẠ Y

* Hệ số dung lượng (k’): cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2 pha cộng với sức chứa cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động trong thời điểm cân bằng. Khoảng tối ưu từ 1 đến 5 [11]. * Hệ số bất đối xứng (AF): Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ. Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2. Giá trị của nó càng gần 1 thì pic càng cân đối [22]. 7

* Số đĩa lý thuyết (N): Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột. Hiệu lực tách của cột sẽ tăng khi số đĩa lý thuyết càng lớn và chiều cao đĩa càng nhỏ. Với điều kiện sắc ký xác định thì giá trị này cũng xác định. N tối ưu từ 2500 đến 5000 [23, 24].

OF FI

* Độ phân giải (Rs): Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Thực tế nếu pic cân đối thì Rs tối thiểu là 1,5. Tốt nhất Rs > 2 để phân biệt giữa pic của hợp chất mục tiêu và pic liền kề gần nhất (tạp chất, chất pha loãng, thành phần phân tách, chất nội chuẩn, …) theo hướng dẫn của ICH [25]. 1.2.3. Cấu tạo về hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

NH ƠN

Hệ thống HPLC gồm các bộ phận: bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy tích phân hoặc máy ghi [26]. 1.2.4. Xây dựng phương pháp định lượng a. Chuẩn bị dung dịch thử

QU Y

Xử lý mẫu nghiên cứu là một trong những giai đoạn tối quan trọng đảm bảo tính chính xác của kết quả nghiên cứu. Việc xử lý mẫu đề cập đến kỹ thuật xử lý mẫu rắn/lỏng để chiết xuất hoặc tách chiết thành mẫu có thể phân tích được. Có một số kỹ thuật xử lý mẫu dược phẩm tiêu biểu như: chiết pha rắn, chiết lỏng/lỏng, chiết lỏng siêu tới hạn, vi chiết pha rắn, … Cơ bản xử lý mẫu sẽ bao gồm các bước sau nghiền → chiết xuất → pha loãng → lọc. Với

DẠ Y

KÈ

mẫu rắn người ta thường nghiền tay hoặc nghiền máy. Sau đó, các kỹ thuật chiết xuất sẽ được áp dụng phù hợp với từng loại mẫu. Với mẫu dạng hỗn dịch, hay sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn hoặc chiết lỏng/lỏng. Với dược chất thân nước, dung môi dùng để chiết có thể là nước, hoặc hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ phụ thuộc vào pKa của dược chất. Dung môi chiết xuất phải có khả năng hòa tan dược chất và tương thích với pha động trong kỹ thuật HPLC [27]. Chú ý đánh giá ảnh hưởng của đệm, pH, nhiệt độ, lực lắc, tần số siêu âm, … đến dược chất trong mẫu. Thời gian chiết tối ưu là dưới 30 phút, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm [28].

b. Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần [11].

OF FI

c. Điều kiện sắc ký

NH ƠN

* Lựa chọn pha tĩnh (chọn cột): cột có bản chất là chất rắn, xốp, kích thước hạt nhỏ, đồng nhất, không được thay đổi bản chất nhóm thế trong pha tĩnh. Đường kính hạt từ 3 – 10 µm, cho phép giảm 50%, không được phép tăng với sắc ký lỏng đẳng dòng và không được thay đổi với sắc ký lỏng rửa giải gradient. Yêu cầu pha tĩnh là trơ, bền vững với môi trường sắc ký, có khả năng tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng động học của sự tách xảy ra nhanh và lặp lại tốt. Thông thường ta dùng 2 loại: cột pha thường (NP) silicagel trung tính chuyên tách các chất có độ phân cực kém và trung bình, cột pha đảo (RP) silicagel đã alkyl hóa, dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion. Kích thước cột có thể điều chỉnh chiều dài ± 70%, đường kính trong ± 25%.

KÈ

QU Y

* Lựa chọn pha động: là dung môi dùng để rửa giải các chất cần phân tích ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký, góp phần quyết định hiệu suất tách. Pha động phải trơ với pha tĩnh, hòa tan được chất mẫu, ổn định theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. Lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh ± 30% nồng độ tương đối hay ± 2% nồng độ tuyệt đối tùy theo khoản giá trị nào lớn hơn. Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối. Trong sắc ký pha thuận, pha động có thể là dung môi hữu cơ ít phân cực như n-hexan, benzene, n-hepta, … Trong sắc ký pha đảo, pha động thường là hệ dung môi hữu cơ ít phân cực như nước, MeOH, ACN hay hỗn hợp của chúng, …

DẠ Y

* Chọn tốc độ dòng: sau khi chọn được pha động, pha tĩnh phù hợp thì cần chọn tốc độ dòng để quá trình tách được tốt hơn. Yêu cầu tốc độ dòng không quá lớn tránh tạo áp suất cao trong cột, gây tổn hại cột và cho thời gian lưu của chất phân tích hợp lý, có thể thay đổi ± 50%. Khi kích thước cột thay 9

. Trong đó F2, F1

đổi, tốc độ dòng điều chỉnh theo công thức F2 = F1

lần lượt là tốc độ dòng thực tế và tốc độ dòng trong chuyên luận, l2, l1 lần lượt là chiều dài cột thực tế và trong chuyên luận, d2, d1 lần lượt là đường kính trong thực tế và trong chuyên luận.

OF FI

* Chọn đệm pH: trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính acid hay base thường phải thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký, nồng độ muối trong pha đệm được thay đổi ± 10%. Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký. Điều chỉnh thay đổi ± 0,2 đơn vị pH trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận hoặc thay đổi ± 1,0 đơn vị pH khi nghiên cứu chất không ion hóa [11, 26].

NH ƠN

d. Xây dựng công thức tính toán

* Phương pháp chuẩn ngoại: hai mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích hoặc chiều cao pic của hai mẫu sẽ tính được nồng độ các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm và chuẩn hóa nhiều điểm. Chuẩn hóa 1 điểm: nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ nồng độ mẫu thử

QU Y

Nồng độ mẫu thử = Nồng độ mẫu chuẩn ×

KÈ

Chuẩn hóa nhiều điểm: chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ liên tiếp, tiến hành sắc ký thu diện tích (chiều cao) pic tại mỗi điểm chuẩn. Vẽ biểu đồ tương quan giữa diện tích S (chiều cao H) pic với nồng độ C của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ chất trong mẫu thử. Có thể dựa vào sơ đồ hoặc xây dựng phương trình hồi quy.

DẠ Y

* Phương pháp chuẩn nội: khắc phục được nhiều nhược điểm và cực tiểu hóa được sai số do máy móc và kỹ thuật. Tiến hành: người ta thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất tinh khiết bằng nhau gọi là chất chuẩn nội, tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Hệ số đáp ứng FX =

- mC và mIS là khối lượng của chất chuẩn và chuẩn nội 10

- SC và SIS là diện tích pic của chất chuẩn và chuẩn nội mIS

FX, CT =

CIS

Phương pháp chuẩn 1 điểm: mT =

- CC và CIS là nồng độ của chất chuẩn và chuẩn nội

OF FI

* Phương pháp chuẩn nhiều điểm: chuẩn bị một dãy chuẩn có nồng độ chất chuẩn liên tiếp nhưng chung một lượng chuẩn nội. Tiến hành sắc ký, vẽ đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỉ số diện tích pic của chuẩn trên chuẩn nội và tỷ số nồng độ của chuẩn trên chuẩn nội. Tiến hành song song với mẫu thử, dựa vào đường chuẩn để xác định nồng độ mẫu thử.

NH ƠN

* Phương pháp thêm chuẩn: xử lý mẫu thử và sắc ký. Thêm vào mẫu thử một lượng đã biết chất chuẩn tương ứng, xử lý mẫu và sắc ký. Nồng độ chưa biết CX của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ ΔC (lượng chất thêm vào) và sự tăng diện tích (hoặc chiều cao) pic ΔS theo công thức: CX = SX

DẠ Y

KÈ

QU Y

* Phương pháp thêm đường chuẩn: chuẩn bị một dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau và các chất chuẩn tương ứng tăng dần. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký. Dựng đường chuẩn tương quan giữa diện tích hoặc chiều cao pic tổng (thử + chuẩn) với nồng độ hoặc lượng của chất chuẩn thêm ΔC, kéo dài đường chuẩn cắt trục hoành tại một điểm chính là nồng độ chất cần xác định.

