ĐỊNH LƯỢNG CLOBETASOL PROPIONAT
vectorstock.com/24597468
Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLOBETASOL PROPIONAT TRONG DẦU GỘI ĐẦU BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM
Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594
BỘ QUỐC PHÒNG
AL
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
NH ƠN
OF
ĐINH THỊ KHÁNH LY
FI
CI
HỌC VIỆN QUÂN Y
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
QU Y
CLOBETASOL PROPIONAT TRONG DẦU GỘI ĐẦU BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
DẠ Y
KÈ
M
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC
HÀ NỘI – 2022
BỘ QUỐC PHÒNG
AL
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
NH ƠN
OF
ĐINH THỊ KHÁNH LY
FI
CI
HỌC VIỆN QUÂN Y
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
QU Y
CLOBETASOL PROPIONAT TRONG DẦU GỘI ĐẦU BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
DẠ Y
KÈ
M
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC
Cán bộ hướng dẫn: TS. Trần Quang Trung
HÀ NỘI – 2022
AL
LỜI CẢM ƠN
CI
Em xin cảm ơn chân thành đến TS Trần Quang Trung, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, quan tâm và chỉ bảo, giúp đỡ em để hoàn thành tốt khóa luận này.
OF
FI
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc Học viện Quân y, Phòng Đào tạo đại học cùng toàn thể các thầy cô giáo đang hoạt động, giảng dạy tại Học Viện Quân Y, đặc biệt là thầy cô Viện Đào tạo Dược. Cảm ơn thầy cô về những kiến thức và kĩ năng mà các thầy cô đã trang bị, truyền đạt cho chúng em trong suất quá trình học tập tại ngôi trường.
NH ƠN
Với lòng biết ơn vô hạn em xin được gửi tới ông bà, bố mẹ, anh chị em, bạn bè và những người thân yêu nhất luôn bên cạnh em và ủng hộ em hết lòng trên con đường học tập cũng như trong suốt quá trình làm khóa luận. Mặc dù đã cố gắng hoàn thành khóa luận trong phạm vi và khả năng cho phép nhưng chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót.
QU Y
Cuối cùng, em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc, công tác tốt và gặt hái được nhiều thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống.
DẠ Y
KÈ
M
Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 7 năm 2022 Sinh viên
Đinh Thị Khánh Ly
AL
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC HÌNH
FI
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
CI
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
OF
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN ........................................................................... 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ CLOBETASOL PROPIONAT ......................................... 2 1.1.1. Đặc điểm chung ......................................................................................... 2
NH ƠN
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng......................................................................... 3 1.1.3. Chỉ định – Liều dùng .................................................................................. 3 1.1.4. Độc tính của Clobetasol propionat .............................................................. 4 1.1.5. Một số chế phẩm dầu gội đầu chứa Clobetasol propionat trên thị trường....... 4 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG CLOBETASOL PROPIONAT . 4
QU Y
1.3. SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ......................................................... 6 1.3.1. Phương pháp HPLC ................................................................................... 6 1.3.2. Cấu tạo máy HPLC .................................................................................... 7 1.3.3. Các thông số đặc trưng trong HPLC ............................................................ 9
M
1.3.4. Ứng dụng của HPLC ................................................................................ 12
KÈ
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU14 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU.................................. 14 2.1.1. Nguyên vật liệu, hóa chất nghiên cứu ........................................................ 14
DẠ Y
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ................................................................................... 14 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 15 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 15 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 16
AL
2.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ........................ Error! Bookmark not defined. 2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ......................................................................... 16
CI
2.2.3. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu .................................................................... 18
2.2.4. Thẩm định phương pháp định lượng Clobetasol propionat trong dầu gội đầu19
FI
2.2.5. Định lượng Clobetasol propionat trong dầu gội đầu ................................... 23
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ......................... 24
OF
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................... 24 3.1.1. Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký.............................................................. 24 3.1.2. Kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu ........................................................ 30
NH ƠN
3.1.3. Kết quả thẩm định phương pháp ............................................................... 31 3.1.4. Định lượng các chế phẩm Dầu gội đầu chứa CLP trên thị trường................ 38 3.2. BÀN LUẬN ............................................................................................... 41 3.2.1. Về xây dựng quy trình phân tích ............................................................... 41 3.2.2. Về phương pháp xử lý mẫu ....................................................................... 41
QU Y
3.2.3. Về thẩm định phương pháp ....................................................................... 42 3.2.4. Về kiểm tra các mẫu dầu gội đầu lưu hành trên thị trường .......................... 42
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 45 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 47
M
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
DẠ Y
KÈ
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
Bảng
AL
DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng
Trang
1.1
Một số tính chất của CLP
1.2
Một số chế phẩm dầu gội đầu chứa clobetasol propionat trên thị trường
1.3
Một số nghiên cứu về định lượng CLP
2.1
Các nguyên vật liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
14
2.2
Các mẫu dầu gội đầu chứa CLP được sử dụng để định lượng
15
2.3
Các thông số của cột được khảo sát
16
2.4
Dãy dung dịch CLP chuẩn
21
3.1
Kết quả khảo sát hiệu lực cột
25
3.2
Kết quả khảo sát thành phần pha động
27
3.3
Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động ACN:H2O
28
3.4
Kết quả khảo sát tốc độ dòng
30
3.5
Kết quả lựa chọn dung môi chiết mẫu
31
3.6
Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu
32
3.7
Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống
33
3.8
Xây dựng đường chuẩn CLP
36
3.9
Kết quả khảo sát độ đúng
37
Kết quả khảo sát độ lặp lại của mẫu thử
37
CI
FI
OF
NH ƠN
QU Y
M
KÈ
3.10
2 4 5
Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của mẫu thử
38
3.12
Hàm lượng CLP xác định được trong 2 ngày
38
3.13
Kết quả khảo sát LOD và LOQ
29
3.14
Kết quả định lượng CLP trong dầu gội SnowClear
40
3.15
Kết quả định lượng CLP trong dầu gội Jassuny
40
3.16
Kết quả định lượng CLP trong dầu gội Baroka
41
DẠ Y
3.11
Hình
AL
DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình
Trang
1.1
Cấu trúc hóa học của clobetasol propionat
1.2
Cấu tạo máy HPLC
3.1
Phổ UV của dung dịch CLP chuẩn 20µg/ml
3.2
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP khi sử dụng cột Phenomenex LUNA
3.3
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP khi sử dụng cột SunfireTM
26
3.4
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động MeOH: H2O (80/20,v/v)
27
3.5
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (60/40,v/v)
27
3.6
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (55/45,v/v)
28
3.7
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (60/40,v/v)
28
3.8
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (65/35,v/v)
29
3.9
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (70/30,v/v)
29
3.10
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với tốc độ dòng 1,2ml/phút
30
3.11
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với tốc độ dòng 1,0ml/phút
30
3.12
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với tốc độ dòng 0,8ml/phút
31
CI
2 6
KÈ
M
QU Y
NH ƠN
OF
FI
25 26
Sắc ký đồ mẫu trắng MeOH
34
3.14
Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP 20µg/ml
34
3.15
Sắc ký đồ mẫu thử chứa CLP
34
3.16
Sắc ký đồ nền mẫu không chứa CLP
35
3.17
Sắc ký đồ nền mẫu thêm CLP chuẩn
35
3.18
Đồ thị quan hệ tuyến tính của diện tích peak và nồng độ CLP
36
DẠ Y
3.13
3.20
Sắc ký đồ của dầu gội đầu Jassuny
3.21
Sắc ký đồ của dầu gội đầu Baroka
40
AL
Sắc ký đồ của dầu gội đầu SnowClear
41 42
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
NH ƠN
OF
FI
CI
3.19
Viết tắt
Viết đầy đủ
CI
TT
AL
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ACN
Acetonitril
2
CLP
Clobetasol Propionat
3
FDA
Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực
4
HPLC
OF
phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ)
FI
1
High – performance Liquid Chromatography
NH ƠN
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao) 5
H2O
Nước
6
ICH
International Conference on Harmonization
LOD
Limit of Detection (Giới hạn phát hiện )
8
LOQ
Limit of Quantifitation (Giới hạn định lượng)
9
MeOH
Methanol
10
RSD
Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)
11
TKPT
Tinh khiết phân tích
12
TLTK
Tài liệu tham khảo
USP
United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)
DẠ Y
KÈ
13
QU Y
7
M
(Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người)
ĐẶT VẤN ĐỀ
CI
AL
Corticosteroid là một nhóm thuốc được chỉ định rộng để điều trị các bệnh về da liễu do có khả năng làm giảm nhanh các triệu chứng bệnh không mong muốn. Corticosteroid có hiệu quả đối với các tình trạng liên quan đến các đặc tính tăng sinh, đặc tính miễn dịch và viêm [1].
NH ƠN
OF
FI
Căn cứ vào hiệu lực, các corticosteroid được chia làm 7 loại [2]. Trong đó, clobetasol propionat là một loại corticosteroid siêu mạnh loại I và được bào chế dưới nhiều dạng khác nhau để sử dụng ngoài da (dầu gội, kem, gel, thuốc mỡ…). Clobetasol propionat đã được FDA chấp thuận vào ngày 27 tháng 12 năm 1985 [3]. Tuy nhiên, clobetasol propionat tại chỗ thường bị lạm dụng để điều trị bất kỳ vấn đề nào trên da và để lại những hậu quả nghiêm trọng. Việc sử dụng kéo dài clobetasol propionat cũng như sử dụng không đúng hàm lượng, liều lượng có thể gây ra nhiều tác dụng phụ như các phản ứng mẫn cảm trên da, teo da, ức chế vùng dưới đồi, tuyến yên, tuyến tượng thận… và nhiều hệ lụy sau này [1, 4].
