Revista Avft 2 2009 by felipe espino

Contenido Malaria due Plasmodium knowlesi in South-Eastern Asia and America. May imported cases represent an health care alert? Plasmodium knowlesi as the fifth malaria parasite Sergio Sabbatani, Sirio Fiorino, Roberto Manfredi

Tubercular disease caused by bacillus of Calmette-Guerin administered as a local adjuvant treatment of relapsing bladder carcinoma Pathogenetic, diagnostic and therapeutic issues, and literature review Bacillus Calmette-Guérin disease after intravesical instillation Roberto Manfredi, Nicola Dentale, Benedetta Piergentili, Cristian Pultrone, Eugenio Brunocilla

Micobacteriosis sistémica por Mycobacterium avium en paciente con SIDA Systemic mycobacteriosis for Mycobacterium avium in a AIDS patient Mederos Cuervo LM, Pomier Suárez O, Trujillo Avalos A, Fonseca Gómez C, Montoro Cardoso

Efectos de la administración crónica de alcohol sobre la conducta motora y su relación con el sistema colinérgico muscarinico en ratas Sprague Dawley bajo estrés discontinuos

Chacón Lozsán Francisco J, Bonfante-Cabarcas Rafael Armando, Damelis Daza y Douglas Garcia

Posible efecto antioxidante de la atorvastatina en individuos hiperlipidemicos Possible antioxidant effects of atorvastatin in hyperlipidemic individuals Marielena Muñoz, Mercedes Elena Márquez, Maira Soledad Carrizales, Rosalía de Carmen Sutil de Naranjo, María Esther Gómez, Elias Sukkar, Yulimir Khlaid, Yudith Peña.

Iatrogenic equine metabolic syndrome in thoroughbred horses Abelardo Morales, Francisco García, Víctor Bermúdez, María Morales, Luís Leal, Pedro López, Gilberto Planas, Carlos Rodríguez.

Institución publicadora Sociedad Venezolana de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica Dirección: Escuela de Medicina José María Vargas, Cátedra de Farmacología, piso 3, Esquina Pirineos, San José. Caracas - Venezuela. Telfs.:(0212)5619871 - (0414)1361811 (0414) 3805405 Fax: (0212)3214385 www.archivosvenezolanosdefarmacolgiayterapeutica.com revista.avft@gmail.com Objetivos de la revista Promover la productividad científica tanto de la comunidad nacional como internacional en los campos de farmacología en general, fisiología, fisiopatología e inmunología; la divulgación de artículos científicos y tecnológicos originales y artículos de revisión por invitación del Comité Editorial. Áreas de interés de la revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica pública artículos originales y de revisión, dedicados a los estudios de las drogas en el hombre así como de algunos estudios relacionados con las drogas en los animales, las evaluaciones de drogas nuevas, métodos de investigación, efectos tóxicos en los animales y en el hombre. Igualmente, publica trabajos originales y de revisión en el área de la Farmacología Clínica y Terapéutica, Fisiología y Fisiopatología. Historia de la revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica nació en 1982 como una necesidad de tener en Venezuela y Latinoamérica de una revista científica que publique la investigación farmacológica básica y clínica de nuestro país y América Latina, así como la investigación en otras ciencias básicas como Bioquímica, Fisiología, Fisiopatología e Inmunología. Simultáneamente con su creación, también se fundo la Sociedad Interamericana de Farmacología Clínica y Terapéutica y la Sociedad Venezolana de Farmacología y Terapéutica, inmediatamente AVFT se convirtió en el Órgano Oficial de las Sociedades Venezolanas de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica. Se solicito la indización en el Index Médico Latinoamericano y luego AVFT fue seleccionada en los Índices Extramed de la Organización Mundial de la Salud y en el Latinoamericano de Revistas Científicas de la Universidad Autónoma de México. Desde hace una década el FONACIT y el CDCH la apoyan económicamente y la han seleccionada en el Núcleo de Revistas del FONACIT. El FONACIT considera a AVFT como una de las revistas científicas venezolanas arbitradas con contenido más original y de mayor interés. Algunos investigadores connotados como Marcelo Alfonzo, ltala Lippo de Becemberg, AliciaPonte Sucre, Anita Israel, Luigi Cubeddu, Rafael Hernández, etc. han escogido a AVFT para publicar sus

hallazgos básicos y clínicos por su arbitraje, difusión e indización. Actualmente se ha remozado el Comité Editorial y los formatos adecuándolos a las exigencias de índices internacionales como el SCI, Excerpta Medica y Current Contents. A partir de 2002 AVFT se publicará cuatrimestralmente dado la mayor demanda científica. AVFT tradicionalmente ha publicado las reuniones anuales de Farmacología, ASOVAC, Facultad de Farmacia, del Instituto de Medicina Experimental y de Congresos de Farmacología organizados en nuestro país. Periodicidad Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica es una publicación semestral con 2 números al año. Título abreviado: AVFT INDIZADA EN: 1) LIVECS (Literatura Venezolana de Ciencias de la Salud) 2) LILACS (Literatura Latinoamericana y del Caribe en Ciencias de la Salud) 3) Índice de Revistas Latinoamericanas en Ciencias (Universidad Nacional Autónoma de México) 4) BIREME 5) LATINDEX 6) SCIELO 7) REDALYC Copyright Sociedad Venezolana de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica. Derechos reservados. Queda prohibida la reproducción total o parcial de todo el material contenido en la revista sin el consentimiento por escrito del editor en jefe. Patrocinadores Esta revista se financia gracias a los aportes que ofrecen el Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología (FONACIT), y Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la UCV (CDCH).

Alfieri Anita (Venezuela) Arciniegas Enrique (Venezuela) Armas María Cristina (Venezuela) Bermúdez Fernando (Venezuela) Bianco Nicolás (Venezuela) Bravo Laura (Cuba) Bonilla Jairo (Colombia) Cabezas Gloria A. (Venezuela) Campos Augusto (Venezuela) Carmona Oswaldo (Venezuela) Carvajal Ana (Venezuela) Correa Maria Fernanda (Venezuela) Crippa Giuseppe (Italia) De Santis Juan (Venezuela) Di Prisco María C. (Venezuela) Dujovne Carlos A. (Estados Unidos) Fouillioux Christian (Venezuela) Fuenmayor Luis (Venezuela) Gómez Héctor J. (Estados Unidos) Gómez Juanita (Venezuela) Hernández Pieretti Otto (Venezuela) Israili Zafar (Estados Unidos) Lares Mary (Venezuela) Lechin Fuad (Venezuela) Levenson Jaime (Francia) Lynch Neil (Australia) Manfredi Roberto (Italia) Malka Samuel (Venezuela) Martínez Antonio Dalessandro (Venezuela) Mc Lean A.E.M. (Inglaterra) McNay John L. (Estados Unidos) Mederos Lilian (Cuba) Mejías Enrique J. (Venezuela) Meza Carolina (Venezuela) Moncada Salvador (Reino Unido) Moreno Alejandra (Mexico) Naranjo Claudio A. (Canadá) Ponte-Sucre Alicia (Venezuela) Prichard B.N.C. (Inglaterra) Ram Venkata (Estados Unidos) Ramos Alexis (Venezuela) Rivera María (Venezuela) Rodríguez R. Miguel A. (Venezuela) Salazar Margarita (Venezuela) Souki Aida (Venezuela) Urbina Adalberto (Venezuela)

Editor en Jefe Dr. Manuel Velasco Editor Ejecutivo Dr. Freddy Contreras Editor Emeritus Dr. Augusto Campos Editores Asociados Dr. Alfonzo Marcelo Dra. Armas de Hernández, María José

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Dr. Cano Clímaco Dr. Cubeddu Luigi Dr.Hernández Rafael Dr. Magaldi Luís Dra. Mathison Yaira Lic. Ortiz Holger Dra. Salazar Mariselis Dra. Sosa Amparo Dra. Stern de Israel, Anita Comité Editorial Abadi Isaac (Venezuela) Acquatella Harry (Venezuela) Alcocer Luís (Méjico)

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Instrucciones a los Autores

Alcance y política editorial La Revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica es una publicación biomédica periódica, arbitrada, de aparición semestral, destinada a promover la productividad científica de la comunidad nacional e internacional en todas las áreas de Ciencias de la Salud y Educación en Salud; la divulgación de artículos científicos y tecnológicos originales y artículos de revisión por invitación del Cómité Editorial. Está basada en la existencia de un Comité de Redacción, consistente en un Editor-Director, Editores asociados principales y Comisión Editorial y Redactora. Los manuscritos que publica pueden ser de autores nacionales o extranjeros, residentes o no en Venezuela, en castellano (con resumen en idioma inglés y castellano) y deben ser remitidos a la Redacción de la Revista. Los manuscritos deben ser trabajos inéditos. Su aceptación por el comité de redacción implica que no ha sido publicado ni está en proceso de publicación en otra revista, en forma parcial o total. El manuscrito debe ir acompañado de una carta solicitud firmada por el autor principal y el resto de los autores responsables del mismo. En caso de ser aceptado, el Comité de Redacción no se hace responsable con el contenido expresado en el trabajo publicado. Aquellos que no se acojan a las condiciones indicadas, que sean rechazados por lo menos por dos árbitros que dictaminen sobre su calidad y contenido, y que no cumplan con las instrucciones a los autores señalados en otro aparte, no serán publicados y devueltos en consecuencia a los autores.

a. Página del título.

Forma de preparación de los manuscritos Para la publicación de trabajos científicos en la Revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica, los mismos estarán de acuerdo con los requisitos originales para su publicación en Revistas Biomédicas, según el Comité Internacional de Editores de Revistas Biomédicas (Annal of Internal Medicine 2006:126(1):36-47). Además, los editores asumen que los autores de los artículos conocen y han aplicado en sus estudios la ética de experimentación (Declaración de Helsinki). A tales efectos, los manuscritos deben seguir las instrucciones siguientes:

c. El nombre del departamento(s) o instituciones a quienes se les atribuye el trabajo.

