Tinh dầu, hương liệu Phương pháp nghiên cứu và ứng dụng PGS.TS. Văn Ngọc Hướng by Dạy Kèm Quy Nhơn Official

PGS.TS. V¨n Ngäc H−íng

Tinh dÇu, h−¬ng liÖu ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu vµ øng dông

nhµ xuÊt b¶n ®¹i häc quèc gia hµ néi

MỤC LỤC

Trang MỞ ĐẦU ...................................................................................................1 Chương 1 KIẾN THỨC CƠ SỞ VỀ TINH DẦU ......................................................3 1.1. Định nghĩa tinh dầu ..................................................................3 1.2. Vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật ............................3 1.3. Tính chất của tinh dầu...............................................................4 1.4. Phân loại tinh dầu .....................................................................9 Chương 2 NGUYÊN LIỆU CHO TINH DẦU.........................................................30 2.1. Nguồn tài nguyên thực vật có tinh dầu ...................................30 2.2. Sự định khu của tinh dầu trong thực vật.................................30 2.3. Một số thực vật có tinh dầu ở Việt Nam.................................34 Chương 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ TINH DẦU ....................................44 3.1. Phương pháp cất tinh dầu với nước ........................................44 3.2. Phương pháp chiết tinh dầu ...................................................51 3.3. Phương pháp hấp phụ điều chế tinh dầu.................................61 3.4. Phương pháp ép tinh dầu ........................................................63 Chương 4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ NGHIÊN CỨU TINH DẦU .............64 4.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) khảo sát thành phần tinh dầu ...................................................................................64 4.2. Sắc ký khí (GC) và GC kết hợp với khối phổ (GC-MS) nghiên cứu tinh dầu ............................................................................70 Chương 5 PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN CỦA TINH DẦU ............................72 5.1. Phương pháp cất phân đoạn phân lập các thành phần của tinh dầu ...................................................................................72 iii

5.2. Phương pháp sắc ký cột phân lập các thành phần của tinh dầu ...................................................................................80 Chương 6 ÁP DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ CHO NGHIÊN CỨU TINH DẦU ..............................................................................................87 6.1. Phổ hồng ngoại (IR – Infrared Spectrocopy)..........................87 6.2. Phổ tử ngoại (UV – Ultra Violet Spectrometry).....................93 6.3. Phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS – Electron Impact Mass Spectrometry) ................................................................98 6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR ......................108 6.5. Ví dụ về xác định cấu trúc phân tử tecpenoit bằng phương pháp phổ................................................................................131 Chương 7 KIẾN THỨC CƠ SỞ VỀ CHẤT THƠM ..............................................147 7.1. Khái niệm về mùi và chất thơm............................................147 7.2. Cơ chế cảm nhận mùi ...........................................................148 7.3. Thụ quan hoá học (cảm thụ hoá học)....................................150 Chương 8 ĐÁNH GIÁ VỀ MÙI.............................................................................151 8.1. Độc tính và độ an toàn mùi...................................................151 8.2. Sự quyến rũ và ưa chuộng ....................................................152 8.3. Cường độ mùi .......................................................................154 8.4. Đánh giá mùi qua tính chất hoá lý của chất thơm ................157 8.5. Đánh giá mùi qua tác dụng sinh lý .......................................158 8.6. Giá trị mùi.............................................................................159 8.7. Cảm nhận tín hiệu mùi..........................................................159 Chương 9 MỐI LIÊN HỆ GIỮA CẤU TRÚC PHÂN TỬ VÀ HOẠT TÍNH MÙI ..........................................................................161 9.1. Sự lựa chọn lập thể đối quang ..............................................161 9.2. Sự lựa chọn lập thể không đối quang ...................................162 9.3. Đặc tính điện tử.....................................................................164 iv

9.4. Một vài ví dụ về nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính mùi ....................................................................165 Chương 10 CÁC THÀNH PHẦN CỦA CHẤT THƠM ..........................................171 10.1. Đơn hương.............................................................................171 10.2. Chất điều hương ....................................................................177 10.3. Chất định hương....................................................................177 10.4. Dung môi...............................................................................179 Chương 11 ỨNG DỤNG CỦA TINH DẦU ............................................................181 11.1. Tinh dầu cho nước hoa và mỹ phẩm .....................................181 11.2. Tinh dầu cho thực phẩm........................................................182 11.3. Tinh dầu cho dược phẩm.......................................................183 11.4. Tinh dầu cho sản xuất hương liệu .........................................183 Chương 12 MỘT SỐ CHUYỂN HOÁ TINH DẦU.................................................184 12.1. Mục đích, thành phần và khả năng chuyển hoá ....................184 12.2. Một số chuyển hoá của các tinh dầu .....................................185 Chương 13 ỨNG DỤNG CỦA CHẤT THƠM........................................................192 13.1. Kỹ thuật pha chế hương liệu .................................................192 13.2. Pha chế hương liệu ................................................................195 13.3. Pha chế hương bắt chước và một số đơn pha chế hương bắt chước ....................................................................................196 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................203

MỞ ĐẦU Nước ta ở vùng nhiệt đới gió mùa, ánh sáng nhiều, lượng mưa lớn, độ ẩm cao nên thực vật phát triển mạnh. Thảm thực vật nước ta đa dạng và phong phú vào bậc nhất thế giới, có hàng nghìn họ, hàng vạn loài và đặc biệt phong phú là các loại cây có tinh dầu. Có nhiều cây quý hiếm như thảo quả, quế chi, bạch đậu khấu, dương xuân sa, sa nhân… Có nhiều cây đặc hữu như riềng Bắc bộ, riềng Phú Thọ… Các cây có tinh dầu không chỉ là nguồn nguyên liệu phong phú cho khai thác tinh dầu mà còn là nguồn cây thuốc dân tộc, chữa được nhiều bệnh hiểm nghèo và hiệu dụng, là cây gia vị nổi tiếng trong chế biến thực phẩm. Nếu biết đi sâu nghiên cứu nguồn tài nguyên này, biết bảo tồn quỹ gen quý giá và phát triển thì chắc chắn nó sẽ mang lại lợi ích to lớn về kinh tế xã hội, góp phần chuyển đổi cơ cấu cây trồng và phát triển kinh tế nông thôn. Tinh dầu là một lĩnh vực rất lớn và quan trọng của hợp chất thiên nhiên. Nghiên cứu tinh dầu sẽ góp phần phát triển hoá hữu cơ, đặc biệt sinh tổng hợp hữu cơ qua vi sinh vật, qua công nghệ biến đổi gen và nuôi cấy mô tế bào. Hơn nữa, nói đến tinh dầu là nói đến hương liệu, nói đến chất thơm, nói đến gia vị vì hầu hết tinh dầu phục vụ cho các lĩnh vực này và làm thuốc phục vụ cho đời sống. Nền văn minh của con người càng phát triển, nhu cầu này càng lớn. Như vậy, nghiên cứu và phát triển tinh dầu có đầy đủ điều kiện về nguyên liệu cũng như nhu cầu, do đó nó trở thành ngành có nhiều tiềm năng và triển vọng. Cuốn sách được chia thành ba phần chính. Phần thứ nhất là các khái niệm cơ bản về tinh dầu, về nguồn gốc, các tính chất vật lý và hoá học của tinh dầu, về phân loại tinh dầu, về nguyên liệu và các phương pháp điều chế tinh dầu. Phần thứ hai đề cập đến các phương pháp nghiên cứu tinh dầu; các phương pháp sắc ký phân tích định tính, định lượng, nhận biết các thành phần của tinh dầu, các phương pháp vật lý hiện đại xác định cấu trúc phân tử của các thành phần của tinh dầu. Phần thứ ba của 1

cuốn sách là các ứng dụng và chuyển hoá tinh dầu thành các mặt hàng đắc dụng khác. Với các nội dung trên, chúng tôi hi vọng cuốn sách không chỉ đưa đến cho độc giả những kiến thức cơ bản, sâu sắc và toàn diện về tinh dầu mà còn đưa đến cho độc giả các phương pháp nghiên cứu hiện đại đối với tinh dầu. Rõ ràng cuốn sách như một cẩm nang đối với những ai say mê nghiên cứu và ứng dụng tinh dầu. Tuy vậy, khó mà đáp ứng được hết mọi yêu cầu của độc giả, hơn thế không thể nói là không có những thiếu sót. Do đó, những ý kiến đóng góp của độc giả đối với cuốn sách là vô cùng quý giá đối với chúng tôi, chúng tôi rất trân trọng và tham khảo để tu sửa cuốn sách tốt hơn nữa. Tác giả

Phần thứ nhất

TINH DẦU Chương 1 KIẾN THỨC CƠ SỞ VỀ TINH DẦU 1.1. Định nghĩa tinh dầu Hiện nay có một số quan niệm khác nhau về tinh dầu. Người thì cho rằng tinh dầu là các chất thơm thu được từ thực vật, người khác cho rằng tinh dầu là sản phẩm thứ cấp trong quá trình trao đổi chất trong thực vật. Theo Martin Petozilka, Charles Ehret, tinh dầu là sản phẩm thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước từ nguyên liệu thực vật. Quan niệm này cho đến nay được nhiều người thừa nhận hơn cả. 1.2. Vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật Với nguyên tố cacbon đánh dấu và các phương pháp khác, người ta đã chứng minh được rằng tinh dầu cũng như nhiều hợp chất khác trong cơ thể thực vật được sinh tổng hợp từ cùng một chất khởi nguyên, đó là axit axetic. Axit này chuyển thành Geranylpyrophotphat và Farnesylpyrophotphat; từ hai dẫn xuất này sinh tổng hợp ra hàng loạt chất khác nhau, đáp ứng nhu cầu và phát triển của cơ thể thực vật. Quá trình đó được Nicolaev mô tả trên sơ đồ hình 1.1. Người ta cũng chứng minh được rằng tinh dầu tham gia vào nhiều quá trình chuyển hoá trong cơ thể thực vật. Nó tồn tại trong thực vật không những ở dạng tự do trong các túi tinh dầu mà còn liên kết với các hợp chất khác nhau trong các mô của tế bào thực vật và như thế tinh dầu tham gia vào các quá trình trao đổi chất, quá trình sinh lý, sinh hoá trong cơ thể thực vật. Có người cho rằng tinh dầu tự do trong các túi tinh dầu là chất tiết của cơ quan tiết của thực vật, nhưng nhiều người cho rằng đó là chất dự trữ, chất bảo vệ. Còn tinh dầu liên kết với các chất khác trong các mô, các cơ quan khác nhau của thực vật là tinh dầu chuyển hoá, tinh dầu chức năng. 3

Axit axetic Geranylpyrophosphat

Monotecpenoit

Farnesylpyrophosphat

Geranyl - geronyl (P)

Serquitecpenoit

§itecpenoit

Carotenoit

Vitamin E vµ K

Phyton

Vitamin A

Cophermen

Hocmon sinh s¶n

Plastoquinon

C¸c vitamin D

Giberilin

Steroit

Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hoá Geranylpyrophotphat và Farnesylpyrophotphat trong cơ thể sống (Nicolaev, 1968)

Theo P.X. Tanaxienco (1985), tinh dầu trong thực vật có các vai trò sau đây: – Bảo vệ: chống sâu bệnh, chống nấm, chống tàn phá của ngoại cảnh; – Biến đổi sức căng bề mặt của nước trong cây, thúc đẩy sự vận chuyển nước, tăng hiệu quả của phản ứng enzym. Gần đây người ta cho rằng tinh dầu, nhất là phần nhẹ, phần có mùi là thông tin hoá học giữa các cơ thể sống trong giới thực vật và có khi đóng vai trò duy trì sự tồn tại và phát triển của thực vật, đặc biệt là tinh dầu của các loài hoa, chính nhờ mùi của tinh dầu của các loài hoa mà ong, bướm, côn trùng bị lôi cuốn để hưởng thụ nên chúng chuyển từ hoa này sang hoa khác, từ hoa đực sang hoa cái, mang theo các nhuỵ hoa làm cho quá trình thụ phấn thêm kết quả và thực vật thêm phát triển. 1.3. Tính chất của tinh dầu Tinh dầu là một hỗn hợp nhiều thành phần, nó thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước nên nó không tan hoặc kém tan trong nước. Tuy là một hỗn hợp nhiều thành phần nhưng mỗi loại tinh dầu của mỗi loài, hay một bộ phận của thực vật xác định thì có số thành phần xác 4

định, hàm lượng các thành phần cũng xác định nên các hằng số vật lý như tỷ trọng (d), chiết suất (n), độ quang cực (α) và các chỉ số hoá học như chỉ số axit, chỉ số ancol, chỉ số cacbonyl, chỉ số este… của nó là xác định. Chính vì thế, người ta căn cứ vào các hằng số vật lý và các chỉ số hoá học của tinh dầu để sơ bộ nhận biết và đánh giá tinh dầu.

1.3.1. Tính chất vật lý và hằng số vật lý của tinh dầu Nếu tinh dầu là chất lỏng thì chúng thường có nhiệt độ sôi không ổn định và có khi cao đến 320oC và chiết suất từ 1,378 đến 1,5850, tỷ trọng nhỏ hơn hoặc lớn hơn 1 một chút. Nếu tinh dầu là chất rắn thì có điểm chảy ≤ 160oC. Tinh dầu không tan hay kém tan trong nước, tan tốt trong cồn 99,5%, đietyl ete, benzen, etylaxetat… a) Tỷ trọng của tinh dầu Tỷ trọng của tinh dầu là tỷ số của trọng lượng của một thể tích xác định của tinh dầu và trọng lượng của nước có cùng thể tích. Tỷ trọng phụ thuộc vào bản chất tinh dầu, thành phần tinh dầu và vào nhiệt độ. Tỷ trọng càng cao thì mạch cacbon tinh dầu càng dài nếu là mạch thẳng, số vòng càng lớn nếu là mạch vòng, các dẫn xuất oxi có tỷ trọng cao hơn các hiđrocacbon tương ứng. Khi đo ở 20oC, ta có: m1 − m d 20 20 = m2 − m trong đó: d là tỷ trọng; 20 ở trên là nhiệt độ tinh dầu lúc đo; 20 ở dưới là nhiệt độ của nước lúc đo; m là trọng lượng của cuvet; m1 là trọng lượng của cuvet và tinh dầu; m2 là trọng lượng của cuvet và nước. Tỷ trọng của một chất nguyên chất hay một hỗn hợp có thành phần không đổi là một hằng số ở một nhiệt độ xác định nên người ta dùng tỷ trọng để đánh giá độ tinh khiết một chất hay đánh giá thành phần của một hỗn hợp. Vì thể tích thay đổi theo nhiệt độ, đối với nước khối lượng riêng của nó lớn nhất khi ở 4oC, khi đó 1 ml nước nặng 1 g. Từ 4oC đến 20oC khối lượng của nó giảm, nên khi đo nước ở nhiệt độ khác mà muốn đưa về 4oC thì phải nhân thêm khối lượng riêng của nước lúc đo, ví dụ đo ở 20oC: 5

d 20 20 =

m1 − m m2 − m

×Q

trong đó: Q là khối lượng riêng của nước lúc đo (cho trong các tài liệu). b) Chiết suất (chỉ số khúc xạ) Chiết suất của tinh dầu là tỷ số của sin góc tới trên sin góc khúc xạ khi cho tia sáng đi từ không khí vào tinh dầu. Chiết suất phụ thuộc vào bản chất của chất, phụ thuộc vào thành phần của hỗn hợp, phụ thuộc vào nhiệt độ và bước sóng của ánh sáng dùng để đo. Thường người ta đo chiết suất ở 20oC và ánh sáng là bước sóng vạch D của natri và khi đó ta có n 20 D . Đối với một số tinh dầu chiết suất của nó thay đổi từ 0,013 đến 0,014, nhưng thông thường từ 0,003 đến 0,004 khi nhiệt độ thay đổi, nghĩa là thay đổi rất ít ở con số thứ ba sau dấu phảy. Vì vậy, điều hoà nhiệt độ chính xác khi đo chiết suất là rất quan trọng, thường dùng nhiệt kế có độ chính xác 0,1oC. Vì có độ chính xác cao và rất phụ thuộc vào thành phần nên người ta dùng chiết suất để theo dõi quá trình phản ứng, ví dụ phản ứng chuyển hoá pseudoionon thành α,β-ionon hay thành phần hỗn hợp α và β-ionon. Quá trình hiđro hoá, polime hoá hay vòng hoá đều có ảnh hưởng lớn đến nD, nên người ta có thể dùng n 20 D theo dõi các quá trình đó. Ví dụ: geraniol:

n 20 D = 1,4760;

xitronelol: n 20 D = 1,4560;

xitral:

n 20 D = 1,4890;

xitronelal:

n 20 D = 1,4880;

pseudoionon:

n 20 D = 1,5330;

α-ionon:

n 20 D = 1,4980.

Chiết suất của một chất lỏng nguyên chất hay một hỗn hợp có thành phần xác định là một hằng số ở một nhiệt độ xác định nên người ta dùng chiết suất để nhận biết và đánh giá tinh dầu, xác định độ tinh khiết của chất. c) Độ quay cực của tinh dầu Hầu hết tinh dầu đều có cacbon bất đối xứng nên có đồng phân quang học, nghĩa là nó làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực đi một góc nào đó khi cho ánh sáng phân cực qua tinh dầu. Tuỳ theo tinh dầu tạo 6

ra góc quay bên phải hay bên trái mà ta có tinh dầu quay phải +α hay quay trái –α. Để xác định chiều quay của tinh dầu người ta đo độ quay cực của D-glixeranđehit, nếu cùng chiều thì tinh dầu thuộc dãy D (quay phải) và ngược lại là dãy L (quay trái). Độ quay cực α phụ thuộc vào bản chất của chất, vào nồng độ, vào chiều dài của cuvet đựng tinh dầu để ánh sáng đi qua, vào nhiệt độ khi đo, vào bước sóng của ánh sáng dùng để đo. [α]Dt gọi là độ quay cực riêng của chất quang hoạt. Thông thường người ta xác định [α]Dt theo công thức sau: [α ]Dt =

100α

l.C ở đây: α là góc đọc được trên quang cực kế;

l là chiều dài cuvet dùng để đo; t là nhiệt độ khi đo; C là nồng độ (số gam tinh dầu trong 100 ml dung dịch). Đối với tinh dầu nguyên chất, người ta thường đo độ quay cực ở o 20 C, ánh sáng vàng vạch D của đèn natri, chiều dài cuvet là 1 dm và C lúc đó chính là tỷ trọng và ta có công thức: α [α ]20 D = d ở đây: α: trị số đo được trên máy; d: tỷ trọng của tinh dầu đã xác định ở 20oC. Độ quay cực riêng của một chất lỏng quang hoạt trong hỗn hợp chất lỏng có chất quang hoạt và thành phần không đổi là một hằng số ở một nhiệt độ xác định và bước sóng xác định nên người ta dùng nó để đánh giá độ tinh khiết của một chất hay thành phần của hỗn hợp.

1.3.2. Các chỉ số hoá học của tinh dầu a) Chỉ số axit của tinh dầu Chỉ số axit của tinh dầu là số miligam KOH dùng để trung hoà hết số axit tự do có trong 1 gam tinh dầu: 5, 61.a Ax = m 7

a: số ml dung dịch KOH 0,1N; m: lượng cân của tinh dầu theo gam. Nếu biết phân tử lượng của axit có trong tinh dầu thì hàm lượng axit có trong tinh dầu là: a.M % axit = 5, 61 M: phân tử lượng của axit. Chỉ số axit cho biết hàm lượng axit trong tinh dầu. b) Chỉ số este Chỉ số este của tinh dầu là số miligam KOH cần để thuỷ phân hết lượng este có trong 1 gam tinh dầu: (v − v ).5, 61 E= 1 2 m v1: số ml KOH 0,1N cho vào để thuỷ phân este; v2: số ml KOH 0,1N dư sau phản ứng; m: lượng cân của tinh dầu theo gam. Chỉ số este cho biết hàm lượng este trong tinh dầu. Chú ý: Để có chỉ số este chính xác, người ta dùng tinh dầu đã xác định chỉ số axit để xác định chỉ số este, hoặc là tinh dầu đã loại hết axit tự do rồi xác định chỉ số este. c) Chỉ số ancol tự do trong tinh dầu Chỉ số ancol tự do trong tinh dầu được tính bằng chỉ số axyl hoá tinh dầu. Chỉ số axyl hoá tinh dầu là hiệu số của chỉ số este sau khi axyl hoá và chỉ số este của tinh dầu. Gọi chỉ số ancol là An, chỉ số este sau khi axyl hoá là E2 và chỉ số este của tinh dầu là E1, ta có chỉ số ancol tự do trong tinh dầu: An = E2 – E1 Chỉ số ancol cho biết hàm lượng ancol trong tinh dầu. d) Chỉ số cacbonyl (anđehit và xeton) Hầu hết các anđehit và xeton tham gia phản ứng oxim hoá: C 8

→ O + NH2OH.HCl ⎯⎯

+ HCl

Chuẩn độ lượng HCl hình thành trong phản ứng chúng ta biết lượng NH2OH tham gia phản ứng và từ đó suy ra được lượng nhóm cacbonyl có trong tinh dầu tham gia phản ứng. Có thể nói chỉ số nhóm cacbonyl trong tinh dầu là số miligam hiđroxylamin để oxim hoá hết nhóm cacbonyl có trong 1 gam tinh dầu: 33N C= m N: số mol NH2OH.HCl dùng cho phản ứng; m: lượng cân. Chỉ số cacbonyl cho biết hàm lượng hợp chất cacbonyl trong 1 gam tinh dầu. 1.4. Phân loại tinh dầu

Người ta thường phân loại tinh dầu theo hai cách: phân loại theo nguồn gốc nguyên liệu để điều chế tinh dầu và phân loại theo thành phần hoá học chính của tinh dầu.

1.4.1. Phân loại tinh dầu theo nguồn gốc Cách phân loại này dựa vào nguyên liệu để sản xuất ra tinh dầu để gọi tên tinh dầu, vì thế tên của tinh dầu xuất phát từ tên nguyên liệu và khi đó mùi của tinh dầu cũng đặc trưng cho mùi của nguyên liệu dùng để sản xuất tinh dầu. Ví dụ tinh dầu của quả chanh gọi là tinh dầu chanh và mùi của tinh dầu chanh cũng là mùi của quả chanh; tinh dầu của hoa bưởi gọi là tinh dầu hoa bưởi và mùi của tinh dầu này là mùi của hoa bưởi; tinh dầu của vỏ cây quế gọi là tinh dầu quế và mùi của tinh dầu quế là mùi của vỏ cây quế… Cách phân loại này vừa nói được loại nguyên liệu dùng để sản xuất tinh dầu, vừa nói được mùi đặc trưng của tinh dầu cũng như của nguyên liệu và như vậy nó rất thuận lợi cho người dùng.

1.4.2. Phân loại tinh dầu theo thành phần hoá học Thành phần hoá học chính của tinh dầu là thành phần có hàm lượng lớn nhất hay tổng các thành phần có hàm lượng lớn và căn cứ thành phần chính người ta gọi tên tinh dầu. Ví dụ: Tinh dầu thảo quả (Amomam aromaticum Roxb) có hàm lượng các dẫn xuất isopren (C5) chiếm tới 80 – 85%, đặc biệt lớn là 9

1,8-cineol nên người ta gọi tinh dầu thảo quả là tinh dầu tecpenoit. Tinh dầu màng tang (Litsea cubeba Lour) cũng là tinh dầu tecpenoit vì thành phần chính của nó là citral, một dẫn xuất oxi của monotecpen, chiếm trên 60%. Nhưng tinh dầu xá xị (Cinnamomum Porecterum Kosterm) là tinh dầu phenylpropanoit (C6-C3). Vì thành phần chính của tinh dầu này là safrol - một dẫn xuất của phenylpropan. Tinh dầu hương nhu trắng (Ocimum Gratisimum L.) có thành phần chính là eugenol (60 – 80%), một dẫn xuất của phenylpropan nên nó cũng là tinh dầu phenylpropanoit. Cách phân loại này không chỉ cho biết thành phần chính của tinh dầu mà còn cho biết thành phần chính thuộc loại hợp chất gì nên rất thuận tiện cho nhận thức và định hướng sử dụng tinh dầu. Tuy vậy, cách phân loại như trên chỉ là tương đối vì có nhiều loại tinh dầu không những có thành phần tecpenoit mà còn có cả thành phần phenylpropanoit nữa. Ví dụ tinh dầu bạch đậu khấu (Mefristica fragram H.), ngoài thành phần tecpenoit như pinerycamphen còn có cả myristixen là dẫn xuất của phenylpropan. 1.4.2.1. Tinh dầu tecpenoit Trong thiên nhiên, số lượng tinh dầu tecpenoit chiếm đại đa số. Nghiên cứu cấu trúc phân tử của tinh dầu tecpenoit, L. Ruzika (1922) đi đến nhận xét rằng tất cả các phân tử của thành phần tinh dầu tecpenoit đều được xây dựng trên cơ sở đơn vị isopren (C5). Nói một cách khác, người ta có thể phân chia khung cacbon phân tử của các thành phần tinh dầu tecpenoit thành các đơn vị isopren (C5) và như thế, tuỳ theo số đơn vị isopren trong cấu trúc phân tử mà người ta chia tecpenoit thành các lớp chất khác nhau: + Hemitecpen được xây dựng từ 1 đơn vị isopren (C5); + Monotecpen được xây dựng từ 2 đơn vị isopren (C10); + Sesquitecpen được xây dựng từ 3 đơn vị isopren (C15); + Đitecpen được xây dựng từ 4 đơn vị isopren (C20); + Sestotecpen được xây dựng từ 5 đơn vị isopren (C25); + Tritecpen được xây dựng từ 6 đơn vị isopren (C30); + Politecpen được xây dựng từ nhiều đơn vị isopren (C5)xn. Đến đây chúng ta thấy thuật ngữ tecpenoit có nghĩa rất rộng, nó bao gồm không những các hợp chất thuộc lớp hemi, mono, sesqui, đi, tri…

mà cả các dẫn xuất chứa oxi, các dẫn xuất thoái biến của tecpen như ionon; chòn thuật ngữ tecpen thường chỉ một lớp chất, ví dụ monotecpen, sesquitecpen… và các dẫn xuất của chúng. Tuy vậy, trong sử dụng đôi khi ranh giới này cũng không rõ ràng. L. Ruzika còn nhận xét rằng các đơn vị isopren trong phân tử tecpenoit thường liên kết “đầu đuôi” với nhau: ®u«i ®Çu

®u«i

+ ®Çu

®u«i

⎯⎯ → ®Çu

C5H8

C10H16

isopren

oximen

Phát hiện này vô cùng quan trọng, không những nó thúc đẩy tìm kiếm quy luật chung của sự hình thành các phân tử tecpenoit trong thiên nhiên trên cơ sở các đơn vị isopren mà còn giúp ích rất lớn trong viẹc xác định cấu trúc phân tử của các tecpenoit mới tìm được và còn gợi mở sự tìm kiếm các đơn vị isopren thiên nhiên để tìm ra sự phát sinh sinh học (biogenesis) các tecpenoit. a) Sự phát sinh sinh học các tecpenoit Sự phân lập được axit mevalonic của Folker năm 1956 và các nghiên cứu tiếp theo của Blocklynen, Dopjax đã làm sáng tỏ con đường sinh tổng hợp axit mevalonic và cơ chế chuyển hoá axit này thành các đơn vị isopren sinh học, làm cơ sở cho các quá trình sinh tổng hợp các tecpenoit trong thiên nhiên. Quá trình này được J. Manh (1992) tóm tắt như sau:

Đầu tiên là sự ngưng tụ 2 phân tử axetyl-ScoA tạo thành axetoaxetyl-SCoA (I), tiếp theo là sự cộng hợp ái nhân của axetyl-ScoA khác vào phân tử xetoaxetyl-ScoA vừa tạo thành rồi thuỷ phân cho sản phẩm 3-hiđroxy-3-metylglutaryl-SCoA (II). Khử sản phẩm này thành hemithioaxetyl (III) và khử tiếp thành axit 3R-mevalonic (IV), axit này bị photphat hoá, decacboxyl hoá và loại nước để tạo thành isopentenylpyrophotphat (V) (IPP) và đimetylallylpyrophotphat (VI) (DMAPP) hay tạo thành IPP rồi đồng phân hoá thành DMAPP. Các đơn vị isopren hoạt động này là những nguyên liệu cho sinh tổng hợp các tecpenoit trong thiên nhiên.

CH3

H SCoA + CH2

SCoA ⎯⎯⎯→ CH3

− HSCoA

CH2

SCoA

O (I)

CH3

CH2

SCoA + CH3

O OH CH

khö

⎯⎯ → HOOC

(III)

HOPP

SCoA

(II)

khö

→ HOOC SCoA ⎯⎯

OH CH2OH (IV)

⎯⎯ → ⎯⎯⎯ → HOOC

OH CO

→ HOOC SCoA ⎯⎯

OH CH2OPP

CH2OPP

− H2O

IPP (V)

− CO2

⎯⎯ →

CH2OPP DMAPP (VI)

Hình 1.2. Sơ đồ sinh tổng hợp các “isopren hoạt động”

b) Các hemitecpen (C5) Các hemitecpen hình thành là do sự chuyển hoá các đơn vị “isopren hoạt động” IPP và DMAPP qua các phản ứng thuỷ phân, hợp nước, oxi hoá, khử hay tác dụng với các hợp chất khác, và như thế bộ khung cacbon của nó chỉ có một đơn vị isopren (C5). Hầu hết chúng là các chất có hoạt tính sinh học, các pheromon giới tính, các chất báo động hay phòng vệ. Ví dụ 2-metyl-3-buten-2-ol (1) là một pheromon tập hợp, nghĩa là khi có mùi của hợp chất này thì các loại côn trùng cánh cứng tập hợp lại thành tốp lớn; 3-metyl-3-buten-1-ol (2) là một pheromon báo động của ong bò vẽ; este 3-metyl-2-pentin-2-buteonal (3) tạo thành trong tuyến nọc độc của ong thợ Vespa Crabro. Sau đây là một số hemitecpen thường gặp:

N OH

O (1)

(2)

(3)

(4)

O S

HO (5)

(6)

S S

(7)

(8)

S (9)

Trong thành phần mùi của các loài hoa cũng có một số hemitecpen, khi đó các chất này đóng vai trò là chất dụ dẫn côn trùng mang phấn hoa đực sang hoa cái tạo điều kiện cho nòi giống phát triển. c) Monotecpen (C10) Sinh tổng hợp monotecpen (C10) bắt nguồn từ sự cộng hợp ái điện tử đimetylallylpyrophotphat (C5) vào liên kết đôi của isopentenylpyrophotphat (C5), sau đó loại axit pyrophotphoric (HOPP) tạo thành geranylpyrophotphat (C10) là một chất khởi nguyên của các monotecpen. Chính sự ngưng tụ đầu đuôi này của phân tử đimetylallylpyrophotphat (I) với isopentenylpyrophotphat (II) là cơ sở lý thuyết cho nguyên tắc đầu đuôi của L. Ruzicka. isopenteylpyrophotphat 1 4 3 1

H2 C

OPP

(I) ®imethylallylpyrophotphat

⎯⎯ →

OPP

CH2

HR HS

(II)

CH2

OPP

3 2

OPP

CH2OPP

⎯⎯⎯→ HOPP

Geranyl PP (GPP)

⎯⎯ → ←⎯ ⎯

CH2OPP

Neryl PP (NPP)

Hình 1.3. Sơ đồ sinh tổng hợp tiền chất của monotecpen: GPP và NPP

Geranylpyrophotphat (GPP) đồng phân hoá dễ dàng thành các dạng khác nhau theo sơ đồ sau: OPP OPP

⎯⎯ →

OPP

⎯⎯ →

OPP

⎯⎯ →

OPP

⎯⎯ →

C¸c tecpen vßng ®¬n vßng ®«i

Hình 1.4. Chuyển hoá GPP thành monotecpen

Chính sự đa dạng trong đồng phân hoá này mà từ các chất khởi nguyên GPP sinh tổng hợp được trên 500 monotecpen khác nhau, có cả trong các vi khuẩn, vi trùng, vi nấm, tảo, côn trùng thực vật và cả động vật như cá sấu, hải li… Nhưng phổ biến và quan trọng nhất của monotecpen là trong thực vật. Nó có trong hơn 100 họ thực vật và chiếm khoảng 0,01% trọng lượng tươi, chiếm phần lớn mùi của hoa, tinh dầu và turpentin, phổ biến nhất là trong các họ cây hạt kín như orrchidaceae, asteraceae và limiceae. Sau đây là một số khung cacbon cơ sở của monotecpen (C10):

(1) 2,6-§imetyloctan

(2) Lavandulan

(3) Artemizan

(4) p-Mentan

(5) m-Mentan

(6) Cafranan

(9) Iran

(13) Camfan

(10) Pinan

(14) Isocamfan

(17) Xantenan

(7) Evicarvan

(8) Ionan

(11) Tuian

(15) Fenxan

(18) Tetraxantalan

(12) Caran

(16) Xantan

(19) Chrisantenan

Hình 1.5. Các khung cacbon cơ sở của monotecpen

Một cách tổng quát, người ta chia khung cacbon của monotecpen thành hai loại: loại theo nguyên tắc (regular) và loại không theo nguyên tắc (irregular), monotecpen theo nguyên tắc là dẫn xuất của geranylpyrophotphat, một sản phẩm ngưng tụ của đimetylallylpyrophotphat và isopentenylpyrophotphat theo nguyên tắc đầu đuôi của hai đơn vị isopren, loại monotecpen theo nguyên tắc phổ biến nhất trong thiên nhiên. Loại monotecpen ít phổ biến hơn trong thiên nhiên là monotecpen không theo nguyên tắc. Loại này không phù hợp với mô hình chung của nguyên tắc đầu đuôi của các đơn vị isopren mà sinh ra do sự sắp xếp lại 15

của dạng monotecpen nguyên tắc hay do sự ngưng tụ không theo đầu đuôi của hai phân tử đimetylallylpyrophotphat. Nhóm thứ nhất do sự sắp xếp lại các monotecpen theo nguyên tắc như các chất fenchen (21), camphen (22), eurcarvon (23) và nezukon (24).

3 2

(21)

(22)

(23)

(24)

Ví dụ như sự phát sinh sinh học các monotecpen isocamphen và fenchon do Wagner Meerwein đề nghị là một điển hình: OPP OPP OPP

⎯⎯ →

HOH

⎯⎯ →

OH [O] ⎯⎯ →

Fenchon

⎯⎯ → Isocamphen

Nhóm thứ hai do sự ngưng tụ không đầu đuôi của hai đơn vị isopren đimetylallylpyrophotphat. Đại diện cho nhóm chất này là lavandulol (25), xeton aremisia (26), santolinatrien (27) và axit chrysanthemic (28).

HO O C O (25)

(26)

(27)

(28)

Sinh tổng hợp lavandulol là một ví dụ cho loại này: 2

PPO

⎯⎯ →

PPO

3' 1'

⎯⎯ → 1' - 2

HOCH2

1 2 1'

⎯⎯ →

2' 3'

Cation lavandulyl

Lavandulol

d) Sesquitecpen (C15) Theo D.J. McGasvey và Q.C. Rotean (1995), sesquitecpen là sản phẩm thiên nhiên phổ biến nhất được nghiên cứu mạnh mẽ nhất và được hiểu biết sâu sắc nhất về hoá học, về sinh hoá và phát sinh sinh học. Trên 300 khung cacbon khác nhau đã được xác định và hàng nghìn các hợp chất có oxi biến đổi của chúng được phân lập từ thực vật trên đất liền và trên biển, từ nguồn vi sinh vật. Các chất chuyển hoá này biểu hiện các đặc tính sinh lý như kháng sinh, chống ung thư, chống oxi hoá, chống vi khuẩn, chống độc, chống nấm, chống côn trùng… và hoạt tính hocmon. Rất nhiều sesquitecpen hiđrocacbon, ancol và các dẫn xuất tạo nên tinh dầu, nhờ tính thơm và mùi mà nó trở nên những chất có giá trị kinh tế cao. Khung cacbon của sesquitecpen có 15 nguyên tử cacbon tương ứng với 3 đơn vị isopren, đó là sự ngưng tụ đầu đuôi của geranylpyrophotphat (GPP) với isopentenylpyrophotphat (IPP) để tạo thành famesylpyrophotphat (FPP). Do sự phân cực của liên kết C1–OPP, do sự tương tác ái nhân của các liên kết đôi C6–C7 và C10–C11 mà vòng hoá để tạo thành các cation vòng trung gian có vòng 6 hay 7 như I và II (a, b) do liên kết đôi C6–C7 tạo nên, vòng 10 hay 11 như III và IV (c, d) do liên kết đôi C10–C11 tạo

nên. Các cation trung gian tự vòng hoá, sắp xếp lại và kết thúc phản ứng bằng cách vất bỏ proton hay tương tác với tác nhân ái nhân mà thông thường là nước để dập tắt điện tích dương và tạo ra sản phẩm sesquitecpen. H OPP

OH 1

GPP (C 10)

IPP (C 5) − HOPP

(I) 10

(III)

2 1

OPP d

c FPP

(II)

(IV)

e f

OPP

PP (C 15)

(V)

Sơ đồ sinh tổng hợp các sesquitecpen

Cần nhớ rằng có rào cản hình học cho sự đóng vòng trực tiếp transtrans-FPP để tạo vòng, như liên kết đôi cis để tạo vòng 10 và 11, trong trường hợp này người ta cho rằng có sự đồng phân hoá FPP thành NPP tương ứng để có cấu hình linh hoạt và do đó NPP trải qua sự ion hoá đóng vòng một cách dễ dàng (quá trình e và f). 18

Sau đây nêu một vài ví dụ. Ví dụ 1: Sinh tổng hợp δ-cadinen.

OPP

OPP FPP

NPP

H −H

δ-Cadinen

Ví dụ 2: Sinh tổng hợp β-farnesen, α- và β-bisabolen. −H

CH2

H β-Farnesen a

OPP FPP

OPP

NPP

H2C

c α-Bisabolen

β-Bisabolen

Cho đến nay, người ta đã tìm thấy hàng nghìn sesquitecpen khác nhau, nhưng tất cả chúng đều xếp vào trong 300 khung cacbon cơ sở. Sau đây là một số khung chính:

(1) Farnezan

(2) Bizabolan

(3) Elenman

(4) Humulan

(5) Germaeran

(6) Ka®inan

(7) Xelinan

(8) §aukan

(9) Eremofilan

(10) Gvaian

(11) Khamazulen

(12) Vetivan

(13) Xieran

(14) Kariofilan

(15) Akoran

(16) β-Xantalan

(17) Bergamotan

(18) Kopan

(19) Aromadendran

(20) Xedran

(21) Patrulan

e) Đitecpen (C20) Các kiểu đóng vòng khác nhau của geranylgeranyldiphotphat (GGPP) bằng enzym là cơ sở lý luận cho sự tạo thành đitecpen. Như vậy khung cơ sở của đitecpen có 20 nguyên tử cacbon hay là 4 đơn vị isopren (C5×4 = C20). Phần lớn hợp chất đitecpen là chất rắn có nhiệt độ sôi cao, tỷ trọng 0,92 – 0,95. Có 5 loại enzym đóng vòng khác nhau để tạo ra đitecpen. + Tổng hợp casben: Sự tạo thành (1S,3R)-casben bằng cách ion hoá đóng vòng GGPP do sự tấn công của liên kết đôi cuối mạch lên cacbon allylic-1 đã bị ion hoá:

⎯⎯ → 14 15

H5 1

GGPP

OPP

3 2

H2 Casben

+ Tổng hợp ent-copalyđiphotphat Proton gây ra sự đóng vòng để tạo thành ent-copalyđiphotphat:

OPP

OPP CH2

⎯⎯ →

H H

H GGPP

ent-Copalyl®iphotphat (ent-CPP)

+ Tổng hợp taxađien Bắt đầu bằng sự ion hoá GGPP và qua một loạt bước đóng vòng, taxa-4,11-đien được tạo thành:

Enz → H B

⎯⎯ → H OPP

11 12

4 5

H Taxa-1,4-®ien

Enz

+ Tổng hợp abietađien Sự hình thành abieta-7,13-đien bằng một loạt bước vòng hoá mà bắt đầu bằng sự thúc đẩy của proton và sự ion hoá GGPP:

OPP

⎯⎯ →

H OPP H

GGPP

CPP

13 1

H Abieta-7,13-®ien

+ Tổng hợp ent-kauren Không phải bắt đầu từ GGPP mà bắt đầu từ ent-CPP để đóng vòng tạo ra ent-kaur-16-en:

OPP 1

H H

⎯⎯ →

4 3

H ent-kaur-16-en

Tuy vậy, vào năm 1997 người ta chỉ ra rằng GGPP bị chuyển hoá thành ent-kaur-16-on qua ent-CPP trong nấm Phacospharia L. 487. Trên cơ sở đặc tính chung người ta chia sinh tổng hợp đitecpen thành hai dạng: dạng A bắt đầu bằng sự ion hoá điphotphat, còn dạng B bắt đầu bằng sự proton hoá ở liên kết đôi 14,15.

