ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG HPLC

ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

vectorstock.com/24597468

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

BỘ QUỐC PHÒNG

OF

HỌC VIỆN QUÂN Y

FI C

IA L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ƠN

TRỊNH HƯƠNG GIANG

NH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN

QU Y

A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG

DẠ

Y

KÈ

M

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

HÀ NỘI – 2022

BỘ QUỐC PHÒNG

OF

HỌC VIỆN QUÂN Y

FI C

IA L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ƠN

TRỊNH HƯƠNG GIANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

NH

ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH

QU Y

BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

DẠ

Y

KÈ

M

Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS. Chử Văn Mến

HÀ NỘI – 2022

IA L

LỜI CẢM ƠN

FI C

Em xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, ban Giám đốc Học viện Quân y, phòng Đào tạo, hệ quản lý học viên Dân sự, trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học – Viện nghiên cứu y dược học quân sự - Học viện Quân y đã hết sức quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập trong suốt 5 năm qua cũng như thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy:

OF

PGS.TS Chử Văn Mến

Là người thầy đã tận tình hướng dẫn khoa học, giảng dạy những kiến

ƠN

thức và kinh nghiệm thực tế quý báu cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận

NH

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Trịnh Nam Trung – Viện trưởng Viện Đào tạo Dược, DS Nguyễn Thị Thanh Hằng và toàn thể các thầy giáo, cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Kiểm nghiệm – Độc chất cũng như các bộ môn khác thuộc trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân y đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em được tiến hành nghiên cứu, học

QU Y

tập để hoàn thành khóa luận này.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã đồng hành, ủng hộ và động viên em trong quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện khóa luận này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên

DẠ

Y

KÈ

M

Xin chân thành cảm ơn!

Trịnh Hương Giang

MỤC LỤC

IA L

DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH

FI C

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 3 1.1. BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH ............................................................. 3

OF

1.2. TỔNG QUAN VỀ BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN ........................... 6 1.2.1. Hợp chất Berberin (BER) ................................................................. 6 1.2.2. Hợp chất Saikosaponin A (SAIKO) ................................................. 7

ƠN

1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ PHÂN TÍCH SAIKOSAPONIN VÀ BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

NH

(HPLC) ............................................................................................................. 9 1.3.1. Một số nghiên cứu về phân tích thành phần BER trong hoàng bá bằng HPLC ....................................................................................................... 9 1.3.2. Một số nghiên cứu về phân tích thành phần SAIKO trong sài hồ

QU Y

bằng HPLC ..................................................................................................... 10 1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ........................................... 11 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ............... 11 1.4.2. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký .................................. 11

M

1.4.3. Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng ................................................................................................................ 14

KÈ

1.4.4. Thẩm định quy trình phân tích ....................................................... 14

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ............... 19 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ........................... 19

DẠ

Y

2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................... 19 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................. 19 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu....................................................................... 19

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 20

IA L

2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời BER và SAIKO ..... 20 2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời BER và SAIKO ... 21

FI C

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 23

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ......................................................... 24 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG .......................................................................................................... 24

OF

3.1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng ................................... 24 3.1.2. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng .................................. 27 3.2. BÀN LUẬN ............................................................................................. 36

ƠN

3.2.1. Về phương pháp xử lý mẫu ............................................................ 36 3.2.2. Về lựa chọn điều kiện sắc ký .......................................................... 37

NH

3.2.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký .......................................................... 38 3.3. VỀ KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ........... 39 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ

DẠ

Y

KÈ

M

QU Y

TÀI LIỆU THAM KHẢO

STT

Tên bảng

Trang

Thành phần bài thuốc Nhất gan linh

2.1

Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

3.1

Chương trình 1

3.2

Chương trình 2

3.3

Chương trình dung môi pha động

26

3.4

Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống

27

3.5

Diện tích pic và nồng độ của dung dịch chuẩn BER và SAIKO

29

3.6

Kết quả đánh giá độ chính xác trong ngày và khác ngày

31

3.7

Kết quả khảo sát độ đúng

33

3.8

Kết quả khảo sát LOD, LLOQ

34

OF ƠN

NH

QU Y

M

Một số phương pháp xử lý mẫu BER và SAIKO

KÈ Y

3.10

FI C

1.1

3.9

DẠ

IA L

DANH MỤC CÁC BẢNG

So sánh một số điều kiện và kết quả phân tích BER, SAIKO bằng HPLC

4

18 23 23

37 39

Tên hình Công thức hóa học của Berberin

1.2

Công thức hóa học của Saikosaponin A

3.1

SKĐ với chương trình 1 (a) và chương trình 2 (b)

11

3.2

SKĐ tại tốc độ dòng 0,2mL/phút (a) và 0,3mL/phút (b)

24

3.3

Kết quả khảo sát độ chọn lọc - đặc hiệu: SKĐ mẫu trắng (a), SKĐ mẫu thử (b), SKĐ mẫu chuẩn (c)

25

3.4

Đường chuẩn thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của BER và SAIKO

29

KÈ

M

QU Y

NH

ƠN

OF

1.1

Y DẠ

Trang

FI C

STT

IA L

DANH MỤC HÌNH ẢNH

5 6

ACN

Acetonitrile

BER

Berberin

CS

Cộng sự

DĐVN V

Dược điển Việt Nam V Dimethylformamide

DMSO

Dimethyl sulfoxide

HPLC

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

ƠN

International Conference Harmonization

LLOQ

Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Giới hạn định lượng

NH

LOD

NGL RSD SAIKO SKĐ

M

TCCS

Methanol

TFA

KÈ

YHCT

Nhất gan linh

QU Y

MeOH

Y

OF

DMF

ICH

DẠ

FI C

Chữ viết đầy đủ

Chữ viết tắt

IA L

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Độ lệch chuẩn tương đối Saikosaponin Sắc ký đồ

Tiêu chuẩn cơ sở Acid trifluoroacetic Y học cổ truyền

IA L

ĐẶT VẤN ĐỀ

Y học hiện đại và y học cổ truyền Việt Nam đều đang nỗ lực tìm ra những

FI C

phương pháp, những nghiên cứu để điều trị xơ gan. Có nhiều bài vị thuốc, bài thuốc có giá trị điều trị xơ gan đang được ứng dụng điều trị có hiệu quả. Tuy nhiên, điều trị còn cục bộ, chưa có những phương pháp chung để lượng giá,

OF

đánh giá theo y học hiện đại, chưa thống nhất được các phương pháp chẩn đoán, điều trị bệnh theo y học cổ truyền.

Bài thuốc Nhất gan linh là sự kết hợp các vị thuốc sự kết hợp giữa hai bài

ƠN

cổ phương "Nhất quán tiễn" và "Trư linh thang" đồng thời gia, giảm thêm một số vị thuốc. Từ năm 2013 đến năm 2017, Viện YHCT Quân đội đã sử dụng bài thuốc Nhất gan linh dưới dạng thuốc sắc điều trị cho 86 bệnh nhân xơ gan và đạt

NH

hiệu quả tốt [5]. Tuy nhiên do đường dùng phức tạp, bệnh nhân phải nằm nội trú để điều trị nên tỷ lệ bệnh nhân được điều trị không nhiều. Ngoài ra, khi sử dụng dưới dạng thuốc sắc gặp phải những hạn chế của thuốc YHCT như sử dụng

QU Y

phương pháp sắc truyền thống chỉ chiết bằng nước nên không chiết kiệt được hoặc gia nhiệt cao làm hoạt chất bị phân hủy, …Vì vậy, việc chuyển bài thuốc NGL sang dạng bào chế hiện đại có ý nghĩa quan trọng, giải quyết được các nhược điểm trên, đồng thời góp phần tăng hiệu quả điều trị và có thể sử dụng cho bệnh nhân điều trị ngoại trú. Những nghiên cứu gần đây cho thấy, thành

M

phần berberin trong Hoàng bá và saikosaponin trong sài hồ có tác dụng bảo vệ

KÈ

gan và điều trị bệnh gan [5,6,10]. Tuy nhiên, việc nghiên cứu phân tích đồng thời berberin và saikosaponin còn rất hạn chế, mới chỉ có số ít nghiên cứu nhằm phát hiện sự có mặt của chúng trong bài thuốc cổ truyền Trung Quốc. Do vậy, để

Y

phục vụ nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến vào chuyển dạng bào chế bài

DẠ

thuốc Nhất gan linh, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình định lượng

1

đồng thời berberin và saikosaponin A trong bài thuốc Nhất gan linh bằng sắc

IA L

ký lỏng siêu hiệu năng” nhằm hai mục tiêu như sau:

1. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời berberin và saikosaponin

FI C

trong bài thuốc NGL bằng UPLC

2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời berberin và saikosaponin

DẠ

Y

KÈ

M

QU Y

NH

ƠN

OF

trong bài thuốc NGL bằng UPLC

2

IA L

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH

Theo y học cổ truyền thì sự hình thành của xơ gan có liên quan đến 3 tạng

FI C

can, tỳ và thận. Sự mất kiện vận của tỳ gây thấp nhiệt nội sinh, thanh dương

không thăng lên được, trọc âm không giáng xuống làm ủng trệ trung tiêu, ảnh hưởng tới sự sơ tiết của can; hoặc can khí uất kết lâu ngày gây khí trệ huyết ứ,

OF

can uất hoành nghịch gây thủy thấp đình lưu, huyết ứ uẩn kết, ủng trệ trung tiêu; hoặc nhiệt độc xâm nhập vào tạng can gây chứng thấp nhiệt, khí trệ huyết ứ.