1. Mecanografiar original a doble espacio en idioma español, papel Bond blanco, 216 x 279 mm (tamaño carta) con márgenes por lo menos de 25 mm, en una sola cara del papel. Usar doble espacio en todo el original. Su longitud no debe exceder las 10 páginas, excluyendo el espacio destinado a figuras y leyendas (4-5) y tablas (4-5). 2. Cada uno de los componentes del original deberán comenzar en página aparte, en la secuencia siguiente:

b. Resumen y palabras claves. Se recomienda a los autores de los artículos al colocar las palabras clave utilicen el DECS (Descriptores en Ciencias de la Salud) que puede ser consultado en la siguiente dirección: http.//decs. bvs.br c. Texto. d. Agradecimientos. e. Referencias. f. Tablas: cada una de las tablas en páginas apartes, completas, con título y llamadas al pie de la tabla. g. Para la leyenda de las ilustraciones: use una hoja de papel distinta para comenzar cada sección. Enumere las páginas correlativamente empezando por el título. El número de la página deberá colocarse en el ángulo superior izquierdo de la misma. 3. La página del título deberá contener: 3.1. Título del artículo, conciso pero informativo. a. Corto encabezamiento de página, no mayor de cuarenta caracteres (contando letras y espacios) como pie de página, en la página del titulo con su respectiva identificación. b. Primer nombre de pila, segundo nombre de pila y apellido (con una llamada para identificar al pie de página el más alto grado académico que ostenta y lugar actual donde desempeña sus tareas el(los) autores.

d. Nombre y dirección electrónica del autor a quien se le puede solicitar separatas o aclaratorias en relación con el manuscrito. e. La fuente que ha permitido auspiciar con ayuda económica: equipos, medicamentos o todo el conjunto. f. Debe colocarse la fecha en la cual fue consignado el manuscrito para la publicación. 4. La segunda página contiene un resumen en español y su versión en inglés, cada uno de los cuales tendrá un máximo de 150 palabras. En ambos textos se condensan: propósitos de la investigación, estudio, método empleado, resultados (datos específicos, significados estadísticos si fuese posible) y conclusiones. Favor hacer énfasis en los aspectos nuevos e importantes del estudio o de las observaciones. Inmediatamente después del resumen, proporcionar o identificar como tales: 3-10 palabras claves o frases cortas que ayuden a los indexadores

en la construcción de índices cruzados de su artículo y que puedan publicarse con el resumen, utilice los términos del encabezamiento temático (Medical Subject Heading) del Index Medicus, cuando sea posible. 5. En cuanto al texto, generalmente debe dividirse en: introducción, materiales y método, resultados y discusión. 6. Agradecimientos, sólo a las personas que han hecho contribuciones reales al estudio. 7. Las citas de los trabajos consultados seguirán los requisitos de uniformidad para manuscritos presentados a revistas Biomédicas, versión publicada en: Annal of Internal Medicine 2006; 126(1): 36-47. www.icmje.com. No se aceptarán trabajos que no se ajusten a las normas. 8. Tablas: En hoja aparte cada tabla, mecanografiada a doble espacio; no presentar tablas fotográficas; enumere las tablas correlativamente y proporcione un título breve para cada una; dé a cada columna un encabezamiento corto o abreviado; coloque material explicativo en notas al pie de la tabla y no en el encabezamiento; explique en notas al pie de la tabla las abreviaturas no estandarizadas usadas en cada tabla; identifique claramente las medidas estadísticas de las variables tales como desviación estándar y error estándar de la medida; no use líneas horizontales ni verticales: citar cada tabla en orden correlativo dentro del texto; citar la fuente de información al pie de la tabla si ésta no es original. 9. Ilustraciones: Deben ser de buena calidad; entregarlas separadas; las fotos, en papel brillante con fondo blanco, generalmente 9 x 12 cm. Las fotografías de especímenes anatómicos, o las de lesiones o de personas, deberán tener suficiente nitidez como para identificar claramente todos los detalles importantes. En caso de tratarse de fotos en colores, los gastos de su impresión correrán a cargo del autore(s) del trabajo. Lo mismo sucederá con las figuras que superen el número de cuatro. Todas las figuras deberán llevar un rótulo engomado en el reverso y en la parte superior de la ilustración indicando número de la figura, apellidos y nombres de los autores. No escribir en la parte posterior de la figura. Si usa fotografía de personas, trate de que ésta no sea identificable o acompañarla de autorización escrita de la misma. Las leyendas de las ilustraciones deben ser mecanografiadas a doble espacio en página aparte y usar el número que corresponde a cada ilustración. Cuando se usen símbolos y fechas, números o letras para identificar partes en las ilustraciones, identifíquelas y explíquelas claramente cada una en la leyenda. Si se trata de microfotografía, explique la escala e identifique el método de coloración. 10. Envíe un original y dos copias impresas en un sobre de papel grueso, incluyendo copias fotográficas y figuras entre cartones para evitar que se doblen, simultáneamente envíe una versión electrónica en CD o a través del e-mail: revista. avft@gmail.com, indicando el programa de archivo. Las fotografías deben venir en sobre aparte. Los originales deben acompañarse de una carta de presentación del autor en la que se responsabiliza de la correspondencia en relación a los originales. En ella debe declarar que conoce los originales y han sido aprobados por todos los autores; el tipo de artí-

culo presentado, información sobre la no publicación anterior en otra revista, congresos donde ha sido presentado y si se ha usado como trabajo de ascenso. Acuerdo a asumir los costos de su impresión en caso de fotos a color, autorización para reproducir el material ya publicado o ilustraciones que identifiquen a personas. 11. Los artículos a publicarse, pueden ser: originales, revisiones, casos clínicos, y cartas al editor. 12. Cuando se refiere a originales, queda entendido que no se enviará artículo sobre un trabajo que haya sido publicado o que haya sido aceptado para su publicación en alguna parte. 13. Todos los trabajos serán consultados por lo menos por dos árbitros en la especialidad respectiva. 14. La Revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica, no se hace solidaria con las opiniones personales expresadas por los autores en sus trabajos, ni se responsabiliza por el estado en el que está redactado cada texto. 15. Todos los aspectos no previstos por el presente reglamento serán resueltos por el Comité Editorial de la Revista. 16. La revista apoya las políticas para registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journall Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de esas iniciativas pera el registro y divulgación internacional de Información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se aceptarán para publicación, a partir de 2007, los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayo Clínicos validados por los criterios establecidos por OMS e ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de Identificación se deberá registrar al final del resumen.

Editorial Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica (Avft) publica su segundo número del 2009, cinco (5) artículos originales en el área de la bacteriología procedentes de Cuba y de Italia. Un artículo original en el área de sistema colinérgico muscarinico y su relación con la conducta motora en ratas tratadas con alcohol, Otro artículo reportando los efectos antioxidantes de la atorvastatina en sujetos hiperlipemicos Finalmente un artículo original sobre síndrome metabólico iatrogenico en caballos.

Dr. Manuel Velasco Editor en Jefe

Malaria due to Plasmodium knowlesi in South-Eastern Asia and America. May imported cases represent a health care alert? Sergio Sabbatani1, MD, Sirio Fiorino2, MD, Roberto Manfredi1, MD 1 Infectious Diseases, University of Bologna, S. Orsola-Malpighi Hospital, Bologna, Italy 2 Internal Medicine, Budrio General Hospital, Budrio, Italy Conflicts of interest, funding, sponsorship, acknowledgements: none Correspondence: Dr. Sergio Sabbatani, MD Infectious Diseases, S. Orsola Hospital. Via Massarenti 11. I-40138 Bologna, Italy Telephone: +39-051-6363355. Telefax: +39-051-343500. E-mail: Sergio.sabbatani@aosp.bo.it

Recibido: 05/10/2009

Aceptado: 05/10/2009

Key words: Malaria parasites, Plasmodium knowlesi, emerging plasmodia, human health, public health concerns

Four main malaria plasmodia involve human beings. Plasmodium vivax, Plasmodium malariae and Plasmodium ovale had an older evolution paralelling the human species evolution (co-evolution)1-3, while Plasmodium falciparum has been encountered by humans later during their evolution, since it was acquired by monkeys probably between the end of Mesolithic and the beginning of Neolithic eras4. Over twenty species of malaria plasmodia are capable of infecting monkeys (Table 1), but the anecdotal transmission of these organisms to humans has been considered until recently a rare event, with minor public health concerns. The transmission of these plasmodia protozoa predominantly occurred in South-Eastern Asia, China, and Central-Southern America5. The expansion of human activities in geographic areas which remained poorly anthropized in the past (i.e. forest zones where productive activities have been recently started), and wild regions, which are increasingly visited by travellers practicing trekking activities, represent objective elements which lead to an expected increase of risk to acquire malaria plasmodia of simian origin. Moreover, the present demographic expansion of local populations in different regions of the Southern Asia and Southern America, which also involved wild areas close to rain forests, especially when villages living of agricultural or breeding activities are interested, bear further epidemiological risk factors. In these environmental contexts, an overlapping of human and simian habitats becomes evident, in presence of a common infestation by Anopheles mosquitoes, which are the needed vehicle for malaria transmission to humans. Among the twenty plasmodia species which may infect monkeys, five of them have been documented as potential infectious agents for humans: they are Plasmodium simium, Plasmodium brasilianum (South America), Plasmodium cynomolgi, Plasmodium inui, and Plasmodium knowlesi (South-Eastern Asia)5. The majority of

malaria infection of monkeys tend to cause a mild-to-moderate disease in humans, which is frequently self-limiting, and rarely requires antimalaric chemotherapy, since they are often missed or neglected. The identification of P. knowlesi disease foci confirmed by biomolecular techniques in Sarawak (Malaysian Boneo), Sabah (a state belonging to the Malaysia Confederation), and Pahang (peninsular Malaysia) between the end of the past century and early XXI century6,7, catched the attention of researchers and clinicians operating in SouthEastern Asia, and more recently of the international health care authorities5, initially focusing the attention on episodes which presented a typical malaria course, but received a microbiological (microscopic) diagnosis of P. malariae infection. A distinctive feature of these patients was the elevated parasitemia and the severity of clinical course, should a rapid and appropriate treatment was not administered6,7; in the records of these authors also four cases with a lethal evolution were present. Later, the availability of specific P. knowlesi primers allowed to pose a definitive diagnosis also in subjects whose erythrocytes proved morphologically similar to those infected by P. malariae, but tested negative when assessed with P. malariae primers. The more severe impact of P. knowlesi malaria is related to the evidence that this Plasmodium has a daily replication cycle and may therefore reach an elevated, life-threatening parasitemia in absence of an effective treatment, whereas P. malariae has a replication cycle every three days (responsible of the so-called quartan fever), and never reaches so elevated blood parasite concentrations6-8. Recent entomology studies9 demontrated that in the Malaysian geographic context the more efficient vector transmitting P. knowlesi infection to humans is Anopheles latens, and the most elevated bite rate is registered at the limits of forest (6.74%), while a reduce frequency regards the rain forest (1.85%) and the examined longhouses (the typical