Tiếp theo dạng A là dạng B và được xúc tác cùng loại enzym hay khác loại enzym, ngược lại có thể tiếp theo dạng B là dạng A và được xúc tác cùng loại hay khác loại enzym. Sự chuyển đổi bắt đầu bằng sự vòng hoá sản phẩm được xúc tác bằng men oxi hoá. Thuộc vào dạng A, ví dụ xembren-4,6-ddiol (1); dạng A-B, ví dụ taxuyunnanin C (2) (có trong tế bào T. Chinensis); thuộc dạng B, ví dụ ent-sclaren (3) và dạng B-A, ví dụ pimarađien (4). OAc OH H OAc H

AcO H

OAc (1)

(2)

H H (3)

H H (4)

f) Tritecpen (C30) Vì hầu hết tritecpen đều là chất rắn, có nhiệt độ sôi rất cao, hầu như ít khi có trong tinh dầu nên không được đề cập đến ở đây. Các isoprenoit khác như carotenoit, steroit cũng tương tự, không được đề cập đến ở đây. 1.4.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tecpenoit a) Đồng phân cấu tạo Chính sự ngưng tụ đầu đuôi của các đơn vị isopren như đã nêu trên mà tạo ra rất nhiều đồng phân cấu tạo mạch nhánh, mạch vòng. Trong phân tử lại có liên kết đôi, có cacbon bất đối xứng nên tạo ra nhiều đồng phân hình học và đồng phân quang học. Chính sự liên kết các đơn vị isopren như thế nên một đặc điểm đặc thù của hợp chất tecpenoit là trong

phân tử có nhóm metyl, metylen, isopropyl, isopropenyl. Nắm được đặc điểm này giúp chúng ta nhanh chóng nhận ra cấu trúc phân tử của nó nhờ vào các phương pháp vật lý hiện đại. b) Đồng phân hình học Chính sự liên kết các đơn vị isopren nên liên kết đôi trong hợp chất tecpenoit rất phổ biến và do đó các đồng phân Z-, E- xuất hiện nhiều. Nguyên nhân là ở chỗ liên kết đôi C=C do một liên kết σ và một liên kết π tạo thành, có sự xen phủ cực đại mặt bên của hai obitan p chưa lai hoá của hai nguyên tử cacbon tham gia liên kết. Sự xen phủ kiểu mặt bên này làm cho liên kết π có mặt phẳng đối xứng và do đó nó ngăn cấm liên kết này quay tự do (vì quay tự do liên kết π sẽ bị phá vỡ và sẽ gây ra hiện tượng đồng phân hoá Z ↔ E). Vì không quay tự do được nên khi có các nhóm thế khác nhau ở 2 nguyên tử cacbon tham gia liên kết đôi thì xuất hiện sự phân bố khác nhau của các nhóm thế ở phía này hay ở phía kia của mặt phẳng liên kết π. Chính sự phân bố khác nhau này tạo ra các đồng phân hình học Z và E. Đồng phân Z được quy định cho 2 nhóm thế có thể tích lớn của 2 nguyên tử cacbon tham gia liên kết đôi ở cùng một phía với mặt phẳng liên kết π và khác phía là đồng phân E. Ví dụ: a c a c

Za>b

d E-

c>d

Z (Zusammen): cïng nhau

a>b

c<d

E (Entegegen): kh¸c nhau

Sự lớn bé của các nhóm thế được quy định theo số thứ tự nguyên tử trong bảng tuần hoàn: H < C < N < O < F < Cl Ví dụ: Cl Cl Cách gọi cũ đây là đồng phân cis, cách gọi mới là đồng phân E, như vậy hai cách gọi khác nhau. H Br ECl > H

Cl < Br

Cách gọi cũ đây là đồng phân trans, cách gọi mới là đồng phân E, như vậy hai cách gọi giống nhau.

CH3 E-

Cl > H

Cl > CH3

Khi nhóm thế phức tạp thì xét liên kết tiếp theo, ví dụ: Cl

CH2OH

CH3

CH2OH CH(CH3)OH

H E-

ZCl > H

C(OHH) > C(HHH)

Cl > H

C(OHH) < C(HCO)

Với các liên kết đôi thì xem như nối với 2 nguyên tử, ví dụ: H C

O O

C(OOH)

C(OOO) 2

OH E-, Z(Geraniol)

E-, E(Nerol)

Đối với hợp chất vòng thì tuỳ theo nhóm thế ở cùng phía hay khác phía của mặt phẳng phân tử mà có các đồng phân cis hay trans: HOOC

COOH

HOOC

cis-

trans-

COOH

OH Mentol

Mentol

Isomentol

Neomentol

Isoneomentol

c) Đồng phân quang học Nếu trong phân tử tecpen có 1 cacbon bất đối xứng thì người ta đo độ quay cực của nó cùng với độ quay cực của D-glyxeranđehit. Khi đó, nếu nó có độ quay cực cùng chiều với độ quay cực của D-glyxeranđehit thì nó có cấu hình D- và ngược lại là L-. Và khi đó có sự quy ước nhóm tương đương của nhóm thế ở cacbon bất đối xứng của tecpen với các nhóm thế –CHO, –OH, –H và –CH2OH của D-glyxeranđehit. Ví dụ D-citronellal có cấu hình như sau: 2

CH2CHO

CHO

6 7 9

CH2C5H9

3 8

CH3

D-Citronellal

CH2OH H

D-Citronellal

D-Glyxeran®ehit

Nếu trong phân tử có nhiều cacbon bất đối xứng thì chọn cacbon bất đối xứng có trị số điểm nhỏ nhất để xếp cấu hình: 3 2 1

* *

2 3

CH2

CH3 6

CH2

CH2CH2

CH2

CH3

Nếu chúng ta theo ký hiệu của Can, Ingon và Preloc (1955, 1956) thì việc quy định nhóm thế tương đương của cacbon bất đối của tecpen với nhóm thế của cacbon bất đối của glyxeranđehit là không cần thiết. Vì theo hệ thống ký hiệu này, người ta chọn nhóm thế cấp nhỏ nhất trong 27

bốn nhóm thế của cacbon bất đối đặt ở đỉnh tứ diện xa người quan sát nhất, ba nhóm thế còn lại nằm trên mặt phẳng tứ diện gần người quan sát nhất. Nếu sự sắp xếp ba nhóm thế này theo thứ tự từ lớn đến bé mà đúng với chiều quay của kim đồng hồ thì cấu hình phân tử của cacbon bất đối là R (nghĩa là bên phải), còn ngược chiều quay của kim đồng hồ thì cấu hình phân tử của cacbon bất đối là cấu hình S (nghĩa là bên trái). Theo cách này, cấu hình D-citronellal ở trên là cấu hình R vì thứ tự CHHCOOO > CHHCHH > CHHH theo chiều quay của kim đồng hồ. Tương tự như vậy, D-menton là R-menton. 1.4.3.2. Tinh dầu phenylpropanoit (C6–C3)

Tinh dầu phenylpropanoit là tinh dầu mà thành phần chính là các dẫn xuất phenypropan. Số lượng loại tinh dầu này trong thiên nhiên không nhiều và phổ biến bằng tinh dầu tecpenoit nhưng nó có giá trị kinh tế cao và có nhiều ứng dụng cho cuộc sống. Ví dụ tinh dầu hương nhu trắng (Ocimum Gratissimum L.), hương nhu lìa (Ocimum Tencuflorum L.). Trong tinh dầu hương nhu trắng eugenol (1) chiếm tới 70 – 73,5%, ở Nam Trung Quốc thành phần này lên tới 95%. Tinh dầu quế (Cinnamomum Cassia J.S. Presc) có thành phần chính là anđehit cinnamic (2) chiếm từ 70 – 95%. Tinh dầu xá xị (Cinnamomum porrecterum Kosteon Slee) có thành phần chính là Safrol (3) chiếm 90 – 96%. Vanillin (4) một thành phần phổ biến trong nhựa cây bồ đề (Stymax Pierc). CH2

CH2

CH CH

CHO

CH2

OCH3

OH (1)

O (2)

(3)

CH2

CHO

OCH3 OH (4)

Tất cả các chất trên và các chất tương tự đều là dẫn xuất của phenylpropan và được sinh tổng hợp từ phenylalanin qua sơ đồ sau:

Axit shikimic qua thø cÊp

CH2

COOH

NH2 Phenylalanin

CH CH

COOH CH CH

COSCoA CH CH

CHO

Axit cinnamic

CH CH

COOH CH CH

CH2OH

CH2 CH2

OCH3 OH

Axit ferulic

COSCoA CO CH

COSCoA

CH2

O Safrol

COSCoA

OCH3 OH

Eugenol

OCH3 OH

CH2

OCH3 OH

CH CH

CH2OH

Ancol cinaramylic

OCH3 OH

CH CH

CHO

OCH3 OH VanilloylCoA

OCH3 OH Vanillin

Sơ đồ sinh chuyển hoá phenylalanin thành các phenylpropanoit

Chương 2 NGUYÊN LIỆU CHO TINH DẦU 2.1. Nguồn tài nguyên thực vật có tinh dầu

Cho đến nay, nguyên liệu chủ yếu cho sản xuất tinh dầu là thực vật bậc cao, còn động vật thì rất ít. Có khoảng 3.000 loài cây trong 120 họ thực vật bậc cao có tinh dầu và tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới 45%, vùng ôn đới 20%, cận nhiệt đới 10%, còn lại là các vùng khác. Việt Nam ở vùng nhiệt đới gió mùa nên có rất nhiều loài thực vật có tinh dầu. Các họ cây có nhiều loài chứa tinh dầu là: họ sim (Myrtaceae), họ bạc hà (Lamiaceae), họ hoa tán (Apinaceae), họ cúc (Asteraceae), họ cam (Rutaceae), họ long não (Lauraceae), họ thông (Pinaceae), họ hoa hồng (Rosaceae), họ gừng (Zingiheraceae), họ hoàng đàn (Cupressaceae)… Tuy số loài cây có tinh dầu có nhiều nhưng mới có khoảng 100 loài cây đã đưa vào khai thác, gieo trồng, sử dụng và cung cấp khoảng 80.000 tấn/năm tinh dầu cho nhu cầu của thế giới. Nước sản xuất nhiều tinh dầu nhất là Trung Quốc, sau đó đến Ấn Độ, Brazin, Indonesia. Nước tiêu thụ nhiều tinh dầu nhất là Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Nhật Bản, Thuỵ Sỹ… Giá tinh dầu khá đắt, nhất là tinh dầu quý hiếm như tinh dầu trầm hương - khoảng 100.000 USD/kg, hoa hồng - khoảng 7.600 USD/kg, vông vang - 5.000 USD/kg. 2.2. Sự định khu của tinh dầu trong thực vật

Các kết quả nghiên cứu cho đến nay đã khẳng định rằng tinh dầu có mặt trong tất cả các loại mô của thực vật, thậm chí cả trong cơ thể của động vật và vi sinh vật. Từ thực tế này, người ta cho rằng quá trình tích luỹ tinh dầu không chỉ là hoạt động chức năng riêng của cơ quan tiết tinh dầu mà còn đóng vai trò là chất trung gian của quá trình trao đổi chất trong cơ thể thực vật. Tinh dầu là một hỗn hợp các chất hữu cơ rất phức tạp, có tinh dầu có số thành phần xấp xỉ 100, hàm lượng các thành phần rất khác nhau. Tỷ lệ hàm lượng giữa các thành phần của tinh dầu thay đổi theo điều kiện sinh 30

trưởng, pha sinh trưởng và trong các bộ phận khác nhau của thực vật. Nhưng theo một số tác giả thì số lượng thành phần của tinh dầu ít thay đổi trong phạm vi một loại. Cho đến nay, nhiều nhà nghiên cứu thống nhất rằng tinh dầu chỉ được tích luỹ ở các cấu trúc chuyển hoá gọi là cơ quan tiết, như thế sự định khu của tinh dầu trong thực vật gắn liền với sự định khu của quá trình hình thành cơ quan tiết và hoạt động tích luỹ tinh dầu của cơ quan này trong quá trình sinh trưởng của cây.

2.2.1. Định khu và phân loại cơ quan tiết Căn cứ vào nguồn gốc phát sinh, người ta chia cơ quan tiết làm hai nhóm: nhóm cơ quan tiết ngoại sinh và nhóm cơ quan tiết nội sinh. Khi cơ quan tiết nằm ở mặt ngoài của cơ thể thực vật thì gọi là cơ quan tiết ngoại sinh, ngược lại khi cơ quan tiết nằm bên trong các bộ phận cơ thể thực vật thì gọi là cơ quan tiết nội sinh. Ở thực vật thuộc nhóm cơ quan tiết ngoại sinh thì các cơ quan tiết hình thành từ tế bào biểu bì của chồi sinh trưởng, còn nhóm cơ quan tiết nội sinh thì có cơ quan tiết bên trong các cơ quan của thực vật. Các thực vật có cơ quan tiết ngoại sinh, nghĩa là hữu sinh tại biểu bì và phân bố tinh dầu cũng theo quy luật chung là nằm ở biểu bì. Còn các thực vật có cơ quan tiết nội sinh thì phân bố của tinh dầu không theo quy luật nào cả. Có loài thì tinh dầu ở vỏ thân, lá, vỏ quả. Có loài thì tinh dầu ở rễ (gừng, riềng), có loài thì tinh dầu ở vỏ màng hạt (vông vang). Như vậy sự phân bố tinh dầu trong thực vật đi kèm với nguồn gốc và phân bố của cơ quan tiết. Tất cả các đặc điểm trên của sự phân bố cơ quan tiết của thực vật được thể hiện trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Sự phân bố cơ quan tiết và tinh dầu trong một số loài thực vật

Loài thực vật

Cơ quan tiết

Nơi định khu tinh dầu

Bạc hà (Mentha spp)

Ngoại sinh

Biểu bì, lá, thân, đài hoa

Hương nhu (Ocimum spp)

Ngoại sinh

Biểu bì, lá, thân, đài hoa

Gừng gió (Zingiber zerumbet)

Nội sinh

Thân, rễ (củ)

Tràm (Melalenca spp)

Nội sinh

Lá, vỏ thân, quả

Dầu (Dipterocaprus)

Nội sinh

Gỗ, thân

Vông vang (Ambelmos-chus)

Nội sinh

Màng hạt

Quá trình phân hoá cơ quan tiết, cấu trúc và hoạt động của cơ quan tiết ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng, khối lượng của tinh dầu, nó dễ bị ảnh hưởng bởi tác động bên ngoài.

2.2.2. Cấu tạo của cơ quan tiết Như trên đã trình bày, căn cứ vào nguồn gốc và vị trí phát sinh, người ta chia cơ quan tiết thành 2 nhóm: nhóm nội sinh và ngoại sinh. Ở mỗi nhóm như vậy lại chia thành nhóm nhỏ hơn nữa và cách chia này cho đến nay vẫn còn nhiều tranh cãi, nhưng cách chia được nhiều người chấp nhận là cách chia do G.A. Denixova đề nghị (1975). Cách chia đó theo sơ đồ sau:

TuyÕn tiÕt Ngo¹i sinh L«ng tiÕt C¬ quan tiÕt

TÕ bµo tiÕt Néi sinh

èng tiÕt TuyÕn tiÕt néi sinh

Theo Denixova, nhóm cơ quan tiết ngoại sinh bao gồm 2 nhóm nhỏ: tuyến tiết và lông tiết. Tuyến tiết lại có 2 kiểu: tuyến tiết 1 tế bào cán và tuyến tiết 2 tế bào cán. Mỗi kiểu như vậy đặc trưng cho một loài hay một họ. Ví dụ kiểu tuyến ngoại tiết 1 tế bào cán thường gặp ở các loài ở họ hoa môi, trong lúc đó loài Salvia Sclareae thì tuyến ngoại tiết có 3 tế bào cán, còn loại Hclichchrysam Italicum có nhiều tế bào cán. Lông tiết được đặc trưng bằng cấu trúc đơn bào ở đầu, nếu lông tiết có 2, 4 tế bào ở đầu thì chúng được xếp thành một hàng. Lông tiết rất phong phú và đa dạng, ngay trong một loài tc cũng có nhiều dạng lông tiết. Sau khi tiết ra, tinh dầu cư trú ngay tại tuyến tiết hay lông tiết và ở vùng dưới lớp biểu bì. Nhóm cơ quan tiết nội sinh theo Denixova được chia thành 3 nhóm: + Tế bào nội tiết: tế bào này làm chức năng tiết tinh dầu và tích luỹ tinh dầu. Ở đây sau khi tiết, tinh dầu tập trung thành giọt và cư trú ở không bào. + Ống tiết: bao gồm nhiều ống làm chức năng tiết tinh dầu và làm thành hệ thống ống tiết của cây. Tinh dầu sau khi được tiết thì tập trung lại trong ống tiết. 32

+ Tuyến nội tiết: có cấu tạo hình cầu với 16 (hoặc hơn) tế bào tiết, nằm ở mặt ngoài. Tinh dầu tiết ra được chứa vào khoang bao bọc bởi các tế bào tiết.

2.2.3. Hoạt động tích luỹ tinh dầu của cơ quan tiết Quá trình tổng hợp tinh dầu trong thực vật do tế bào tiết đảm nhiệm và thực hiện qua hệ thống men. Sau khi hình thành các phân tử tinh dầu tập hợp thành hạt rất bé và tồn tại trong sinh chất của tế bào. Ở đây các hạt tinh dầu bé tập hợp với nhau thành giọt lớn tinh dầu. Ở giai đoạn này, người ta có thể quan sát thấy giọt tinh dầu qua kính hiển vi dưới sự hỗ trợ của chất nhuộm màu thích hợp. + Đối với tế bào tiết thì tinh dầu tích luỹ trong không bào. Không bào chứa tinh dầu tăng dần, cả về số lượng và thể tích trong quá trình sinh trưởng của cây, các không bào dung nạp vào nhau tạo nên khoang chứa tinh dầu. Song song với quá trình này có quá trình tiêu giảm và keo hoá các nguyên sinh chất của dịch tế bào, sản phẩm của quá trình này bám sát vào vách tế bào hay nằm xen kẽ với các khoang tinh dầu. + Đối với các ống tiết thì không bào phát triển rông thành gian bào. Ở phần non của ống tiết, tế bào tiết hoạt động mạnh, ở phần già của ống tiết tế bào tiết già dần, keo hoá tạo thành mỏng áp sát tế bào tạo ra các ống dẫn tinh dầu và các chất khác (lignin). Như vậy, ở phần non của ống tiết là các tế bào tiết hoạt động để tổng hợp và tích luỹ tinh dầu, còn ở phần già thì tế bào tiết chất và để tạo ra các ống dẫn, ống thấm. + Ở tuyến tiết nội sinh thì quá trình tích luỹ tinh dầu trong các tế bào tiết theo lực li tâm và tạo thành quả cầu chứa tinh dầu. Quả cầu chứa tinh dầu tăng dần về kích thước trong suốt quá trình tiết. Đối với cơ quan tiết ngoại sinh, hoạt động tiết và tích luỹ theo một cơ chế chung: khoang chứa tinh dầu hình thành do sự phát triển của màng Cuticul bao phủ đầu tiết. Như vậy, tinh dầu vừa được sinh tổng hợp ra đã ở trong khoang chứa bằng màng Cuticul. Nhiều nghiên cứu cho thấy màng Cuticul phát triển độc lập, không phụ thuộc vào sự tổng hợp tinh dầu. Minh chứng cho điều này là thể tích khoang chứa tinh dầu đạt được cực đại và hoàn chỉnh trước lúc tinh dầu được tổng hợp.

Tóm lại, dù thực vật có cơ quan tiết nội sinh hay ngoại sinh thì sự tổng hợp tinh dầu vẫn do tế bào tiết đảm nhiệm và thực hiện qua hệ thống men. Nhưng với thực vật có cơ quan tiết nội sinh thì tinh dầu tích luỹ trong các khoang, các tuyến hay túi cầu và chúng được bao bọc bởi vách bào vững chắc và nằm sâu trong cơ quan tiết. Trong khi đó, thực vật có cơ quan tiết ngoại sinh thì tinh dầu tích luỹ ngay trên bề mặt cơ quan tiết và chỉ được bao bọc bởi màng Cuticul mỏng manh nên tinh dầu dễ thoát ra ngoài không khí khi có tác động của ngoại cảnh như cơ học hay vật lý. Nhận thức trên rất quan trọng trong quá trình điều chế tinh dầu từ một nguyên liệu thực vật đã biết. 2.3. Một số thực vật có tinh dầu ở Việt Nam

Thực vật chứa tinh dầu ở Việt Nam có rất nhiều, hàng trăm loài, hàng chục chi có trong nhiều họ thực vật khác nhau. Ở đây chỉ nêu lên một số loài phổ biến, quan trọng và có ý nghĩa kinh tế. Để cho việc tra cứu chúng được thuận tiện, các loài thực vật có tinh dầu được xếp theo thứ tự abc của tên thường dùng, không theo thứ tự abc của tên quốc tế, có ghi bộ phận sử dụng, hàm lượng tinh dầu, thành phần chính (có hàm lượng lớn) và vùng sinh thái (xem bảng 2.2).

Chương 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ TINH DẦU Cho đến nay, có thể xếp các phương pháp sản xuất tinh dầu thành 4 nhóm chính: + Phương pháp cất với nước; + Phương pháp chiết; + Phương pháp hấp thụ; + Phương pháp ép. Mỗi phương pháp có những ưu điểm riêng, nhược điểm riêng, kỹ thuật tiến hành riêng. Nó có thể có hiệu quả tốt cho nguyên liệu này mà không thích hợp cho nguyên liệu khác. Chính vì thế người ta phải căn cứ vào đặc tính của nguyên liệu và đặc tính của tinh dầu có trong nguyên liệu đó mà chọn phương pháp thích hợp nhất, để có hiệu quả cao nhất. 3.1. Phương pháp cất tinh dầu với nước

Đây là một phương pháp cổ truyền nhất, truyền thống và phổ biến nhất. Có nhiều kỹ thuật thực hiện cất tinh dầu với nước: cất trực tiếp, cất cách thuỷ, nhưng cả hai phương pháp này đều có cùng một cơ sở lý thuyết chung.

3.1.1. Cơ sở lý thuyết Quá trình cất là quá trình chuyển trạng thái lỏng thành trạng thái hơi và ngưng tụ trạng thái hơi thành trạng thái lỏng. Tóm tắt quá trình này theo sơ đồ: Láng 1 Láng 1 lµ nguyªn liÖu

H¬i

Ng−ng tô h¬i

Láng 2 Láng 2 lµ s¶n phÈm

Khi cung cấp nhiệt cho chất lỏng, tức là tăng nhiệt độ và làm tăng quá trình bay hơi của nó. Sự bay hơi tăng dần đến khi áp suất hơi của chất lỏng bằng áp suất khí quyển trên bề mặt chất lỏng thì chất lỏng sôi. Lúc này, sự cung cấp nhiệt càng mạnh, chất lỏng sôi càng mạnh, tốc độ 44

bay hơi càng nhanh, và nhiệt độ sôi của nó thì không thay đổi, cho đến khi chất lỏng bay hơi hết thì nhiệt độ mới thay đổi. Như vậy, nhiệt độ sôi của một chất lỏng là một hằng số và gắn liền với áp suất khí quyển trên bề mặt chất lỏng đó. Vì thế nói nhiệt độ sôi của một chất lỏng bao giờ cũng phải nói áp suất mà chất lỏng đó sôi, ví dụ nước sôi ở 100oC ở áp suất 760 mmHg. Áp suất càng thấp thì nhiệt độ sôi càng giảm. Sự sôi của một đơn chất lỏng xảy ra khi áp suất hơi riêng phần của nó bằng áp suất khí quyển trên bề mặt nó. Vậy sự sôi của một hỗn hợp chất lỏng xảy ra khi tổng áp suất riêng phần của các thành phần chất lỏng không tan vào nhau bằng áp suất khí quyển trên bề mặt hỗn hợp chất lỏng đó. Như thế nhiệt độ sôi của một hỗn hợp thường nhỏ hơn nhiệt độ sôi của các thành phần khi chúng ở riêng biệt. Quả vậy, nhiệt độ sôi của nước ở 760 mmHg là 100oC, nhiệt độ sôi của anilin ở áp suất 760 mmHg là 184oC. Nhưng nhiệt độ sôi của hỗn hợp anilin - nước ở áp suất này (760 mmHg) chỉ là 98,5oC. Rõ ràng nhiệt độ sôi của hỗn hợp anilin - nước thấp hơn nhiệt độ sôi của anilin cũng như nhiệt độ sôi của nước khi chúng nguyên chất. Tinh dầu cũng vậy, nó là một hỗn hợp không tan hay kém tan trong nước, nên khi cất với nước thì nhiệt độ sôi của hỗn hợp tinh dầu - nước bao giờ cũng thấp hơn nhiệt độ sôi riêng phần của tinh dầu cũng như nhiệt độ sôi riêng phần của nước. Nói cách khác, dù nhiệt độ sôi của tinh dầu cao hơn 100oC bao nhiêu đi nữa nhưng khi trộn lẫn tinh dầu và nước thì khi cất chúng ta cất chúng ở nhiệt độ thấp hơn 100oC. Đây là một ưu việt lớn của phương pháp cất với nước vì nó cho phép ta hạ nhiệt độ cất xuống thấp, nên các tinh dầu ít bị biến chất vì nhiệt, nhất là các tinh dầu nhạy cảm với nhiệt. Trong tướng hơi của hỗn hợp tinh dầu và nước, nếu chúng ta gọi áp suất hơi của tinh dầu và hơi nước là P; gọi áp suất hơi riêng phần của tinh dầu là Ptd và của hơi nước là Pn thì theo định luật Dalton ta có: P = Ptd + Pn (3.1) Nếu chúng ta gọi Ntd là số mol của tinh dầu trong tướng hơi và Nn là số mol của nước trong tướng hơi của chúng thì (vì số mol riêng phần tỷ lệ thuận với áp suất riêng phần) ta có tỷ lệ:

N td Nn

Ptd

(3.2)

Trong tướng hơi, nếu chúng ta gọi trọng lượng của hơi tinh dầu là Wtd và trọng lượng của hơi nước là Wn; phân tử lượng của nước là Mn và phân tử lượng của tinh dầu là M td (vì tinh dầu là một hỗn hợp nhiều chất nên chúng ta lấy phân tử lượng trung bình), lúc này chúng ta có: W N td = td (3.3) M td Nn =

Wn Mn

(3.4)

Thay (3.3) và (3.4) vào (3.2) ta có: Wtd Wn

Ptd .M td Pn .M n

(3.5)

Khi chúng ta đem toàn bộ hơi trên bề mặt hỗn hợp tinh dầu nước mà ngưng tụ thành hỗn hợp lỏng tinh dầu - nước thì biểu thức (3.5) là biểu thức biểu thị tỷ lệ về trọng lượng của phần tinh dầu cất được và phần nước cất được. Vì tinh dầu không tan trong nước nên bị tách khỏi nước và kết hợp với nhau thành phần dầu riêng và phần nước riêng, hai phần này cách li bằng mặt phân cách (mặt phân lớp). Người ta dùng phễu chiết để lấy phần dầu và phần nước riêng. Vì biểu thức (3.5) không đề cập đến các yếu tố trong tướng lỏng của hỗn hợp nê tỷ lệ giữa tinh dầu và nước trong tướng lỏng cũng chưa xác định. Nhưng nếu có một lượng tinh dầu lúc đầu là Wtd thì chúng ta cũng có thể tính được lượng nước cần để cất hết lượng tinh dầu đó nhờ biểu thức (3.5) và khi đó lượng dầu thu được này chính là gần bằng lượng dầu lấy trước khi cất. Do đó lượng nước cần thiết để cất hết lượng tinh dầu Wtd là: W .P .M Wn = td n n (3.6) Ptd .M td Ở đây Wtd là hỗn hợp tinh dầu để cất; Mn = 18; M td thường lấy phân tử lượng của thành phần chính của tinh dầu; còn Pn và Ptd thì xác định bằng thực nghiệm. 46

Một cách gần đúng người ta lấy Pn = 760 và lấy áp suất hơi bão hoà của thành phần chính của tinh dầu ở nhiệt độ 100oC. Và như thế, với bất kỳ một nguyên liệu nào khi biết hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu đưa cất thì người ta cũng biết được lượng nước cần thiết để cất hết số tinh dầu có trong nguyên liệu đó nếu biết Mtd và Ptd. Điều đáng lưu ý trong thực tế, tinh dầu trong nguyên liệu không phải ở dạng tự do, nó liên kết với nguyên liệu, bị hấp thụ trong nguyên liệu… do đó áp suất hơi riêng phần của nó nhỏ hơn nhiều so với Ptd mà ta tính ở trên và càng khác nhiều so với áp suất hơi bão hoà của thành phần chính mà chúng ta chọn ở 100oC. Do đó lượng nước lấy theo biểu thức (3.6) bao giờ cũng phải lấy thừa. Tuy nhiên vì nước là nguyên liệu rẻ tiền nên để có hệ số an toàn cao, không gây hiện tượng khét cháy, bao giờ nước cũng được lấy lớn hơn gấp nhiều lần so với lý thuyết và lúc này lại nảy sinh vấn đề là làm thế nào để biết khi nào thì lượng tinh dầu cất hết để ngừng cất. Người ta thường dùng dung dịch KMnO4 0,1% để thử hỗn hợp tinh dầu và nước cất được. Khi phản ứng này âm tính có nghĩa là hết tinh dầu trong hỗn hợp và khi đó kết thúc sự cất.

3.1.2. Phương pháp cất trực tiếp nguyên liệu và nước Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện nhất do đó phổ biến nhất. Người ta cho nguyên liệu và nước vào nồi cất, cung cấp nhiệt trực tiếp cho nồi cất để hỗn hợp nguyên liệu (tinh dầu) và nước sôi biến thành hỗn hợp hơi tinh dầu - nước, chuyển hỗn hợp này vào bộ phận ngưng tụ để ngưng tụ thành hỗn hợp lỏng tinh dầu - nước, dẫn hỗn hợp lỏng này vào bộ phận phân li để phân li tinh dầu và nước thành hai phần riêng biệt. Dùng bình chiết để chiết lấy dầu. Quá trình này thể hiện ở sơ đồ sau:

H¬

nh i ti

dÇu

−íc -n

Nguyªn liÖu cã tinh dÇu, n−íc, nhiÖt

Ng−ng tô h¬i tinh dÇu vµ n−íc

N−íc

Hç tin n hî hd pl á Çu - n ng −íc

Ph©n li vµ chiÕt

Tinh dÇu

Phương pháp này áp dụng chung cho tất cả các loại nguyên liệu có tinh dầu. Tuy nhiên, tuỳ theo bản chất nguyên liệu và bản chất tinh dầu mà người ta thực hiện ở mỗi công đoạn có khác nhau. a) Xử lý nguyên liệu Với các loại nguyên liệu mà thân nhỏ, mềm, lá mỏng, nhỏ, ngắn như cây sả, hương nhu, lá bạch đàn, cây hoắc hương, cây húng, cây ngải cứu, cây rau mùi, hương lau… người ta chỉ cần băm nhỏ hay thái nhỏ. Các loại hoa như bưởi, nhài, huệ, ngọc lan… người ta chỉ dập nát. Đối với các loại thân gỗ cứng, gỗ pơmu, rễ rẽ hương, trầm hương… người ta phải làm thành mùn cưa hay bào thành phoi bào mỏng. Đối với các loại quả hạt như hạt tiêu, sa nhân, bạch đậu khấu, hồi, thảo quả… người ta phải nghiền nhỏ. Đối với các nguyên liệu tươi thì sau khi xử lý cho vào nồi cất cùng với nước và tiến hành cất. Đối với nguyên liệu khô thì phải ngâm với nước khoảng từ 3 – 10 giờ rồi mới tiến hành cất. b) Cung cấp nhiệt Với cất trực tiếp thì người ta đun trực tiếp bằng củi, bằng than hay bằng điện, gas. c) Nồi cất Thông thường nồi cất có đáy cách nguyên liệu với đáy đun trực tiếp. Làm như vậy để tránh các chất nhựa, chất bột bám sát vào đáy đun trực tiếp tạo ra nhiệt độ cao cục bộ, gây khê, khét và cháy. Hiện tượng này sẽ sinh ra sự biến chất nguyên liệu, tinh dầu và làm sản phẩm có mùi khê, khét, không sử dụng được. d) Cung cấp nước Lượng nước thường lấy gấp 2, 3 lần tính theo lý thuyết. Người ta cho nước làm nhiều lần, lần đầu cho ngập nguyên liệu, các lần sau tuỳ theo lượng nước cất ra mà cho vào một lượng nước tương đương, cho đến khi cất hết tinh dầu. Chú ý không bao giờ để cạn kiệt nước trong nồi cất mới cho thêm nước. Hiệu quả cất tốt nhất khi nước trong nồi luôn luôn ngập nguyên liệu. Với các loại tinh dầu có tinh dầu nặng, nhiệt độ sôi cao, khó bay hơi, người ta thêm NaCl vào nồi cất với hàm lượng 12 – 15% để tăng nhiệt độ cất của hỗn hợp lên trên nhiệt độ sôi của nước, lúc đó nhiệt độ sôi của

dung dịch muối nước là 108oC, nhờ nhiệt độ cao này mà các phần nặng của tinh dầu cũng cất được và hiệu suất sẽ cao. Với các thiết bị hiện đại thì nước sau khi chiết lấy tinh dầu được cho trở lại nồi cất. Làm như vậy không chỉ tiết kiệm nước mà điều căn bản hiệu suất lấy tinh dầu sẽ cao và rất tiện cho khâu chiết tinh dầu thành sản phẩm sau này. e) Quá trình làm lạnh để ngưng tụ hơi hỗn hợp tinh dầu - nước Quá trình này thực hiện theo 2 cách: hoặc cho hỗn hợp hơi đi vào các ống dẫn toả nhiệt đặt trong lòng buồng nước luôn lạnh (a) hoặc cho luồng nước luôn lạnh đi vào các ống đặt trong buồng hỗn hợp hơi (b). Hiệu suất làm lạnh được tính theo biểu thức: kSv h= o t trong đó: h là hiệu suất đông tụ; S là diện tích tiếp xúc hơi nóng và mặt làm lạnh; k là hệ số truyền nhiệt; to là nhiệt độ làm lạnh; v là tốc độ dòng của nước. Yêu cầu của làm lạnh để ngưng tụ là hỗn hợp tinh dầu và nước ra khỏi buồng làm lạnh có nhiệt độ ≤ 25oC. f) Phân li tinh dầu và nước Người ta dẫn hỗn hợp tinh dầu - nước thu được sau ngưng tụ vào bình phân li. Bình này phải có cấu trúc đặc biệt để theo dõi được sự phân li và biết được sự phân li đã hoàn thành, nghĩa là 2 phần tinh dầu và nước tách biệt nhau bằng một mặt phân chia rõ ràng và nét. Khi đó, nếu tinh dầu nhẹ hơn nước (trường hợp phổ biến) nó nổi lên trên và người ta tháo khoá xả nước trở lại bình cất và lấy tinh dầu. Trong trường hợp dầu nặng hơn nước, nó lặn dưới nước thì người ta tháo lấy dầu, nước còn lại cho vào nồi cất. Ở lần cuối cùng, khi sự cất kết thúc thì người ta dùng dung môi để chiết phần dầu còn khuếch tán trong nước sau khi đã lấy dầu. Lúc này để việc chiết dễ dàng và cho hiệu quả cao, người ta bão hoà nước cất được bằng NaCl sạch vì NaCl tan mạnh trong nước nên nó đẩy tinh dầu tan kém trong nước ra và tạo điều kiện chiết tốt hơn. Mặt khác, NaCl làm tăng trọng lượng dung dịch, do đó tăng sự chênh lệch về tỷ trọng của dung dịch và dung môi, làm cho sự phân li lúc chiết nhanh chóng hơn.

NaCl còn là chất phá nhũ, phá keo vì nó là chất điện li mạnh làm cho quá trình phân li tinh dầu - nước chóng hoàn thành. Việc chiết tinh dầu còn lại trong nước thường tiến hành 3 lần, sau đó gộp dịch chiết lại, làm khô bằng chất làm khô rồi cất loại dung môi thu tinh dầu và gộp với tinh dầu chiết lúc ban đầu. Hiện nay người ta thiết kế bộ phận chiết liên tục để vừa lấy tinh dầu ra vừa cho nước quay trở lại nồi cất một cách liên tục để việc cất không bị gián đoạn.

3.1.3. Phương pháp cất cách thuỷ Về thực chất phương pháp này không khác với phương pháp cất trực tiếp nhưng cần chú ý đến những điểm sau: cất trực tiếp là tác dụng trực tiếp nhiệt vào nồi cất chứa nguyên liệu và nước, còn cất cách thuỷ là tác động nhiệt vào nồi cất chứa nước mà trong đó có đựng nồi cất nguyên liệu và nước. Như vậy nồi cất nhận nhiệt từ nước ở nồi cách thuỷ truyền cho nên ở đây không bao giờ có nhiệt độ cao hơn 100oC và tốc độ rất chậm. Chính vì thế tinh dầu thu được trong trường hợp này có mùi rất tốt, không bao giờ có cháy, có khê. Và cũng chính nhiệt độ cất thấp, tốc độ cất chậm nên phương pháp này chỉ thích hợp cho một số nguyên liệu có tinh dầu nhẹ, dễ bay hơi, rất nhạy cảm với nhiệt độ, dễ biến chất do nhiệt, ví dụ như tinh dầu hoa dạ hương.

3.1.4. Phương pháp cất với hơi của nước Phương pháp này thường áp dụng để tinh chế tinh dầu. Người ta cho một luồng hơi nước từ một nồi phát hơi đi vào trong lòng tinh dầu (trường hợp tinh chế tinh dầu) hay đi qua nguyên liệu chứa tinh dầu, nên luồng hơi này tác dụng với nguyên liệu làm bay hơi tinh dầu và mang theo hơi tinh dầu để đi vào bộ phận ngưng tụ như cất trực tiếp. Ưu điểm của phương pháp này là người ta có thể gia nhiệt luồng hơi nước trước lúc đi vào nồi cất để luồng hơi này có nhiệt độ trên 100oC (hơi quá nhiệt), nhờ vậy mà tăng nhiệt độ cất của hỗn hợp. Sự gia nhiệt luồng hơi này cao hay thấp tuỳ thuộc vào bản chất nguyên liệu và tinh dầu. Một ưu điểm nữa không kém phần quan trọng là không bao giờ có hiện tượng quá nhiệt cục bộ để gây cháy, khê. Chính vì thế phương pháp này thích hợp với nhiều nguyên liệu mà đặc biệt là nguyên liệu rễ, củ, quả có nhiều chất bột. 50

3.2. Phương pháp chiết tinh dầu

Dựa vào khả năng hoà tan khác nhau của một số chất trong các dung môi khác nhau, người ta đưa ra phương pháp phân lập chúng gọi là phương pháp chiết. Phương pháp chiết là phương pháp cổ nhất nhưng quan trọng nhất trong điều chế tinh dầu. Phương pháp này cho phép chuyển tinh dầu nằm trong một chất rắn hay trong một dung dịch vào dung môi, sau đó loại dung môi và thu tinh dầu. Nếu chất bị chiết được tách ra khỏi môi trường rắn bằng dung môi thì được gọi là chiết rắn - lỏng, còn chất bị chiết được tách ra khỏi môi trường lỏng (dung dịch) bằng dung môi thì gọi là chiết lỏng - lỏng. Chiết rắn - lỏng và chiết lỏng - lỏng có cùng một bản chất là dựa vào khả năng hoà tan của dung môi đối với chất bị chiết. Nếu khả năng hoà tan của dung môi đối với chất bị chiết lớn hơn lực liên kết của chất bị chiết với môi trường rắn hay khả năng hoà tan của nó đối với môi trường lỏng thì dung môi đó dùng được. Như vậy, điều quan trọng nhất trong phương pháp chiết là khả năng hoà tan của dung môi đối với chất bị chiết. Khả năng hoà tan này của dung môi dựa vào độ phân cực của dung môi, độ phân cực của chất bị chiết và tuân theo nguyên lý “đồng nhất”, nghĩa là dung môi có cực hoà tan chất có cực, dung môi không cực hoà tan chất không cực và ngược lại là không thực hiện được, nghĩa là dung môi có cực không hoà tan chất không cực. Ngoài ra, dung môi không được tương tác hoá học với chất hoà tan cũng như các chất trong môi trường và thiết bị, đặc biệt không được hoà tan vào môi trường chiết và có nhiệt độ sôi càng thấp càng dễ dàng loại bỏ nó ra khỏi chất bị chiết. Để chọn dung môi cho phương pháp chiết một chất nào đó người ta phải căn cứ vào đặc tính của dung môi và các đặc tính đó được chỉ ra trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc tính của một số dung môi

Tên chất

Công thức

d.c

d20

nd20

d.s

i.t

sol20

d.h

n-Hexan

C6H14

1,9

0,66

1,3779

68,9

240

k.tan

0,31

Cyclohexan

C6H12

2,0

0,78

1,4264

80,7

260

k.tan

0,94

Cacbon

CCl4

2,2

1,6

1,4631

0,08

0,97

46,5

tetraclorit

Đioxan

C4H8O2

2,2

1,03

1,422

101

375

sol

1,21

98,6

Xilen

C8H10

2,3

0,87

1,500

140

465

0,5

0,6

Toluen,

C7 H8

2,4

0,87

1,499

110,8

535

0,5

0,57

86,5

Cacbon đisulphit

CS2

2,6

1,26

1,630

46,5

102

2,9

0,4

Tricloroetylen

C2HCl3

3,3

1,46

1,477

410

0,57

Đietyl ete

(C2H5)2O

4,3

0,71

1,353

170

0,24

Clorofom

CHCl3

4,8

1,47

1,447

61,7

0,56

n-Butyl axetat

C6H12O2

5,0

0,88

1,395

126

370

0,73

Etyl axetat

C4H8O2

6,0

0,90

1,373

77,2

460

0,44

87,6

Metyl axetat

C3H6O3

7,3

0,93

1,359

240

0,38

104,4

Tetrehiđrofuran

C4H8O

7,4

0,89

1,407

230

sol

0,47

106,8

Điclorometan

CH2Cl2

9,0

1,32

1,424

605

0,43

78,7

Metyl glycol

C3H10O3

9,1

1,01

1,042

145

sol

1,14

C5H12O

13,9

0,81

1,411

138

300

3,4

101

Cyclohexanol

C6H12O

0,94

1,463

160

108

Butan-1-ol

CH3(CH2)3OH

0,81

1,399

117,2

340

2,95

143

Metyl glycol

C3H8O2

17,3

0,96

1,402

124

sol

1,7

135

Metyletyl xeton

C4H8O2

0,80

1,379

260

0,42

105

Propanol-2

CH3CH(OH)CH3

18,3

0,78

1,377

82,4

425

tan

2,27

159

Propanol-1

CH3CH2CH2OH

20,1

0,80

1,386

94,7

405

tan

2,2

166

Axeton

CH3COCH3

20,7

0,79

1,359

26,5

540

tan

0,32

125

Trietylenglycol

C6H14O4

1,12

1,456

288

355

tan

179

Etanol

C2H5OH

24,3

0,79

1,361

78,5

425

tan

1,2

166

Propylenglycol

C3H8O2

1,04

1,433

188

tan

Metanol

CH3OH

32,6

0,79

1,329

455

tan

0,55

263

Etylenglycol

C2H6O2

37,7

1,12

1,431

197

410

tan

Glyxerin

C3H8O3

42,5

1,261

1,4747

290

tan

1400

184

Nước

H2 O

78,5

1,00

1,333

100

1,0

539

metylbenzen

axetat Pentanol, amyl ancol

d.c: hằng số điện môi; d20: tỷ trọng;

n d20

: chiết suất; d.s: điểm sôi; i.t: nhiệt bốc cháy;

sol20: độ tan trong nước ở 20oC; η: áp suất hơi bão hoà; d.h: bắt nổ.

