Monitorización de la salud intestinal en terneros lactantes mediante biomarcadores sanguíneos

Resumen

La evolución del sector ganadero hacia sistemas más intensivos, con mayores producciones y un menor uso de antibióticos, ha promovido la aparición de herramientas diagnósticas incluidas en planes de monitorización para evaluar la salud y el bienestar animal con el fin de implementar medidas preventivas y reducir el riesgo de aparición de enfermedades. Los terneros prerrumiantes presentan una elevada predisposición a padecer patologías, por ello en este artículo vamos a hablar del estudio de biomarcadores sanguíneos, describiendo los más relevantes en cuanto a la evaluación de su salud digestiva y respiratoria, ya que son las patologías más interesantes en este grupo de edad.

Palabras clave: monitorización; ternero lactante; biomarcador sanguíneo.

Abstract

Digestive health monitoring in suckling calves using blood biomarkers

The evolution of the livestock sector towards more intensive systems, with higher yields and less use of antibiotics, has promoted the use of monitoring tools to assess animal health and welfare, in order to implement preventive measures and reduce the risk of disease occurrence. Pre-weaning calves have a high predisposition to suffer pathologies, so in this article we are going to talk about the study of blood biomarkers, describing the most relevant ones in terms of digestive and respiratory health assessment, as these pathologies are the most interesting in this age group.

Keywords: monitoring; suckling calf; blood biomarker.

Introducci N

El sector ganadero en nuestro país ha experimentado un gran cambio en las últimas décadas, evolucionando hacia sistemas de producción más intensificados. El aumento del censo de animales por granja, la reducción del uso de sistemas de pastoreo y el aumento de las producciones, hacen que los animales de abasto presenten una mayor susceptibilidad a padecer enfermedades infecciosas y metabólicas. La aparición de una enfermedad en una granja afecta directamente al bienestar animal, a su rendimiento productivo y a la rentabilidad de la explotación, y genera un aumento en el uso de antibióticos, bien por estar causada por un agente bacteriano o por la aparición de infecciones bacterianas secundarias a la patología principal. Por todo ello, es necesario tomar medidas para evitar la presencia de enfermedades en las explotaciones y disponer de herramientas que nos permitan evaluar de la forma más objetiva posible todo aquello que pueda afectar a la salud de los animales, destacando la relevancia de la salud digestiva y respiratoria sobre los rendimientos productivos en animales jóvenes. Estas herramientas se recogen en programas de monitorización, que sirven para controlar el estado sanitario de un grupo de animales y tienen un enfoque distinto al diagnóstico de una patología concreta. Una buena forma de monitorización de la salud de los animales es mediante el empleo de marcadores hematológicos y bioquímicos, que nos proporcionan información de forma indirecta sobre la funcionalidad de los diferentes órganos y aparatos. Estos tienen especial interés en el ganado bovino, ya que el valor del individuo es elevado y no es posible utilizar métodos de monitorización que requieran el sacrificio, como sí ocurre en el caso de la acuicultura o avicultura. La variedad de marcadores potenciales es muy amplia, lo que dificulta la selección de aquellos que puedan ser más relevantes. Para que un biomarcador sea considerado bueno debería establecer una clara relación con los procesos fisiopatológicos que causan la alteración en la salud del animal y disponer de buena precisión, reproducibilidad, sensibilidad y especificidad, además de ser fácilmente medible, preferiblemente mediante técnicas poco invasivas. Por todo ello, el objetivo de este artículo es realizar una revisión sobre los biomarcadores sanguíneos más relevantes para la mo- nitorización de la salud en terneros, haciendo hincapié en aquellos que puedan reflejar alteraciones digestivas y respiratorias.

Marcadores Bioqu Micos

Existe una amplia variedad de marcadores bioquímicos que pueden monitorizarse a nivel sanguíneo y que nos permiten valorar de forma indirecta y poco invasiva la salud animal. Para facilitar la elección de aquellos que tengan una mayor relevancia en las alteraciones específicas que queramos evaluar, a continuación, se realiza una selección y clasificación de los biomarcadores con mayor relevancia para la salud de los terneros (tabla).

