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Marcadores de la variabilidad genética en el género Musa. 1
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MarÍa I. Román , M. Alonso , A. Barrios 1 Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales. 2 Facultad de Biología, UH. Resumen El género Musa es muy antiguo y muchas de las especies presentes en él son utilizadas tanto en la alimentación humana como en la animal. La sección Eumusa forma parte de la gran diversidad del género, contiene la mayoría de los bananos y plátanos comestibles. El mejoramiento genético de Musa es una tarea difícil, productos de las complejidades dados por la partenocarpia, esterilidad, poliploidía y propagación vegetativa. Estos programas destinados a la obtención de nuevas variedades de un cultivo requieren de la utilización de la variabilidad genética como punto de partida. Son numerosos los métodos existentes para determinar el grado de variabilidad entre las diferentes poblaciones. Los métodos basados en la morfología permiten analizar los distintos rasgos observables (fenotipos) entre las plantas. Sin embargo, los análisis citogenéticos y moleculares o genético-bioquímico permiten analizar las diferencias entre los cromosomas, las proteínas o el ADN de las plantas. Estos estudios combinados brindan una mejor caracterización de las colecciones del género Musa.
I.1 Origen y evolución del plátano fruta El plátano silvestre ha sido usado por el hombre desde los comienzos de su existencia y su domesticación empezó al iniciarse el cultivo de las plantas comestibles. Se originó en el sudeste de Asia y constituía en esa región un extenso e importante cultivo comestible, cuando se establecieron los primeros registros históricos que han llegado hasta nosotros. Las más antiguas noticias que se poseen sobre el plátano son de la India (600-500 AC), pero el cultivo debe haber existido en el país desde muchos milenios antes (Reynolds, 1951). Diferentes grupos de plátanos comestibles surgieron en las diferentes zonas que se extienden entre la India y Malasia Oriental. Los dos factores principales en la evolución del plátano comestible fueron: el desarrollo de la potencialidad genética de la partenocarpia vegetativa y, al mismo tiempo, el desarrollo de la esterilidad genética. Los plátanos comestibles más antiguos fueron, por tanto, linajes diploides comestibles de Musa acuminata Colla, como los que aún persisten en gran número en el sudeste de Asia (Simmonds, 1962).
El plátano se introdujo en el Africa Oriental a través de Madagascar, hacia el año 500 DC, llegando a la costa oeste del continente a través de las zonas tropicales del centro (Greenway, 1944; Reynolds, 1951). Llegó al Mediterráneo hacia el 650 DC y viajeros polinesios lo llevaron al Pacífico aproximadamente por el año 1000 (Merrill, 1941; Marshall, 1956). El nombre “banano” provino de la costa de Guinea, en Africa Occidental, específicamente de las lenguas sherbro o temne de la costa de Sierra Leona, a principios del siglo XVI (Bakshi, 1963). La palabra “plantain” es más oscura, al parecer se halló primero en español ( “plátano” ). Ambos fueron asimilados después por otras lenguas europeas; no cabe duda que esos dos vocablos quedaron plenamente establecidos en inglés, en las Antillas, a mediados del siglo XVII (Cheesman, 1948). El plátano fue llevado a las Islas Canarias por los portugueses, poco después de 1402 (Reynolds, 1927; 1951) y de ahí pasó al Nuevo Mundo. En 1516, Fray Tomás de Berlanga, obispo de Panamá, introdujo en Santo Domingo las primeras plantas de bananos, procedentes de Islas Canarias, de donde se propagó a otras islas del Caribe y posteriormente al continente (López, 1984). Los cambios posteriores en los plátanos comestibles se produjeron por la hibridación entre Musa balbisiana Colla y Musa acuminata Colla y por la aparición de clones diploides, triploides y tetraploides. Los tipos comestibles triploides de Musa acuminata Colla (grupo AAA) parecen originarse en Malasia, en la misma región que sus progenitores diploides. Sin embargo, los híbridos son característicos de la India y existe un segundo centro de diversificación en la región de Filipinas. En Cuba se exportó el banano, especialmente la variedad “Jonhson”, el cual era cultivado principalmente en la región nordeste de la provincia de Oriente (Banes y Baracoa), hasta que en los años treinta las plantaciones fueron destruidas por enfermedades fungosas (Hernández, 1973). En el año 1950, se dejó prácticamente de exportar como resultado del abandono de las plantaciones por las compañías extranjeras (Alvarez, 1993). Hacia la década del sesenta se desarrolla de forma extensiva con el mínimo de insumos y en lo fundamental carentes de sistemas de riego y otras técnicas de avanzadas; esta situación comenzó a modificarse a partir de 1971, llegando a obtenerse, en áreas determinadas bajo riego con microjet y alta tecnología, hasta 100 t/ha de rendimiento (Rodríguez,1997). Se han llevado a cabo diversas investigaciones para apoyar el cultivo y la calidad de los cultivares del plátano fruta. Cabe destacar la influencia de la densidad de plantación de los cultivares (Rodríguez et al., 1983a), el estudio del comportamiento de varios cultivares en distintos suelos (Rodríguez et al, 1984), diferentes