3.2.1. Chiết rắn - lỏng Chiết rắn - lỏng là chiết tinh dầu nằm trong môi trường rắn. Ví dụ chiết cafein khỏi cà phê, chiết tinh dầu chanh khỏi quả chanh. Chiết rắn lỏng là phương pháp rất phổ biến. Nó được áp dụng trong công nghệ thực phẩm để chiết chất thơm, trong công nghệ dược phẩm để chiết các chất làm thuốc trong cây thuốc, trong công nghệ mỹ phẩm để chiết các hương liệu cho pha chế mỹ phẩm… Quá trình chiết rắn - lỏng khá đơn giản. Người ta ngâm nguyên liệu vào dung môi một thời gian nhất định rồi lọc dịch chiết ra, loại dung môi và thu sản phẩm chiết. Cách này gọi là chiết ngâm gián đoạn. Người ta có thể cho dung môi đi qua nguyên liệu một cách liên tục để hoà tan chất bị chiết, sau đó loại dung môi và thu được sản phẩm chiết. Cách chiết này gọi là chiết liên tục (chiết Soxlec). Mỗi phương pháp như vậy có thể thực hiện ở nhiệt độ thường hay ở một nhiệt độ xác định. Để thực hiện chiết có hiệu quả cần chú ý các vấn đề sau đây: a) Xử lý nguyên liệu trước lúc chiết Chất bị chiết thường phân bố trong nguyên liệu, liên kết với nguyên liệu và được nguyên liệu che chở. Do đó, để chiết được chúng người ta phải xử lý nguyên liệu để giải phóng chúng ra hay tạo điều kiện cho chúng tiếp xúc với dung môi để dung môi tương tác với chúng và hoà tan chúng. Ví dụ: Vì tinh dầu trong quả chanh tập trung ở vỏ quả, còn trong các múi và ruột quả hầu như không có tinh dầu. Hơn nữa, cơ quan của chanh thuộc loại nội sinh, tinh dầu nằm trong các tế bào tiết hay ống tiết, do đó việc xử lý tốt nhất ở đây là gọt vỏ chanh ra khỏi vỏ, sau đó tiến hành đập nát hay nghiền nhỏ để chiết. b) Lựa chọn dung môi Kết quả chiết phụ thuộc vào đặc tính của dung môi nên sự lựa chọn dung môi là quan trọng hàng đầu cho kết quả chiết. Để chọn đúng dung môi cho chiết trước hết phải có hiểu biết sâu sắc về đặc tính của chất bị chiết mà quan trọng nhất là thành phần hoá học, cấu trúc phân tử để từ đó suy ra đặc tính vật lý như độ phân cực, hằng số điện môi, tính tan… của chất bị chiết. Trên cơ sở hiểu biết này mà so sánh chúng với các đặc tính

của các dung môi đã cho trong các tài liệu (x. bảng 3.1) và chọn dung môi sao cho hiệu suất chiết là tốt nhất và an toàn trong quá trình sử dụng. Ví dụ, để chiết hiđrocacbon tecpenoit thì người ta phải hiểu rằng đây là hợp chất kém phân cực , hằng số điện môi thấp vì chúng chứa các liên kết kém phân cực, đây là hợp chất kị nước (hiđrophop vì phân tử chỉ chứa cacbon và hiđro). Từ đó chọn dung môi, tốt nhất là các dung môi kém phân cực như hexan, benzen, xyclohexan… Ngược lại, để chiết các chất có độ phân cực lớn, hằng số điện môi cao như các ancol tecpenic, flavonoit, axit cacboxylic… thì phải chọn dung môi có độ phân cực lớn, hằng số điện môi cao như metanol, n-butanol… Nếu trong nguyên liệu có nhiều loại chất, từ không phân cực đến phân cực lớn, mà các chất đó rất cần cho nghiên cứu thì người ta lại áp dụng phương pháp chiết phân lớp theo độ phân cực tăng dần của dung môi (hay hằng số điện môi tăng dần). Ví dụ lúc đầu chiết bằng n-hexan (hằng số điện môi 1,9), sau đó chiết bằng etyl axetat (hằng số điện môi 6) và cuối cùng chiết bằng metanol (hằng số điện môi 32,6). Làm như vậy người ta thu được 3 nhóm sản phẩm chiết, từ không phân cực là sản phẩm chiết của n-hexan, phân cực vừa là của etyl axetat và phân cực lớn là sản phẩm chiết bằng metanol. Sau đó, tuỳ theo yêu cầu sử dụng mà người ta dùng sản phẩm của dung môi chiết thích hợp. Phương pháp này cho phép tận dụng được rất nhiều chất trong nguyên liệu hay nhiều sản phẩm từ một nguyên liệu. Cần chú ý tính hoà tan của các chất vào các dung môi có tính tương đối vì quá trình này phụ thuộc rất nhiều yếu tố, nhất là yếu tố khuếch tán vì nhiệt. Vì thế người ta không thể nói các chất có cực không tan hoàn toàn vào dung môi không phân cực, do đó 3 sản phẩm chiết ở trên là sự phân lớp tương đối, nghĩa là trong sản phẩm của lớp chất này cũng có lẫn một lượng nhỏ sản phẩm của lớp khác, đặc biệt là sản phẩm của các lớp kế tiếp nhau. Để phát hiện các chất trong mỗi lớp, người ta khảo chúng bằng sắc ký lớp mỏng với các thuốc thử đặc trưng. Ví dụ, để phát hiện các tecpenoit và dẫn xuất của isoprenoit, người ta dùng dung dịch vanillin trong H2SO4 đặc 2M, để phát hiện flavonoit người ta dùng dung dịch FeCl3 1M, để phát hiện các ancaloit người ta dùng thuốc thử Dragendoft hay SCAP – sau khi tìm được chất mong muốn thì loại dung môi để thu cặn chiết phục vụ cho các mục đích tiếp theo. 54

Với các nguyên liệu mà chất bị chiết bền với nhiệt thì người ta có thể chọn phương pháp chiết gián đoạn. Theo cách này người ta đun hồi lưu nguyên liệu với dung môi trong một thời gian (hay giữ ở một nhiệt độ nào đó), sau đó hút dịch chiết ra, cho dung môi khác và đun lại 2 lần. Làm như vậy cho đến lúc chiết hết chất bị chiết. Gộp các dịch chiết lại, loại dung môi trong chân không và thu sản phẩm. Một phương pháp chiết được dùng rất phổ biến trong phòng thí nghiệm và công nghiệp là phương pháp chiết liên tục, thiết bị của phương pháp gồm 3 bộ phận (x. hình 3.1).

Hình 3.1. Thiết bị chiết tự động (Soxlec)

Bình đun (1) để chứa dung môi có ống (2) thông với bộ phận sinh hàn (3) để khi dung môi sôi, hơi của nó đi lên sinh hàn, bộ phận đựng nguyên liệu (4) có ống thông nhau (5) từ đáy của bộ phận đựng nguyên liệu với bình đun để khi dung môi ngập nguyên liệu thì tự động chảy xuống bình đun. Người ta cho nguyên liệu vào bộ phận đựng nguyên liệu, cho dung môi vào nguyên liệu sao cho bề mặt của nó ngang với mặt trên của ống thông nhau (5). Khi đó dung môi sẽ theo ống thông nhau mà chảy xuống bình, làm như vậy một lần nữa là dủ lượng dung môi cần dùng. Đun sôi dung môi, hơi dung môi theo ống dẫn lên sinh hàn, ở đây hơi dung môi bị đông tụ, rơi xuống bộ phận nguyên liệu, dung môi ngấm vào nguyên liệu, hoà tan chất bị chiết và đầy dần lên cho đến mức trên ống thông nhau thì tự động rút xuống bình đun theo ống thông nhau mang theo các thiết bị chiết. Ở bình đun dung môi lại bay hơi lên sinh 55

hàn và để lại chất bị chiết trong bình đun. Quá trình này diễn ra một cách liên tục cho đến khi toàn bộ các chất bị chiết trong nguyên liệu được dung môi chiết ra hết và đã đi xuông bình đun thì ngừng chiết, loại dung môi thu được cặn chiết. Ưu điểm của phương pháp này là chỉ dùng một lượng dung môi nhỏ có thể chiết được một lượng lớn nguyên liệu và chiết rất triệt để.

3.2.2. Chiết lỏng - lỏng Chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật phân tách chất có từ lâu đời trong các phòng thí nghiệm. Từ năm 1930 nó đã được đưa vào áp dụng rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp hoá dầu, công nghiệp hạt nhân để chiết uran, công nghiệp chất thơm để chiết hương liệu. Để thực hiện chiết lỏng - lỏng người ta chọn dung môi không tan, không trộn lẫn trong môi trường chiết, nhưng hoà tan tốt chất bị chiết có trong môi trường chiết, cho dung môi đã chọn vào môi trường chiết rồi lắc hay khuấy trộn kỹ, sau đó để yên cho phân lớp thành 2 pha: pha dịch chiết và pha môi trường chiết. Vì khả năng hoà tan của chất bị chiết vào dung môi lớn hơn nên pha dịch chiết chứa chất bị chiết ít, chiết phần dịch chiết ra và loại dung môi dung môi người ta thu được chất bị chiết. Quá trình chiết lỏng - lỏng tuân theo quy luật phân bố Nernst. Nếu gọi nồng độ chất bị chiết x trong dung môi A là CXA và nồng độ của nó trong môi trường chiết B là CXB thì khi đạt được sự phân lớp và cân bằng pha ta có: k=

CXA CXB

k: hằng số phân bố. Quy luật này đúng khi nồng độ chất bị chiết nhỏ và có trạng thái giống nhau trong cả 2 pha. Theo quy luật này khả năng hoà tan của dung môi đối với chất bị chiết càng lớn bao nhiêu, hiệu quả chiết càng cao bấy nhiêu. Quả vậy, nếu chúng chúng ta gọi m là số mol của chất bị chiết có trong môi trường chiết, v là thể tích dung môi dùng để chiết, W là thể tích của môi trường, m1 là số mol của chất bị chiết còn lại trong môi trường sau lần chiết thứ nhất, theo Nernst ta có: ⎡ m − m1 ⎤ ⎡ m1 ⎤ k=⎢ ⎥:⎢ ⎥ ⎣ v ⎦ ⎣ v ⎦ 56

→

m1 =

mW kv + W

(1)

Biểu thức này cho thấy k lớn, v lớn thì m1 bé. Nghĩa là hệ số phân bố càng lớn, dung môi chiết càng nhiều thì càng chiết được nhiều chất, hiệu suất chiết càng lớn. Nếu gọi m2 là số mol của chất chiết còn lại trong môi trường sau lần chiết thứ 2, ta có: mW (2) m2 = 1 kv + W Thay (1) vào (2) ta có: 2

⎡ W ⎤ m2 = ⎢ ⎥ .m ⎣ kv + W ⎦ Nếu thực hiện chiết nhiều lần thì biểu thức là: n

⎡ W ⎤ mn = ⎢ ⎥ .m ⎣ kv + W ⎦

(3)

mn số mol chất bị chiết còn lại trong môi trường sau n lần chiết. Biểu thức (3) cho thấy càng chiết nhiều lần thì lượng chất bị chiết còn lại trong môi trường càng ít. Nó cũng cho thấy cùng một lượng dung môi như nhau nhưng chia ra để chiết nhiều lần thì tốt hơn để cả mà chiết một lần. Để thực hiện chia dung môi để chiết nhiều lần, người ta chia lượng dung môi chiết thành các phần bằng nhau và đặt trong một dãy các bình chiết, rồi cho dịch chiết lội qua (x. hình 3.2).

Hình 3.2. Quá trình chiết nhiều lần

Lựa chọn dung môi: Đối với chiết lỏng - lỏng sự lựa chọn dung môi có ý nghĩa quyết định cho sự thành công. Sau đây là các tiêu chuẩn để lựa chọn dung môi: + Hiệu quả phân bố; + Hệ số tách lớn; + Tỷ trọng và độ nhớt tốt để đảm bảo sự phân lớp và cân bằng pha xảy ra nhanh; + Khả năng hoà tan chất bị chiết lớn nhưng hoà tan vào môi trường bé; + Sức căng bề mặt thấp; + Không độc và khó cháy; + Bền khi sử dụng; + Không ăn mòn trang thiết bị; + Dễ kiếm và rẻ tiền.

3.2.3. Chiết bằng CO2 lỏng CO2 lỏng hoà tan dễ dàng các chất hữu cơ có phân tử bé (< 400đv) như hiđrocacbon, ete, xeton, lacton, este, mono và sesquitecpenoit. Nó khó hoà tan các chất có phân tử lượng lớn. Tính chất hoà tan của nó còn phụ thuộc vào độ phân cực của các chất. Ví dụ các chất béo, nhựa, chất bột, steroit, một số ancaloit, carotenoit… không hoà tan được vào CO2 lỏng. Các chất phân cực lớn như đường, gluxit, amino axit, photpholipit, các polime, các muối vô cơ cũng không hoà tan trong CO2 lỏng. Các chất thơm và nguyên liệu chất thơm dễ bay hơi hoà tan dễ dàng trong CO2 lỏng và đạt đến 10% tính theo trọng lượng. Khả năng hoà tan của CO2 lỏng giảm theo độ phân cực và phân tử lượng của các chất bị hoà tan, ví dụ dầu béo, tinh bột, nhựa, ancaloit, carotenoit và polime hoà tan hạn chế vào CO2 lỏng, chỉ đạt được 0,1 đến 1% theo trọng lượng. Nước cũng hoà tan kém trong CO2 lỏng, độ hoà tan của nước phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, ví dụ ở 50oC nước hoà tan vào CO2 lỏng đạt 0,3% theo trọng lượng. Chính vì thế người ta không dùng CO2 lỏng để chiết chất thơm từ các nguyên liệu có độ ẩm cao hơn 10%. a) Tính chọn lọc của CO2 lỏng CO2 lỏng có khả năng thay đổi lực dung môi rất lớn tuỳ theo sự thay đổi về tỷ trọng. Đó là kết quả của sự tương tác của áp suất và nhiệt độ.

Đây là điểm khác biệt giữa CO2 lỏng với các dung môi khác. Kết quả chiết bằng CO2 lỏng phụ thuộc vào áp suất khi thực hiện chiết. Ví dụ ở 100 bar, CO2 lỏng chỉ chiết được các chất có phân tử lượng bé dễ bay hơi như các mono và sesquitecpen. Nhưng ở 300 bar nó chiết được các chất có phân tử lượng lớn như dầu béo, sáp, resin. Quá trình chiết chọn lọc này làm cho phương pháp chiết bằng CO2 lỏng nổi trội hơn so với các dung môi khác. Như vậy, trong cùng một nguyên liệu, tuỳ theo điều kiện chiết khác nhau mà cho các sản phẩm khác nhau. b) Chất lượng sản phẩm chiết bằng CO2 lỏng Nhờ tính hoà tan chọn lọc của CO2 lỏng với các chất bị chiết, nhờ tính chọn lọc của phương pháp chiết bằng CO2 lỏng và tính năng của CO2 trong các pha khí và lỏng trong quá trình chiết mà sản phẩm chiết bằng CO2 lỏng có chất lượng rất cao. Chất lượng này thể hiện trong các điểm sau đây: + Không bị biến chất vì nhiệt hay phân huỷ; + Không bị mất mát các thành phần dễ bay hơi; + Chứa đầy đủ các thành phần dễ bay hơi; + Độ cô đặc rất cao. Thành phần của cặn chiết biểu hiện đầy đủ phổ thành phần của nguyên liệu ban đầu; + Không có cặn dung môi; + Không có muối vô cơ và kim loại nặng;

+ Sản phẩm sạch, không có vi khuẩn hoạt động; + Phù hợp với mong muốn của người sử dụng; + Quá trình thực hiện chiết bằng CO2 lỏng không gây cháy, nổ và khá an toàn. Đối với các tinh dầu thì chiết chọn lọc bằng CO2 lỏng thuận lợi và ưu việt hơn rất nhiều so với các phương pháp truyền thống khác. Đặc biệt đối với các loại tinh dầu và chất thơm dễ bay hơi, dễ bị phân huỷ vì nhiệt, dễ bị thuỷ phân thì phương pháp chiết bằng CO2 lỏng trở nên lý tưởng, chẳng hạn tinh dầu của các loài hoa. Khó có một sản phẩm nào đảm bảo thành phần và mùi vị của nguyên liệu ban đầu như sản phẩm chiết bằng CO2 lỏng. Ví dụ, khi phân tích thành phần tinh dầu kinh giới thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước và phương pháp chiết bằng CO2 lỏng 59

trên cùng một thiết bị sắc ký khí mao quản, người ta thấy chúng không những khác nhau về thành phần, đặc biệt các thành phần sôi thấp, dễ bay hơi mà còn khác nhau rất lớn về hàm lượng của các thành phần khác. Ví dụ, tỷ lệ linalool trên linalylaxetat trong tinh dầu chiết bằng CO2 lỏng cao hơn nhiều so với tinh dầu cất lôi cuốn bằng hơi nước trong cùng một nguyên liệu thô, xem sắc phổ hình 3.3.

Hình 3.3. Sắc phổ của tinh dầu kinh giới điều chế theo 2 phương pháp

c) Áp dụng chiết bằng CO2 lỏng Vì sản phẩm chiết bằng CO2 lỏng có nhiều ưu điểm và chất lượng cao, quy trình chiết CO2 lỏng cũng tương đối đơn giản và an toàn nên phương pháp này được áp dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược liệu. Các áp dụng chung của phương pháp này được thể hiện trong các lĩnh vực sau: – Chiết các nguyên liệu rắn: Các dịch chiết gia vị và pha chế đồ uống. Ở đây người ta chú ý đến cả hai loại sản phẩm, sản phẩm chiết chọn lọc và sản phẩm chiết tổng số. – Làm sạch để hoàn thiện sản phẩm: Ví dụ cho loại áp dụng này là dùng CO2 lỏng để chiết caffein trong hạt cà phê vối và trong chè đen để nâng cao chất lượng của sản phẩm loại này, loại bổ mỡ trong bộ ca cao, tách bỏ thuốc trừ sâu trong một số thực phẩm, rau quả. – Chiết các chất lỏng: Dùng CO2 lỏng để loại bỏ các chất dầu từ các dịch chiết trực tiếp đầu tiên.

3.3. Phương pháp hấp phụ điều chế tinh dầu

Người ta trộn nguyên liệu như các loại hoa với chất hấp phụ hay rải hoa trên một lớp chất hấp phụ để chất hấp phụ hấp phụ tinh dầu, rồi dùng dung môi chiết tinh dầu ra khỏi chất hấp phụ và cất loại dung môi thu tinh dầu. Ở đây tinh dầu ở thể hơi do nguyên liệu sinh ra nên có thể coi quá trình này như quá trình hấp phụ chất khí. Do đó có thể sử dụng phương trình đẳng nhiệt Langmuir để tính. Nếu gọi áp suất hơi của tinh dầu trên bề mặt chất hấp phụ là P; Q là các vị trí hấp phụ trên bề mặt chất hấp phụ đã bị chiếm; kdes là hệ số giải hấp; Vdes là tốc độ giải hấp - tốc độ các phân tử thoát ra khỏi vị trí hấp phụ; kads là hệ số hấp phụ; Vads là tốc độ hấp phụ - tốc độ các phân tử đi vào vị trí hấp phụ và giữ lại trên đó: Vdes = kdes.Q và Vads = kads.P(1 – Q) Khi quá trình hấp phụ hoàn thành là lúc đạt được trạng thái cân bằng giữa hấp phụ và giải hấp, nghĩa là tốc độ hấp phụ bằng tốc độ giải hấp nên chúng ta có: Vads = Vdes kads.P(1 – Q) = kdes.Q kads.P – kads.P.Q = kdes.Q kads.P = kdes.Q + kads.P.Q k ads .P → Q= k ads .P + k des Chia cả tử và mẫu số cho kdes và đặt K =

k ads k des

, gọi là hằng số cân

bằng hấp phụ chúng ta có: KP (1) Q= KP + 1 Phương trình (1) biểu thị đường đẳng nhiệt Langmuir. Khi áp suất rất nhỏ thì KP rất nhỏ và khi đó Q = KP, nghĩa là Q tuyến tính với P. Đó chính là quy luật Henry, đường biểu diễn trở nên đường thẳng và biểu thị mối quan hệ nồng độ chất bị hấp phụ của cả 2 pha ở trạng thái cân bằng.

Ở áp suất cao thì đường đẳng nhiệt Langmuir trở nên thẳng, cuối cùng dẫn đến giá trị tiệm cận và khi đó KP >> 1 nên Q → 1. Nghĩa là trạng thái mà tất cả cac vị trí hấp phụ đã bị lấp đầy (hấp phụ). Đối với sản xuất tinh dầu, trường hợp này không có, mà thường là áp suất rất bé, nên để có sự hấp phụ cực đại thì cần có thời gian và phương trình biểu diễn là phương trình (1). Hơn nữa tinh dầu là một hỗn hợp rất nhiều chất nên khi đó đường đẳng nhiệt Langmuir có dạng: K a .Pa (2) Q= K a .Pa + K b .Pb + K c .Pc + ... + 1 Ở đây a quy cho thành phần a, b quy cho thành phần b trong tinh dầu và khi đó có sự cạnh tranh hấp phụ giữa các thành phần trong tinh dầu. Nếu chúng ta gọi 2 thành phần a và b trong tinh dầu ở thể hơi có sự cạnh tranh bị hấp phụ trên chất hấp phụ, thể hiện ở tỷ số các vị trí hấp phụ mà chúng chiếm được là αab thì: Q α ab = a (3) Qb Vì ở đây áp suất hơi của tinh dầu quá nhỏ nên Qa = Ka.Pa và Qb = Kb.Pb, do đó: K .P α ab = a a K b .Pb Đặt

→

Ka Kb

=β

α ab = β.

Pa Pb

(4)

Nhìn vào (4) chúng ta thấy αab tăng khi Pa tăng và Pb giảm, nghĩa là thành phần nào có áp suất hơi riêng phần lớn sẽ bị hấp phụ nhiều. Tất nhiên kết luận mới đúng một phần vì một phần phụ thuộc khác mà chúng ta chưa đề cập đến, đó là lực liên kết giữa chất bị hấp phụ và chất hấp phụ. Lực này phụ thuộc vào bản chất hấp phụ hay gọi là khả năng hấp phụ.

3.3.1. Các chất hấp phụ Trong sản xuất tinh dầu, chất hấp phụ thường gặp nhất là than hoạt tính, parafin, bơ, mỡ bò, mỡ các súc vật khác. Khả năng hấp phụ hay đặc 62

tính hấp phụ của các chất hấp phụ này rất khác nhau. Ví dụ đặc tính hấp phụ của than hoạt tính ở pha hơi được chỉ ra trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Đặc tính hấp phụ của than hoạt tính

Đặc tính vật lý

Than hoạt tính của than

Kích thước rây

100

CCl4 hoạt tính (%)

Chỉ số iot

1000

Khối lượng riêng

500

250

Tro

Than hoạt tính của gỗ

Ngoài các chất hấp phụ nêu trên, ngày nay người ta cũng sử dụng các dạng zeolit (MFZS), các silicagel và nhôm hoạt hoá.

3.3.2. Kỹ thuật tiến hành Cho đến nay có 2 phương pháp thực hiện hấp phụ tinh dầu: phương pháp rải và phương pháp trộn. a) Phương pháp rải Người ta cán chất hấp phụ thành lớp mỏng trong các hộp kín rồi rải hoa hay nguyên liệu chứa tinh dầu lên trên lớp chất hấp phụ, đậy kín hộp. Sau một thời gian thì lấy hoa ra thay hoa khác. Làm như vậy nhiều lần để có sự hấp phụ tinh dầu tối đa trên chất hấp phụ. Dùng dung môi để chiết tinh dầu trên chất hấp phụ. Loại dung môi, thu tinh dầu. b) Phương pháp trộn Người ta chế hoá chất hấp phụ thành hạt nhỏ rồi trộn các hạt nhỏ chất hấp phụ này vào hoa đặt trong hộp kín, sau một thời gian sàng hoa ra và dùng cồn 95o để chiết tinh dầu đã hấp phụ trong hạt hấp phụ rồi cất loại cồn thu tinh dầu. 3.4. Phương pháp ép tinh dầu

Phương pháp này áp dụng cho các loại quả mà phần tinh dầu ở lớp vỏ. Ví dụ các quả thuộc chi citrus (chanh, cam, quýt, bưởi…). Chúng ta biết túi tinh dầu nằm ở lớp vỏ ngoài của bất kỳ loại vỏ nào cũng bị bật ra khi cọ xát, vì thế người ta gọt lớp vỏ ngoài của quả tươi mà không đụng đến các mô trắng bên trong, rồi cho vỏ gọt vào máy ép để ép tinh dầu. 63

Phần thứ hai

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TINH DẦU Tinh dầu là một hỗn hợp nhiều chất, nhiều thành phần mà các hằng số vật lý và các chỉ số hoá học của tinh dầu mới cho những khái niệm chung chung hay những dự đoán về các thành phần mà không cho số liệu của thành phần cụ thể. Do đó, để nghiên cứu tinh dầu trước hết phải xác định số thành phần, phân tích định tính, định lượng các thành phần, phân lập các chất tinh khiết, xác định cấu trúc phân tử, nghiên cứu hoạt tính sinh học, cuối cùng chuyển hoá và ứng dụng nó trong cuộc sống.

Chương 4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ NGHIÊN CỨU TINH DẦU 4.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) khảo sát thành phần tinh dầu

Đây là một phương pháp đơn giản và dễ thực hiện. Người ta dùng một bản mỏng silicagel bán sẵn trên thị trường (ví dụ bản silicagel 60 F254 của hãng NERCK), dùng capila chấm một chấm tinh dầu đã pha loãng lên một đầu bản rồi cho vào bình triển khai sắc ký đã có sẵn dung môi, để cho dung môi bị mao dẫn thấm lên bản và đưa chấm tinh dầu đi trên bản từ dưới lên. Khi tuyến dung môi lên gần mép trên của bản thì lấy ra, làm khô dung môi và hiện màu các vệt chất bằng các thuốc hiện. Có bao nhiêu vệt chất được hiện màu trên bản là bấy nhiêu thành phần tinh dầu. Các thành phần này không chỉ khác nhau về màu sắc khi hiện với thuốc mà khác nhau cơ bản về giá trị Rf. Rf được quy định là tỷ số giữa khoảng cách đi được của vệt chất tính từ điểm xuất phát đến tâm của vệt 64

và khoảng cách đi được của dung môi tính từ điểm xuất phát đến tuyến dung môi: l Rf = 1 l2 l1: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vệt; l2: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tuyến dung môi. Như thế giá trị Rf luôn nhỏ hơn 1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký là hấp phụ và giải hấp phụ. Nếu gọi lực hấp phụ của hợp chất x là Fhx và lực giải hấp của nó là Fgx thì thời gian bị hấp phụ có thể tính là Fhx – Fgx, thời gian dịch chuyển 1 . Gọi tốc độ di chuyển của dung môi là v, thời gian dịch chuyển Fhx − Fgx là t, chúng ta có: l1 = v.

R fx =

và l2 = v.t

Fhx − Fgx

l1 l2

v Fhx − Fgx

: vt =

1 (Fhx − Fgx ).t

(1)

Biểu thức (1) cho thấy Rf cực đại khi Fhx = Fgx. Nghĩa là khi chất không bị hấp phụ đi cùng với dung môi và Rf càng bé khi hiệu số Fhx – Fgx càng lớn, điều này hợp lý vì chất càng bị hấp phụ mạnh Rf càng bé khi thời gian dịch chuyển giống nhau. Như thế, nếu x tinh khiết thì SKLM chỉ cho một vệt và hiện một màu đồng nhất với một số thuốc hiện, nghĩa là Rf là một hằng số đối với một chất, với một dung môi hay hệ dung môi xác định, chất hấp phụ xác định và chạy trong điều kiện sắc ký xác định. Nếu x là một hỗn hợp (trường hợp phổ biến trong tinh dầu) thì x cho nhiều vệt có Rf khác nhau tuỳ thuộc vào thành phần, cấu trúc phân tử của chúng. Các vệt này có thể có màu sắc khác nhau hay giống nhau trong cùng một thuốc hiện và màu sắc khác nhau khi hiện với các thuốc hiện khác nhau. Kinh nghiệm nghiên cứu cho thấy: (i) Khi x là một chất nguyên chất thì Rf có ý nghĩa khi nó nằm trong khoảng 0,6 – 0,75 và hiện màu đồng nhất với một thuốc hiện. Nếu màu 65

không đồng nhất trong cùng một vệt có nghĩa là có thể đó là một hỗn hợp, khi đó hoặc là người ta cạo vệt ra chiết chất và chạy SKLM lại với hệ dung môi khác, hoặc chạy SKLM kép, nghĩa là lần thứ nhất với hệ dung môi này, khi kết thúc thì lấy bản sắc ký ra, làm khô dung môi rồi chạy lại SKLM với hệ dung môi khác theo chiều vuông góc với lần chạy thứ nhất. Khi đó, nếu có nhiều chất trong một vệt cũ thì chúng sẽ tách nhau ra và cho Rf khác nhau trong lần chạy sau. (ii) Khi x là một hỗn hợp thì các vệt chất càng rải đều trên bản bao nhiêu càng tốt bấy nhiêu và ∆Rf càng lớn cang tốt. (iii) SKLM có độ nhạy không cao, các chất có hàm lượng quá bé (< 1%) SKLM thường không phát hiện được nhất là các chất có độ nhạy kém với thuốc hiện. (iv) Nếu có chất mẫu, chúng ta có thể SKLM các chất mẫu cùng với các chất trong hỗn hợp, kết quả này cho phép chúng ta sơ bộ nhận dạng các chất trong hỗn hợp nhờ giá trị Rf giống nhau và màu sắc hiện giống nhau của các vệt chất trong hỗn hợp với các vệt chất mẫu. (v) SKLM còn cho phép chúng ta tìm được chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, khi người ta cho bản SKLM đã có chất vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật, sau đó đọc kết quả qua vòng kháng khuẩn đối với vệt chất. Đây là một phương pháp hiện đại để nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất sinh học trong tinh dầu. (vi) SKLM phát hiện phản ứng đã bắt đầu và theo dõi quá trình phản ứng, kết thúc phản ứng, đây là một kỹ thuật hiện đại nghiên cứu phản ứng hữu cơ. Ví dụ khi cho hai chất A và B phản ứng với nhau sau một thời gian, người ta lấy một ít hỗn hợp phản ứng chạy SKLM mà phát hiện có chất mới ngoài A và B thì phản ứng đã chạy. Tương tự như vậy, phản ứng kết thúc khi A hoặc B hoặc cả A và B không còn.

4.1.1. Chất hấp phụ cho SKLM Chất hấp phụ vô cùng phổ biến trong SKLM là silicgel, Al2O3, giấy và bột xenlulô. Rf của một chất phụ thuộc rất lớn vào lực hấp phụ của chất hấp phụ, mà mỗi chất hấp phụ khác nhau có lực hấp phụ riêng của mình. Lực hấp phụ của các chất hấp phụ và chất bị hấp phụ là lực liên kết van der Waals, liên kết muối, tương tác axit - bazơ, liên kết hiđro, liên kết tĩnh điện (liên kết π), liên kết vòng càng cua (chelatin) và liên kết 66

công hoá trị. Lực các liên kết này thể hiện ở năng lượng liên kết được chỉ ra trong bảng 4.1.

D¹ng liªn kÕt

Bảng 4.1. Năng lượng liên kết (kJ/mol)

van der Waals Muèi néi - muèi ngo¹i T−¬ng t¸c axit - baz¬ Hi®ro TÜnh ®iÖn Cµng cua Céng ho¸ trÞ 5 10 20

100

200

500

Mỗi chất hấp phụ liên kết với các chất bị hấp phụ có thể bằng một loại liên kết ở trên, cũng có thể bằng nhiều loại liên kết trên. Năng lượng hấp phụ của chất hấp phụ phụ thuộc vào bề mặt hấp phụ, vào nhiệt độ hoạt hoá, dung lượng hạt, kích thước hạt… Bảng 4.2 chỉ ra một số đặc tính vật lý của một số chất hấp phụ. Bảng 4.2. Chỉ tiêu vật lý của một số chất hấp phụ

Chất hấp phụ Đặc tính vật lý Diện tích bề mặt (m2/g) Khối lượng riêng (kg/m3) Nhiệt độ hoạt hoá (oC) Dung lượng lỗ (% tổng số) Kích thước lỗ (nm) Thể tích (cm3)

Al2O3

Silicagel

320 800 150 – 315 50 1 – 1,75 0,40

830 720 180 – 280 50 – 55 1 – 40 0,42

Riêng đối với than hoạt tính thì khả năng hấp phụ của nó còn phụ thuộc vào nguyên liệu điều chế nó và được đánh giá qua các chỉ số hấp phụ I2, CCl4 và khối lượng riêng (x. bảng 4.3). 67

Bảng 4.3. Đặc tính hấp phụ của các dạng than hoạt tính

Hấp phụ pha lỏng Than gỗ Than đá 40 50 70 150 250 500

Đặc tính vật lý Hoạt tính đối với CCl4 (%) Chỉ số iot Khối lượng riêng (kg/m3)

4.1.2. Dung môi cho SKLM Ngoài chất hấp phụ, dung môi cũng đóng vai trò quyết định sự thành công của SKLM. Vì Rf của một chất không chỉ phụ thuộc vào bản chất chất hấp phụ mà phụ thuộc rất lớn vào bản chất của dung môi, nghĩa là phụ thuộc vào thành phần và cấu tạo phân tử của dung môi và có thể đặc trưng bằng độ phân cực của nó (x. bảng 4.4). Bảng 4.4. Độ phân cực của một số dung môi

Tên dung môi Butan Triclotrofloroctan Xiclopentan Heptan Hexan Ete dầu hoả Isooctan Xiclohexan n-Butylclorit Cacbontetraclorit Toluen o-Xilen Clorobenzen Etylete Metylenclorit Etylenđiclorit Isopropyl ancol n-Butylaxetat Isobutyl ancol

µ 0,0 0,0 – 0,1 – 0,1 0,1 – 0,1 0,1 0,2 0,1 1,6 2,4 – 2,5 2,7 2,8 3,1 3,5 3,5 – 4,0 – 4,0

Tên dung môi n-Propyl ancol Tetrahiđrofuran Clorofom Metylisobutyl xeton Etylaxetat Metyl-n-propyl xeton Metyletyl xeton Đioxan Axeton Metanol Piriđin 2-Metoxyetanol Axetonitrin Propylencacbonat Đimetylfomamit Đimetylaxetamit n-Metylpirolidon Đimetylsunfoxit Nước

µ 4,0 4,0 4,1 – 4,2 4,4 – 4,5 4,7 4,8 5,1 5,1 5,3 5,5 5,8 6,1 6,4 6,5 6,7 7,2 10,0

Sự lựa chọn dung môi cho sắc ký phải căn cứ vào độ phân cực của chất phân tích, độ phân cực của dung môi và theo nguyên tắc chất phân cực hoà tan trong dung môi phân cực, không hoà tan trong dung môi không phân cực và ngược lại. Như thế đối với một chất cũ, độ phân cực đã biết thì việc lựa chọn dung môi để sắc ký trở nên đơn giản, nhưng đối với một chất mới thành phần và cấu tạo phân tử chưa biết, độ phân cực chưa biết thì việc lựa chọn dung môi để sắc ký trở nên phức tạp hơn nhiều. Trong trường hợp này thì thường người ta chọn hệ dung môi 2 hay 3 cấu tử. Lúc đầu chọn dung môi (A) hoà tan chất chưa biết (x) hoàn toàn, tiến hành SKLM và có RfAx, sau đó chọn dung môi B hoà tan dung môi A (sự hoà tan các dung môi vào nhau x. hình 4.1) nhưng không hoà tan x, tiến hành SKLM và có RfBx, Rfx tỷ lệ thuận với trung bình cộng của RfAx và RfBx: R + R fBx R f = fAx 2

Hình 4.1. Sơ đồ trộn lẫn các dung môi

Vì Rfx có giá trị cực đại là 1 nên một cách gần đúng nó tỷ lệ với thể tích dung môi A và thể tích dung môi B trong hỗn hợp dung môi AB. Ví dụ, để có Rf = 0,7, người ta lấy hỗn hợp dung môi 7×A/3×B. Như thế khi muốn tăng độ phân cực của hệ (tăng Rf) thì ta thêm dung môi thứ 3 có độ phân cực lớn và ngược lại, muốn giảm Rf thì ta thêm dung môi thứ 3 có độ phân cực kém. Tuy nhiên, người ta cũng có thể thay đổi tỷ lệ A/B để đạt được mong muốn có Rf thích hợp.

4.2. Sắc ký khí (GC) và GC kết hợp với khối phổ (GC-MS) nghiên cứu tinh dầu

Hầu hết các tinh dầu là chất lỏng có nhiệt độ sôi dưới 300oC nên phương pháp GC và GC-MS đóng góp đắc lực trong nghiên cứu tinh dầu về số thành phần, về hàm lượng và nhận biết các thành phần. Người ta cho khí mang (heli hay nitơ) mang tinh dầu đi qua cột sắc ký mao quản dài trên 60 m tráng chất hấp phụ. Vì các thành phần của tinh dầu có thành phần nguyên tố khác nhau, có cấu tạo phân tử khác nhau nên bị hấp phụ và giải hấp khác nhau trên cột sắc ký, kết quả là chúng đi ra khỏi cột ở các thời điểm khác nhau hay nói một cách khác, thời gian lưu (Ri) của chúng trên cột khác nhau, detectơ ghi lại thời gian lưu đó của các thành phần trên sắc phổ, và như vậy ứng với mỗi thành phần của tinh dầu có một thời gian lưu xác định và một pic xác định trên sắc phổ. Sắc phổ có bao nhiêu pic là tinh dầu có bấy nhiêu thành phần. Chiều cao của pic hay chính xác hơn là diện tích của pic trên sắc phổ tỷ lệ thuận với hàm lượng thành phần của tinh dầu. Do đó đo diện tích của mỗi pic chia cho tổng diện tích của các pic người ta tính được hàm lượng của các thành phần tinh dầu. Nếu như chúng ta có một bộ chất chuẩn thì bằng phương pháp thêm chất chuẩn vào tinh dầu rồi chạy sắc ký và so sánh sắc phổ của tinh dầu chưa có chất thêm và sắc phổ của tinh dầu đã có chất thêm người ta nhận dạng được các thành phần trong tinh dầu. Tuy vậy, phương pháp này đòi hỏi nhiều chất mẫu và thời gian để thực hiện nên khá tốn kém. Ngày nay, nhờ sự kết hợp sắc ký khí và khối phổ, người ta nhận dạng một cách nhanh chóng các thành phần của tinh dầu. Các thành phần của tinh dầu sau khi đi qua cột sắc ký được chuyển vào buồng bắn phá của khối phổ, ở đây chúng bị bắn phá bởi một chùm điện tử có năng lượng 70 eV dưới áp suất 10–6 – 10–7 mmHg thành các phân mảnh nhỏ. Các mảnh này chuyển qua khối phối ký và ghi số lượng các mảnh cùng trọng lượng của chúng thành phổ. Nhìn vào phổ khối người ta biết ngay phân tử lượng, số lượng và trọng lượng các phân mảnh. Do cấu trúc phân tử của các thành phần là xác định nên số mảnh và quy luật phân mảnh là xác định. Nhờ thế người ta so sánh phổ này với các phổ khối của các chất có trong thư viện của máy. Nếu có sự trùng lặp trên 90% thì có thể coi là trùng nhau và các thành phần của tinh dầu được nhận dạng. Điều này 70

càng chính xác khi kết hợp được với kinh nghiệm phân tích và quy luật phân rã chất. Vào những năm 70 của thế kỷ trước, cột sắc ký khí làm bằng kim loại có chiều dài hạn chế và nhồi bằng các chất hấp phụ khác nhau, lại chưa kết hợp được với khối phổ và máy tính nên việc phân tích thành phần và nhận dạng các thành phần bị hạn chế. Hiện nay, cột sắc ký được làm rất bé, dạng mao quản, dài trên 60 m, tẩm chất hấp phụ, lại kết hợp được với khối phổ và máy tính nên việc phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thuận lợi và chính xác hơn nhiều.