Marcadores inflamatorios de respuesta de fase aguda

La respuesta de fase aguda es una reacción que está ocasionada por diferentes procesos que implican una alteración de la hemostasia. Entre ellos, destacan procesos inflamatorios, infecciosos, endotoxemias, traumatismos o estrés. Esta respuesta sistémica tiene como objetivo proporcionar al organismo la energía y los sustratos necesarios para la lucha frente a la agresión que está sufriendo, a la vez que limita el daño causado sobre los tejidos y se restaura el tejido sano. No obstante, en contraposición ocasiona cambios que perjudican la salud de los animales y sus rendimientos productivos, entre los que se incluyen cambios metabólicos (pérdida de masa muscular y aumento de la lipólisis), endocrinos (aumento del cortisol sérico), hematopoyéticos (anemia, leucocitosis) o fiebre y anorexia.

Durante el desarrollo de la respuesta de fase aguda, entran en juego dos grupos de marcadores inflamatorios que actúan de forma secuencial: las citocinas y las proteínas de fase aguda (PFA). En la figura 1 se detalla de forma esquemática la sucesión de acontecimientos que tienen lugar en la respuesta de fase aguda. De forma resumida, esta comienza con la liberación de citocinas por parte de las células inflamatorias a nivel local, lo que desencadena un efecto en cascada que ocasiona su incremento a nivel sistémico. El aumento de citocinas circulantes provoca, posteriormente, la estimulación de los hepatocitos para la producción de proteínas de fase aguda. A continuación, se detallan los biomarcadores inflamatorios más relevantes de cada grupo para la monitorización de la respuesta de fase aguda en terneros.

Citocinas séricas

Las citocinas son proteínas de pequeño tamaño liberadas por las células inflamatorias, entre las que se incluyen linfocitos, neutrófilos, monocitos y macrófagos. Existe una gran cantidad de citocinas con funciones muy diversas, pero en esta re- para la monitorización de la salud en terneros lactantes.

Tipos de marcadores Biomarcadores Tipo de muestra*

Interleucina 6 (IL-6)

Interleucina 1β (IL-1β)

Citocinas séricas

Inflamatorios

Proteínas de fase aguda

Estrés oxidativo

Permeabilidad intestinal

Inmunitarios

Factor de necrosis tumoral α (TNF-α)

Interferón γ (IFN-γ)

Interleucina 10 (IL-10)

Amiloide sérico A (SAA)

Haptoglobina (Hp)

Glutatión peroxidasa (GPx)

Superóxido dismutasa-1 (SOD-1)

Malondialdehído (MDA)

Diamino oxidasa (DAO)

D-Lactato

Lipopolisacárido (LPS)

Inmunoglobulina A (IgA)

Inmunoglobulina G (IgG)

Hematológicos Hemograma

Suero sanguíneo

Suero sanguíneo

Suero sanguíneo Sangre entera (con anticoagulante)

Suero sanguíneo

Suero sanguíneo

Sangre entera (con anticoagulante) visión nos centraremos en aquellas con mayor relevancia en la instauración y la desactivación de la respuesta inflamatoria de fase aguda.

*En este artículo se valoran únicamente biomarcadores en muestra sanguínea, pero algunas de estas determinaciones también se pueden detectar en otros tipos de muestras o tejidos.

La interleucina 1β (IL-1β), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y el interferón γ (IFN-γ) constituyen el grupo de citocinas proinflamatorias más importantes a monitorizar a nivel sérico en producción animal, puesto que son las que tienen un impacto más directo sobre los procesos inflamatorios. En contraposición, la IL-10 es una citocina producida mayoritariamente por los neutrófilos con un marcado carácter antiinflamatorio, cuya función es reducir la respuesta inflamatoria y reinstaurar la situación de homeostasis. Cabe destacar aquí también la interleucina 6 (IL-6), citocina pleiotrópica (con funciones pro y antiinflamatorias) que desempeña funciones muy diversas y relevantes a nivel sistémico, destacando su papel en la modulación de la respuesta inmunitaria e inflamatoria y en la estimulación de la producción de PFA en el hígado de los animales.

Dadas las interconexiones de todas estas citocinas y sus características particulares, es recomendable una monitorización conjunta de todas ellas, de manera que permita comprender qué está ocurriendo en el organismo de los animales. Hay que tener en cuenta que la interpretación de los resultados respecto al incremento o disminución de estos marcadores variará dependiendo del objetivo del estudio. Así, de forma genérica interesa que las citocinas proinflamatorias se encuentren en niveles bajos, lo que sugiere que no existe una agresión externa. No obstante, en caso de que se quiera realizar una vacunación, es preferible que estas citocinas se encuentren elevadas antes de la inmunoestimulación, lo que garantiza la instauración de una respuesta inmunitaria rápida. En este sentido, son diversos los estudios que incluyen la monitorización de estas citocinas para evaluar el efecto que determinados aditivos o cambios de estrategias nutricionales pueden tener sobre la salud de los terneros.