Trên lâm sàng thường có các triệu chứng như ngực sườn đầy tức, ợ hơi, nôn,

ƠN

buồn nôn, chán ăn, đại tiện lỏng... bệnh lâu ngày khí trệ sinh ra huyết ứ, biểu hiện các triệu chứng mạng sườn đau tức tăng cố định, môi lưỡi tím thâm, các hội chứng ứ huyết, xuất huyết.

NH

Khí trệ, huyết ứ, thủy thấp ứ đọng, can huyết hư tổn trong cơ thể lâu ngày sẽ gây can thận âm hư, huyết ứ, thấp nhiệt, thủy thấp đình trệ với các biểu hiện hư thực lẫn lộn, bệnh nhân mệt mỏi, gầy yếu, da xạm, hạ sườn đầy tức, đầy

QU Y

bụng, chán ăn, phù, cổ trướng…

Pháp điều trị ở giai đoạn này chủ yếu "công bổ kiêm trị" vừa tư bổ can thận, dưỡng huyết đồng thời sơ can giải uất, thanh nhiệt, lợi thấp.

Hiện nay, Trung Quốc đã ứng dụng nhiều vị thuốc, bài thuốc y học cổ truyền điều trị xơ gan như: Sài hồ, Nghệ, Hoàng kỳ, Đan sâm, Cỏ nhọ nồi, Lưỡi

M

rắn, Cà gai leo, Nga truật, Cúc gai, Cam thảo bắc, Hoàng bá, Trư linh thang,

KÈ

Nhất quán tiễn, Sài hồ sơ can thang...

Những nghiên cứu gần đây chứng minh hoạt chất Saikosaponin A, B2, C

trong Sài hồ giảm đáng kể các biểu hiện của cytokine viêm, do đó làm giảm

Y

viêm gan và giảm tình trạng vàng da ở chuột, các chất khử trùng được chiết xuất từ lá Sài hồ có tác dụng chống oxy hóa đáng kể và hoạt tính bảo vệ gan. Nghiên

DẠ

cứu in vitro đã chứng minh rằng các saikosaponin làm giảm gốc tự do trong gốc diphenyl picryl hydrazinyl và có thể ngăn chặn sự hình thành superoxide do 3

tham gia quá trình khử các anion superoxide trong tế bào gan. Saikosaponin B2

IA L

cũng là một tác nhân kháng virus hiệu quả. Hoạt chất Berberin có trong dịch chiết Hoàng bá chống xơ hóa giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh gan. Berberine có

FI C

thể bảo vệ tế bào gan khỏi tổn thương do ứ mật thông qua bài tiết các sản phẩm bilirubin từ gan.

Từ nhu cầu bức thiết của điều trị xơ gan, từ lý luận của y học cổ truyền và những nghiên cứu gần đây chứng minh tác dụng của các vị thuốc y

OF

học cổ truyền trong bệnh xơ gan, quá trình ứng dụng bài thuốc y học cổ truyền điều trị có hiệu quả cho bệnh nhân xơ gan tại Viện Y học cổ truyền Quân đội, nhóm nghiên cứu lựa chọn bài thuốc “Nhất gan linh”.

ƠN

Thành phần bài thuốc là sự kết hợp giữa hai bài cổ phương "Nhất quán tiễn" và "Trư linh thang" đồng thời gia, giảm thêm một số vị thuốc. Trong thời

NH

gian từ năm 2013 đến năm 2017, Viện YHCT Quân đội đã sử dụng bài thuốc Nhất gan linh dưới dạng thuốc sắc điều trị cho 86 bệnh nhân xơ gan kết quả các triệu chứng như phù, cổ trướng, vàng da…cải thiện rõ rệt, đa số các triệu chứng

DẠ

Y

KÈ

M

QU Y

cải thiện trên 76%.

4

Số lượng

1

Sa sâm

gram

10

2

Sinh địa

gram

3

Đương quy

gram

4

Xuyên luyện tử

gram

5

Trư linh

gram

10

6

Bạch linh

gram

15

7

Trạch tả

gram

15

8

Râu ngô

gram

15

9

Hoàng bá

gram

10

11

Mẫu đơn bì

gram

10

11

Sơn thù

gram

06

12

Chỉ thực

gram

10

13

Sài hồ

gram

08

14

Mật nhân

gram

10

15

Bạch thược

gram

12

M KÈ

15 12 06

OF

ƠN

NH

Y DẠ

5

IA L

Đơn vị

TT

FI C

Vị thuốc

QU Y

Bảng 1. 1. Thành phần bài thuốc Nhất gan linh

IA L

1.2. TỔNG QUAN VỀ BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN 1.2.1. Hợp chất Berberin (BER)

ƠN

OF

FI C

1.2.1.1. Công thức cấu tạo

NH

Hình 1. 1. Công thức hóa học của Berberin Công thức phân tử: C20H18NO4+.

Trọng lượng mol phân tử: 336,3612 g/mol.

QU Y

Danh pháp quốc tế: 5,6 - dihydro - 9,10 - dimethoxybenzo [g] - 1,3 benzodioxolo [5,6-a] quinolizinium [13].

1.2.1.2. Tính chất lý hóa

Trạng thái: Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng.

M

Độ tan: tan trong nước nóng, ít tan trong ethanol và nước, rất khó tan trong cloroform, không tan trong ether.

KÈ

Nhiệt độ nóng chảy: 145 °C [13].

1.2.1.3. Tác dụng dược lý

Y

Berberine là muối amoni bậc bốn của một alkaloid isoquinoline, màu

DẠ

vàng, có trong rất nhiều cây thuốc như Vàng đắng (Coscinium fenestratum Colebr. Menispermaceae), Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.

Rutaceae), Hoàng liên chân gà hay còn gọi là Xuyên liên (Coptis chinensis 6

Franch. hoặc Coptis quinquesecta Wang. Ranunculaceae), một số cây họ

FI C

IA L

Hoàng liên gai (Berberidaceae), một số cây thuộc họ Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC). Các nghiên cứu cho thấy BER có nhiều tác dụng dược lý gồm: ức chế sự chuyến hóa của một số vi sinh vật, ức chế hình thành nội độc tố vi khuấn, ức chế quá trình tiết dịch ruột và các chất diện giải, ức chế sự co thắt cơ trơn, giảm viêm, ức chế kết tập tiều cầu, tăng số lượng tiểu

OF

cầu trong một số bệnh giảm tiểu cầu, kích thích tiết mật và bilirubin, chống ung thư, nhạy cảm phóng xạ, chống viêm, làm khô vết loét, chống lipid máu và chống đái tháo đường [15]. Điều trị bệnh đường ruột như lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, lỵ amip, viêm ruột, tiêu chảy [13,15], hạ sốt, hạ đường huyết, chống oxy hóa, chẹn

ƠN

kênh kali [15], kháng khuẩn, loại bỏ độc tố [13].

1.2.2. Hợp chất Saikosaponin A (SAIKO)

KÈ

M

QU Y

NH

1.2.2.1. Công thức hóa học

DẠ

Y

Hình 1. 2. Công thức hóa học của Saikosaponin A

Công thức phân tử: C42H68O13 Trọng lượng phân tử: 780,99 g/mol

7

Danh pháp quốc tế: (2S,3R,4S,5S,6R) - 2 - [(2R,3R,4S,5S,6R) - 3,5 -

FI C

IA L

dihydroxy - 2 - [[(1S,2S,4S,5R,8R,9R,10S,13S,14R,17S,18R) - 2 - hydroxy - 9 - (hydroxymethyl) - 4,5,9,13,20,20 - hexamethyl - 24 - oxahexacyclo tetracos -15-en-10-yl] oxy] - 6 - methyloxan - 4 - yl] oxy - 6 - (hydroxymethyl) oxane - 3,4,5 - triol [16].