Chương 5 PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN CỦA TINH DẦU Để nghiên cứu cấu trúc phân tử, đặc tính hoá học, hoạt tính sinh học và chuyển hoá hoá học các thành phần của tinh dầu, phải có chất tinh khiết từ các thành phần của tinh dầu. Do đó phân lập các chất tinh khiết từ tinh dầu đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu tinh dầu. Hơn thế, nhu cầu kỹ thuật, nhu cầu của cuộc sống con người đòi hỏi độ tinh khiết của các chất sử dụng ngày càng cao vì các chất tinh khiết có độ tinh khiết 4 hay 5 số 9 có những đặc tính quý giá mà các chất thông thường không thể có được. Có nhiều phương pháp phân lập các chất tinh khiết từ tinh dầu. Tuỳ theo tính chất và thành phần của tinh dầu mà người ta lựa chọn phương pháp phân lập thích hợp. 5.1. Phương pháp cất phân đoạn phân lập các thành phần của tinh dầu

Phương pháp cất là phương pháp vật lý phân tách các chất lỏng, là phương pháp rất quan trọng và phổ biến trong phòng thí nghiệm và trong công nghiệp. Phương pháp cất được áp dụng để phân tách và tinh chế các chất có nhiệt độ sôi thấp hơn 350oC. Dựa vào nhiệt độ sôi khác nhau của các chất lỏng trong hỗn hợp mà người ta phân tách chúng ra khỏi hỗn hợp bằng phương pháp cất. Cất là một quá trình chuyển chất lỏng thành hơi, sau đó đông tụ hơi thành lỏng. Để chuyển chất lỏng thành hơi, người ta đun sôi chúng bằng nhiệt, để chuyển hơi thành lỏng, người ta đông tụ chúng bằng sinh hàn. Một chất lỏng sôi khi áp suất hơi của nó bằng áp suất bên ngoài. Khi áp suất bên ngoài giảm thì nhiệt độ sôi cũng giảm. Do đó, một chất lỏng nguyên chất bao giờ cũng có một nhiệt độ sôi xác định ở một áp suất xác định, ví dụ ở 100oC/760 mmHg nước nguyên chất sôi nhưng ở 15 mmHg nước nguyên chất cũng sôi. Một hệ chất lỏng hai cấu tử A và B tan hoàn toàn vào nhau được gọi là hệ lý tưởng khi lực tương tác giữa các phân tử cùng loại giống hệt lực 72

tương tác giữa các phân tử khác loại, entanpi riêng phần của nó không phụ thuộc vào nồng độ và bằng entanpi mol của các thành phần nguyên chất. Như thế hệ lý tưởng tuân theo định luật Raoult, nghĩa là áp suất hơi riêng phần của một thành phần tỷ lệ với mol phần của nó trong hỗn hợp lỏng. Nếu gọi mA và mB là áp suất hơi riêng phần của A và B trong pha hơi, PA và PB là áp suất hơi bão hoà của A và B khi chúng nguyên chất, xA và xB là mol phần của A và B trong pha lỏng. Ta có: mA = PA.xA (1) mB = PB.xB (2) Nếu gọi P là áp suất chung của hỗn hợp, yA và yB là mol phần của A và B trong pha hơi, ta có: mA = P.yA (3) mB = P.yB (4) Từ (1), (2), (3), (4), ta có: yA P x = A . A (5) 1 − y A PB x B Vì hệ 2 cấu tử nên yB = 1 – yA và xB = 1 – xA, chúng ta có: yA P x = A. A 1 − y A PB 1 − x A Đặt

PA PB

= α và gọi nó là hệ số tách, ta có công thức toán học cho cất đơn: yA 1 − yA

= α.

xA 1− xA

(6)

Biểu thức (6) cho thấy hệ số tách α càng lớn, nghĩa là nhiệt độ sôi của A và B càng cách xa nhau thì khả năng tách chúng ra khỏi nhau càng lớn. Thực nghiệm cho thấy khi các thành phần có nhiệt độ sôi cách xa nhau thì có thể tách chúng ra khỏi nhau một cách hoàn toàn. Vì thế phương pháp cất đơn được áp dụng rộng rãi trong việc tinh chế và sản xuất tinh dầu. Mối quan hệ giữa thành phần của pha hơi và thành phần của pha lỏng tương ứng được mô tả trên biểu đồ cân bằng pha, các đường cong cân bằng được xây dựng ở một nhiệt độ hay một áp suất không đổi. 73

Với các hỗn hợp lý tưởng như hỗn hợp A và B thì biểu đồ cân bằng pha của nó được chỉ ra trên hình 5.1. 1,0 A

0,8

0,6 YA 0,4 0,2

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Hình 5.1. Biểu đồ các đường cong cân bằng pha lỏng – hơi của các cấu tử có độ bay hơi khác nhau

Biểu đồ này cho thấy A có độ bay hơi lớn hơn B (nhiệt độ sôi thấp hơn B nên đường cong cân bằng pha hơi và pha lỏng của nó vòng xa đường phân giác của biểu đồ hơn so với đường cong cân bằng pha của B). Với các hỗn hợp không lý tưởng, loại hỗn hợp này chiếm tuyệt đại đa số trong thực tế. Các thành phần của hỗn hợp không lý tưởng không hoạt động độc lập với nhau và không tuân theo định luật Raoult mà biểu hiện theo phương trình Clausius – Clapayron. Do đó có đường cong cân bằng pha của hỗn hợp không lý tưởng thường cắt đường phân giác của biểu đồ cân bằng pha ở một điểm nào đó tuỳ theo đặc điểm của hỗn hợp. Tại giao điểm của 2 đường này, hỗn hợp có thành phần của pha hơi và pha lỏng giống nhau nên hỗn hợp sôi ở một nhiệt độ không đổi và thành phần không đổi ở một áp suất xác định. Người ta gọi hỗn hợp này là hỗn hợp đẳng phí. Ví dụ: hỗn hợp không lý tưởng HNO3 và nước có α < 1, áp suất hơi là cực tiểu và đẳng phí là cực đại (đường 1 hình 5.2). Hỗn hợp EtOH và nước có α > 1, áp suất hơi nước cực đại và đẳng phí cực tiểu (đường 2 hình 5.2).

% mol pha h¬i

% mol pha láng

Hình 5.2. Biểu đồ cân bằng pha của HNO3 – H2O và EtOH – H2O

Hỗn hợp đẳng phí EtOH và H2O có thành phần cố định 95,57% EtOH và 4,43% H2O theo thể tích, sôi cố định 78,15oC/760 mmHg, có tên thương mại cồn 96. Vì nhiệt độ sôi của hỗn hợp đẳng phí này thấp hơn nhiệt độ sôi của nước (100oC/760 mmHg) và etanol nguyên chất (78,5oC/760 mmHg) nên trong công nghiệp sản xuất cồn từ ngũ cốc hay rỉ đường theo phương pháp lên men người ta chỉ thu được cồn 96 mà không thu được cồn tuyệt đối. Muốn có etanol tuyệt đối người ta phải áp dụng các phương pháp vật lý hay hoá học để phá đẳng phí, sau đó tinh chế lại.

5.1.1. Cất phân đoạn ở áp suất thường Để phân lập các chất lỏng có nhiệt độ sôi gần nhau người ta không thể áp dụng phương pháp cất đơn giản mà phải áp dụng phương pháp cất phân đoạn. Có thể coi cất phân đoạn là thực hiện một chuỗi lần cất đơn liên tiếp nhau. Do đó biểu thức cất phân đoạn được xây dựng trên biểu thức cân đơn (6). y1A x = α. 1A (6) 1 − y1A 1 − x1A Vế phải của biểu thức này là thành phần hơi của lần cất thứ nhất và cũng là thành phần lỏng của lần cất thứ hai. Do đó, nếu gọi mol phần của chất dễ bay hơi ở pha lỏng trong lần cất thứ hai. Do đó, nếu gọi mol phần của chất dễ bay hơi ở pha lỏng trong lần cất thứ hai là x2A thì chúng ta có: y 2A x (7) = α. 1A 1 − y 2A 1 − x1A 75

Gọi y2A là mol phần của pha hơi trong lần cất thứ hai ta có biểu thức của lần cất thứ hai: y 2A x (8) = α. 2A 1 − y 2A 1 − x 2A Từ (6), (7) và (8) ta có: y 2A x x = α.α. 1A = α 2 . 1A 1 − y 2A 1 − x1A 1 − x1A Một cách tương tự khi tiến hành cất n lần thì biểu thức toán học là: y nA x = α n . 1A 1 − y nA 1 − x1A Biểu thức này cho thấy thành phần dễ bay hơi A được làm giàu dần lên qua mỗi lần cất và đạt đến độ tinh khiết cao khi n lớn. Như thế, độ tinh khiết của thành phần dễ bay hơi phụ thuộc vào số lần cất hay còn gọi là số đĩa lý thuyết. Thiết bị cất phân đoạn cổ điển là cột cất có nhiều đĩa lý thuyết được thiết kế theo nguyên tắc dòng ngược, nghĩa là pha hơi đi từ đáy cột lên trên đầu cột còn pha lỏng thì đi từ đầu cột xuống đáy cột, mỗi đĩa cất làm việc như một lần cất đơn (x. hình 5.3).

Hình 5.3. Xác định bằng đồ thị số đĩa lý thuyết

Với mục đích tăng cường sự tiếp xúc giữa pha hơi và pha lỏng hồi lưu, người ta thiết kế hệ sinh hàn ở đầu cột. Để có sự cân bằng nhiệt động giữa pha lỏng và hơi trong quá trình chuyển pha trong cột, cần xác định tỷ lệ giữa số đĩa lý thuyết và chiều cao của cột. Số đĩa lý thuyết phụ thuộc vào khoảng trống chung và vào sự chuyển khối trong cột, nghĩa là phụ thuộc vào cấu trúc của cột. Mỗi loại cột cần phải tính toán và thiết kế sao cho mọi đĩa lý thuyết trong cột đều được tăng cường tiếp xúc giữa pha hơi và pha lỏng hồi lưu trong sự cân bằng nhiệt động. Số đĩa lý thuyết cực tiểu của một cột cất để cất được một hỗn hợp nào đó có thể được xác định theo hai phương pháp: + Phương pháp thứ nhất theo biểu đồ pha mà số đĩa lý thuyết được xác định giữa 2 đường cong cân bằng pha và đường chéo của biểu đồ hỗn hợp (x. hình 5.3b). + Phương pháp thư hai theo mol phần của thành phần dễ bay hơi ở đầu cột và ở nồi cất kết hợp với hệ số tách theo công thức: x x log A . B 1− xA 1− xB −1 Số đĩa lý thuyết = log α α: hệ số tách; xA: mol phân của thành phần dễ bay hơi ở đầu cột; xB: mol phân của thành phần dễ bay hơi ở đáy cột. Độ tinh khiết của sản phẩm phụ thuốc rất nhiều vào độ hồi lưu của pha lỏng nên người ta quan tâm đến độ hồi lưu. Tỷ lệ hồi lưu là tỷ lệ thể tích của chất lỏng lấy ra khỏi cột và chất lỏng quay trở lại cột. Thông thường tỷ lệ này là 1/5 hay 1/10 tuỳ theo độ phức tạp của hỗn hợp. Độ tinh khiết của sản phẩm cũng phụ thuộc rất lớn vào hiệu quả phân tách của cột, nghĩa là vào số đĩa lý thuyết của cột, nhất là với các hỗn hợp chất lỏng mà nhiệt độ sôi của các thành phần quá gần nhau. Vì thế người ta luông quan tâm cải tiến kỹ thuật để nâng cao số đĩa lý thuyết của cột. Hầu hết các cải tiến đều chú trọng tăng cường sự tiếp xúc giữa hai pha hơi và lỏng trong cân bằng nhiệt động cũng như khoảng không tối ưu của chuyển khối trong cột. Theo hướng này người ta thay cột đĩa bằng cột nhồi, nghĩa là người ta sử dụng các vật nhồi khác nhau như lò xo kim loại, yên ngựa bằng sứ, vành khuyên thuỷ tinh… nhồi vào cột cất 77

sao cho chúng chiếm khoảng 70 – 80% khả năng thoát hơi. Hình 5.4 cho một số ví dụ về các vật nhồi cột.

Hình 5.4. Các loại vật nhồi cột

Khi làm việc với cột nhồi cần chú ý các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng làm việc của cột sau: 1. Phân bố của các vật nhồi sao cho pha lỏng dễ dàng đi qua được ở các khoảng trống và thấm ướt toàn bộ mặt ngoài của chúng. 2. Phải lắp cột hoàn toàn thẳng đứng, thực tế cho thấy chỉ cần nghiêng cột 1% độ nghiêng thì hiệu quả làm việc của cột giảm đi 50 – 70% hiệu quả thực tế của nó. 3. Bộ phận sinh hàn ở đầu cột phải đảm bảo ngưng tụ hầu như 100% pha hơi lên đầu cột. Có như thế hiệu suất sản phẩm mới cao. 4. Hiệu quả phân tách của cột đạt kết quả tốt khi cột có hiệu ứng thành hồi lưu lớn, nghĩa là khi pha lỏng dễ dàng đi từ chất nhồi đến thành cột và đến các chỗ dốc khuyết trong cột. Về sau người ta chế tạo cột cất có trụ quay. Nguyên tắc làm việc của cột này là pha hơi đi theo khe hở giữa thành cột và thành trụ quay mà lên đầu cột. Vì trụ giữa quay nên các phân tử hơi phải đi theo đường xoáy trôn ốc và thường xuyên va chạm vào thành cột có pha lỏng đi xuống. Chính sự chuyển động này mà khả năng tiếp xúc giữa pha hơi và pha lỏng rất lớn nên hiệu quả phân tách rất cao. Cột cất hiệu quả nhất là cột 78

Darkine-Elaner Spinning Bank, đó là cột cất gián đoạn cao 51 cm, bán kính 8 mm nhưng tương ứng với 200 đĩa lý thuyết, nó cho phép phân tách được các chất có nhiệt độ sôi chênh lệch nhau 2 – 3oC. Vì thế nó là một công cụ đắc lực cho nghiên cứu tinh dầu.

5.1.2. Phương pháp cất trong chân không Có rất nhiều chất ở nhiệt độ sôi bình thường của chúng đã bị biến chất; các chất có nhiệt độ sôi cao khi tiến hành cất, chúng thường bị oxi hoá, polime hoá, đồng phân hoá…, nghĩa là bị biến chất do tác dụng của nhiệt. Với những chất mẫn cảm với nhiệt như vậy, người ta không thể tiến hành tinh chế hay phân tách chúng bằng phương pháp cất ở áp suất không khí mà phải tiến hành ở áp suất thấp - cất chân không. Như đã trình bày ở trên, nhiệt độ sôi của một chất lỏng phụ thuộc rất lớn vào áp suất trên bề mặt của nó. Nếu áp suất này giảm thì nhiệt độ sôi của nó cũng giảm theo. Dựa vào tính chất này, người ta tiến hành cất chân không bằng cách giảm áp suất lúc cất bằng máy hút chân không. Với các máy hút tốt, người ta có thể giảm áp suất từ 760 mmHg (áp suất thường) xuống áp suất 1 – 2 mmHg, thậm chí xuống 10–1 – 10–5 mmHg, và như vậy nhiệt độ sôi của chất có thể giảm đến hàng trăm độ. Ví dụ, nước nguyên chất ở áp suất thường (760 mmHg) sôi ở 100oC, nhưng khi hạ áp suất xuống 10 mmHg thì sôi chỉ ở 10oC. Chính vì sự thuận lợi này mà hầu hết các chất thơm và tinh dầu đều được tinh chế và phân lập ở áp suất thấp khi chúng là chất lỏng. Tất cả các phương pháp cất đơn, cất phân đoạn đều có thể thực hiện ở áp suất thấp. Với phương pháp này tinh dầu không bị biến chất do nhiệt, không bị khét, bị khê, bị oxi hoá… do đó chất lượng mùi rất tốt. Sau đây là một ví dụ về chọn phương pháp điều chế và phân lập thành phần chính của tinh dầu. Tinh dầu củ riềng Lào (Alpinia laosensis Gognep) cất cuốn bằng hơi nước chỉ đạt hiệu suất 0,031% tính theo trọng lượng khô, nó có phổ kháng khuẩn rộng và mạnh, phân tích sắc ký khí khối phổ (GC-MS) cho thấy thành phần chủ yếu của nó là các sesquitecpenoit (40 – 50%). Ba yếu tố hoạt tính sinh học, thành phần và hiệu suất đã nêu làm chúng ta quan tâm đặc biệt đến tinh dầu này, vì thành phần chủ yếu là sesquitecpenoit mà thành phần này có nhiệt độ sôi cao, nhất là do các dẫn xuất có oxi của chúng, vì thế với phương pháp cất cuốn hơi nước không 79

cho phép thu triệt để các thành phần này, hơn nữa hiệu suất lại quá thấp. Vì thế người ta nghĩ đến phương pháp chiết tinh dầu. Theo định nghĩa truyền thống, tinh dầu là các thành phần không tan hoặc kém tan trong nước nên người ta chọn dung môi ete dầu hoả sôi (30 – 60oC) hay benzen để chiết. Bằng cách này từ củ riềng Lào người ta thu được tinh dầu với hiệu suất 1,98%, cao hơn hẳn phương pháp cất cuốn hơi nước thu tinh dầu. Sắc ký lớp mỏng phân tích tinh dầu này trên silicagel dung môi n-hexan/etylaxetat (95/5 V/V), thuốc hiện vanillin 0,5% trong H2SO4 đặc cho thấy có 4 thành phần chính có Rf: 0,74; 0,72; 0,42 và 0,34, GC-MS phân tích tinh dầu này cũng cho thấy có 4 thành phần chính ứng với thời gian lưu là 1,36; 4,27; 6,27; 10,96 và hàm lượng tương ứng là 26,77; 1,29; 2,33; 65,57%. Kết quả phân tích này cho phép chúng ta chọn phương pháp cất phân đoạn dưới áp suất thấp để thu thành phần chính của tinh dầu. Với cột cất dài 30 cm, đường kính 1,5 cm, chất nhồi lò xo thuỷ tinh đường 0,3 cm, cất ở áp suất 5 mmHg, tỷ lệ hồi lưu 1/10, người ta thu được 4 phân đoạn chính, trong đó đáng chú ý là phân đoạn có nhiệt độ sôi 158 – 162oC/5 mmHg chiếm 68% tổng tinh dầu. Cất lại phân đoạn này trên cột cất trên nhưng với chất nhồi lò xo thuỷ tinh dài 0,3 cm, đường kính 0,15 cm người ta được phân đoạn sôi ổn định 160oC/5 mmHg có hàm lượng 58,3% tổng tinh dầu, độ tinh khiết 99,05%; n d20 1,4321; d 24 24 0,8168. Kết quả xác định cấu trúc phân tử cho thấy nó là 3-(p-axeto-

phenyl)-3-metylcacboxylpropen-1. 5.2. Phương pháp sắc ký cột phân lập các thành phần của tinh dầu

Cơ sở lý thuyết của sắc ký cột là hấp phụ và giải hấp phụ (xem lại phần 4.1). Quá trình hấp phụ và giả hấp phụ của các thành phần của tinh dầu dưới tác dụng của chất hấp phụ và dung môi rửa cột xảy ra một cách liên tục trên toàn cột nên những thành phần nào bị hấp phụ mạnh và giải hấp kém thì đi chậm và ra khỏi cột sau, còn thành phần bị hấp phụ kém và giải hấp nhanh thì đi nhanh hơn và ra khỏi cột trước. Như thế, chính sự hấp phụ và giải hấp phụ khác nhau của các thành phần đối với một chất hấp phụ và hệ dung môi rửa mà chúng đi trong cột với thời gian khác nhau và ra khỏi cột ở thời điểm khác nhau nên người ta phân lập được các thành phần của tinh dầu. 80

5.2.1. Chọn chất hấp phụ cho sắc ký cột Căn cứ vào bản chất chất cần phân tách và căn cứ vào đặc tính của chất hấp phụ để lựa chọn chất hấp phụ. Đặc tính chất hấp phụ thể hiện trong các đặc tính vật lý của chúng (x. bảng 1.2 và 1.3). Thông thường, người ta chia chất hấp phụ thành 3 loại lớn: phân cực mạnh (Al2O3), phân cực trung bình (silicagel) và phân cực ít (than hoạt tính). Ngoài các đặc tính vật lý của chúng đã được nêu trong bảng 1.2 và 1.3, một đặc tính quan trọng nữa cần quan tâm là kích thước hạt mà thể hiện ở đường kính của nó. Kích thước hạt càng nhỏ, diện tích bề mặt chất hấp phụ càng lớn vì diện tích bề mặt hấp phụ được tính trên một đơn vị khối lượng, khả năng phân tích càng cao. Nhưng hạt nhỏ thì tốc độ rửa chậm, có khi không rửa được, cần phải nén hay bơm dung môi đi qua cột để rửa.

5.2.2. Chọn dung môi cho sắc ký cột – Như trên đã trình bày, có sự tương quan giữa sắc ký cột với SKLM. Do đó người ta dùng SKLM để lựa chọn dung môi cho rửa sắc ký cột. Áp dụng nguyên tắc lựa chọn dung môi trong SKLM (xem mục 3.5) để lựa chọn dung môi cho việc khảo sát các thành phần cần phân tích trong tinh dầu sao cho ∆Rf của các thành phần càng lớn càng tốt, thông thường > 0,2, sau đó đưa chất lên cột và dùng dung môi này để rửa cột. – Căn cứ vào kết quả khảo sát mẫu phân tích bằng SKLM, người ta có thể rửa cột bằng hệ dung môi theo gradien. Lúc đầu rửa bằng dung môi không phân cực, sau tăng dần độ phân cực của hệ dung môi rửa cột bằng cách tăng thành phần phân cực. Ví dụ rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan/etylaxetat theo tỷ lệ sau: 100% hexan, rồi giảm dần 80%, 60%, 40%, 20%; còn etylaxetat tăng dần từ 20% đến 100%. Như thế hệ dung môi rửa có thành phần 100% dung môi không phân cực n-hexan đến dung môi phân cực etylaxetat 100%. Còn rất nhiều cách rửa cột nữa mà chưa nêu ở đây.

5.2.3. Kích thước cột và phương pháp nhồi chất hấp phụ vào cột Trong điều kiện lý tưởng, hạt hấp phụ đồng nhất, chỉ một kích thước, điều kiện sắc ký tối ưu về dung môi, về tốc độ rửa cột, về nhồi cột thì thiết diện đo được của chất phân tách trên cột là một mặt phẳng vuông góc với phương thẳng đứng của cột (Hình 5.5a). 81

Hình 5.5. Mặt cắt đứng thiết diện di chuyển của các phân tách trên cột sắc ký

Nhưng thực tế không như vậy, kích thước hạt không đồng nhất, thông thường các cỡ hạt khác nhau, đường kính của chúng từ 40 – 63 µm, các điều kiện sắc ký không thể nào chuẩn hoá tuyệt đối được nên thiết diện của các thành phần tinh dầu đi trên cột là một mặt phẳng nghiêng so với chiều thẳng đứng (hình 5.5b) hay mặt gồ ghề (hình 5.5c, d). Do đó các chất không tách khỏi nhau được, kết quả phân tách các thành phần của hỗn hợp không đạt yêu cầu, nhất là khi ∆Rf của chúng bé. Để hạn chế điều này, người ta xây dựng một tỷ lệ hợp lý giữa chiều cao và đường kính của cột thông thường, tỷ lệ đó là 1/30, 1/50… tuỳ theo kích thước của hạt và tuỳ theo ∆Rf giữa các vệt cần tách. Có 2 phương pháp nhồi chất hấp phụ vào cột. Phương pháp nhồi khô là cho từng lượng nhỏ chất hấp phụ vào cột rồi gõ hay nén cho chặt, sau đó cho một lượng nhỏ chất hấp phụ khác và làm như vậy cho đến lúc đầy cột, rồi cho một lượng dung môi rửa đi qua để xem cột làm việc tốt chưa và tiến hành sắc ký cột. Phương pháp nhồi ướt là hoà chất hấp phụ vào một dung môi rồi đổ vào cột và để yên cho cột ổn định sau 12 giờ thì sử dụng (ở đây có thể dùng dung môi để rửa cột, hay dung môi khác nhưng không ảnh hưởng đến kết quả sắc ký). Phương pháp nhồi khô không đảm bảo tính đồng đều của cột, nhất là cỡ hạt không đều. Phương pháp nhồi ướt có nhiều ưu điểm hơn. Ngày nay, trên thị trường có bán sẵn những cột sắc ký mà các chỉ số kỹ thuật đã ghi rõ nên việc sử dùng rất tiện lợi.

5.2.4. Cho hỗn hợp chất cần phân tách lên cột và rửa cột Người ta hoà tan hỗn hợp chất cần phân tách vào một lượng dung môi vừa đủ để tan hết, rồi bơm nó lên đầu cột và tiến hành rửa. Cũng có thể hoà tan chất vào dung môi, cho một lượng nhỏ chất hấp phụ vào đó,

trộn đều và làm bay hơi dung môi để tẩm các chất cần phân tách vào chất hấp phụ rồi cho nó lên cột và tiến hành rửa. Việc rửa cột phải tiến hành với tốc độ sao cho phù hợp với quá trình hấp phụ và giải hấp trên cột, nếu không kết quả phân tách sẽ không tốt. Kinh nghiệm cho thấy với cột silicagel cỡ hạt 40 – 60 µm thì tốc độ rửa 3 ml/phút là tốt. Vì tốc độ rửa phụ thuộc rất lớn vào cỡ hạt của chất hấp phụ nên với các cỡ hạt lớn 60 – 100 µm thì cứ để cột thẳng đứng theo trọng lực, dung môi có thể đi từ trên cột xuống cuối cột và ra khỏi cột mà không cần trợ giúp gì cả. Nhưng với các cỡ hạt ≤ 40 µm thì dung môi không thể đi qua cột khi không có trợ lực. Với loại cột này người ta thường nén không khí để đẩy dung môi đi qua cột, phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký cột nhanh. Với các loại hạt kích thước nhỏ nữa thì người ta dùng bơm để bơm dung môi rửa đi qua cột, ví dụ sắc ký lỏng điều chế hiệu lực cao (HPLC). Việc rửa cột có thể tiến hành với một loại dung môi đồng nhất từ đầu đến cuối (loại này thường là hệ dung môi có thành phần cố định của 2 hay 3 dung môi theo khảo sát của SKLM ở trên), cũng có thể tiến hành theo gradien phân cực của dung môi, nghĩa là lúc đầu rửa bằng dung môi có độ phân cực cực tiểu, 100% dung môi không phân cực, sau đó tăng dần thành phần phân cực của hệ, nghĩa là tăng dần độ phân cực của hệ dung môi cho đến lúc nó có độ phân cực cực đại, 100% dung môi phân cực. Khi dung môi ra khỏi cột, người ta thu gom chúng vào các phân đoạn khác nhau nhờ vào máy phân đoạn theo thời gian hay theo số giọt (thể tích). Thể tích mỗi phân đoạn phụ thuộc vào ∆Rf. Với các thành phần kế tiếp nhau, có Rf cách xa nhau (∆Rf lớn) thì có thể lấy phân đoạn với thể tích lớn, ∆Rf của các thành phần kế tiếp cần tách càng bé thì thể tích mỗi phân đoạn lấy càng nhỏ.

5.2.5. Thu gom sản phẩm và tinh chế Có nhiều cách để kiểm tra sự đồng nhất giữa các phân đoạn để thu gom chúng, loại dung môi thu sản phẩm nhưng đơn giản và dễ tiến hành là SKLM. Nếu các thành phần liên tiếp của tinh dầu có Rf cách xa nhau và điều kiện sắc ký tốt thì vệt của chúng trên cột riêng biệt nhau và đồ thị biểu diễn hàm lượng của chúng ra khỏi cột theo thời gian như chỉ ra trên hình 5.6. 83

Hình 5.6. Đồ thị biểu thị hàm lượng các chất A, B, C ra khỏi cột theo thời gian

Chính vì đặc tính phân bố các chất ra khỏi cột như chỉ ra ở trên mà người ta dùng SKLM kiểm tra các phân đoạn theo phương pháp “trung bình” rồi gộp các phân đoạn có sắc phổ giống nhau, loại dung môi và thu chất cần phân lập. Phương pháp “trung bình” được tiến hành như sau: lúc đầu kiểm tra các phân đoạn 1, 10, 20, 30…, sau đó kiểm tra các phân đoạn 5, 15, 25…, nếu phân đoạn 5 và 10 có sắc phổ giống nhau thì các phân đoạn 6, 7, 8 và 9 không cần kiểm tra nữa mà có thể gộp chúng vào phân đoạn 5 và 10, tiếp tục kiểm tra các phân đoạn trước phân đoạn 5 và sau phân đoạn 10 để tìm phân đoạn chất bắt đầu ra khỏi cột và phân đoạn chất đã ra hết. Một cách tương tự như vậy trên cơ sở đường kính của vệt, nồng độ vệt qua hiện màu mà người ta có thể tím được nhanh chóng điểm bắt đầu chất ra, điểm cực đại và điểm kết thúc lúc chất ra hết. Sau khi gộp các phân đoạn có sắc phổ giống nhau người ta loại dung môi và thu chất phân lập. Nếu sản phẩm là chất rắn thì tìm dung môi để kết tinh lại là được sản phẩm tinh khiết. Nếu sản phẩm là chất lỏng thì tiến hành cất lại trên thiết bị cất vi lượng. Một ví dụ khác về chọn phương pháp điều chế và phân lập thành phần chính của tinh dầu. Tinh dầu thu được từ thân củ gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) bằng phương pháp cất cuốn hơi nước trong một thiết bị đặc biệt và có áp dụng hiệu ứng muối (hình 5.7). Cách vận hành thiết bị như sau: Cho nguyên liệu đã xử lý vào bình cất (a), cho dung dịch muối NaCl 15% đến ngập nguyên liệu. Đun hồi lưu trong 2 – 3 giờ. Khi đun hỗn hợp 84

hơi dầu-nước theo ống dẫn (b) đến sinh hàn (c) đông tụ thành dịch dầu-nước, dịch này đi qua (c) bẫy đựng dung môi benzen (d), dầu tan vào dung môi và được giữ lại, nước thì qua khoá lỗ (e) rồi (b) theo ống dẫn về bình cất. Như (d) vậy, sau một thời gian đun hồi lưu một phần tinh dầu trong nguyên (e) liệu đã được chuyển vào dung môi trong bẫy (d). Khi đó tháo dung môi trong bẫy qua khoá (e) rồi tiếp tục cất (a) trực tiếp cho đến khi dịch cất dầunước qua khoá (e) có phản ứng âm tính với với dung dịch Hình 5.7. Thiết bị cất cuốn hơi nước KMnO4 0,02%. Bão hoà dịch dầu-nước này bằng NaCl rồi chiết bằng dung môi n-hexan. Gộp dung môi chiết này với dung môi trong bẫy, làm khô bằng Na2SO4 khan rồi cất loại dung môi thu tinh dầu. Với phương pháp này hiệu suất tinh dầu thu được từ củ gừng gió đạt 0,75% tính theo nguyên liệu khô. Làm lạnh tinh dầu này trong tủ lạnh ở –5 ÷ –10oC trong 1 ngày người ta được một lượng lớn tinh thể Zerumbon. Phần dịch dầu còn lại được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng trên silicagel với hệ dung môi n-hexan/etylaxetat 95/5 (V/V), hiện bằng vanillin 0,5% trong H2SO4 đặc thì được 10 vệt có Rf: 0,93; 0,89; 0,83; 0,79; 0,73; 0,68; 0,56; 0,45; 0,36 và 0,14. GC-MS xác định được 32 thành phần có trong tinh dầu gừng gió sau khi loại Zerumbon trong đó có 10 thành phần chính (thành phần có hàm lượng lớn hơn 1%) được chỉ ra trong bảng 4.5. Kết quả phân tích SKLM, GC-MS và đặc điểm nhiệt độ sôi cho phép chúng ta chọn phương pháp phân lập các chất trong tinh dầu này là phương pháp sắc ký cột.

Bảng 4.5. Một số thành phần chính

ts , C

Tên chất

Hàm lượng

ts , o C

Tên chất

Hàm lượng

207

Camphor

2,0

230

trans-Cariphylen

1,65

209

E-12-morcaryophylen

1,04

263

α-Humulen

16,89

210

Caryophylenoxit

4,64

268

Bicyclo-(4,10)heptan

2,89

211

Bicyclo-(9,10)dodecadien-3,7

7,57

272

2-Cyclohexen-1on

1,47

212

α-Thuyen

1,13

TT chảy 68,5

Zerumbon

53,3

Với cột cao 100 cm, đường kính 3 cm, silicagel cỡ hạt 40 – 63 µm, tỷ lệ chất phân tích và chất hấp phụ 1/50, nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt, dung môi rửa n-hexan/etylaxetat 95/5 (V/V), tốc độ rửa 3 ml/phút. Thu 100 phân đoạn, mỗi phân đoạn 10 ml. Kiểm tra các phân đoạn có sắc phổ giống nhau và gộp chúng thành các nhóm - loại dung môi và thu sản phẩm. Tuỳ theo chất lượng sản phẩm của từng nhóm mà người ta tiến hành khảo sát lại hệ dung môi và chạy lại sắc ký cột tách một lần nữa, hoặc chỉ kết tinh lại là đạt. Với tinh dầu gừng gió, các phân đoạn 46 – 53 chỉ cho 1 vệt có Rf 0,73, hiện tử ngoại cho mày vàng, vanillin cho màu hồng thẫm, gộp các phân đoạn này, loại dung môi và kết tinh lại trong n-hexan thu được tinh thể hình kim nóng chảy ở 68,5oC, ký hiệu là Z. Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký khí cho thấy độ tinh khiết đạt 99,5%. Xác định cấu trúc phân tử Z được chỉ ra ở cuối phần áp dụng các các phương pháp quang phổ nghiên cứu tinh dầu.

Chương VI ÁP DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ CHO NGHIÊN CỨU TINH DẦU 6.1. Phổ hồng ngoại (IR – Infrared Spectrocopy)

6.1.1. Kiến thức cơ sở Các nguyên tử trong phân tử luôn luôn dao động theo 3 hướng khác nhau trong không gian và gọi là dao động riêng phân tử. Mỗi dao động riêng chia làm 2 loại: + Dao động làm thay đổi chiều dài của liên kết gọi là dao động hoá trị, ký hiệu là ν. + Dao động làm thay đổi góc giữa các liên kết gọi là dao động biến dạng, ký hiệu là δ. Mỗi loại như vậy lại phân làm đôi, một dao động đối xứng và một dao động bất đối xứng. Mỗi dao động riêng có một mức năng lượng nhất định nên khi chiếu hC tia hồng ngoại có năng lượng E = , trong đó λ có bước sóng dài từ λ 100 cm–1 đến 200 cm–1, thì các dao động hấp thu năng lượng ở bước sóng nhất định và dao động mạnh hơn, nhanh hơn. Sự hấp thụ năng lượng này được ghi lại thành biểu đồ gọi là phổ hồng ngoại. Như vậy mỗi pic trên phổ hồng ngoại ứng với một dao động và vì trong phân tử có nhiều loại dao động nên phổ hồng ngoại có nhiều pic rất phức tạp. Vì thế khi phân tích phổ hồng ngoại người ta chỉ chú ý những pic chính đặc trưng cho một số loại liên kết. Các tần số dao động đặc trưng cho các liên kết và nhóm chức được cho trong các bảng từ 6.1.1 đến 6.1.6.

6.1.2. Các điều lưu ý khi áp dụng phổ IR để nghiên cứu tinh dầu (i) Phổ IR phụ thuộc rất lớn vào nồng độ, nhiệt độ và môi trường để ghi phổ. Ví dụ, νC=O của menton trong n-hexan là 1723 cm–1, nhưng 87

trong CHCl3 là 1712 cm–1; νOH của xiclohexanol trong CCl4 nồng độ 0,5M cho 2 pic: pic nhọn 3635 cm–1, pic parabol 3353 cm–1, nhưng tăng nồng độ lên 2M thì pic nhọn 3630 cm–1 nhỏ đi một cách nhanh chóng, còn pic parabol 3340 cm–1 lớn lên một cách vượt bậc. (ii) Vì chất lượng phổ IR phụ thuộc nhiều yếu tố nên sai số của nó khá lớn, ± 10 cm–1. (iii) Cần biết phân biệt tần số hấp thụ của CH của nhóm metylen, metylen và metin, nhóm metylen đầu mạch và nhân benzen, phân biệt liên kết đôi bình thường với liên kết 1 nhóm thế, 2 nhóm (cis và trans), 3 nhóm thế, liên kết đôi liên hợp và liên kết C–O–C của este thẳng, este vòng: ở este thẳng có 1 pic νC–O–C = 1300 cm–1 và 900 cm–1 nhưng vòng hẹp epoxit thì chỉ có 1 pic 1260 cm–1. ν–OH không có liên kết hiđro (nồng độ loãng hay môi trường không cực) thì pic nhóm OH là 3630 + 10 cm–1, nhưng có liên kết hiđro (nồng độ cao, môi trường phân cực) thì pic nhóm OH là một parabol 3400 – 3600 cm–1. Bảng 6.1.1. Tần số dao động đặc trưng của các nhóm hiđrocacbon no

Dạng

Nhóm

ν(C–H)

CH3

ν(C–H)

CH2

ν(C–H) CH3

δ(C–H)

cm–1 2962 ± 10 2872 ± 10 2926 ± 10 2850 ± 10 3040 ± 10 1460 ± 10

CH(CH3)2 iso

1386 ± 5

CH(CH3)2 gem

1382 ± 5

Bảng 6.1.2. Tần số dao động đặc trưng của liên kết đôi

Dạng ν(C–H)

Nhóm R–CH=CH2 R C CH2 R R R C C R C

C R

ν(C=C)

R–CH=CH2 R C CH2 R R R C C R C

C R

R C

R R

R R C

δ(C–H)

vinyl

3085 ± 10

metylen

2872 ± 10 3085 ± 10

cis 2 nhóm thế

3020 ± 10

trans 2 nhóm thế

3025 ± 10 1643 ± 5 1648 ± 5

cis 2 nhóm thế

1655 ± 5

trans 2 nhóm thế

1673 ± 10

3 nhóm thế

1672 ± 7

4 nhóm thế

1675 ± 5 1442 ± 7 992; 910

R–CH=CH2 R R

1410 ± 10 890 ± 5

CH2

cis 2 nhóm thế

1260 ± 10 690 ± 10

trans 2 nhóm thế

1305 ± 10 971 ± 7

3 nhóm thế

820 ± 20

R R R C R

cm–1

C R

Bảng 6.1.3. Hấp thụ hồng ngoại của nhân thơm

Dạng

cm–1

ν(C–H)

3050

δ(C–H)

700–900

Dạng

cm–1 1600

ν(C=C)

1500 1470

Bảng 6.1.4. Tần số dao động đặc trưng của δ(C–H) trong hệ thơm

Hệ thơm

δ(C–H), cm–1

1 nhóm thế

750 700 620

1,2 – hai nhóm thế

750 720 785

1,3 – hai nhóm thế

715 700

1,4 – hai nhóm thế

820 810

1,2,3 – ba nhóm thế

725 653 810

1,2,4 – ba nhóm thế

815 730 840

1,3,5 – ba nhóm thế

840 690 560

Bảng 6.1.5. Tần số dao động hoá trị đặc trưng của hợp chất cacbonyl và este

Dạng hợp chất

Hợp chất

ν(C=C), cm–1

R–CO–R1

Xeton mạch thẳng no

1715

Xeton vòng 4 Xeton vòng 5 Xeton vòng 6 Xeton vòng 7

1780 1745 1812 1705

Ar–CO–R Ar–CO–Ar C=C–CO–R R–CHO

Aryl xeton Điaryl xeton Xeton α,β-không no Anđehit no

1690 1665 1685 1730

RCOOH

Axit cacboxylic monome Axit cacboxylic monome

1760 1700

RCOOR1 C=C–COOR1 RCOOC=C

Este no Este α,β-không no Eno este

1740 1720 1770

β-lacton γ-lacton δ-lacton γ-lacton-α,β-không no

1820 1765 1725 1750

Eno-γ-lacton

1800

R–CO–O–CO–R

Anhiđrit

1820 1750

R–CO–O–R RCOOCH3 C6H5COOR CH3COOR

Liên kết C–O–C trong este Metyl este Ankyl benzoat Ankyl axetat

O Cn

1165 – 1270 1165 1270 1245

Bảng 6.1.6. Hấp thụ hồng ngoại các nhóm chức

a) Nhóm amin + Amin bậc 1: Có 2 đỉnh nhọn, νNH = 3500 – 3600 cm–1 νNH = 1650 cm–1 + Amin bậc 2: Có 2 đỉnh nhọn, νNH = 3600 cm–1 νNH = 1652 cm–1 + Amin bậc 3: νC–N = 1030 cm–1, 1130 cm–1 với amin thơm: νC–N = 1080 cm–1 với amin thẳng: νC–N = 1200 cm–1 b) Nhóm amit νC=O của amit bậc 1: νC=O của amit bậc 2:

1600 – 1690 cm–1 1500 – 1690 cm–1

c) Nhóm ete Với ete vòng no có 2 tần số:

+ Tần số thứ nhất: νC–O–C = 1000 cm–1 + Tần số thứ hai: νC–O–C = 1020 – 2075 cm–1 Cả 2 tần số này đều phụ thuộc độ lớn của vòng. Khi có liên kết đôi bên cạnh thì cả 2 tần số này đều chuyển về 1200 – 1275 và 1020 – 1075 cm–1. Vòng epoxit có νC–O–C = 1250 cm–1; riêng cineol-1,8 có ν1(C–O–C) = 1030 cm–1 và ν2(C–O–C) = 990 cm–1. Bảng 6.1.7. Đặc trưng phổ hồng ngoại của nhóm hiđroxyl (OH) và C–O của ancol, phenol và axit cacboxylic

Chất νOH của ancol, phenol

Điều kiện ghi Trong dung dịch loãng, OH dạng tự do

Vị trí hấp thụ

Đặc điểm pic

3600

pic nhọn

Trong dung dịch đặc OH 2500 – 3200 liên hợp, liên kết hiđro

pic tù (parabol)

νOH của axit

Axit dạng monome Axit dạng đime

3600 2500 – 3000

pic rỗ nhọn pic không rõ

νC–O

Ancol, phenol, axit

1150 – 1100

rất rộng, mạnh

Đặc điểm phổ hồng ngoại của liên kết C–O–C trong các ete: với các ete mạch thẳng thì hấp thụ hồng ngoại của liên kết C–O–C ở 1300 cm–1; với các ete mạch vòng thì thay đổi theo độ lớn của vòng. 6.2. Phổ tử ngoại (UV – Ultra Violet Spectrometry)

6.2.1. Kiến thức cơ sở Ánh sáng tử ngoại có bước sóng từ 150 đến 600 nm, do đó có năng lượng đủ để làm cho các electron tham gia liên kết và electron p chuyển từ trạng thái liên kết lên trạng thái phản liên kết: σ → σ*; π → π*; p → σ* ; p → π*

Hình 6.2.1. Sơ đồ năng lượng chuyển trạng thái của các electron

Nếu gọi năng lượng ở trạng thái liên kết là Eo và năng lượng ở trạng thái phản liên kết là E thì năng lượng mà liên kết hấp thụ được để chuyển hC trạng thái là ∆E = E – Eo = hν = . Ở đây C là tốc độ ánh sáng, h là λ hằng số Planck, ν là tần số và λ là bước sóng. Như vậy, liên kết càng bền, năng lượng hấp thụ càng lớn, bước sóng ánh sáng bị hấp thụ càng nhỏ. λσ→σ* = 120; λπ→π* = 160; λp→σ* = 180 và λp→π* = 286 nm. Như thế electron p dễ bị kích thích nhất, sau đó đến liên kết π và khó nhất là liên kết σ. Hệ liên hợp càng kéo dài λmax hấp thụ càng lớn, nghĩa là chuyển λmax về phía sóng dài. a) Liên hợp π – π λmax của etylen là 125 nm nhưng của butađien-1,3 thì có 2 bước sóng hấp thụ ở 175 và 217 nm. Điều này được thể hiện trên hình 6.2.2.

Hình 6.2.2. Mức năng lượng, trạng thái obitan, định hướng spin của butađien-1,3

Người ta cho rằng butađien-1,3 có 2 trạng thái liên kết: trạng thái các liên kết π liên hợp là trạng thái bền nhất π1 và trạng thái các liên kết độc lập π2 ít bền hơn π1. Khi bị chiếu UV thì butađien-1,3 chuyển từ π1 lên π2, sau đó hấp thụ năng lượng và chuyển lên trạng thái phản liên kết π*3 và π*4 . Trong đó π*4 kém bền nhất, có nguyên liệu kích thích lớn, λmax = 175 nm, còn π*3 có nguyên liệu kích thích bé hơn, λmax = 217 nm. b) Liên hợp p – π Đôi electron chưa chia sẻ p liên hợp với electron π tạo nên liên kết p – π và ở đây cũng có 2 λmax hấp thụ tương tự như ở liên kết π – π.

Điều này được thể hiện trên hình 6.2.3 và bảng 6.2.1.