Hình 1.2. Đồ thị phương pháp thêm đường chuẩn

OF FI

* Phương pháp chuẩn hóa điện tích: hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và có đáp ứng với detector như nhau. Kỹ thuật này trong HPLC bị hạn chế vì đáp ứng như nhau với detector là điều thiếu chắc chắn [26]. 1.2.5. Thẩm định phương pháp định lượng bằng HPLC a. Độ đặc hiệu

QU Y

NH ƠN

Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất , … Cụ thể trong phép phân tích định lượng, nó là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác. Tiến hành phân tích các mẫu trắng, lặp lại tối thiểu 6 lần, không được cho tín hiệu phân tích. Tiếp tục phân tích mẫu thử hoặc mẫu trắng thêm chuẩn ở hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần. So sánh kết quả với mẫu trắng, phải cho tín hiệu chất cần phân tích. Sau khi chuẩn bị mẫu (mẫu trắng hoặc mẫu thử) và phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký thu được các pic sắc ký, ta thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này. So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu [29]. b. Khoảng tuyến tính

DẠ Y

KÈ

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Giá trị này cần được khảo sát ở khoảng 10 (ít nhất 5, 6) mức nồng độ khác nhau. Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. Sự tuyến tính đa phần phụ thuộc vào bản chất chất phân tích và kỹ thuật sử dụng, kỹ thuật HPLC nếu sử dụng detector UV-Vis có thể cho khoảng tuyến tính đến 106 thậm chí đến 107. Sau 12

khi xác định khoảng tuyến tính, ta đi xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan, yêu cầu hệ số hồi quy tuyến tính R là 0,995 ≤ R ≤ 1. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn giá trị không được , trong đó Ct là nồng độ tính ngược theo

vượt quá ± 15% (

OF FI

đường chuẩn của các điểm chuẩn, Cc là nồng độ của các điểm chuẩn) [30]. c. Giới hạn phát hiện

QU Y

NH ƠN

Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Trong định lượng, đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. Có nhiều cách xác định LOD khác nhau tùy thuộc vào phương pháp áp dụng là phương pháp công cụ hay không công cụ. Nếu dựa trên độ lệch chuẩn có thể thực hiện trên mẫu trắng hoặc mẫu thử, tiến hành song song 10 mẫu, xác định giá trị trung bình ( ) và độ lệch chuẩn (SD) từ đó tính được LOD. Đánh giá LOD đã tính được: tính R = /LOD. Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy. Nếu nằm ngoài khoảng trên phải điều chỉnh nồng độ dung dịch thử. Cũng có thể tính LOD bằng tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 3, 4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu S/N = chiều cao tín hiệu của chất phân tích / nhiễu đường nền. LOD được chấp nhận khi S/N bằng 2 đến 3, thường là 3. Hoặc có thể dựa trên đường chuẩn nếu phương pháp có xây dựng đường chuẩn, LOD = 3,3SD / a, trong đó a là độ dốc đường chuẩn, SD độ lệch chuẩn của tín hiệu [30].

KÈ

d. Giới hạn định lượng

DẠ Y

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn. Việc xác định LOQ cần tính đến các yếu tố ảnh hưởng trong mẫu phân tích, do đó cần thực hiện trên nền mẫu thật. LOQ trong nhiều trường hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính. Nếu xác định dựa trên độ lệch chuẩn thì cũng có thể tiến hành trên mẫu trắng và mẫu thử, mẫu trắng LOQ =

, mẫu thử LOQ = 10SD. Nếu quy trình phân tích sử dụng các

công cụ có nhiễu đường nền, có thể tính LOQ bằng tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N = 10. Có thể dựa trên đường chuẩn, LOQ = 10SD / a [30].

OF FI

e. Độ đúng

NH ƠN

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng μ. Có thể xác định độ đúng bằng so sánh với phương pháp chuẩn/đối chiếu. Phân tích mẫu chuẩn hoặc mẫu thử, thực hiện 10 lần bằng phương pháp khảo sát và bằng một phương pháp đối chiếu. Đánh giá bằng cách so sánh phương sai của hai phương pháp đó, dùng tiêu chuẩn F (Fisher) và so sánh hai trị giá trung bình bằng tiêu chuẩn t (Student). Ngoài ra có thể sử dụng vật liệu chuẩn để xác định. Nhiều tổ chức có uy tín như USFDA, EURACHEM, ICH... quy định tính độ chệch để xác định độ đúng như sau

, trong đó

là

f. Độ chụm

QU Y

giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm, μ là giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. USFDA quy định độ chệch của các phương pháp xác định dư lượng phải không được lớn hơn 15% và không lớn hơn 20% tại LOQ. Cũng có thể dùng độ thu hồi để tính toán độ đúng [30].

KÈ

Độ chụm chỉ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh trị giá trung bình. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực, bao gồm độ lặp lại, độ chụm trung gian, độ tái lập. Đây là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn.

DẠ Y

Độ lặp lại được xác định bằng cách bố trí thí nghiệm hoặc tính toán trên các kết quả phân tích mẫu thực đã làm. Nên tiến hành ở nồng độ khác nhau trong khoảng làm việc, mỗi nồng độ làm lặp lại 10 lần (ít nhất 6 lần). Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV. Ở 14

khoảng nồng độ này, theo AOAC RSD% tối đa chấp nhận được là 1,8%, như vậy phương pháp áp dụng có độ chụm đạt yêu cầu.

Độ chụm trung gian được xác định bằng cách tiến hành trong nội bộ phòng thí nghiệm. Phân tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như nền mẫu, thiết bị, con người, dụng cụ hóa chất, điều kiện môi trường thay đổi.

OF FI

Độ tái lập tương tự như độ chụm trung gian nhưng thực hiện giữa các phòng thí nghiệm khác nhau [30]. g. Tính ổn định của phương pháp

DẠ Y

KÈ

QU Y

NH ƠN

Độ ổn định của phương pháp là khả năng cung cấp các kết quả có độ chính xác (độ đúng và độ chụm) chấp nhận được dưới những điều kiện có sự thay đổi về một số điều kiện thực hiện phương pháp. Bao gồm độ vững (là mức độ lặp lại các kết quả phân tích khi có sự thay đổi nhỏ một số thông số của phương pháp) và độ chắc chắn (là mức độ lặp lại các kết quả phân tích khi có sự thay đổi một số yếu tố thuộc về điều kiện phân tích). Tiến hành bố trí thí nghiệm để đánh giá kết quả của hai nhóm đạt được khi điều kiện thay đổi dựa trên việc so sánh hai phương sai (chuẩn F) và so sánh hai giá trị trung bình (chuẩn t) [30, 31].

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

OF FI

2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất nghiên cứu

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ

Các nguyên vật liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện dưới bảng 2.1. Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Nguyên liệu

Tiêu chuẩn

Viện KN thuốc TP HCM

TKPT

Trung Quốc

EP 8.0

Ketoprofen chuẩn 0105178; 99,80%)

Ketoprofen

Kali dihydrophosphat

Trung Quốc

TKHH

Acid phosphoric đặc

Trung Quốc

TKHH

Acetonitril

Merck

HPLC

Methanol

Trung Quốc

TKHH

Nước cất 2 lần

Việt Nam

TCCS

Ethanol

Merck

HPLC

L-α-Lecithin đậu nành (SL)

Sigma-Aldrich

TKHH

Trung Quốc

TCCS

Dicloromethan (DCM)

Trung Quốc

TCCS

QU Y

NH ƠN

(SKS

Nguồn gốc

STT

KÈ

Tween 80

a. Mẫu thử

DẠ Y

Mẫu transferosome ketoprofen 5 mg/ml: 0,5 g ketoprofen nguyên liệu được hòa tan trong 6 g lecithin đậu nành, 1,5 g tween 80 trong 100 ml DCM. Cô quay loại bỏ dung môi trong 3 giờ, ở 45oC, tốc độ quay 60 vòng/ phút. Tiến hành hydrat hóa màng bằng 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,4 16

trong thời gian 1 giờ, ở 45oC, tốc độ quay 125 vòng/phút thu được transferosome đồng nhất [32]. b. Mẫu placebo

Tiến hành tương tự như mẫu thử nhưng không có ketoprofen.

OF FI

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ chính sử dụng trong các nội dung nghiên cứu gồm có: - Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D; Detector PDA (Mỹ). - Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sĩ).