M
QU Y
Theo bản cập nhật của Ủy ban Khoa học Mỹ phẩm ASEAN vào năm 2021, corticosteroid được liệt kê vào danh mục các chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm (số tham chiếu là 300, phụ lục II, phần 1) [5]. Do vậy, các sản phẩm sử dụng ngoài da có chứa thành phần clobetasol propionat đều phải đăng ký dưới dạng thuốc thì mới được phép lưu hành. Giới hạn nồng độ sử dụng an toàn cho phép của clobetasol propionat trong các chế phẩm sử dụng ngoài da là 0,05% [6]. Nhưng việc kiểm soát lượng clobetasol propionat sử dụng ngoài da ở mỗi bệnh nhân rất khó khăn do không có sự phân liều cụ thể, nhất là khi sử dụng dưới dạng dầu gội đầu. Do đó yêu cầu quan trọng đầu tiên là cần phải kiểm soát được nồng độ clobetasol propionat trong các chế phẩm ngoài da nói chung và trong dầu gội nói riêng nằm trong giới hạn cho phép để đem lại an toàn, hiệu quả cho người bệnh.
KÈ
Để góp phần vào việc quản lý sử dụng clobetasol propionat em tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng clobetasol propionat trong dầu gội đầu bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu sau:
DẠ Y
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng clobetasol propionat trong dầu gội đầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng một số dầu gội đầu có chứa clobetasol propionat trên thị trường. 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
AL
1.1. TỔNG QUAN VỀ CLOBETASOL PROPIONAT
OF
FI
CI
1.1.1. Đặc điểm chung
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của clobetasol propionat [3, 7]
NH ƠN
Tên chung quốc tế: clobetasol propionat.
Tên khoa học: 21-chloro-9-fluoro-11β, 17-dihydroxy-16β- methylpregna 1,4-diene-3, 20-dione 17-propionat [8]. Bảng 1.1. Một số tính chất của CLP Tính chất
Thông số
𝐶25 𝐻32 𝐶𝑙𝑂5 [3, 8]
Trọng lượng phân tử
466,97 Da [3]
Thể chất
Bột kết tinh trắnh hoặc gần trắng, không mùi [9]
QU Y
Công thức phân tử
196 ° C [7]
Độ tan trong nước
2μg/ml [10]
Hệ số phân dầu nước (logP)
3,5 [7]
DẠ Y
KÈ
M
Nhiệt độ nóng chảy
Clobetasol propionat (CLP) thực tế không tan trong nước, tan ít trong benzen, dietyl ete, ethanol; tan tự do trong axeton, dimetylsulfoxit, cloroform, methanol và dioxan [8, 9, 11].
2
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng
AL
1.1.2.1. Dược lực học
OF
FI
CI
Clobetasol propionat là dạng muối propionat của clobetasol, một loại corticosteroid tổng hợp tại chỗ có đặc tính chống viêm, chống ngứa và co mạch. clobetasol propionat phát huy tác dụng bằng cách liên kết với các thụ thể glucocorticoid trong tế bào chất và sau đó kích hoạt biểu hiện gen qua trung gian thụ thể glucocorticoid. Điều này dẫn đến tổng hợp một số protein chống viêm, đồng thời ức chế sự tổng hợp của một số chất trung gian gây viêm. Cụ thể, clobetasol propionat dường như tạo ra các protein ức chế phospholipase A2, do đó kiểm soát việc giải phóng axit arachidonic tiền chất gây viêm từ các phospholipid màng bởi phospholipase A2 [7, 8, 12].
1.1.2.2. Dược động học
NH ƠN
Clobetasol propionat là một dẫn xuất prednisolon có độ đặc hiệu cao hơn đối với thụ thể glucocorticoid so với thụ thể mineralocorticoid. Nó đã được chứng minh hoạt tính vượt trội so với fluocinonide và lần đầu tiên được mô tả trong tài liệu vào năm 1974 [1].
QU Y
CLP dùng tại chỗ có thể hấp thu được qua da bình thường (còn nguyên vẹn). Mức độ hấp thu tại chỗ qua da phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng thuốc bôi, tá dược dùng chế tạo thuốc, tính toàn vẹn của hàng rào biểu bì, băng kín trong thời gian lâu, mức độ viêm da, tình trạng bệnh khác ở da. Dạng thuốc gel hấp thu tốt hơn dạng thuốc kem [12].
M
Khi thuốc đã được hấp thu qua da, CLP sẽ trải qua quá trình dược động học như khi dùng toàn thân. Thuốc bị chuyển hóa chủ yếu ở gan. Sau đó, được thải trừ qua thận và một phần qua mật, rồi theo phân ra ngoài [12].
KÈ
1.1.3. Chỉ định – Liều dùng
1.1.3.1. Chỉ định
DẠ Y
CLP là một corticosteroid tác dụng tại chỗ nhóm I (tác dụng mạnh nhất). CLP thường được sử dụng để điều trị các bệnh ngoài da như vảy nến, bạch biến, chàm, viêm da dị ứng…. [1, 9].
3
AL
Điều trị tại chỗ ngắn ngày (dưới 2 tuần) đối với các biểu hiện viêm, ngứa do các bệnh da vừa hoặc nặng đáp ứng với corticosteroid, bao gồm cả các bệnh da vùng đầu, eczema kháng corticosteroid tác dụng yếu [8, 12].
CI
1.1.3.2. Liều dùng - Hàm lượng
Hàm lượng của CLP cho phép trong các chế phẩm bôi ngoài da là 0,05% [6].
FI
1.1.4. Độc tính của Clobetasol propionat
NH ƠN
OF
Dữ liệu về quá liều cấp tính của glucocorticoid rất hiếm. Dùng quá liều clobetasol propionat có thể dẫn đến ức chế trục HPA có thể đảo ngược và suy glucocorticoid. Liều cao mãn tính của glucocorticoid có thể dẫn đến sự phát triển của đục thủy tinh thể, tăng nhãn áp, tăng huyết áp, giữ nước, tăng lipid máu, loét dạ dày tá tràng, viêm tụy, bệnh cơ, loãng xương, thay đổi tâm trạng, rối loạn tâm thần, teo da, dị ứng, mụn trứng cá, chứng tăng huyết áp, ức chế miễn dịch, giảm sức đề kháng nhiễm trùng, mặt trăng, tăng đường huyết, hạ calci huyết, giảm phosphat máu, toan chuyển hóa, ức chế tăng trưởng và suy thượng thận thứ phát. Quá liều có thể được điều trị bằng cách điều chỉnh liều hoặc ngừng corticosteroid cũng như bắt đầu điều trị triệu chứng và hỗ trợ [7]. 1.1.5. Một số chế phẩm dầu gội đầu chứa Clobetasol propionat trên thị trường
QU Y
Bảng 1.2. Một số chế phẩm dầu gội đầu chứa clobetasol propionat trên thị trường Tên sản phẩm
Xuất xứ
1
Dầu gội Haicneal
Sino American Dihon Kunming - Hàn Quốc
2
Dầu gội SnowClear
Công ty Cổ phần tập đoàn Merap
3
Dầu gội Jasunny
Công ty Cổ phần dược phẩm Gia Nguyễn
DẠ Y
5
KÈ
4
M
STT
Clobex Shampoo
Galderma - Pháp
Dầu gội Baroka
Shanghai Baolong Pharmaceutical Co., Ltd - Trung Quốc
1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG CLOBETASOL PROPIONAT
4
L A
Tại Việt Nam, cho tới nay có rất ít các nghiên cứu phân tích CLP trong các chế phẩm dược phẩm nói chung và phân tích CLP trong dầu gội đầu nói riêng. Trên toàn thế giới đã có nhiều phương pháp để định lượng CLP. Các phương pháp định lượng CLP được trình bày ở bảng 1.3.
I C
Bảng 1.3. Một số nghiên cứu về định lượng CLP Điều kiện phân tích Cột sắc ký
STT
Pha động
Tốc độ dòng
Thể tích tiêm
Nền mẫu
TLTK
1,0 ml/phút
10µl
Kem, thuốc mỡ, dung dịch dùng ngoài
[13]
4,6mm x 15cm, L1
Natri 0,05M
240nm
2
Zorbax Eclipse XDB-C18 Chương trình gradient của (250 mm x 4,6 mm, 5m) hỗn hợp Kali Dihydro Photphat, MeOH, ACN
240nm
gradient
20µl
thuốc mỡ
[14]
3
Agilent poroshell HPH-C8 Chương trình gradient của (4,6 × 100 mm, 2,7 μm) hỗn hợp ACN và amoni axetat (pH 7,5; 0,01 M)
239nm
1,0 ml/phút
10µl
Kem
[15]
4
Cột RP-18 (4,6 x 250mm, MeOH: H2O (80:20,v/v) 5µm), 110A0
241nm
1,0 ml/phút
20µl
Vi nang nano
[9]
5
NovaPak C18 (150 x MeOH : H2O (74:26, v/v) 3,9mm; 4µm)
240nm
1,0 ml/phút
20µl
Nhũ tương
[16]
6
Phenomenex Luna C18 ACN:H2O (48:52, v/v) (4,6 x 250 mm; 5µm)
240nm
1,0 ml/phút
5µl
Mỹ phẩm
[17]
7
Purospher STAR Si (4,0 x ACN : H2O (60:40,v/v) 250 mm; 5 µm)
237nm
1,0 ml/phút
10µl
Mỹ phẩm
[18]
D
Y Ạ
M È
Q
:
Bước sóng
1
K
ACN : MeOH dibiphosphat (95:20:85)
I F F O
Y U
N Ơ
H N
5
1.3. SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
AL
1.3.1. Phương pháp HPLC
FI
CI
Sắc ký lỏng hiệu năng cao đôi khi còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao (High-Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay rây phân tử là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
NH ƠN
OF
Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Sắc ký thường được hoàn thành trong một thời gian ngắn (khoảng 30 phút). Chỉ những thành phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích được bằng HPLC [19]. Khi nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp 2 chất A, B (có thể nhiều hơn) vào cột phân tích thì kết quả là 2 chất A, B sẽ được tách ra khỏi nhau nhờ pha động và được rửa giải ra khỏi cột. Tùy thuộc vào bản chất của pha động, pha tĩnh, chất phân tích mà các chất được rửa giải ra khỏi cột với tốc độ khác nhau [17, 20].