Hình 6.2.3. Các bước chuyển trạng thái của các liên kết π – π và p – π

Bảng 6.2.1. Cực đại hấp thụ của các hợp chất có liên kết p – π

Dạng hợp chất

λmax, nm

εmax

C=C

170

10.000

CH3O-γ=C

190

10.000

Cl–C6H5

210

7.400

c) Liên hợp σ – π Liên hợp σ – π còn gọi là siêu liên hợp, nghĩa là liên hợp của liên kết σ C–H với liên kết π cách nó một liên kết đơn. Sự liên hợp này cũng làm cho cực đại hấp thụ chuyển về phía sóng dài, điều này thể hiện trong bảng 6.2.2. Bảng 6.2.2. Hấp thụ cực đại của một số chất

λmax, nm

εmax

CH2=CH2

165

16.000

(CH3)2C=C(CH3)2

196

CH2=CH–CH=CH2

217

21.000

CH3–CH=CH–CH=CH2

223

24.000

CH3–CH=CH–CH=CH–CH3

227

24.000

Dạng hợp chất

Chú ý: (i) Phổ UV bị ảnh hưởng lớn bởi dung môi dùng để ghi phổ, do đó phải ghi rõ phổ UV trong dung môi gì. (ii) Với các nhóm thế có hiệu ứng ±I không ảnh hưởng đến λmax nhiều nhưng những nhóm thế có hiệu ứng liên hợp π – π, p – π và σ – π có ảnh hưởng đến chuyển dịch cực đại hấp thụ, điều này được thể hiện ở bảng 6.2.3. Bảng 6.2.3. Đặc điểm hấp thụ của C6H5–X

λmax, nm

εmax

–H

254

204

–CH3

261

225

–OH

270

1450

–NH2

280

1450

–COOH

273

900

Nhóm thế X

6.2.2. Phổ UV phục vụ nghiên cứu tinh dầu Các liên kết đôi thế, liên kết đôi liên hợp, hệ vòng thơm cũng như dẫn xuất oxi của chúng rất phổ biến trong tinh dầu cũng như các thành phần của tinh dầu nên phổ UV đóng góp đắc lực trong việc xác định cấu trúc phân tử của chúng. Để vận dụng tốt phổ UV cần chú ý số liệu đã cho trong các bảng từ 6.2.1 đến 6.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến cực đại hấp thụ a) Ảnh hưởng của nhóm thế Khi nguyên tử hiđro của anken hay vòng thơm được thay thế bằng các nhóm thế khác nhau thì cực đại hấp thụ của hợp chất thay đổi khác nhau.

Với các nhóm thế gây hiệu ứng ±I không ảnh hưởng nhiều nhưng những nhóm thế có hiệu ứng liên hợp π – π, p – π và σ – π đều có ảnh hưởng lớn đến sự chuyển dịch cực đại hấp thụ về phía sóng dài (x. bảng 6.2.3). b) Ảnh hưởng của lập thể Các đồng phân hình học cis-, trans- của liên kết đôi có ảnh hưởng đáng kể đến đặc điểm phổ tử ngoại. Bảng 6.2.4. Các nhóm mang màu

Chuyển λmax, nm logεmax

Dung môi

CH2=CH2

π → π*

162,5

4,2

Heptan

(CH3)2CO

p → π*

279

1,2

Heptan

C=C

CH=CH

π → π*

173

3,8

Khí

C–X

CH3Cl

p → π*

173

2,3

Hexan

Nhóm

Hợp chất

C=C

Bảng 6.2.5. Các polien

λmax, nm

logεmax

CH2=CH–CH=CH2

217

4,3

CH2=CR–CH=CH2

220

4,3

R–CH=CH–CH=CH2

223

4,4

Dạng hợp chất

CH2=CR–CR=CH2

226

4,3

R–CH=CH–CH=CH–R

227

4,4

237

4,9

247

4,3

275

4,5

CH3–CH=CH–CH3 trans

Bảng 6.2.6. Hợp chất cacbonyl α,β-không no

Dạng hợp chất

π → π*

p → π*

λmax

logεmax

λmax

logεmax

CH2=CH–CHO

208

4,0

318

1,1

CH3–CH=CH–CH3

220

4,2

322

1,4

CH2=CH–CO–CH3

212

3,5

324

1,3

CH3–CH=CH–CO–CH3

224

4,0

315

1,6

(CH3)2C=CH–CO–CH3

235

4,2

314

1,8

CH3–CH=CH–COOH

205

4,2

CH3–CH=CH–COOR

205

4,2

Bảng 6.2.7. Benzen và một số dẫn xuất

Dạng chất

CH3

λmax, nm

Dạng chất

λmax, nm

255 (2,5)

275 (3,3) 286 (3,0)

262 (2,3)

297 (2,8)

275 (3,7)

295 (4,6)

280 (3,2) 317 (1,8)

245 (4,6) 251 (4,7) 259 (4,5) 274 (4,1)

C O

CH3

6.3. Phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS – Electron Impact Mass Spectrometry)

6.3.1. Kiến thức cơ sở Vì phân tử lượng của các thành phần của tinh dầu không vượt quá 500 đ.v. nên EI-MS rất thích hợp cho nghiên cứu tinh dầu. Với các chất có phân tử lượng lớn như lutexin, caroten, các glucozit của steroit thì người ta dùng phổ khối lượng bắn bằng nguyên tử nhanh (FAB-MSE – Fast Atom Bomberment Mass Spectrometry). Khi phân tử bị bắn phá bằng chùm electron có năng lượng cao (70 eV) dưới chân không lớn (10–6 mmHg) và nhiệt độ cao (≥ 200oC) thì nó bị phân rã thành mảnh ion gốc hay ion: + 1e

ABC

+ 2e

ABC + 2e

ABC

+ 3e

Ion gốc (1) có khối lượng lớn nhất nên gọi là ion phân tử. Dưới tác dụng của electron năng lượng cao, ion phân tử bị phân rã tiếp thành mảnh gốc và mảnh ion: hoÆc

ABC hoÆc

Sự phân mảnh thiếp theo của mảnh ion thành mảnh phân tử trung hoà và ion:

→ A + B+ hay A+ + B AB+ ⎯⎯ Cho toàn bộ các mảnh có trong buồng bắn phá qua bộ phận phân tích theo khối lượng của mảnh rồi chuyển tín hiệu vào máy ghi và ghi thành sơ đồ theo khối lượng và cường độ (hàm lượng) sơ đồ này gọi là phổ khối lượng (EI-MS). Như vậy, trong phổ khối EI-MS pic có trọng lượng lớn nhất nằm bên phải phổ đó là trọng lượng ion phân tử (M+) và cũng chính là phân tử lượng của chất bị bắn phá. Nếu phân tử lượng là số chẵn thì thì phân tử không có nguyên tử nitơ hay một số chẵn nguyên tử nitơ. Nếu phân tử lượng là số lẻ thì trong phân tử có một nguyên tử hay một số lẻ nguyên tử nitơ. 98

Sau pic ion phân tử là các pic của các mảnh gốc, mảnh ion hay phân tử trung hoà; phân tử trung hoà được sinh ra từ gốc phân tử hay từ ion mảnh khác có khối lượng lớn hơn nó. Mảnh gốc được sinh ra từ ion gốc phân tử. Quá trình phân mảnh diễn ra theo một cơ chế nhất định và được chỉ ra trên hình 6.3.1 và trọng lượng một số mảnh được chỉ ra trên sơ đồ 6.3.1.

Hình 6.3.1. Chiều cao vạch phổ ion phân tử của hợp chất chứa Cl, Br và S Sơ đồ 6.3.1. Các cơ chế phân mảnh trong EI-MS

1. Tách ankyl

2. Tách olefin

3. Tách allyl

4. Tách ion tropylium (vòng thơm)

5. Tách đồng li

6. Tách dị li

7. Tách ở vị trí α đối với nhóm C–Y và C–O

100

8. Tách Retro-Diels-Alder

9. Tách phân tử trung hoà bằng chuyển vị liên kết đôi cis hay vòng thơm thế ortho

10. Chuyển vị McLafferty a) Nhóm cacbonyl

b) Vòng thơm và anken

Các ion hình thành luôn tồn tại ở dạng bền (ví dụ: –C≡O+; –CH=OH+).

101

6.3.2. Phổ khối lượng của một số hợp chất thường gặp 1. Ankylbenzen Ví dụ phổ EI-MS của n-propylbenzen được chỉ ra trên hình 6.3.2:

Hình 6.3.2. Phổ khối lượng n-propylbenzen

Ở đây chúng ta chú ý pic phân tử lượng M+ = 120 và các pic có m/e sau: 91, 77, 65 và 51. Vì hợp chất là ankylbenzen nên người ta nghĩ ngay đến cơ chế tạo ion tropylium, nghĩa là cơ chế tạo ra mảnh m/e = 91 vòng 7.

102

2. Xeton Ví dụ phổ khối lượng của menthon (hình 6.3.3) chú ý các pic M+ = 154, m/e = 139, 112, 97, 70 và 69.

Hình 6.3.3. Phổ khối lượng của menthon

150 – 139 = 15 ⇒ CH3 154 – 112 = 42 ⇒ 15 + 15 + 2 ⇒ CH3CH3CH2• 112 – 97 = 15 ⇒ CH3• 154 – 83 = 71 ⇒ 15 + 15 + 13 + 14 + 14 ⇒ CH3(CH3)CHCH2CH2• Cơ chế phân mảnh:

103

3. Phenol Chú ý các mảnh M++ = 94, m/e = 66, 65

Hình 6.3.4. Phổ khối lượng của phenol

94 – 66 = 28 ⇒ 12 + 16 ⇒ CO 66 – 65 = 1 ⇒ H Cơ chế phân mảnh:

4. Axit cacboxylic Thường gặp tách OH (m/e 17) và tách COOH (m/e 45). Ví dụ phổ khối lượng của axit m-metoxibenzoic (hình 6.3.5). Ở đây chú ý: M+ = 152, m/e = 135, 122, 107, 77.

Hình 6.3.5. Phổ khối lượng của axit m-metoxibenzoic

104

152 – 135 = 17 ⇒ OH 152 – 122 = 30 ⇒ 16 + 14 ⇒ OCH2 122 – 77 = 45 ⇒ 12 + 16 + 17 ⇒ COOH 135 – 107 = 28 ⇒ 12 + 16 ⇒ CO Cơ chế phân mảnh:

5. Este của axit cacboxylic Số khối thường gặp là m/e = 61, 75, 89, 103, … Ví dụ khối lượng của n-butyl salixylat. Hợp chất este có nhóm cacbonyl nên người ta nghĩ ngay đến chuyển vị một cách dễ dàng, tìm ra nhóm trung gian như trên.

Hình 6.3.6. Phổ khối lượng của n-butyl salixylat

105

Cơ chế phân mảnh:

Bảng 6.3.1. Bảng số khối của một số mảnh ion

m/e

Mảnh ion

m/e

Mảnh ion

CH2

Cl (và m/e 37)

CH3

HCl (và m/e 38)

O, CH4

C3H3

OH, NH3

CH2C≡N

H2O, NH4

C3H5, CH2C≡N+H

C3H6, CH2CO

C3H7, CH3C=O, CONH

C≡N, C2H2

CH2CH=O+H, CH3CHNH2, CO2

C2H3

CH3CHOH, CH2CH2OH, O=CO

C2H4, CO, N2

C2H5, COH

NO2

CH2NH2, NO

CH2SH, CH3S

CH2OH, OCH3

CH3S+H

CH2Cl (và m/e 51)

H2S

CH2CH2C≡N

106

CH2OCH3, CH3CH–O+H

m/e

Mảnh ion

m/e

C4H7, CH2=CH–C=O

C6H13, C4H9C=O

C4H8, C3H4O

C3H7C(=O)CH2+H, C4H9CHNH2

C4H9, C2H5C=O

O=COC3H7, CH2C(=O)OC2H5,

CH3C(=O)CH2+H, C2H5CHNH2,

Mảnh ion

CH3CHC(=O)OCH3

(CH3)2NCH2, C2H5NHCH2

CH2C(=O)OC2H5+H

(CH3)2COH, CH2OC2H5,

CH2

O=C–OCH3, NH2C(CH2)=O+H 60

CH2ONO, CH2COOH+H

CH2COOH+2H, CH2SCH3, CH2CH2SH

+ H,

CH2CH2CH2C≡N

C5H9, CF3, C4H5O

C5H10

C5H11, C3H7C=O

C2H5C(=O)CH2+H, C3H7CHNH2

O=COC2H5, CH2C(=O)OCH3

CH2C(=O)OCH3+H

O=COC2H5+2H, CH2SC2H5

C6H5

C7H15

C6H5+H

104

C2H5CHONO2,

C6H5+2H, Br (và m/e 81) 105

N H

CH2

N H

CH2CH2CH2CH2CH2C≡N C7H13,

CH2

CH2O+H

CH CH2

CH2CH2

CH3SS+H, HBr (và m/e 82) 81

CH2

+ H,

CH2

CH2CH2CH2CH2C≡N

C6H11

111 119

CF2CF3,

CHCH3 CH3 ,

CH3 CH3

CH=O CH3

107

m/e

Mảnh ion C=O

121

m/e

131

Mảnh ion

C3F5

OH C=O

123

139 F

127

128

C=O Cl (vµ m/e 141)

149

O O + H

C O

6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR

(Proton and carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrocopy)

6.4.1. Tính chất vật lý của hạt nhân và tác dụng của từ trường ngoài lên nó tạo nên cộng hưởng từ Hạt nhân nguyên tử mang điện tích dương và tự quay quanh mình G tạo nên dòng điện vòng có momen điện từ µ , đồng thời cũng tạo ra JG momen quay gọi là momen spin P . Như vậy, JG hạt nhân nguyên tử được G đặc trưng bằng momen từ µ và momen spin P . Khi đặt hạt nhân nguyên tử vào từ trường ngoài có cường độ Bo thì dưới tác dụng của đường sức từ trường ngoài momen từ của hạt nhân bị xoay đi một hướng nhất định trong không gian gọi là lượng tử hoá và được đặc trưng bằng số lượng tử m (m có các giá trị – I, I + I, + I). Đối với các nguyên tử có hạt nhân như 1H, 13C và 31P thì I chỉ có 2 giá trị là 1 1 + và − . Nếu gọi z là trục của hướng từ trường ngoài Bo thì hình 2 2 chiếu của µ trên trục z là µz. Bo lúc này có 2 trường hợp, một trường hợp momen từ của hạt nhân có hướng trùng với hướng của momen từ trường ngoài Bo và có năng lượng thấp E1. Trường hợp thứ hai, momen từ của hạt nhân có hướng không trùng với hướng từ trường ngoài Bo và khi đó nó có năng lượng cao E2. Hiệu số 2 mức năng lượng này là năng lượng cần để chuyển hướng momen từ của hạt nhân trùng hướng với từ trường ngoài: 108

∆E = E 2 − E1 =

h 2π

γBo

(1)

γ là hằng số hồi chuyển, nó phụ thuộc vào từng loại hạt nhân. Tỷ lệ giữa các hạt nhân năng lượng thấp N1 và hạt nhân năng lượng cao N2 theo sự phân bố của Boltzman: N1 = e −∆E / kT (2) N2 k là hằng số phụ thuộc bản chất của hạt nhân; T là nhiệt độ tuyệt đối. Ở một tác dụng nhất định của từ trường ngoài thì số lượng hạt nhân ở 2 mức năng lượng cân bằng nhau. Cân bằng này bị phá vỡ khi cung ứng một năng lượng mới và lúc này các hạt nhân ở mức năng lượng thấp nhận năng lượng và nhảy lên mức năng lượng cao, nhưng sau đó một số hạt nhân lại bức xạ năng lượng và quay về mức năng lượng thấp cho đến lúc thiết lập được cân bằng mới, thời gian cần để thực hiện quá trình này gọi là thời gian phục hồi spin - spin. Năng lượng cần để thực hiện quá trình này chính là năng lượng giữa 2 mức năng lượng cao và thấp của hạt nhân (∆E) và người ta gọi nó là năng lượng cộng hưởng từ hạt nhân. Nếu gọi νo là tần số cộng hưởng, ta có: 1 (3) νo = γBo 2π Biểu thức (3) cho thấy cùng một từ trường ngoài Bo như nhau nhưng những hạt có hằng số hồi chuyển γ khác nhau sẽ có tần số cộng hưởng νo khác nhau. Ví dụ, cùng trong một từ trường ngoài Bo = 23487 (G) nhưng 1H có γ = 26,5 nên νo = 100 µHz; trong khi đó 13C có γ = 6,726 nên νo = 25,145 µHz. Để có sự cộng hưởng từ, người ta tác động vào hạt nhân đặt trong từ trường Bo một từ trường biến đổi B1 có hướng vuông góc với hướng từ trường Bo và quay với tốc độ quay ωo trùng với tốc độ G Hình 6.4.1. Tác dụng của từ trường B1 lên quay ωo của momen từ µ . hạt nhân đặt trong từ trường Bo Chính sự biến đổi của từ 109

trường B1 gây nên sự cộng hưởng từ của các hạt nhân. Quá trình này được thể hiện trên hình 6.4.1.

6.4.2. Hằng số chắn và độ chuyển dịch hoá học a) Hằng số chắn Bất kỳ hạt nhân nào cũng có lớp vỏ các electron bao bọc. Các electron này sinh ra một từ trường B’ ngược chiều với từ trường ngoài Bo để che chắn cho hạt nhân, làm giảm bớt sự tác động của từ trường ngoài lên hạt nhân. Vì thế, từ trường ngoài tác dụng thực sự lên hạt nhân bị yếu đi, người ta gọi nó là từ trường hiệu dụng và ký hiệu là Be. Vì mỗi hạt nhân có một lớp vỏ electron xác định nên sự che chắn này là cố định, vì thế gọi nó là hằng số chắn và ký hiệu là σ. Khi đó Be = Bo(1 – σ). Như thế mật độ electron càng cao, hằng số chắn càng lớn, từ trường hiệu dụng càng bé, hạt nhân càng được bảo vệ, không bị tác dụng lớn của từ trường ngoài. Các hạt nhân có vỏ điện từ giống nhau thì có hằng số chắn bằng nhau, các hạt nhân như thế gọi là hạt nhân tương đương. Các hạt nhân không có vỏ điện từ giống nhau, không có hằng số chắn bằng nhau gọi là hạt nhân không tương đương. Ví dụ: Ha1 Hb1 Ar

Hb2

Ha2 Hb3

Ha1, Ha2 tương đương; Hb1, Hb2, Hb3 tương đương nhưng Ha1 và Hb1 không tương đương. Có 2 nguyên nhân xuất hiện hằng số chắn: (i) Hiệu ứng nghịch từ: Các electron bao quanh hạt nhân sinh ra từ trường ngược chiều với từ trường ngoài làm giảm bớt (chắn bớt) sự tác dụng của nó lên hạt nhân. Lớp vỏ điện từ càng dày, mật độ càng cao cang chắn nhiều, hằng số chắn càng lớn. Như thế, các nhóm có hiệu ứng +I có hằng số chắn lớn (CH3, C2H5,…), các nhóm có hiệu ứng –I có hằng số chắn bé (Cl, Br, NO2,…). Các hợp chất có hằng số chắn lớn nằm ở phía trường mạnh (bên phải). (ii) Hiệu ứng thuận từ: Đối với các hợp chất có liên kết π như olefin, ankin, benzen và cacbonyl, ở đây các electron chuyển động sinh 110

ra dòng điện vòng và tạo ra từ trường riêng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường ngoài. Các nghiên cứu cho thấy các hợp chất này có từ trường riêng cùng chiều với từ trường ngoài, nghĩa là có hiệu ứng thuận từ, nghĩa là hằng số chắn bé, trường hiệu dụng lớn nên các hợp chất có hằng số chắn bé nằm ở phía trường yếu (bên trái). b) Độ chuyển dịch hoá học Khi đặt hạt nhân A và B của cùng một nguyên tố vào từ trường ngoài Bo và gọi hằng số chắn của hạt nhân A là σA và hằng số chắn của hạt nhân B là σB, chúng ta có: 1 (4) δA = σBo (1 − σA ) 2π 1 (5) δB = σBo (1 − σ B ) 2π Hiệu số ∆ν = νA – νB ≈ δB – δA Người ta không thể đo trực tiếp được δA và δB nhưng đo được ∆ν khi lấy một trong hai số làm chuẩn thì biết được số kia. Trong trường hợp này người ta lấy chất có hằng số chắn lớn nhất làm chuẩn, đó là tetrametylsilan (CH3)4Si (TMS) và khi đó: δ = δTMS – δX Ở đây δTMS là hằng số chắn của TMS, còn δX là hằng số chắn của một chất nào đó. Giá trị δ gọi là độ chuyển dịch hoá học, δ không phụ thuộc tần số của máy đo nhưng ν phụ thuộc tần số của máy đo, vì thế người ta chọn δ làm số đo cho phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Tuy nhiên δ chưa có thứ nguyên nên từ biểu thức (4) và (5), ta có: ν − ν TMS (Hz) ν X − ν TMS (Hz) δ= X = = a.10−6 6 ν o (MHz) ν o .10 (Hz) νo là tần số của máy đo, 10–6 chính là phần triệu ppm nên người ta chọn nó làm thứ nguyên: δ = a ppm Người ta chọn TMS có hằng số chắn lớn nên hầu như không bị từ trường ngoài tác dụng, tín hiệu của nó nằm ở phía trường mạnh và hầu như không bị chuyển dịch hoá học. Nếu đặt δTMS = 0 ppm, ngược lại trifloaxetic axit có hằng số chắn bé nhất nên nó bị tác dụng của từ trường 111

ngoài mạnh nhất nên tín hiệu của nó dịch chuyển mạnh, nằm ở phía trường yếu bên trái và có độ chuyển dịch hoá học lớn, do đó đặt δ = 10 ppm. Người ta chia từ 0 ppm đến 10 ppm thành 10 đơn vị bằng nhau và như vậy các hạt nhân 1H có độ chuyển dịch không mạnh thường nằm trong khoảng 0 → 10 ppm. Tuy vậy, cũng có những hạt nhân có độ chuyển dịch vượt ra ngoài phạm vi 10 ppm về phía trái, 11, 12, 13… ppm. Các điều nêu trên thể hiện trên hình 6.4.2.

Hình 6.4.2. Tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân của một số chất

6.4.3. Tương tác spin - spin 6.4.3.1. Hằng số tương tác spin - spin Lẽ ra 1 proton hay nhóm proton có vỏ electron tương đương chỉ cho 1 tín hiệu (1 pic) trên phổ nhưng trong thực tế không phải như vậy. Ví dụ phổ của CH3CH2OH có 3 nhóm pic, nhóm a có 3 đỉnh (triplet), nhóm b có 1 đỉnh (singlet), nhóm c có 4 đỉnh (quartet).

Hình 6.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của CH3CH2OH

112

Nguyên nhân của sự phân chia một pic thành nhiều đỉnh như vậy là do sự tương tác qua lại giữa các proton của các nhóm sát cạnh nhau tạo nên. Trong phổ cộng hưởng từ proton của CH3CH2OH được giải thích như sau: Nhóm CH2 có 2 proton, mỗi proton này có 2 từ trường riêng giống hệt nhau về cường độ, 2 từ trường này đồng thời tác động lên nhóm CH3 làm thành 2 mức năng lượng, do đó tín hiệu của nó bị phân chia thành 2 đỉnh giống nhau về cường độ. Vì nhóm CH2 có 2 proton nên chúng đã làm cho tín hiệu của nhóm CH3 phân chia thành 4 đỉnh. Nhưng vì 2 proton của nhóm CH2 tương đương nhau hoàn toàn nên 4 từ trường riêng của 2 proton này giống nhau và do đó tác động giống hệt nhau lên nhóm CH3 và làm cho tín hiệu nhóm này phân chia thành 4 đỉnh giống nhau về cường độ và cách đều nhau, và do đó 2 đỉnh gần nhau ở giữa chồng khít lên nhau thành 1 đỉnh, vì thế chúng ta chỉ có 3 đỉnh, mà 2 đỉnh hai bên có cường độ bằng nhau còn đỉnh ở giữa có cường độ gấp đôi, chúng ta có tỷ lệ 1 : 2 : 1 và khoảng cách giữa các đỉnh giống hệt nhau. Bằng cách giải thích tương tự, 3 proton của nhóm CH3 tác động lên nhóm CH2 làm cho tín hiệu của pic phân chia thành 6 đỉnh mà 4 đỉnh ở giữa chồng lên nhau từng đôi một tạo thành 2 đỉnh có cường độ gấp đôi 2 đỉnh ở ngoài cùng, nên cuối cùng chúng ta có 4 đỉnh và chúng có tỷ lệ 1 : 2 : 2 : 1. Như vậy, có thể nói nếu nhóm bên cạnh có 2 proton tương tác thì nó làm cho nhóm bị tương tác thành 3 đỉnh và tỷ lệ cường độ giữa các đỉnh là 1 : 2 : 1, nếu có n proton tương tác thì có n + 1 đỉnh và tỷ lệ cường độ các đỉnh được mô tả theo tam giác Pascal (nếu chúng là phổ đơn giản). n=0 n=1

n=2 n=3

singlet

1 1 1

2 3

dublet

triplet

1 3

quartet multiplet

n=n Hình 6.4.4. Tam giác Pascal

Như trên đã trình bày, khoảng cách giữa các đỉnh liền kề nhau trong cùng một nhóm là bằng nhau và không thay đổi, người ta gọi chúng là hằng số tương tác spin - spin và ký hiệu là JH–H. J được tính theo đơn vị Hz là hiệu số của tần số của 2 đỉnh liền kề nhau. Số liệu tần số này sẽ được cung cấp kèm theo phổ 1H. 113

Khi 2 nhóm proton liền kề nhau mà các proton của chúng không tương đương nhau nhưng tương tác tương hỗ lẫn nhau thì hằng số tương tác spin - spin của chúng bằng nhau (Ja = Jb) và có hiệu ứng mái, nghĩa là các đỉnh ở về phía gần nhau có cường độ cao hơn chút ít so với cường độ các đỉnh xa hơn.

Hình 6.4.5. Phổ cộng hưởng từ proton của 1-nitropropan

6.4.3.2. Các loại tương tác spin - spin Các proton có lớp vỏ electron dù khác nhau chút ít cũng có tương tác spin - spin. Sau đây là các loại tương tác spin - spin: • Tương tác geminal: là tương tác giữa các proton trên cùng một nguyên tử cacbon.

X Y J=0

H C

→ 20 Hz

H C

J=0

→ 4 Hz

• Tương tác vicinal: là tương tác giữa các proton ở 2 nguyên tử cacbon cạnh nhau phụ thuộc vào góc (θ) giữa 2 mặt phẳng chứa 2 proton đó. Ha X CH3

6 - 10 Hz

He He

H C

Ha Ha.Ha Ha.He He.He

114

6 - 13 Hz 2 - 4 Hz 2 - 4 Hz

5 - 12 Hz

12 - 18 Hz

• Tương tác spin - spin của các proton cách xa: các proton ở cách xa nhau 1, 2 cacbon có thể tương tác với nhau. H

CH C

0 - 25 Hz

2 - 3 Hz

H CH

• Tương tác spin - spin của các proton trong benzen và vòng 5 H o: 7 - 10 Hz m: 2 - 3 Hz p: 0 - 1 Hz

H4 H5

H3 X

J2–3

J2–4

J2–5

J3–4

2,0

0,9

1,5

3,5

2,7

1,3

1,5

2,1

4,7

1,0

2,9

3,4

Qua các loại tương tác spin - spin kể trên, có thể có nhận xét chung là 2 proton có khoảng cách càng xa nhau thì tương tác càng yếu dần, J bé dần. 6.4.3.3. Cường độ vạch phổ Diện tích giới hạn bởi đường cong của mỗi nhóm tỷ lệ thuận với số proton của nhóm đó mà nó thể hiện trên chiều cao của đường cong tích phân. Chú ý chiều cao của pic cũng phụ thuộc hàm lượng của chất đó có trong hỗn hợp hay nồng độ của nó trong dung dịch. Trong hình 6.4.6 chúng ta thấy rõ nếu nhóm thứ nhất (triplet) có giá trị là 3H thì nhóm thứ hai (quartet) có giá trị là 2H và nhóm thứ 3 có giá trị 5H. Kết quả này dựa trên sự so sánh chiều cao giữa các pic mà được thể hiện ở đường cong tích phân gọi là integral. Điều này phù hợp với công thức phân tử của etylbenzen. Điều này đúng vì 4 lý do: (1) độ chuyển dịch hoá học của 3 nhóm pic 1,2 ppm cho nhóm CH3, 2,5 ppm

115

cho nhóm CH2 và 7,2 ppm cho các proton ở nhân thơm là hợp lý; (2) độ bội của các nhóm pic: triplet chứng tỏ cạnh CH3 có nhóm CH2 quartet, chứng tỏ cạnh CH2 có CH3 và 5 proton ở nhân thơm là multiplet với máy có độ phân giải thấp, với máy tốt có độ phân giải cao thì thấy rõ sự tương tác ortho-ortho, ortho-meta, ortho-para, meta-meta; (3) hằng số tương tác spin - spin J của 2 nhóm 1 và 2 hoàn toàn bằng nhau; (4) tỷ lệ cường độ của các pic là 3 : 2 : 5 là phù hợp với CH3–CH2–C6H5.

Hình 6.4.6. Phổ cộng hưởng từ proton của etyl etylbenzen. Chiều cao bậc thang đường cong tích phân tỷ lệ với số proton ở mỗi nhóm

6.4.4. Phân tích phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) Để phân tích phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) một cách nhanh chóng, cần chú ý phân tích phối hợp chặt chẽ 4 yếu tố sau: (1) độ chuyển dịch hoá học của các pic; (2) độ bội trong mỗi pic; (3) hằng số tương tác spin - spin của mỗi pic và giữa các pic; (4) cường độ của các pic. Trong mỗi yếu tố như vậy cần hiểu rõ các yếu tố khác ảnh hưởng đến nó như yếu tố vị trí, yếu tố không gian, hiệu ứng mái… Trong thực tế nghiên cứu, người ta thường gặp 2 loại chất: (1) loại chất đã biết hay dự đoán được công thức cấu tạo, ví dụ như các chất tổng hợp từ một số chất đã biết trước hay chuyển hoá từ một chất đã biết công thức cấu tạo rồi; (2) loại chất hoàn toàn chưa biết gì về công thức cấu tạo cả, ví dụ như các chất phân lập được từ các nguồn nguyên liệu khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật. Việc phân tích cấu trúc phân tử của những chất hoàn toàn chưa biết rất khó khăn, nó đòi hỏi sự phối hợp nhiều loại phổ, một mình phổ cộng hưởng từ proton chưa giải quyết được, hơn nữa đôi khi nó còn đòi hỏi phối hợp thêm với các phương pháp khác như phương pháp hoá học, sinh học… 116

6.4.4.1. Phân loại phổ Căn cứ vào ∆J và các nhóm proton để phân loại: ∆J + Nếu > 1 thì ký hiệu bằng các chữ cái cách xa nhau như Ax, J A2x, A3x và trường hợp khác thì ký hiệu AB, A2B, ABC… ∆J + Nếu > 6 thì gọi chúng là phổ bậc 1, số còn lại gọi là phổ bậc cao. J (1) Lo¹i Ax:

Cl2CHCHBr2

(2) Lo¹i A2x: Cl2CHCH2Br

(3) Lo¹i A3x: CH3CHO

(4) Lo¹i Aox: CH3CHCH3

NO2 Hình 6.4.7. Các dạng phổ bậc 1

Các loại phổ trên là loại phổ đơn giản nhất vì trong phổ chỉ có 2 loại nhóm proton. 2 nhóm này có thể có số proton tương đương nhau (proton có độ chuyển dịch hoá học giống nhau) như hình 6.4.5a: A = 1, x = 1 nên độ bội (số đỉnh) trong các nhóm là bằng nhau cả về số lượng, cả về cường độ và cả về hằng số tương tác spin - spin. Số lượng và cường độ thì tính theo nguyên tắc Pascal, ví dụ ở hình 6.4.5a, vì nhóm nào cũng có 1H cả nên nhóm nào cũng có 2 đỉnh và chúng có cường độ bằng nhau, có J như nhau JAx - JxA và được tính bằng cách lấy hiệu sô của 2 tần số của 2 pic gần kề trong 1 nhóm. Chỉ còn một điều cần xác định, đó là độ chuyển dịch hoá học của mỗi nhóm, ở đây người ta căn cứ vào hằng số chắn, nghĩa là căn cứ vào mật độ electron, ví dụ như trong hợp chất CHCl2–CHBr2 thì H ở CHCl2 có δ lớn hơn δ của CHBr2 vì Cl2 có –I mạnh hơn Br2 nên mật độ electron ở đây ít hơn, hằng số chắn nhỏ hơn. 117

Ở các trường hợp b, c, d thì đơn giản, chỉ cần căn cứ vào độ bội là xác định được ngay. Ví dụ phổ b có nhóm bên phải là dublet, nhóm bên trái là triplet thì người ta nói ngay rằng nhóm bên phải có 2H và nhóm bên trái có 1H, và nếu phổ có integral thì thấy ngay rằng nhóm bên phải có đường tích phân cao gấp 2 nhóm bên trái. Cũng giải thích tương tự như vậy đối với phổ c và d. (5) Loại AMX, ví dụ phổ phần vinyl của vinylaxetat:

Hình 6.4.8. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân vinyl trong vinylaxetat

(6) Loại AnMmXy, ví dụ phổ của 1-nitropropan:

Hình 6.4.9. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của 1-nitropropan

Cả 2 loại phổ trên đều có 3 nhóm pic, nghĩa là chúng có 3 loại proton không tương đương nhau. Phổ ở hình 6.4.6 có 3 nhóm nhưng độ bội của nhóm I và nhóm II bằng nhau (2) và có J nhỏ (khoảng cách giữa 2 đỉnh hẹp), còn ở nhóm III có số đỉnh cao và lớn. Chính nhờ đặc điểm này giúp chúng ta xác định được nhóm phổ thuộc dạng tương tác spin 118

spin nào: Nhóm I thuộc proton A và nhóm II thuộc proton M vì 2 proton này có J nhỏ nên chúng phải gần nhau, vì chúng gần tương đương nhau nên tương tác với nhau theo kiểu geminal và cho dạng doublet doublet. Ở đây nhóm I phải thuộc về HA vì ở vị trí cạnh với nhóm axyl (nhóm có hiệu ứng –I và –C, làm cho mật độ electron của nó giảm đi chút ít so với HM nên HM thuộc nhóm pic II. Nhóm III thuộc HX vì nó có 4 đỉnh. M có J gần bằng nhau nên có thể suy ra 2 proton tương tác lên nó gần tương đương như thế chỉ có HA và HM, cũng lý luận theo mật độ electron để xác định 2 đỉnh bên phải là của HA còn 2 đỉnh bên trái là HM. Phổ ở hình 6.4.9 chỉ cần nhìn độ bội, hiệu ứng mái và integral thì người ta cũng biết ngay được nhóm bên phải là của CH3, nhóm bên trái là của CH2 và nhóm giữa thuộc CH2-β. 6.4.4.2. Phân tích phổ bậc cao đơn giản dạng AB và ABX ∆ν Phổ bậc cao là phổ có < 6 nên không thể xác định các thông số J δ và J trực tiếp trên phổ được mà phải tính toán phức tạp. Ví dụ phổ của phần nhân thơm của 3-brom-tert-butoxythiophen thuộc loại phổ AB được chỉ ra trên hình 6.4.10.

Hình 6.4.10. Phổ cộng hưởng từ cproton của 3-brom-tert-butoxythiophen

Ở đây:

J AB = (ν1 − ν 2 ) = (ν3 − ν o ) δAB = ν A − ν B = (ν1 − ν 4 )(ν 2 − ν 4 ) ν AB =

1 2

(ν A + ν B ) =

1 2

(ν 2 + ν 3 )

119

1 ν A = ν AB + δAB (Hz) 2 1 ν B = ν AB − δAB (Hz) 2 ν δA = A (ppm) νo δB =

νB νo

(ppm)

6.4.5. Phổ cộng hưởng từ 13C và các phương pháp kỹ thuật phổ Cho đến nay, tất cả các hợp chất hữu cơ đều xây dựng trên nguyên tử cacbon thiên nhiên, mà trong thiên nhiên có 2 loại nguyên tử cacbon luôn luôn bên cạnh nhau là 12C và 13C. Nguyên tử 12C không có từ tính nhưng nguyên tử 13C thì có từ tính rất bé, chỉ chiếm 1,1% nên với máy thông thường không ghi được phổ của nó mà phải dùng đến máy cộng hưởng từ biến đổi Fourier (FT). Phổ 13C-NMR phức tạp hơn 1H-NMR nhiều vì trong 13C-NMR có cả cộng hưởng từ cacbon-13 với cacbon-13 và cộng hưởng từ cacbon-13 với proton nên người ta ghi phổ 13C-NMR với 2 cách, cách có tương tác 1H và cách không có tương tác 1H. 6.4.5.1. Phổ 13C tương tác 1H Vì 13C và 1H đều có I = ½ nên quy tắc đa vạch của 13C giống quy tắc đa vạch của 1H trong phổ của nó. C không có H cho pic đơn singlet; CH - có 1H cho pic đôi duplet; CH2 - có 2H cho pic 3 triplet;

CH3 - có 3H cho pic 4 quartet. Hằng số J (13C–H) phụ thuộc vào hàm lượng s trong obitan lai hoá, đi từ lai hoá sp3 đến lai hoá sản phẩm thì sản phẩm có hàm lượng s tăng nên hằng số tương tác spin tăng. J của C–H của cacbon lai hoá sp3 có JC–H = 125 Hz; J của C–H của cacbon lai hoá sp2 có JC–H = 160 Hz; J của C–H của cacbon lai hoá sp có JC–H = 250 Hz. 120

Khi C nối với nhóm thế có hiệu ứng làm giàu electron thì hằng số JC–H càng tăng. Tương tác C với các hiđro ở xa nó 1, 2 cacbon thì rất nhỏ, không thấy. Tương tác giữa cacbon-13 cạnh nhau cũng rất nhỏ nên không giúp ích gì cho chứng minh cấu tạo. 6.4.5.2. Phổ 13C xoá tương tác 1H Phổ 13C có tương tác 1H cho rất nhiều nhóm đỉnh, nhiều vạch, chúng lại có cường độ nhỏ lẫn cả vào vạch nhiễu của máy nên không phân tích được. Để khắc phục người ta ghi phổ xoá bỏ tương tác proton và khi đó mỗi nguyên tử cacbon chỉ cho một vạch phổ nên phổ đơn giản đi rất nhiều, so sánh phổ (a) và (b) trong hình 6.4.11.

Hình 6.4.11. Phổ 13C-NMR có tương tác C–H (a) và xoá tương tác C–H (b) của 1-etinyl-3-trimetylsilanetinyl benzen

Để thực hiện ghi phổ 13C xoá 1H người ta dùng 2 kỹ thuật: APT và DEPT. Kỹ thuật APT cho các tín hiệu của nhóm CH2 và C quay lên trên, còn các nhóm CH3 và CH thì quay xuống dưới. Kỹ thuật DEPT chó các tín hiệu CH3 và CH quay lên trên còn CH2 quay xuống dưới. Ngày nay kỹ thuật DEPT dùng phổ biến nhất và thường ghi phổ thành 3 loại: (1) Phổ DEPT 90 ghi các vạch phổ của các nguyên tử cacbon bậc 1 và bậc 3 (CH3 và CH) ở phía trên phổ và quay đầu lên trên;

Hình 6.4.12. Phổ APT của 13C

121

(2) Phổ DEPT 150 ghi các vạch phổ của các nguyên tử cacbon bậc 2 (CH2) ở phía dưới phổ và quay đầu xuống còn CH3 và CH quay đầu lên trên; (3) Phổ CPD ghi tất cả các vạch của tất cả cacbon trong phân tử và tất cả các pic đều ở phía trên phổ, quay đầu lên trên.

6.4.5.3. Cương độ pic Cần chú ý rằng cường độ vạch phổ trong phổ 13C phụ thuộc vào số nguyên tử hiđro liên kết với nó và số nguyên tử cacbon tương đương. 2

C(CH3)3

4 3 2

2 1

3 3x CH3

4 1

1 C a)

Hình 6.4.13. Cường độ pic của một số chất

Ở hình (a) có 1 vạch cao hẳn lên vì đó là 3 CH3 tương đương nên chồng lên nhau, còn vạch kia thấp (1 cacbon). Ở hình (b) có 6 cacbon nhưng cho 4 vạch, trong đó có 2 vạch thấp là 1 cacbon còn 2 vạch cao, mỗi vạch 2 cacbon tương đương chập vào nhau (vạch bên phải là cacbon 3 và 3, vạch bên trái là cacbon 2 và 2, nó ở bên trái vì do tác động của nhóm R), hình (c) cũng tương tự như vậy. 6.4.5.4. Độ chuyển dịch hoá học Độ chuyển dịch hoá học 13C nằm trong vùng rộng từ 0 – 200 ppm. Chất chuẩn thường dùng là TMS, dung môi là CDCl3, C6D6, (CD3)2SO, CD3OD… Độ chuyển dịch hoá học của 13C phụ thuộc vào mức độ lai hoá của nó và vào độ âm điện của nhóm liên kết với nó. Ví dụ: CH3I CH3Br CH3Cl CH3F

– 33 9 24 76 ppm Từ I đến F độ âm điện tăng, hiệu ứng –I tăng nên δ tăng. 122

Ngày nay người ta lập các bảng thực nghiệm để tính δ . (1) Với các 13C có lai hoá sp3 thì δ của nó tính theo công thức: δ = −2,3 + ∑ Si

Si là các nhóm thế ở vị trí i mà số gia của nó được cho trong bảng sau: α

–H

–C

9,1

9,4

–2,5

0,3

–C=C<

21,5

6,9

–2,1

0,4

–C≡C–

4,4

5,6

–3,4

–0,6

–C6H5

22,1

9,3

–2,6

0,3

–C=C=C<

14,4

5,0

–5,5

–CH=O

29,9

–0,6

–2,7

–CO–

22,5

3,0

–3,0

–COOH

20,1

2,0

–2,8

–COO

24,5

3,5

–2,5

–COOR

22,6

2,0

–2,8

–O–CO

54,5

6,5

–6,0

–O–

49,0

10,1

–6,2

0,1

Nhóm thế

Ví dụ: 1 CH 3 − 2 CH 2 −3 CH 2 − 4 CH 2 −5 CH3 C1 có: 1Cα, 1Cβ, 1Cγ và 1Cδ nên: δ = –2,3 + 9,1 + 9,4 – 2,5 + 0,3 = 14 ppm C2 có: 2Cα, 1Cβ và 1Cγ nên: δ = –2,3 + 2.9,1 + 9,4 – 2,5 = 22,8 ppm C3 có: 2Cα và 2Cβ nên: δ = –2,3 + 2.9,1 +2. 9,4 = 34,3 ppm C5 giống với C1; C4 giống với C2. (2) Với các 13C có lai hoá sp2 trong các olefin thì δ tính theo công thức: 123

... γ ... β ... α

απ ... β π ... γπ ...