NH ƠN

- Bể siêu âm Elmasonic S 100 H (Đức).

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,1 mg (Thụy Sĩ). - Tủ lạnh Toshiba GR-K18EA (Nhật).

- Máy quang phổ EMC-61 PC-UV Spectrophotometer (Emclab, Đức). - Các dụng cụ thí nghiệm khác: ống nghiệm, bình định mức, pipet, cốc có mỏ, giấy lọc … đạt tiêu chuẩn phân tích và kiểm nghiệm.

QU Y

2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu a. Địa điểm nghiên cứu:

Bộ môn kiểm nghiệm - độc chất, Viện đào tạo Dược, Học viện quân y. b. Thời gian thực hiện khóa luận:

Từ tháng 01-5/2022.

KÈ

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng a. Lựa chọn bước sóng phát hiện

DẠ Y

Để xác định bước sóng thích hợp để phân tích KETO, tiến hành ghi phổ UV của mẫu chuẩn KETO trên máy quang phổ EMC-61 PC-UV Spectrophotometer (Emclab, Đức).

OF FI

Cách tiến hành: Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10 ml, pha loãng bằng pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch KETO chuẩn có nồng độ khoảng 20 µg/ml. Ghi phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch này. Ghi phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch này với dải sóng từ 200 – 400 nm, cuvet thạch anh dày 1cm. Mẫu trắng là dung môi MeOH. Dựa vào hình ảnh phổ thu được, lựa chọn bước sóng phân tích thích hợp. b. Lựa chọn pha động * Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

NH ƠN

- Dung dịch chuẩn gốc 200 µg/ml: Cân chính xác khoảng 20 mg KETO chuẩn vào bình định mức 10ml, thêm khoảng 8 ml MeOH vào bình định mức, lắc đều đến khi KETO chuẩn tan hết, bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch và lắc đều. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch trên bằng pipet bầu cho vào bình định mức 10 ml, pha loãng bằng MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch KETO chuẩn có nồng độ 200 µg/ml. - Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 ml, pha loãng bằng MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch KETO chuẩn có nồng độ 20 µg/ml.

QU Y

* Tiến hành: Tiến hành phân tích mẫu chuẩn trong 3 loại pha động có thành phần khác nhau: - Mb 1: ACN – acid acetic 1% trong nước (45:55). - Mb 2: ACN - đệm phosphat (pH 2,2; 0,01 M) (40:60).

- Mb 3: ACN - đệm phosphat (pH 1,5; 0,01 M) (60:40). Các điều kiện được cố định:

KÈ

- Cột pha tĩnh: Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

DẠ Y

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Detector: PDA, bước sóng theo kết quả đã khảo sát phần a.

- Thời gian lưu và hình dạng pic KETO là cơ sở để lựa chọn pha động.

b. Lựa chọn tốc độ dòng

OF FI

d. Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu thử

Sau khi lựa chọn được pha động, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn với pha động đã chọn với các tốc độ dòng: 0,8; 1,0; 1,2 ml/phút, các điều kiện khác được giữ nguyên như mục b. Thời gian lưu, áp suất cột và hình dạng pic KETO là cơ sở để lựa chọn tốc độ dòng.

Tiến hành chiết KETO từ chế phẩm bằng các dung môi khác nhau, pha loãng và định lượng mẫu bằng HPLC. Các dung môi sử dụng là MeOH, EtOH 96% hoặc ACN. Cách tiến hành:

QU Y

NH ƠN

- Chuẩn bị dung dịch thử: hút chính xác 2 ml mẫu thử vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml dung môi lắc siêu âm 15 phút trong bể siêu âm (công suất 550 W, 50/60 Hz), để nguội, sau đó bổ sung dung môi đến vạch, lắc đều. Lọc dung dịch trên qua giấy lọc (bỏ 20ml dịch lọc đầu), hút chính xác 1,0 ml dịch lọc vào bình định mức 10 ml, pha loãng bằng dung môi tương ứng đến vạch, lắc đều. Lọc dung dịch thu được qua màng lọc 0,45 µm thu được mẫu thử để tiến hành sắc ký. - Chuẩn bị dung dịch chuẩn: tương tự như mục 2.2.1.b . Với mỗi mẫu, tiêm 3 lần vào hệ thống sắc ký và lấy giá trị trung bình. Căn cứ vào kết quả sắc ký để lựa chọn dung môi có khả năng chiết KETO từ chế phẩm với hiệu suất cao nhất.

2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng

KÈ

Sau khi khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký, phương pháp phân tích được thẩm định theo hướng dẫn của ICH Q2(R2) [30]. a. Tính tương thích của hệ thống

DẠ Y

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn KETO vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Độ thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua, độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng và số đĩa lý thuyết.

Tiêm 6 lần mẫu KETO chuẩn 20 µg/ml vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi kết quả: độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu (không quá 1%), diện tích pic (không quá 2%), hệ số đối xứng (không quá 2%) và số đĩa lý thuyết (không quá 2%). b. Độ đặc hiệu

OF FI

Để chứng minh sự có mặt của tá dược, dung môi hòa tan mẫu, dung môi pha động không ảnh hưởng đến việc định lượng KETO trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC. Tiến hành sắc ký và ghi sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và dung dịch placebo để so sánh. - Mẫu trắng: MeOH

NH ƠN

- Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được pha tương tự mục d, b phần 2.2.1. với dung môi hòa tan là dung môi đã được khảo sát.

QU Y

- Dung dịch placebo: hút chính xác 2 ml mẫu placebo vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml dung môi đã khảo sát, lắc siêu âm 15 phút trong bể siêu âm (công suất 550 W, 50/60 Hz), để nguội, bổ sung dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc dung dịch trên qua giấy lọc (bỏ 20ml dịch lọc đầu), hút chính xác 1,0 ml dịch lọc vào bình định mức 10 ml, pha loãng bằng dung môi tương ứng đến vạch, lắc đều. Lọc dung dịch thu được qua màng lọc 0,45 µm thu được mẫu thử để tiến hành sắc ký.

KÈ

Thời gian lưu pic chính trên sắc ký đồ dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic KETO trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng và dung dịch placebo không phát hiện pic tại vị trí thời gian lưu của pic KETO hoặc có phát hiện nhưng hệ số ảnh hưởng không vượt quá 20%. c. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

DẠ Y

Tiến hành: Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của KETO trong khoảng 50 - 200 % nồng độ làm việc (tương ứng 10 µg/ml đến 40 µg/ml). Cách pha: Từ dung dịch KETO chuẩn có nồng độ 200 µg/ml. Cho vào 5 bình định mức các thể tích dung dịch KETO chuẩn có nồng độ 200 µg/ml 20

STT

Thể tích KETO chuẩn gốc 200 µg/ml (ml)

Bảng 2.2. Dãy dung dịch chuẩn KETO

như bảng 2.2, pha loãng bằng MeOH và định mức đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Thể tích MeOH vừa đủ (ml)

Nồng độ dung dịch KETO chuẩn (µg/ml)

NH ƠN

OF FI

Tiến hành phân tích dãy dung dịch chuẩn theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Từ các giá trị diện tích pic, xây dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của dung dịch KETO với hệ số tương quan của đường chuẩn không dưới 0,995. d. Độ đúng

QU Y

Xác định độ đúng thông qua độ thu hồi (độ tìm lại) của phương pháp bằng cách thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó. Thêm chất chuẩn ở ba mức nồng độ là mức thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc. Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được pha tương tự mục d, b phần 2.2.1. với dung môi hòa tan là dung môi đã được khảo sát.

DẠ Y

KÈ

Pha dung dịch thử thêm chuẩn: có nồng độ lần lượt bằng 70%, 100% và 120% nồng độ định lượng (20 µg/ml). Cân chính xác 50 mg KETO chuẩn vào bình định mức 50 ml, thêm MeOH vừa đủ, lắc đều thu dung dịch chuẩn A. Từ dung dịch chuẩn A và mẫu thử tiến hành pha theo bảng 2.3 trong bình định mức 50 ml.