1.2.2.2. Tính chất lý hóa Trạng thái: chất rắn kết tinh

Nhiệt độ nóng chảy: 225 – 232oC [16].

ƠN

1.2.2.3. Tác dụng dược lý

OF

Độ tan: DMF: 30mg/ml, DMSO: 30mg/ ml, Ethanol: 30mg/ml, Ethanol: PBS (ph 7,2) (1: 9): 0,1mg/ml.

NH

Saikosaponin A là triterpene glycoside được phân lập từ các cây thuốc như Bupleurum spp. Heteromorpha spp. và Scrophularia scorodonia [16].

Các nghiên cứu cho thấy SAIKO có nhiều tác dụng dược lý gồm: Chống viêm không steroid, giảm đau, hạ sốt và ức chế tiểu cầu, là chất chống ung thư, chất tạo phytogenic, tác nhân chống virus và ức chế miễn dịch [16]; Chống viêm,

QU Y

chống nhiệt và tác dụng chống độc gan trong điều trị cảm lạnh thông thường, sốt và viêm gan. Ngoài ra í tai biết đến công dụng ức chế con đường viêm của SSNa trong bệnh béo phì [14].

An thần, chống co giật, hạ huyết áp, chậm nhịp tim và tán huyết, phục hồi chức năng gan và tổn thương mô do galactose gây ra, ức chế bài tiết axit

DẠ

Y

KÈ

M

dạ dày và tăng độ pH của dịch dạ dày, ức chế trypsin, tăng đáng kể tuyến thượng thận. Tác dụng chống mầm bệnh, tác động đến chuyển hóa vật chất, chống bức xạ [10,14,16].

8

1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ PHÂN TÍCH SAIKOSAPONIN VÀ

IA L

BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

FI C

1.3.1. Một số nghiên cứu về phân tích thành phần BER trong hoàng bá bằng HPLC

Hiện nay đã có một số nghiên cứu phân tích thành phần BER trong hoàng bá:

OF

Theo Kamal YT và CS đã phân tích đồng thời BER trong hoàng bá bằng HPLC. Tiến hành phân tích berberin với điều kiện sắc ký gồm: máy HPLC Shimazu, cột Luna C18 (5 µm, 250 x 4,6 mm), pha động là ACN/ acid

ƠN

phosphoric 0,05% (10:80) bao gồm 10 - 80%, tốc độ dòng: 1mL/ phút, bước sóng 266 nm. Kết quả cho thấy pic berberin sắc nét, cân đối, thời gian lưu

NH

10,0 ± 0,4 phút. Kết quả từ phân tích hồi quy tuyến tính cho thấy mối quan hệ tuyến tính tốt (R2 = 0,998 ± 0,0011) trong khoảng tuyến tính (5 – 500 μg/mL). LOD và LOQ lần lượt là 1,5 và 5,3 μg.mL-1, độ thu hồi trung bình: 94,6 – 103,1%. Độ chính xác trong ngày, giữa các ngày và giữa các hệ thống đạt yêu cầu, với độ lệch chuẩn tương đối trong khoảng 0,7 - 1,8%. Hàm lượng

QU Y

berberin trong hoàng bá và công thức bài thuốc tương ứng là 0,033% và 0,0089% [9].

Năm 2015, Lin Ma và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định hàm lượng berberin trong P. amurense (Hoàng bá) từ các độ cao khác nhau trên núi Trường Bạch. Berberin trong các mẫu được chiết xuất bằng áp suất cao (UPE)

M

và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Quá trình phân tách các chất được thực hiện trên cột Hypersil ODS C18 (4,6 mm x 250 mm, cỡ

KÈ

hạt 5 µm). Pha động là hỗn hợp của acetonitrile / trietanolamin 0,3% (pH 3,5) (35:65). Tốc độ dòng:1 mL/phút, nhiệt độ cột là 30oC. Thể tích tiêm: 10µL, bước sóng 265 nm. Tất cả các dung dịch chuẩn và dịch chiết mẫu được lọc

Y

qua màng lọc 0,45 µm trước khi phân tích HPLC. Kết quả cho thấy, hàm

DẠ

lượng dịch chiết trong khoảng 6,576 - 328,8 mg L-1 với RSD < 5,6%, độ chính xác tốt với sai số tương đối RE < 3,6% và tuyến tính tốt (R2 = 0,9998).

[12] 9

Một nghiên cứu khác của G.A. Akowuah và cộng sự tiến hành định

FI C

IA L

lượng Berberin từ dịch chiết cây Vàng đắng (Coscinium fenestratum, Menispermaceae) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Điều kiện sắc ký bao gồm: máy HPLC Agilent 1200 bơm G1311A với bộ khử khí G1322A, đầu dò mảng đi-ốt G1315D (DAD), cột ODS, Chromolith, RP18e, 100 × 4,6 mm. Pha động gồm metanol và nước (90:10), tốc độ dòng 0,5

OF

mL/ phút và nhiệt độ cột là 25°C, thể tích tiêm 20μL. Dung dịch mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi tiêm vào cột. Phép đo được thực hiện ở bước sóng 226, 270 và 340 nm. Hàm lượng berberin được xác định bằng phương pháp HPLC ở bước sóng 270 và 340 nm được phát hiện là cao hơn so với giá trị thu được ở bước sóng 226 nm. Hàm lượng berberin được xác định

ƠN

bằng HPLC nằm trong khoảng từ 0,98% đến 0,99% trong dịch chiết metanol, 0,85% đến 0,88% trong dịch chiết metanol - nước (1: 1), và 0,24 đến 0,25 trong dịch chiết nước [8].

NH

1.3.2. Một số nghiên cứu về phân tích thành phần SAIKO trong sài hồ bằng HPLC Aoxue Liu và CS đã phân tích SAIKO trong Bupleuri Radix bằng HPLC. Điều kiện sắc ký bao gồm: cột C18 Waters (2,7 μm, 150 x 4,6 mm), pha động

QU Y

là acid acetic 0,01% (A)/ ACN (B) với chương trình rửa giải gradient: 0∼55 phút, 30 - 32% B, 50∼58 phút, 32 - 90% B và 58∼60 phút, 90 - 30% B, nhiệt

M

độ cột 50°C. Kết quả cho thấy đường chuẩn có độ tương quan tuyến tính tốt với R2 = 0,998, độ thu hồi trung bình từ 80 - 109%, độ chính xác trong ngày và khác ngày với RSD lần lượt là 1,0 - 1,9% và 1,4 - 2,1% [7].

Năm 2005, Xiu Qinli và CS đã phân tích SAIKO trong Bupleuri Radix

Y

KÈ

bằng HPLC. Saikosaponin-a và -d được chuyển đổi hoàn toàn thành saikosaponin-b1 và -b2 bằng cách xử lý acid nhẹ. Phân tích HPLC được thực hiện trên cột ODS-C18 với tốc độ dòng 1,0 ml/ phút và bước sóng phát hiện 250 nm. Sắc ký đồ của saikosaponin-b1 và -b2 được tách tốt thu được khi rửa giải với hệ dung môi acetonitrile/ acid fomic 1% (37,5: 62,5). Đường chuẩn

DẠ

của saikosaponin-b1 và -b2 tương ứng là tuyến tính trong khoảng 4,9 - 98,0

10

lần lượt là 98,3% (RSD = 3,1%) và 96,4% (RSD = 1,8%) [11].

1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

IA L

μg/ml và 3,5 - 71,0 μg/ml. Độ thu hồi trung bình của saikosaponin-b1 và -b2

FI C

1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của

OF

pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự

ƠN

phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [19,20,23,24].

1.4.2. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký - Thời gian lưu

NH

tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó. t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống

QU Y

sắc ký

tR’ (Thời gian lưu thực): tR’ = tR – t0 W: là chiều rộng đáy pic.

DẠ

Y

KÈ

M

W1/2: là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.

11

IA L FI C OF ƠN NH

Hình 1.3. Minh hoạ các thông số sắc ký

QU Y

- Hệ số dung lượng k k!

𝑉" 𝑄" 𝑡$! 𝑡$ − 𝑡& =𝐾 = = = 𝑉# 𝑄# 𝑡% 𝑡&

Trong đó:

M

VS: thể tích pha tĩnh

Vm: thể tích pha động

KÈ

QS: lượng chất trong pha tĩnh Qm: lượng chất trong pha động

DẠ

Y

Cần chọn cột, pha động... sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1< k’< 8.

- Hệ số chọn lọc a 𝐾' 𝐾'! 𝑡'! a= = = 𝐾( 𝐾(! 𝑡(!