δ = 123,3 + ∑ Si + ∑ Sπi + hiệu chỉnh

Si, Sπi là các nhóm thế mà số gia đã cho trong bảng sau: γ

Nhóm thế

απ

βπ

γπ

–1,5

7,2

10,6

–C<

–7,9

–1,8

1,5

6,0

25,7

–OH

–43,3

–1,0

2,0

29,0

–OR

–39,0

–1,0

18,0

–O–CO–CH3

–27,0

15,0

–CO–CH3

6,0

13,0

–CHO

13,0

4,0

–COOH

9,0

6,0

–COOR

7,0

13,6

–C–C<

–7,0

12,5

C6H5

–11,6

3,5

0,2

Hiệu chỉnh α … απ

(trans)

R C

C R

α … απ

(cis)

–1,1

α…α

(geminal)

–4,8

R C

α … απ

(vicinal)

2,5

R C

C R

β…β

2,3

Ví dụ: H H

O CH2

CH3 CH3

C1 có απ là –O–, απ là CH2, βπ là 2CH3 và vicinal ở C2 nên: 124

δC1 = 123,3 – 39.0 – 7.9 – 21.8 + 2.5 = 75,1 ppm

C1 có απ là –O–, π là O2, β là 2CH3 và geminal nên: δC2 = 123,3 + 29.0 + 10.6 + 7.2 – 4,8 = 172,5 ppm (3) Với 13C có lai hoá sp trong các hợp chất kiểu X1–C≡ thì δ tính theo công thức: δ = 41, 2 + ∑ X1 + ∑ X 2

Trong đó X1 và X2 là các nhóm thế mà số gia đã cho trong bảng sau: X1

–18,9

49,4 CH2=CH

CH3

–11,2

45,0 HC≡C

C2H5

–5,5

45,3 C(CH3)2OH

C4H9

–5,9 1,6

Nhóm thế

t-C4H9

Nhóm thế

–9,0

56,1

–22,2

42,2

–1,5

49,6

46,1 CH3CO

8,1

56,1

43,8 OC2H5

–2,8

–2,9

–10,0

58,7

C6H5

–6,9

55,4 COC6H5

p-CH3OC6H4

–7,0

54,3 (CH3)2COH

–1,6

47,7

p-CH3C6H4

–7,1

54,9 CH2OH

–7,6

51,5

p-ClC6H4

–8,3

56,4

Ví dụ: 2

C1 có X1 là H, X2 là C6H5 nên: δC1 = 41,2 –18,9 + 55,6 = 77,7 ppm C2 có X1 là C6H5, X2 là H nên: δC2 = 41,2 –6,9 + 94,4 = 83,7 ppm (4) Với 13C của các hợp chất thơm thì δ tính theo công thức: δ = 128,5 + Si Trong đó Si là các nhóm thế mà số gia đã cho trong bảng sau:

125

Nhóm thế

C-1

ortho

meta

para

–OCH3

31,4

–14,4

1,0

–7,7

–OC6H5

29,0

–9,9

2,0

–5,0

–O–

39,6

–8,2

1,9

–13,6

–O–CO–CH3

23,0

–6,0

1,0

–2,0

–NH2

18,0

–13,3

0,9

–9,8

–NHCH3

21,7

–16,2

0,7

–1,8

–N(CH3)2

23,0

–16,0

1,0

–12,0

–N(C2H5)2

20,0

–15,0

1,0

–12,0

–N(C6H5)2

19,0

–4,0

1,0

–6,0

–NH–CO–CH3

11,0

–10,0

–6,0

VÝ dô:

3 4

2 1

CH3

C1 có OCOCH3 nên: δC1 = 128,5 + 23 + 1,7 = 152,2 ppm C2 có OCOCH3 ở ortho, Br ở ortho nên: δC2 = 128,5 – 6,0 + 3,4 = 125,9 ppm C3 có trực tiếp Br, OCOCH3 ở meta nên: δC3 = 128,5 – 5,5 + 1,0 = 124,0 ppm C4 có Br ở ortho, OCOCH3 ở para nên: δC4 = 128,5 + 3,4 – 2,0 = 129,9 ppm C5 có OCOCH3 ở ortho, Br ở para nên: δC5 = 128,5 – 6,0 – 1,7 = 120,8 ppm

6.4.6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2D) Người ta tác dụng vuông góc một xung vào hệ spin rồi dựa vào kỹ thuật biến đổi Fourier để lập ra mối quan hệ giữa δ và J rồi biểu diễn chúng trên 2 trục vuông góc nhau gọi là phổ cộng hưởng từ hạt nhân 127

2 chiều (2D). Trước kia quan hệ giữa δ và J được biểu diễn trên cùng 1 trục nên gọi là phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1D). Có nhiều kỹ thuật thực hiện phổ NMR-2D, ví dụ phổ 1H-1H-COSY, 1H-13C-COSY, 2D-NOESY, 2D-HMBC, 2D-NMQC, … 6.4.6.1. Phổ 1H-1H-COSY Trong phổ này người ta biểu diễn mối liên quan giữa độ chuyển dịch hoá học của một loại hạt nhân trong cùng 1 phân tử, ở đây hạt nhân đó là proton, vì thế người ta đạt trên 2 trục vuông góc đều là phổ proton cả. Ví dụ phổ 1H-1H-COSY của 2-butanol được chỉ ra trên hình 6.4.14.

Hình 6.4.14. Phổ 1H-1H-COSY của 2-butanol

Ở đây ta nhận thấy trên đường chéo của hình vuông có các tín hiệu và có nhiều tín hiệu không ở trên đường chéo. Nếu lấy tâm của một tín hiệu nào đó không nằm trên đường chéo mà vẽ một tam giác vuông xuống 2 điểm là 2 tín hiệu trên đường chéo, từ 2 điểm trên đường chéo này vẽ đường song song với 2 trục đến phổ ta tìm ngay được các nhóm proton tương tác với nhau mà đỉnh của tam giác vuông là điểm thể hiện n , tín hiệu AB là thể sự tương tác đó. Ví dụ trong tam giác vuông A(AB)B hiện sự tương tác của nhóm A và nhóm B. Tương tự như vậy chúng ta tìm thấy sự tương tác giữa các nhóm AC, AD, CD, DB. Vì thế, nhờ vào phổ 1H-1H-COSY người ta lập được khung cacbon của phân tử. 128

6.4.6.2. Phổ 1H-13C-COSY Phổ này thể hiện mối liên hệ giữa độ chuyển dịch hoá học của 2 loại hạt nhân khác nhau. Ở đây người ta biểu diễn một trục là 1H, còn trục kia là phổ 13C của cùng một chất. Ví dụ phổ 1H-13C-COSY của 2-butanol được chỉ ra trên hình 6.4.15.

Hình 6.4.15. Phổ 1H-13C-COSY của 2-butanol

Trên phổ 1H-13C-COSY các tín hiệu nằm trên phổ thể hiện mối quan hệ giữa C và H. Vì thế từ một tín hiệu nào đó mà ta chiếu xuống 2 phổ 13 C và 1H thì tìm ngay được nguyên tử cacbon và các nguyên tử hiđro liên kết với nó. Hay nói cách khác, tìm được nhóm liên kết C–H, nghĩa là tìm được nguyên tử hiđro liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon, xác định được nguyên tử hiđro thuộc nguyên tử cacbon nào. Ví dụ từ tín hiệu 3 mà chiếu xuống phổ 1H ta thấy ngay các proton của B thuộc C3, cũng làm như vậy với các điểm 1, 2, 4 chúng ta tìm được các proton thuộc C1, C2 và C4. 6.4.6.3. Phổ 2D-NOESY Cũng như phổ 1H-1H-COSY, phổ 2D-NOESY thể hiện sự tương tác của các proton, nhưng chỉ xét các proton trên các cacbon xa nhau nhưng

129

khoảng cách giữa chúng nhỏ hơn 4Å. Vì là phổ xét tương tác proton cả nên người ta đặt 2 phổ proton ở 2 trục vuông góc nhau. Ví dụ phổ 2DNOESY của axit pamoic.

Hình 6.4.16. Phổ 2D-NOESY của axit pamoic

Ở đây trên các phổ proton, các proton đã được xác định: Ha, Hb, Hc, Hd và He. Các tín hiệu trên đường chéo của phổ cũng như các tín hiệu ngoài đường chéo của phổ là thể hiện mối quan hệ giữa các proton trong phân tử. Lấy 2 tín hiệu bất kỳ trên đường chéo sao cho chúng làm thành một hình vuông với 2 tín hiệu nữa ở 2 phía ngoài đường chéo mà chính 2 tín hiệu này làm nên đường chéo của hình vuông đó. Rồi từ 2 tín hiệu này chiếu xuống 2 phổ chúng ta tìm ngay được proton nào tương tác với 130

proton nào. Ví dụ, chọn 2 tín hiệu a và c. Ở bên phải và bên trái đường chéo ac có 2 tín hiệu a’ và e’ tương ứng làm nên hình vuông aa’ee’ mà ac là đường chéo. Từ e ta chiếu xuống phổ 1H ở trên ta thấy ngay được Ha. Vậy Ha và He có tương tác với nhau. Trên phân tử Ha và He cách nhau 1 cacbon. Cũng tương tự như vậy, người ta tìm được Hb và He có tương tác với nhau, 2 proton này ở cạnh nhau. Như vậy, phổ 2D-NOESSY cũng như phổ 1H-1H-COSY phát hiện được sự tương tác của proton gần nhau và cả proton xa nhau. Tuy nhiên, tín hiệu của nó tương tác proton-proton có thể xuất hiện ở phổ NOESY mà không xuất hiện ở phổ COSY nên việc dùng phổ NOESY là cần thiết. 6.4.6.4. Phổ HMQC Thể hiện sự tương tác của cacbon với các nguyên tử hiđro liên kết trực tiếp với nó vì thế người ta đặt 2 phổ 13C và 1H trên 2 trục vuông góc với nhau. 6.4.6.5. Phổ HMBC Thể hiện sự tương tác của cacbon với các proton của cacbon bên cạnh nó. 6.4.6.6. Phổ COSY QP Thể hiện sự tương tác của các proton của 2 cacbon cách xa nhau, có thể cách 2 hay 3 cacbon. Tóm lại, phổ NMR 2D cho chúng ta biết được chắc chắn mối quan hệ giữa các proton ở gần nhau và xa nhau, nguyên tử hiđro liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon. Vì thế nó giúp ích đắc lực trong việc xác định cấu hình của phân tử hay sự phân bố proton trong không gian của phân tử. 6.5. Ví dụ về xác định cấu trúc phân tử tecpenoit bằng phương pháp phổ

Trong phần trước chúng ta đã đề cập đến điều chế tinh dầu củ gừng gió (Zingiber gerumbet) vùng Tam Đảo bằng cất cuốn hơi nước và phân tích thành phần của nó, làm lạnh tinh dầu này ở –10oC trong 1 ngày nó sẽ kết tinh thành tinh thể và tinh chế bằng sắc ký cột hay kết tinh lại chúng ta thu được chất tinh khiết Z-Z có điểm nóng chảy 67oC. Để xác định cấu trúc phân tử Z-Z, người ta ghi các phổ IR, UV, MS, 1 H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HMQC, COSY của nó. Với tư liệu phổ này chúng ta có nhiều con đường xác định cấu trúc phân tử Z-Z.

131

6.5.1. Đi từ điểm chảy Tra từ điển các hợp chất thiên nhiên theo mục điểm nóng chảy chúng ta có được tên chất, công thức phân tử và các tài liệu có liên quan, trong đó có các phổ. So sánh phổ Z-Z và phổ theo tài liệu mà có sự trùng lặp trên 90% thì có thể coi là nhận dạng được Z-Z. Trường hợp này đúng khi Z-Z là một chất cũ, còn khi Z-Z là một chất mới thì phương pháp này không có ý nghĩa.

6.5.2. Đi từ nguồn gốc của chất Vì Z-Z lấy là từ tinh dầu gừng gió nên khi làm tổng quan về gừng gió theo tên khoa học của nó, chúng ta có được tất cả các chất mà người ta đã phân lập được từ củ gừng gió cùng với các đặc tính vật lý và số liệu quang phổ của nó. Lúc này chỉ cần so sanh số liệu thu được và số liệu có trong tài liệu là nhận ra được Z-Z. Phương pháp này cũng chỉ áp dụng khi Z-Z là chất cũ.

6.5.3. Đi từ khối phổ Các máy quang phổ hiện đại thường có kèm theo thư viện phổ mẫu của hàng vạn chất nên sau khi ghi khối phổ Z-Z chúng ta chỉ so sánh khối phổ này với các khối phổ có trong thư việc máy, nếu có sự trùng lặp trên 90% thì coi là phân tử Z-Z đã được nhận dạng.

6.5.4. Phương pháp tổng quát Phương pháp này không quan tâm đến nguồn gốc hay hằng số vật lý của hợp chất mà chỉ quan tâm đến các đặc điểm phổ của nó để xác định cấu trúc phân tử. Các bước chủ yếu của phương pháp này như sau: 1. Xác định công thức phân tử a) Căn cứ phổ IR để biết thành phần của hợp chất: C, H, O, N, S, …; các nhóm chức: OH, >CO, C=C, C–O–C, SH, >C=S, …; các loại nhân thơm, các loại amin. b) Căn cứ vào 1H-NMR để biết các proton nhóm metyl, proton olefin, proton thơm và có thể biết tổng số proton trong phân tử.

c) 13C-NMR cho biết chính xác số nguyên tử cacbon trong phân tử và có thể nhận ra được số cacbon của nhóm cacbonyl, cacbon của nhân thơm, cacbon của anken, cacbon của cacbinol và cacbon của ankan. 132

d) Phổ DEPT cho biết chính xác số nhóm metyl, metylen, metin, tổng số cacbon và hiđro liên kết với nhau và cacbon không có hiđro. e) Khối phổ cho biết phân tử lượng của phân tử và quy luật phân mảnh qua trọng lượng các mảnh bị phân rã. Từ 5 số liệu phổ trên tìm được công thức phân tử một cách chắc chắn. 2. Xác định chỉ số không no và hàm lượng cacbon trong phân tử Chỉ số không no U là tổng số liên kết đôi và số vòng trong phân tử: 2n + 2 − x + m U= 2 n: số cacbon trong phân tử; x: số nguyên tử hiđro trong phân tử; m: số nguyên tử có hoá trị 3 trong phân tử. Hàm lượng cacbon trong phân tử: 12n.100 %C = M

n: số nguyên tử cacbon trong phân tử; M: trọng lượng phân tử. Từ U và C sơ bộ dự đoán loại hợp chất: – Nếu C và U đều nhỏ có thể là hợp chất không vòng hay hợp chất no; – Nếu C và U đều lớn có thể là hợp chất không no, đa vòng, thơm, do đó cần ghi thêm UV để suy ra khung cacbon cơ sở. 3. Dùng phổ HMQC, HMBC để kiểm tra lại hiđro thuộc cacbon nào và cạnh cacbon nào trong phân tử đã được xây dựng. 4. Dùng phổ COSY, NOESY để khẳng định sự phân bố không gian của các nhóm trong phân tử.

Ví dụ: Xác định công thức cấu tạo phân tử Z-Z theo các số liệu phổ đã cho từ trang 136 đến 146. - Phổ IR của Z-Z (tr. 136 cho thấy nhóm cacbonyl α, β không no, νC=O = 1712 cm–1, liên kết đôi νC=C = 1655 cm–1, liên kết đôi 2 nhóm thế trans δC–H = 815 cm–1. 133

- Phổ 1H-NMR (tr. 142 và 143) cho thấy có cặp proton dạng pic AB của olefin 2 nhóm thế dạng trans δH = 5,9 ppm 1H, d, J = 16,4 HZ và δH = 5,06 ppm 1H, d, J = 16,4 Hz; 2 nhóm metyl liên kết với cacbon bậc 3 dạng pic đơn: δH = 1,13 ppm, s, 3H và δH = 1,54 ppm, s, 3H; nhóm gem-đimetyl dạng 2 pic đơn δH = 1,3 ppm; s, 3H và δH = 1,07 ppm, s, 3H. - Phổ 13C-NMR (tr. 143) cho thấy phân tử Z-Z có 15 nguyên tử cacbon, trong đó có một nhóm >C=O, δC = 204,28 ppm, 6 cacbon vùng olefin từ 160,68 ÷ 124,95 ppm và 8 cacbon ankan từ 42,37 ÷ 11,72 ppm. - Phổ DEPT của Z-Z (tr. 143) cho thấy có 4 nhóm metin, 3 nhóm metylen và 4 nhóm metyl. Như vậy, số cacbon và hiđro liên kết với nhau trong phân tử là C11H22 và 4 cacbon không liên kết với hiđro. - Phổ EI-MS của Z-Z (tr. 138) cho pic ion phân tử lượng là 218 đ.v. Từ các số liệu trên chúng ta tìm được công thức phân tử Z-Z là C15H22O, chỉ số không no của Z-Z là 5. Hàm lượng cacbon nhỏ, kết hợp với con số 15 nguyên tử cacbon trong phân tử và số nhóm metyl lớn (4 nhóm) cho phép chúng ta nghĩ đến Z-Z là hợp chất sesquitecpen, nghĩa là có 3 đơn vị isopren I, II, III trong phân tử Z-Z và như thế phải có 9 metyl nhưng ở đây chỉ có 4 nhóm, như vậy phải có 5 nhóm metyl đã tham gia liên kết theo nguyên tắc đầu đuôi và vì có nhóm gem-đimetyl nên liên kết phải là: đầu I – đuôi III; đuôi I – đầu II; đuôi II – đầu III (hình 1) và vòng hình thành là vòng unđecan (vòng 11). Chỉ số không no là 5, có 1 vòng vậy còn 4 liên kết đôi. Đã có 1 liên kết đôi của nhóm cacbonyl vậy còn 3 liên kết đôi trong vòng. Vì có nhóm cacbonyl α,β-không no, vì cả 2 nhóm metyl đều có dạng pic đơn nên ba liên kết đôi chỉ có thể ở các vị trí 2-3, 6-7 và 10-11, nhóm cacbonyl ở vị trí 1 và công thức cấu tạo của Z-Z như hình 2. Sự phân bố các liên kết trong phân tử được kiểm tra lại nhờ phổ HMQC, HMBC, COSY và NOESY (tr. 144 – 146). Chú ý: liên kết đôi cũng có thể ở vị trí 5-6 và như thế chúng ta có thêm đồng phân mới. Để nhận biết hợp chất Z-Z thuộc đồng phân nào chúng ta so sánh số liệu phổ 1 H và 13C ghi được với số liệu phổ lý thuyết của 2 đồng phân, đồng phân nào có phổ lý thuyết gần với phổ Z-Z thì đó là công thức cấu tạo của Z-Z và kiểm tra lại một lần nữa bằng phổ 2D.

134

O 1 4 1

III

I 15

10 9

3 4 5

7 6

(1)

(2) Zerumbon

Số liệu phổ H và C-NMR được chỉ ra trên bảng 6.5.1. Bảng 6.5.1. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của Z-Z 1

NMR

TT C

δC (ppm)

204,28

137,25

H-NMR

δH (ppm)

Số H

148,25

5,24

29,37

2,14

39,40

2,34

12,55

136,22

124,95

6,02; 6,0

12,45

42,35

1,89

12,77

42,37

120,10

5,97

16,4

160,68

5,86

16,6

24,45

1,54

24,36

1,55

15,16

1,67

11,72

1,97

Dạng

J (Hz)

6,04

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

Phần thứ ba

Hương liệu (chất thơm) Chương 7 KIẾN THỨC CƠ SỞ VỀ CHẤT THƠM 7.1. Khái niệm về mùi và chất thơm

Mùi (odour) là một cảm giác tâm sinh lý, nó được tạo nên do tác dụng sinh hoá của một tác nhân lên cơ quan khứu giác, tác nhân tạo nên mùi gọi là chất thơm. Chất thơm bay hơi được, hay khuếch tán được vào không khí, có thể là đơn chất hay hỗn hợp các hợp chất, có thể là chất rắn, chất lỏng hay chất khí. Cơ quan cảm nhận mùi (receptor của khứu giác) cảm nhận mùi của chất thơm lan truyền hay khuếch tán trong không khí khi bị hít vào cơ quan cảm nhận mùi. Mùi phụ thuộc vào thành phần hoá học (ví dụ: H2S thối, CH3COOH chua), phụ thuộc vào cấu tạo hoá học của phân tử chất thơm (ancol isoamylic mùi xốc, ancol … mùi hắc), phụ thuộc vào đối tượng cảm nhận mùi như loài, giống, tuổi và cả tình trạng sức khoẻ lúc cảm nhận mùi, mùi còn phụ thuộc vào thói quen và tập quán đối tượng sử dụng mùi. Tuỳ theo lĩnh vực sử dụng mùi mà nó có tên riêng và phương thức điều chế riêng. Theo tiếng Anh, mùi dùng trong nước hoa, mỹ phẩm có tên là perfume, dùng trong thực phẩm là flavour, còn trong sản xuất công nghiệp là fragrance industry, mùi là tín hiệu thông tin đối với côn trùng gọi là pheromone, các chất thơm có mùi trong thực vật gọi là tinh dầu (essential oils)…

147

7.2. Cơ chế cảm nhận mùi 7.2.1. Giải phẫu cơ quan khứu giác

Hình 7.1. Mặt cắt của đầu người cho thấy vị trí của cấu trúc cơ bản trong vùng khứu giác và miệng (Amoore và cộng sự, 1964)

7.2.1.1. Lỗ mũi Giải phẫu mũi cho thấy lỗ mũi thông từ bên ngoài đến phổi, thiết diện lỗ mũi ở khoang mũi rất khác nhau từ loài này sang loài khác, giống này sang giống khác của các loài động vật có vú. Phía trên lỗ mũi có xương sụn mềm, co giãn được khi thở và theo nhịp thở, sự thay đổi này của xương lá mía làm cho thiết diện của lỗ mũi thay đổi 2 đến 3 mm theo chiều rộng, do đó thay đổi lưu lượng không khí đi qua mũi. Cơ chế hoạt động co giãn này của 2 lỗ mũi giống như hoạt động của cái van và được Gilbert khảo sát và biểu thị theo sơ đồ ở hình 7.2.

Hình 7.2. Mô tả chu kỳ mũi lý tưởng: luồng không khí qua cả 2 lỗ mũi phải và trái rất nhịp nhàng và cùng một chiều dài chu kỳ nhưng 2 lỗ mũi ngược nhau 180o

148

Gilbert cũng khẳng định rằng các lỗ mũi luôn luôn hỗ trợ cho nhau. Khi lỗ mũi này bị tồn thương không hoạt động được thì lỗ mũi kia hoạt động với tần suất cao hơn và biên độ lớn hơn. 7.2.1.2. Ô khứu giác Chỗ phồng lên trong lỗ mũi là vòm mũi, nơi đây tập trung các ô khứu giác (receotor cell). Ô khứu giác là một bán nguyệt cầu, chứa đầy chất nhờn, được tạo bởi mô biểu bì. Trong ô khứu giác có chứa nhiều lông tơ khứu giác rất mảnh, được cấu tạo bằng các nơron thần kinh, các lông tơ khứu giác này xuyên qua mô biểu bì và nối với dây thần kinh truyền dẫn. Trên lông tơ khứu giác còn có các protein đặc hiệu chuyên dùng, calmoclulin liên kết và các photpho protein (P50 GAP50)… Số ô khứu giác và số lông tơ trong mỗi ô, cấu tạo và thành phần chất nhờn trong ô khứu giác của các loài, giống, giới khác nhau thì khác nhau nên khả năng cảm nhận mùi của chúng khác nhau. 7.2.1.3. Thành phần chất nhờn Chất nhờn trong ô khứu giác là một hỗn hợp lipit, photpho lipit. Ngày nay người ta phát hiện thấy có một số protein đặc hiệu. Thành phần hoá học và cấu trúc phân tử các chất nhờn cũng thay đổi theo loài, giống, tuổi… 7.2.1.4. Cơ chế cảm nhận mùi Các phân tử chất thơm (ligand mùi) theo luồng không khí hít vào mũi, đập vào các ô khứu giác trong vòm mũi, tan hay khuếch tán vào chất nhờn trong ô khứu giác, tiếp xúc với các loại nơron trên bề mặt các lông tơ lơ lửng trong chất nhờn ở ô khứu giác, tác động kích thích, chèn ép lên các loại nơron tạo ra các tín hiệu mùi đặc trưng riêng của mỗi ligand mùi. Các tín hiệu này được nơron truyền vào lông tơ, truyền vào dây thần kinh truyền dẫn, dây thần kinh truyền dẫn tín hiệu về thần kinh trung ương. Ở đó tín hiệu mùi được phân tích và so sánh với các tín hiệu có trong kho lưu trữ của bộ nhớ, nếu tín hiệu giống tín hiệu có trong bộ nhớ thì mùi đó là mùi cũ và nếu khác thì đó là mùi mới và ghi nhớ chúng. Như thế, để có tín hiệu mùi, các ligand mùi phải chuyển từ pha khí của không khí hít vào mũi rồi chuyển vào pha lỏng là chất nhờn trong ô khứu giác để có điều kiện tác động, kích thích các nơron tạo nên tín hiệu mùi. Sự chuyển pha này phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhưng quan trọng nhất là thành phần, cấu trúc phân tử và nồng độ của ligand mùi, tính thấm nước và kỵ nước cũng như độ phân cực của phân tử ligand mùi.

149

Thành phần hoá học của chất nhờn trong ô khứu giác này cho thấy chúng là môi trường ít phân cực, kỵ nước. Vì vậy, các chất có độ phân cực lớn không lan được vào đó, như nước thì không thể gây mùi được nên nó là chất không mùi. Ngược lại, các chất có tính kỵ nước lớn như ankan, metan, etan… cũng không thể lan vào đó để gây mùi nên các chất này cũng không mùi. Các chất có độ phân cực trung bình như các este, xeton,… tan tốt trong chất nhờn nên cho mùi tốt. Vậy bản chất tín hiệu mùi là gì? Đó có thể là một tác động cơ học thuần tuý, do ligand mùi lan vào dịch nhờn, làm cho tính chất vật lý của dịch nhờn thay đổi nên có những tác động cơ học lên lông tơ khứu giác khác nhau cho tín hiệu mùi. Đó có thể là một điện thế, các ligand mùi phân cực khi tan vào chất nhờn tạo nên một điện thế khác điện thế lúc đầu của dung dịch nên dung dịch tác động lên các lông tơ, luồng điện này để tạo ra tín hiệu có mùi. Đó cũng có thể là một sự đáp ứng lại của các thụ quan khi có mặt ligand mùi trong môi trường sống của mình. Đó cũng có thể là sự thay đổi tính chất của lông tơ khi có các ligand mùi hấp phụ lên bề mặt lông tơ. Một vấn đề đặt ra là liệu các phân tử chất mùi đi đâu khi vào ô khứu giác. Những luồng khí đi qua khoang mũi theo nhịp thở ra của phổi làm các ligand mùi chuyển từ pha lỏng sang pha khí rồi đi ra. Những nghiên cứu gần đây cho thấy trong dịch nhờn của ô khứu giác có các enzym oxynaza kiều P4450 và glucuranxyla, các enzym này một mặt oxi hoá chuyển ligand mùi kỵ nước thành ưa nước để đào thải hay phân huỷ nó. 7.3. Thụ quan hoá học (cảm thụ hoá học)

Nghiên cứu sự cảm nhận mùi là nghiên cứu mối liên hệ giữa thành phần, cấu trúc phân tử của ligand mùi và thành phần, cấu trúc phân tử của chất nhờn và cấu trúc phân tử của nơron thụ quan và sự tương tác lẫn nhau giữa chúng, trên cơ sở đó mà tạo ra các chất mùi mới, các hỗn hợp mùi mới phù hợp với nhu cầu thưởng thức của nhiều người. Việc nghiên cứu thụ quan hoá học (chemorecepter) hay cảm thụ hoá học (chemosenser) có độ nhạy cao, có tính phức tạp và đa dạng là các nghiên cứu đang được quan tâm. Các kiểu thụ quan hoá học đặc hiệu, nhận dạng cũng như đặc tính và cấu trúc của phân tử truyền dẫn chưa được đề cập đến trong chương này.

150

Chương 8 ĐÁNH GIÁ VỀ MÙI 8.1. Độc tính và độ an toàn mùi

Ngày nay, người tiêu dùng quan tâm đến sự độc hại và an toàn của hàng hoá sử dụng hơn bao giờ hết. Quả vậy, không hiếm người khi mua một lọ nước hoa, một hộp mỹ phẩm hay một lọ chất thơm cạo râu hay bất kỳ một chế phẩm nào đó trong hàm trăm sản phẩm chất thơm mà không có câu hỏi về sự an toàn của nó cho sức khoẻ khi sử dụng hay không? Điều này dễ hiểu vì không ít người bị dị ứng hay bị tấy da khi sử dụng các mỹ phẩm có chất thơm. Nguyên nhân là do các nhà sản xuất chỉ quan tâm đến lợi nhuận mà quên mất sự an toàn cho người tiêu dùng và uy tín của họ nữa. Chính vì thế, Hội Hương liệu Quốc tế (International Fragrance Association – IFRA) có trên 100 hội viên đại diện cho những nước đứng đầu về chất thơm, có cơ quan đóng ở Giơnevơ (Thuỵ Sỹ) đã truyền bá và công bố các số liệu khoa học về đặc tính và độ an toàn của chất thơm trên tạp chí “Chất độc trong thực phẩm và mỹ phẩm LFRA” và công bố các số liệu độc của hơn 1300 nguyên liệu chất thơm thường gặp và 7000 phép thử độ độc của chúng. Đối với mỗi nguyên liệu chất thơm cần có các số liệu sau đây: 1. Độc tính đối với đường miệng - giới hạn thử; 2. Độc tính đố với da, nếu mức độ độc đối với đường miệng được khẳng định; 3. Gây nhức nhối da; 4. Dễ bắt ánh sáng lên da; 5. Nguyên liệu có vấn đề nghi ngờ hay không? Kem theo các số liệu này là công thức cấu tạo hoá học và các số liệu để nhận biết cần thiết, qua đây chúng ta thấy tiêu chí hàng đầu của người tiêu dùng là độc tính, an toàn và chúng được đánh giá theo các yêu cầu sau: 1. Xác định có sự nguy hiểm - có gây tổn thương; 2. Đánh giá sự nguy hiểm - cái gì có thể khi tổn thương xảy ra; 151

3. So sánh với các nguy hiểm có liên quan; 4. Xác định độ an toàn - mức độ nguy hiểm nhỏ nhất có thể chấp nhận được. Một trong các chỉ số đo độ độc quan trọng nhất là LD50 (liều cần thiết để giết chết 50% quần thể thí nghiệm). Ví dụ, đường để 50% số chuột cống trong nhóm có trong lượng 300 g bị chết là 10 g, trong khi đó muối xianua chỉ có 0,002 g và như thế người ta nói xianua độc hơn đường (LD50 của đường là 10, LD50 của xianua đối với chuộc cống là 2.10–3). Như thế cương độ độc của một chất không chỉ được xác định bằng sự nguy hiểm, bằng các hiệu ứng mà còn bằng một lượng chất độ (xác định dose) gây ra các hiệu ứng đó. Nghiên cứu độc tính bao giờ cũng tiến hành với động vật trước, sau đó đến người tình nguyện và cuối cùng mới phổ biến ra đại chúng. Tuy vậy, những kết quả không phải bao giờ cũng đồng nhất giữa vật và người, giữa người này với người khác. Hơn nữa, chỉ số LD50 mới chỉ nói lên kết quả của thí nghiệm đương thời, vậy mùi sau khi sang thế hệ khác thì thế nào, vấn đề này hiện nay còn đang được nghiên cứu. 8.2. Sự quyến rũ và ưa chuộng

Như chúng ta đã biết trong chương 7, cảm nhận mùi không chỉ phụ thuộc vào bản chất của mùi mà còn phụ thuộc rất lớn vào cấu trúc và sự hoàn thiện của cơ quan khứu giác của người và động vật có vú. Sự quyến rũ và ưa chuộng của một mùi nhất định lại phụ thuộc vào khả năng cảm nhận của người và động vật có vú. Do đó, để khảo sát sự quyến rũ và ưa chuộng của ligand mùi nào đó, người ta phải tiến hành thử nghiệm với số đông và lấy con số thống kê. Phương pháp thống kê càng chính xác khi số người tham gia thử nghiệm càng đông, tối thiểu trên 50, và số lần thí nghiệm lớn (5 – 10 lần). Điều này mâu thuẫn với tài chính vì thế các công ty hương liệu lớn có một đội ngũ những người cảm quan mùi chuyên nghiệp (5 – 10 người). Sau khi thử nghiệm với các người chuyên nghiệp, người ta đưa thử nghiệm với số đông quần chúng. Nếu kết quả phù hợp thì mùi được chấp thuận là mùi tốt. Sự quyến rũ và ưa chuộng của mùi được thể hiện trong các chức năng của nó. 152

8.2.1. Mùi là dấu hiệu của sự có mặt Thú ăn thịt phát hiện sự có mặt của con mồi qua mùi của nó. Đối với một số động vật thì mùi của kẻ thù đánh dấu sự nguy hiểm, ví dụ như mùi của thú ăn thịt đối với con mồi.

8.2.2. Mùi là dấu hiệu của sinh lý Nhiều loài động vật như chó, mèo, trâu bò…, trong mùa sinh sản, ở con cái phát ra mùi đặc trưng làm kích thích sự hưng phấn của con đực, quyến rũ của con đực đối với con cái, và như thế về phương diện này thì mùi là phương tiện để bảo tồn và duy trì nòi giống. Ở mức độ nào đó, con người sử dụng nước hoa cũng tương tự như con vật sử dụng mùi. Vì thế có nước hoa cho đàn bà và nước hoa cho đàn ông. Nước hoa đàn bà thường có mùi êm dịu, hấp dẫn và gợi cảm, nước hoa đàn ông thường có mùi của các loại hạt, quả và có tính quý phái, cao sang.

8.2.3. Mùi là dấu hiệu của chất lượng Sản phẩm mùi của những nghệ nhân pha chế mùi giống như bức tranh của người hoạ sỹ tài hoa trong pha chế màu, phối màu hay giống như bản nhạc của người nhạc sỹ tinh tế trong phối âm của nốt nhạc cho tiếng đàn. Do đó sản phẩm mùi được nhiều người ưa chuộng và mếm mộ thường rất đắt, có sản phẩm đắt bằng mấy chục lần vàng theo khối lượng, ví dụ, các loại xạ, các loại musk. Do đó mùi cũng biểu thị sự giàu sang của người sử dụng.

8.2.4. Mùi là dấu hiệu để nhận biết Mỗi chất có đặc tính riêng, mỗi loài vật có mùi riêng nên có thể nói mùi là dấu hiệu để nhận biết. Việc con chó phát hiện mùi của ma tuý, mùi của kẻ tội phạm có lẽ phải hiểu theo cách này.

8.2.5. Mùi là phương tiện thông tin (hay còn gọi là thông tin hoá học) Bên cạnh thị giác, khứu giác, xúc giác, các loài động vật còn sử dụng mật mã hoá học để truyền đạt tín hiệu riêng cho nhau, thông báo cho nhau về những thông tin về sự nguy hiểm, sự đe doạ từ bên ngoài hay để nhận biết nhau. Chất hoá học do con vật phát ra để làm các nhiệm vụ trên gọi là thông tin hoá học (chemical communication). Kênh thông tin hoá học này đóng vai trò vô cùng quan trọng đối với động vật, đặc biệt là các loài công trùng. Nordlund phân chia các loại thông tin hoá học theo sơ đồ sau: 153

Semiochemical

Pheromon néi bé loµi

Primer

Allelochemical gi÷a c¸c loµi

Releaser

Allmon

Thay ®æi Sinh lý (Physiology)

Kairomon ThuËn lîi

øng xö (Behaviours)

TËp trung (Receiver)

Pheromon: có pheromon giới tính, pheromon tập hợp; releaser là chất liên kết các cá thể không phân biệt đực, cái trong một quần thể để cùng chung sống; primer là chất sử dụng khi có xung đột giữa các loại; còn allomon là chất nguỵ trang. Rõ ràng mỗi semiochemical có một chức năng trong quá trình sống của động vật. Để tấn công con mối đực một cách dễ dàng, con nhện Maslrolhera cornigera phóng ra chất Z-9-tetradecenyl axetat là pheromon của con mối cái để làm mê hoặc con mối đực rồi tấn công nó cho dễ dàng. 8.3. Cường độ mùi

Cường độ mùi là một trong những tiêu chí quan trọng để đánh giá mùi. Cường độ mùi phụ thuộc rất nhiều thông số, không chỉ của chất mùi mà còn cả của chủ thể nhận mùi. Sau đây là một số thông số chính.

8.3.1. Cường độ tác dụng đến phần tử nhạy cảm Các thông số đầu tiên biểu thị mức độ tác dụng đến phần tử nhạy cảm là chất lượng mùi và cường độ mùi. Cả 2 thông số này phụ thuộc vào chủ quan, không đo được một cách khách quan nên độ chính xác của nó dựa trên sự phán xét của số đông theo phương pháp thống kê.

8.3.2. Cường độ tác dụng đến sinh lý Những quá trình kích thích xảy ra bên trong và bên ngoài hệ thống khứu giác được thể hiện bằng thông số điện thế đo được hay tần số của sự hoạt động của hệ thống khứu giác. Hai thông số này đều biểu thị cường độ mùi một cách trực tiếp. 154

8.3.3. Biến đổi về hoá lý Cường độ mùi liên hệ chặt chẽ với thông số về sự biến đổi hoá lý. Với các đơn chất có thể xếp mối liên hệ cường độ mùi với sự biến đổi hoá lý theo từng cặp sau đây: – Liên hệ giữa chất lượng và cấu trúc; – Liên hệ giữa cường độ và nồng độ; – Liên hệ giữa cường độ và cấu trúc. Với các hỗn hợp thì mối liên hệ giữa cường độ và nồng độ là chủ yếu. Năm 1957, Stevens đã đưa ra một phương trình toán học để mô tả mối quan hệ giữa cường độ, nồng độ và cấu trúc phân tử chất thơm như sau: I = kCn logI = logk + nlogC trong đó: I - cường độ chất kích thích; C - nồng độ chất kích thích; n và k – các hằng số đặc trưng cho thành phần và cấu trúc phân tử của từng chất thơm.

A nA = 1,1

nB = 0,4

Th B

Th A

logC

Th 1 Th 2

logC b)

Hình 8.1

Đồ thị của phương trình này thể hiện trên hình 8.1. Trục tung biểu thị cường độ tác động (kích thích) tâm sinh lý, trục hoành biểu thị nồng độ kích thích. ThA và ThB là ngưỡng lý thuyết của A và B. Ngưỡng lý thuyết này là nồng độ mà ở đó đường thẳng biểu diễn cường độ kích thích cắt trục ngang và cường độ mùi bằng 0, nói một cách khác ngưỡng 155

lý thuyết là ranh giới giữa không có và có tác dụng của mùi, hay là nồng độ tối thiểu để chất mùi bắt đầu kích thích. n là độ dốc, nó biểu thị cường độ tăng rất nhanh theo nồng độ, n càng lớn cường độ càng lớn. k là hệ số chắn. Hệ số chắn biểu thị nồng độ của chất thơm mà ở đó cường độ kích thích bắt đầu thay đổi từ không đến có. Các loại chất thơm có số mũ n nằm trong khoảng 1 cho thấy rằng cường độ kích thích gia tăng cùng với tốc độ tăng hay giảm của nồng độ. Mối quan hệ giữa cường độ kích thích và cấu trúc phân tử chất thơm cũng được biểu thị trong các hằng số k và n đã nêu ở trên. Với các chất thơm khác nhau giá trị n thay đổi trong khoảng 0,1 đến 1 thường là 0,2 đến 0,7. k còn đặc trưng cho nồng độ ngưỡng, cho sự khác biệt từ chất thơm này đến chất thơm khác và không lớn hơn 6/10. Các thông số n và k có thể xác định bằng thực nghiệm theo phương pháp đo khứu giác. Nó thường được xác định đối với mỗi chất thơm và khi đó ta tính được cường độ mùi của chất thơm khi biết nồng độ qua phương trình Stevens. Theo phương trình này thì cường độ mùi tăng mãi theo nồng độ. Nhưng trong thực tế không phải như vậy. Khảo sát kỹ sự phụ thuộc cường độ mùi vào nồng độ theo phương trình Stevens cho thấy cường độ mùi tăng dần từ lúc bắt đầu có mùi (ngưỡng lý thuyết Th1 – hình 8.1b) rồi tăng dần theo nồng độ đến một lúc nào đó thì con người không phân biệt được mùi nữa mặc dù nồng độ tăng. Lúc đó người ta gọi là ngưỡng trên (Th2 – hình 8.1b). Vậy ngưỡng trên là nồng độ mà ở đó con người không cảm giác được sự thay đổi mùi. Sự khảo sát này rất có ý nghĩa trong pha chế hương liệu. Th1 và Th2 không chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất thơm mà còn phụ thuộc rất lớn vào đối tượng thưởng thức hương liệu. Đối với người này và chất thơm này có Th1 và Th2 nhưng giá trị này chưa chắc đúng với người khác. Sự pha chế hương liệu đối với một chất thơm thường chỉ sử dụng trong khoảng Th1 đến Th2. Đây là giá trị thực tiến của phân tử Stevens. Các mối quan hệ giữa cường độ mùi và nồng độ của một hỗn hợp là đặc biệt thú vị. Vì hầu hết các mùi mà chúng ta có được trong cuộc sống cụ thể hàng ngày, bao gồm các loại nước hoa, các loại mỹ phẩm, các loại mùi thực phẩm, thuốc lá, nước uống… và cả các mùi thiên nhiên đều là mùi của hỗn hợp nhiều chất thơm. Như thế mùi của hỗn hợp nhiều chất thơm không chỉ đơn giản là tổng các mùi của mỗi thành phần mà còn là một tổ hợp tương tác của mùi đó. Do đó để hiểu biết mùi hỗn hợp phải có thời gian dài để thử nghiệm và nghiên cứu. 156

Có điều chắc chắn mùi của hỗn hợp phụ thuộc rất nhiều yếu tố như sau: số lượng thành phần trong hỗn hợp, nồng độ của mỗi thành phần trong hỗn hợp, nồng độ hỗn hợp, cấu trúc hoá học của mỗi thành phần, quan hệ giữa các thành phần của hỗn hợp cả về mặt tính chất lẫn mặt cấu trúc… Người ta đã sử dụng phương pháp toán học, tin học để sáng tạo mùi của hỗn hợp. 8.4. Đánh giá mùi qua tính chất hoá lý của chất thơm

8.4.1. Phân tích để phân loại nguyên liệu Ngày nay, các loại nguyên liệu chất thơm như nước hoa, tinh dầu hay bất kỳ một chất nào thu được bằng cất hơi nước, cất chân không hay chiết từ nguyên liệu thực vật, hay từ một sản phẩm nước hoa cụ thể đều có thể phân tích một cách nhanh chóng về thành phần, về cấu trúc phân tử theo các phương pháp và công cụ hiện đại như: GC, GC-MS, 1HNMR, 13C-NMR, MS, UV, IR… Các số liệu phân tích này là cơ sở cho sự đánh giá chất thơm.