Proteínas de fase aguda (PFA)

Las PFA son proteínas plasmáticas que pueden clasificarse en función de su función biológica en PFA negativas, es decir, aquellas que disminuyen sus niveles séricos al producirse la respuesta inflamatoria de fase aguda (por ejemplo, albúmina), y PFA positivas, aquellas que se elevan al producirse una respuesta de fase aguda. Son estas últimas las de mayor relevancia a monitorizar cuando queremos evaluar la salud de los animales.

Las dos PFA más importantes en el ganado vacuno son el amiloide sérico A (SAA) y la haptoglobina (Hp). SAA actúa mediando en la migración de neutrófilos y monocitos al tejido dañado, mientras que la haptoglobina se une a la hemoglobina libre, disminuyendo las reservas de hierro e inhibiendo el crecimiento bacteriano. El incremento sérico de SAA se produce en menos de 4 h tras el inicio de la agresión, mientras que los cambios en los niveles de haptoglobina tardan en instaurarse unas 24-48 h.

En terneros, ambos marcadores se han revelado como potentes indicadores de procesos inflamatorios a nivel digestivo, respiratorio o incluso cardiaco. No obstante, su relevancia varía dependiendo del aparato afectado. Así, por ejemplo, diversos estudios han apuntado que la haptoglobina es un marcador más sensi- ble de procesos respiratorios en terneros, llegando a detectarse incrementos en procesos débiles y moderados, mientras que el SAA requiere de estímulos más intensos y prolongados para poder detectarse su incremento.

Marcadores De Estr S Oxidativo

El estrés oxidativo es un estado patológico que se produce como consecuencia del desequilibrio entre la producción de radicales libres de oxígeno/nitrógeno (RONS) y la disponibilidad de mecanismos de defensa antioxidante necesarios para reducir el daño celular y tisular inducido por los radicales libres (figura 2).

Para la monitorización del estrés oxidativo es indispensable incluir biomarcadores que reflejen las defensas antioxidantes y los productos del daño oxidativo. Dentro de los mecanismos de defensa antioxidante, las dos enzimas que desempeñan un papel más relevante en el ganado vacuno son la superóxido dismutasa (SOD) y la glutatión peroxidasa (GPx). Su función es la reducción de especies reactivas de oxígeno para su transformación en moléculas menos dañinas para el organismo, actuando cada enzima en un sistema de regulación antioxidante diferente. Así, la SOD actúa en presencia de altas concentraciones de peróxido de hidrógeno (H2O2), mientras que la GPx lo hace a bajas concentraciones, lo que demuestra una correlación inversa en la actividad de ambas enzimas. Por su parte, el malondialdehído (MDA) es el único biomarcador medible derivado de la interacción de los radicales libres con los lípidos séricos y tisulares, lo que se conoce como peroxidación lipídica. Esto hace que este compuesto sea ampliamente usado para la monitorización del estrés oxidativo como contraposición a las enzimas antioxidantes.

El papel que juega el estrés oxidativo en la salud de los terneros durante el periodo de lactación es crítico. Diversos estudios han asociado el estrés oxidativo con procesos digestivos y respiratorios en estos animales. Además, un estudio reciente ha señalado que el estrés oxidativo es un factor crítico en la modulación de la respuesta inmunitaria en terneros recién nacidos, puesto que parece reducir la respuesta inmunitaria celular y humoral (producción de inmunoglobulinas), indispensable para la lucha frente a patógenos o para la eficacia de la vacunación.

Oxidación del ADN

Oxidación de las proteínas

Peroxidación de lípidos y producción de MDA

RONS: Radicales libres de oxígeno/nitrógeno; MDA: malondialdehído. Adaptado de Abuelo, A. et al. (2022). https://www.canr.msu.edu/news/reevaluating-antioxidants-for-dairy-cattle

Marcadores De Permeabilidad Intestinal

La pared intestinal desempeña un papel fundamental en el organismo, no solo en la absorción de nutrientes, sino también a nivel inmunitario y de control del paso de diferentes compuestos y sustancias desde la luz intestinal al torrente sanguíneo. Es imprescindible el mantenimiento de una buena unión entre las células del epitelio intestinal, de manera que su funcionalidad se mantenga intacta y se evite una absorción de forma paracelular (figura 3). Una disrupción de la integridad epitelial provoca el paso de compuestos perjudiciales para el organismo, como sustancias tóxicas, microorganismos o sus metabolitos, que pueden repercutir de forma negativa en la salud del animal, provocando procesos inflamatorios o infecciosos y, en definitiva, una reducción de sus rendimientos productivos.