Archivos Venezolanos de FarmacologĂa y TerapĂŠutica Volumen 28, nĂşmero 2, 2009

Plasmodium knowlesi as the fifth malaria parasite

Malaysia houses) (0.28%), which never were the site of micro-epidemic disease clusters. Based on these data, it has been hypothesized that humans acquire infection in the forest, when hunting, or after working hours, when coming home at darkness10. The potential simian reservoirs are Macaca mulatta, M. nemestina, M. inus, and Saimiri sciurea. After the report of Malaysia foci, where native population was involved, and the identification of single imported cases in Europe and North America by tourists who travelled for short periods close to forest areas of South-Eastern Asia11-15, the attention of researchers for P. knowlesi rapidly increased. In the year 2008, the Journal “Nature” published the analysis of the nuclear genomic sequencing of P. knowlesi16. It was the first complete gene sequencing of a simian Plasmodium, therefore offering the opportunity for a comparation with the complete genome of P. vivax and other already known Plasmodia genomes. In contrast with other plasmodial genomes, putative familiar antigenic variants are scattered throughout the genome and associated with intrachromosomal telomere repeats. One of these families, called KIRs, includes genomic sequences which on the whole match around one-half of the extracellular domain CD99 of the host: this situation suggested that this form could represent an inusual molecular mimicry16,17. A relevant information came from recent observations and epidemiological data coming from Malaysia. The habitat of humans is more and more overlapping that of primates, and it is primarily due to two aspects: the first is related to the expansion of human activities (agriculture, deforesting, clearing of valued wood, and animal breeding), in areas also inhabitated by monkeys. The second emerging issue is related to the relevant increase of touristic activities (i.e. trekking) by intrenational visitors, who spend a proportionally limited time in this environment, and subsequently come back to their countries of origin8. In this last situation, the limited knowledge of simian plasmodia and thir diagnos-

tic-identification problems, may confuse Western health care providers, especially when a basic microscopic, parasitologic examination is carried out for the research and identification of malaria plasmodia, which does not allow to distinguish P. malariae from P. knowlesi, therefore posing at risk patient’s life8. The biomolecular techniques are extremely useful to trace the general epidemiology of malaria, and to clarify the role and importance of mixed infections, which still remain underestimated8. Unfortunately these sophisticated assays are costly and not easily available throughout the world, especially in developing countries. On the basis of epidemiological features of regions where epidemic foci of P. knowlesi malaria have been reported, and the anecdotal episodes of clinical reports occurred in Western travellers coming back in their countries of origin with a P. knowlesi disease, it is not possible to establish whether infections have been acquired by the most common animal reservoirs (i.e. macaques), or whether human-to-human contagion may occur. However, it is presently clear that this zoonosis is no more responsible of single, episodic cases, but it represents a true health care emrgency in South-Eastern Asian countries. The Figure 1 allows to appreciate the overal co-evolutive pathway of malaria plasmodia in parallel with that of the genus Homo, from hominids (group A), toward modern men (group C), with the appearance of P. falciparum which entered the epidemiological scenario infecting humans (group B) of mesolithic and early neolithic eras, who spent their lives in cabins located at the edge of rain forest and in the proximity of the first cultured fields. Just the introduction of the first organized human activities which significantly contributed to the expansion of P. falciparum, which up to date represents the most relevant malaria pathogen from the pathocenosis of pre-historical populations, unavoidably conditioning both economic and anthropological development. With regard to the appearance of a novel malaria parasite epidemiologi-

Table 1 49

Simian Plasmodium species

Human species resembling to them

Regional distribution

Asia P. coatney

P. falciparum

Malaysia, Philippines

P. cynomolgi

P. vivax

India, Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Taiwan

P. eylesi

P. vivax

Malaysia

P. fieldi

P. ovale

Malaysia

P. fragile P. hylobati

P. falciparum P. vivax

India, Sri Lanka Indonesia

P. inui

P. malariae

India, Indonesia, Malaysia, Philippines, Sri Lanka, Taiwan

P. jeffrey

P. vivax

Indonesia, Malaysia

P. knowlesi

P. malariae, P. falciparum

China, Indonesia, Malaysia, Philippines, Singapore, Thailand, Taiwan

P. pitheci P. simiovale P. silvaticum P. youngi

P. vivax P. ovale P. vivax P. vivax

Malaysia Sri Lanka Malaysia Malaysia

P. brasilianum

P. malariae

Brazil, Colombia, Mexico, Panama, Peru, Venezuela

P. simium

P. vivax

Brazil

South America

Malaria species of simian origin isolated in Asia and in Southern America (modified from the reference quotation4). Their associated geographical distrubution, and the morphologic similarities to one of the four “classical” human plasmodia species (i.e. Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, and Plasmodium malariae), are pointed out.

cally relevant for humans, the hope is that this novel patocenosis remain circumscribed in some countries of South-Eastern Asia, without extension to other areas, which are susceptible due to similar climatic and environmental features. In this evenience, the impact of autochtonous populations, not naturally immunized, after the contacts which normally occur during early infancy, may be responsible for particularly se-

vere consequences, not only for local populations lacking of a specific immune memery, but also for the growing number of tourists and excursionists, who may be exposed to the risk to come back to their countries of origin with a P. knowlesi malaria infection, whose diagnosis cannot rely on the routine laboratory examinations.

The enclosed graph depicts the biological and filogenetical evolutions of P. vivax, P. malariae, and P. ovale (Group A), compared with the extremely more recent evolution pathway of P. falciparum (group B). P. knowlesi (belonging to group C), is the last Plasmodium species which steadily entered the human pathology, and is related to productive and touristic human activities carried out in the forest regions of Malaysia and Borneo. The image has been taken and modified from some studies published by L. Capasso (quoted at reference [1]), in particular with the adjunct of group C malaria parasites.

References 1.

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Sing B, Sung LK, Matusop A, Radhakrishnama A, Shamsul Smita SG, Cox-Singh J, et al. A large focus of naturally acquired Plasmodium knowlesi infections in human beings. Lancet 2004; 363:10171024.

8. 9.

Cox-Singh J, Davis TME, Lee KS, Shamsul SGS, Matusop A, Ratnam S, et al. Plasmodium knowlesi malaria in humans is widely distributed and potentially lifre threatening. Clin Infect Dis 2008; 46:165171. White NJ. Plasmodium knowlesi: the fifth human malaria parasite. Editorial Commentary. Clin Infect Dis 2008; 46:172-173. Vythlingam I, Tan CH, Asmad M, Chan ST, Lee KS, Singh B. Natural transmission of Plasmodium knowlesi to humans by Anopheles latens in Sarawak, Malaysia. Trans R Soc Trop Med Hyg 2006; 100:1987-1088.

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Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 28, número 2, 2009

Figure 1

Comportamiento de indicadores de calidad del cultivo en los laboratorios de diagnóstico de tuberculosis en la provincia de Las Tunas, Cuba Behavior of quality indicators of cultures in the tuberculosis laboratories diagnosis in Las Tunas province, Cuba María Rosarys Martínez Romero1, Misleidis Sardiña Aragón, Grechen García, Marisol Díaz Almaguer2, Ernesto Montoro Cardoso1. 1 Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones en Tuberculosis y Micobacterias. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (IPK). Centro Colaborador OPS/ OMS. Ciudad de La Habana, Cuba. 2 Laboratorio Microbiología Hospital “Ernesto Guevara”. Las Tunas Correspondencia: Dra María Rosarys Martinez Romero. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. CP: 11300. La Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: rosarys@ipk.sld.cu.

Recibido: 20/07/2009

Aceptado: 02/10/2009

Resumen

Summary

Antecedentes: El cultivo bacteriológico, es la prueba de oro para el diagnóstico definitivo de la tuberculosis (TB). La finalidad del control de calidad es mejorar continuamente la eficiencia y el uso del cultivo como una alternativa de diagnóstico y monitoreo, asegurando que la información generada por el laboratorio sea confiable y exacta. Método: Se calcularon los indicadores de calidad (IC) a 5799 cultivos de las muestras de esputo de pacientes con TB pulmonar confirmada bacteriológicamente, recibidas en los laboratorios de diagnóstico de TB de la provincia Las Tunas, 4721 del laboratorio del Centro Provincial de Higiene y Epidemiología (CPHE) y 1078 del laboratorio del Centro Municipal de Higiene y Epidemiología (CMHE) de Puerto Padre, en el período de octubre del 2003 a septiembre del 2005.

Background: The bacteriological culture, it is the golden test for the definitive diagnosis of the tuberculosis (TB). The purpose of the quality control is improve the efficiency and use of culture like an alternative of diagnosis and monitoring, and assuring that the information generated by the laboratory are reliable and exact.