8.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự bay hơi Bất kỳ một chất lỏng hay chất rắn nào cũng có sự khuếch tán phân tử của mình vào pha khí xung quanh. Sự khuếch tán này xảy ra một cách liên tục cho đến một trạng thái cân bằng. Khi đó các phần tử khuếch tán tạo nên áp suất riêng phần của chất lỏng hay chất rắn trong môi trường xung quanh nó. Tất nhiên trong một hệ hở, áp suất riêng phần giảm dần từ bề mặt chất đến khoảng cách xa dần. Áp suất riêng phần phụ thuộc vào nhiệt độ, áp suất khí quyển xung quanh và bản chất của chất lỏng hay chất rắn. Trong một hệ kín, ở nhiệt độ và áp suất xác định, áp suất riêng phần của một chất nguyên chất gọi là áp suất hơi bão hoà của nó. Như thế, áp suất hơi bão hoà càng lớn thì khả năng bay hơi càng mạnh. Còn trong một hỗn hợp thì áp suất hơi bão hoà này gọi là áp suất riêng phần, áp suất riêng phần tuân theo định luật Raoult: Pi = Pio .x i Pio là áp suất hơi riêng phần của hợp chất i khi nó nguyên chất; xi là

nồng độ mol phần của chất i ở trong hỗn hợp. Như thế, trong một hỗn hợp, áp suất riêng phần càng lớn thì khả năng bay hơi càng mạnh. 157

Đối với một hệ pha loãng (hệ thường gặp nhất), nghĩa là dung dịch của chất thơm pha trong dung môi thì sự phân bố mô tả theo phương trình Henry: Pi = k i .x i k là hệ số riêng phần khí/lỏng, nó là hằng số ở một nhiệt độ xác định đối với một chất đã cho (độ hoà tan trong dung môi). Hai đinh luật Raoult và Henry đúng cho hệ lý tưởng và kín. Nhưng trong thực tế, các hệ đều không lý tưởng và hở, hơn thế trong hệ có sự tương tác với nhau giữa các phân tử trong cùng một hỗn hợp và giữa các chất trong mỗi pha nên các giá trị Pi tính được thường sai lệch chút ít so với giá trị thực tế. Trong thực tế sản xuất và cuộc sống, người ta chú ý nhiều đến sự phụ thuộc vào nồng độ và nhiệt độ của của sự bay hơi. 8.5. Đánh giá mùi qua tác dụng sinh lý

Áp dụng kỹ thuật đo sinh lý bằng điện trong nghiên cứu tiếp nhận mùi của động vật đã có vào những năm 1950, Adiran và cộng tác viên đã đưa phương pháp này vào nghiên cứu đánh giá mùi. Sự thay đổi chậm điện thế biểu thị trên cực góp điện thế xảy ra khi có sự kích thích mùi lên mô biểu bì mũi của động vật có xương sống hay lên các ăngten của công trùng với việc sử dụng kỹ thuật đo DC, đã cho thấy mối quan hệ mùi với sinh lý (hình 8.2). DC-ghi nhịp điệu thay đổi điện thế theo sự tác động vào ô khứu giác hay các nơron trên các đầu lông tơ.

Hình 8.2. Sơ đồ điện giải ghi nhận được từ con ếch khi nó tiếp xúc với n-butanol. A- DC điện thế chậm từ mô biểu bì mũi; B- DC cùng một lúc các xung điện của nơron cô lập trong khoang mũi

Nhiều thí nghiệm cho thấy rằng dòng điện thế phóng đại và tần số của sự thay đổi điện thế không tuyến tính với nồng độ kích thích, rất giống với sự phản xạ của cảm thụ trong chức năng chi phối tâm sinh lý. 158

Như thế, sự thực hiện sinh lý điện thế này có thể dùng để đo cường độ mùi tiếp nhận của động vật. Tất nhiên chất lượng mùi còn phụ thuộc vị trí đo mà ở đó có nhiều hay ít nơron cảm nhận. Theo phương pháp này, Hulus và cộng tác viên đã nghiên cứu phản xạ sinh lý người đối với tác động của mùi. Họ nhấn mạnh rằng mỗi một cách sản xuất, mỗi một cách bào chế chất thơm nhiều thành phần, có tần số khác nhau thì chất có tần số phóng đại lớn nhất chi phối chất lượng chất thơm. 8.6. Giá trị mùi

Giá trị mùi (Odour Value - OV) có thể đánh giá bằng tỷ số giữa nồng độ tác động và nồng độ ngưỡng. C Nång ®é t¸c dông cña chÊt th¬m OV = ac = C thr Nång ®é ng−ìng cña chÊt th¬m Cả Cac và Cthr đều tính theo mol/lit trong không khí. Số đo này biểu thị nồng độ tác dụng lớn hơn nồng độ ngưỡng bao nhiêu lần. Nó bắt đầu vào năm 1963 và người ta gọi nó dưới nhiều tên khác như “Rome Value”, “Odor Unit Number”… Nó có là con số biểu thị cường độ và chất lượng mùi, dùng để tính toán cường độ và chất lượng mùi của hỗn hợp. Tất nhiên sự biểu thị này không phải trực tiếp với nhiều lý do mà chưa có dịp bàn luận ở đây. 8.7. Cảm nhận tín hiệu mùi

Để có tín hiệu mùi, yếu tố tiên quyết là chất thơm (ligand mùi) tiếp cận được với phần tử hoạt tính của thụ quan, vì lông tơ thụ quan được bao phủ bởi một lớp chất nhờn nên ligand mùi phải tan vào chất nhờn rồi mới tiếp xúc được với phần tử hoạt tính của thụ quan để kích thích và tác động lên thụ quan rồi tạo nên tín hiệu mùi. Như thế có thể nói quá trình tạo nên mùi bao gồm hai giai đoạn. Giai đoạn đầu ligand mùi tan vào chất nhờn, phủ lên màng nơron của lông tơ khứu giác (lông tơ thụ quan), giai đoạn tiếp theo là ligand mùi bị hấp phụ và tiếp cận, kích thích, tác động lên màng nơron khứu giác và tạo nên tín hiệu mùi, tín hiệu mùi được dây thần kinh truyền dẫn về thần kinh trung ương. Quá trình tạo và truyền tín hiệu mùi được mô tả trên hình 8.3. Người ta xác nhận rằng quá trình khứu giác giữa ligand mùi và các phần tử hoạt động thụ quan là quá trình lưỡng phân tử. Điều đầu tiên và quan trọng nhất trong quá trình kích thích phân tử này là tạo được liên 159

kết của phân tử ligand mùi với các phân tử của màng bao receptor protein (R), đó chính là callasteric enzym, gồm 2 phần: phần thay đổi (V) và phần không thay đổi (C), các liên kết không hoá trị dẫ đến một phức thuận nghịch, sự hoạt động của protein ATP liên kết (G) và một khe co giãn của các phản ứng coenzym, CAMP hoạt động của adenylat oxydaza gây nên sự photphin hoá protein Kinasc (P), tạo nên một sự thay đổi trong kênh ion protein (IC) và của ion. Kết quả là màng nơron bị khử cực và tín hiệu thoát ra được truyền về hệ thần kinh trung ương.

Hình 8.3. Mô hình hoạt động của sự tương tác của chất mùi và sự truyền tín hiệu ở màng khứu giác

Hình ảnh sinh hoá này của cơ quan khứu giác cho thấy sự cảm nhận mùi được nhiều hay ít, cao hay thấp phụ thuộc rất lớn vào độ nhạy tính đặc hiệu của cơ quan khứu giác. Rõ ràng trong cả 2 giai đoạn của quá trình khứu giác đều có sự tương tác giữa phân tử ligand mùi và phân tử chất nền (bao gồm phân tử chất nhờn, phân tử hoạt động nơron receptor) mà sự tương tác này lại phụ thuộc rất nhiều vào cấu trúc phân tử của chất nền. Cấu trúc phân tử của chất nền như chúng ta biết đó là các protein, protein đặc hiệu, lipit, photpholipit, enzym. Nói chung, đó là môi trường kém phân cực, kị nước. Tất nhiên mức độ phân cực cũng như kị nước của môi trường khứu giác phụ thuộc và vật chủ. Quy luật chung của sự hoà tan cho thấy môi trường của khứu giác đòi hỏi một sự đáp ứng phù hợp cao về cấu trúc phân tử, về độ phân cực, tính kị nước cũng như cấu hình, cấu dạng của phân tử ligand mùi, có như thế phân tử chất thơm mới có thể biểu lộ được đặc tính mùi của mình. Do đó trước khi phân loại chất thơm theo hoá học chúng ta xem xét các tính chất cần có của chất thơm. 160

Chương 9 MỐI LIÊN HỆ GIỮA CẤU TRÚC PHÂN TỬ VÀ HOẠT TÍNH MÙI

Mối quan hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính mùi (Structure Activity Relationship - SAR) là vấn đề lý thú, được nhiều nhà khoa học quan tâm. Giải quyết được vấn đề này giúp cho việc tổng hợp và sáng tạo ra nhiều chất thơm mới có những tính năng như ý muốn. Đó là ước vọng tốt đẹp của các nhà hương liệu hay các nghệ nhân bào chế hương liệu. Sau đây là những vấn đề chính trong mối quan hệ này. 9.1. Sự lựa chọn lập thể đối quang

Sự lựa chọn trong các đồng phân đối quang (enantioselectivity) của nhóm chất thơm kiểu ambergis (1), (2),(3), (4) được nghiên cứu để mở rộng hiểu biết về mùi. Kết quả cho thấy chỉ có C18 axetal (5) và ete vòng (3) mới có mùi giống ambergis. Trong khi đó các đồng phân đối quang của nó ent-9 và ent-3 cũng có mùi, nhưng kém xa mùi ambergis. Ngược lại các hợp chất (4) và (6) đều là hợp chất không mùi thì đồng phân đối quang của nó ent-4 và ent-10 có biểu thị mùi nhưng không giống mùi amgergis. Những cặp đối quang không có hoạt tính như vậy là những ví dụ được ghi nhận đầu tiên cho tính phức tạp đặc biệt của các đối quang trong nhận thức mùi. Các đồng phân đối quang của hợp chất (8) chỉ khác chút ít so với mùi cơ sở về cả số lượng lẫn chất lượng, ví dụ dẫn xuất ent-6 có giá trị ngưỡng cao hơn (2,4) trong khi đó (8) là 2,2 (đo trong nước). Những hiểu biết khác nhau về mùi của các cặp đối quang làm sáng rõ thêm nhiều cặp khác và nó là cơ sở không chỉ cho hiểu biết cấu trúc không gian ba chiều mà còn mang lại những hiểu biết về sự hưng phấn tự nhiên của hệ thống thụ quan của con người và tương tác của nó với chất thơm hay với những hợp chất sinh học khác.

161

Hình 9.1

9.2. Sự lựa chọn lập thể không đối quang

Sự đáp ứng mùi là một chức năng của sự lựa chọn lập thể không đối quang (diastereoselectivity) của chất nền, đặc biệt đối với nhiều chất thuộc dãy ambergis đã được nghiên cứu. Sự khác biệt về cấu trúc của các đồng phân không đối quang gắn liền với cấu hình không gian 3 chiều của chúng, ảnh hưởng đến tất cả các thông số hoá – lý của chúng, kết quả tác động của mỗi đồng phân là kết hợp tất cả các yếu tố đó, mà chúng là kỹ xảo hoá học trong thời gian tương tác của chúng với thụ quan. Một số các hợp chất có cấu trúc thay đổi đôi chút của các hợp chất (3), (6) và (9) tạo ra thông tin về mối liên hệ giữa hoạt tính nhạy cảm và khả năng tương tác với hệ tiếp nhận phức tạp. Tính đặc thù của đồng phân không đối quang của các chất thơm dạng ambergis đã được chi tiết hoá và tóm tắt trong quy tắc triaxial của sự cảm nhận mùi mà kiểu phân tử được chỉ ra trong hình 9.2. Theo nguyên tắc triaxial thì các hợp chất có vòng decalin muốn có hoạt tính thì 2 vòng của nó phải có liên kết trans và có 3 nhóm thế ở các vị trí 4, 8 và 10 phải ở vị trí axial.

162

Ra Ra'

Ra"

Ra 8

Ra" 1

Ra'

(A)

(B)

Hình 9.2. Quy tắc triaxial của cảm nhận mùi. Sơ đồ biểu thị mối liên hệ giữa hệ thông dòng decalin và ambergis

Mùi của lớp chất này xuất hiện gắn liền với khung trans-decalin. Dấu hiệu đa bội của tương tác giữa phân tử đa bội và vị trí receptor phức tạp dường như được kết hợp với sự định hướng axial của các nhóm thế Ra, R’a và R”a, ở đó nhóm chức có oxy có thể gắn ở một trong các vị trí Ra, R’a, R”a hay Re như đã chỉ ra ở kiểu A. Mùi ambergis biến mất trong các đồng phân lập thể dia có hệ thống vòng decalin dạng cis như chỉ ra ở kiểu B. Các chất trong bảng 9.1 là ví dụ cho mối liên hợp mùi và sự lựa chọn cấu hình dia. Bảng 9.1. Các chất thơm ambergis tương tự và các đồng phân dia của chúng

Hoạt động

Không hoạt động

163

Cần lưu ý rằng các thông số phụ thuộc cấu trúc phân tử chất thơm gắn liền với các đặc tính điện tử, ưa nước và kị nước của chúng. Khi nghiên cứu các hợp chất steroit có mùi, người ta thấy quy tắc triaxial và hoá lập thể của 2 vòng dính kết A/B có ý nghĩa quyết định hoạt tính mùi hay hoạt tính sinh học. 3α-Androit-16-en-3α-ol (18) có mùi rất mạnh, giống mùi gỗ bạch đàn và xạ hương động vật.

Hình 9.3. Đặc trưng phân tử chất mùi steroit

Trong khi đó đồng phân 3β-epime (19) của nó là chất không mùi. Xeton (22) có trong thành phần nước tiểu cũng không mùi. Các chất đó có khả năng truyền tin hoá học về tình dục nên có thể nói chúng là các pheromon tình dục của động vật có vú. Ví dụ, pheromon 3α-ancol (18) và xeton tương ứng (22) được xem như là các pheromon tình dục của lợn động đực. Trong khi đó đồng phân 3β-epime (19) hầu như không có một hoạt tính kích thích tình dục nào cả. Các ancol (20) và (21) với cấu hình cis A/B cũng không có đặc tính mùi. Từ việc kiểm tra 50 steroit khác nhau dẫn đến một nhận thức khá rõ về hoạt tính của các chất cụ thể theo mùi của steroit. 9.3. Đặc tính điện tử

Mối liên hệ giữa đặc tính điện tử của các hợp chất dạng ambergis và tính khứu giác đã được Vead và cộng sự nghiên cứu. Không thoả mãn 164

với các kết quả chỉ dựa trên cấu trúc và hoá lập thể, họ phân tích 10 chất và phát hiện rằng trong tất cả các cấu trúc đều có một obitan phân tử gần như đồng nhất với sự tham gia của obitan nguyên tử hiđro axial bậc ba, và các hợp chất hoạt động có 2 nguyên tử hiđro đóng góp chính. LUMO (obitan phân tử receptor) mà chúng tạo với nguyên tử oxi một tam giác gọi là “tam giác ambergis” (x. hình 9.4).

Hình 9.4. Tam giác của các chất mùi ambergis

Tuy nhiên, cần nhấn mạnh rằng những kết quả tính toán cơ lượng tử về đặc tính cấu trúc điện tử có thể được thay thế bởi sự phân tích đơn giản các đặc điểm hình học (sự có mặt hay không các mặt “tam giác ambergis” tương ứng). Một ví dụ nổi bật cho các yếu tố lập thể của đôi điện tử là hợp chất (25) và (26), cả hai đều có “tam giác ambergis” nhưng chỉ có (25) là có hoạt tính. 9.4. Một vài ví dụ về nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính mùi

Ngoài các nghiên cứu SAR của các chất mùi dãy ambergis và steroit đã nêu ở trên để đưa đến các mô hình vể cấu trúc có mùi, cấu trúc không mùi (có hoạt tính – không có hoạt tính), ngày nay các nghiên cứu SAR được chú trọng trong 2 lĩnh vực sau: 165

9.4.1. Nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính mùi các chất thơm của gỗ bạch đàn Hoá học chất thơm gỗ bạch đàn phát triển mạnh vào năm 1982, khi thành phần chính của tinh dầu gỗ bạch đàn Tây Ấn Độ được Semmler, Rugieka và Themman xác định. Đó chính là sesquitecpen ancol (+)-αsantalol (27) và (+)-β-santalol (28).

Hình 9.5

Mối quan hệ giữa mùi và cấu trúc được thể hiện rõ ràng nhất trong các nghiên cứu chất thơm của gỗ bạch đàn. Các mức độ thay đổi mùi của gỗ bạch đàn được đặc trưng ở tất cả các chất chứa 1 nhóm hiđroxyl gắn với phần cứng và 1 gốc ankyl cồng kềnh đính trực tiếp vào nguyên tử cacbon-5 mà nó có cấu hình tương tự cấu hình cis-santalol thiên nhiên. Trên cơ sở hiểu biết này, người ta đoán trước các hợp chất (30), (31), (32) có mùi gỗ bạch đàn, trong khi đó hợp chất (E)-β-santalol (29) và đồng phân epime của nó không có mùi gỗ bạch đàn. Qua hàng trăm chất được nghiên cứu, các nhà khoa học đã tóm tắt mối liên hệ giữa cấu trúc hoá học và mùi gỗ bạch đàn như sau: “Chất mùi gỗ bạch đàn biểu thị trên một phân tử có 13 – 17 nguyên tử cacbon, có 1 nhóm hiđroxyl ở một khoảng cách nhất định với một nhóm thế lớn. Nhóm thế lớn này có thể là đơn vòng, nhiều vòng hay một hệ thống mạch béo với sự chia nhánh ở cacbon 2 và 6 và một liên kết đôi hay một vòng 3 ở C-7”. Cùng lúc đó Naifrawer đưa ra một tính toán chi tiết về mối quan hệ cấu trúc – mùi và công thức hoá thành quy tắc bạch đàn cho các chất có mùi bạch đàn như sau: 166

1. Phân tử lượng : Số nguyên tử cacbon là 12 – 16 nguyên tử, oxi ete tương đương một nguyên tử cacbon. 2. Nhóm chức: Phân tử phải chứa nhóm hiđroxyl tự do. 3. Hình học phân tử: Nhóm hiđroxyl và một nhóm thế cao hay một nguyên tử cacbon bậc 4 phải định vị cho khung phân tử như là một phương cách để tồn tại một cấu dạng hợp lý, trong đó nguyên tử oxi của nhóm hiđroxyl và nguyên tử cacbon thế cao ở gần nhau là 4Å. 4. Các hiệu ứng điện tử: Nếu nhóm thế mật độ điện tử cao (ete, liên kết đôi hay nhóm xiclopropyl) liên kết với nguyên tử cacbon bậc 4 thì mùi bạch đàn có thể biến đổi thuận lợi hơn. Nếu mạch cacbon giữa nhóm hiđroxyl và nguyên tử cacbon thế cao chứa một nguyên tử cacbon lai hoá sp2 thì mùi bạch đàn có thể bị biến đổi theo một vài chiều hướng. 5. Hiệu ứng của nhóm thế: Khi nhóm hiđroxyl là một phần của một mạch nhánh thì nguyên tử cacbon α với nguyên tử cacbinol có thể thế ankyl. Bảng 9.2. Hình học phân tử của các hợp chất kiểu sandalwood (khoảng cách đo được trên mô hình Dreiding)

Mùi bạch đàn

Không có mùi bạch đàn

167

Khoảng cách cần thiết giữa nguyên tử oxi hiđroxyl và nguyên tử cacbon thế cao 4Å là cơ sở chính đẻ so sánh các chất thơm bạch đàn (33), (35), các đồng phân dia không hoạt tính của chúng (34) và (36) có khoảng cách tương ứng rộng hơn.

9.4.2. Nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính mùi của các xạ hương Có các hợp chất vừa giống nhau về cấu trúc, vừa giống nhau về mùi, nhưng cũng có những chất giống nhau về mùi nhưng khác nhau về cấu trúc và ngược lại. Các loại xạ hương (musk) vòng lớn muscon (38), xạ nhân thơm musk xeton (39), xạ steroit androstenol (40) (hình 9.6) có cấu trúc phân tử rất khác nhau nhưng chúng có mùi gần nhau và có tên chung là xạ hương.

Hình 9.6. Các xạ hương, sản phẩm thương mại (37), muscon (38), musk xeton (39)

Trong phạm vi nghiên cứu SAR, Beet và Theiman đã hệ thống hoá các thông số về cấu trúc quan trọng nhất thành các quy tắc gọi là “quy tắc musk” cho các chất thuộc lớp xạ nhân thơm có nhóm nitro theo tiêu chí sau: 1. Có 14 – 20 nguyên tử cacbon (tối ưu từ 16 – 18); 2. Hai trung tâm bậc 4 (hay một bậc 4 và một bậc 3) gắn vào vị trí ortho hay meta của hệ thống nhân thơm; 3. Một nhóm ankyl trong nhân thơm, trong một số trường hợp nhóm axyl có thể được thay thế bởi một ete hay một nhóm nitrin; 4. Không có vị trí cản trở lập thể của nhóm chức; 5. Có sự định hướng của trục dipol phân tử; 6. Cấu trúc gói kín. Theo nguyên tắc này, người ta dự đoán một hợp chất có cấu trúc đặc biệt có mùi hay không có mùi (x. hình 9.7). 168

Ví dụ: Một phân tử với 2 trung tâm bậc 4 ở vị trí para trong nhân thơm (trái với quy định 2 và 4) như chỉ ra ở dạng C hay là với nhóm axyl bên cạnh trung tâm bậc 4 (dạng D và F trái với quy tắc 4 và 5) biểu thị không có mùi musk nào hay mùi rất yếu.

Hình 9.7. Các bộ khung cơ sở trực tiếp hay không trực tiếp của các xạ hương

Người ta chia loại musk thành musk meta hay musk ortho tuỳ theo nhóm thế bậc 4 ở vị trí meta hay ortho (bảng 9.3, 9.4). Do nắm được các quy tắc về mối liên hệ giữa cấu trúc và mùi, ngày nay người tổng hợp được hàng trăm loại musk khác nhau, để thay thế cho musk thiên nhiên. Bảng 9.3. Các ví dụ về musk meta

169

Bảng 9.4. Các ví dụ về musk ortho

9.4.3. Sự hỗ trợ của tin học trong nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính mùi Với các phần mềm hữu hiệu, máy tính giúp chúng ta tính được chính xác các cạnh của tam giác ambergis (hình 9.4). Khoảng cách quyết định tính chất mùi của các trung tâm gây mùi ở hợp chất mùi bạch đàn (bảng 9.2) và khoảng cách của các nhóm thế và nhóm nitro hay axyl trong hợp chất xạ hương cũng quy định mùi của các hợp chất đó. Máy tính còn giúp chúng ta thiết lập các mô hình tối ưu về cấu trúc phân tử cho một chất mùi xác định theo các thông số cấu trúc của mùi đó. Sau đó chúng ta tiến hành tổng hợp theo mô hình tối ưu đó. Làm như thế chắc chắn công việc tiến triển nhanh hơn nhiều so với cách làm thử nghiệm trước đây.

170

Chương 10 CÁC THÀNH PHẦN CỦA CHẤT THƠM Trong thực tế, hầu như không có chất thơm nào được sử dụng dưới dạng đơn chất mà hầu hết chúng được sử dụng dưới dạng hỗn hợp nhiều chất, đặc biệt đối với chất thơm thiên nhiên thì nguyên tắc này càng đúng. Vì thế người ta phân chia các thành phần chất thơm theo vai trò và chức năng của chúng trong hỗn hợp chất thơm. 10.1. Đơn hương Một chất nguyên chất có mùi đặc trưng thì gọi là đơn hương. Như vậy, đơn hương có thành phần phân tử, công thức cấu tạo và cấu hình phân tử, các hằng số vật lý, các tính chất hoá học và mùi xác định. Đối với nghệ nhân pha chế hương liệu, nắm được đặc trưng mùi, tính chất vật lý và hoá học của các đơn hương là nắm được chìa khoá để sáng tạo mùi mới. Sau đây là một số đặc trưng quan trọng nhất của đơn hương.

10.1.1. Đặc tính và đặc trưng mùi của đơn hương Đặc tính mùi quyết định tính chất của hương liệu, đặc trưng mùi quyết định hướng ứng dụng của hương liệu. Bảng 10.1. Đặc tính và đặc trưng mùi của một số đơn hương phổ biến

STT

Hợp chất

2-Metyl-3-furantiol

bis(2-Metyl-3-furyl)disunfit

Fufuryl mercaptan

Ngưỡng, µg/kg 0,01

Đặc tính mùi

Mục đặc trưng

Thịt, ngọt

Cà phê, gà, bò

Thịt

Bò, gà, chè

0,13

Thịt quay

Bò, gà, cà phê

Metrional

0,20

Khoai tây nấu

Lơn, cà phê

3-Mercapto-3-metyl-1butanol

10,0

Sâu kén

Cà phê

2-Axetyl-2-thiazolin

1,0

Vỏ bánh mì

Bò

2,10-5,0

171

STT

Hợp chất

Ngưỡng, µg/kg

Đặc tính mùi

Mục đặc trưng

(E,E)-2,4-Decadienal

0,07

Dầu mỡ

Lạc, hạnh nhân

(E,E)-2,4-Nonandienal

0,09

Mỡ

Bò

(E)-2-Octenol

3,0

Mỡ

Bò

2-Undecanal

4,0

Ngọt, citrans

Gà

12-Metyltridecanal

0,1

Giống bơ

Cừu

Decanal

Thực vật

Lạc, hạnh nhân

γ-Dodecalacton

7,0

Sâu kín, quả

Đào

γ-Decalacton

11,0

Hoa quả

Dừa

4-Hiđroxy-2,5-đimetyl3-(2,4)-furanon (HDF)

0,4

Giống curamel

Ngô rang

Phenylaxetaldehit

4,0

Mật ong, ngọt

Cacao

Isoamyl axetat

Mạnh, hoa quả

Chuối

Isobutyl axetat

Mạnh, hoa quả

Chuối

Butyl axetat

Mạnh, hoa quả

Dứa

Allyl hexanoat

Rất mạnh

Dứa

n-Butyl-n-butyrat

Mạnh, hoa quả

Dâu

Etyl isovalerat

Mạnh, hoa quả

Táo

Etyl xinnamat

Ngọt, mạnh

Mật ong

Isoamyl isovalerat

Mạnh, hoa quả

Táo

Limonen

Mạnh

Chanh

Metyl antranilat

Ngọt, mạnh

Bưởi

Xinnamandehit

Cay, mạnh

Quế

Anetol

Sắc, mạnh

Hồi

Vanillin

Ngọt

Vani

Bezyl butyrat

Mạnh

Mận

Etyl heptanoat

Nhũ, ngọt

Rượu vang

Etyl nonanoat

Nhũ

Rượu cô nhắc

Etyl octanoat

Nhũ, ngọt

Rượu sampanh

Epoxietyl xinnamat

Ngọt, mạnh

Mật ong

172

STT

Hợp chất

Ngưỡng, µg/kg

Đặc tính mùi

Mục đặc trưng

Etyl propionat

Mạnh

Rượu rum

Axit isobutyric

Mạnh

Bơ

Isoamyl isobutyrat

Mạnh

Mận

γ-Nonalacton

Rất mạnh

Dứa

γ-Unoccalacton

Rất mạnh

Đào

Eugenol

Mạnh, ngọt

Đinh hương

Allixin

Mạnh, cay

Tỏi

Zingiberen

Nóng, mạnh

Gừng

trans,trans-Piperinamit

Mạnh, cay

Hạt tiêu

Capsaixin

Mạnh, hắc

Ớt

Tumeton, α-tumerson

Hắc

Nghệ

Patchouli

Mạnh

Hoắc hương

Metol

Mạnh, nóng

Bạc hà

Propenyl disunfua

Hắc

Hành

1,8-Xineol

Mạnh

Bạch đàn

Linaloon

Mạnh, ngọt

Rau mùi

Safrol

Mạnh

Rẻ hương

Jasmon

Mát, dịu

Hoa nhài

Xitronellol

Dịu, ngọt

Hoa hồng

10.1.2. Hệ số bền mùi của đơn hương Hệ số bền mùi của đơn hương chính là thời gian bay hơi của đơn hương, nó tỷ lệ nghịch với áp suất hơi của nó. Người ta đã nghiên cứu chi tiết vấn đề này qua nhiều thí nghiệm khác nhau ở các đơn hương khác nhau và xếp chúng theo thời gian 100, đơn vị là giây. Với các đơn hương có thời gian bay hơi từ 1 đến 14 người ta xếp chúng vào nhóm đầu, nhóm kém bền mùi nhất hay là bay hơi nhanh nhất. Các đơn hương có độ bền mùi từ 15 đến 60 người ta xếp chung vào nhóm giữa, nhóm có độ bền trung bình. Còn các đơn hương có độ bền mùi từ 61 đến 100 thuộc nhóm thấp, nhóm có độ bền mùi cao, hay nói một cách khác là độ bay hơi thấp. Việc sắp xếp này thể hiện trong bảng 10.2. 173

Bảng 10.2. Thời gian bay hơi của một đó đơn hương NHÓM KÉM BỀN MÙI

U 1

Đơn hương Axetophenon

Etylphenyl axetat Nonyl axetat

Benzandehit

Terpinyl axetat 6

Xitronellyl fomiat

Etyl axetat

Isobutylphenyl axetat

Isobutyl axetat

Linalyl benzoat

Metyl benzoat

Phenyletyl benzoat

Benzyl fomiat

Amyl propionat

Etyl benzoat

Benzyl isobutyrat

Metyl salixylat

Benzyl propionat

Octyl axetat

Geranial

Phenyletyl axetat

Ginger

Phenylalyl propionat

Ancol nonylic

Phenyletyl salixylat

Geranyl isobutyrat

Benzyl xinnamat

Amyl salyxylat

Paracresyl axetat

Benzyl salixylat

Paracresyl isobutyrat

Xitronellyl axetat

Cuminin andehit

Etyl antranilat

Xyclodexanyl butyrat

Geraniol

Etyl salixylat

Isobutyl benzoat

Metyl axetophenon

Linalyl propionat

Terpineon 4

Đơn hương

Amyl axetat Benzyl axetat

Geranyl butyrat

Xitronellol

Metyl anicat

Geranyl benzoat

Neryl axetat

Metyl butyrat

Etyl anisat

Nonyl andehit

Linalyl axetat

Ancol phenyletylic

Phenylpropyl propionat Metyl eugenol

174

Amyl butyrat

Ancol dexylic

Paracretylphenyl axetat Ancol phenylpropylic

Linallyl cinnamat Ancol etylic 12

Metyl ionon

Phenyletyl xinnamat

Phenylpropyl axetat

Terpinyl propionat

Phenylpropyl isobutyrat

Amylbenzyl ete

NHÓM BỀN MÙI TRUNG BÌNH

U 15

Đơn hương

Heliotropin

Metyl isoeugenol

Xinnamyl axetat

Isobutylmetyl antranilat

Xinnonyl fomiat 16

Đơn hương

Amyl anisat

Metylphenyl axetat 27

Eugenol

Xitronellyl benzoat Dimetyl hydroquinon

Tetrahidrogeraniol

Xinnamyl butyrat

Phenoxyetyl isobutyrat

Etyl lauriat

Phenyletyl isobutyrat

Dimetyl antranilat

Cherig sage

Rodinyl propionat

Amyl benzoat

Axetyl isoeugenol

Anisandehit

Isobutyl xinnamat

Indol

Bornyl axetat

α,β-Ionon

Ancol anisic

Metyl antranilat

Ancol laurinic

Cinnamyl propionat

Andehit laurinic

Linalyl antranilat

Ancol andexylic

Metoxyaxetophenon

Axetat

Anisyl axetat

Merolidol

Etyl xinnamat

Benzylphenyl axetat

Geranyl axetat

175

NHÓM BỀN MÙI CAO

Đơn hương

U 100

Đơn hương

Amylphenyl axetat

Cumarin

Ancol xinnamic

Decl andehit

Linalyl salixylat

γ-Nonyl lacton

Metyl naphtylxeton

Linalylphenyl axetat

Hydroxy xitronellal

Resinoit

Andehit octylic

Patchouli

Etylmetylphenyl glycidat

Axit phenyl axetic

Rodinyl axetat

Andehit undexylic

Undecalacton

10.1.3. Tính tan của đơn hương Để sử dụng đơn hương có hiệu quả trong pha chế hương liệu, nghệ nhân pha chế không chỉ phải nắm chắc đặc tính mùi, đặc trưng mùi của đơn hương mà còn phải nắm chắc tính hoà tan của đơn hương nữa. Như chúng ta đã biết 2 phần tử A và B tan tốt vào nhau (trộn lẫn vào nhau) khi tương tác đồng loại tương đương tương tác khác loại, nghĩa là tương tác giữa các phần tử A – A cũng tương đương với tương tác giữa các phần tử A – B và tương đương với tương tác giữa các phần tử B – B. Tương tác giữa các phần tử A và B có thể là tương tác van der Waals, có thể là tương tác lưỡng cực và cũng có thể là tương tác theo liên kết hoá học mà chủ yếu là liên kết hiđro. Trong các tương tác trên thì tương tác lưỡng cực và liên kết hiđro là quan trọng hơn cả. Tương tác lưỡng cực xảy ra và càng bền chặt khi phần tử A và B có độ phân cực lớn. Điều này, dẫn đến chất có độ phân cực hoà tan vào chất có độ phân cực. Trong dung dịch liên kết giữa các phân tử là liên kết lưỡng cực và liên kết van der Waals. Khi A và B không có độ phân cực thì sự hoà tan vào nhau của chúng xảy ra theo sự khuếch tán do nhiệt. Trong dung dịch lúc này lực liên kết giữa các phân tử là lực van der Waals. Khi A và B đều có khả năng tạo liên kết hiđro thì giữa chúng ngoài các liên kết trên còn có liên kết hiđro nữa. Như vậy, trong 3 loại liên kết giữa A và B khi chúng tan vào nhau thì liên kết hiđro là bền nhất, sau đó là liên kết có cực và cuối cùng là liên kết van der Waals. 176

Như thế chúng ta có nguyên tắc chất có cực hoà tan trong dung môi có cực, không hoà tan trong dung môi không cực, và ngược lại. Ví dụ C2H5OH tan trong nước, không tan trong ete dầu hoả, n-hexan hoà tan trong ete dầu hoả mà không hoà tan trong nước. Đó là nguyên tắc thực dụng trong pha chế chất thơm. Tóm lại, tính tan của đơn hương phụ thuộc vào thành phần và cấu tạo phân tử của đơn hương, nghĩa là phụ thuộc vào độ phân cực và khả năng tạo liên kết hiđro của đơn hương. 10.2. Chất điều hương

Hợp chất có khả năng làm thay đổi cương độ mùi, đặc tính mùi của một hương liệu gọi là chất điều hương. Điều hương có thể là một đơn chất hay một hỗn hợp các chất. Hầu hết các điều hương là chất có mùi nên có nhiều chất vừa là đơn hương vừa là điều hương, trong pha chế hương liệu bao giờ người ta cũng lưu ý mùi của nó. Sau đây là một số ví dụ: 1. Mùi chính của hoa bưởi, hoa cam là metyl antranilat và một số chất khác. Để làm dậy mùi hoa bưởi người ta dùng anđehit anisic, ancol anisic hay benzyl axetat. Để làm dịu mùi và bền mùi người ta dùng metyl antranilat, còn để làm hài hoà mùi thì dùng unnanol. 2. Mùi chính của hoa hồng là mùi phối hợp của 6 ancol: rodinol, xitronellol, geraniol, nerol, linalool và ancol phenyletylic. Để làm cho mùi hoa hồng trở nên nhẹ nhàng hơn, lôi cuốn hơn người ta dùng dầu hương xitrronellyl axetat. Để làm cho mùi hồng thơm ngát và ấn tượng thì dùng isobutyl butyrat, phenyletyl axetat. 3. Để làm cho mùi quế êm ngọt, ít cay người ta dùng eugenol và metyl eugenol. Nhưng để làm cho mùi hồi bền, êm dịu và hấp dẫn người ta dùng heliotropin, làm cho mùi hồi ngọt ngào thì dùng clorofom. Qua cách sử dụng trên người ta thấy điều hương là những chất rất có ý nghĩa trong hương liệu. Chúng không mang mùi đặc trưng nhưng chúng làm cho mùi đặc trưng của chất thơm thêm những sắc thái mà nghệ nhân tạo mùi mong muốn. 10.3. Chất định hương

Những chất có khả năng giữ được mùi của hương liệu làm cho hương liệu thơm lâu hơn, bền hơn gọi là chất định hương. Như thế, chất định hương vừa có khả năng giữ được các thành phần có mùi của hương liệu, làm cho chúng chậm bay hơi và kéo dài thời gian 177

có mùi, vừa có khả năng liên kết chặt chẽ với môi trường. Người ta sử dụng định hương bằng cách trộn lẫn hoàn toàn nó vào hương liệu và môi trường, do đó sản phẩm cuối cùng tốt hơn. Để làm được hai chức năng này định hương phải có các đặc tính sau:

10.3.1. Liên kết với đơn hương Để giữ được các thành phần có mùi, chất định hương phải liên kết với các thành phần này hoặc bằng liên kết van der Waals hoặc bằng liên kết lưỡng cực hoặc bằng liên kết hiđro hoặc bằng cả ba loại liên kết này. Để đạt được điều này, tốt nhất là các đơn hương phải hoà tan được vào trong định hương với cấu trúc phân tử của các thành phần có mùi của hương liệu. Mối quan hệ đó cho thấy nếu cấu trúc phân tử của các thành phần có mùi là phân cực thì chọn định hương phân cực và ngược lại. Đây là một trong các nguyên tắc chọn định hương.

10.3.2. Nhiệt độ sôi Nhiệt độ sôi cao cũng có nghĩa là tốc độ bay hơi chậm, giữ được mùi lâu. Do đó nhiệt độ sôi cao như là một đặc tính tiên quyết của các chất định hương. Vì định hương liên kết chặt chẽ với đơn hương nên khi định hương không bay hơi hay bay hơi chậm, kém thì nó kéo theo sự bay hơi chậm, kém của đơn hương, làm cho thời gian có mùi của đơn hương kéo dài. Đó là cơ chế tác dụng của định hương. Trong cùng một điều kiện thí nghiệm với các phương pháp khác nhau, người ta đã xác nhận rằng trong 3 chất: ancol benzylic sôi ở 68oC/3 mmHg, đimetyl phtalat sôi ở 143oC/3 mmHg và benzyl benzoat sôi ở 147oC/3 mmHg thì benzyl benzoat có tính định hương cao nhất, sau đó đến đimetyl phtalat, còn ancol benzylic có tính định hương thấp nhất. Với quan điểm này, tất cả các đơn hương có sự bay hơi từ 100 trở lên đều có tính định hương, ví dụ, coumarin, patchouli, anđehit undexylic… và các chất sau đây cũng là những định hương thường dùng: đimetyl glycol (sôi 245oC), axit benzoic (sôi 249oC), trietylenglycol (sôi 276oC), đietyl phtalat (sôi 293oC), benzyl benzoat (sôi 323oC), amyl phtalat (sôi 336oC), triphenyl photphat (sôi 410oC), metyl xelulocacboxylat (CMC), glyxerin, aga-aga, các chất nhựa keo…

10.3.3. Liên kết với môi trường Một định hương dù có liên kết chặt chẽ với đơn hương: giữ được mùi tốt, nhưng không tan được vào môi trường sử dụng hương liệu hay 178

liên kết không chặt chẽ với môi trường sử dụng hương liệu, nghĩa là không liên kết chặt chẽ với môi trường sử dụng hương liệu thì định hương đó vô dụng. Do đó, tính chất hoà tan (hay trộn lẫn hoàn toàn) của định hương vào môi trường sử dụng hương liệu là tính bắt buộc của định hương. Sự hoà tan của định hương vào môi trường sử dụng định hương có 2 ý nghĩa: trước hết đó là điều kiện cần để phân tử chất định hương liên kết chặt chẽ với các phân tử của môi trường, thứ hai đó là quá trình tan của định hương cũng kéo theo quá trình tan của các đơn hương.

10.3.4. Đặc tính mùi a) Định hương là chất không mùi Những chất không có mùi như glyxerin, CMC, aga-aga, trimetylglycol, đường… có thể là những chất định hương. Trong trường hợp này, việc sử dụng định hương trở nên đơn giản, người ta chỉ quan tâm đến khả năng hoà tan và khả năng liên kết của định hương với các đơn hương và môi trường là đủ. b) Định hương có mùi Những chất có mùi như vanillin, patchouli, cumarin, musk, các loại nhựa thơm như nhựa các loại trám, nhựa gỗ phách…, trong trường hợp này người ta không chỉ xem xét các tính chất cần có của một định hương mà còn xem xét đặc tính mùi của định hương để sử dụng nó cho phù hợp với mùi mong muốn. c) Định hương không được tạo mùi mới trong quá trình sử dụng Một điều cấm kị đối với các định hương là không được tạo ra các mùi mới trong quá trình sử dụng, nhất là mùi khét và các mùi khó chịu. 10.4. Dung môi

Dung môi là môi trường để pha chế hương liệu, là thành phần có hàm lượng lớn nhất trong hương liệu. Ví dụ, trong nước hoa bưởi, hoa cam, thành phần có mùi thơm chiếm một lượng rất bé, ít hơn 0,5%, trong khi đó nước chiếm trên 99,5%, người ta gọi nước là dung môi; trong sữa cà phê thì sữa là dung môi. Yêu cầu cao nhất của dung môi đối với hương liệu là khả năng hoà tan của nó đối với các thành phần của hương liệu như các đơn hương, các định hương càng lớn càng tốt. An toàn đối với người sử dụng cũng là một yêu cầu không thể thiếu. 179

Tuỳ theo tính chất của các thành phần hương liệu, tuỳ theo đối tượng sử dụng hương liệu mà người ta chọn dung môi thích hợp để pha chế. Ví dụ, đối với bánh kẹo vì môi trường sử dụng là bột, đường, protein, vì có nhiệt nên dung môi thường dùng là glyxerin-nước, propylenglycol-nước; còn đối với nước hoa thì dung môi chủ yếu là cồn-nước, điều này dễ hiểu vì yêu cầu tiêu dùng là bay hơi và không để lại dấu vết. Trong các dung môi đã dùng trong hương liệu thì cồn và nước là 2 loại phổ biến nhất, với lượng lớn nhất.

