1cultivo de tejidos

Universidad Dr. José Matías Delgado FACULTAD DE AGRICULTURA E INVESTIGACIÓN AGRÍCOLA “ JULIA HILL DE O‘ SULLIVAN “

Nombre de la Materia: Introducción a la Biotecnología Lic. Sonia Edith Solórzano

Unidad 2. Cultivo de Tejidos Contenido: 1. Regeneración de plantas in – vitro 1.1 Clonación 1.2 Época de la generación celular 1.3 Callos 2. Regulación de organogénesis y embriogénesis en cultivos celulares.

3. Desarrollo de la biotecnología para mejorar cultivos La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de una planta poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametas.

Esta capacidad se denomina totipotencia celular y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristematicas, presentes en distintos órganos de la planta.

La primera etapa en el cultivo In vitro de cualquier planta es la desinfección superficial del Ex plante. Después siguen las etapas de Iniciación (establecimiento aséptico del ex plante) Multiplicación de los Ex plantes y Desarrollo (Obtención de plantas enteras)

Cultivo de tejidos: Término amplio que se aplica a la técnica de cultivo in vitro de células y tejidos vegetales en medio nutritivo de composición definida, en condiciones controladas de luminosidad y temperatura. Las células vegetales son totipotentes, o sea, cada célula de una planta posee toda la información genética y el aparato fisiológico necesario para regenerar una planta entera y funcional. Por ésto esta técnica ha sido utilizada desde mediados del siglo XX para la producción de plantas con miras a la propagación, limpieza clonal, conservación, intercambio de germoplasma, etc.

In vitro: Literalmente “en vidrio”, término aplicado a los procesos biológicos que propician el crecimiento de células, tejidos u órganos vegetales en medio de cultivo. Por ejemplo: en tubo de prueba o en frascos, en un medio artificial y bajo condiciones asépticas Son técnicas modernas el cual abarca un grupo de técnicas que consisten en el cultivo bajo condiciones asépticas de las diferentes partes de la planta. Estas técnicas tienen gran potencial para estudios básicos y aplicados en la micro propagación de especies económicamente importantes y como un modelo para estudios fisiológicos, bioquímicos, genéticos y morfológicos.

Los aspectos fundamentales para el cultivo de tejidos son el aislamiento de fragmentos de tejidos u órganos (explantes) de una planta completa y proveer a estos explantes de un medio ambiente apropiado que permita expresar su capacidad morfogenética.

Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, estos deben proveerse además ciertos requerimientos externos: los tejidos pueden necesitar que se les apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio liquido.

Para el cultivo de suspensiones celulares de una gran variedad de plantas se ha utilizado el medio Inorgánico MS desarrollado por Murashige y Skoog (1962) para el cultivo de tejidos. Se usan frecuentemente los medios de consistencia semisólida en vez de los líquidos

Entre los factores más importantes para lograr la respuesta morfogenética deseada se encuentra la composición del medio de cultivo. En todo intento de propagación vegetal in vitro, el carácter del proceso de diferenciación está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales.

Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.

Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo, en general, es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar.

La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis de manera que son innecesarios altos niveles de luz.

Las plantas producidas In vitro crecen en un ambiente aséptico y su desarrollo requiere de una energía Exógena (azúcar) o sea son plantas heterótrofas con un escaso desarrollo del aparato fotosintético. Además se desarrollan en presencia de una lata con una humedad relativa (100 %) Las hojas de las plantas no presentan una adecuada capa de cera epicular, la cutícula es delgada, el meso filo empalizado es de escaso desarrollo con grandes espacios intercelulares y generalmente se observa baja densidad estomática, lo cual las hace susceptibles a la deshidratación .

En estas condiciones la hoja número uno inicia su emergencia ocho días después de realizado el trasplante. El follaje que la panta Invitro desarrolla es transicional y las hojas tienden a atrofiarse. El ritmó de emisión foliar es de aproximadamente una hoja cada ocho días, lo ideal.

El grado de contaminación mediante esta técnica es bajo (3 a 5 %), si se presenta es debido a presencia de contaminación Bacterial Endógena (interna), honservandose en la base de los explantes, un halo de color blanco o exudados amarillentos con posterior necrosis (Muerte de las células y los tejidos). Esta infección es fácilmente detectable en los primeros cuatro días del cultivo.

El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explanto y termina con la obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuación: Elección de la planta y/o tejido donante de explantos. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias o estrés). Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial para inducir: callo, brote, raíz o embrión somático, etc. Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias. Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir a los brotes o embriones somáticos en plántulas. En el enraizamiento se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). Aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte

Forma de Crecimiento

Tipo de Cultivo Cultivo de órganos

Determinados Hojas,Flores,Frutos (enteros) Indeterminados Yemas meristemáticas apicales y laterales,raíces

Organizado Cultivo de embriones

Semillas, embriones aislados

Cultivo de Tejidos Vegetales

Cultivo de callos Desorganizado

Cultivo de células en suspensión Cultivo de células individuales

CULTIVO In Vitro DE CÉLULAS Y TEJIDOS.