tratamientos a la semilla con respecto a los rendimientos (Pérez et al, 1986) y la creación de un método de propagación intensiva del plátano fruta (Filipia, 1987). I.2 Clasificación y descripción botánica Los plátanos y bananos pertenecen al orden Scitamineae, familia Musaceae, género Musa. La familia está formada por dos géneros: Ensete y Musa. El género Ensete está representado por siete u ocho especies monocárpicas, las plantas son vigorosas y muy parecidas a las del plátano, principalmente en el sistema foliar, pero se diferencia de éstas porque no presentan ramificaciones en el cormo y como consecuencia no produce hijos. Se reproduce por semillas y su uso es fundamentalmente ornamental (Champion,1968). El género Musa es muy antiguo y ha sido clasificado por Cheesman (1948) en cuatro secciones, donde se considera además en el sistema de clasificación internacional de la Red Internacional para el Mejoramiento del Banano y Plátano (INIBAP), del Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI)(1998), a los híbridos formados entre especies de este género (Tabla 1) Existe una gran diversidad en el género Musa, muchas de las especies presentes en él son utilizadas tanto en la alimentación humana como en la animal. Sin embargo, las fibras y pulpas de algunos bananos silvestres, como Musa velutina, Musa sanguinea, son empleadas en las industrias papelera y de cordería. Por otra parte, en las diferentes secciones aparecen especies como Musa coccinea, que por sus brácteas escarlatas poseen gran interés ornamental y Musa textilis, que por sus fibras son utilizadas para el comercio. Tabla 1: Clasificación del género Musa.
Género Sección Musa Australimusa Callimusa Rhodochlamys Eumusa Eumusa Australimusa
Especies Musa textilis Musa coccinea Musa ornata Musa acuminata Musa balbisiana x Musa balbisiana textilis
x
Musa
La Sección Eumusa contiene la mayoría de los bananos y plátanos comestibles, y se admite que esta serie de poliploides se derivan de las dos especies salvajes: Musa acuminata Colla y Musa balbisiana Colla, de donde provienen respectivamente las designaciones AA y BB del genoma (Berrie 1997; Osuji 1997). Los bananos son plantas herbáceas perennes que pueden alcanzar los 6 m de altura (Simmonds, 1966; Berrie, 1997); los tallos aéreos están sostenidos por las vainas foliares, unidos apretadamente, que forman el pseudotallo de forma cílindrica, con hojas compuestas, un cormo y un sistema radicular fibroso. Las raíces brotan, normalmente, en grupos de cuatro, en la superficie del cílindro central del cormo (Riopel y Steeves, 1964) y tienen de 5 a 8 mm de espesor. Varían considerablemente en número, según el estado de salud de la planta, encontrándose de 200 a 500 raíces ( Robin y Champion, 1962; Summerville, 1994). Las hojas se desarrollan en el centro del pseudotallo y surgen de él en un estado de arrollamiento sumamente apretado, pero en completo desarrollo en el momento de emerger. Aumentan de tamaño hasta un máximo y después declinan bruscamente, poco antes de que el punto vegetativo se transforme en inflorescencias (Simmonds,1966). Las flores son ebracteadas y están dispuestas en fascículos biseriados sobre protuberancias nodales, recubierto cada fascículo por una bráctea decídua. Los nódulos basales de la inflorescencia tienen flores femeninas y los nódulos distales masculinas; a menudo, uno o más fascículos de flores neutras o intermedias se encuentran presentes, entre las zonas masculinas y femeninas. El eje que sustenta normalmente a las flores masculinas continúa creciendo, mientras los frutos se desarrollan (Simmonds,1966). Las flores femeninas tienen ovarios inferiores triloculares y funcionales así como estaminidios y las flores masculinas tienen ovarios abortivos y estambres bien desarrollados. Los frutos son partenocárpicos y la pulpa se desarrolla principalmente a partir de la pared del ovario, producto de las inducciones de las sustancias del crecimiento (Simmonds, 1966). La esterilidad es en parte independiente de la partenocarpia; muchos plátanos comestibles resultan algo fértiles si se les poliniza. Los plátanos silvestres tienen frutos con semillas que se desarrollan únicamente si son polinizados de manera efectiva. Los frutos del plátano, por lo general, son negativamente geotrópicos y la forma del fruto adulto refleja la postura del racimo y la posición de los frutos en este último. La mayoría de los plátanos son estériles, lo que puede estar determinado por la presencia de genes de esterilidad femenina y/o por cambios numéricos o estructurales de los cromosomas, así como por su nivel de ploidía (Soto, 1985).