A pesar de las limitaciones para la monitorización de forma directa de la permeabilidad intestinal en el ganado vacuno, existen tres marcadores que pueden detectarse a nivel sanguíneo que permiten conocer si se están produciendo disrupciones a nivel de la pared intestinal: la diamino oxidasa (DAO), el D-Lactato y el lipopolisacárido (LPS). La DAO es una enzima presente en las células del epitelio intestinal y únicamente se libera a sangre cuando la mucosa intestinal está dañada. Por su parte, el D-Lactato es un metabolito que procede de la fermentación de la microbiota y no puede ser degradado rápidamente por las enzimas de los mamíferos. Por último, el LPS es un componente de la pared de las bacterias Gram negativas, de manera que su presencia a nivel sanguíneo es un indicador claro de filtraciones intestinales en ausencia de enfermedad infecciosa sistémica. Todos estos marcadores no deberían encontrarse en la circulación sanguínea o detectarse en niveles casi despreciables si la integridad intestinal fuese correcta. Son diversos los estudios que han monitorizado estos marcadores en terneros para evaluar el efecto directo o indirecto que tienen determinados aditivos, como el ácido butírico o húmico, o probióticos, sobre la permeabilidad intestinal. Además, a nivel práctico, su monitorización puede permitirnos conocer la situación de nuestra granja e identificar posibles factores en la explotación que puedan estar provocando disrupciones intestinales que impliquen una disminución de la salud en los terneros, tales como estrés térmico, procesos infecciosos o fallos en las estrategias nutricionales.

Marcadores Inmunitarios

Para garantizar un estatus sanitario óptimo de nuestros terneros, es imprescindible que su respuesta inmunitaria sea rápida y eficaz. Las inmunoglobulinas (Ig) séricas son indicadores importantes de esta función inmunitaria, puesto que son capaces de reconocer y neutralizar antígenos de manera específica, lo que constituye una defensa muy eficaz contra patógenos. Las inmunoglobulinas o anticuerpos están producidas por los linfocitos B y están presentes no solo en el plasma sanguíneo, sino también en otros fluidos biológicos, como saliva, mucosas, secreciones intestinales, la leche o el calostro. En el ganado vacuno existen cinco tipos de inmunoglobulinas, destacando el papel principal que juegan las IgG y las IgA. Las IgG son las inmunoglobulinas más abundantes a nivel sanguíneo y son imprescindibles para combatir infecciones víricas y bacterianas. Por su parte, las IgA son inmunoglobulinas de mucosas, cuya función es actuar como primera línea de defensa frente a la entrada de patógenos, por ejemplo, a nivel respiratorio o digestivo, si bien también se encuentran en concentraciones abundantes a nivel sanguíneo. En el caso de los terneros lactantes, el éxito de su respuesta inmunitaria frente a agentes patógenos está muy condicionado por el encalostramiento, ya que las inmunoglobulinas no son capaces de atravesar la placenta y los terneros nacen agammaglobulinémicos, es decir, sin anticuerpos. El calostro es muy rico en IgG, IgM e IgA, lo cual es vital para transmitir de forma pasiva la inmunidad al ternero, garantizando así unas defensas fuertes que permitan responder contra agentes infecciosos. Además, tras el encalostramiento, la toma de leche, rica en IgA, contribuye al mantenimiento de la inmunidad a nivel de la mucosa diges- tiva. Por todo ello, es muy importante la monitorización de los niveles de inmunoglobulinas séricas en terneros, lo que nos permite identificar y corregir posibles deficiencias en el encalostramiento que conllevan un aumento de la susceptibilidad a las infecciones.

Marcadores Hematol Gicos

La hematología es el estudio de las células sanguíneas y permite la detección de alteraciones del sistema hematológico y la evaluación del estado sanitario general de un animal o grupo de animales, ayudando a diagnosticar enfermedades subclínicas y a realizar el seguimiento de las mismas y de las terapias aplicadas.