Bảng 2.3. Dãy dung dịch thử thêm chuẩn Mẫu thử

Dd chuẩn A (1 mg/ml) 3 ml

Nồng độ 20 µg/ml

5 ml

1 ml 1 ml

OF FI

Nồng độ 20 µg/ml x 80%

(5 mg/ml)

Dung dịch thử thêm chuẩn

Nồng độ 20 µg/m l x 120%

7 ml

1 ml

NH ƠN

Cho vào bình định mức 50 ml thêm 40 ml dung môi MeOH, siêu âm 15 phút, để nguội thêm tiếp dung môi vừa đủ 50 ml, lắc đều. Tiếp tục pha loãng 10 lần bằng cùng dung môi, lọc qua màng lọc 0,45 µm thu dãy dung dịch thử thêm chuẩn. Mỗi mẫu thử thêm chuẩn và mẫu thử được tiêm 3 lần vào hệ thống sắc ký, chạy ở điều kiện đã chọn, tính giá trị diện tích pic trung bình của các mẫu, từ đó tính được nồng độ của KETO trong các mẫu. Tính độ thu hồi (R%) theo công thức sau: Cts − Ct x100 Cs

QU Y

R (%) = Trong đó:

- Cts: Nồng độ KETO trong mẫu thử thêm chuẩn (µg/ml) - Ct: Nồng độ KETO trong mẫu thử (µg/ml) - Cs: Nồng độ KETO chuẩn thêm vào (µg/ml)

e. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

KÈ

Theo kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký với mẫu chuẩn KETO nồng độ 20 µg/ml, ta tính được thời gian lưu trung bình của các mẫu.

DẠ Y

Trên sắc ký đồ của mẫu trắng, đo độ nhiễu đường nền trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn, thu được diện tích nền So (µV.s), từ đó ước lượng diện tích pic của LOD (lớn hơn hoặc bằng 3 lần So) và LOQ (lớn hơn hoặc bằng 10 lần So). Căn cứ vào diện tích pic của

LOD và LOQ ước lượng được, pha 3 mẫu chuẩn có nồng độ gần với mỗi nồng độ ước lượng được và tiến hành chạy sắc ký ở điều kiện đã chọn.

Từ kết quả sắc ký, lựa chọn nồng độ nhỏ nhất cho diện tích pic lớn hơn diện tích LOD và LOQ ước lượng từ nhiễu đường nền. f. Độ lặp lại, độ chụm trung gian

OF FI

Độ lặp lại của phương pháp là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng 1 mẫu, được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của 6 phép thử song song (6 lần định lượng 6 mẫu).

NH ƠN

Pha 6 dung dịch thử tương tự mục d phần 2.2.1 với dung môi đã khảo sát. Chạy sắc ký theo điều kiện đã khảo sát, tính RSD (%) của hàm lượng KETO trong dung dịch thử không vượt quá 2%. Độ chụm trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau. Thực hiện tương tự như khảo sát độ lặp lại nhưng được thực hiện vào ngày khác khi khảo sát độ lặp lại.

QU Y

Giá trị định lượng trung bình của mỗi ngày và của cả hai ngày thực hiện phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0%. RSD (%) kết quả định lượng của mỗi ngày và của cả hai ngày thực hiện phải ≤ 2,0%. Độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 ngày thực hiện ≤ 2,0%. 2.2.3. Định lượng KETO trong transferosome

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: tương tự mục b phần 2.2.1.

DẠ Y

KÈ

Chuẩn bị dung dịch thử từ chế phẩm KETO transferosome tự bào chế: hút chính xác 2 ml chế phẩm vào bình định mức 50 ml thêm 40 ml dung môi đã khảo sát, lắc siêu âm 15 phút trong bể siêu âm (công suất 550 W, 50/60 Hz), để nguội thêm tiếp dung môi vừa đủ 50 ml, lắc đều. Tiếp tục pha loãng 10 lần bằng cùng dung môi, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành chạy sắc ký: Mỗi dung dịch thử được tiêm 3 lần vào hệ thống sắc ký, chạy sắc ký theo phương pháp đã xây dựng. Dung dịch chuẩn tiêm 3 lần, tính giá trị diện tích pic trung bình của 3 lần đo. 23

- St: Diện tích pic của dung dịch thử (µV.s)

OF FI

- Cs: Nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml)

Trong đó:

Nồng độ KETO trong dung dịch thử (Ct) được tính theo công thức:

- Ss: Diện tích pic của dung dịch chuẩn (µV.s)

Trong đó:

NH ƠN

Từ nồng độ chất trong dung dịch thử (Ct), ta tính được hàm lượng KETO trong chế phẩm theo công thức sau:

: Khối lượng cân chất chuẩn (mg)

- P: Hàm lượng chuẩn (ghi trên nhãn) 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được phân tích xử lý theo phương pháp thống kê y học trên máy tính và phần mềm Microsoft Excel 2016.

QU Y

Các kết quả được xử lý và biểu thị: - Giá trị trung bình:

- Độ lệch chuẩn: SD =

DẠ Y

KÈ

- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD =

× 100

3.1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng 3.1.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng phân tích

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

QU Y

NH ƠN

OF FI

Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện KETO, tiến hành ghi phổ UV của dung dịch KETO chuẩn nồng độ 20 µg/ml với dải sóng từ 200 – 400 nm, cuvet thạch anh dày 1cm. Mẫu trắng là dung môi MeOH. Phổ hấp thụ của dung dịch có dạng như trong hình 3.1.

Hình 3.1. Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch KETO 20 µg/ml

DẠ Y

KÈ

Nhận xét: từ phổ hấp thụ của dung dịch KETO 20 µg/ml thấy cực đại hấp thụ của dung dịch này khoảng 259,4 nm với độ hấp thụ là 1,4492. Tham khảo các nghiên cứu định lượng KETO được trình bày ở bảng 1.1, căn cứ vào phổ hấp thụ và nghiên cứu tài liệu tham khảo, để giảm ảnh hưởng của dung môi và tạp chất nhưng vẫn đảm bảo định lượng được KETO, lựa chọn bước sóng 260 là bước sóng để nhận tín hiệu của KETO trên detector.

3.1.1.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động

OF FI

Trên cơ sở tham khảo các tài liệu và quả khảo sát tìm điều kiện sắc ký phù hợp, cố định được các điều kiện sắc ký như sau: cột pha tĩnh SunFireTM C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl, detector: PDA, bước sóng 260 nm, cột ở nhiệt độ phòng. Tiến hành sắc ký với 3 pha động khác nhau, kết quả thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.2, 3.3, 3.4. Bảng 3.1. Lựa chọn thành phần pha động

Thời gian Hệ số bất đối lưu (phút) xứng (AF)

Pha động

12,708

1,12

11202

19,128

1,03

8439

5,609

2,18

8112

KÈ

QU Y

NH ƠN

Mb 1: ACN – acid acetic 1% trong nước (45:55) Mb 2: ACN - đệm phosphat (pH 2,2; 0,01 M) (40:60) Mb 3: ACN - đệm phosphat (pH 1,5; 0,01 M) (60:40)

Số đĩa lý thuyết (N)

DẠ Y

Hình 3.2. Sắc ký đồ KETO chuẩn pha động Mb 2

AL CI OF FI NH ƠN

KÈ

QU Y

Hình 3.3. Sắc ký đồ KETO chuẩn pha động Mb 3

Hình 3.4. Sắc ký đồ KETO chuẩn pha động Mb 1

DẠ Y

Nhận xét: tiến hành quan sát 3 sắc ký đồ dung dịch KETO chuẩn trong các pha động khác nhau nhận thấy pic sắc ký đều cân đối, tuy nhiên thời gian lưu của pic KETO trên sắc ký đồ với pha động Mb 2 quá dài gây thất thoát dung môi, trong khi Mb 3 lại quá ngắn có khả năng các pic trên sắc ký đồ chưa tách khỏi nhau. Mặt khác Mb 2, Mb 3 có pH thấp gây ảnh hưởng đến độ 27

bền của cột, đệm phosphat yêu cầu rửa cột lâu. Do đó chọn pha động Mb 1: ACN – acid acetic 1% trong nước tỷ lệ 45:55. 3.1.1.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng

OF FI

Khảo sát 3 tốc độ dòng khác nhau 0,8; 1,0; 1,2 ml/phút với pha động ACN – acid acetic 1% trong nước tỷ lệ 45:55, cố định các điều kiện sắc ký còn lại như trên, thu được kết quả như bảng 3.2 và hình 3.5. Bảng 3.2. Lựa chọn tốc độ dòng Thời gian lưu