I.3 Mejoramiento genético y conservación del germoplasma. El mejoramiento genético del plátano es una tarea díficil, producto de las complejidades dadas por la partenocarpia, esterilidad, poliploidía y propagación vegetativa (Kulasekaran, 1986). La mayor parte de los caracteres de importancia económica presentan diferencias significativas entre los diferentes grados de ploidía. La selección individual dentro de un mismo grado de ploidía es fundamental para el mejoramiento genético (Ortiz et al, 1997). La variación del genoma ocurre dentro y a través de las generaciones de Musa, lo que reduce la precisión del desempeño de los progenitores sobre el valor de la progenie con respecto al rendimiento y otras características con herencia compleja. La selección de los progenitores a través del examen de la progenie se requiere, para lograr ganancias genéticas en el futuro (Tenkovano et al, 1998). Estos programas, destinados a la obtención de nuevas variedades de un cultivo, con características superiores a los existentes, requieren básicamente de la utilización de la variabilidad genética, como punto de partida para efectuar las combinaciones de genes que resulten en las variedades deseadas. El primer paso en el programa de mejoramiento consiste en buscar o seleccionar progenitores masculinos, los cuales deben ser altamente resistentes a las enfermedades fungosas: Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis) y Mal de Panamá (Fusarium oxysporum ), poseer un racimo vertical y compacto, ser partenocárpico, tener frutos tan grandes como la ploidía permita y con polen suficiente en las flores masculinas (Simmonds, 1966). Los diploides comestibles partenocárpicos traídos a las Antillas tienen la forma exigida y los frutos grandes, pero no son resistentes a la Sigatoka negra, sin embargo, los diploides con semillas son silvestres y en la mayoría de los casos son resistentes a las enfermedades fungosas, pero por su apariencia no son considerados como plátanos comerciales. Es por eso que la actividad más importante en el mejoramiento de bananos y plátanos es el desarrollo de híbridos diploides superiores agronómicamente y resistentes a enfermedades (Tenkovano et al, 1998). Unas de las vías más utilizadas se basó en la hibridación de clones triploides con fertilidad femenina residual con diploides mejorados como progenitor masculino (Román et al, 1988; Rowe y Rosales, 1993).
La mejora por cruzamientos posibilita reunir características y cualidades de diferentes poblaciones, por lo que amplía las bases genéticas para la selección y acelera los resultados del mejoramiento (Rodríguez et al, 1981), su eficiencia depende fundamentalmente del número de genes que toman parte de la determinación de los caracteres que hay que cambiar y el sistema de fecundación predominante en la especie dada (García, 1996). Este método ha sido muy explotado en el mundo y es la vía fundamental por la que se han obtenido la mayoría de las variedades cultivables. La producción actual de plátanos se basa principalmente en los híbridos poliploides, los que posteriormente no pueden ser mejorados por selección clásica a causa de su esterilidad. Sin embargo, una gran cantidad de mutaciones somáticas útiles se han acumulado durante siglos de propagación vegetativa y selección por los productores. Se han desarrollado marcadores de ADN basados en microsatélites para caracterizar la variabilidad somaclonal (Kaemmer et al, 1996). En el género Musa, los híbridos tetraploides son muy robustos y esta fuerza le confiere mayor resistencia a las enfermedades. Existe una estrategia basada en el mejoramiento de los tetraploides utilizando las propiedades antimitóticas de la colchicina para generar tetraploidía (Hamill et al, 1992). Los tetraploides seminíferos obtenidos mediante el tratamiento de plántulas con colchicina han mostrado que disminuye la velocidad de crecimiento y el número de flores femeninas así como la fertilidad femenina (Desauw, 1998). El germoplasma constituye el elemento de los recursos genéticos, que incluye la variabilidad genética intra e interespecífica, con fines de utilización en la investigación en general y específicamente en el mejoramiento genético (Goldert, 1996). El banco de germoplasma es el fundamento esencial para un programa de mejoramiento genético, si se desea desarrollar este último sobre bases sólidas y obtener un avance consistente en todos los lineamientos de mejoramiento que se persigan (Castillo, 1991). Actualmente hay cerca de seis millones de muestras almacenadas en todo el mundo en bancos de germoplasma ex situ (almacenamiento de semillas a bajas temperatura y humedad). Los cereales tales como: el trigo (Triticum aestivum L.), el arroz (Oryza sativa L.) y el maíz (Sea mayz L.) están bien representados. Muchos cultivos tropicales no pueden ser almacenados como semillas y deben ser mantenidos como colecciones vivas en bancos de germoplasma de campo o mediante el mantenimiento in vitro (FAO, 1997).