La serie roja, formada por los eritrocitos o glóbulos rojos, se encarga de transportar oxígeno a los tejidos y extraer dióxido de carbono. La disminución en la serie roja indica un cuadro anémico y puede estar causado por enfermedades metabólicas, deficiencias minerales, infecciones que causen hemólisis o cuadros hemorrágicos o afecciones de la médula ósea. Los glóbulos blancos o leucocitos componen la serie blanca y forman parte del sistema inmunitario, haciendo frente a los patógenos que se introducen en el organismo por distintas vías. Estas células están divididas en dos grupos: granulocitos (neutrófilos, basófilos y eosinófilos) y agranulocitos (linfocitos y monocitos). El recuento de leucocitos permite evaluar el estatus sanitario del animal y, dependiendo del tipo de células alteradas, nos ayuda- rá a orientar el diagnóstico etiológico. Por ejemplo, el aumento de leucocitos (leucocitosis) se observa en infecciones bacterianas, intoxicaciones, shock anafiláctico o situaciones de estrés, y se caracteriza por un aumento de los neutrófilos (neutrofilia) y, a veces, de monocitos (monocitosis) y una disminución de linfocitos (linfopenia) y eosinófilos (eosinopenia). La situación contraria es un cuadro de leucopenia (recuentos bajos de leucocitos), apareciendo en infecciones víricas, bacterianas, aplasia de médula ósea y enfermedad hepática. El estudio hematológico dentro del programa de monitorización permite una primera valoración rápida y sencilla de la salud de los animales. En el caso de enfermedades subclínicas o con signos clínicos inespecíficos es de gran utilidad para orientar la naturaleza de dicha enfermedad.

¿QUÉ TIPO DE MUESTRA SE NECESITA PARA LA MEDICIÓN DE ESTOS MARCADORES Y CÓMO SE PUEDE CONSERVAR?

Para la monitorización de marcadores sanguíneos el tipo de muestra a recoger es la sangre, pudiendo ser recogida sin anticoagulante para la obtención de suero, o con anticoagulante, para el análisis de sangre entera. Dentro de esta última, también tendremos variaciones en función del anticoagulante empleado (heparina, EDTA o citrato).

Como premisa general, el tipo de muestra necesaria para la cuantificación de estos marcadores sanguíneos va a variar dependiendo del biomarcador, siendo recomendable consultar al laboratorio al que se deriven las muestras antes de su recogida. De forma orientativa en la tabla 1 se incluye el tipo de muestra recomendado para la monitorización de los parámetros incluidos en este artículo.

La conservación también dependerá del biomarcador a analizar, siendo lo ideal enviar la muestra inmediatamente después de la recogida para que el tiempo entre la toma de muestras y el análisis laboratorial sea el mínimo posible. A medida que avanzan las horas hay mayor probabilidad de degradación de los analitos, pudiendo afectar al resultado del análisis. En el caso de la sangre entera, por ejemplo, no se puede congelar, por lo que su análisis laboratorial debe ser relativamente rápido. No obstante, la congelación de suero sanguíneo es frecuente en estudios donde se toman muestras en varios momentos para ver la evolución del estado del animal, pudiendo analizarlos a la vez para reducir la variabilidad.

¿CÓMO SE MIDEN ESTOS MARCADORES A NIVEL SANGUÍNEO?

La técnica más ampliamente utilizada para la detección y cuantificación de los marcadores bioquímicos incluidos en este artículo es la técnica ELISA (por el acrónimo en ingles de Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay) o, lo que es lo mismo, un inmunoensayo basado en enzimas. En rasgos generales, esta técnica consiste en la detección de un antígeno (o compuesto de interés) a través de un anticuerpo que está unido a una enzima que es capaz de generar un producto detectable, como puede ser un cambio de color o la emisión de luminiscencia, que posteriormente puede leerse mediante un espectrofotómetro y proporcionar un resultado cuantitativo (figura 4A).

Otra opción es el uso de la técnica de inmunoturbidimetría, que constituye una herramienta muy importante para la determinación de proteínas a nivel sanguíneo, como la haptoglobina, basándose en la reacción clásica antígeno-anticuerpo. La interacción entre la proteína diana y su anticuerpo complementario provoca una aglutinación que conduce a una turbidez que puede detectarse ópticamente con un fotómetro (figura 4B).