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
Ngày nay, HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hoá học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược học nói riêng. [19]
Hình 1.2. Cấu tạo máy HPLC
6
1.3.2. Cấu tạo máy HPLC
CI
AL
Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật để tách định lượng bằng sắc ký lỏng. Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận được kết nối với nhau.
FI
1.3.2.1. Hệ thống cấp pha động
OF
Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh. Có 2 cách sử dụng pha động: - Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký.
NH ƠN
- Chương trình hóa dung môi: pha động là một hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2 – 4 dung môi được đựng trong các loại bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định. Có hai kiểu thực hiện chương trình dung môi: Chương trình dung môi áp suất thấp: các dung môi đựng trong các bình riêng. Mỗi bình có van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
QU Y
Chương trình dung môi áp suất cao: điểm khác chủ yếu là mỗi dung môi có một bơm riêng, việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao. Chương trình này có tốn kém và cồng kềnh hơn với loại hòa trộn ở áp suất thấp. Tuy nhiên, nó có độ đúng và độ lặp lại cao hơn.
M
1.3.2.2. Hệ thống bơm
KÈ
Hệ thống bơm để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc kí. Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng những yêu cầu sau:
DẠ Y
- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên (1 psi= 0,068 atm). - Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 – 5,00 m/phút. - Có thể chịu được sự tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn).
7
AL
- Những máy sắc ký lỏng hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn. Khoảng bơm có lưu lượng dao động từ 2 -3 ml/phút, áp suất có thể lên tới 10000 psi.
CI
1.3.2.3. Hệ tiêm mẫu
FI
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay bằng hệ thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vào vòng chứa mẫu (tiêm bằng tay) hay trong hệ tiêm mẫu tự động.
OF
1.3.2.4. Cột sắc ký
NH ƠN
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10 – 30 cm, đường kính trong 4 – 10 mm, thường có cột nhồi và cột bảo vệ. Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 – 10 nm, gần đây có loại cột nhỏ với đường kính trong 1 – 2 mm, dài 3 – 7,5 cm. Chất nhồi cột thường là silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ (hoặc liên kết hóa học với một chất hữu cơ). Ngoài silicagel người ta còn dùng một số loại hạt khác như nhôm oxyd, polymer xốp, chất trao đổi ion. Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm tăng tuổi thọ của cột.
QU Y
1.3.2.5. Detector và bộ phận ghi tín hiệu Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín hiệu được ghi trên sắc ký đồ. Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:
M
- Đáp ứng nhanh và lặp lại.
KÈ
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ thấp. - Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng. - Khoảng hoạt động tuyến tính rộng.
DẠ Y
- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.
Detector là bộ phân quan trọng quyết định đến độ nhạy của phương pháp. Tùy thep bản chất lý hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector phù hợp. Có các loại detector như:
8
AL
- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát quang.
CI
- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến.
FI
- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hóa: là các cation, anion, các chất có tính dẫn điện…
OF
- Detector khối phổ: thường dùng để nhận biết và xác định các hợp chất khi chúng rất khó tách bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ. Ví dụ như các chất có khối lượng phân tử lớn, các chất không bền với nhiệt, các hợp chất phân cực…
NH ƠN
Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính. 1.3.3. Các thông số đặc trưng trong HPLC
1.3.3.1. Thời gian lưu tR
QU Y
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. 1.3.3.2. Hệ số phân bố K
KÈ
M
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K: 𝐶𝑠 K= x 100% 𝐶𝑀
DẠ Y
Trong đó: Cs: Nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/l). CM: Nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/l).
Hệ số K phụ thuộc bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan. Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn. 9
1.3.3.3. Hệ số dung lượng K’
CI
AL
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng. 𝑡𝑅 − 𝑡0 K′ = 𝑡0
FI
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị doãng. Trong thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu.
OF
1.3.3.4. Hệ số tách α
NH ƠN
Hệ số tách α (hay còn gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B) là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố và là tỉ số của hệ số phân bố của hai chất. α=
𝐾𝐴 𝐾′𝐴 𝑡𝑅𝐴 = = 𝐾𝐵 𝐾′𝐵 𝑡𝑅𝐵
Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1. 1.3.3.5. Số đĩa lý thuyết
QU Y
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
KÈ
M
Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định. Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau: N = 5,54 (
𝑡𝑅 ) 𝑊0,5
DẠ Y
Trong đó: W0,5: độ rộng tại ½ của peak.
1.3.3.6. Độ phân giải Rs Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau được tính theo công thức sau: 10
𝑡′𝑅𝐵 − 𝑡′𝑅𝐴 𝑊𝐵 − 𝑊𝐴
Trong đó:
CI
tRA, tRB: Thời gian lưu của 2 peak liền kề nhau.
AL
𝑅𝑆 = 2
WA, WB: độ rộng peak đo ở các đáy.
FI
Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách nhau là RS = 1,0. Trong phép định lượng RS = 1,5 là phù hợp.
NH ƠN
OF
Nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách ra xa nhau, nếu hai chất này tách nhau quá xa làm cho đường nền càng kéo dài thì cũng không cần thiết. Vì như thế tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn. Do đó giá trị RS chỉ vừa đủ để tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau là tốt. Nghĩa là chỉ cần hai peak vừa tách ra khỏi hẳn nhau dứt khoát là được. 1.3.3.7. Các hệ số liên quan tới đối xứng của peak sắc ký Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký người ta dùng các đại lượng: Hệ số bất đối AF:
𝑏 𝑎
QU Y
𝐴𝐹 =
Trong đó: a: nửa chiều rộng phía trước peak b: nửa chiều rộng phía sau peak (cả a và b được đo ở 1/10 chiều cao peak)
M
Giá trị AF càng gần 1, peak càng đối xứng.
DẠ Y
KÈ
Hệ số kéo đuôi AS 𝐴𝑠 =
𝑎+𝑏 2𝑎
(Với a và b đo ở 1/20 chiều cao peak) Nếu AS càng lớn hơn 1, peak kéo đuôi càng nhiều, peak càng mất cân
đối.
Hệ số kéo đuôi của peak chính phải trong khoảng 0,8-1,5 (0,8≤ AS ≤1,5).
11
1.3.4. Ứng dụng của HPLC
AL
HPLC có 3 ứng dụng chính là định tính, định lượng và điều chế. 1.3.4.1. Định tính
OF
FI
CI
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng điều kiện sắc ký (pha động, pha tĩnh, nhiệt độ) là những thông tin định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu. Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ thường gặp khó khăn. Do vậy, HPLC thường dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ. 1.3.4.2. Phân tích định lượng
NH ƠN
Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao peak hoặc diện tích pic. Chiều cao peak dễ đo, tuy nhiên chỉ dùng được khi peak hẹp, cân đối. Diện tích peak được dùng phổ biến và đảm bảo cho kết quả tin cậy. Những phương pháp thường dùng trong phân tích sắc ký: - Phương pháp chuẩn ngoại: tiến hành chạy sắc ký ở cả hai mẫu chuẩn vị thử trong cùng điều kiện. So sánh diện tích peak của mẫu thử với diện tích peak của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử.
QU Y
Có 2 phương pháp:
Chuẩn hóa một điểm: chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử.
M
Chuẩn hóa nhiều điểm: xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định.
DẠ Y
KÈ
- Phương pháp thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của chất trong mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ ΔC và sự tăng của diện tích pic ΔS. - Phương pháp chuẩn nội: người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch đối chiếu. Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn. 12
Một số yêu cầu đối với chất chuẩn nội:
AL
Pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác. Pic của chất chuẩn nội phải gần với pic của chất phân tích
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
NH ƠN
OF
FI
CI
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: hàm lượng phần trăm của chất phân tích được xác định bằng tỷ số (tính theo %) của diện tích pic chất đó và diện tích các pic có trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và pic các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện).
13
AL
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
CI
2.1.1. Nguyên vật liệu, hóa chất nghiên cứu
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Tên
Tiêu chuẩn
Xuất xứ
1
Acetonitril
HPLC
2
Aceton
TKPT
3
Clobetasol propionat chuẩn
Chuẩn đối chiếu thứ cấp Viện kiểm nghiệm SKS: C0320170.03 thuốc Trung Ương HL: 99,2%.
4
Methanol
5
Methanol
6
Nước tinh khiết
FI
STT
OF
Merck
NH ƠN
Trung Quốc
HPLC
Merck
TKPT
Trung Quốc
DĐVN V
Việt Nam
QU Y
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
DẠ Y
KÈ
M
- Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, Detector 2487 dual α Absorbance, cột SunFireTM (RP-C18, 5 µm, 100Ao, 250 x 4,6 mm) (Mỹ). - Máy quang phổ EMC-61 PC-UV Spectrophotometer (Emclab, Đức). - Bể siêu âm Elmasonic S 100 H (Đức). - Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,1 mg (Thụy Sĩ). - Cân kỹ thuật Satorius độ chính xác 0,01 g (Đức). - Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sĩ). - Các dụng cụ thí nghiệm khác như: Cốc có mỏ, ống nghiệm, phễu lọc, giấy lọc, bình định mức, pipet,…. đạt tiêu chuẩn phân tích và kiểm nghiệm.
14
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
Dầu gội Jasunny
3
Dầu gội Bakora
Công ty CP Dược phẩm Gia Nguyễn
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
2
Ketoconazole 15mg/g Clobetasol propionat 0,25mg/g
natri lauryl sulfat, ethanol, dinatri edetat, coco fatty acid diethanolamid, fatty alcohol polyxyethylen ether sulfat, acid citric, polyquaternium, guar gum, germall plus, emulsified silicon oil, ethylen glycol distearat, menthol, essence, eosin Y, nước tinh khiết
CI
Tá dược
FI
Dầu gội Công ty CP SnowClear tập đoàn Merap
Thành phần chính
NH ƠN
1
Công ty sản xuất
OF
STT Tên mẫu
AL
Bảng 2.2. Các mẫu dầu gội đầu chứa CLP được sử dụng để định lượng
Shanghai Baolong Pharmaceutic al Co., Ltd Trung Quốc
Ketoconazole 15mg/g Clobetasol propionat 0,25mg/g
natri lauryl sulfat, natri carboxymethylcellulose, glycerin, odd citric monohydrate, polysorbot 80, cetyl acolcol, parafin lỏng, menthol, vanillin, ponceau 4R, ethanol 96%, nước tinh khiết
Ketoconazole 15mg/g Clobetasol propionat 0,25mg/g
Không công bố trên tờ hướng dẫn sử dụng
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
Khoa Kiểm nghiệm - Độc chất, Viện Đào tạo Dược, Học Viện Quân Y.