Las colecciones de campo juegan un papel inicial, ya que posibilitan no sólo conservar el germoplasma en un ambiente natural por un tiempo prolongado, sino también caracterizarlo y evaluarlo por lo menos durante las primeras fases, propagarlo regularmente y controlarlo con facilidad (Perret, 1990). Las especies de plantas de propagación vegetativa, con un ciclo biológico largo o con semillas de corta duración (recalcitrantes), se suelen mantener en bancos de germoplasma de campo. Cabe citar cultivos como la yuca (Manihot esculenta Crantz), la papa (Solanum tuberosum L.) y principalmente los bananos y plátanos (Withers, 1992). Casi todos los países tienen por lo menos un banco de germoplasma de campo y hay muchos que cuentan con varios. En el mundo hay muchos países que mantienen bancos de germoplasma de bananos y plátanos, entre ellos se encuentran: Sureste Asiático (Nasution, 1984; Hore et al, 1992; Amalray, 1992), Indonesia (Sastrapradja, 1984), Tailandia (Chonchalow y Silayoi, 1984), Brasil (Siquiera et al., 1988), Filipinas (Zamora et al., 1989; Espino y Pascua, 1992), Costa Rica (Pérez, 1997), Africa Oriental y Central ( Makumbi y Rubaiyo, 1995), entre otros. En nuestro país, el Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT) es el encargado del mantenimiento de las colecciones de viandas tropicales y plátanos vianda y fruta. Algunas de las especies y clones de la colección del género Musa se han evaluado desde el punto de vista morfológico y citogenético (Román y Rodríguez, 1986), de fertilidad del polen (Román et al., 1988) e isoenzimáticos (Román y Manzano, 1991; Román, 1996 y Román et al., 1997). En estos momentos la conservación in vitro del germoplasma de Musa, se efectúa en forma de meristemos proliferantes en condiciones de crecimiento lento (De Smet y Van den Houwe, 1991). Adicionalmente, el mantenimiento de una colección in vitro requiere de un intensivo trabajo y está sujeto a riesgos de contaminación y de error humano durante los subcultivos. Es por eso que la crioconservación o el almacenamiento de células o tejidos a temperaturas ultrabajas (-196°C), se presenta como una opción de interés para el almacenamiento a largo plazo, ya que el crecimiento cesa completamente, debido a la falta de agua e inhibición de todas las reacciones químicas. Por tanto, en teoría, el tejido en condiciones de crioconservación, no está sujeto a la variación somaclonal (Panis, 1995).