12

IA L

Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1 Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 < a < 2,0 - Hệ số kéo đuôi AS a+b 2𝑎

FI C

𝐴" =

Với a và b đo ở 1/20 chiều cao peak

OF

Nếu AS càng lớn hơn 1, peak kéo đuôi càng nhiều, peak càng mất cân đối.

Hệ số kéo đuôi của peak chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤

ƠN

1,5) - Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột 𝑊)/+, 2𝑎

NH

AF =

+

+

Trong đó

𝑡$ 𝑡$ 7 = 5,54 × ; < 𝑊 𝑊) +

QU Y

N = 16 × 6

W: Chiều rộng đo ở đáy pic.

W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.

KÈ

M

- Độ phân giải Rs R" =

2 × (𝑡$' − 𝑡$( ) 1,18 × (𝑡$' − 𝑡$( ) = 𝑊' + 𝑊( 𝑊)/+' − 𝑊)/+(

DẠ

Y

Trong đó: tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).

WB, WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic.

W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.

13

Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA, W1/2B, W1/2A phải tính theo cùng một đơn

IA L

vị.

Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5.

FI C

1.4.3. Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng [19,20,23,24].

OF

- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiên hành sắc ký trong cùng điều kiện.

Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc

ƠN

chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử.

QU Y

mẫu thử một cách chính xác.

NH

- Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm này gọi là chuẩn nội. Từ những dữ kiện về: diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong - Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu 9 thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng

M

của diện tích hoặc chiều cao pic.

KÈ

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.

1.4.4. Thẩm định quy trình phân tích

DẠ

Y

Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp” (Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào năm 2022 [26], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ 14

đúng, độ chính xác trung gian, độ lặp lại, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và

IA L

miền giá trị. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng không bắt buộc phải có trong quy trình thẩm định.

1.4.4.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống

FI C

Kiểm tra tính tương thích hệ thống là một phần không thể tách rời trong nhiều quy trình phân tích. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống là những phép

OF

thử nhằm đánh giá tính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử. Các thông số của phép thử tính tương thích của hệ thống được thiết lập cho từng quy trình riêng biệt phụ thuộc vào loại quy trình được thẩm 1.4.4.2. Độ chọn lọc - đặc hiệu

ƠN

định. Thông số này đặc biệt quan trọng trong các phương pháp sắc ký [17].

NH

Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Thông thường các thành phần này gồm các tạp chất, sản phẩm phân huỷ, chất nền… Nói cách khác, tính đặc hiệu thể hiện khả năng nhận diện chính xác chất cần phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác

QU Y

Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu: - Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong

M

khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [18,21,23].

1.4.4.3. Khoảng tuyến tính

KÈ

Tính tuyến tính được đánh giá bằng cách quan sát đồ thị của tín hiệu

ứng với nồng độ (hoặc hàm lượng) của chất phân tích. Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao của pic) và nồng độ (hoặc hàm

DẠ

Y

lượng) của chất cần phân tích. Mối quan hệ tuyến tính này phải được đánh giá bằng phương pháp thống kê. Sử dụng phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất).

15

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong

IA L

một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Theo hướng dẫn của ICH, phải áp dụng tối thiểu 5 nồng độ khác nhau để xác định đường tuyến tính.

FI C

Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ nồng độ các mẫu của chất cần phân tích. Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ số 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [17,18,22].

1.4.4.4. Giới hạn phát hiện

định chính xác hàm lượng [17,18,22,26].

ƠN

Phương pháp xác định

OF

Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác

Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc

NH

LOD = 3,3 x SD/S

Trong đó: S là độ dốc của đường chuẩn định lượng SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.

SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc

QU Y

dựa vào đường chuẩn định lượng.

1.4.4.5. Giới hạn định lượng

M

Giới hạn định lượng (LLOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp [17,18,22,26].

KÈ

Phương pháp xác định Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc LLOQ =10 x SD/S

DẠ

Y

Trong đó:

S là độ dốc của đường chuẩn độ.

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.

16

SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc

IA L

dựa vào đường cong chuẩn độ 1.4.4.6. Độ đúng

FI C

Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với một mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định [17,18,21,25].

OF

Phương pháp xác định

Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần

ƠN

mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau).

NH

Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau: Tỷ lệ phục hồi = Trong đó:

𝑋M × 100% µ

QU Y

𝑋M là giá trị mẫu đo được

µ là giá trị mẫu theo lý thuyết.

Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý

M

mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2%. Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao.

KÈ

1.4.4.7. Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử

DẠ

Y

riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [17,18,22,26].

Phương pháp xác định

17

Độ lặp lại: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích

IA L

trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại còn được gọi là độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng. Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD).

FI C

Độ chính xác trung gian: Tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Phân tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống máy thay đổi.

OF

Yêu cầu

DẠ

Y

KÈ

M

QU Y

NH

ƠN

Giá trị RSD nhỏ hơn 2% .

18

IA L

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên vật liệu

FI C

Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu được tổng hợp trong bảng 2.1 Bảng 2. 1. Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu Nguyên liệu

Xuất xứ

1

Berberin chuẩn

Viện KNTTW

2

Saikosaponin A chuẩn

Trung Quốc

3

Bài thuốc nhất gan linh

Việt Nam

4

ACN

5

Acid formic

6

Nước cất 2 lần

7

Methanol

Tiêu chuẩn CAS: C0420168.04 Độ tinh khiết: 86,2% Số lô: A14GB145174 Hàm lượng: ³ 98% TCCS

ƠN

OF

STT

HPLC

Merck

HPLC

Việt Nam

DĐVN V

Đức

HPLC

NH

Merck

Và một số hoá chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn phân tích.

QU Y

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Acquity UPLC; cột Acquity UPLC BEH C18 1,7 micromet; 2,1 x 100mm (Mỹ).

Màng lọc Sartorius Minisart kích thước lỗ lọc 0,45 µm (Đức).

Bộ lọc hút chân không thuỷ tinh xốp có gắn màng lọc PE (Sartotius,

M

Đức).

Bề siêu âm Elma (Elmasonic S 100H, Đức).

KÈ

Cân phân tích ML 204/01 (± 0,1 mg, Mettler Toledo, Thụy Sĩ).

Các dụng cụ thí nghiệm khác như: ống nghiệm, cốc có mỏ, phễu lọc, giấy lọc, ... đạt tiêu chuẩn phân tích và kiểm nghiệm.

Y

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu

DẠ

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học - Viện nghiên cứu y dược học quân sự - Học viện Quân y.

19

IA L

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời BER và SAIKO 2.2.1.1. Phương pháp xử lý mẫu

FI C

Dung dịch chuẩn gốc BER: Cân chính xác khoảng 10,0 mg BER chuẩn, cho vào bình định mức 5mL, thêm khoảng 3 mL MeOH, siêu âm trong khoảng 15 phút cho BER tan hết, thêm MeOH đến vạch, lắc đều, thu được

OF

dung dịch BER có nồng độ BER khoảng 2000,0 µg/mL. Dung dịch chuẩn gốc SAIKO: Cân chính xác khoảng 10,0 mg SAIKO chuẩn, cho vào bình định mức 5 mL, thêm khoảng 3 mL MeOH, siêu âm

ƠN

trong khoảng 15 phút cho SAIKO tan hết, thêm MeOH đến vạch, thu được dung dịch có nồng độ SAIKO khoảng 2000,0 µg/mL.

NH

Dãy chuẩn hỗn hợp BER và SAIKO làm việc: từ dung dịch chuẩn gốc BER và SAIKO đem pha loãng với MeOH để được dãy chuẩn hỗn hợp BER và SAIKO có nồng độ trong khoảng 5,0 - 50,0 µg/mL. Mẫu thử dịch chiết bài thuốc NGL: Cân chính xác khoảng 10,0 g bột bài thuốc NGL đã nghiền mịn, chiết nóng có khuấy trộn với khoảng 50,0 mL

QU Y

MeOH trong 1h ở 40°C. Ly tâm thu dịch chiết để riêng, bã tiếp tục chiết với khoảng 30,0 mL MeOH tương tự như trên. Tập trung toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 100 mL, bổ sung vừa đủ thể tích bằng MeOH. Lọc dịch chiết qua màng 0,45 µm để phân tích HPLC. 2.2.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký

M

Dựa vào các tính chất của BER và SAIKO và các tài liệu tham khảo [18,30], tiến hành khảo sát phương pháp phân tích với các điều kiện như sau:

KÈ

Điều kiện cố định: • Detector PDA.

DẠ

Y

• Thể tích tiêm: 10µL.