Diện tích pic

Chiều cao

(phút)

(µV.s)

(µV)

0,8 ml/phút

15,670

2234577

97004

1,0 ml/phút

12,620

1782604

96475

1,2 ml/phút

10,440

1441493

94525

DẠ Y

KÈ

QU Y

NH ƠN

Tốc độ dòng

Hình 3.5. Sắc ký đồ KETO chuẩn với tốc độ dòng 1,2 ml/phút

AL CI OF FI NH ƠN

KÈ

QU Y

Hình 3.6. Sắc ký đồ KETO chuẩn với tốc độ dòng 0,8 ml/phút

Hình 3.7. Sắc ký đồ KETO chuẩn với tốc độ dòng 1,0 ml/phút

DẠ Y

Nhận xét: mục đích của việc khảo sát tốc độ dòng là lựa chọn tốc độ dòng phù hợp đảm bảo KETO được tách biệt hoàn toàn so với tạp chất, pic gọn, cân đối, thời gian lưu tối ưu tránh hao phí dung môi. Dựa vào các pic sắc ký thu được ta thấy các pic đều cân đối, chân pic gọn, pic chính tách rời khỏi peak tạp, áp suất cột đảm bảo. Tuy nhiên ở tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thời gian

lưu của pic là nhỏ nhất, hạn chế được việc lãng phí dung môi. Vì vậy chọn tốc độ dòng là 1,2 ml/phút. 3.1.1.4. Kết quả khảo sát dung môi hòa tan mẫu thử

Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi hòa tan mẫu được thể hiện trong bảng 3.3.

Tỷ lệ so với nhãn (%)

4,17

83,4

4,36

87,2

1459627

4,84

96,8

1479721

ACN

1254377

EtOH 96%

1313162

MeOH

QU Y

Dung dịch chuẩn

NH ƠN

Dung dịch thử

Hàm lượng (mg/ml)

Diện tích pic TB (µV.s)

Dung môi hòa tan

OF FI

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát dung môi hòa tan mẫu

DẠ Y

KÈ

Hình 3.8. Sắc ký đồ dung môi hòa tan mẫu thử MeOH

AL CI OF FI

QU Y

NH ƠN

Hình 3.9. Sắc ký đồ dung môi hòa tan mẫu thử EtOH 96%

Hình 3.10. Sắc ký đồ dung môi hòa tan mẫu thử ACN

KÈ

Nhận xét: căn cứ vào kết quả trên, có thể thấy dung môi MeOH có khả năng hòa tan KETO tốt nhất trong ba loại dung môi được khảo sát. Như vậy, lựa chọn MeOH để hòa tan mẫu thử trong phân tích định lượng KETO. Từ các kết quả khảo sát trên, xây dựng phương pháp sắc ký với những điều kiện như sau:

DẠ Y

- Hệ thống sắc ký: hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D - Cột sắc ký pha đảo SunFireTM C18 (4,6 × 250 mm, 5µm) - Detector UV bước sóng 260 nm

- Pha động: acetonitril : acid acetic 1% trong nước tỉ lệ 45:55 - Thể tích tiêm: 20µl

- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (25-26oC)

OF FI

- Dung môi hòa tan mẫu: MeOH

3.1.2. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng bằng HPLC

NH ƠN

Tiến hành đánh giá phương pháp định lượng KETO trong chế phẩm bằng HPLC xây dựng được ở các chỉ tiêu sau: Tính phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, LOD và LOQ. 3.1.2.1. Tính tương thích của hệ thống

Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn KETO nồng độ 20 µg/ml vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã xây dựng. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic (µV.s)

Hệ số bất đối (AF)

Số đĩa lý thuyết (N)

10,464

1523280

1,77

10784

10,377

1532126

1,78

10950

10,383

1532529

1,81

10981

10,389

1487381

1,82

10899

10,454

1536365

1,79

10940

10,432

1542428

1,77

10873

10,417

1525685

1,79

10904

0,038

19777

0,02

70,289

RSD (%)

0,37

1,30

1,14

QU Y

STT

DẠ Y

KÈ

Nhận xét: kết quả khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) diện tích pic của KETO, số đĩa lý thuyết, hệ số bất đối trong 6 phép thử đều nằm trong khoảng cho phép (< 2%), các giá trị của thời gian lưu cũng nằm trong giới hạn <1%. Điều này chứng tỏ hệ thống được sử dụng là phù hợp và đảm bảo ổn định cho phép phân tích định lượng KETO.

OF FI

3.1.2.2. Độ đặc hiệu

QU Y

NH ƠN

Tiến hành sắc ký mẫu trắng, dung dịch chuẩn và dung dịch thử, dung dịch placebo thu được hình ảnh sắc ký đồ như ở hình 3.11, 3.12, 3.13 và 3.14.

DẠ Y

KÈ

Hình 3.11. Sắc ký đồ của mẫu trắng MeOH

Hình 3.12. Sắc ký đồ dung dịch KETO chuẩn 20 µg/ml 33

AL CI OF FI Hình 3.14. Sắc ký đồ dung dịch placebo

KÈ

QU Y

NH ƠN

Hình 3.13. Sắc ký đồ dung dịch KETO thử 20 µg/ml

DẠ Y

Nhận xét: sắc ký đồ của mẫu trắng (MeOH), dung dịch placebo không xuất hiện pic trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu của KETO (khoảng 10,4 phút). Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử có chứa KETO đều cho 1 pic ở thời gian lưu tR = 10,4 phút. Điều này chứng tỏ pic trên sắc ký đồ là của KETO.

3.1.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của KETO trong khoảng 50 - 200% nồng độ làm việc (10 µg/ml đến 40 µg/ml) và xây dựng đường chuẩn được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.15. Khối lượng cân chất chuẩn 19,7 mg

Nồng độ dd KETO chuẩn (µg/ml)

9,85

15,76

19,7

Diện tích pic 834639 TB (µV.s)

23,64

29,55

39,4

2253839

2914994

NH ƠN

Mẫu

OF FI

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của Spic vào nồng độ dung dịch

1231708

1522425

1804794

Phương trình hồi quy: Y= 71071X + 126947

Kết quả

KÈ

QU Y

R² = 0,9996

DẠ Y

Hình 3.15. Đồ thị biểu thị sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của KETO

Từ phương trình hồi quy, ta có độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Δi theo bảng 3.6 35

Bảng 3.6. Kết quả độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Nồng độ dd KETO tính ngược từ đường chuẩn (µg/ml)

Độ chệch Δi (%)

9,85

9,96

1,09

15,76

15,54

19,7

19,63

23,64

23,61

29,55

29,93

39,4

39,23

NH ƠN

OF FI

Nồng độ dd KETO chuẩn (µg/ml)

-1,37 -0,33 -0,14 1,27

-0,43

QU Y

Nhận xét: kết quả trình bày ở bảng 3.5, 3.6 và hình 3.15 cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát, diện tích pic thu được đáp ứng trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ của chúng, sự phụ thuộc thể hiện qua đường thẳng hồi quy tuyến tính và hệ số R² = 0,9996. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn không vượt quá ± 15%. Như vậy phương pháp định lượng đã xây dựng tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát từ 10 µg/ml – 40 µg/ml (tương đương khoảng nồng độ từ 50% đến 200% nồng độ làm việc). 3.1.2.4. Độ đúng

Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn thu được kết quả như trong bảng 3.7. Dựa vào hàm lượng KETO đã biết của dung dịch chuẩn và dung dịch thử tính được lượng KETO chuẩn tìm thấy trong mẫu thử thêm chuẩn.

KÈ

- Mẫu chuẩn: diện tích pic 1519235 µV.s

DẠ Y

- Mẫu thử: diện tích pic 1510277 µV.s, hàm lượng 4,89 mg/ml

1223418 1221967 1221339 1533733 1522856 1529064 1847059 1843469 1845268

3,03 3,02 3,02 5,04 4,97 5,01 7,07 7,04 7,05

CI Kết quả

OF FI

3,03 3,03 3,03 5,05 5,05 5,05 7,07 7,07 7,07

% Tìm thấy

100,00 99,69 99,56 99,76 98,37 99,16 99.93 99,61 99,77

NH ƠN

STT

Lượng Diện tích chuẩn pic dung Lượng thêm dịch thử chuẩn tìm vào thêm chuẩn thấy (mg) (mg) (µV.s)

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng

SD = 0,57 RSD (%) = 0,58 SD = 0,16 RSD (%) = 0,16 RSD (%) = 0,32

QU Y

Kết quả

SD = 0,23 RSD (%) = 0,23

Nhận xét: lượng chất chuẩn thu hồi lại được trong các mẫu thử thêm chuẩn nằm trong khoảng 98,37 % đến 100,00 % so với lượng chuẩn thêm vào; RSD = 0,32 % (< 2%) chứng tỏ phương pháp được sử dụng có độ đúng cao.