I.4 Marcadores utilizados para el estudio de la variabilidad genética en los bancos de germoplasma
La evaluación de los recursos genéticos es importante para identificar rasgos potencialmente valiosos de las muestras, así como las variedades locales que podrían utilizar directamente los agricultores (Cote et al.,1993). La diversidad se puede analizar a nivel intraespecífico o interespecífico y se puede estudiar en otros niveles de organización, desde los ecosistemas hasta los niveles celular, subcelular y molecular. Son numerosos los métodos existentes para determinar el grado de variación genética entre distintas plantas o poblaciones (Jarret, 1990). Los métodos basados en la morfología permiten analizar las diferencias de rasgos observables (fenotipos) entre las distintas plantas. Estos métodos son relativamente económicos y constituyen la base de la caracterización de las muestras de plantas en los bancos de germoplasma (Siquiera et al., 1988; Makumbi y Rubaihayo, 1995; De O et al., 1997). Los métodos citogenéticos y moleculares o genético-bioquímicos permiten analizar las diferencias entre los cromosomas, las proteínas o el ADN de las plantas (Avise, 1994). El análisis citogenético caracteriza y diferencia a los genotipos mediante el estudio del cariotipo y la meiosis (Lacadena, 1995), mientras que el análisis isoenzimático proporciona un estimado de la diversidad genética, basándose en la presencia de genes comunes (Brown y Clegg, 1983), por lo cual ambos estudios ofrecen nuevas posibilidades para el manejo de una colección. I.4.1 Evaluación morfoagronómica La clasificación mediante descriptores cualitativos y cuantitativos y el establecimiento de las relaciones entre y dentro de un grupo taxonómico de Musa, se convertirán en herramientas importantes para el mejoramiento de bananos y plátanos, la identificación de duplicados y determinación de los principales caracteres para diferenciar el material genético (Osuji et al., 1997; Ortiz et al.,1998). La evaluación sistemática del material experimental permite realizar la selección de clones prometedores, que pueden ser empleados como nuevos cultivares en la zona agroecológica escogida (Ortiz et al., 1998). Los datos de caracterización son descriptores morfológicos, que se pueden observar fácilmente a simple vista y se expresan en todos los ambientes. Tales datos describen los atributos de la especie objeto de muestreo, como la altura de las plantas, la morfología de las hojas, el color de las flores, entre otros. Los caracteres morfológicos resultan de gran interés dentro de este contexto. Algunos ejemplos de la importancia de tales caracteres han sido expuestos por Jain et al. (1975). Evidencias convincentes de su aplicación lo constituyen la
posibilidad de distinguir el nivel de ploidía, mediante mediciones del grano de polen en diversos cultivares (García et al., 1996), la utilización del grano de polen como indicadores de tolerancia al estrés de temperatura y humedad, así como evaluar caracteres relacionados con la entrada de patógenos y caracterización de variedades (Morales et al., 1996). La detección de diferencias en los patrones radiculares y la arquitectura entre los genotipos, pueden ofrecer un criterio de selección para la tolerancia a enfermedades, plagas y estrés de temperatura (Leskovar y Staffella, 1995). Es más fácil llegar a medir la variación genética de caracteres, como producción y rango de adaptación de variedades, pero resulta imposible reconocer y enumerar en una población los genotipos y los loci que afectan esos caracteres básicos, dado que tal variación se manifiesta generalmente como diferencias sutiles, las que se confunden tras el rango experimental de detección por variación inducida por el ambiente. Muchas características agronómicas que necesitan los mejoradores tienen una complejidad genética excesiva, para poder distinguir en la caracterización preliminar de las muestra s de germoplasma. Estos datos se suelen poner de manifiesto en la fase de evaluación del germoplasma, para conocer los rasgos agronómicos útiles, muchos de los cuales pueden estar sometidos a las interacciones entre el genotipo y el medio ambiente (G x M), siendo en consecuencia específicos de un lugar (Hayword et al., 1994; Iglesias, 1994). Los marcadores clásicos son de uso simple, ellos pueden permitir consideraciones ambiguas e interferencias entre el marcador y el fenotipo que será evaluado, porque se distinguen solo a nivel de plantas en un órgano y estadío de desarrollo (Florido, 1999); de ahí que en la mayoría de los casos, como parte de la variabilidad de un cultivo, se busquen estudios más directos del genoma a través del análisis citogenético e isoenzimático (Tanskley y Orton, 1983). En Cuba, las ventajas de los estudios morfoagronómicos se han utilizado para la caracterización y diferenciación de clones de cultivos como tomate (Lycopersicon esculentum Mill) (Florido, 1999), plátano (Musa spp)(Román, 1996; Acosta, 1999; Alonso 2000; Cazañas, 2001) y yuca (Manihot esculenta Crantz) ( Fernández, 1999), entre otros. I.4.2 Estudios citogenéticos. La citogenética es la ciencia que estudia el cromosoma bajo cualquier nivel o dimensión (Lacadena, 1996). Su objetivo fundamental es analizar y explicar cómo la estructura y el comportamiento de los cromosomas garantizan la triple función de conservar la información genética entre las células de un organismo pluricelular, transmitirla de padres a hijos y ilberarla de forma ordenada para controlar las