15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
AL
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
*Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
OF
FI
CI
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10mg CLP chuẩn bằng cân phân tích vào bình định mức 100ml. Thêm khoảng 70ml dung môi vào trong bình định mức và lắc siêu âm hòa tan hoàn toàn trong khoảng 30 phút, để nguội và bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc CLP 100µg/ml.
NH ƠN
Dung dịch chuẩn: Hút chính xác 10ml dung dịch chuẩn gốc vừa pha vào bình định mức 50ml, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều thu được dung dịch chuẩn 20µg/ml. 2.2.1.1. Bước sóng phân tích
Để xác định bước sóng thích hợp để phân tích CLP, tiến hành ghi phổ UV của mẫu CLP chuẩn 20µg/ml trên máy quang phổ với dải sóng từ 200400nm, cuvet thạch anh dày 1cm với mẫu trắng là dung môi được lựa chọn.
QU Y
Dựa vào hình ảnh phổ, lựa chọn được bước sóng thích hợp để khảo sát phương pháp định lượng CLP bằng HPLC. 2.2.1.2. Khảo sát hiệu lực cột
Tiến hành phân tích mẫu trên 2 loại cột với các thông số được thể hiện như bảng 2.3. Bảng 2.3. Các thông số của cột được khảo sát
KÈ
1
Tên cột
Thông số cột
SunFireTM
C18 5µm (4,6 x 250mm), 100A0
Phenomenex
C18 5µm (4,6 x 250mm), 110A0
M
STT 2
DẠ Y
Điều kiện cố định: -
Bước sóng phân tích: Dựa trên kết quả khảo sát mục 2.2.1.1. Nồng độ mẫu: 20µg/ml. Thể tích tiêm mẫu: 10µl. Nhiệt độ cột: 25oC. Tốc độ dòng: 1ml/phút. 16
- Thời gian chạy: 15 phút.
CI
AL
Từ kết quả về thời gian lưu, diện tích peak, hệ số bất đối xứng và số đĩa lý thuyết, lựa chọn một hệ pha động có khả năng tách tốt và có thời gian lưu hợp lý. 2.2.1.3. Khảo sát thành phần hệ pha động
Điều kiện cố định:
Bước sóng phân tích: Dựa trên kết quả khảo sát mục 2.2.1.1. Cột phân tích: Dựa trên kết quả khảo sát mục 2.2.1.2. Nồng độ mẫu: 20µg/ml. Thể tích tiêm mẫu: 10µl. Nhiệt độ cột: 25oC. Tốc độ dòng: 1ml/phút.
NH ƠN
-
OF
- Hệ 1: MeOH : H2O (80/20, v/v). - Hệ 2: ACN : H2O (60/40, v/v).
FI
Dựa trên các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các hệ pha động khác nhau bao gồm:
QU Y
Từ kết quả về thời gian lưu, diện tích peak, hệ số bất đối xứng và số đĩa lý thuyết, lựa chọn một hệ pha động có khả năng tách tốt và có thời gian lưu hợp lý nhất. 2.2.1.4. Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động
M
Tiến hành khảo sát tỷ lệ pha động với thành phần hệ pha động đã được lựa chọn ở phần 2.2.3.3 theo các tỷ lệ: 55/45; 60/40; 65/35; 70/30. Các điều kiện cố định: Bước sóng phân tích: Dựa trên kết quả khảo sát mục 2.2.1.1. Cột phân tích: Dựa trên kết quả khảo sát mục 2.2.1.2. Nồng độ mẫu: 20µg/ml. Thể tích tiêm mẫu: 10µl. Nhiệt độ cột: 25oC. Tốc độ dòng: 1ml/phút.
KÈ DẠ Y
-
17
AL
Yêu cầu: Từ kết quả về thời gian lưu, diện tích peak, hệ số bất đối xứng và số đĩa lý thuyết, lựa chọn một tỷ lệ của hệ pha động có khả năng tách tốt và có thời gian lưu hợp lý nhất.
CI
2.2.1.5. Khảo sát tốc độ dòng
FI
Tiến hành phân tích với các tốc độ dòng 0,8ml/phút; 1,0ml/phút; 1,2ml/phút. Các điều kiện cố định:
OF
Bước sóng phân tích: Dựa trên kết quả khảo sát mục 2.2.1.1. Cột phân tích: Dựa trên kết quả khảo sát mục 2.2.1.2. Nồng độ mẫu: 20µg/ml. Thể tích tiêm mẫu: 10µl. Nhiệt độ cột: 25oC.
NH ƠN
-
Yêu cầu: Từ kết quả về thời gian lưu, diện tích peak, hệ số bất đối xứng và số đĩa lý thuyết, lựa chọn một tốc độ dòng có khả năng tách tốt và thích hợp nhất. 2.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
2.2.2.1. Dung môi chiết mẫu
QU Y
Dựa vào các tính chất của chất nghiên cứu và tham khảo một số nghiên cứu phân tích CLP ở một số chế phẩm [13, 17, 18], tiến hành khảo sát chiết CLP bằng các dung môi MeOH, ACN, Aceton để lựa chọn dung môi xử lý mẫu.
KÈ
M
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 2g dầu gội đầu chứa CLP vào bình định mức 25ml. Thêm khoảng 20ml dung môi vào trong bình định mức và lắc siêu âm khoảng 30 phút, để nguội và bổ sung dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Để lạnh trong nước đá khoảng 20 phút, đem ly tâm 7000 vòng/phút trong 10 phút. Để ở nhiệt độ phòng, lấy phần dung dịch lọc qua màng lọc 0,45µm.
DẠ Y
Phân tích HPLC mẫu thử. Mỗi khảo sát lặp lại 3 lần.
Đồng thời chuẩn bị các dung dịch chuẩn CLP bằng cách hòa tan CLP chuẩn trong các dung môi MeOH, ACN, Aceton và tiến hành như mục 2.2.1 để được các dung dịch chuẩn có nồng độ 20µg/ml. Tiến hành phân tích HPLC các mẫu chuẩn, mỗi mẫu tiêm 3 lần.
18
CI
Nồng độ CLP trong mẫu thử (Ct) được tính theo công thức:
Trong đó:
OF
St: Diện tích peak của mẫu thử (µV.s).
FI
𝑆𝑡 x 𝐶𝑠 x 100% 𝑆𝑠
𝐶𝑡 (µg/ml) =
AL
Tính hiệu suất chiết và lựa chọn ra dung môi. Dung môi được chọn có khả năng hòa tan tối đa dược chất và hòa tan tối thiểu các tá dược, hiệu suất cao và có độ lặp lại tốt giữa các lần.
Ss: Diện tích peak của mẫu chuẩn (µV.s). Cs: Nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml).
NH ƠN
Công thức tính hiệu suất:
H(%) = Trong đó:
𝐶𝑡 x V x 100% m x X x 1000
V: thể tích dung dịch (V=25ml). M: khối lượng mẫu thử (g).
QU Y
X: hàm lượng CLP trong mẫu thử (mg/g). 2.2.2.2. Khảo sát thời gian chiết mẫu Tiến hành khảo sát thời gian chiết trong 15, 30 và 45 phút để lựa chọn thời gian chiết tối ưu.
M
Xử lý mẫu như mực 2.2.2.1 với dung môi được lựa chọn với thời gian chiết là 15, 30 và 45 phút.
KÈ
Phân tích HPLC, tính hiệu suất chiết. Mỗi khảo sát lặp lại 3 lần.
DẠ Y
Thời gian lựa chọn là thời gian chiết được CLP với hiệu suất cao, độ lặp lại tốt giữa các lần. 2.2.3. Thẩm định phương pháp định lượng Clobetasol propionat trong
dầu gội đầu Phương pháp được đánh giá theo hướng dẫn của ICH và thông tư 32/2018 của Bộ Y tế [21, 22] dựa trên khảo sát các chỉ tiêu trong thẩm định quy trình phân tích sau: 19
2.2.3.1. Tính tương thích hệ thống
CI
AL
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn CLP vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Độ thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu, diện tích.
FI
Ghi lại kết quả của: thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối xứng và số đĩa lý thuyết của peak CLP chuẩn.
OF
Yêu cầu: Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0%, nếu không có quy định khác. Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp [23]. 2.2.3.2. Độ đặc hiệu
NH ƠN
Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác (tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất,…) trong mẫu thử. Chuẩn bị 5 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu nền, mẫu nền thêm chuẩn, mẫu thử.
QU Y
- Mẫu trắng: dung môi pha chuẩn. - Mẫu nền, mẫu thử: được tiến hành như mục 2.2.2.1.
M
- Mẫu nền thêm chuẩn: Cân chính xác 2g dầu gội đầu (mẫu nền) vào bình định mức 25ml. Thêm vào 5ml CLP chuẩn gốc vào bình định mức trên. Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký với những điều kiện đã được lựa chọn. Yêu cầu:
DẠ Y
KÈ
- Sắc ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. - Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [24, 25].
2.2.3.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn Để khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ với diện tích peak của CLP, chuẩn bị một dãy 6 dung dịch CLP chuẩn với nồng độ lần lượt như bảng 2.4.
20
AL
Cho dung dịch chuẩn gốc CLP 100µg/ml vào 6 bình định mức 10ml với thể tích như bảng 2.4, pha loãng bằng dung môi và định mức đến vạch, lắc đều. Mỗi nồng độ thực hiện 3 lần.