¿ Qué es cultivo de tejidos?

Quiere decir" dentro de vidrio”, el cultivo de plantas o de alguna de sus partes dentro de recipientes de vidrio en condiciones de ambiente controlado

Plantas con Uniformidad, Estabilidad e Identidad Genética Calidad Genética y fitosanitaria

Mejoramiento genético

Aplicaciones de la técnica de Cultivo de Tejidos

Conservación de germoplasma

Propagación masiva

¿ MICROPROPAGACIÓN? Reproducción de plantas en laboratorio. Corte de un tejido o de un órgano utilizado para iniciar un cultivo

 Método efectivo eliminación de virus

para

la

 Si la planta esta en plena actividad mayor porcentaje de éxito  Corto tiempo, muchas plantas  Plantas producidas identicas a la madre

PROCESO DEL CULTIVO IN VITRO FASE DE CAMPO: En el campo se colecta el material vegetativo a ser introducido en un Banco de Germoplasma o es enviado por centros internacionales como parte de los convenios de Intercambio de Germoplasma Banco de Germoplasma

COLECTA DE MATERIAL: Hijos de Espada de plátano, Mini tubérculos de papá y material vegetativo de Loroco

FASE DE LABORATORIO Se inicia el proceso de introducción de los materiales, con la reducción y esterilización superficial o desinfección del material colectado, en donde, se desinfecta con Hipoclorito de Sodio o lejía al 5% o adicionando 3 gotas de tween 20, seguidamente se realizan tres enjuagues con agua destilada estéril y a continuación se realiza la separación del tejido foliar hasta llegar al Domo meritemático, este proceso se realiza dentro de la cámara de flujo laminar en condiciones asépticas utilizando utensilios estériles como pinzas, bisturí y otros.

Hipoclorito de Sodio o lejía al 5%

cámara de flujo laminar

FASES DE LA MICROPROPAGACIÓN 1. INICIO El ex planté o material inicial en cultivo in Vitro, que puede ser una pequeña porción de tallo, hoja, yema o raíz se coloca en un tubo de ensayo para producir pequeñas plantitas, que son las réplicas del progenitor.

Previo a su transferencia al medio de iniciación, el ex planté es sometido a un tratamiento antioxidante mediante la inmersión en una solución acuosa estéril de ácido ascórbico o cisteína entre otros El explante es inoculado en los tubos de ensayo conteniendo el medio de iniciación de Murashige y Skoog (MS).

EXTRACCIÓN DEL EXPLANTE O MERISTEMO: Material de Plátano y Papa .

CONDICIONES CONTROLADAS

OPTIMO CRECIMIENTO Y DESARROLLO

Durante las tres fases In vitro los cultivos conteniendo el domo meristemático en el medio de cultivo se mantienen en cuartos con ambientes controlados con parámetros controlados como son: temperatura promedio de 25 a 14 ± 1 °C dependiendo del cultivo, foto período de 16 horas luz e intensidad lumínica de 3,000 lux para el periodo de establecimiento del cultivo.

2. MULTIPLICACIÓN El medio de multiplicación contiene reguladores de crecimiento, utilizados para estimular la formación y multiplicación de brotes La plántula es seccionada conteniendo de 2 a 3 yemas vegetativas para su micro propagación, la parte del corte debe quedar en contacto con el medio para evitar su deshidratación y pérdida de regeneración. Esta etapa dura siete sub cultivos de 21 días.

3. ENRAIZAMIENTO Los brotes mayores son transferidos a un medio de desarrollo, sin adicionarle reguladores o componentes aditivos de crecimiento, permitiendo la obtención de plantas completas. En esta etapa cada 30 días hay una adecuada proporción de raíz y follaje.

Una vez que se presenta la formación de raíces y la emisión foliar , las plantas son aptas para su transferencia al invernadero 4. FASE DE ENDURECIMIENTO O ACLIMATACIÓN Es una de las etapas más importantes en la micro propagación , inicia cuando las vitroplántulas están listas para ser transferidas al propagador bajo condiciones controladas de humedad y luz para evitar su deshidratación.

Las plántulas en fase de aclimatación y crecimiento inicial en invernadero y vivero se dice que han entrado a la etapa ex vitro, extra vitrum o post vitro, y se les llama vitroplantas y es una de las etapas mas importantes en la micro propagación No cuentan con un sistema fotosintético bien desarrollado, es decir, son parcialmente heterótrofos.