funciones celulares y el desarrollo del organismo, estudiando asimismo los controles y variaciones, sus consecuencias genéticas e implicaciones evolutivas así como las aplicaciones en la mejora genética de las plantas y animales o en la medicina. En las plantas, se emplean diversas metodologías para el estudio de los cromosomas, que van desde los métodos clásicos hasta el empleo de técnicas moleculares. La estimación de ploidía se realiza generalmente mediante el conteo de cromosomas, en cortes microscópicos preparados a partir de las puntas de las raíces en crecimiento activo (Osuji et al., 1996). Este método junto con el aplastado son los que generalmente se utilizan para contar los cromosomas en Musa (Sandova l et al., 1997). Se ha demostrado que los estudios cromosómicos siguen siendo la única comprobación exacta de los niveles de ploidía en el germoplasma de Musa (Van den Houwe et al., 1995). De esta manera, el conteo de cromosomas ha sido utilizado con este fin por autores como Hore et al. (1992), que realizaron una clasificación de los géneros Musa y Ensete en el noreste de India, así como Amalray (1992), que caracterizó el banco de germoplasma de bananos en el sur de la India. Además, se caracterizaron algunos de los clones del banco de germoplasma del Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT) en Cuba (Román y Rodríguez, 1986) así como los diploides, triploides y tetraploides del banco de germoplasma del Centro de Investigaciones Agrícola “La Rita “, Costa Rica (Peréz, 1997). Es imposible confeccionar mapas genómicos detallados, sin el análisis de la estructura y el comportamiento de los cromosomas durante la mitosis y meiosis. Es por eso que el conocimiento citológico es útil, para determinar los niveles de ploidía en el producto de los cruces obtenidos en programas de fitomejoramiento genético, interpretar fenómenos como la fertilidad masculina y femenina en los cultivares de Musa, la cual es afectada por variaciones en el número de cromosomas, su estructura y comportamiento (Simmonds, 1959), así como mejorar la utilidad de los cultivares de Musa a través del mejoramiento (Sandoval et al., 1997). Realmente, la realización de un programa de este tipo se facilita enormemente, al suministrarle técnicas citológicas confiables (Vakili, 1996). En la década de los treinta y los cuarenta, se determinó que el número básico de cromosomas en el género Musa (Cheesman y Later, 1935; Wilson, 1946) es de 11 y se encontró que los tipos cultivados poseen tres niveles de ploidía natural: 2n=2x=22, 2n=3x=33, 2n=4x=44 cromosomas (Berrie, 1997). Los cultivares comestibles del género Musa se originaron a partir de la hibridación intra e interespecífica entre dos especies diploides silvestres de Musa (Sección Eumusa), Musa acuminata Colla y Musa balbisiana Colla, que contribuyeron con los genomas A y B respectivamente (Simmonds, 1959). La poliploidía y la
hibridación dieron origen a una cantidad de clones diploides, triploides y tetraploides, con diferentes intercambios de los genomas A y B. De esta manera, la mayoría de los cultivares son bananos AA, AAA, plátanos AAB y bananos de cocción ABB (Simmonds, 1966; Wang et al., 1993). Varios estudios citológicos realizados en el plátano fruta han mostrado importantes resultados. Se plantea que existe suficiente evidencia experimental, para concluir que las anomalías en el número de cromosomas son más frecuentes en especies poliploides (D ′Amato, 1978) y (Karp, 1991), así como la presencia de anomalías estructurales o rearreglos cromosómicos, tales como translocaciones, delecciones o inversiones pueden ser la causa de pérdida de material genético y de alteraciones en la secuencia del ADN (Sherperd, 1990; Desauw, 1998). Asimismo, se ha comprobado que la inestabilidad mitótica en Musa aumenta si las plantas se encuentran en condiciones in vitro (Sandoval et al., 1997). Para entender mejor la citogenética del plátano fruta, se necesita más conocimientos sobre la compleja estructura genómica y las relaciones filogenéticas de los híbridos, cultivares y tipos silvestres. De este modo, se puede identificar a los ancestros diploides fértiles de los actuales cultivares poliploides. Actualmente, se desarrollan técnicas moleculares que van cambiando el mundo de la cariología de Musa. Se plantea que los microsatélites se han convertido