CI
Bảng 2.4. Dãy dung dịch CLP chuẩn 1
2
3
4
Thể tích CLP chuẩn gốc (ml)
1,0
1,5
2,0
2,5
Nồng độ CLP chuẩn (µg/ml)
10
15
20
5
6
3,0
4,0
FI
STT
25
30
40
Định mức vừa đủ 10ml
Dung môi
OF
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, tiêm mỗi mẫu và lấy giá trị của diện tích peak trung bình. Từ các giá trị diện tích peak trung bình, xây dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ dung dịch CLP.
2.2.3.4. Khảo sát độ đúng
NH ƠN
Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) ≥0,997 (hay R2>0,995). Nếu r<0,997 phải có sự giải thích phù hợp.
Thêm chất chuẩn ở 3 mức nồng độ là mức thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc [24].
QU Y
Thêm chính xác một lượng chất chuẩn CLP vào nền mẫu sao cho sau khi xử lý thu được nồng độ dung dịch sắc ký tương ứng với 3 mức nồng độ là 80%, 100%, 120% nồng độ phân tích của CLP chuẩn. Tại mỗi mức nồng độ tiến hành 3 mẫu độc lập trong cùng điều kiện khảo sát.
KÈ
M
Cân chính xác 2g dầu gội đầu (mẫu nền) vào bình định mức 25ml, thực hiện trên 9 bình, mỗi mức nồng độ 3 bình. Thêm lần lượt vào mỗi bình 4; 5; 6ml CLP chuẩn gốc vào các bình trên. Thêm khoảng 10-15ml dung môi vào trong bình định mức và lắc siêu âm khoảng 30 phút, để nguội và bổ sung dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Để lạnh trong nước đá khoảng 20-30 phút, đem ly tâm 7000 phút/vòng trong 10 phút. Để ở nhiệt độ phòng, lấy phần dung dịch lọc qua màng lọc 0,45µm.
DẠ Y
Tiến hành phân tích các mẫu trên ở điều kiện sắc ký đã xây dựng. Tính hiệu suất thu hồi (R%) theo công thức: 𝑅(%) =
𝐶𝑡𝑠 𝑥100% 𝐶𝑠
Trong đó: 21
AL
o Cts: Nồng độ CLP trong mẫu thử tìm lại (µg/ml). o Cs: Nồng độ CLP chuẩn thêm vào (µg/ml). Yêu cầu:
FI
CI
- Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%): 98,0 - 102,0%. - RSD ≤ 2 %. - Nếu các giá trị trên nằm ngoài khoảng này cần phải có thuyết minh về sự phù hợp của việc chấp nhận giá trị này [23]. 2.2.3.5. Khảo sát độ lặp lại
OF
Chuẩn bị 6 mẫu thử có chứa CLP riêng biệt. Tiến hành xử lý mẫu và phân tích các mẫu ở điều kiện sắc ký đã xây dựng. Tính hàm lượng % so với nhãn và RSD(%) của hàm lượng trên.
NH ƠN
Yêu cầu: Giá trị RSD phải ≤ 2,0%, nếu không có quy định khác. Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp [23]. 2.2.3.6. Khảo sát độ chính xác trung gian
Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau [22].
Yêu cầu:
QU Y
Thực hiện tương tự như khảo sát độ lặp lại nhưng được thực hiện vào ngày khác của khảo sát độ lặp lại.
KÈ
M
- Giá trị định lượng trung bình của mỗi ngày và của cả hai ngày thực hiện phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0%. - Giá trị RSD (%) kết quả định lượng của mỗi ngày và của cả hai ngày thực hiện phải ≤ 2,0%. - Độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 ngày thực hiện ≤ 2,0% [23].
DẠ Y
2.2.3.7. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng dưới (LOQ) Từ kết quả khảo sát tính thương thích hệ thống với mẫu chuẩn CLP 20µg/ml, tính được thời gian lưu trung bình của các mẫu. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng, đo độ nhiễu đường nền trong khoảng thời
gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn, thu được diện tích nền 𝑆𝑜 22
(µV.s). Từ đó ước lượng diện tích peak của LOD (lớn hơn hoặc bằng 3𝑆𝑜 ) và
AL
LOQ (lớn hơn hoặc bằng 10𝑆𝑜 ).
CI
Căn cứ diện tích peak của LOD và LOQ ước lượng được, pha 3 mẫu chuẩn có nồng độ gần với nồng độ ước lượng và tiến hành chạy sắc ký ở điều kiện đã khảo sát được.
FI
Từ kết quả sắc ký, lựa chọn nồng độ nhỏ nhất cho diện tích lớn hơn diện tích LOD và LOQ ước lượng từ nhiễu đường nền.
OF
2.2.4. Định lượng Clobetasol propionat trong dầu gội đầu
2.2.4.1. Tiến hành
Chuẩn bị từng mẫu thử dầu gội chứa CLP và thực hiện như mục 2.2.2.1.
2.2.4.2. Tính toán kết quả
NH ƠN
Chạy sắc ký: Mỗi mẫu thử được chuẩn bị 3 lần và tiến hành chạy sắc ký theo phương pháp đã được xây dựng.
Từ nồng độ CLP trong mẫu thử, tính được hàm lượng CLP trong chế phẩm theo công thức: HL(mg/g)=
𝐶𝑡 × 𝑉 × 10−3 𝑚
QU Y
Trong đó:
○ 𝐶𝑡 : Nồng độ CLP trong mẫu thử (µg/ml). ○ V: Thể tích mẫu thử (ml).
M
○ m: Khối lượng của mẫu thử (g).
KÈ
% so với nhãn của CLP được tính theo công thức: % so với nhãn=
𝐻𝐿 𝐶𝑛
Trong đó: 𝐶𝑛 : Nồng độ CLP trong mẫu thử trên nhãn(mg/g).
DẠ Y
2.2.4.3. Xử lý số liệu Số liệu thu thập được được nhập và xử lý bằng phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016.
23
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
AL
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1.1. Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký
CI
3.1.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng phân tích
QU Y
NH ƠN
OF
FI
Tiến hành ghi phổ UV của dung dịch chuẩn có nồng độ 20µg/ml ở bước sóng 200 – 400 nm, kết quả ghi phổ UV được thể hiện ở hình 3.1:
Hình 3.1. Phổ UV của dung dịch CLP chuẩn 20µg/ml
M
Nhận xét: Phổ hấp thụ UV của dung dịch CLP chuẩn 20µg/ml cho cực đại hấp thụ ở bước sóng 237,4nm với độ hấp thụ là 0,6654. Dựa vào hình ảnh phổ thu được và một số nghiên cứu đã trình bày, lựa chọn bước sóng 237nm để khảo sát phương pháp định lượng CLP bằng HPLC.
KÈ
3.1.1.2. Kết quả khảo sát hiệu lực cột Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hiệu lực cột Thời gian lưu (phút)
Diện tích peak (µV.s)
Hệ số bất đối xứng (AF)
Số đĩa lý thuyết (N)
Phenomenex LUNA
9,905
392795
1,047
7957
SunfireTM
10,502
541622
1,103
10249
DẠ Y
Cột
24
AL CI FI OF
QU Y
NH ƠN
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP khi sử dụng cột Phenomenex LUNA
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP khi sử dụng cột SunfireTM
DẠ Y
KÈ
M
Dựa vào kết quả về hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết, thời gian lưu và sắc ký đồ thu được, nhận thấy cả 2 cột đều cho các chỉ số nằm trong giới hạn cho phép. Tuy nhiên, cột Phenomenex LUNA cho peak không cân đối, chân peak bị dãn ra, hiệu lực cột cũng thấp hơn so với cột SunfireTM. Cột Phenomenex LUNA cho thời gian lưu (9,905 phút) ngắn hơn không đáng kể so với cột SunfireTM (10,502 phút). Do đó, cột SunfireTM là phù hợp và lựa chọn cột này dùng cho quá trình phân tích. 3.1.1.3. Kết quả khảo sát thành phần pha động Tiến hành khảo sát điều kiện ở 2 hệ pha động khác nhau, kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.2.
25
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động Thời gian lưu (phút)
Hệ số bất đối xứng (AF)
MeOH: H2O (80/20,v/v)
6,864
1,602
ACN:H2O (60/40,v/v)
10,502
1,103
NH ƠN
OF
FI
CI
AL
Hệ pha động
M
QU Y
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động MeOH: H2O (80/20,v/v)
KÈ
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (60/40,v/v)
DẠ Y
Nhận xét: Kết quả khảo sát 2 hệ pha động cho thấy sử dụng hệ pha động ACN:H2O (60/40) cho kết quả phân tách tốt, đường nền ổn định, peak cân đối và chân peak gọn hơn so với hệ pha động còn lại với AF=1,103. Hệ pha động MeOH:H2O (80/20) cho thời gian lưu ngắn nhưng lại cho peak không cân đối với hệ số bất đối xứng là 1,602. Vì vậy lựa chọn hệ pha động ACN:H 2O cho các nghiên cứu tiếp theo.
26
3.1.1.4. Kết quả tỷ lệ pha động
AL
Tiến hành khảo sát hệ pha động ACN:H2O với các tỷ lệ thu được kết quả trong bảng 3.3 dưới đây.
Hệ số bất đối xứng (AF) 1,521 1,103 1,400 1,621
FI
Diện tích peak (µV.s) 395536 541622 421764 43655
OF
Thời gian lưu (phút) 15,383 10,502 8,596 6,958
NH ƠN
ACN:nước (v/v) 55/45 60/40 65/35 70/30
CI
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động ACN:H2O
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (55/45,v/v)
Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (60/40,v/v)
27
AL CI FI OF
QU Y
NH ƠN
Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (65/35,v/v)
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với hệ pha động ACN:H2O (70/30,v/v)
KÈ
M
Nhận xét: Từ kết quả khảo sát nhận thấy tỷ lệ dung môi ACN:H2O (70/30) cho đường nền không ổn định, peak không cân đối. Tỷ lệ dung môi ACN:H2O (55/45), ACN:H2O (60/40) và ACN:H2O (65/35) cho thời gian lưu thích hợp, đường nền ổn định. Tuy nhiên với tỷ lệ dung môi ACN:H2O (60/40) có đường nền ổn định hơn, peak gọn, cân đối hơn với hệ số bất đối xứng là 1,103. Do đó, lựa chọn hệ dung môi tỷ lệ dung môi ACN:H2O (60/40) để phân tích định lượng CLP.