• Nhiệt độ cột: 30°C. a) Khảo sát chương trình dung môi pha động.

Tiến hành sắc ký một mẫu chuẩn và một mẫu thử với các điều kiện cố

định trên, tốc độ dòng là 0,2 mL/phút, pha động bao gồm pha động 1: ACN 20

và 0,1% TFA hoặc pha động 2: acid phosphoric 0,01% và ACN với tỉ lệ thay

IA L

đổi theo chương trình dung môi.

FI C

Sau khi thu được SKĐ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng các chương trình khảo sát, lựa chọn chương trình cho kết quả SKĐ thích hợp nhất cho các khảo sát tiếp theo. b) Khảo sát tốc độ dòng

OF

Tiến hành khảo sát tốc độ dòng ở các giá trị là 0,2 mL/phút; 0,3 mL/phút.

Tiến hành sắc ký một mẫu chuẩn và một mẫu thử với các điều kiện đã

ƠN

lựa chọn. Sau khi thu được SKĐ của mẫu chuẩn và mẫu thử ở 2 tốc độ dòng khác nhau, lựa chọn tốc độ dòng cho kết quả SKĐ thích hợp nhất để hoàn thiện quy trình định lượng BER và SAIKO bằng phương pháp HPLC. 2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời BER và SAIKO

NH

Thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của ICH, đánh giá các chỉ tiêu sau: 2.2.2.1. Tính tương thích hệ thống

QU Y

Tiến hành tiêm 6 lần mẫu chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 20 μg/mL vào hệ thống UPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi lại kết quả: thời gian lưu, diện tích, hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết và tính toán giá trị RSD (%).

2.2.2.2. Tính chọn lọc - đặc hiệu

KÈ

M

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã xác định các mẫu: mẫu chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/mL, mẫu thử và mẫu trắng (MeOH). Ghi lại các sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của hoạt chất.

Yêu cầu: pic của BER và SAIKO trong SKĐ mẫu chuẩn phải cân đối,

DẠ

Y

sắc nét, trong SKĐ mẫu thử phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp, đồng thời không xuất hiện trong SKĐ mẫu trắng.

21

IA L

2.2.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

FI C

Tiến hành sắc ký dãy chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng 5,0 - 50,0 µg/mL theo điều kiện đã xây dựng, ghi lại đáp ứng pic của BER và SAIKO tại các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi quy thể hiện sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của BER và SAIKO, xác định hệ số tương quan R2.

2.2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

OF

Tiến hành sắc ký 3 lần mẫu trắng là MeOH. Ghi lại độ nhiễu đường nền tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của BER và SAIKO Giá trị LOD, LLOQ được xác định theo công thức:

ƠN

LOD=k. SD/S

2.2.2.5. Độ đúng

NH

Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của đáp ứng của mẫu trắng, S là độ dốc đường hồi quy tuyến tính; k = 3,3 cho LOD; k = 10 cho LLOQ.

Độ đúng của phương pháp được thực hiện theo phương pháp thêm chuẩn: Hút chính xác 1 mL mẫu thử và 1 mL mẫu chuẩn có nồng độ chính

QU Y

xác khoảng 20 µg/mL bằng micropipet, trộn đều, thu được mẫu thử thêm chuẩn. Tiến hành phân tích 6 mẫu độc lập theo điều kiện đã lựa chọn. Căn cứ vào đường hồi quy tuyến tính, diện tích pic của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn để tìm lại lượng mẫu chuẩn thêm vào ban đầu. Độ thu hồi hoạt chất được xác định dựa vào tỉ lệ % lượng tìm thấy theo đường chuẩn so với lượng

M

thực tế thêm vào.

KÈ

2.2.2.6. Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác

trung gian.

DẠ

Y

• Độ lặp lại của phép đo Đô ḷ ặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm riêng biệt

6 mẫu thử (có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch 22

chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký S peak

IA L

và thời gian lưu tR.

Yêu cầu: Với phép thử định lượng: Giá trị RSD ≤ 2,0%. Các trường hợp giá trị RSD trên 2%, cần phải có sự giải thích phù hợp.

FI C

• Độ chính xác trung gian

OF

Tiến hành như độ lặp lại và làm trong 2 ngày khác nhau cùng với điều kiện và người thực hiện.

Yêu cầu: Giá trị RSD từ 6 mẫu chuẩn trong một ngày và 6 mẫu chuẩn trong ngày khác đều có RSD ≤ 2,0%.

ƠN

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu

DẠ

Y

KÈ

M

QU Y

NH

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và các phần mềm thống kê y học.

23

IA L

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

FI C

3.1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng

Căn cứ vào các tài liệu tham khảo và dựa trên các khảo sát sơ bộ, đề tài lựa chọn các điều kiện cố định gồm: Cột: Acquity UPLC BEH C18 1,7

OF

micromet; 2,1 x 100mm, detector PDA, thể tích tiêm: 10μL, nhiệt độ cột: 30°C, tiến hành khảo sát tỷ lệ các thành phần pha động và tốc độ dòng để xây dựng phương pháp định lượng HPLC. 3.1.1.1. Kết quả khảo sát chương trình dung môi pha động

ƠN

Khi có các điều kiện trên, khảo sát tỉ lệ thành phần pha động theo các chương trình sau:

Thời gian (phút)

NH

Bảng 3. 1. Chương trình 1 0,1% TFA

% ACN

90

10

55

45

11,90 → 12,00

45

55

12,00 → 15,00

90

10

0,00 → 10,20

QU Y

10,20 → 11,90

M

Bảng 3. 2. Chương trình 2 0,01% Acid phosphoric

% ACN

0,00 → 10,20

90

10

10,20 → 11,90

55

45

11,90 → 12,00

45

55

12,00 → 15,00

90

10

Y

KÈ

Thời gian (phút)

DẠ

Với mỗi chương trình dung môi, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn một mẫu chuẩn (khoảng 20,0 μg/mL), tốc độ dòng là 0,2 mL/phút, kết quả được trình bày ở hình 3.1.

24

IA L (b)

QU Y

NH

ƠN

OF

FI C

(a)

Hình 3. 1. SKĐ với chương trình 1 (a) và chương trình 2 (b) Kết quả hình 3.1 cho thấy:

M

Với chương trình 1: trong SKĐ đường nền không ổn định, chân pic không gọn, thời gian lưu của BER là 9,787 và SAIKO là 11,038.

Với chương trình 2: trong SKĐ pic của BER và SAIKO lần lượt xuất

KÈ

hiện ở 8,709 và 11,484 phút, pic cân đối, sắc nét, các pic thử đã tách hoàn toàn.

DẠ

Y

Như vậy, SKĐ của chương trình 2 đáp ứng được yêu cầu của phương pháp. Do đó, lựa chọn chương trình 2 (CT2) để tiếp tục khảo sát.

25

IA L

3.1.1.2. Kết quả khảo sát tốc độ dòng

FI C

Tiến hành khảo sát pha động ở 3 tốc độ dòng khác nhau là: 0,2 mL/phút (CT2); 0,3 mL/phút (CT1). Ở mỗi giá trị tiêm sắc ký một mẫu chuẩn (khoảng 20,0 μg/mL) theo các điều kiện đã lựa chọn. Kết quả được trình bày ở hình 3.2.

QU Y

NH

ƠN

OF

(a)

DẠ

Y

KÈ

M

(b)

Hình 3. 2. SKĐ tại tốc độ dòng 0,2mL/phút (a) và 0,3mL/phút (b)

26

Từ kết quả hình 3.2. cho thấy, khi thay đổi tốc độ dòng thì thời gian lưu

FI C

IA L

và hình dạng pic của BER và SAIKO có thay đổi, nhưng vẫn đảm bảo các pic này được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn. So với tốc độ dòng 0,2 mL/phút thì ở tốc độ dòng 0,3 mL/phút có áp suất cao nên đường nền không ổn định ảnh hưởng đến kết quả. Do đó, tốc độ dòng 0,2 mL/phút là phù hợp nhất nên được lựa chọn để tiếp tục khảo sát.

OF

Từ các kết quả đã khảo sát, đề tài đã lựa chọn được điều kiện phân tích định lượng đồng thời BER và SAIKO trong bài thuốc NGL như sau: Cột: Acquity UPLC BEH C18 1,7 micromet; 2,1 x 100mm.

Detector PDA: lựa chọn bước sóng 210 nm.