3.1.2.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

KÈ

Theo kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký với mẫu chuẩn KETO nồng độ 20 µg/ml ta có thời gian lưu trung bình của các mẫu là tR = 10,417 phút. Trên sắc ký đồ mẫu trắng, đo tín hiệu nhiễu đường nền trong khoảng thời gian từ 9,2 đến 11,6 phút thu được giá trị chiều cao = 60 µV.

DẠ Y

Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp được thể hiện trong bảng 3.8.

LOD

180 (3 x Ho)

LOQ

600 (10 x Ho)

Nồng độ chất chuẩn (µg/ml) 0,01 0,015 0,02 0,048 0,05 0,052

Chiều cao pic thực tế đo được (µV)

Chiều cao pic ước lượng (µV)

160 189 215 575 623 662

OF FI

Chỉ tiêu

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát LOD và LOQ

NH ƠN

Nhận xét: theo kết quả ở bảng trên, phương pháp định lượng đã xây dựng có LOD = 0,015 µg/ml và LOQ = 0,05 µg/ml. 3.1.2.6. Độ lặp lại, độ chụm trung gian

- Nồng độ làm việc của dung dịch thử KETO là 20 µg/ml. Chạy sắc ký và ghi sắc ký đồ của 6 dung dịch thử và dung dịch chuẩn. - Dung dịch chuẩn: khối lượng cân mS = 0,02002 g. Nồng độ dung dịch mẫu chuẩn: 19,98 µg/ml.

QU Y

- Diện tích pic trung bình mẫu chuẩn: SS = 1519235 µV.s Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày trong bảng 3.9. Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại

STT

Diện tích pic (µV.s)

Hàm lượng (µg/ml)

1467346 1510577 1511632 1512871 1510116 1513700 1519235

4,82 4,97 4,97 4,97 4,97 4,98

DẠ Y

KÈ

1 2 Dung dịch 3 thử KETO 4 (20 µg/ml) 5 6 Dung dịch chuẩn TB SD RSD (%)

4,95 0,06 1,21 38

Nhận xét: kết quả thử độ lặp lại của phương pháp cho thấy, trong các điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả là 1,21 % (< 2%). Như vậy, phương pháp đã chọn đảm bảo độ lặp lại của các kết quả trong các thử nghiệm được thực hiện song song.

OF FI

Với độ chụm trung gian tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn thu được kết quả như trong bảng 3.10, 3.11. Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ chụm trung gian STT

2 Dung dịch thử KETO (20 µg/ml)

Hàm lượng (µg/ml)

1520431

5,00

NH ƠN

Diện tích pic (µV.s)

3 4 5 6

QU Y

Dung dịch chuẩn

1489203

4,90

1510901

4,97

1512671

4,97

1502132

4,94

1493700

4,91

1519235 4,95

0,04

RSD (%)

0,80

DẠ Y

KÈ

Ngày 2

4,82

5,00

4,97

4,90

4,97

4,98

4,95

Ngày 1

OF FI

STT

Bảng 3.11. Hàm lượng KETO xác định được trong 2 ngày

4,97 4,94 4,91

NH ƠN

4,95

SD 2 ngày: 0,04

RSD 2 ngày: 0,8%

Nhận xét: Độ lặp lại kết quả định lượng trong mỗi ngày cho RSD đạt 1,21%; 0,80% và trong cả 2 ngày là 0,79% nhỏ hơn 2%. Như vậy phương pháp đã cho đảm bảo độ chụm trung gian.

QU Y

3.1.3. Kết quả định lượng KETO trong transferosome Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng, áp dụng để định lượng KETO trong mẫu transferosome ketoprofen 5 mg/ml.

Kết quả định lượng được tính toán bằng phương pháp chuẩn ngoại nghĩa là so sánh diện tích pic của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký, từ đó tính ra hàm lượng của KETO trong chế phẩm so với hàm lượng ghi trên nhãn theo công thức. SS = 1519398 µV.s.

KÈ

Mẫu chuẩn: mS = 20,02 mg

Kết quả định lượng KETO trong transferosome được thể hiện ở bảng

DẠ Y

3.12.

1524673

5,01

1532870

5,04

1518229

4,99

Hàm lượng (%)

(µV.s)

Hàm lượng mẫu thử (mg/ml)

100,25 100,78

OF FI

Diện tích pic thử

STT

Bảng 3.12. Kết quả định lượng KETO trong transferosome

99,82

100,28

3.2. BÀN LUẬN

NH ƠN

Nhận xét: kết quả ở bảng 3.12 cho thấy hàm lượng KETO trong mẫu nghiên cứu là 100,28% so với hàm lượng ghi trên nhãn. Như vậy, mẫu thử trên đều đạt yêu cầu về hàm lượng KETO.

QU Y

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, được sử dụng phổ biến trong phân tích định lượng dược phẩm. Tuy có một số nhược điểm như giá thành trang thiết bị còn cao, dung môi, hóa chất đắt tiền nhưng HPLC có nhiều ưu điểm nổi bật như tính ổn định, độ chọn lọc, tính chính xác cao và có thể định tính, định lượng đồng thời nhiều hoạt chất mà không cần phân tách. Hầu hết hệ thống HPLC hiện nay đều sử dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo trong phân tích dược phẩm do sự tiện dụng, nhanh chóng so với sắc ký pha thuận và khả năng phân tích hàng loạt mẫu. Do vậy, phương pháp được xây dựng có tính thiết thực, nhiều khả năng có thể áp dụng trong thực tế phân tích các chế phẩm có chứa KETO ở Việt Nam.

DẠ Y

KÈ

Khóa luận được phát triển từ phương pháp định lượng viên nang KETO giải phóng kéo dài trong USP 41 [2]. Tiến hành chọn phương pháp vì đây được coi là phương pháp chính thống, có độ tin cậy cao hơn so với các bài báo khoa học. So với chuyên luận định lượng KETO trong viên nang giải phóng kéo dài của USP 41, phương pháp định lượng được thay đổi về điều kiện xử lý mẫu phân tích, bước sóng phân tích, nồng độ làm việc. Do đối tượng phân tích của USP 41 là viên nang giải phóng kéo dài ở trạng thái rắn nên cần có giai đoạn chiết xuất trước khi pha loãng bằng pha động đến nồng 41

OF FI

độ định lượng. Tuy nhiên, chế phẩm transferosome KETO ở trạng thái lỏng nên không cần bước hòa tan, nhưng dung môi cần phá hủy được cấu trúc transferosome để giải phóng KETO thành dung dịch. Dung môi hòa tan mẫu thử sử dụng trong khóa luận được chọn là MeOH, tham khảo từ nghiên cứu của tác giả Shukla K. V. và Limsuwan T. [33, 34] và kết quả thực nghiệm. MeOH cho hiệu suất hòa tan cao nhất với tỷ lệ hàm lượng xác định được so với hàm lượng trên nhãn đạt 96,8%, cao hơn hẳn so với kết quả sử dụng dung môi ACN và EtOH 96% lần lượt là 83,4 và 87,2%. Ngoài ra, việc sử dụng dung môi MeOH an toàn hơn so với ACN, do ACN có thể tạo thành các cyanid có độc tính cao trong quá trình xử lý mẫu.

QU Y

NH ƠN

Khóa luận lựa chọn bước sóng phân tích là 260 nm tương tự với bước sóng phân tích chế phẩm KETO dạng gel của tác giả De Jalón E. G và cộng sự [19]. Trong các nghiên cứu khác, bước sóng phân tích được sử dụng một cách không thống nhất, dao động từ 230 đến 268 nm. Trong đó USP 41 sử dụng bước sóng 254 nm để phát hiện KETO trong viên nang giải phóng kéo dài. Điều này có thể giải thích do khả năng hấp thụ khác nhau của KETO trong các dung môi khác nhau. Khi thực hiện thí nghiệm này, bước sóng phân tích được lựa chọn dựa trên phổ hấp thụ của KETO trong pha động. Bước sóng lựa chọn là 260 nm không có sự khác biệt quá lớn so với USP 41 và kết quả của các nghiên cứu khác.