Resultados: En el CPHE la tasa de contaminación (TC), el aporte del cultivo al diagnóstico (ACD) y el % baciloscopía positiva con cultivo negativo fue de 4.3%, 34.8% y 6.3% respectivamente. En el laboratorio del CMHE la TC presentó un valor de 7.6% y el resto de los indicadores fue de 0%. Conclusiones y recomendaciones: Los indicadores de calidad del cultivo en el laboratorio del CPHE de Las Tunas, exceptuando el % BK (+) CU (-), presentaron valores aceptables para un buen desempeño del laboratorio; en el laboratorio del CMHE de Puerto Padre los valores de los IC, a excepción del % BK (+) CU (-), fueron superiores establecidos por las normas internacionales. Recomendamos incorporar el cálculo de los IC a la red nacional de laboratorios que realizan cultivo, para conocer y evaluar los resultados del trabajo e incorporar la evaluación de la sensibilidad del medio de cultivo para mejorar el rendimiento y la calidad del diagnóstico de la TB. Palabras claves: cultivo, indicadores de calidad, tuberculosis, laboratorios, municipio.

Method: The quality indicators (QI) were calculated in 5799 sputum samples, from patients with pulmonary TB confirmed by bacteriological culture, received in the TB diagnosis laboratories from Las Tunas province, 4721 from TB Laboratory of the Hygiene and Epidemiology Provincial Center (HEPC) and 1078 from TB Laboratory of the Hygiene and Epidemiology Municipal Center (HEMC) of the Puerto Padre municipality, from October 2003 to September 2005. Results: In the HEPC the contamination rate (CR), the culture contribution to the diagnosis (CCD) and the percent of positive baciloscopy with negative culture (% BK+ CU -) was 4.3%, 34.8% and 6.3% respectively. In the laboratory of the HEMC the CR was 7.6% and the rest of the indicators were 0%. Conclusions and recommendations: The QI of culture in the HEPC laboratory from Las Tunas municipality, excepting the % BK (+) CU (-) presented acceptable values for a good performance, in the HEMC laboratory from Puerto Padre municipality, the IC values, to exception of the % BK (+) CU (-), were superiors to the established for the international norms. We recommended incorporate the calculation of QI in the national network of laboratories culture, in order to improve the yield and quality of TB diagnosis. Key words: culture, quality indicators, tuberculosis, laboratories, municipality

Por décadas, el diagnóstico de la tuberculosis (TB) ha dependido de la observación directa de los bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) y la demostración del Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en el cultivo. La coloración de Ziehl Neelsen, es el procedimiento más comúnmente usado para indicar la presencia de BAAR en el esputo, pero su sensibilidad es más baja que la del cultivo1,2. El cultivo bacteriológico, es la prueba de oro para el diagnóstico definitivo de la TB. Según el método de decontaminación y el tipo de medio de cultivo utilizado, pueden ser detectadas hasta un mínimo de 10 células viables por mililitro de esputo. Mediante los métodos de cultivo es posible extender la confirmación del diagnóstico de TB en aproximadamente 15 – 20% del total de casos y del 20 – 30% de los pacientes con tuberculosis pulmonar. Además, la detección de los enfermos es más temprana, con frecuencia antes de volverse infecciosos. Por otra parte, el cultivo, permite determinar un número reducido de bacilos presentes en la muestra, de esta manera puede aumentarse considerablemente la eficiencia en el diagnóstico de los fracasos al finalizar el tratamiento. Sin embargo, el cultivo de las muestras es mucho más caro que la microscopía y es preciso contar con instalaciones para la preparación de los medios de cultivo y personal capacitado3–6. El Laboratorio Nacional de Referencia es el responsable de asegurar la calidad de los cultivos, monitoreo de la oferta, uso y rendimiento del mismo en la red de laboratorios. El control de calidad (CC) de los cultivos, es un sistema de supervisión interna eficaz de los resultados del trabajo de los laboratorios, permite mejorar continuamente la eficiencia y el uso del mismo como una alternativa de diagnóstico y monitoreo, asegurando que la información generada por el laboratorio sea confiable y exacta. Tiene tres componentes fundamentales: el control de calidad, mejoramiento de la calidad y las pruebas de competencia3,6. En nuestro país, no se han realizado investigaciones relacionadas con el CC del cultivo de tuberculosis y en el mundo se han reportado muy pocos estudios sobre este tema. Mediante el presente trabajo nos propusimos evaluar los indicadores de calidad del cultivo de las muestras de esputo recibidas en los laboratorios de diagnóstico de TB de la provincia Las Tunas, con el propósito de mejorar el rendimiento y la calidad del diagnóstico de la TB.

mas y Procedimientos del Programa Nacional de Control de la TB7, como técnica de descontaminación se utilizó el método de Petroff modificado, posteriormente fueron inoculadas 0.2 décimas (dos tubos por muestra) en el medio de Lowestein Jensen e incubados a 37o Celsius por 8 semanas, realizando la lectura semanal. Para calcular los indicadores de calidad de los cultivos de tuberculosis, se clasificaron a los pacientes con TB pulmonar confirmada bacteriológicamente en varias categorías, según la bibliografía consultada6. Categorías: A) BK (+) / Cultivo (+). B) BK (+) / No Cultivo C) BK (-) / Cultivo (+) D) BK (+) / Cultivo (-) E) BK (+) / Cultivo contaminado F) BK no realizada / Cultivo (+) Una vez clasificados los casos por categoría, se calcularan los siguientes indicadores de calidad: • Aporte del cultivo al diagnóstico (ACD). • % de muestras BK (+) / Cultivo (-). • Tasa de contaminación (TC). Fórmulas para realizar los cálculos e interpretación de los resultados: I. Aporte del cultivo al diagnóstico (ACD): los valores de este indicador, para que sea aceptable, deben oscilar entre 20% y 30%, de los casos con confirmación bacteriológica. ACD = __________C___________ X 100 A+B+C+D+E II. % de muestras BAAR (+) / Cultivo (-): Los valores de esta proporción para que sea aceptable deben encontrarse entre un 2 – 3%. % BAAR (+) CU (-) = _______D________ X 100 A+B+C+D+E III. Tasa de contaminación (TC): expresada como porcentaje de tubos contaminados entre total de tubos inoculados. No debe superar el 5%. TC = ____Tubos contaminados___ X 100

Materiales y métodos

Total de tubos inoculados

Se calcularon los indicadores de calidad a 5799 cultivos de la provincia de Las Tunas, de ellas 4721 del laboratorio del Centro Provincial de Higiene y Epidemiología (CPHE) y 1078 del laboratorio del Centro Municipal de Higiene y Epidemiología (CMHE) de Puerto Padre, en el período de octubre del 2003 a septiembre del 2005.

Resultados

Fueron excluidas del estudio las muestras no útiles para cultivo (muestras escasas y/o derramadas). Las muestras después de realizar la baciloscopía (BK), fueron procesadas según lo establece el Manual de Nor-

De los 5599 cultivos de esputo analizados, 4721 se realizaron en el laboratorio de diagnóstico del CPHE y 1078 en el CMHE de Puerto Padre. Al calcular los IC del cultivo, pudimos observar que la tasa de contaminación observada en el laboratorio del CPHE fue de 4.3%, menor al 5%, valor mínimo establecido por las normas internacionales para un buen desempeño del laboratorio6, y en el CMHE de Puerto Padre la TC fue mayor con un 7.6%.

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Introducción

En relación a aporte del cultivo al diagnóstico, en el CMHE de Puerto padre, el cultivo no aportó ningún caso y en el CPHE el aporte al diagnóstico fue de un 34%. El % de cultivos negativos con BK positiva en el laboratorio provincial (CPHE) fue de un 6.3%. El laboratorio del CMHE de Puerto Padre no presentó casos con BK (+) CU (-). Tabla 1. Resultados de los Indicadores de calidad de los cultivos por laboratorio INDICADORES DE CALIDAD LABORATORIOS DE CULTIVO

TC (%)

ACD (%)

% BK(+) CU(-)

CPHE Las Tunas

4,3

6,3

CMHE Puerto Padre

7,6

Leyenda: TC: tasa de contaminación

ACD: Aporte del cultivo al diagnóstico

% BK (+) CU (-): porciento de baciloscopía positiva y cultivo negativo

Discusión La mayoría de las muestras clínicas enviadas al laboratorio de cultivo de TB están contaminadas en mayor o menor grado por gérmenes de la flora normal que se reproducen a una gran velocidad y se desarrollarían rápidamente en la superficie del medio. El Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es de crecimiento lento, por lo otros microorganismos digerirían los nutrientes del medio antes de que pudieran crecer los bacilos. Por esta razón la mayoría de las muestras deben someterse a procesos de digestión y decontaminación rigurosos que destruyan los desechos orgánicos y elimine la flora indeseable3.