El análisis hematológico se puede realizar mediante diversas técnicas que miden y clasifican los diferentes tipos de células que componen la sangre. Las tecnologías más utilizadas son la citrometría láser, citrometría de flujo, impedancia electrónica o detección de flujo envolvente de corriente continua, entre otras.

Interpretaci N De Resultados

Una vez valoradas todas las opciones de marcadores sanguíneos, deberemos elegir unas u otras y combinarlas en función del objetivo de la monitorización. El plan de muestreo se debe adecuar al objetivo, al número total de animales a estudiar y se puede complementar con otras pruebas de diagnóstico como el control de alguna enfermedad de interés. Así, por ejemplo, para evaluar el estatus inmunitario a la llegada al cebadero de un lote de 100 terneros sin patología aparente y de tamaño y edad similar, podemos recoger muestras de 10 animales representativos del grupo y valorar las IgG (en suero sanguíneo) y realizar un hemograma (en sangre entera). Además, podemos complementar el estudio con las determinaciones serológicas de virus respiratorios (IBR, BVD, PI3 y RS), para valorar si presentan anticuerpos y poder establecer un plan vacunal adecuado a su estado sanitario.

La interpretación de los resultados es más compleja que el diagnóstico laboratorial de una enfermedad infecciosa, pues no consiste en confirmar la presencia de un patógeno en un animal enfermo, sino en evaluar de manera conjunta si los animales presentan un biomarcador alterado y si este resultado es indicador de afectación de la salud de los terneros o descartar que presenten una enfermedad subclínica. Al analizar los resultados, se deben tener en cuenta los siguientes puntos:

■ Valores de referencia. No existen rangos de referencia para muchos biomarcadores, ya que hay diversos factores genéticos y ambientales que hacen que no sea posible establecer unos valores universales para cada especie animal. Por este motivo, los biomarcadores suelen estudiarse en proyectos que evalúan la eficacia de productos o estrategias, comparando los resultados obtenidos entre un grupo control y un grupo experimental.

■ Aplicación a nivel de rebaño. Los resultados se interpretan de manera conjunta dentro del rebaño, no siendo de utilidad un resultado individual. Lo adecuado es tener grupos definidos para establecer diferencias estadísticas, comparando con datos productivos.

■ Conservación de la muestra. La concentración de los metabolitos se puede alterar en caso de hemólisis, lipemia o envejecimiento de la muestra, siendo necesario valorar el correcto estado de la muestra al analizarla.

Conclusiones

Los protocolos de monitorización de marcadores bioquímicos y hematológicos en terneros permiten el control del estatus sanitario de los animales. Cada vez más programas de control de enfermedades presentan planes de monitorización, ya que permiten optimizar los índices productivos del rebaño mediante el diagnóstico precoz de las enfermedades y la rapidez en la implantación de medidas preventivas eficaces.

Bibliograf A

Abramowicz, B. et al. (2019). Haematology in the early diagnosis of cattle diseases-a review. Veterinarski Arhiv, 89(4), 579–590. https://doi.org/10.24099/VET.

ARHIV.0700

Cuervo, W. et al. (2021). Oxidative stress compromises lymphocyte function in neonatal dairy calves. Antioxidants 2021, Vol. 10, Page 255, 10(2), 255. https:// doi.org/10.3390/ANTIOX10020255

Joshi, V. et al. (2018). Haptoglobin and serum amyloid A as putative biomarker candidates of naturally oc- curring bovine respiratory disease in dairy calves. Microbial Pathogenesis, 116, 33–37. https://doi. org/10.1016/J.MICPATH.2018.01.001

Klopp, R. N. et al. (2022). Effects of feeding Saccharomyces cerevisiae fermentation products on the health of Holstein dairy calves following a lipopolysaccharide challenge. Journal of Dairy Science, 105(2), 1469–1479. https://doi.org/10.3168/jds.2021-20341

Liu, S., Wu, J., Wu, Z., Alugongo, G. M., Zahoor Khan, M., Li, J., . Cao, Z. (2022). Tributyrin adminis- tration improves intestinal development and health in pre-weaned dairy calves fed milk replacer. Animal Nutrition, 10, 399–411. https://doi.org/10.1016/J.ANINU.2022.06.004

Wang, D., You, Z., Du, Y., Zheng, D., Jia, H., & Liu, Y. (2022). Influence of sodium humate on the growth performance, diarrhea incidence, blood parameters, and fecal microflora of pre-weaned dairy calves. Animals, 12(1), 123. https://doi.org/10.3390/ ANI12010123/S1