en marcadores, para la caracterización del banano y el plátano (Weising et al., 1996) y ayudarán a estudiar la estructura y filogenia de los genomas de Musacea (Kaemmer et al., 1996). Se ha comenzado a desarrollar un nuevo método para la preparación de metafase en placas adecuadas para el análisis de cromosomas de alta resolución (Dolezel et al., 1998), el cual permite un conteo confiable de cromosomas y el análisis de la morfología básica de los cromosomas (Horry et al., 1998), así como la aplicación de la citometría de flujo y la citogénetica molecular constituirán una herramienta poderosa en la determinación del tamaño y la estimación de la composición del genoma nuclear, así como la estimación de los pares de bases (Dolezel et al., 1999 ). La aplicación de nuevas técnicas permite abordar de nuevo viejos problemas citogenéticos pendientes aún por resolver. De hecho, la metodología de la citogenética moderna está permitiendo responder a muchas cuestiones, uniendo los estudios bioquímicos y fisiológicos de los biólogos celulares con el diseño experimental genético (Nurse, 1990,1994). I.4.3 Caracterización isoenzimática La definición de “isozimas” fue propuesto por Marker y Moller en 1959, para designar a cada una de las múltiples formas enzimáticas que catalizan la misma reacción, con similar o idéntica especialidad de sustrato y que están presentes
dentro del mismo organismo. Posteriormente, fue introducido el término de “isoenzimas”, el cual algunos investigadores plantean que debe ser restringido a formas moleculares múltiples de enzimas, que se derivan de un mismo tejido u órgano, que tienen orígenes genéticos similares y que poseen actividades catalíticas muy semejantes, no exactamente superpuestas. Actualmente se utilizan indistintamente ambos términos (Markert y Moller,1959; Brewer y Singh, 1971). Dado que las enzimas constituyen una expresión de la diferenciación de las células, el análisis de las propiedades y patrones cambiantes durante el desarrollo, puede llegar al entendimiento de los mecanismos metábolicos y genéticos básicos, sobre el cual descansa la diferenciación celular (Iglesias, 1994). Las enzimas generalmente están constituidas por una o varias cadenas polipeptídicas y su expresión está determinada casi siempre por genes mendelianos simples con alelos codominantes, que en condiciones de laboratorio bien controladas, presentan alta heredabilidad (Wendel y Weeden, 1989). Los genetistas vegetales han empleado las isoenzimas con diferentes objetivos: análisis de la diversidad genética, estudios sistemáticos y evolutivos, caracterización de colecciones núcleo, identificación de genotipos y predicción de heterosis, así como el marcaje e introgresión de genes de interés agronómico (González, 1989; Román, 1996; Florido, 1999). El potencial de las isoenzimas para diferenciar y desarrollar nuevas funciones, depende en gran medida de la manera por la cual ellas fueron generadas (Weenden, 1983) y la multiplicidad isoenzimática puede ser el resultado de diferencias en las secuencias de aminoácidos o producto de modificaciones posttraduccionales. Las isoenzimas pueden ser codificadas por diferentes alelos del mismo locus (aloenzimas o aleloenzimas) (Prakash et al., 1969) o por diferentes loci (isoenzimas no alélicas ), así como pueden haber ocurrido cambios conformacionales o de dobleces en la estructura terciaria o cuaternaria por mecanismos epigenéticos (isoenzimas conformacionales) (Scandalios,1974). El hecho de que el locus o los loci que codifican para las isoenzimas pueden ser multialélicos, suministra grandes fuentes de variación, provocando una multiplicidad de formas isoenzimáticas (Iglesias, 1986). Las proteínas e isoenzimas existen en una variedad de formas moleculares múltiples y ellas pueden ser separadas por su movimiento relativo, a través de un medio polarizado. Se colocan extractos de tejidos en un medio y aplicando un campo eléctrico, las moléculas de proteínas migrarán a una velocidad determinada basándose en su carga neta, su peso molecular y el pH del medio. Las proteínas y las enzimas separadas de esta forma en bandas, pueden ser visualizadas mediante técnicas histoquímicas apropiadas (Iglesias, 1986). Actualmente, se acepta que la técnica de electroforesis permite un muestreo de loci genéticos de una manera aleatoria y con la proporción de enzimas seleccionadas al