ƠN

Thể tích tiêm: 10 μL. Nhiệt độ cột: 30ºC

NH

Dung môi pha động: Acid phosphoric 0,01%/ACN với chương trình như sau: Bảng 3. 3. Chương trình dung môi pha động 0,01% Acid phosphoric

% ACN

0,00 → 10,20

90

10

10,20 → 11,90

55

45

11,90 → 12,00

45

55

12,00 → 15,00

90

10

M

QU Y

Thời gian (phút)

KÈ

3.1.2. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng 3.1.2.1. Tính tương thích hệ thống Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành tiêm 6 lần mẫu chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 20,0 μg/mL vào hệ thống UPLC, sắc ký

DẠ

Y

với điều kiện đã chọn, kết quả được trình bày ở bảng 3.4.

27

STT

Thời gian lưu TR (phút)

Spic (μAU.s)

IA L

Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống Hệ số bất đối xứng

Số đĩa lý thuyết BER

SAIKO

BER

SAIKO

BER SAIKO

1

8,754

11,484

625745

232765

1,29

1,28

6399

7945

2

8,790

11,484

621357

228562

1,32

1,25

6457

8019

3

8,779

11,487

621856

229147

1,29

1,26

6645

7966

4

8,775

11,490

623145

228873

1,27

1,30

6534

8299

5

8,764

11,493

619832

232412

1,33

1,31

6757

8217

6

8,753

11,488

623845

231832

1,28

1,28

6512

7964

𝐗

8,769

11,488

622630

230599

1,30

1,28

6551

8068

SD

0,015

0,004

0,02

0,02

130

151

RSD (%)

0,168

0,030

1,80

1,62

1,99

1,87

0,839

SAIKO

NH

0,333

OF

ƠN

2073,311 1935,746

FI C

BER

Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy, thời gian lưu cả BER là 8,769 ± 0,015 (RSD% = 0,168%) và của SAIKO là 11,488 ± 0,004 (RSD% = 0,030%). Diện

QU Y

tích pic của BER tại nồng độ khảo sát là 622630 ± 2073,311 (RSD% = 0,333%) và SAIKO là 230599 ± 1935,746 (RSD% = 0,839%). Hệ số bất đối xứng của pic BER là 1,30 ± 0,02 (RSD% = 1,80%), của pic SAIKO là 1,28 ± 0,02 (RSD% = 1,62%). Số đĩa lý thuyết của pic BER là 6551 ± 130 (RSD% =

M

1,99%), của pic SAIKO là 8068 ± 151 (RSD% = 1,87%). Như vậy, độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) về thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối xứng, số

KÈ

đĩa lý thuyết của cả hai chất này đều thấp, điều này khẳng định các điều kiện sắc ký và hệ thống UPLC sử dụng phù hợp và đảm bảo ổn định cho định lượng đồng thời BER và SAIKO.

Y

3.1.2.2. Độ chọn lọc- độ đặc hiệu

DẠ

Để đánh giá độ chọn lọc – đặc hiệu, tiến hành sắc ký liên tiếp mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Kết quả được trình bày ở hình 3.3.

28

(b)

QU Y

NH

ƠN

OF

FI C

IA L

(a)

Y

KÈ

M

(c)

DẠ

Hình 3. 3. Kết quả khảo sát độ chọn lọc - đặc hiệu: SKĐ mẫu trắng (a), SKĐ mẫu thử (b), SKĐ mẫu chuẩn (c) 29

Từ kết quả hình 3.3 cho thấy, tại vị trí xuất hiện đáp ứng pic của BER và

FI C

IA L

SAIKO trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất hiện pic tương ứng trên sắc ký đồ mẫu thử và đồng thời không xuất hiện pic tương ứng trên mẫu trắng. Pic của BER và SAIKO trên mẫu thử là cân đối, sắc nét, tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Do đó, phương pháp và điều kiện sắc ký đã lựa chọn đảm bảo độ chọn lọc và đặc hiệu khi phân tích BER và SAIKO. 3.1.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính

OF

Tiến hành sắc ký dãy chuẩn hỗn hợp BER và SAIKO có khoảng nồng độ từ 5,0 – 50,0 μg/mL theo điều kiện đã lựa chọn. Kết quả diện tích pic và nồng độ của dung dịch chuẩn BER và SAIKO được trình bày trong bảng 3.5 và hình

ƠN

3.4.

Bảng 3. 5. Diện tích pic và nồng độ của dung dịch chuẩn BER và SAIKO Berberin

1

5,05

NH

STT

142654

5,10

53654

2

10,10

286321

10,02

106760

15,15

427154

15,30

162867

20,20

622630

20,40

230599

30,30

867432

30,60

338785

50,50

1497631

51,00

556689

4

KÈ

M

5 6

Nồng độ (μg/mL)

Spic (μAU.s)

Nồng độ (μg/mL)

Spic (μAU.s)

QU Y

3

y = 29746x + 10307 R2 = 0,9985

Y

Đường chuẩn

DẠ

Saikosaponin A

30

y = 11019x – 1966,5 R2 = 0,9993

IA L BER

SAIKO

FI C

y = 29746x - 10307 R² = 0,9985

1500000

1200000

900000

OF

Diện tích pic µAU.S

1800000

y = 11019x - 1966,5 R² = 0.9993

300000

0 0

10

20

ƠN

600000

30

40

50

60

NH

Nồng độ ( µg/mL)

Hình 3. 4. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của BER và SAIKO

QU Y

Từ kết quả bảng 3.5 và hình 3.4 cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát, có mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của BER và SAIKO. Đường tương quan thu được là đường thẳng có hệ số tương quan R2 của BER là 0,9985 và SAIKO là 0,9993. Do đó, có thể sử dụng phương pháp HPLC để định lượng BER và SAIKO trong các mẫu phân tích.

M

3.1.2.4. Độ chính xác

KÈ

Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn. Dựa vào kết quả định lượng

DẠ

Y

và phương trình đường chuẩn, tính được nồng độ BER/ SAIKO xác định độ chính xác trung gian và độ lặp lại. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6.

31

IA L

Bảng 3. 6. Kết quả đánh giá độ chính xác trong ngày và khác ngày BERBERIN Mẫu

Khối lượng mẫu cân

Diện tích pic

1

10,35

1393472

2

10,21

1387739

3

10,65

1401922

47,48

4

10,25

1387955

47,01

5

10,16

1376828

46,63

6

10,44

1398374

47,36

TB ± SD

DẠ

Y

FI C

47,19 47,00

47,01 ± 0,30 0,64

1

10,13

1358329

2

10,38

1408392

3

10,20

1378493

46,69

4

10,25

1389404

47,06

5

10,17

1369392

46,38

6

10,42

1410382

M

KÈ

3

Nồng độ

OF

QU Y

RSD

NH

1

ƠN

Ngày

46,01 47,69

47,76

TB ± SD

46,93 ± 0,71

RSD

1,50 32

Diện tích pic

Nồng độ

1

10,34

106849

9,88

2

10,21

105039

3

10,66

109748

4

10,25

106824

9,87

5

10,16

103762

9,60

6

10,44

RSD

10,13

QU Y

1

108382

NH

TB ± SD

OF

1

DẠ

Y

9,71

10,14

10,01 9,87 ± 0,20 1,99

104572

9,67

2

10,38

107493

9,93

3

10,20

105782

9,78

4

10,25

106743

9,87

5

10,17

104920

9,70

6

10,42

109018

10,07

M

KÈ

3

FI C

Mẫu

Khối lượng mẫu cân

ƠN

Ngày

IA L

SAIKOSAPONIN A

TB ± SD

9,84 ± 0,15

RSD

1,55

33

Từ kết quả bảng 3.6 cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối RSD% ở các

FI C

IA L

nồng độ khảo sát trong ngày và khác ngày đều < 2% với cả BER và SAIKO. Như vậy, phương pháp phân tích có độ chính xác cao, đảm bảo yêu cầu để định lượng BER và SAIKO trong các mẫu phân tích, đảm bảo độ chính xác trung gian và độ lặp lại.

3.1.2.5. Độ đúng

Kết quả khảo sát độ đúng được trình bày ở bảng 3.7.