180

Phần thứ tư

ỨNG DỤNG VÀ CHUYỂN HOÁ TINH DẦU Chương 11 ỨNG DỤNG CỦA TINH DẦU Tinh dầu có nhiều ứng dụng, đặc biệt dùng nhiều trong 3 ngành: hương liệu mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm. Tuỳ theo tính chất, tuỳ theo cách sản xuất mà có các ứng dụng khác nhau của tinh dầu. Ở đây chỉ nêu 3 hướng ứng dụng chính. 11.1. Tinh dầu cho nước hoa và mỹ phẩm

Lượng tinh dầu lớn nhất là phục vụ cho hương liệu và mỹ phẩm. Đặc biệt là tinh dầu các loại hoa. Chính loại tinh dầu này ra đời tạo ra một ngành nghề tinh tế, quý phái là nghề làm nước hoa (perfumery). Tất cả các nước hoa đề có tinh dầu. Tinh dầu dùng trong nước hoa, hương liệu và mỹ phẩm dưới dạng pha chế với các chất khác, trong nước hoa có hàm lượng tinh dầu rất ít mà chủ yếu là cồn và các chất pha chế khác, còn tinh dầu chỉ chiếm khoảng vài phần trăm hay phần nghìn, phần vạn. Trong các kem xoa thì hàm lượng còn ít hơn. Tuỳ theo chất lượng tinh dầu và phương pháp điều chế mà sử dụng vào mục đích khác nhau. Ví dụ, có 30 loại hoa hồng nhưng người ta chỉ chọn được 3 loại để trồng làm nguyên liệu điều chế tinh dầu, đó là Rosa carritifolia L., Rosa gallica Lam và Rosa damacena Mill. Có hàng chục đồn điền ở Bulgaria, ở Pháp trồng các loại hoa hồng này, hàng năm cung cấp tinh dầu hoa hồng cho toàn thế giới. Người ta nghiên cứu các điều chế tinh dầu khác nhau để có sản phẩm cho mục đích khác nhau. Ví dụ, cho 100 kg hoa hồng vào nước và cất lấy 100 lít nước cất của hoa, rồi để yên cho tinh dầu nổi lên, chiết lấy tinh dầu cho pha chế nước hoa, số nước sau khi lấy tinh dầu thì dùng vào việc pha chế kem xoa hay dược phẩm; hay là để có loại tinh dầu hoa hồng đặc sắc êm dịu thì người ta 181

ngâm hoa hồng trong dầu béo ở 30 – 40oC nhiều lần, đến khi dầu béo bão hoà tinh dầu thì xử lý với cồn 90% để lấy tinh dầu pha chế nước hoa cao cấp. Tinh dầu nguyên chất của thiên nhiên như là một mẫu mùi do thiên nhiên pha chế, nó đã tối ưu về số lượng, về thành phần nên bền mùi, hấp dẫn và rất được ưa chuộng. Do đó con người đã phân tích định tính, định lượng nó một cách chính xác bằng GC-MS và các phương tiện khác, sau đó người ta bắt chước để làm hương nhân tạo, hay lấy hương thiên nhiên làm chuẩn rồi pha chế thêm các chất khác để có hương mới. Theo hướng này, R. Cerkclaud đã phân loại các mùi hương theo một thang 45 loài của thiên nhiên như: Nhài, Cam, Huệ, Hồng, Cỏ tươi, Violet, Mimosa, Chanh, Quế, Hồi…, hương các loài quả. Ở mỗi loại hương như vậy ông chỉ ra các chất chủ đạo, các chất phối chế, các chất tương phản nên nó giúp cho con người làm hương liệu có thêm khả năng sáng tạo. 11.2. Tinh dầu cho thực phẩm

Đã là thực phẩm thì phải có mùi, có vị để kích thích dịch vị, tạo ra sự ham muốn, thèm khát, do đó ăn ngon, ăn nhiều và chóng tiêu hoá. Để có mùi, có vị thì phải có tinh dầu. Do đó nhu cầu tinh dầu cho thực phẩm là nhu cầu tất yếu không thể thiếu được. Tinh dầu cho thực phẩm trước hết là không độc, an toàn, sau đó là mùi dễ chịu kích thích dịch vị. Tuy nhiên, vì lượng tinh dầu trong thực phẩm dùng rất ít, thường là dưới ngưỡng gây độc hại nên những vụ ngộ độc do tinh dầu rất ít gặp. Dùng phổ biến nhất trong thực phẩm là tinh dầu các loại quả như: chanh, cam, xoài, mơ, mít, dứa… ; các loại tinh dầu tạo mùi; các tinh dầu vừa mùi, vừa vị như: tỏi, tiêu, nghệ, gừng, bạc hà, húng, tía tô, quế, hồi, thảo quả, đinh hương, nếp… Tuỳ theo nhu cầu và cách chế biến thực phẩm mà người ta chọn tinh dầu và phương pháp điều chế thích hợp. Ví dụ để pha rượu chanh, rượu cam hay các loại nước giải khát có mùi chanh, cam, người ta không dùng loại tinh dầu cất lôi cuốn hơi nước từ vỏ các loại cây này mà có cách điều chế riêng: gọt vỏ ngoài của quả chanh, cam lúc chưa chín cho vào cồn 96%, ngâm một thời gian rồi vớt vỏ ra, hạ độ cồn xuống 60%, chiết bỏ phân tecpen không tan, cất lôi cuốn hơi nước phần cồn 60% có tinh dầu, người ta thu được “cồn chanh thơm” dùng để pha các loại rượu và nước 182

giải khát. Ví dụ khác, để có mùi bưởi cho các loại bánh trung thu, bánh chè làm, chè…, người ta hái hoa bưởi tươi lúc 9 – 10 giờ sáng, cho vào nước rồi cất theo tỷ lệ 1 kg lấy 1 lít nước hoa, rồi pha thêm một số chất thơm khác là người ta có loại “nước hoa bưởi” để dùng. Nhưng đối với các công nghệ bánh kẹo thì không dùng loại tinh dầu như vậy mà người ta pha tinh dầu vào các chất khác như cồn 96%, glyxerin, propylenglycol, vanillin để dùng. 11.3. Tinh dầu cho dược phẩm

Căn cứ tác dụng sinh lý, sinh hoá, kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu mà người ta sử dụng tinh dầu để làm thuốc. Trong thuốc dân tộc tinh dầu được sử dụng nhiều nhất dưới tác dụng nguyên liệu của chúng, ví dụ: thiên niên kiện, bạch chỉ, thảo quả, hồi, quế… Tuy nhiên người ta không dùng loại tinh dầu nguyên chất như tinh dầu tẩy giun cất ra từ hoa hay quả của cây Chenopodium ambrosivides L. Tinh dầu bạc hà pha thành dầu xoa bóp để trị các bện về viêm khớp xương, giảm đau. Tinh dầu khuynh diệp nồng độ 0,5 – 1% nhỏ mũi chống cảm cúm. 11.4. Tinh dầu cho sản xuất hương liệu

Ngày nay hương liệu thiên nhiên không đủ để đáp ứng thực tế, vì vậy phần lớn hương liệu dùng trong thực tế là hương liệu nhân tạo, nghĩa là do người ta pha chế mà tạo thành. Để làm được việc đó, đáp ứng đủ nhu cầu của các ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp mỹ phẩm, thuốc là, người ta cần một lượng đơn hương rất lớn. Đơn hương là một đơn chất tinh khiết có mùi thơm, để có được các đơn hương này người ta có 2 cách điều chế, đó là lấy từ tinh dầu, làm cho giá trị của tinh dầu được nâng cao. Ví dụ tinh dầu màng tang chứa 40 – 50% xitral chỉ có 25.000 đ/kg, trong khi đó xitral tách từ tinh dầu này có độ tinh khiết 98 – 99% để làm đơn hương giá 300.000 đ/kg. Chính vì thế việc phân lập thành phần có mùi thơm của tinh dầu theo độ tinh khiết cao để làm đơn hương pha chế hương liệu là một lĩnh vực rất được quan tâm và luôn luôn cải tiến. Ba kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực này là cất phân đoạn dưới chân không cao và số đia lý thuyết lớn, sắc ký cột điều chế và lọc qua màng rây phân tử.

183

Chương 12 MỘT SỐ CHUYỂN HOÁ TINH DẦU 12.1. Mục đích, thành phần và khả năng chuyển hoá

12.1.1. Mục đích của chuyển hoá Chuyển hoá tinh dầu nhằm mục đích nâng cao khả năng ứng dụng của tinh dầu, mở rộng phạm vi ứng dụng của tinh dầu và làm tăng giá trị kinh tế của nó. Để đạt được mục đích này người ta chú ý đến các hướng chuyển hoá sau đây: – Chuyển hoá các thành phần không có giá trị sử dụng cho hương liệu, mỹ phẩm thành nguyên liệu quý cho hương liệu và mỹ phẩm. – Chuyển hoá các thành phần không dùng được cho công nghệ thực phẩm thành chất thơm cho công nghệ này. – Chuyển hoá các thành phần của tinh dầu thành chất làm thuốc hay tăng hoạt tính sinh học của nó. – Các chuyển hoá nhằm mục đích khác.

12.1.2. Thành phần của tinh dầu cần phải chuyển hoá Các thành phần có hàm lượng lớn mà không có giá trị sử dụng và giá trị kinh tế nhưng có khả năng chuyển hoá là các thành phần của tinh dầu cần chuyển hoá trước tiên.

12.1.3. Khả năng chuyển hoá Khả năng chuyển hoá của tinh dầu là tổng khả năng chuyển hoá của các thành phần của tinh dầu và khả năng chuyển hoá của mỗi thành phần. Khả năng chuyển hoá của một thành phần là căn cứ vào thành phần phân tử, nhóm chức có trong phân tử và cấu tạo phân tử của thành phần đó. Ví dụ khả năng chuyển hoá của eugenol là khả năng chuyển hoá của nhóm hiđroxy, của nhóm metoxy, của nhóm propenyl và của nhân benzen. 184

12.2. Một số chuyển hoá của các tinh dầu

12.2.1. Chuyển hoá citral của tinh dầu màng tang (Litsea cubeba) Citral là thành phần chính của tinh dầu màng tang (60 – 80%). Để có citral sạch phục vụ cho chuyển hoá, người ta cất phân đoạn tinh dầu màng tang sau khi đã loại axit và làm khô trên cột cất phân đoạn có hiệu lực cao ở áp suất 12 mmHg và lấy phân đoạn sôi 110 – 112oC/12 mmHg, 20 d15 4 0,8895, n D 1,4891 là các citral (a) dạng α và β và lấy phân đoạn sôi 20 102 – 104oC/12 mmHg, d15 4 0,8910, n D 1,4900 là các citral (b) dạng α

và β không lấy phân đoạn thấp hơn vì đó là isocitral. Bản thân citral là một hương liệu quý, nó có trong tinh dầu chanh, vỏ chanh và rất nhiều tinh dầu khác với hàm lượng thấp nhưng khi chuyển hoá citral thành ionon thì giá trị của nó tăng lên hàng trăm lần vì ionon là một hương liệu quý và rất đắt. a) Chuyển hoá citral thành ionon Dưới tác dụng của xúc tác kiềm, citral ngưng tụ với axeton cho pseudoionon, đồng phân hoá pseudoionon người ta thu được ionon là một hương liệu quý phái. CHO + CH3

CH3

Citral KOH

O CH3 Pseudoionon

α-ionon

β-ionon

γ-ionon

185

Trong 3 sản phẩm trên, β-ionon có mùi hấp dẫn nhất, ưa chuộng nhất nên người ta chuyển hoá α-ionon thành β-ionon bằng cách đồng phân hoá có H2SO4 làm xúc tác: H2SO4

COCH3

α-ionon

COCH3 β-ionon

Ngoài sản phẩm α-ionon, β-ionon và γ-ionon còn có sản phẩm phụ neo-α-ionon và neo-β-ionon. b) Chuyển hoá citral thành geraniol Khác với các phương pháp khử khác, phản ứng khử MerweinPondorff-Verleiy khử nhóm cacbonyl thành nhóm cacbinol nhưng bảo toàn liên kết đôi α, β của nó, vì thế người ta dùng phản ứng này để khử citral thành geraniol, nó là một thành phần chính của tinh dầu hoa hồng. [(CH3)2CHO]3Al

CHO β-Citral d¹ng a

CH2OH Geraniol

c) Nâng cao giá trị tinh dầu sả chanh (Cymbopogon citratus Stapf) Tinh dầu sả chanh có 2 thành phần chính là citral và geraniol. Geraniol là thành phần chính của tinh dầu hoa hồng, có mùi thơm đặc biệt, hấp dẫn, trong khi đó citral lại có mùi hắc hơi khó chịu, vì thế giá trị của tinh dầu sả chanh kém xa tinh dầu sả hoa hồng (Cymbopogon martini J.F. Watson) vì tinh dầu của loại sả này là citronelol, geraniol…Vì thế, để nâng cao giá trị tinh dầu sả chanh người ta cất phân đoạn tinh dầu này và lấy phân đoạn sôi 96 – 102oC/12 mmHg. Ở phân đoạn này citral chiếm tới 50 – 60%, sản phẩm còn lại là geraniol. Khử hoá phân đoạn này theo phương pháp trên hay phương pháp điện hoá chúng ta thu được sản phẩm mà geraniol chiếm đến 95%).

12.2.2. Chuyển hoá eugenol của tinh dầu hương nhu (Ocimum) Ở nước ta có 2 loại hương nhu: hương nhu trắng (Ocimum sanctum L.) và hương nhu tía (Ocimum gratissimum L.). Hàm lượng tinh dầu

186

hương nhu trắng cao hơn tinh dầu hương tía, thành phần chính của tinh dầu hương nhu là eugenol (40 – 65%). Để có eugenol sạch dùng cho chuyển hoá, người ta hoà tan tinh dầu hương nhu vào dung dịch KOH 4% (pH = 10) rồi chiết bỏ phần không tan bằng dung môi n-hexan hay toluen, sau đó axit hoá bằng H2SO4 đến pH = 4 rồi chiết bằng etylaxetat, làm khô, loại dung môi, thu eugenol thô, cất phân đoạn lại eugenol thô, lấy phân đoạn sôi ở 106oC/4 mmHg, d 20 4 1,0664; n 20 D 1,5410. Đó là eugenol tinh khiết dùng cho chuyển hoá. a) Chuyển hoá eugenol thành chất dụ dẫn Metyleugenol là một chất dụ dẫn các loại ruồi vàng hại cây ăn quả họ citrus và các loại quả khác. Để tiêu diệt loại ruồi này người ta cho metyleugenol vào các bẫy có chất diệt côn trùng, vì bị mê mẩn với chất metyleugenol ruồi vàng bay vào bẫy nên bị nhiễm độc và chết. Như thế, một vườn cam, quýt, bưởi, chanh rộng hàng chục hecta chỉ cần 5, 6 bẫy là đủ diệt ruồi vàng, bảo vệ quả mà không cần dùng nhiều thuốc nên không gây ô nhiễm môi trường, an toàn cho người sử dụng và giá thành hạ. Người ta dùng MeI hay (CH3)2SO4 để metyl hoá nhóm OH tạo nên metyleugenol: CH2CH CH2

CH2CH CH2 NaOH

Eugenol

CH2

CH3I

OCH3 OH

CH2CH

OCH3 ONa

OCH3 OCH3 Metyleugenol

b) Chuyển hoá eugenol thành vanillin Vanillin là một đơn hương, đồng thời là một định hương, nó được dùng rất phổ biến trong công nghệ thực phẩm với một lượng lớn. Vanillin có trong thiên nhiên, nhưng không đủ đùng trong công nghiệp nền người ta tìm mọi cách tổng hợp nó. Có nhiều con đường tổng hợp vanillin: từ lignin phế thải của nhà máy giấy, từ goaiacol và từ eugenol. Người ta đồng phân hoá eugenol thành isoeugenol dưới tác dụng của kiềm và nhiệt, sau đó dùng các tác nhân oxi hoá khác nhau để oxi hoá isoeugenol thành vanillin:

187

CH2CH CH2

KOH/EtOH

CHO O3

OCH3

CH3

OCH3

Eugenol

Isoeugenol

Vanillin

12.2.3. Chuyển hoá α-pinen của tinh dầu thông (Pinus) Ở Việt Nam có 7 loại thông khác nhau, mọc hoang và trồng trên 360.000 ha, nhưng có 3 loại phổ biến nhất là: thông nhựa (Pinus merkusii Junghuln & de Vriese), thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gardon) và thông đuôi ngựa (Pinus masoniana Lam). Loài thông nhựa cho nhiều nhựa nhất. Trong nhựa thông có 2 phần: phần nhựa gọi là colophan (> 60%) và phần tinh dầu gọi là tecpentin (≤ 35%). Thành phần chính của tinh dầu thông là α-pinen (65 – 75%). Hàng năm chúng ta sản xuất được trên 2.500 tấn nhựa thông. Như thế đây là một nguồn nguyên liệu quý, nếu biết sử dụng nó sẽ mang lại lợi ích to lớn. Để có α-pinen cho chuyển hoá, người ta cất phân đoạn tinh dầu thông trên cột cất có hiệu lực cao và lấy phân đoạn sôi 65 – 67oC/10 mmHg có 20 d 20 4 0,8585; n D 1,4557. a) Chuyển hoá α-pinen thành camphor α-Pinen có nhiều nhưng ít giá trị, còn camphor là một dược liệu có nhu cầu lớn. Vì vậy, chuyển hoá α-pinen thành camphor là cần thiết và khả thi. Có 2 cách tiến hành: (i) Lúc đầu người ta chuyển α-pinen thành bocneol, sau đó oxi hoá bocneol thành camphor.

Cl H CH3COOONa

HCl

α-Pinen

OCOCH3 H

OH H Bocneol

188

Camphor

(ii) Chuyển hoá α-pinen thành camphen theo phương pháp Tiensco, rồi chuyển camphen thành este của axit fomic, thuỷ phân, đồng phân hoá thành bocneol để oxi hoá thành camphor. O HO C O H

H NaOH

α-Pinen

OH H Bocneol

Camphor

b) Chuyển hoá α-pinen thành tecpinhiđrat Tecpinhiđrat là nguyên liệu làm thuốc và là chất trung gian cho nhiều sản phẩm tổng hợp khác như tecpineol, cineol… Người ta hiđrat α-pinen với sự có mặt H2SO4 để tạo ra sản phẩm tecpylmono hay đisunphat, sau đó thuỷ phân thu tecpinhiđrat. OSO3H HOSO3H

OSO3H

HOSO3H

α-Pinen

Tecpinhi®rat

12.2.4. Chuyển hoá safrol của tinh dầu rẻ hương (xá xị) (Cinnamomum parthenoxylon Meisn) Cây rẻ hương rất phổ biến trong rừng của nước ta, đặc biệt là rừng các tỉnh miền Bắc và miền Trung. Trong rễ và lõi gỗ cây rẻ hương có hàm lượng tinh dầu rất cao (rễ 1 – 3%, gỗ 0,5 – 1%). Thành phần chính của tinh dầu là safrol (75 – 80%). Bản thân safrol đã có giá trị nhưng chuyển hoá thành heliotropin còn có giá trị hơn hàng trăm lần. Để có safrol tinh khiết cho chuyển hoá, người ta cất phân đoạn tinh dầu 20 rẻ hương và lấy phân đoạn 106,4oC/10 mmHg, d 20 4 1,100; n D 1,5360. 189

Để chuyển hoá safrol thành heliotropin, người ta tiến hành qua 2 giai đoạn. Đồng phân hoá safrol thành isosafrol, sau đó oxi hoá isosafrol bằng các tác nhân khác nhau thành heliotropin. CH2CH

CH2

CH CHCH3

CHO

KOH/EtOH

O O

Safrol

O O

Isosafrol

Heliotropin

12.2.5. Chuyển hoá linalool của tinh dầu cây mùi (Coriondrum Sativum L.) Thân, hoa và quả cây mùi có hàm lượng tinh dầu lớn (1 – 2%). Thành phần chính của tinh dầu này là linalool (60 – 70%). Cất phân đoạn tinh dầu hạt mùi ở áp suất 3 mmHg trên cột cất 12 đĩa lý thuyết, chỉ số hồi trên 1/5 và lấy phân đoạn sôi 59 – 60oC/3 mmHg, d 620 0,8652; n 20 D 1,4638, người ta thu được linalool để dùng cho chuyển hoá. Linalool có mùi tốt, êm dịu và có trong nhiều loài hoa nhưng linaloyl axetat có mùi tốt hơn, êm dịu hơn, hấp dẫn hơn. Linaloyl axetat thu được bằng cách axyl hoá linalool trong môi trường kiềm bằng anhiđrit axetic. OH

OCOCH3 (CH3CO)2O pyri®in

Linalool

Linaloy axetat

12.2.6. Chuyển hoá zerumbon của tinh dầu gừng gió (Zingiber zerumbet J.E.Sm) Gừng gió là cây thuốc dân tộc, nó có nhiều nơi ở nước ta, nhất là vùng Bình Trị Thiên và Tam Đảo. Tinh dầu thân củ gừng gió có hàm lượng zerumbon rất cao (70 – 80%). Zerumbon có tác dụng kháng khuẩn, chống oxi hoá, chống và phòng ngừa tái phát ung thư. Nhóm chức sinh học của zerumbon là xeton vòng α,β-không no. Nó không tan trong nước do đó xâm nhập vào cơ thể khó, đó là lý do mà người ta chuyển hoá nó 190

thành chất dễ tan hơn với hi vọng làm tăng hoạt tính sinh học của nó và dễ sử dụng hơn. Phân tử zerumbon có 3 liên kết đôi, nhưng 2 liên kết đôi tham gia vào nhóm chức sinh học, còn 1 liên kết đôi ở C2 – C3 có thể chuyển hoá được. Để chuyển hoá liên kết đôi này người ta oxi hoá nó, sau đó thế ái nhân để tạo ra các nhóm phân cực, làm tăng tính tan của phân tử. 4 3

7 6 2 1

8 9

10 11

OR HO R: CH3, C2H5, glucosit...

Tất nhiên còn rất nhiều hương chuyển hoá khác đối với zerumbon.

191

Chương 13 ỨNG DỤNG CỦA CHẤT THƠM 13.1. Kỹ thuật pha chế hương liệu

13.1.1. Khả năng pha chế hương liệu Cần nhớ rằng trong thiên nhiên không có mùi của một đơn hương, mà hầu hết mùi trong thiên nhiên là mùi của một số hỗn hợp nhiều đơn hương. Trong thực tế sử dụng cũng vậy, người ta thường sử dụng mùi của hỗn hợp nhiều chất, ít khi sử dụng mùi của một đơn chất. Chính vì các lý do trên mà người ta quan tâm nhiều nhất đến hỗn hợp nhiều đơn hương. Một vấn đề được đặt ra là có một số đơn hương nhất định cùng các điều kiện khác nhau cho phép thì có bao nhiêu hỗn hợp hương liệu có thể pha chế được. Trước lúc giải quyết vấn đề này cần lưu ý rằng: mùi đặc trưng của một hỗn hợp là mùi của thành phần có cường độ mùi lớn nhất và hàm lượng nhiều nhất. Nói như thế có nghĩa là mùi của một hỗn hợp phụ thuộc vào số thành phần của hỗn hợp và vào nồng độ của mỗi thành phần trong hỗn hợp. Chính vì có 2 thông số biến thiên như vậy mà khả năng pha chế các hương liệu (số hỗn hợp chất thơm thu được) từ một số đơn hương cho trước là rất lớn. Ví dụ có 7 đơn hương sau: (1) limonen (mùi chanh); (2) etyl butyrat (mùi dứa chín); (3) isoamyl axetat (mùi chuối chín); (4) isoamyl isovalerat (mùi táo chín); (5) γ-nonalacton (mùi dứa); (6) γ-undecalacton (mùi đào chín); (7) metyl antranilat (nùi hoa bưởi). Pha chế 7 đơn hương này để tạo ra các hỗn hợp chất thơm chính là bài toán tổ hợp của 7 đơn hương mà chúng ta có công thức tổng quát: n! Ckn = (n − k)!k!

trong đó n và k đều là số dương tự nhiên và n > k. Kết quả tính toán cho thấy tổng số các hỗn hợp thu được là 127. Rõ ràng đây là một con số rất lớn. Hơn thế trong mỗi hỗn hợp mùi sẽ thay đổi khi nồng độ của các thành phần của nó thay đổi. Rõ ràng từ 7 đơn hương trên và các dung môi nhất định cần thiết, chúng ta có thể pha chế rất nhiều hương liệu. 192

Ví dụ chúng ta có hỗn hợp: Isoamyl axetat 7%; Etyl butyrat 0,8% γ-Nonalacton 1,8%; Vanillin 0,4% Cồn 96 90% Hỗn hợp này có mùi chuối chín rõ rệt. Nhưng khi giảm nồng độ isomayl axetat xuống 1,8%, tăng etyl butyrat lên 7% thì hỗn hợp lại có mùi dứa chín đặc trưng.

13.1.2. Kỹ thuật pha chế hương liệu a) Khái niệm nhũ tương Nhũ tương là một hỗn hợp 2 chất lỏng không trộn lẫn vào nhau mà phân tán vào nhau. Những chất lỏng trộn lẫn được vào nhau không tạo được nhũ tương mà tạo thành dung dịch trong suốt, đồng nhất, ví dụ nước và cồn. Những chất lỏng không trộn lẫn được vào nhau thì tạo thành nhũ tương, nghĩa là chúng phân tán vào nhau tạo thành dung dịch đục không đồng nhất, có khả năng phân lớp thành 2 pha riêng biệt. Nghiên cứu nhũ tương dưới kính hiển vi cho thấy nhũ tương có rất nhiều phần tử nhỏ hình cầu có đường kính khác nhau tồn tại trong môi trường lỏng. Như thế trong nhũ tương có 2 pha. Chất lỏng của nhũ tương mà tồn tại dưới dạng hình cầu nhỏ riêng biệt gọi là pha gián đoạn.

Chất lỏng kia bao quanh các hình cầu nhỏ tồn tại liên tục gọi là pha liên tục. Pha gián đoạn ở bên trong pha liên tục nên có khi người ta còn gọi nó là pha trong, còn pha liên tục gọi là pha ngoài. b) Điều chế Nếu có 2 chất không trộn lẫn vào nhau, ví dụ dầu (D) và nước (N) thì chúng ta có thể điều chế được 2 dạng nhũ tương. Dạng thứ nhất dầu hoà vào nước, phân tán trong nước (tất nhiên lượng dầu ít hơn lượng nước) gọi là nhũ tương dầu - nước (D/N). Dạng thứ hai nước được nhũ hoá trong dầu, phân tán trong dầu (tất nhiên lượng nước ít hơn lượng dầu) gọi là nhũ tương nước - dầu (N/D). c) Phân loại Để phân loại nhũ tương người ta căn cứ vào đặc tính của pha ngoài. Ví dụ, để nhận ra nhũ tương D/N người ta thử tính dẫn điện và nhuộm màu với chất màu tan trong nước, nếu cả 2 tín hiệu này dương tính thì đó là nhũ tương D/N. Ngược lại, để nhận ra nhũ tương N/D thì người ta

193

cũng thử tính dẫn điện và chất màu tan trong dầu, nếu tính dẫn điện không có và chất màu có tín diệu dương thì đó là nhũ tương N/D. d) Độ bền Độ bền của nhũ tương phụ thuộc vào tỷ trọng của các cấu tử, vào độ nhớt, vào tỷ lệ giữa các thành phần và kỹ thuật điều chế nhũ tương. Nếu các cấu tử tham gia tạo thành nhũ tương có tỷ trọng gần bằng nhau, có độ nhớt lớn, tỷ lệ về thể tích giữa chúng khác nhau nhiều, kỹ thuật phân tán tốt để phần tử có thể tích ít phân tán thành các tiểu cầu càng bé càng tốt trong cấu tử kia thì nhũ tương thu được rất bền. Như thế có thể nói nhũ tương bền là nhũ tương luôn luôn tồn tại 2 pha lẫn lộn: pha gián đoạn và pha liên tục. Nhũ tương bền là nhũ tương không bị phân lớp thành 2 lớp riêng biệt, đồng nhất và độ lập với nhau qua mặt phân cách. Quá trình phân lớp của nhũ tương phụ thuộc vào quá trình kết hợp của các tiểu cầu trong nhũ tương, nghĩa là phụ thuộc vào nồng độ của tiểu cầu, tốc độ chuyển động để va chạm lẫn nhau, kết hợp lẫn nhau, vào việc liên kết giữa các phần tử của tiểu cầu và nhất là vào độ chênh lệch về tỷ trọng của cấu tử tạo ra tiểu cầu và tỷ trọng của cấu tử tạo ra môi trường. e) Phá nhũ tương Nhũ tương là một hiện tượng thường gặp trong thực tế, đặc biệt trong pha chế hương liệu. Trong thực tế sản xuất cũng có lúc người ta dùng hương liệu dưới dạng nhũ tương bền, nhưng hầu hết là hương liệu dưới dạng dung dịch đồng nhất 1 pha trong suốt. Vì thế kỹ thuật phá nhũ tương trong pha chế hương liệu rất quan trọng. Nguyên nhân tạo nhũ tương là tương tác đồng loại khác tương tác khác loại, nói một cách khác tính chất hiđrophyl hay hiđrophob của các cấu tử tham gia nhũ tương quá khác nhau nên chúng không thể tương tác với nhau để trộn lẫn vào nhau nên chúng tồn tại độc lập với nhau theo pha của mình và tạo nên nhũ tương. Ví dụ trong nhũ tương D/N, dầu có tính hiđrophob quá mạnh còn nước thì mang tính hiđrophyl quá mạnh, 2 cấu tử này ở 2 cực khác nhau nên không thể tương tác với nhau, liên kết với nhau để trở thành một pha trong suốt mà phải tồn tại độc lập với nhau theo pha của mình trong cùng một hỗn hợp nhũ tương. Để phá hiện tượng này người ta cần một chất trung gian vừa có tính hiđrophob để liên kết chặt chẽ với dầu, vừa co tính hiđrophyl để hoà tan vào nước, chính sự tương tác này làm cho dầu và

194

nước trộn lẫn hoàn toàn vào nhau xoá nhoà ranh giới pha để tạo thành một pha đồng nhất trong suốt và hiện tượng nhũ tương không còn nữa. Chất như vậy gọi là chất phá nhũ. Ví dụ trong nhũ tương isoamyl axetat và nước thì etanol là chất phá nhũ vì trong phân tử etanol vừa có nhóm etyl là nhóm hiđrophob, nó liên kết chặt chẽ được với isoamyl axetat, vừa có nhóm hiđroxyl là nhóm hiđrophyl nên nó liên kết được với nước, nhóm này làm cho phân tử etanol tan tốt vào nước nhờ liên kết hiđro với nước. Quá trình này làm cho isoamyl axetat tan theo etanol vào nước và như vậy xoá nhoà pha tiểu cầu isoamyl axetat, dung dịch trở thành một pha liên tục và trong suốt. Để chọn một chất phá nhũ tương thích hợp, người ta căn cứ vào thành phần cấu trúc phân tử, tính chất vật lý và hoá học của các cấu tử tham gia tạo nhũ tương. 13.2. Pha chế hương liệu

a) Xác định tỷ lệ của các thành phần để pha chế Ví dụ đơn giản có 3 thành phần: etyl butyrat có mùi dứa, nước và cồn. Vậy nên chọn tỷ lệ pha chế thế nào? Trước hết qua cấu tạo phân tử ta biết ngay etyl butyrat không tan trong nước nhưng tan tốt trong cồn 96o, còn cồn thì tan tốt trong nước. Vì etyl butyrat không tan trong nước nên tạo nhũ tương được với nước, hơn nữa nó là đơn hương nên không thể là thành phần có lượng lớn trong hỗn hợp, vì thế ta xác định một tỷ lệ theo ý muốn giữa etyl butyrat và nước, chuẩn độ, tỷ lệ 5/20 (V/V), vừa khuấy mạnh 20 phần nước vừa cho từ từ vào đó 5 phần etyl butyrat so cho tạo được nhũ tương tốt etyl butyrat - nước. Tiếp theo vừa khuấy đều vừa cho EtOH 96o từ từ vào dung dịch nhũ tương mới thu được cho đến khi dung dịch trong suốt, ghi lượng EtOH 96o cho vào, ví dụ 75 phần. Như thế tỷ lệ pha chế giữa etyl butyrat, nước và cồn 96o là 5 : 20 : 75 hay 1 : 4 : 15 (V/V).

b) Thứ tự pha chêm Để xác định được thứ tự pha chế, cần xác định vai trò các chất trong hỗn hợp pha chế. Ở đây etyl butyrat là chất tạo nhũ, nước là pha liên tục, cồn 96o là chất phá nhũ. Vậy theo tính chất của nhũ thì thứ tự pha chế tốt nhất trong trường hợp này là pha 5 thể tích etyl butyrat vào 75 thể tích cồn 96o, khuấy kỹ rồi để yên tối thiểu 1 giờ cho dung dịch ổn định, sau đó vừa khuấy kỹ vừa cho từ từ 20 thể tích nước vào dung dịch thu được. 195

13.3. Pha chế hương bắt chước và một số đơn pha chế hương bắt chước

a) Pha chế hương bắt chước Pha chế hương bắt chước là pha chế một hương liệu có mùi của một hương liệu có sẵn trong thiên nhiên. Như thế để việc bắt chước thành công thì trước hết phải có số liệu về thành phần cơ bản của hương thiên nhiên mà mình định bắt chước. Số liệu này có thể tra cứu trong các tài liệu khoa học, có phân tích định tính, định lượng các thành phần mẫu hương thiên nhiên bằng GC-MS và GC/O (GC Combined with Olfactomertry). Ví dụ, định bắt chước hương chuối chín: tìm hiểu các tài liệu về hương chuối, người ta thấy thành phần chính là isobutyl axetat, isoamyl axetat, benzyl axetat. Đối chiếu cảm nhận các đơn hương này thì thấy chỉ có isoamyl axetat mới có mùi chuối chín thực sự và trong bảng hàm lượng các thành phần hương chuối thiên nhiên nó cũng chiếm hàm lượng lớn. Do đó người ta tìm kiếm đơn hương này từ thiên nhiên hay tổng hợp hoá học. Tiếp theo người ta tìm thêm một số đơn chất có nhóm mang mùi tương tự, đó là các este, ví dụ, etyl butyrat, benzyl propionat… Một số chất định hương như vanillin, dung môi EtOH 96o, glyxerin và nước. Qua cấu trúc phân tử các chất đã có cho thấy hầu hết chúng đều tan trong EtOH. Sau đó áp dụng kỹ thuật pha chế hương liệu (như mục 13.2) để pha chế hương chuối. Sau khi pha xong cần kiểm nghiệm lại bằng phương pháp cảm quan và thống kê. Tất nhiên các hoá chất dùng phải tinh khiết và được phép dùng trong thực phẩm.

b) Một số đơn pha chế hương bắt chước Đơn 1 – Mùi táo chín Amyl valerat 300 Etyl malonat 200 Axetanđehit 100 Clorofom 50 Geranyl butyrat 45 Etyl axetat 200 Vanillin 5 Glyxerin 100 1000

196

Đơn 2 – Mùi chuối chín Isoamyl axetat 300 Amyl butyrat 100 Bezanđehit 15 Benzyl propionat 40 Etyl butyrat 200 Etyl sebacat 100 Dầu đinh hương 20 Dầu hạnh nhân 20 Vanillin 5 800

Đơn 3 – Mùi dứa chín Etyl butyrat 400

Đơn 4 – Mùi nho chín Amyl butyrat 100

Amyl butyrat Etyl axetat Axetanđehit CHCl3 Dầu chanh Propyl valerat Vanillin

Etyl axetat Etyl octanoat Etyl pelagomat Etyl fomat Metyl salixylat Axetanđehit Axit sucxinic

300 200 30 50 100 50 30

Octyl valerat Vanillin Glyxerin

10 5 120

300 50 60 50 20 100 20 1000

995

Đơn 5 – Mùi dâu chín Etyl butyrat 200

Đơn 6 – Mùi đào chín γ-Undecalacton 500

Etyl axetat Etylmetylphenyl ete Glyxidat Etyl belargonat Etyl fomat Benzyl axeton Etyl benzoat Metylnaphtyl xeton

Amyl axetat Amyl fomat Benzanđehit Benzyl xinnamat Etyl ocnantat Etyl butyrat Etyl valerat Vanillin

Metyl salixylat Tinh dầu quế Coumarin

300 80 100 100 10 30 130 10 20 10 10

150 50 10 40 50 50 50 100 1000

1000

197

Đơn 7 – Mùi mận Axetanđehit

Etyl axetat Etyl butyrat Etyl fomat Etyl ocnantat Benzanđehit γ-Nonalacton Tinh dầu quýt Vanillin Glyxerin

250 250 100 50 200 20 5 10 5 110

Đơn 8 – Mùi mơ chín Etyl butyrat 200

Etyl valerianal Amyl bentyrat Etyl salixylat Etyl ocnantat Clorofom Undecalacton Vanillin Tinh dầu nhài Glyxerin

300 70 50 30 50 10 10 20 260

1000

Đơn 9 – Mùi chanh quả Metyl heptanon 0,5

Đơn 10 – Mùi cà phê rang Dịch cà phê cô đặc 2167,5

Terpineol Linalool Anđehit C10 Anđehit C8

1 1 1,25 1,25

Etyl fomat Điaxetyl Tional Propylenglycol

Geranyl axetat

1,75

Xitral Tinh dầu chanh Apenxin

60 100 833,25 1000

198

28,4 3,5 1,7 1374,9 3576

Đơn 11 – Mùi lựu α-Ionon

Đơn 12 – Mùi caramen Heliotropin 23,5

β-Ionon Nerolin Heliotropin Anđehit C14 Amyl butyrat Vanillin Etyl axetat

Etyl vanillin Vanillin Dầu chanh Etyl butyrat Điaxetyl Cồn 95% Ronio ete

Etyl butyrat Etyl enantat Khi sử dụng lấy 200 ml hỗn hợp trên pha thêm 800 ml EtOH 95o

4,0 23,5 4,0 31,0 54,5 117,0 132,75 147,0

38,0 333,5 5,0 5,0 5,0 346,8 233,5

267,5 7,85

1000

Đơn 13 – Mùi socola Amyl axetat 113,5

Đơn 14 – Mùi cacao Nước cất cacao 2720

Vanillin Anđehit C18 Anđehit C14 n-Butylphenyl axetat

Propylenglycol Vanillin Amylphenyl axetat Benzyl butyrat

Propylenglycol Dịch chiết cacao

118,5 3,5 35,0 14,0 1360,0

1500 170 130 7 4527

2722 4330

199

Đơn 15 – Mùi tỏi Đialyl sunfat

Allyl mecaptan Đimetyl sunfit Axit axetic băng

90 5 2 3 100

Đơn 16 – Mùi mật ong Metyl axetophenon 0,375

Dầu gerani Etyl vanillin Axit phenyl axetic

0,375 6,000 12,000

Metyphenyl axetat Etyl perlagonat Etyl axetat Amyl axetat Amyl valerat EtOH 95o

12,625 31,25 100 187 250 400 1000

Đơn 17 – Mùi hoa nhài Lynalyl axetat 1,75

Đơn 18 – Mùi hoa hồng Xitronelol 250

Benzyl butyrat Benzyl benzoat Benzyl axetat Benzyl fomat Xitronelyl axetat Dầu nhài Dầu lan Ancol benzylic Ancol phenylpropylic

Ancol phenyletylic Geraniol Rodinol Eugenol α-Ionon Ancol xinnamic Axit phenyl axetic Phenyl axetanđehit Anđehit undecylenic

Linalool Geramyl axetat Xitronelol Indol Ancol xinnamic

2,50 12,20 4,75 9,70 6,00 86,50 17,0 7,85 12,10 12,20 22,00 25,25 231,00 210,00 1000

200

100 250 200 5 70 50 40 3 2 970

Đơn 19 – Mùi hoa dạ hương Benzyl axetat 175

Đơn 16 – Mùi hoa huệ Benzyl axetat 25

Linalool Ancol phenylic Heliotropin Ancol xinnamic Isoeugenol Phenyl axetanđehit

100 40 180 330 5 100

Linalool Đimetylbenzylcacbinol Bergamo Xitronellyl fomat Rodinol Heliotropin

30 50 20 20 150 40

930

Ancol xinnamic Hiđroxyxitronelol ete

150 515 1000

201

202

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

Lã Đình Mỡi (chủ biên) và cộng sự, Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam, Tập I, II, Nxb Nông nghiệp, 2001.

Đặng Như Tại, Cơ sở hoá lập thể, Nxb Giáo dục, 1998.

Nguyễn Đình Triệu, Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hoá hữu cơ, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, 1999.

Văn Ngọc Hướng, Hương liệu và ứng dụng, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, 2003.

René Cerbelaud, Hương liệu trong mỹ phẩm và thực phẩm, 1992.

Tiếng Anh

Erich Ziegler, Herta Ziegler, Flavourings Production, Composition Aplication, Willy WCN, Weiheim, New York, 1998.

Joserph Merory, Food Flavouring, Composition Manufacture and Use, AVI Publishing Company Inc., 1960.

William A.Paucher, Perfumes Comesties and Soaps, Vol I, II, Chapman & Hall Ltd., 1959.

P.M. Muller, D. Lampossky, Perfumes-Art, Science & Technology, Elsevier Applied Science, London & New York, 1991.

10. Jimmy L.Humphsey, Geoge E.Kller, Separation Process Technology, McGraw-Hill, New York-Sydney-Tokyo-Toronto, 1998. 11. R. Blackwell Smith, Orzanization of the Food Chemical Codex, 1966 – 1972, Midland, 1972. 12. Andrew J.Taylor, Food Flavour Technology, CRC Press, 2002. Tiếng Nga

13. M. Gariaev, I. Pliva: Metơđư issleđovania efir masel, Almaata, 1992. 14. G.A. Melemtieva, Farmatseptisáetheskaia khimia, Tom I, II, Mosskva-Meditsina, 1976. 203