azar, que muestran variaciones electroforéticas, se puede realizar un estimado de la proporción de loci genéticos involucrados en las variaciones (Brewer y Singh, 1971). El estudio de las proteínas y enzimas mediante las técnicas electroforéticas permite determinar las interacciones intragénicas e intergénicas, así como las influencias ambientales sobre los genotipos. Además, por ser el polimorfismo de las enzimas uno de los mecanismos de regulación de los procesos metabólicos, han sido objeto de numerosas investigaciones en varios cultivos (Brown y Moran, 1981). La mayor ventaja de las técnicas electroforéticas sobre los marcadores morfológicos radica en su codominancia, la cual las hace muy útiles para dilucidar el mecanismo de variación para un solo loci y hacen posible el estudio de la variación genética entre organismos, al nivel de su composición enzimática o proteica (Tanksley et al., l 1989). Mediante el empleo de las frecuencias de bandas y de no alelos, se han podido detectar estimados de la variabilidad existente en las poblaciones de numerosas especies cultivadas, así como obtener información taxonómica valiosa en estudios intergénicos e interespecíficos, que han sido útiles en estudios filogenéticos y de biodiversidad (Iglesias, 1998; Marselli et al., 1996; Jaaska, 1996; Hirata, 1996; Suh et al., 1997). Los estudios isoenzimáticos se han utilizado, también, para la caracterización in vitro de líneas celulares (Martelli et al., 1993; Arzatefernandez et al., 1993) y monitorear la variabilidad en estudios de micropropagación (Iglesias, 1994; Zambrano et al., 1998). Es por eso, que la electroforesis de proteínas para la actividad enzimática, es calificada como un poderoso instrumento en el estudio, monitoreo y medición directa de la variación genética en el cultivo de tejidos vegetales de amplia aplicación, en particular, en la determinación de variabilidad intraespecífica (Lassner y Orton, 1983; Iglesias y González, 1995). A pesar del amplio uso de esta técnica en los análisis genéticos, ella presenta una serie de inconvenientes que dificultan su utilización en la estimación de la variación genética, porque cerca del 30% de los cambios de bases del ADN no originan modificación en las secuencias de aminoácidos de las proteínas. La técnica, también, presenta la limitante de ser sólo válida para el estudio de genes estructurales, que codifican para determinadas proteínas y depende de la edad y el tipo de tejido utilizado (Triest, 1992), por lo que hoy en día estos estudios se complementan con marcadores mucho más potentes a nivel del ADN (Prince et al ., 1993; Stalker, 1994; Suh et al., 1997). Las isoenzimas se han empleado en la caracterización e identificación del germoplasma de Musa, por lo útil que resulta para examinar el grado de diversidad genética y la relación dentro y entre las especies (Aradyhya et al., 1994).
Lebot et al. (1993) utilizaron tres sistemas: malato deshidrogenasa, fosfoglucomutasas y fosfoglucoisomerasas, para estudiar cultivares de M. acuminata y M. balbisiana. Reyes et al. (1997) caracterizaron clones diploides, triploides y tetraploides de este cultivo y detectaron un alto polimorfismo en once de los sistemas estudiados; en 1998, esto mismos autores evaluaron 15 clones de la colección colombiana de Musaceas, mediante la utilización de nueve sistemas enzimáticos, entre los que se encuentran las esterasas, enzima málica, diaforasas, rubisco deshidrogenasa y otros. En Cuba, se han utilizado las ventajas de las técnicas electroforéticas para la caracterización y diferenciación de clones y variedades del género Musa (Iglesias, 1980a; Román y Manzano, 1991). Iglesias (1980b) utiliza diferentes sistemas enzimáticos, para relacionar la constitución genómica y estudiar el origen y las relaciones filogenéticas dentro del género y Román (1996); Román et al. (1997); Acosta (1999); Alonso (2000); Cazañas (2001) caracterizaron clones de plátano fruta y plátanos burro del banco de germoplasma del Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT). Bibliografía § Acosta, R. (1999). Caracterización citogenética, genético-bioquímica y morfoagronómica de diez clones de plátano ′ Burro ′ (Musa spp, Grupo ABB). Tesis de diploma. Facultad de Biología, UH. 50pp. § Alonso, M. (2000). Caracterización de diez cultivares de plátano fruta (Musa spp). Trabajo de diploma. Facultad de Biología, UH. 60pp. § Álvarez, J. M. (1993). Programas de plátano. Estrategia para enfrentar la situación actual. MINAGRI. 23pp. § Amalray, V. (1992). Collecting banana germplasm in Southern India. FAO. IBPGR. Plant Genetic Resources Newsletter (ITA); 64-66. 56pp. § Aradhya, K. M.; F. Zee; R. M. Manshardt (1994). Isozyme variations on wild and cultivated pineapple germplasm. I International Pineapple Symposium. Honolulu, Hawai. § Arzatefernández, A. M.; T. Nakasaki; H. Yamagata; T. Tanisaka (1997). Production of doubled-haploid plants from Liluim longifloum. Thumb. Anther culture. Plant Sci. 123(1-2):179-187. § Avise, J. C. (1994). Molecular Markers, Natural History and Evolution. Lst edn. Chapmas y Hall. New York, 511pp. § Bakshi, T. S. (1963). Bananas of Southern Sierra Leone. Econ. Bot (17):252262. § Berrie, A. M. (1997). The Musaceae: the bananas. In: An introduction to the botany of the major crop plants . Heyden, Londres, 113-116pp. § Brewer, G. J.; C. F. Singh (1971). Introduction to isozyme techiques. Acad. Press. New York.186p.
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