OF

Bảng 3. 7. Kết quả khảo sát độ đúng

Hàm lượng Lượng trong thu hồi mẫu thử (μg) (Spic μg/mL)

Saikosaponin A

ƠN

Berberin

Diện Độ tích thu hồi pic (%) (μAU.s)

Hàm lượng trong mẫu thử (Spic (μg/mL)

Lượng thu hồi (μg)

Độ thu hồi (%)

Diện tích pic (μAU.s)

1

996912

33,86

9,91

98,13

163547

15,02

10,07

98,73

2

1000432

33,98

10,03

99,30

166385

15,28

10,33

101,26

3

1006788

34,19

10,24

101,41

167579

15,39

10,44

102,32

4

1007884

34,23

10,28

101,78

165881

15,23

10,28

100,81

999577

33,95

10,00

99,01

168979

15,51

10,56

103,57

34,29

10,34

102,37

166158

15,26

10,31

101,06

QU Y

M

KÈ

5

100,33

101,29

SD

1,74

1,62

RSD

1,73

1,60

DẠ

TB

1005209

Y

6

NH

Mẫu

34

IA L

FI C

Từ kết quả bảng 3.7 cho thấy, tại các giá trị khảo sát có độ thu hồi lớn, từ 98,13% - 102,37% đối với BER; từ 98,73% - 103,57% đối với SAIKO. Giá trị độ lệch chuẩn (RSD%) giữa các mẫu tại điểm khảo sát < 2%. Như vậy, phương pháp phân tích có độ đúng cao, đảm bảo yêu cầu để định lượng BER và SAIKO trong các mẫu phân tích.

3.1.2.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

OF

Để xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, tiến hành tiêm sác ký 3 lần mẫu trắng, ghi lại độ nhiễu đường nền tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của BER và SAIKO, thể hiện ở bảng 3.8.

ƠN

Bảng 3. 8. Kết quả khảo sát LOD, LLOQ Độ nhiễu đường nền tại thời gian lưu của SAIKO (μAU.s)

3922

6892

2083

7929

1893

3908

1120,629

2087,585

0,124

0,625

0,377

1,895

NH

Mẫu

Độ nhiễu đường nền tại thời gian lưu của BER (μAU.s)

1 3 SD LOD (μg/mL)

M

LLOQ (μg/mL)

QU Y

2

DẠ

Y

KÈ

Từ số liệu bảng 3.8, áp dụng công thức tính cho kết quả giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của BER lần lượt là 0,124 μg/mL và 0,377 μg/mL; của SAIKO lần lượt là 0,625 μg/mL và 1,895 μg/mL.

35

IA L

3.2. BÀN LUẬN 3.2.1. Về phương pháp xử lý mẫu

Tác giả

Mục đích phân tích

Dung Phương môi, tỉ lệ pháp dung môi/ chiết nguyên liệu

OF

STT

FI C

Bảng 3. 9. Một số phương pháp xử lý mẫu BER và SAIKO

3

Jung Won Choi và CS [28]

DẠ

Y

5

ƠN

NH

Ngâm

Định lượng đồng thời các dẫn xuất saikosaponin trong Siêu âm Sài hồ

Định lượng Berberin Theo trong bài thuốc J.V.Srinivasan YHCT Soxhlet và CS [29]

KÈ

4

In-Seon Park và CS [27]

Định lượng Saikosaponin A trong Sài hồ

QU Y

2

Đề tài khóa luận

M

1

Định lượng đồng thời BER và SAIKO trong Siêu âm bài thuốc NGL

Dược điển Việt Nam V [30]

Định lượng đồng thời berberin clorid và palmitin clorid trong Siêu âm Hoàng bá

36

Thời gian chiết/ lần

Methanol 10/1

2h/lần

Ethanol 35/1

7h

Ethanol 70% 8/1

2h, chiết 2 lần

Methanol 10/1

12h

Methanol 250/1

30 phút

Để định lượng được chính xác hàm lượng của BER và SAIKO trong

IA L

bài thuốc NGL, dung môi và phương pháp chiết xuất phải đảm bảo chiết kiệt hoạt chất trong đó. Để phân tích thành phần BER và SAIKO, các tác giả sử dụng phương pháp chiết xuất khác nhau (bảng 4.1).

FI C

Qua bảng 3.9 cho thấy, tác giả Jung Won Choi và CS [28] và Dược điển Việt Nam V [30] đã sử dụng phương pháp chiết siêu âm, dung môi là

OF

Methanol/ Ethanol. Bài thuốc NGL được bào chế dưới dạng viên nang. Do đó để phục vụ nghiên cứu đánh giá tác dụng dược lý của bài thuốc, việc chiết bằng Methanol là hợp lý. Đối với nghiên cứu định lượng BER và SAIKO, các tác giả sử dụng dung môi Methanol/ Ethanol. Việc sử dụng dung môi có khả năng hòa tan tốt

NH

ƠN

hay phương pháp chiết phù hợp, hiệu quả chiết xuất tăng, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu. Do vậy, để định lượng đồng thời BER và SAIKO trong bài thuốc NGL, trong nghiên cứu này sử dụng dung môi MeOH, phương pháp siêu âm để chiết xuất là phù hợp với nghiên cứu đã được công bố.

3.2.2. Về lựa chọn điều kiện sắc ký

QU Y

Nhiều nghiên cứu phân tích thành phần có tác dụng sinh học trong Hoàng bá, Sài hồ, hay định tính các hợp chất trong bài thuốc YHCT lựa chọn cột sắc ký là loại C18 1,7micromet; 2,1 x 100mm. Kết quả cho thấy, nghiên cứu của In-Seon Park và CS [27] định lượng đồng thời được 3 chất trong Sài hồ, trong Dược điển Việt Nam V [30] định lượng đồng thời được 2 chất trong

M

đại hoàng, điều này cho thấy khả năng phân tách các hợp chất của cột C18 1,7micromet; 2,1 x 100mm là rất tốt, pic của các chất phân tích trong mẫu chuẩn thì cân đối, sắc nét, trong mẫu thử thì tách hoàn toàn khỏi các pic tạp.

KÈ

Do đó, trong nghiên cứu này lựa chọn loại cột sắc ký là C18 1,7micromet; 2,1 x 100mm.

Y

Bên cạnh cố định loại cột sắc ký, đề tài cố định một số điều kiện khác gồm: loại dung môi pha động, thể tích tiêm là 10μL, nhiệt độ cột là 30ºC

DẠ

nhằm giảm thời gian và chi phí nghiên cứu.

37

IA L

3.2.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký Bảng 3.10. So sánh một số điều kiện và kết quả phân tích BER, SAIKO bằng HPLC

Dung môi

FI C

Tác giả

OF

STT

Tốc độ dòng (mL/ phút)

Thời gian lưu (phút)

Đề tài khóa luận

ACN/ acid phosphoric 0,01%

0,2

8,77

11,49

15

2

In-Seon Park và CS [27]

ACN/ nước

1

-

12,20

40

3

Jung Won Choi và CS [28]

ACN/ nước

1,1

-

30,70

60

4

Theo J.V.Srinivasan và CS [29]

ACN/ nước

0,6

8,89

-

30

5

Theo Kalma và CS [8]

ACN/ acid orthophosphoric 0,05%

1

10,08

-

25

6

Theo Lin Ma và CS [12]

ACN/ triethanolamine 0,3%

1

8,82

-

15

KÈ

M

QU Y

NH

ƠN

1

Y DẠ

BER

Thời gian phân tích SAIKO mẫu (phút)

38

Qua bảng so sánh các kết quả nghiên cứu (bảng 3.10) cho thấy:

FI C

IA L

Nghiên cứu về định lượng SAIKO trong Sài hồ, In-Seon Park và CS [27] định lượng SAIKO trong đó kết quả thời gian lưu của SAIKO là 12,20 phút với thời gian phân tích mẫu là 40 phút, hay Jung Won Choi và CS [28] định lượng SAIKO trong đó kết quả thời gian lưu của SAIKO là 30,70 phút với thời gian phân tích mẫu là 60 phút

OF

Nghiên cứu về định lượng BER trong Hoàng bá, J.V.Srinivasan và CS [29] định lượng BER trong đó kết quả thời gian lưu của BER là 8,89 phút, Kalma và CS [9] định lượng BER trong đó kết quả thời gian lưu của BER là 10,08 phút, hay Lin Ma và CS [12] định lượng BER trong đó kết quả thời gian lưu của BER là 8,82 phút.

NH

ƠN

Như vậy, các nghiên cứu trên về BER trong hoàng bá và SAIKO trong Sài hồ có kết quả thời gian lưu lớn, thời gian phân tích mẫu kéo dài, gây tốn kém về thời gian và chi phí phân tích. Trong khi đó, phương pháp định lượng đồng thời của BER và SAIKO trong bài thuốc NGL trong nghiên cứu này cho thời gian lưu của BER và SAIKO lần lượt là 8,77 và 11,49 phút, rút ngắn

QU Y

được thời gian phân tích mẫu còn 15 phút, khi đó sẽ tiết kiệm được thời gian và chi phí cho việc phân tích và các nghiên cứu tiếp theo.