El método de decontaminación de Petroff modificado, es uno de los más utilizados internacionalmente, sobre todo en los países de Latinoamérica y se ha demostrado su gran utilidad para el manejo clínico y epidemiológico de la TB, además utilizan para su elaboración reactivos que son de fácil obtención, económicos y no son dependientes de insumos ni equipos de una marca determinada6. Este estudio, es el primer reporte realizado en Cuba sobre control de calidad del cultivo convencional de micobacterias. A nivel internacional se han publicado muy pocos reportes sobre este tema, generalmente utilizando métodos automatizados, por lo que no podemos comparar los resultados obtenidos en nuestro estudio con los reportados a nivel mundial. Para que sobrevivan un número suficiente de bacilos de la TB y se pueda lograr un diagnóstico confirmatorio, no puede evitarse que una proporción de los cultivos se contaminen con otros microorganismos. Por lo general, en los laboratorios una tasa contaminación entre el 2 y el 5% es considerada aceptable. Por encima de este valor, es una señal de alarma que debe ser reportada y analizada por el responsable del laboratorio e investigar las causas que puedan haber provocado la misma para implementar medidas para disminuir la contaminación6. Después de realizar un análisis en el laboratorio del CMHE de Puerto Padre, las muestras mal conservadas y la demora entre la toma y procesamiento

del esputo fueron las principales causas que provocaron el aumento de la TC. Fueron revisadas también las normas y procedimientos para decontaminar las muestras y concentración del decontaminante, las cuales se realizaron según lo normalizado. Por otro lado, es importante destacar que si la TC es menor del 2%, lo cual no sucedió en nuestro estudio, también traduce un problema en el laboratorio, por lo que se hace necesario investigar si el tiempo de exposición al decontaminante fue superior al tiempo establecido o la concentración de verde malaquita en el medio de cultivo es más alta a lo normalizado, porque esto puede eliminar a los bacilos que pudieran haber estado en la muestra, además de la flora normal del sistema respiratorio, aportando resultados falsos negativos del cultivo6. Con el cultivo, es posible extender la confirmación del diagnóstico del 20% - 30% de los casos con TB pulmonar. Cuando el aporte del cultivo es mucho mayor del 30%, es necesario verificar si no existieron errores al realizar la lectura de las baciloscopías (falsos negativos) o si se están investigando un porcentaje elevado de casos con TB poco avanzada, incluyendo a los pacientes pediátricos lo cual no traduce ningún problema en el laboratorio. En nuestro estudio sólo se superó esta cifra en un 4% en el laboratorio del CPHE, fueron revisadas las baciloscopías negativas de ese periodo y no se identificaron errores de lectura, por lo que no lo consideramos un problema. Por el contrario, en el laboratorio del CMHE, el cultivo no aportó ningún caso. Cuando el ACD es menor del 20%, hay que analizar si la decontaminación de las muestras fue muy enérgica, ya sea por una excesiva concentración del decontaminante o por tiempo de exposición prolongado del mismo, o si existió demora excesiva entre la toma y el procesamiento de las muestras, que puede ser letal para las micobacterias, que inferimos fue la causa de la disminución de este indicador6. Las causas mencionadas anteriormente junto a los resultados falsos positivos en la lectura de las baciloscopías, son aspectos importantes que puedan ser la causa del aumento del % de baciloscopías positivas con cultivo negativo. Los valores aceptables para este indicador no deben superar el 3%, como sucedió en el laboratorio provincial del CPHE de las Tunas, pensamos después de realizar un profundo análisis que la demora entre la toma y el procesamiento de las muestras, fueron las causas que influyeron en el discreto aumento de este indicador. Por debajo de este valor no traduce dificultades en el laboratorio. Podemos concluir que los indicadores de calidad del cultivo en el laboratorio del CPHE de Las Tunas, exceptuando el % BK (+) CU (-), presentaron valores aceptables para un buen desempeño del laboratorio, no sucediendo de la misma manera en el laboratorio del CMHE de Puerto Padre donde la TC fue superior a lo establecido en las normas internacionales (5%) y el cultivo no aportó ningún caso. El del % BK (+) con el cultivo negativo, fue el único indicador que no tradujo dificultad en el adecuado desempeño del personal de este laboratorio. Recomendamos incorporar el cálculo de los IC a la red nacional de laboratorios que realizan cultivo, para conocer y evaluar los resultados del trabajo e incorporar la evaluación de la sensibilidad del medio para mejorar el rendimiento y la calidad del diagnóstico de la TB.

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4. API Consensus Expert Comité. API TB Consensus Guidelines 2006: Management of pulmonary tuberculosis, extra – pulmonary and tuberculosis in special situations. J Assoc Physicians India 2006; 54: 219 – 34.

Tubercular disease caused by bacillus of Calmette-Guerin administered as a local adjuvant treatment of relapsing bladder carcinoma. Pathogenetic, diagnostic and therapeutic issues, and literature review Short title: Bacillus Calmette-Guérin disease after intravesical instillation Roberto Manfredi1,MD, Nicola Dentale1,MD, Benedetta Piergentili1,MD, Cristian Pultrone2,MD, Eugenio Brunocilla2,MD 1 Department of Internal Medicine, Aging, and Nephrologic Diseases, Division of Infectious Diseases, “Alma Mater Studiorum” University of Bologna, S. Orsola-Malpighi Hospital, Bologna, Italy 1 Department of Surgical and Anesthesiological Sciences, Division of Urology, “Alma Mater Studiorum” University of Bologna, S. Orsola-Malpighi Hospital, Bologna, Italy Conflict of interest, sponsorship, fundings, acknowledgements: none Correspondence: Roberto Manfredi, MD Associate Professor of Infectious Diseases, University of Bologna c/o Division of Infectious Diseases, S. Orsola Hospital. Via Massarenti, 11 I-40138 Bologna, Italy. Telephone: +39-051-6363355 / Telefax: +39-051-343500 E-mail: Roberto.manfredi@unibo.it

Recibido: 08/08/2009

Aceptado: 02/10/2009

Abstract

Introduction

Two exemplary case reports of respiratory granulomatous infection caused by bacillus of Calmette-Guérin (BCG) in patients who were repeatedly treated with local, intravesical adjuvant BCG therapy for a relapsing transitional bladder carcinoma, are outlined and discussed, on the ground of the cumbersome diagnostic and differential diagnostic process (especially when a prior tuberculosis and a concurrent chronic obstructive pulmonary disease are of concern), and an updated literature revision. Only four cases of respiratory BCG-itis (pulmonary tuberculosis-like forms), have been reported until now to the best of our knowledge (two of them following bladder instillation of BCG). One episode of ours represents the first described case with a dual, concomitant granulomatous localization of BCG-itis, also involving the genitourinary tract.

Bladder carcinoma is represented in around 90% of cases by urothelial forms (characterized by transitional cells), which usually have a multifocal occurrence and course. At the time of diagnosis, over two thirds of these malignancies have a superficial (mucosal or laminar) localization. The conventional management of localized bladder carcinoma relies on the trans-urethral resection, followed by an endovesical therapy (either cytoxic or immune therapy, especially recommended in more advanced forms).

Key words: Bacillus of Calmette-Guérin, bladder carcinoma, local therapy, infection dissemination, BCG-itis, pulmonary and genito-urinary localizations, differential diagnosis

The bacillus of Calmette-Guérin (BCG) is an attenuated strain of Mycobacterium bovis (a potentially pathogenic Mycobacterium in humans), initially produced as a vaccine against tuberculosis, and largely imployed with this indication since over seven decades, until now1-6. Given to its local immunomodulatory properties, BCG preparations are administered as a part of an adjuvant treatment of bladder adenocarcinoma since the year 19727, through repeated local intravesical instillations. During the last 36 years, a number of clinical trials confirmed the efficacy of local BCG treatment in reducing both progression and recurrences of bladder carcinoma8-12. In particular, the rationale of local adjuvant treatment carried out with cycles of intravesical instillations of BCG solution, aims to strengthen the specific anti-neoplastic immune response, in the attempt to eradicate residual disease foci, and reduce the risk of subsequent cancer relapses11,12. The BCG preparations admnistered in form of intravescial instillations are indicated until now for the adjuvant management of bladder carcinoma with superficial localization, i.e. in situ carcinoma, papillary carcinoma limited to mucosa (stage

As to the immunopathologic rationale of BCG administration against bladder carcinoma, the local immune response elicited by BCG starts with phagocyte cell activation10. After recognizing some BCG antigens the phagocyites trigger the secretion of a cascade of numerous cytokines, including interleukin-12, interferons, and the tumoral necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). The next step in the elicited immune response is represented by the induced polarization of T-helper-0 (Th-0) lymphocytes towards T-helper-1 (Th-1) lymphoid cells. The expansion and activation of Th-1 lymphocyte subset is able to potentiate the anti-neoplastic response carried out by T-cytotoxic lymphocytes (CTL) and that of the so-called natural killer (NK) cells, through the release of a series of other cytokines, with a relevant role played by interleukin-210,12,14,15.

Figure 1

Figure 1. A contrast-enhanced CT scan of the thorax of our first patient. Multiple, micronodular miliary BCG localizations are shown, reproducing the picture of a miliary tuberculosis. A concurrent chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and fibrotic remnants of a prior, juvenile lung tuberculosis are also present.

Figure 2

Aim of our work is to present two exemplary case reports of patients treated with local BCG immunotherapy for a relapsing urothelial bladder carcinoma, who developed a severe M. bovis respiratory infection, whose diagnostic pathway was particulary complicated due to co-existing chronic pulmonary diseases (prior pulmonary tuberculosis, and chronic obstructive pulmonary disease or COPD), and a second, BCG-related isolated genito-urinary lesion retrieved in one case of ours. Case reports First case report A 77-year-old patient with a superficial, relapsing bladder adenorcarcinoma (stage T1, grade 2), known since three years, suffered from three local relapses of the urothelial cancer, always managed with local endoscopic surgery, and later submitted to an adjuvant BCG treatment, lasting since 18 months. After his last month of his weekly cycles of local, endovesical immunotherapy with BCG instillations (75 mcg of BCG diluted with 50 mL of saline), he was hospitalized in the year 2008 because of the appearance and the rapid worsening of hyperpyrexia, malaise, weight loss, and toxemia, which were not responsive to two attempts of empiric broadspectrum antimicrobial chemotherapy, carried out with levofloxacin (10 days), followed by ceftriaxone (three days). After an initial standard chest X-ray study which showed a comprehensive picture of COPD, and multiple upper lobes fibrotic lesions compatible with a prior pulmonary tuberculosis, a high-resolution CT scan (HRCT) and a contrast-enhanced thorax CT scan demonstrated a diffuse involvement of all lung parenchima by an extremely elevated number of small, punctiform nodular lesions, extremely suggestive of miliary mycobacterial/tubercular disease (Figure 1). Multiple radiological signs of a prior lung tuberculosis were present at upper lobes: they included extensive fibrosis, diffuse centrolobular emphisematous lesions, and diffuse pleural thickening with sparse calcifications, while mediastinal lymph nodes were within normal limits, although some calcified nodes were shown.