DẠ Y
3.1.1.5. Kết quả khảo sát tốc độ dòng Tiến hành khảo sát 3 tốc dòng thu được kết quả trong bảng 3.4.
Tốc độ dòng (ml/phút)
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tốc độ dòng Thời gian lưu (phút)
Diện tích peak (µV.s) 28
Hệ số bất đối xứng (AF)
487446 541622 727469
1,070 1,103 1,270
AL
7,991 10,502 14,106
NH ƠN
OF
FI
CI
1,2 1,0 0,8
QU Y
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với tốc độ dòng 1,2ml/phút
DẠ Y
KÈ
M
Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với tốc độ dòng 1,0ml/phút
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP với tốc độ dòng 0,8ml/phút 29
CI
AL
Nhận xét: Từ kết quả trên, ta thấy cả 3 tốc độ dòng các peak đều tách khỏi các peak tạp, peak cân đối, chân peak gọn. Từ tốc độ dòng 1,2ml/phút đến 0,8ml/phút, thời gian phân tích kéo dài, peak rộng hơn. Với tốc độ 1,2ml/phút, áp suất tách lớn (khoảng 2800psi) làm giảm tuổi thọ của cột. Tốc độ dòng 1,0ml/phút có thời gian lưu phù hợp, thời gian phân tích dài hơn không đáng kể. Do đó, lựa chọn tốc độ dòng 1,0ml/phút cho các phân tích tiếp theo.
FI
3.1.2. Kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu
OF
3.1.2.1. Dung môi chiết mẫu
Căn cứ theo mô tả đã được trình bày phần phương pháp, xử lý mẫu trong các dung môi ACN, MeOH, Aceton và tiến hành chạy sắc ký thu được kết quả như sau:
Khối lượng mẫu cân
Dung môi
(g)
2
2,0193
Hiệu
peak
suất
(µV.s)
chiết
503,63
460558
97,26
504,83
469200
98,85
CLP (µg)
QU Y
2,0145
Diện tích
Khối lượng
1,9832
495,80
458357
98,32
2,1016
525,40
558768
98,47
2,0375
509,38
547354
99,50
1,9840
496,00
531743
99,27
1
1,9068
476,70
522336
98,46
2
1,9305
482,63
529072
98,50
KÈ
ACN
1
NH ƠN
Bảng 3.5. Kết quả lựa chọn dung môi chiết mẫu
1,9613
490,33
534606
97,97
3 1
MeOH
2
M
3
Aceton
3
TB
RSD
(%)
(%)
98,14 0,67
99,08 0,44
98,31 0,25
DẠ Y
Nhận xét: Kết quả cho thấy mỗi dung môi khảo sát đều có sự lặp lại giữa các lần đo. Tuy nhiên sử dụng MeOH mang lại hiệu suất chiết cao nhất (99,08%), độ lệch chuẩn giữa các lần phân tích là 0,44%. Aceton cũng mang lại hiệu suất chiết cao (98,31%) nhưng cho peak dung môi cao hơn rất nhiều so với peak chất chuẩn, ACN cho diện tích peak nhỏ hơn. Do đó, lựa chọn MeOH làm dung môi xử lý mẫu trong quá trình phân tích.
30
3.1.2.2. Thời gian chiết mẫu
CI
AL
Căn cứ theo mô tả đã được trình bày phần phương pháp, xử lý mẫu trong các dung môi đã lựa chọn với thời gian chiết là 15, 30, 45 phút và tiến hành chạy sắc ký thu được kết quả như sau: Bảng 3.6. Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu
phút
45 phút
1
2,0755
518,88
504134
89,96
2
1,9523
488,08
495615
94,02
3
1,9703
492,58
503660
94,68
1
2,1016
525,40
558768
98,47
2
2,0375
509,38
547354
99,50
3
1,9840
496,00
531743
99,27
1
2,0128
503,20
538711
99,13
2
1,9821
495,53
534944
99,96
3
2,0332
508,30
539324
98,25
(µV.s)
TB
RSD
(%)
(%)
FI suất
CLP (µg)
QU Y
30
peak
Hiệu
mẫu cân (g)
15 phút
Diện tích
chiết
OF
chiết
Khối lượng
NH ƠN
Thời gian Khối lượng
92,89 2,25
99,08 0,44
99,11 0,71
Nhận xét: Chiết siêu âm trong thời gian 15 phút cũng cơ bản đã chiết được lượng lớn CLP ra khỏi tá dược (92,89%) nhưng mang lại hiệu suất thấp hơn chiết siêu âm trong thời gian 30 phút (99,08%), 45 phút (99,11%) và sự lặp
M
lại giữa các mẫu cũng thấp hơn (RSD=2,25%) so với chiết trong 30 phút, 45 phút. Chiết trong thời gian 45 phút, hiệu suất chiết cao hơn 30 phút nhưng
KÈ
không đáng kể; thời gian chiết lâu, gia nhiệt nhiều hơn dẫn đến hòa tan nhiều loại tá dược có trong mẫu thử gây ảnh hưởng đến kết quả. Do đó, lựa chọn thời gian chiết 30 phút để tiến hành xử lý mẫu.
DẠ Y
3.1.3. Kết quả thẩm định phương pháp
3.1.3.1. Tính tương thích hệ thống Tiến hành khảo sát CLP chuẩn 20µg/ml với 6 lần tiêm theo điều kiện sắc ký đã xây dựng, kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.7.
31
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống Diện tích
Chiều
Số đĩa lý
Hệ số bất đối
lưu (phút)
peak (µV.s)
cao
thuyết (N)
xứng (AF)
1
10,502
541622
32928
10249
2
10,497
547992
32787
10523
3
10,458
549968
33021
10146
4
10,503
543415
32951
10328
1,118
5
10,548
546709
32772
10282
1,104
6
10,492
547972
32190
10184
1,125
TBC
10,500
546280
32775
10285
1,112
SD
0,03
3145,93
302,42
133,66
0,01
RSD(%)
0,27
0,58
0,92
1,30
0,80
AL
Thời gian
FI
CI
1,103
OF
NH ƠN
Lần
1,106 1,115
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các thông số đều <2%, các giá trị của hệ số bất đối nằm trong khoảng cho phép (0,8-1,5). Như vậy, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao phù hợp để định lượng CLP.
QU Y
3.1.3.2. Độ đặc hiệu
DẠ Y
KÈ
M
Kết quả khảo sát độ đặc hiệu được thể hiện bằng hình ảnh sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử trong cùng điều kiện sắc ký đã lựa chọn thu được các sắc ký đồ trong hình dưới đây.
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng MeOH
32
AL CI FI OF
QU Y
NH ƠN
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu chuẩn CLP 20µg/ml
DẠ Y
KÈ
M
Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu thử chứa CLP
Hình 3.16. Sắc ký đồ nền mẫu không chứa CLP
33
AL CI FI OF
Hình 3.17. Sắc ký đồ nền mẫu thêm CLP chuẩn
NH ƠN
Nhận xét: Tại vị trí xuất hiện đáp ứng peak của CLP trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất hiện peak tương ứng trên sắc ký đồ mẫu thử và đồng thời không xuất hiện trên sắc ký đồ trên dung môi pha mẫu, nền mẫu. Trên sắc ký đồ mẫu thử, peak tách hoàn toàn các tạp. Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đặc hiệu cho phân tích CLP. 3.1.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
QU Y
Kết quả khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích peak CLP chuẩn trong khoảng 50-200% nồng độ làm việc được thể hiện trong bảng 3.8 và hình 3.18. mchuẩn=0,0102g. Hàm lượng: 99,2% Nồng độ chuẩn gốc tương ứng: 101,184µg/ml. Bảng 3.8. Xây dựng đường chuẩn CLP
M
Mẫu
KÈ
Nồng độ CLP
1
2
3
4
5
6
10,1184 15,1776 20,2368
25,296
30,2552 40,4736
319983
651799
757481
chuẩn (µg/ml)
DẠ Y
Diện tích Peak
439592
546527
981252
(µV.s)
Kết quả
Phương trình hồi quy: y = 21607x + 106322 Hệ số tương quan: R² = 0,9997
34
AL
y = 21607x + 106322 R² = 0.9997
1000000 800000 600000
CI
Diện tích peak (µV.s)
1200000
400000
0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
OF
Nồng độ (µg/ml)
FI
200000
Hình 3.18. Đồ thị quan hệ tuyến tính của diện tích peak và nồng độ CLP trong khoảng khảo sát
QU Y
NH ƠN
Nhận xét: Từ kết quả khảo sát trong nồng độ 10,1184 - 40,4736µg/ml cho thấy đường hồi quy của CLP là đường thẳng y = 21607x + 106322 với hệ số tương quan R² = 0,9997 nên trong khoảng nồng độ khảo sát có mỗi liện hệ tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích peak và nồng độ CLP. Vì vậy có thể sử dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng CLP bằng cách so sánh diện tích peak của dung dịch thử với dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. 3.1.3.4. Độ đúng
Lượng
KÈ
Mức
M
Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn thu được kết quả như trong bảng 3.9. Dựa vào kết quả định lượng và phương trình đường chuẩn, tính được lượng CLP tìm thấy trong mẫu thử thêm chuẩn:
nồng
DẠ Y
độ
80%
100%
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng Diện tích
Lượng
chuẩn
peak
chuẩn tìm Hiệu suất
TB
RSD
thêm vào
(µV.s)
lại (µg/ml)
(%)
(%)
(%)
454890
16,1322
99,65
453808
16,0821
99,34
99,07
0,77
449843
15,8986
98,21
539878
20,0655
99,16
(µg/ml)
16,1888
20,236
35
99,66
542134
20,1699
99,67
630746
24,2710
99,95
635022
24,4689
100,76
632839
24,3679
100,35
99,50
0,30
AL
24,2832
20,1678
100,35
0,41
CI
120%
542087
OF
FI
Nhận xét: Tại mỗi mức nồng độ, hiệu suất thu hồi lại từ 98,21-100,76%, đều nằm trong khoảng 98-102% so với lượng chất chuẩn thêm vào và RSD<2% chứng tỏ phương pháp sử dụng có độ đúng cao. 3.1.3.5. Độ lặp lại
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp được thể hiện trong bảng 3.10.