DẠ Y

KÈ

Hàm lượng KETO trong transferosome được định lượng ở nồng độ 20 µg/ml với khoảng tuyến tính từ 10 đến 40 µg/ml. Trong nghiên cứu định lượng KETO trong gel của tác giả Özlü C. và cộng sự, khoảng tuyến tính được công bố là 7,5 – 75 µg/ml [14]. Mặt khác tác giả Zhou J. và cộng sự đã định lượng KETO trong viên nang giải phóng kéo dài với khoảng nồng độ tuyến tính 25 - 500 µg/ml [16]. Có thể thấy, nồng độ định lượng sử dụng trong nghiên cứu phù hợp với các dữ liệu đã được báo cáo. Khoảng tuyến tính của khóa luận được xây dựng theo hướng dẫn của ICH với nồng độ từ 50 đến 150% so với nồng độ định lượng. Tuy nhiên, khoảng nồng độ này còn hẹp hơn so với công bố của tác giả Zhou J. và cộng sự (từ 25 đến 500 µg/ml) nhưng lại rộng hơn so với nghiên cứu của tác giả Koppala S. và cộng sự (từ 0,14 đến 0,58 µg/ml) [16, 18]. Nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt này có thể 42

do sự khác biệt về hàm lượng KETO trong mẫu thử, do đặc điểm của mẫu thử có hàm lượng hoạt chất dao động quá lớn.

Mb 1: ACN – acid acetic 1% trong nước (45:55).

Nghiên cứu có khảo sát 3 pha động là:

OF FI

Mb 2: ACN - đệm phosphat (pH 2,2; 0,01 M) (40:60).

Mb 3: ACN - đệm phosphat (pH 1,5; 0,01 M) (60:40).

QU Y

NH ƠN

Kết quả khảo sát và lựa chọn pha động là hỗn hợp ACN và acid acetic 1% trong nước tỉ lệ 45:55. Pha động này có thành phần tương tự như pha động sử dụng trong chuyên luận định lượng KETO trong viên nang giải phóng kéo dài của USP 41. Nhưng về phương pháp chuẩn bị thì đơn giản hơn so với USP 41. Thành phần của pha động gồm ACN có ưu điểm độ nhớt thấp và acid acetic có vai trò acid hóa dung môi làm tăng độ phân cực cho KETO, dẫn đến chất phân tích rửa giải nhanh hơn khỏi pha tĩnh do đó chân pic nhỏ hơn, hình dạng pic đẹp hơn và dễ đạt yêu cầu về độ phân giải. Ngoài ra, các muối acetat so với muối phosphat còn có ưu điểm dễ tan, cả trong dung môi hữu cơ như ACN và MeOH nên dễ dàng được rửa sạch khỏi cột trong thời gian ngắn và không bị tủa lại trong cột. Tuy nhiên, acid acetic có nhược điểm là dễ bay hơi, nên cần chú ý khi chuẩn bị và bảo quản. Nếu pha động bị rò rỉ có thể gây hỏng thiết bị do tính chất ăn mòn.

DẠ Y

KÈ

Khóa luận sử dụng thời gian phân tích là 15 phút, với thời gian lưu của pic KETO là khoảng 10,4 phút. Kết quả này ngắn hơn so với thời gian lưu đã công bố trong nghiên cứu của tác giả Koppala S. và cộng sự khi định lượng KETO trong viên nang (25,73 phút), dài hơn so với thời gian phân tích trong báo cáo của tác giả De Jalón E. G. và cộng sự khi định lượng KETO trong gel (3,72 phút) [18, 19]. Sự khác biệt này có thể là do sự thay đổi tốc độ dòng phân tích cũng như thành phần pha động được sử dụng khi sắc ký. So với thời gian lưu thu được, thời gian phân tích đủ để pic KETO tách hoàn toàn khỏi các pic còn lại. Đồng thời các thành phần khác cũng được rửa giải khỏi cột để chuẩn bị cho lần phân tích tiếp theo. Thời gian phân tích của phương pháp có thể coi là ngắn do không vượt quá 30 phút, đây là một trong những ưu điểm nổi bật của nghiên cứu. Việc tối thiểu hóa thời gian phân tích nhưng vẫn đảm 43

NH ƠN

OF FI

bảo mục tiêu phân tích là một trong những nội dung quan trọng của tối ưu hóa sắc ký. Thời gian phân tích ngắn sẽ có thể tiến hành nhiều mẫu nghiên cứu hơn trong cùng một khoảng thời gian và tiết kiệm pha động. Nhưng nếu thời gian phân tích quá ngắn sẽ không đủ để cho các thành phần trong mẫu tách riêng, đặc biệt là tách riêng khỏi pic KETO, khi đó sẽ không đảm bảo yêu cầu của phương pháp phân tích. Trong nghiên cứu này, độ phân giải của pic KETO với pic liền kề là 2,1 (>1,50) nên được coi là tách hoàn toàn khỏi các pic khác. Thời gian phân tích cũng không thể quá gần với thời gian lưu của pic KETO, do trong mẫu có thể có các thành phần kém phân cực hơn KETO và bị rửa giải khỏi cột sau. Nếu các thành phần này vẫn nằm trong cột thì sẽ bị rửa giải trong lần sắc ký tiếp theo, làm cho các lần phân tích không lặp lại và pha tĩnh bị bẩn dần, dẫn đến thời gian lưu của pic KETO bị thay đổi giữa các lần phân tích. Mặt khác, nếu thời gian phân tích quá dài so với thời gian lưu của KETO cũng không cần thiết, điều đó làm kéo dài thời gian phân tích nhưng không làm tăng thêm hiệu quả phân tích.

DẠ Y

KÈ

QU Y

Về thẩm định phương pháp phân tích, nghiên cứu thực hiện được thực hiện theo các hướng dẫn của ICH. Theo đó, phương pháp định lượng cần thẩm định độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, tính phù hợp của hệ thống, độ đúng, độ chụm (độ lặp lại, độ chụm trung gian). Tuy nhiên, khóa luận này cũng kiểm tra cả giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện. Về độ đặc hiệu, nghiên cứu sử dụng detector PDA nên tính chọn lọc chưa cao. Việc xác định pic KETO chỉ dựa trên thời gian lưu còn chưa hoàn toàn đảm bảo tính đặc hiệu do các chất có cùng tính chất phân cực sẽ được rửa giải khỏi cột cùng thời gian. Trong nghiên cứu cũng thực hiện quét phổ hấp thụ tử ngoại của pic và đối chiếu với phổ của KETO, tuy nhiên thao tác này cũng không đủ đặc hiệu để phân biệt với các sản phẩm phân hủy có cấu trúc gần với dược chất. Để tăng độ đặc hiệu thì có thể kết nối với các detector có độ đặc hiệu cao hơn như detector khối phổ. Về khoảng tuyến tính, theo gợi ý của ICH, khoảng này nên thực hiện từ 80% đến 120% so với nồng độ định lượng, nhưng nghiên cứu có mở rộng hơn so với yêu cầu là từ 50% đến 200% so với nồng độ định lượng. Đây là một trong những ưu điểm của đề tài, có khoảng tuyến tính rộng, phù hợp để định lượng các mẫu có hàm lượng dao động lớn. Mặc dù hệ số

tương quan R của đường chuẩn đáp ứng yêu cầu, tuy vậy, hệ số ảnh hưởng tính theo tỉ số của hệ số tự do phương trình đường chuẩn và tín hiệu đo tại nồng độ định lượng còn cao (8,3%), điều này là hợp lý do việc mở rộng quá nhiều của khoảng tuyến tính. Giá trị LOD và LOQ của nghiên cứu thấp hơn giá trị đã công bố trong báo cáo của tác giả Özlü C. và cộng sự (LOD 0,05

OF FI

µg/ml, LOQ 0,16 µg/ml) [14], mặt khác lại cao hơn nghiên cứu của tác giả De

DẠ Y

KÈ

QU Y

NH ƠN

Jalón E. G. và cộng sự (LOD 0,003 µg/ml, LOQ 0,02 µg/ml) [19].