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Ta), papillary carcinoma extended to lamina propria, but not involving muscular layers (stage T1), or every combination of the above-mentioned conditions11,12. During the subsequent urological follow-up, despite specific treatment, around 5070% of these neoplasms have a relapse, often burdened by a progression of tumoral grading11-13.

Figure 3

A contrast-enhanced CT scan of the abdomen and pelvis did not show lesions compatible with futher miliariform BCG lesions involving abdominal organs: an uniform, mild thickening of bladder walls was evident, as expected by the known underlying, relapsing urothelial carcinoma. Blood and urine cultures, and also microbiological examination of a transbronchial biopsy specimen and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, did not allow the recognition and

culture of any microorganisms, including mycobacteria. On the other hand, an elevated number of lymphoid cells, histiocytes, reactive bronchial cells, and cylindriformcells of bronchial epithelium was demonstrated at BAL study, while a granulomatous-tubercular like picture with lymphoid-histiocyte-giant cell infiltrate was demonstrated at histopathology. On the other hand, a mild positivity of Mantoux intradermal reaction, was confirmed by a frankly positive interferon-gamma-release assay (IGRA, QuantiFERON-TB Gold, Cellestis, Vic., Australia)16. General laboratory examinations showed only an elevated serum C-reactive protein (6.76 mg/dL), but a normal ESR, and no significant abnormalities of total leukocyte count and differential. On the ground of a diagnosis of miliary pulmonary BCGitis, a treatment was immediately started with associated rifampicin, isoniazid, ethambutol, and levofloxacin. The treatment was well tolerated from a clinical and laboratory point of view, and after three weeks our patient achieved a progressive defervescence, an ameliorement of respiratory signs and symptoms, and a slowly progressive resolution of pathological signs at subsequent imaging examinations, allowing hospital discharge and an outpatient follow-up. Antitubercular therapy lasted for a comprehensive period of 9 months (during the last three months it was conducted with rifampicin-isoniazid only), and was well tolerated. A novel HRCT, repeated after six weeks, showed an almost complete disappearance of parenchimal miliary lesions, while the remaining abnormalities, mostly referred to COPD and prior tuberculosis, remained unchanged. Bladder carcinoma remained under control until the last urological visit end endoscopy, carried out two months after hospital dicharge.

Second case report A 58-year-old man with a superficial, multifocal, transitional carcinoma of the bladder already relapsed since 4-5 years, started a local immunotherapy with endovesical BCG instillations around one year before the occurrence of the BCG-related complications. After a first cycle of six weeks of BCG administrations followed by a three-month interval, the treatment was resumed with one BCG instillation per month, and always proved sufficiently well tolerated, save some intercorrent episode of mild and self-limiting hematuria. Three months later, after demonstrating a local tumoral recurrence, which required a cycle of intravesical mitomycin therapy at standard dosages, a further series of BCG immunotherapy cycloes was proposed (81 mcg of BCG diluted with 50 mL of saline solution). During this last adjuvant BCG therapy, our patient showed a fastidious, minimally productive cough, associated with overwhelming fever, not responsive to large-spectrum empiric antibiotic therapy with ciprofloxacin and beta-lactams. Owing to the persistance of these signs and symptoms, our patient was hospitalized at the end of year 2002. The clinical history pointed out a probable pulmonary tuberculosis three decades before, whose diagnosis was mainly based on imaging and clinical remnants. Three years before

admission, a spontaneous pneumothorax (as a complication of a chronic, bullous pulmonary emphisema), required a surgical intervention, which included a pleural decortication. Upon admission, a first chest X-ray film showed multiple specific sequelae, including bilateral, apical pleural thickening, together with a diffuse chronic obstrictive pulmonary disease (COPD), with co-existing chronic bronchitis and an evident emphisematous evolution. A HRCT of the thorax gave a better picture of the diffuse, emphisematous COPD prevailing at upper lobes, where areas of paramediastinic, paracicatritial, and centrolobular emphisema determined a number of bullous lesions, with underlying extensive fibrosal hyperdense bands. Multiple calcified lymph nodes were detected in various thoracic sites, as signs or the prior, juvenile tubercular disease. Notwithstanding a negative Mantoux intradermoreaction, the clinical picture of cough, fever, and later dyspnea posed a suspicion of pulmonary BCG-itis, in a patient with prior lung tuberculosis, a concomitant COPD, and a moderately elevated ESR (30, first hour). As a consequence, an initial association therapy including rifampicin, isoniazid, ethambutol, streptomycin and ciprofloxacin was started, together with supportive treatments. A bronchoscopy with transbronchial biopsies and BAL, allowed to recognize a histopathological picture of multiple-foci chronic granulomatous pneumonia with evidence of nodular-epithelioid and necrotizing evolution, a macrophage and giant-cell tubercular-like infiltrate, with associated diffuse endoalveolar fibrosis. Further investigations performed on BAL fluid showed a prevalence of macrophage and lymphoid cells, together with cylindriphorm bronchial cells, but both microscopical and culture search tested negative, for mycobacteria too. One week later, a second HRCT pointed out the appearance of a dishomogeneous parenchimal infiltrate at the right side, associated with a modest homolateral pleural reaction. Both blood and urine cultures performed upon hospitalization tested negative, while a specific mycobacterial serodiagnosis performed with the TB-test A60 available at that time17 proved frankly positive, demonstrating elevated specific IgG-IgM antibody titers. Due to persisting of irregular hyperpyrexia, and the worsening of cough and dyspnea, complicated by hypoxemia (PaO2 70 mmHg), a low-dose steroideal therapy was added. Three weeks after the first HRCT, a further thorax imaging showed a worsening, due to a dffuse centro-alveolar emphisema at upper lobes, associated with multiple consolidative parenchimal areas involving medium and lower lobes, with predominant sub-pleural localization. Diffuse central-lobular micronodules were present together with a diffuse gross interstitial involvement, compatible with a subacute pneumopathy, complicated with a fibrotic evolution. Despite ongoing antimicrobial and steroideal treatment, two weeks later another HRCT showed an extension of consolidative infiltrates at postero-lateral segments of lower pulmonary lobes. After a slow, but progressive ameliorement of clinical-respiratory picture, after 5 weeks of hospitalization our patient was discharged with the indication to continued anti-tubercular therapy for one comprehensive year. The subsequent follow-up included a satisfactory tolerability of anti-tubercular therapy (reduced to isoniazid and ethambutol only,

From the urologic point of view, a double biopsy of an indolent, penile nodule performed three months before discharge, confirmed another localization of a tuberculosis-like granulomatous lesion at histopathologic studies. Therefore, BCG-itis was responsible for two, concurrent different disease localizations (pulmonary, and genital ones), both following a potential hematogenous dissemination of attenuated BCG bacilli. Six years after discharge (in December 2008), our patient has a stable remission of his bladder carcinoma, and no sign of activity of prior BCG-caused distant-site localization was appreciated. The penile lesion was cured, while the HRCT control confirmed a severe COPD, complicated by multiple fibrous-calcific reliquates, and the functional respiratory tests remained significantly compromised. Discussion The anti-tubercular vaccine BCG, largely employed in the immunization of children and adults in areas which are endemic for tuberculosis, and in the prevention of disseminated, miliary, and central nervous system disease in health care personnel and other subjects with a potential professional or familial exposure to tuberculosis1-4, suffers from a non-negligible rate of untoward events, more frequently represented by local inflammatory lesions interesting the injection and regional sites, usually associated with fever and satellite adenopathy (sometimes evolving into a suppurative form), while focal, long-distance localizations are significantly more infrequent, followed by extremely rare episodes of systemic dissemination of the attenuated M. bovis bacillus (the so-called BCGitis), usually developing in patients with an underlying primary-secondary immunodeficiency5,18, but sometimes observed also in apparently immunocompetent subjects3-5. A recent surveillance project conducted in Ireland on a broad pediatric population which underwent BCG vaccination4, after a median latency of 13 weeks showed the onset of either limphadenitis (suppurative or non-suppurative forms), or abscesses at the inoculum site, or both complications, with a crude frequency of one case every 931 children who received BCG (while one subject of 1,543 developed a suppurative adenitis, which required surgical intervention in around one half of cases)4. Again in developmental ages, a Canadian study5 allowed to observe also cases of bone localization and systemic dissemination of vaccinal BCG, which in some cases led to a

fatal evolution in subjects belonging to selected local native communities (Inuit citizens)5. However, episodes of BCG-itis with thoracic and in particular respiratory, simil-tubercular localization have been reported with an extremely low frequency by the international literature18,19,21,22, while the cases of pulmonary-extrapulmonary tuberculosis caused by M. tuberculosis and occurring despite prior BCG vaccination are not so infrequent, so that the overall effectiveness of BCG vaccination remains under discussion20. Among the estremely rare episodes of BCG-induced pulmonary tuberculosis, a careful literature search shows: one episode in a patient with a malignant hematological disease who underwent a prolonged immunosuppressive treatment with alemtuzumab19, an anecdotal case of systemic, lethal BCG-itis in a 18-year-old patient with a primary immunodeficiency, who also experienced a respiratory localization18, one episode of pulmonary and disseminated BCG disease occurred just in a patient treated with intravesical BCG instillations21, and a second case of granulomatous BCG pneumonia diagnosed after several cycles of local BCG therapy of an urothelial bladder carcinoma22, leading the published episodes to a global number of four cases only18,19,21,22, two of them caused by intravesical BCG administration21,22, as occurred in both our patients. As a consequence, a respiratory BCG infection, especially when isolated, represents an extremely infrequent occurrence, burdened by a very cumbersome differential diagnosis, especially when the involved patients are affected by concomitant chronic respiratory disorders (i.e. COPD), or suffered from a prior lung tuberculosis (as in both cases reported by ours), or when immunodeficiency-related conditions or a severe general wasting caused by underlying illnessess are of concern. In all these circumstances, the BCG invasiveness is greater, whereas a rapid recognition and a timely differential diagnosis and specific treatment may be delayed. When focusing our attention on the therapeutic use of BCG in the local management strategies of superficial, urothelial carcinoma of the bladder, an extensive study performed by Lamm et al. in the year 199221, for the first time faced systematically the untoward events following BCG instillation in a population of even 2,602 treated patients. In the 95% of reported BCG courses, fever and malaise were commonly registered in the days immediately following BCG therapy. Severe BCG complications regarded a minority of cases. With regard to the genito-urinary distric, a granulomatous prostatitis occurred in 0.9% of treated patients21 (while no cases of penile localization occurred, as compared with the second case of ours), while long-distance localizations proved extremely rare: a pneumonia or a granulomatous hepatitis were recognized in 0.7% of overall examined patients (only one case of BCG pneumonia was reported), while a BCG sepsis and disseminated infection was an extremely rare occurrence (0.4% frequency)21. In the year 1997, Allouc et al.23 reported their series which included 148 urologic patients who received local BCG due