NH ƠN
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ lặp lại của mẫu thử Khối lượng
Diện tích peak
% so với
mẫu cân(g)
CLP theo nhãn
(µV.s)
nhãn
1
2,1021
525,53
557711
99,38
2
2,0684
517,10
549944
99,26
3
2,0402
510,05
542698
98,99
4
1,9821
495,53
527898
98,44
5
1,9328
483,20
521942
99,52
6
2,1247
531,18
561100
99,06
M
QU Y
Khối lượng
STT
Trung bình
99,11
RSD (%)
0,39
KÈ
Nhận xét: Kết quả thử độ lặp lại của phương pháp cho thấy ở điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả là 0,39%, nhỏ hơn 2%. Như vậy, quy trình định lượng CLP trong dầu gội đầu đảm bảo được độ lặp lại. 3.1.3.6. Độ chính xác trung gian
DẠ Y
Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn thu được kết quả như trong bảng 3.11. Dựa vào kết quả định lượng và phương trình đường chuẩn, tính được lượng CLP tìm thấy trong mẫu thử thêm chuẩn:
36
Khối lượng
Diện tích peak
% so với
mẫu cân(g)
CLP theo nhãn
(µV.s)
nhãn
1
1,9739
493,48
530763
2
2,1047
526,18
561024
3
2,1250
531,25
558783
4
2,0016
500,40
536854
99,55
5
2,0560
514,00
549883
99,85
6
2,0755
518,88
548733
98,65
99,52 99,99 98,54
FI
OF
STT
AL
Khối lượng
CI
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của mẫu thử
Trung bình
NH ƠN
RSD (%)
99,35 0,61
Bảng 3.12. Hàm lượng CLP xác định được trong 2 ngày STT
Ngày 1
Ngày 2
99,38
99,52
99,26
99,99
98,99
98,54
4
98,44
99,55
5
99,52
99,85
6
99,06
98,65
TB
99,11
99,35
1 2
QU Y
3
RSD 2 ngày: 0,51%
KÈ
M
0,39 0,61 RSD (%) Hàm lượng trung bình cả 2 ngày: 99,28%
DẠ Y
Nhận xét: Độ lặp lại kết quả định lượng trong mỗi ngày cho RSD đạt 0,39%; 0,61% và trong cả 2 ngày là 0,51% nhỏ hơn 2%. Như vậy phương pháp đã cho đảm bảo độ chính xác trung gian. 3.1.3.7. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Trên sắc ký đồ mẫu trắng, đo được tín hiệu nền trong khoảng thời gian từ 9 phút đến 11,50 phút là S0=4885 (µV.s). Kết quả xác định LOD và LOQ được thể hiện trong bảng 3.13 dưới đây: 37
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát LOD và LOQ Nồng độ chất
Diện tích peak
ước lượng (µV.s)
chuẩn (µg/ml)
đo được (µV.s)
0,32
13238
14655
0,34
(3 x S0)
0,36 1,28
48850
1,30
14743 15994
46525
OF
LOQ
CI
LOD
AL
Diện tích peak
FI
Chỉ tiêu
(10 x S0)
1,32
47695 48936
NH ƠN
Nhận xét: Theo kết quả bảng trên, phương pháp định lượng đã xây dựng có LOD=0,34µg/ml và LOQ=1,32µg/ml. 3.1.4. Định lượng các chế phẩm Dầu gội đầu chứa CLP trên thị trường
Trên cơ sở phương pháp định lượng đã được xây dựng, áp dụng để định lượng CLP trong dầu gội đầu trên thị trường. 3.1.4.1. Kết quả định lượng dầu gội SnowClear
QU Y
Hàm lượng của CLP trong dầu gội SnowClear là: 0,25mg/g. Kết quả định lượng CLP trong dầu gội được trình bày trong bảng 3.14. Bảng 3.14. Kết quả định lượng CLP trong dầu gội SnowClear Khối lượng Khối lượng CLP
Diện tích
mẫu cân(g) theo nhãn (µg)
peak (µV.s)
(mg/g)
nhãn
510,95
2
M
STT
3
2,0023
500,58
2,0438
545801
0,2488
99,52
2,0234
505,85
544933
0,2508
100,32
541484
0,2515
100,58
Trung bình
DẠ Y
KÈ
1
Hàm lượng % so với
38
100,29
AL CI FI OF
Hình 3.19. Sắc ký đồ của dầu gội đầu SnowClear
NH ƠN
3.1.4.2. Kết quả định lượng dầu gội Jassuny
Hàm lượng của CLP trong dầu gội Jassuny là: 0,25mg/g. Kết quả định lượng CLP trong dầu gội được trình bày trong bảng 3.15. Bảng 3.15. Kết quả định lượng CLP trong dầu gội Jassuny STT
Khối lượng Khối lượng CLP
Diện tích
Hàm lượng % so với
mẫu cân(g) theo nhãn (µg)
peak (µV.s)
(mg/g)
nhãn
1,9943
498,58
532711
0,2474
98,95
2
2,0783
519,58
553431
0,2489
99,57
3
2,0816
520,40
549821
0,2465
98,61
QU Y
1
DẠ Y
KÈ
M
Trung bình
Hình 3.20. Sắc ký đồ của dầu gội đầu Jassuny 39
99,18
Hàm lượng của CLP trong dầu gội Baroka là: 0,25mg/g.
AL
3.1.4.3. Kết quả định lượng dầu gội Baroka
Kết quả định lượng CLP trong dầu gội được trình bày trong bảng 3.16.
Khối lượng Khối lượng CLP
Diện tích
mẫu cân(g) theo nhãn (µg)
peak (µV.s)
Hàm lượng % so với (mg/g)
nhãn
0,2448
97,90
FI
STT
CI
Bảng 3.16. Kết quả định lượng CLP trong dầu gội Baroka
2,0922
530,55
548901
2
2,0248
511,20
532313
0,2451
98,06
3
2,0353
508,83
533652
0,2459
98,35 98,10
M
QU Y
NH ƠN
Trung bình
OF
1
Hình 3.21. Sắc ký đồ của dầu gội đầu Baroka
DẠ Y
KÈ
Kết quả cho thấy hàm lượng CLP trong các dầu gội đầu trên đạt được từ 98,10-100,29%. Các sản phẩm đều đạt yêu cầu theo quy định tại chuyên luận Clobetasol propionat công thức dùng ngoài của Dược điển Mỹ (USP 43) [13]. Điều này cho thấy, phương pháp phân tích là tin cậy, có thể áp dụng để định lượng CLP trong các sản phẩm dầu gội khác nhau.
40
3.2. BÀN LUẬN
AL
3.2.1. Về xây dựng quy trình phân tích
NH ƠN
OF
FI
CI
Lựa chọn pha động: Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích; ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị.Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, lực rửa giải là đặc trưng cho quá trình sắc kí. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó.
QU Y
Tốc độ dòng pha động là một yếu tố quan trọng trong quá trình sắc kí vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lập cân bằng của chất phân tích giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn làm giảm tính kinh tế của phương pháp. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau [26]. Vì vậy, cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với các điều kiện sắc kí. Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký. Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính, định lượng được các lọai hóa chất một cách nhanh chóng và hiệu quả cao.
M
3.2.2. Về phương pháp xử lý mẫu
DẠ Y
KÈ
Quy trình xử lý mẫu em dùng phương pháp chiết xuất siêu âm. Nhờ vào năng lượng sóng siêu âm để chiết hợp chất chất phân tích ra khỏi nền mẫu thử [27]. Do trong thành phần của dầu gội đầu có chứa nhiều chất béo, chất nhũ hóa... Đồng thời, CLP trong mẫu thử là hợp chất có độ phân cực yếu (logP=3,5) [7]. Vì vậy, nếu hàm lượng chất béo không được loại bỏ trong quá trình xử lý mẫu sẽ chiết đồng thời cùng chất phân tích và gây ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi của phương pháp. Một trong những phương pháp loại bỏ chất béo là sau khi được chiết siêu âm, đem mẫu cho vào trong khu vực có nhiệt độ thấp
41
AL
(khoảng 10oC) để chuyển chất béo thành dạng rắn (đông tụ). Sau đó tiến hành lọc để loại bỏ chất béo [28, 29]. 3.2.3. Về thẩm định phương pháp
OF
FI
CI
Do CLP là chất chỉ được phép sử dụng ở hàm lượng rất nhỏ nên nồng độ khảo sát cũng rất nhỏ, lượng chuẩn thêm vào chỉ đến cỡ microgram, do đó với lượng hoạt chất nhỏ như thế, không thể cân cho từng mẫu được nên hoạt chất được thêm vào bằng cách thêm các thể tích đã tính toán của các dung dịch chuẩn CLP. Mặc dù được tiến hành ở nồng độ rất thấp nhưng kết quả thu được đã cho thấy phương pháp đã đáp ứng được yêu cầu định tính, định lượng, cụ thể:
KÈ
M
QU Y
NH ƠN
- Độ thích hợp hệ thống: Độ lặp lại tốt với RSD của thời gian lưu và diện tích peak nhỏ hơn 2,0%; số đĩa lý thuyết trên 5000; hệ số bất đối nhỏ hơn 1,5. - Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đổ mẫu trắng và nền mẫu không xuất hiện pic ở thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của CLP. Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn cho peak có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của peak chính thu được từ sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. - Độ tuyến tính: Hệ số tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của CLP có r> 0,997 (hay R2 > 0,995). - Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi của tất cả các mẫu đều nằm trong khoảng 98,0 – 102,0% (98,21-100,76%). - Độ lặp lại: RSD của tất cả các mẫu đều lần lượt không quá 2,0%. - Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng: Vì nền mẫu phức tạp nên em xác định LOD, LOQ theo phương pháp pha loãng. Kết quả cho thấy LOD, LOQ đều phù hợp.