Primeramente se extraen las vitro plantas de los frascos eliminando el medio de cultivo de sus raĂ­ces con suficiente agua, para ser transferidas a bolsas de polietileno de 9 x 11 pulgadas o canteros con mezcla de sustrato compuesto por suelo desinfestado, granza quemada y cascajo proporciĂłn de 3:1:1 o Materia OrgĂĄnica

Se realizan dos riegos uno por la mañana y otro por la tarde utilizando bomba de mochila o uso de sistemas de micro aspersión o nebulización hasta humedecer el sustrato, pero se debe tener cuidado, pues que se puede incrementara el contenido de humedad del sustrato, lo cual propicia niveles inconvenientes de CO 2 y O2 que a la vez podría inhibir el crecimiento Al iniciarse la etapa de endurecimiento las plantas provenientes de cultivo In vitro necesitan de una baja intensidad lumínica, la cual gradualmente se puede aumentar mediante la utilización (en el invernadero) de mallas de sombrero las que de acuerdo a la densidad de su tejido determinara la intensidad de sombra en las primeras tres semanas en un ambiente húmedo, con un 80.0 0 % de sombra hasta finalizar la etapa en los propagadores con 65 % de sombra durante 6 semanas, luego las plántulas son trasladadas al vivero con un 50%.

A los 8 días después del trasplante se realiza fertilización foliar, 2 veces por semana, en los primeros 15 días y se aumenta la dosis a los 30 días.

La etapa de adaptación en el invernadero se extiende hasta los 60 días alcanzando las plántulas una altura promedio de 17.0 cm con 6 hojas nuevas.

Se realizan aplicaciones intercaladas y preventivas de insecticidas y fungicidas, a partir de la 4ta semana de permanencia en el vivero. A los dos meses las plantas estarán listas para su comercialización o para realizar ensayos de Investigación o campo

Invernadero: material de plĂĄtano y papa, el tiempo comprendido desde el cultivo inicial de la yema apical, hasta la obtenciĂłn de plantas apropiadas para el trasporte es de aproximadamente 120 dĂ­as para estos cultivos.

FASES DE PROCESO DEL CULTIVO IN VITRO O MICROPROPAGACIÓN Resumen del Cultivo de plátano

1.

3. ENRAIZAMIENTO

4. ACLIMATACIÓN

INICIO

2. MULTIPLICACIÓN

Preparación de medios de cultivo Soluciones madres 1. Macroelementos • • • • •

Nitrato de amonio (NH4NO3) Nitrato de potasio (KNO3) Fosfato de potasio (KH2PO4) Cloruro de calcio Dihidratado (CaCl2. 2H2O) Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4. 7H2O)

2.

Microelementos

• • • • • • • • •

Sulfato Manganeso MnSO4.H20 Ácido bórico (H3BO3) Sulfato de Zinc heptahidratado (ZnSO4. 7H2O) Ioduro de potasio (KI) Molibdato de sodio Dihidratado (Na2MO4. 2H2O ) Cloruro de cobalto Hexahidratado (CoCl2.6H2O) Sulfato cuprico Penta hidratado (CuSO4. 5H2O) Hierro: sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4. 7H2O) Na2-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic)

3.

Vitaminas

•

Myo-inositol (C6H12O6)

•

Ácido Nicotínico

•

Thiamina (Vitamina B1)

•

Piridoxina (Vitamina B6)

•

Glicina

•

Pantotenato de calcio

4.

Regulador de crecimiento

•

Ácido Giberelico (GA3): para crecimiento acelerado

•

Citoquinina : BAP (6- Bencilaminopurina) para producción de brotes

•

Auxinas : ANA (ácido naftalenacético) AIB (ácido indolbutírico) AIA (ácido indolAcetico) para la Inducción de callos, raíces

•

Carbón activado como inductor de raíz

5.

Azúcar

6.

Agente gelificante: Agar o Phytagel

7.

8.

Otros compuestos orgánicos Caseína hidrolizada Regulador de PH

Hidróxido de sodio (Soda cáustica, NaOH) La esterilización del medio se realiza en autoclave a 121 °C durante 15 a 20 minutos

VENTAJAS DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS Incremento acelerado del número de plantas en un periodo corto. Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie reducida, a bajos costos. Mayor control sanitario del material que se propaga. Facilidad de transportar el material in Vitro de un país a otro. Ausencia de peligros ambientales (temporales, desborde de ríos, sequías). Ausencia de infecciones de campo. Disponibilidad permanente de material para propagación y exportación. Acceso oportuno a material para micro propagación. Obtener germoplasma con una gran capacidad regenerativa al continuar su multiplicación en los laboratorios de destino.

Atentamente: Sonia Sol贸rzano sonia.solorzano@gmail.com