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during the last three months). One year after discharge, a novel HRCT showed an advanced, diffuse centro-lobular and subpleural emphisematous lesions, in absence of parenchimal infiltrates and nodular lesions, and relevant, novel mediastinal adenopathies. However, a functional respiratory assessment pointed out a limitation of respiratory flow at low-medium pulmonary volumes, and a compromised alveolar-capillary diffusion, when compared with the same evaluation performed one year before. A perfusional scintigraphy documented a diffuse dishomogeneity of distribution of labelled macroalbumin aggregates, with a pulmonary differential diffusion limited to 50%.

to a relapsing superficial bladder carcinoma, followed for a mean period of 40 months. Local, intravesical, and/or follicolar reactions were detected in 46% of cases, but they had a favorable prognosis, since only slightly more than 10% of episodes required a specific anti-tubercular treatment23. Of interest in relationship with both our case reports, the authors observed that the BCG complications which involved these cancer patients were significantly more frequent when a prior tuberculosis was recognized (on either clinical or especially imaging basis) (up to 50% of cases), when compared with patients with a negative clinical history and chest imaging of a previous tubercular illness 13.8% of cases only)23. From a pathogenetic point of view, also reliable animal models have demonstrated that the exposure to mycobacterial antigens (including those of M. bovis), may exacerbate the clinical expression of a pulmonary M. tuberculosis disease (and mycobacterial diseases as a whole), due to the demonstrated immune activation mechanisms which increase the respiratory inflammation process via the secretion of large amounts of TNF-alpha and other proinflammatory cytokines, concurrently blunting most of defense mechanism, and the containment of local pulmonary mycobacterial load24. After the first relevant survey conduced on over 2,600 urologic cancer patients by Lamm et al.21, single case reports have been published in the international literature regarding anecdotal episodes of respiratory involvement (BCG pneumonia)22, granulomatous hepatitis25,26, renal involvement (granulomatous nephritis)27, bone marrow invasion concurrent with liver disease28, local ocular involvement (corioretinitis)29, and also vascular damage, mostly represented by aneurismatic lesions (of either native or prosthetic large vessels)30,31, in one single episode associated with vertebral osteomyelitis, too31. Finally, secondary to the local (intravesiscal) BCG administration, also isolated episodes of severe sepsis and disseminated BCG infection occurred anecdotally21,32,33. 58

From a practical point of view, when BCG preparations are used as a local adjuvant therapy (mostly repeated cycles of endovesical instillation), these attenuated mycobacteria may gain access to the local hematic-lymphatic vessels, and subsequently have a systemic dissemination, in rare (but non impossible) occurrences. Although infrequently, these events may find a support when uroepithelial lesions are present (as happens in subjects treated for a bladder carcinoma with either surgery or chemotherapy), and when a state of general immunosuppression or reduced defence favored by the underlying disease and its treatment (either surgical, invasive, or cytotoxic ones), are of concern. When these subjects treated with local BCG instillations develop a local, distant, or disseminated inflammatory process, which sometimes may start with an apparently isolated fever and in absence of organ-site signs-symptoms, and it is refractory to an empirical wide-spectrum antimicrobial chemotherapy, an organ or disseminated BCG infection (although rare), should be always taken into careful consideration33,34. As anticipated, particular attention should be deserved to subjects with a history of tuberculosis (as happened in both our patients), since they seem to have a greater risk to develop mycobacterial disease related to

BCG administration23. In fact, also physicians’ and patients’ informations included in the drug package commercialized in Italy, in its 2007 update, underline that “…patients must alert their physician as soon as possible when a worsening or a persistance of pre-existing signs and symptoms occur, and also when one of these symptoms becomes evident…, including cough. A persisting cough after vesical BCG instillation might be a sign of a severe BCG infection; should a BCG infection is confirmed, an immediate treatment with appropriate anti-tubercular drugs is needed…”. As to specific treatment options, the M. bovis strain contained in BCG preparations, proves in vitro susceptible to almost all available anti-tubercular compounds, save the relevant exception of pyrazinamide and some other agents expressing anti-mycobacterial activity, like some aminoglycosides and some fluoroquinolone derivatives35. In the current clinical practice, a three-month long therapy conducted with at least two active drugs (i.e. rifampicin and isoniazid), tested effective in the majority of cases of local (urinary) BCG disease, according to an extensive French experience23, but in our patients the severe pulmonary localizations were overlapped by an underlying COPD, while in the second presented case a concurrent penile BCG granulomatous lesion required up to 8-12 months of anti-tubercular treatment, which was well tolerated from a clinical-laboratory point of view. When considering possible preventive measures in urological patients, a recent randomized study conduced in France allowed to observe that the administration of the fluoroquinolone ofloxacin after every endovesical BCG instillation, significantly reduced the most severe and the systemic complications linked to this adjuvant therapy36; unfortunately, no other literature evidences are present, to support this procedure. In the particular case reports observed by us, both patients had concurrent radiological (HRCT) sequelae of a prior pulmonary tuberculosis, and both subjects were also affected by a long-lasting COPD (with a severe emphisematous-bullous evolution in the second case), which made the recognition of a pulmonary BCG-itis characterized by an extensive miliary or interstitial-nodular involvement, more difficult. The histopathological studies pointed out a granulomatousnecrotizing nodular-epithelioid pneumonia with diffuse macrophage, histiocyte, and giant cell infiltration, followed in the second patient by endoalveoar fibrotic organization. In both patient, the BAL examination demonstrated a prevalence of lymphoid cells, histiocytes, reactive bronchial cells, and cylindriform cells of bronchial epithelium, in the apparent absence of mycobacteria at both microscopic and culture examinations. At a moderately positive Mantoux intradermal reaction (first case) and a negative Mantoux testing (second case), were added a positive in vitro T-lymphocyte testing (Quantiferon) in the first reported case17, and an elevated, positive specific serodiagnosis for mycobacteriosis in the second patient, according to the available laboratory testing in that period (year 2001)16. With regard to the positive interferon-gamma-release assay (IGRA) of our first patient, we underline that our case report is the first one with a BCG-related organ complication

distant organs and sites, especially should a prior tuberculosis has been suffered in the past23.

With regard to the clinical course and outcome, in both our cases the miliary and nodular-infiltrative picture of the first patient, and the granulomatous-fibrosant evolution of the second patient, had a slowly progressive clinical and imaging ameliorement thanks to the well-tolerated associated anti-tubercular therapy, although the follow-up time of our first patient is limited to two months, compared with the more prolonged observation time of the second patient of ours. In this last patient, no residual infiltrates were present at HRCT control after one year, but functional lung examinations showed evident abnormalities expecially under physical exercise, which represented a permanent sequela of the BCG pneumonia, since they remained unchanged after a six-year follow-up.

As anticipated, local-regional adverse reactions to BCG vaccine used to prevent tuberculosis in endemic areas or among exsposed subjects, are proportionally common also in otherwise healthy people of each age3-5, while a systemic involvement including hyperpyrexia, severe cough, respiratory distress, hemodynamic imbalance and mental status disturbances strongly suggest a pulmonary and/or disseminated BCG disease, which needs an elevated clinical suspicion for a prompt recognition, a rapid diagnostic confirmation, and a tempestive and prolonged association anti-tubercular therapy, with the preliminary workout to be realized preferably under a hospitalization regimen.

When discussing the potential pathogenetic links between intravesical BCG immunotherapy and BCG disease with pulmonary and pulmonary-genitourinary localization (in the first and in the second patient, respectively), after the careful exclusion of other ethiologies no doubt can raise, although a respiratory localization mimicking tuberculosis (a miliary form in the first case), have been described very infrequently. After a careful revision of international literature, we found only four episodes of respiratory disease induced by BCG18,19,21,22, two of them apparently caused by local BCG immunotherapy of urothelial bladder carcinoma21,22. As a consequence, our case reports represent the fifth and the sixth absolute described cases of pulmonary BCG-itis observed until now, and the third and fourth absolute episodes following BCG instillation as adjuvant, local therapy of a relapsing bladder carcinoma. Furthermore, the penile granulomatous BCG lesion makes our second reported case unique, since in this last patient the BCG-itis following local immuotherapy interested another distant site with a localized granulomatous involvement, other than the respiratory one. When assessing the pathogenetic mechanisms which relate the local BCG immunotherapy with an eventual occurrence of tuberculosis-like localizations, we have to remind that BCG preparations are based on attenuated M. bovis strains, which have lost most of their virulence, but still remain alive microorganisms. Interestingly, a localized and/or systemic BCG-it is may be not necessarily linked to a massive, direct mycobacterial infection, but it usually depends on an exceedingly elevated hypersensitivity reaction to a gross mycobacterial antigenic load: this perspective may also explain the frequent difficulty to retrieve BCG strains from pathological lesions by current microbiological techniques (i.e. microscopy and culture search), as happened in both our case reports. In the particular circumstance of neoplastic patients who underwent repeated local BCG instillation through invasive local interventions (i.e. cistoscopy, bladder catheterization), or during or after cytotoxic chemotherapy with secondary mucosal lesions, all these conditions may contribute to a hypersensitization against BCG antigens (beyond the possible hematogenous and/or lymphatic dissemination, as happens in the spontaneous miliary disease). Anyway, the massive mycobacterial antigen load, may lead per se to the formation of the characteristic giant-cell tubercular granulomas also in