3.2.4. Về kiểm tra các mẫu dầu gội đầu lưu hành trên thị trường
DẠ Y
Đề tài đã tiến hành định lượng 3 mẫu dầu gội đầu trên thị trường bằng phương pháp đã xây dựng. Kết quả cho thấy các mẫu dầu gội đầu đều chứa hàm lượng CLP dưới 0,05%, đạt yêu cầu theo quy định. Các mẫu dầu gội đầu đều công bố thành phần CLP và hàm lượng đầy đủ theo quy định. Và các mẫu đều được đăng ký dưới dạng thuốc và thể hiện trên bao bì phù hợp với quy định của ASEAN [5]. 42
43
DẠ Y
M
KÈ QU Y NH ƠN
OF
FI
CI
AL
44
DẠ Y
M
KÈ QU Y NH ƠN
OF
FI
CI
AL
KẾT LUẬN
AL
Qua triển khai nghiên cứu đề tài, có thể đưa ra được các kết luận như sau:
CI
1. Đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng Clobetasol Propionat trong dầu gội đầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. - Xử lý mẫu đơn giản bằng Methanol kết hợp làm lạnh và ly tâm.
FI
- Điều kiện sắc ký: Nhiệt độ cột: 25oC.
OF
Cột sắc ký lỏng: SunFireTM C18 5µm (4,6 x 250mm), 100A0. Pha động: ACN : H2O với tỷ lệ 60:40 (v/v). Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
NH ƠN
Bước sóng phân tích: 237 nm Thể tích tiêm: 10𝜇𝑙.
- Thẩm định phương pháp:
KÈ
M
QU Y
- Tính tương thích hệ thống: Độ lặp lại tốt với RSD của các giá trị nhỏ hơn 2,0%; số đĩa lý thuyết trên 5000; hệ số bất đối nhỏ hơn 1,5. - Độ đặc hiệu: Tại vị trí xuất hiện đáp ứng peak của CLP trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất hiện peak tương ứng trên sắc ký đồ mẫu thử và đồng thời không xuất hiện trên sắc ký đồ trên dung môi pha mẫu, nền mẫu. Trên sắc ký đồ mẫu thử, peak tách hoàn toàn các tạp. - Độ tuyến tính: Hệ số tương quan giữa nồng độ và diện tích peak của CLP có r> 0,997 (hay R2 > 0,995). - Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi của tất cả các mẫu đều nằm trong khoảng 98,0 – 102,0% (98,21-100,76%). - Độ lặp lại và độ chính xác trung gian: RSD của tất cả các mẫu đều lần lượt không quá 2,0%. - Giới hạn phát hiện là 0,34µg/ml, giới hạn định lượng là 1,32µg/ml.
DẠ Y
Kết quả thẩm định cho thấy với điều kiện phân tích này phương pháp có độ lặp lại cao, độ đúng tốt, khoảng tuyến tính rộng và có giới hạn phát hiện tốt. 2. Đã áp dụng phương pháp để định lượng 3 mẫu dầu gội đầu trên thị trường có chứa CLP với hàm lượng so với nhãn là 98,10-100,29%, sản phẩm đều đạt yêu cầu theo quy định tại chuyên luận Clobetasol công thức dùng ngoài của Dược điển Mỹ (USP 43). 45
46
DẠ Y
M
KÈ QU Y NH ƠN
OF
FI
CI
AL
KIẾN NGHỊ
AL
1. Cần nghiên cứu hoàn thiện phương pháp để có thể ứng dụng định lượng CLP trong nhiều chế phẩm khác nhau.
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
NH ƠN
OF
FI
CI
2. Cần triển khai rộng hơn việc kiểm tra, định lượng CLP trong các mẫu dầu gội đầu lưu hành trên thị trường để có kết luận chính xác về việc lạm dụng các chất này hay không và có biện pháp quản lý chất lượng hợp lý.
47
AL
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (2021) NCBI, Topical Corticosteroids. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK532940/#, truy cập ngày 06/02/2022.
2.
Jacob SE, Steele T (2006) Corticosteroid classes: a quick reference guide including patch test substances and cross-reactivity. J Am Acad Dermatol. 54(4):723-7.
3.
Cục quản lý Dược (2019) Drug Bank, Clobetasol propionat. https://go.drugbank.com/drugs/DB01013, truy cập ngày 06/02/2022.
4.
Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2006), Dược lý học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 255-258.
5.
FDA (2021) Annexes to the ASEAN Cosmetics Agreement on Substances Used in Cosmetics, List of substances which must not form part of the composition of cosmetic products, 15/01/2021.
6.
Philip O. Anderson, James E. Knoben, William G. Troutman (2008), Handbook of clinical drug data (10th edition). MCGraw-Hill Medical Publishing Division, 642.
7.
National Center for Biotechnology Information (2022). PubChem Compound Summary for CID 32798, Clobetasol propionate. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Clobetasol-propionate, truy cập ngày 12/01/2022.
8.
Drug.com (2022), Clobetasol propionat. https://www.drugs.com/pro/clobetasol-ointment.html, truy cập ngày 06/02/2021.
9.
M.C. Fontana, M.O. Bastos and R.C.R. Beck (2006) Development and Validation of a Fast RP-HPLC Method for the Determination of Clobetasol Propionatein Topical Nanocapsule Suspensions. Journal of Chromatographic Science, 48: 637-640.
10.
Patel, H. K., Barot et al (2013). Topical delivery of clobetasol propionate loaded microemulsion based gel for effective treatment of vitiligo: Ex vivo permeation and skin irritation studies. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 102: 86–94.
KÈ
M
QU Y
NH ƠN
OF
FI
CI
1.
DẠ Y
11.
British Pharmacopoeia Commission Office (2019), British Pharmacopoeia 2020, The Stationery Office on behalf of the Medicines and Healthcare products Regulatory Agency (MHRA).
12.
Bộ Y Tế (2018), Dược Thư Quốc Gia Việt Nam, Nxb. Y học, Hà Nội.
13.
The United States Pharmacopeial Convention (2020). USP 43: Monographs: CLobetasol, p.1079-1082.
Bhuyian, M. H., Rashid, et al (2015) Development and Validation of Method for Determination of Clobetasol Propionate and Salicylic Acid from Pharmaceutical Dosage Form by HPLC, Journal of Pharmaceutical Research International, 7(5), 375-385.
15.
Wenling Yang, Xiaomei Yang, Fanghua Shi et al (2019), Qualitative and quantitative assessment of related substances in the Compound Ketoconazole and Clobetasol Propionate Cream by HPLC-TOF-MS and HPLC, Journal of Pharmaceutical Analysis, 9 (3): 156-162.
16.
Badilli U., Amasya G., Ozkan S. et al (2012) Simultaneous Determination of Clobetasol Propionate and Calcipotriol in a Novel Fixed Dose Emulgel Formulation by LC-UV. Chromatographia, 76(34), 133–140.
17.
Lê Thị Hường Hoa (2013) Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm. Luận án tiến sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
18.
Gagliardi , D. De Orsi, F. Manna et al (2000), HPLC determination of Clobetasol Propionate in cosmetic products, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologie, 23(3), 355-362.
19.
Trần Tử An (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm (sách dùng đào tạo dược sĩ đại học), Nxb. Y học, Hà Nội.
20.
Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 2., Nxb. Y học, Hà Nội.
21.
Bộ Y tế (2018) Quy định việc đăng ký lưu hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc. Thông tư 32/2018/TT-BYT, ngày 12/11/2018.
22.
ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005). Guidelines for validation of analytical procedures: Q2 (R1). Text and Methodology.
23.
Bộ Y tế (2013), Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc. Phụ lục 8.
24.
Trần Cao Sơn (2010) Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật. Nxb Khoa học và kỹ thuật.
25.
Bộ Y Tế (2012), Kiểm nghiêm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đại học), Nxb Giáo dục Việt Nam.
KÈ
M
QU Y
NH ƠN
OF
FI
CI
AL
14.
Bộ Y tế (2012), Hóa phân tích, phân tích công cụ tập 2, NXB Y học, tr. 126-129.
27.
Z. Mester, R. Sturgeon (2003), Comprehensive Analytical Chemistry, Sample preparation for trace element analysis, pp. 353-357.
28.
Mitchell D. Erickson, Lewis (2015), Analytical Chemistry of PCBs.
29.
Pesticide Analytical Manual: Methods for individual residues (2015), United States. Food and Drug Administration, pp 377-378.
DẠ Y
26.
AL
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Tên phụ lục
PL1
Các sắc ký đồ biểu thị độ tương thích hệ thống
PL2
Các sắc ký đồ biểu thị khoảng tuyến tính và đường chuẩn
PL3
Các sắc ký đồ biểu thị độ đúng
PL4
Các sắc ký đồ của mẫu thử
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
NH ƠN
OF
FI
CI
Ký hiệu
AL CI FI OF NH ƠN PL1
CÁC SẮC KÝ ĐỒ BIỂU THỊ
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
ĐỘ TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG
AL CI FI OF NH ƠN PL2
CÁC SẮC KÝ ĐỒ BIỂU THỊ
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ ĐƯỜNG CHUẨN
AL CI FI OF NH ƠN PL3
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
CÁC SẮC KÝ ĐỒ BIỂU THỊ ĐỘ ĐÚNG
AL CI FI OF NH ƠN PL4
DẠ Y
KÈ
M
QU Y
CÁC SẮC KÝ ĐỒ MẪU THỬ