KẾT LUẬN

1. Về xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong transferosome Đã xây dựng được phương pháp định lượng KETO trong transferosome bằng HPLC ở những điều kiện sau:

OF FI

- Hệ thống sắc ký: hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D - Cột sắc ký pha đảo SunFireTM C18 (4,6 × 250 mm, 5µm) - Detector UV bước sóng 260 nm

- Pha động: acetonitril : acid acetic 1% trong nước tỉ lệ 45:55 - Thể tích tiêm: 20µl

NH ƠN

- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

- Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (25-26°C) - Dung môi hòa tan mẫu: MeOH.

2. Về thẩm định phương pháp đã xây dựng theo hướng dẫn của ICH Đã thẩm định phương pháp xây dựng được ở các chỉ tiêu sau:

QU Y

- Tính phù hợp của hệ thống sắc ký: hệ thống được sử dụng phù hợp và đảm bảo tính ổn định cho phương pháp định lượng KETO. - Độ đặc hiệu: các chất khác có mặt trong mẫu thử không ảnh hưởng đến việc định lượng KETO.

- Xây dựng đường chuẩn của KETO trong khoảng nồng độ từ 10-40 µg/ml có phương trình hồi quy Y= 71071X + 126947, hệ số R² = 0,9996, độ chệch các điểm nồng độ đều nằm trong khoảng ±15%.

KÈ

- Độ đúng: độ thu hồi đạt từ 98,37-100,00% trong giới hạn cho phép. - Độ lặp lại, độ chụm trung gian: Cho các giá trị RSD < 2%.

DẠ Y

- LOD = 0,015 µg/ml và LOQ = 0,05 µg/ml.

- Đã xác định hàm lượng KETO trong chế phẩm transferosome ketoprofen 5 mg/ml nghiên cứu đạt 100,28% so với hàm lượng ghi trên nhãn.

KIẾN NGHỊ

Trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp, đã tiến hành nghiên cứu xây dựng và áp dụng phương pháp định lượng trực tiếp ketoprofen bằng HPLC trên chế phẩm transferosome ketoprofen 5 mg/ml và bước đầu thu được những kết quả khả quan. Xin đưa ra một số kiến nghị như sau:

OF FI

- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phương pháp trên để có thể ứng dụng định lượng ketoprofen trong các chế phẩm khác và áp dụng trong điều kiện các cơ sở kiểm tra chất lượng, các phòng kiểm nghiệm khác.

DẠ Y

KÈ

QU Y

NH ƠN

- Tiến hành nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời KETO và omeprazol trong các chế phẩm kết hợp hai hoạt chất này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO The Merck Index CD (2002) Monographs: Ketoprofen.

USP 41 (2018) Monographs: Ketoprofen Capsules, ketoprofen extendedrelease capsules, Chapter 621: Chromatography.

Clarke's Analysis of Drugs and Poisons Third Edition (2005) Monographs: Ketoprofen

OF FI

Tsume Yasuhiro, Mudie Deanna M, Langguth Peter, et al. (2014) The Biopharmaceutics Classification System: subclasses for in vivo predictive dissolution (IPD) methodology and IVIVC, European Journal of

NH ƠN

Pharmaceutical Sciences. 57. 152-163. doi:

Henry D., Lim L. L., Garcia R. L. A. et al. (1996) Variability in risk of gastrointestinal

complications

with

individual

non-steroidal

anti-

inflammatory drugs: results of a collaborative meta-analysis. Bmj., 312 (7046): 1563-1566. 6.

Loftsson T., Hreinsdôttir D. (2006) Determination of aqueous solubility by

QU Y

heating and equilibration: a technical note. Aaps Pharmscitech., 7(1): E29E32. 7.

Sheng J. (2007) In vitro release of ketoprofen from proprietary and extemporaneously manufactured gels. The University of Michigan, Ann Arbor, Michigan. Drug

Bank

Database.

Drug

card

for

ketoprofen.

KÈ

http://www.drugbank.ca/drugs/DB01009, truy cập ngày 20/04/2022. Shohin I. E., Kulinich J. I., Ramenskaya G. V. et al. (2012) Biowaiver monographs for immediate-release solid oral dosage forms: ketoprofen. J

DẠ Y

Pharm Sci. 101(10): 3593-3603.

10.

Liversidge G. G. (1981) Ketoprofen. Analytical profiles of drug substances, Elsevier: 443-471.

Bộ Y Tế (2018) ketoprofen, Phụ lục V, Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất

11.

bản Y học, pp. 541 - 543.

Nciri N., Kwon W., Chung D. S. (2019), Rapid determination of nonsteroidal

anti-inflammatory

drugs

single-drop

combined in-line with capillary electrophoresis.

Yang F., Jin D. (2017), Quantitative Analysis of Ketoprofen Enantiomers

OF FI

13.

microextraction

12.

by Liquid Chromatography/Electrospray Ionization-Mass Spectrometry. 14.

Özlü C., Basan H., Şatana E. et al. (2005) Quantitative determination of ketoprofen

gels

and

ampules

using

flow-injection

NH ƠN

spectrophotometry and HPLC, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. 39 (3-4). 606-611. 15.

Andraws G., Trefi S. (2020) Ionisable substances chromatography: A new approach for the determination of Ketoprofen, Etoricoxib, and Diclofenac sodium in pharmaceuticals using ion–pair HPLC, Heliyon. 6 (8).

16.

Zhou J., Zheng X., Liu Q. et al. (2013) Chiral Separation and Quantitative Determination of Ketoprofen on New Cellulose Bonded Chiral Stationary

75-81. 17.

QU Y

Phase by HPLC, Advances in Biomedical Engineering Research. 1 (4).

Tsvetkova B., Peikova L. (2013) HPLC determination of ketoprofen in tablet dosage forms, Trakia Journal of Sciences. 11 (1). 55. Koppala S., Ranga R. V., Anireddy J. S. (2016) Development and

18.

Validation of a Novel Stability-Indicating RP-HPLC Method for the

KÈ

Simultaneous Determination of Related Substances of Ketoprofen and Omeprazole

Combined

Capsule

Dosage

Form,

Journal

Chromatographic Science. 54 (5). 765-775. De Jalón E. G., Josa M., Campanero M. A. et al. (2000) Determination by

DẠ Y

19.

high-performance liquid chromatography of ketoprofen in vitro in rat skin permeation samples, Journal of Chromatography A. 870 (1-2). 143-149.

Bộ Y tế (2015) Dược thư quốc gia Việt Nam. Nhà xuất bản Y học, pp.

20.

1982-1990. 21.

Martindale The Complete Drug Reference (2014) Thirty-eighth Edition

22.

1522-1526.

Đặng Văn Hòa, Vĩnh Định (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo

23.

OF FI

dược sĩ đại học), Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, pp. 135-184.

Charde Manoj S., Welankiwar A. S., and Kumar Jitendra (2014) Method development by liquid chromatography with validation, International Journal

Pharmaceutical

Chemistry.

24.

(1).

06-10.

doi:

NH ƠN

10.7439/ijpc.v4i1.65.

Sabir Azim Md, Moloy Mitra, and Bhasin Parminder S (2013) HPLC method development and validation: A review, Int. Res. J. Pharm. 4 (4). 39-46.

25.

Center for Drug Evaluation and Research (CDER FDA) (1994), Validation of Chromatographic Methods, Reviewer Guidance.

26.

Bộ Y Tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm (sách dùng đào tạo dược sĩ đại

27.

QU Y

học), Nhà xuất bản Y học, pp. 104 - 110. Kataoka Hiroyuki and Lord Heather L. (2002) Chapter 23 Sampling and sample

preparation

for

clinical

and

pharmaceutical

analysis,

Comprehensive Analytical Chemistry. 37. 779-836. doi: Satinder Ahuja Michael Dong (2005), Handbook of Pharmaceutical

28.

Analysis by HPLC, ed. 1st, United States of America. Đoàn Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học

KÈ

29.

và vi sinh vật, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human use (2022) Validation of analytical

DẠ Y

30.

procedures: text and methodology. Q2(R2).

The European Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea 7th Edition vol 2, pp. 2056 - 2057.

32.

31.

Chu Hà My (2021) Bước đầu nghiên cứu bào chế transferosome

DẠ Y

KÈ

QU Y

NH ƠN

OF FI

ketoprofen. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Học viện Quân Y