Ngoài ra, một điều kiện khác mà nghiên cứu này khảo sát là tốc độ dòng pha động. Đề tài lựa chọn khảo sát tốc độ dòng nhằm đánh giá ảnh hưởng của nó đến kết quả phân tích. Kết quả thực tế cho thấy, so với tốc độ

M

dòng 0,3 mL/phút, tốc độ dòng 0,2 mL/phút cho pic có đỉnh nhọn và đáy hẹp hơn, pic thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp, pic không có hiện tượng dính. Do đó, đề tài lựa chọn tốc độ dòng pha động là 0,2 mL/phút.

KÈ

3.3. VỀ KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Phương pháp định lượng đồng thời BER và SAIKO trong bài thuốc NGL đã được thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn của ICH với các chỉ tiêu:

DẠ

Y

Tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác. Phương pháp định lượng có khoảng nồng độ tuyến tính trong khoảng 5,0 – 50,0 μg/mL, đảm bảo phân tích được các mẫu với các nồng độ chất phân tích khác nhau.

39

Qua quá trình nghiên cứu, rút ra các kết luận sau:

IA L

KẾT LUẬN

FI C

1. Đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời BER và SAIKO trong bài thuốc NGL

Đã lựa chọn được điều kiện sắc ký gồm: Cột: Acquity UPLC BEH C18 1,7micromet; 2,1 × 100mm (Mỹ), detector PDA, bước sóng 210nm, tốc độ

OF

pha động: 0,2 mL/phút, thể tích tiêm mẫu: 10μL, nhiệt độ cột: 30ºC, dung môi pha động là 0,01% acid phosphoric/ ACN với chương trình như sau: 0,01% Acid phosphoric

% ACN

0,00 → 10,20

90

10

ƠN

Thời gian (phút)

10,20 → 11,90

12,00 → 15,00

45

45

55

90

10

NH

11,90 → 12,00

55

QU Y

2. Đã thẩm định được quy trình định lượng đồng thời BER và SAIKO trong bài thuốc NGL Phương pháp định lượng đã được thẩm định đáp ứng đầy đủ các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, độ chọn lọc – đặc hiệu, khoảng tuyến tính từ 5,0 – 50,0 μg/mL, giới hạn phát hiện của BER và SAIKO lần lượt là 0,124

M

μg/mL và 0,625 μg/mL, giới hạn định lượng dưới của BER và SAIKO lần lượt là 0,377 μg/mL và 1,895 μg/mL, độ đúng cao (độ thu hồi từ 98,13% 102,37% đối với BER và từ 98,73% - 103,57% đối với SAIKO, độ chính xác

DẠ

Y

KÈ

cao (giá trị RSD của BER và SAIKO < 2%).

40

IA L

KIẾN NGHỊ Sau khi hoàn thành đề tài, chúng tôi kiến nghị một số vấn đề sau:

FI C

- Nghiên cứu khảo sát, xây dựng quy trình chiết xuất hoạt chất từ bài thuốc NGL - Bào chế bán thành phẩm, khảo sát tính an toàn, tác dụng của bài thuốc

DẠ

Y

KÈ

M

QU Y

NH

ƠN

OF

NGL

41

1.

IA L

TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Quốc Anh, Ngô Quý Châu (2012), “Xơ gan”, Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh nội khoa, NXB Y học, tr. 494-497.

3.

FI C

2. Đại học Y Hà Nội (2011), “Viêm gan B”, Điều trị học Nội khoa Tập I, nhà xuất bản Y học, tr. 197 -199.

Bộ Y tế (2014), “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh viêm gan vi rút

4.

OF

B”, (Ban hành kèm theo Quyết định số 5448/QĐ-BYT ngày 30 tháng 12 năm 2014 của Bộ trưởng Bộ Y tế).

Hải Thượng Lãn Ông Lê Hữu Trác (2008), Hải Thượng Y tông tâm lĩnh tập 2, NXB Y học.

Trần Văn Kỳ (2013), Dược học cổ truyền, Nhà xuất bản Đà Nẵng

6.

Liu C.T., Chuang P.T., Wu C.Y., et al (2006), Antioxidative and in vitro hepatoprotective activity of bupleurum kaoi leaf infusion. Phytother. Res. PTR, tr. 1003–1008.

Aoxue Liu, Tongtong Xu và Wenning Yang (2021), Quantitative Determination of 7 Saikosaponins in Xiaochaihu Granules Using High-

NH

7.

ƠN

5.

8.

QU Y

Performance Liquid Chromatography with Charged Aerosol Detection.

Journal of Analytical Methods in Chemistry, tr. 65-69 G.A. Akowuah và các cộng sự. (2014), Evaluation of HPLC and Spectrophotometric Methods for Analysis of Bioactive Constituent Berberine in Stem Extracts of Coscinium fenestratum, Acta Kamal Yt, Mhaveer Singh và Ennus Tajuddin Tamboli (2011), Quantitative Analysis of Berberine in Berberis aristata Fruits and in a

KÈ

9.

M

Chromatographica 26(2), tr. 243–254.

Traditional Anti-Inflammatory Unani Formulation by Use of a Validated HPLC Method. Acta Chromatographica. 23(1), tr. 157-168.

DẠ

Y

10. L.A. Baltina và các cộng sự. (2015), Glycyrrhizic acid derivatives as influenza A/H1N1 virus inhibitors, Bioorg. Med. Chem. Lett. 25, tr.

1742-1746.

11. Li, X. Q. và các cộng sự. (2005), High performance liquid

IA L

chromatographic assay of saikosaponins from radix Bupleuri in China, Biol Pharm Bull. 28(9), tr. 1736-1742.

FI C

12. Lin Ma, Jun-qing Li và Yuan-dong Hu (2015), Determination of berberine in Phellodendron amurense from different sites of Changbai Mountain. Journal of Forestry Research. 26(1), tr. 201–207.

OF

13. Maria A. Neag và các cộng sự. (2018), Berberine: Botanical Occurrence, Traditional Uses, Extraction Methods, and Relevance in Cardiovascular, Metabolic, Hepatic, and Renal Disorders, The research topic. 9, tr. 557.

ƠN

14. Sung Ok Kim, Ji Yeoung Park, Seo Young Jeon, (2015),

NH

Saikosaponin a, an active compound of Radix Bupleuri, attenuates inflammation in hypertrophied 3T3-L1 adipocytes via ERK/NF-κB signaling pathway, International Journal of Molecular Medicine, tr.

1126-1132.

15. U.S National Library of Medicine, National Center for Biotechnology

QU Y

Information (2018), “Berberine”. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7843460/, truy cập ngày 15 tháng 1 năm 2018.

16. U.S National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information (2018), "Saikosaponin A".

M

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6126128/, truy cập ngày 23 tháng 9 năm 2018.

KÈ

17. Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học), Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, tr.135-184.

18. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định

Y

phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr.10-59.

DẠ

19. Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, tr.68-84.

20. Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and

IA L

Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4).

FI C

21. Chenghan Mei, Bin Li, et al (2015), "Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma

OF

and its application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography B, 993-994, tr.69-74.

22. European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation, tr.9-10.

ƠN

23. Kokane Vikrant , Naik Sonali (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9), tr. 654-663.

NH

24. Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7), tr.1515-1609.

25. The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia

QU Y

Europaea 7th Edition vol 2, tr.2056-2057.

26. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1), tr.6-13.

27. In-Seon Park, Eun Mi Kang, and Namsoo Kim (2010), High-

KÈ

M

Performance Liquid Chromatographic Analysis of Saponin Compounds in Bupleurum falcatum. Journal of Chromatographic Science, tr. 229233.

28. Jung Won Choi, Juree Kim, Sam Sik Kang, et al (2021), Simultaneous determination of saikosaponin derivatives in Bupleurum

DẠ

Y

falcatum by HPLC-ELSD analysis using different extraction methods, Bioactive Materials, tr. 57-61.

29. J.V. Srinivasan, K. P. Unnikrishnan, A. B. Rema Shree, et al (2008),

IA L

HPLC Estimation of berberin in Bupleurum falcatum, Bioactive Materials tr. 96-99.

DẠ

Y

KÈ

M

QU Y

NH

ƠN

OF

FI C

30. Bộ Y tế (2018), “Hoàng bá”, Dược điển Việt Nam V tập II, nhà xuất bản Y học, tr. 1185.

Y

DẠ

KÈ

M QU Y ƠN

NH

IA L

FI C

OF

Y

DẠ

KÈ

M QU Y ƠN

NH

IA L

FI C

OF

Y

DẠ

KÈ

M QU Y ƠN

NH

IA L

FI C

OF

Y

DẠ

KÈ

M QU Y ƠN

NH

IA L

FI C

OF

Y

DẠ

KÈ

M QU Y ƠN

NH

IA L

FI C

OF