At the start of the third millennium, given the limits of efficacy and the non-negligible risks related to the continued use of BCG in the general population (as a vaccine), and in selected patients (i.e. adjuvant immunotherapy of bladder carcinoma), the need to prosecute research projects which may lead to the development of novel vaccines for the prevention of tuberculosis (an emerging and re-emerging disease in the last years, also in industrialized countries)37, become more and more warranted. More immunogenic compounds, improved protection against tuberculosis and ameliorated clinical efficacy as an adjuvant therapy, and especially more safe preparations when compared with standard BCG preparations (used since over 70 years), are strongly needed1-3,6. References 1. Hoft DF. Tuberculosis vaccine development: goals, immunological design, and evaluation. Lancet 2008; 372:164-175 2. Ritz N, Hanekom WA, Robins-Browne R, Britton WJ, Curtis N. Influence of BCG vaccine on the immune response and protection against tuberculosis. FEMS Microbiol Rev 2008; 32:821-841 3. Brimnes N. BCG vaccination and WHO’s global strategy for tuberculosis control 1948-1983. Soc Sci Med 2008; 67:863-873 4. Bolger R, O’Connell M, Menon A, Butler J. Complications associated with the bacille Calmette-Guérin vaccination in Ireland. Arch Dis Child 2006; 91:594-597 5. Deeks SL, Clark M, Scheifele DW, Law BJ, Dawar M, Agmandipour N, Walop W, Ellis CE, King A. Serious adverse events associated with bacille Calmette-Guérin vaccine in Canada. Pediatr Infect Dis J 2005; 24:538-541 6. Brennan MJ. The tuberculosis vaccine challenge. Tuberculosis (Edinb) 2005; 85:7-12. 7. Morales A, Eidinger D, Bruce AW. Intracavitary bacillus CalmetteGuérin in the treatment of superficial bladder tumors. J Urol 1976; 116:180-183 8. Baniel J, Grauss D, Engelstein D, Sella A. Intravesical bacillus Calmette Guérin treatment for Stage T1 grade 3 transitional cell carcinoma of the bladder. Urology 1998; 52:785-789 9. Iori F, Di Seri M, De Nunzio C, Leonardo C, Franco G, Spalletta B, Laurenti C. Long term manteinance bacille Calmette Guérin therapy in high-grade superficial bladder cancer. Urology 2002; 59:414-418 10. Simons MP, O’Donnell MA, Griffith TS. Role of neutrophils in BCG immunotherapy for bladder cancer. Urol Oncol 2008; 26:341-345

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Micobacteriosis sistémica

Mederos Cuervo LM, Pomier Suárez O, Trujillo Avalos A, Fonseca Gómez C, Montoro Cardoso, EH Laboratorio Nacional de Referencia e Investigación de TB y Micobacterias Centro Colaborador OPS/OMS Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí¨ (IPK) Autopista Novia del Mediodía Km 6 ½ Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba Autor por correspondencia: Mederos Cuervo LM e-mail: mederos@ipk.sld.cu

Recibido: 07/07/2009

Aceptado: 29/09/2009

Resumen

Abstract

Se analizaron repetidas muestras procedentes de un paciente cubano con SIDA, para descartar la presencia de bacilos ácido alcohol resistente (BAAR), pasadas 2-3 semana en las muestras de esputo, líquido cefalorraquídeo y de hemocultivo que habían sido procesadas y cultivadas se detecta la presencia de algunas colonias, como resultado se obtuvo el aislamiento de una cepa micobacteriana no pigmentada, de crecimiento lento perteneciente al Grupo III de Runyon, esta cepas fueron clasificadas como Mycobacterium avium por los métodos convencionales establecidos para la identificación de cepas micobacterianas, como técnica confirmativa diagnóstica se utilizó el análisis de las fracciones de ácido micólicos por la técnica de cromatografía en capa delgada bidimensional. El objetivo fundamental de este estudio ha sido reportar el primer caso de micobacteriosis sistémica en un paciente cubano con SIDA.

Several sputum and blood culture simples from a Cuban HIV/AIDS patient were analyzed to discard the presence of alcohol acid resistant bacillus. After 2-3 weeks the culture revealed in both kinds of samples some colonies from nonpigmented mycobacterium strain with slow growth and belonging to III Runyon Group. This strain was classified as Mycobacterium avium by conventional methods established for mycobacterium identification. To diagnostic confirmative method was used the analysis of fraction mycolic acid by bidimensional thin layer chromatography. The main objective of this study was to report the first case of systemic mycobacteriosis in a Cuban HIV/AIDS patient. Key words: opportunistic mycobacteria, AIDS, Mycobacterium avium

Palabras claves: micobacterias oportunistas, SIDA, Mycobacterium avium. Introducción Las infecciones producidas por micobacterias atípicas, ambientales u oportunistas han tenido un significativo aumento, esto ha condicionado un incremento paralelo en la investigación y conocimiento de estos microorganismos, que ha conllevado una estandarización en los criterios y técnicas diagnósticos, y en los ensayos terapéuticos para cada las diferentes especies1,2. En la gran mayoría de los países desarrollados se ha descrito también un aumento importante en la incidencia de infecciones producidas por micobacterias oportunistas incluso en niños, a esta infección se le denomina ¨micobacteriosis¨, este aumento se ha relacionado a diferentes factores; incremento en la prevalencia de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la mejora de las técnicas de diagnóstico

y sobre todo el reconocimiento clínico de la enfermedad y su descripción en pacientes inmunocomprometidos en los cuales están incluidos pacientes con neoplasias, receptores de trasplantes, administración de esteroides y pacientes infectados con el virus de Inmunodeficiencia Humana2-5. Aviumosis es la entidad clínica que es producida por Mycobacterium avium , en las últimas décadas su incidencia a aumentado considerablemente, precisamente después de la aparición de la pandemia por el virus de Inmunodeficiencia Adquirida. El agente causal de la “aviumosis” es Mycobacterium avium, generalmente esta infección se manifiesta como un cuadro localizado normalmente pulmonar en un huésped inmunológicamente normal, el huésped con algún tipo de inmunodeficiencia puede llegar a presentar

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por Mycobacterium avium en paciente con SIDA Systemic mycobacteriosis for Mycobacterium avium in a AIDS patient

diseminación de la infección, en pacientes SIDA los casos de micobacteriosis son más críticos, recientemente muchas han sido las patologías clínicas en que esta especie micobacteriana se ha visto involucrada6-12. Es evidente que dentro de las especies pertenecientes al grupo III según clasificación realizada por Runyon, Mycobacterium avium encabeza la lista de especies micobacterianas más virulentas sobre todo en pacientes con déficit en su barrera inmunológica4. El objetivo de nuestro trabajo es reportar el primer caso de micobacteriosis sistémica en un paciente cubano con SIDA tratado en nuestro Hospital Nacional de Referencia a Atención a Pacientes VIH-SIDA del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”(IPK).

Reporte del caso: Varón blanco de 42 años de edad, raza blanca, diagnosticado como portador de VIH en Septiembre/2005 por pruebas serológicas y W. Blott confirmatorios de infección por VIH, este paciente ingresa en nuestro centro en Enero/2006 refiriendo antecedentes de cuadro de diarreas crónicas y pérdida de peso de más de un 10 % de su peso corporal, astenia, anorexia y fiebre ocasional en los últimos tres meses, interpretándose en aquel ingreso que estas manifestaciones clínicas estuvieran en relación con infección por micobacterias, por el estado depauperado del paciente (Síndrome de desgaste) y la bancarrota inmunológica, dada por un conteo de linfocitos T CD4+ en 10 % -146 cel/mm3, con valores de Carga Viral de 550 000 cp/ml, se consideró como un caso de debút clínico de SIDA. Los resultados de los exámenes complementarios realizados fueron: Hb 8.7 g/l, Htco 0.28, Eritrosementación 141mms, Leucograma 12.7 x109 Seg 0.92, Linfo 0.08, Mono 0.00, Eos 0.00, TGO 15 u/l, TGP 13 u/l, LDH 99 u/l, por lo que se decidió poner tratamiento Antirretroviral de Alta Eficacia (TARGA) con Lamividina (150 mg) + Estavudina (40mg) + Abacavir (200mg) a razón de una tableta de cada una cada 12 horas. En aquel momento se decidió además comenzar tratamiento anti tuberculoso primera fase con las cuatro drogas establecidas en el Programa Nacional de Tuberculosis: Isoniacida (150mg) 2 tabletas/día, Rifampicina (300mg) 2 tabletas/día, Ethambutol (200mg) 5 tabletas/ día, y Piracinamida (500mg) 3 tabletas/día. Egresó el 25 de febrero/2006 con significativa mejoría clínica y de los parámetros hematológicos. Posteriormente tuvo múltiples ingresos por cuadros de infección respiratoria baja, asociado a diarreas crónicas, síndrome febril prolongado, sudoración nocturna, además de referir mala adherencia a la TARGA. El último ingreso fue el 24 de mayo/ 2008 presentando pérdida de peso importante, cuadro de toma sistémica de órganos como pulmón, riñón, médula ósea, peritoneo, hígado, con cuadros de hipoglicemia frecuentes, ascitis, derrame pleural, anemia importante que motivaron el empleo de múltiples esquemas de tratamiento antimicrobiano. Se concluye como caso SIDA con posible micobacteriosis diseminada, su último conteo de células CD4 fue de 9%-31 cel/mm3.

Repetidas muestras biológicas del paciente pulmonares como extrapulmonares fueron analizadas tanto para su cultivo bacteriológico, como también incluyendo la búsqueda de bacilos ácido alcohol resistente (BAAR) para descartar la posibilidad de una micobacteriosis, todas estas muestras fueron procesadas en el Laboratorio Nacional de Referencia e Investigación de TB y Micobacterias del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. Todas las muestras fueron cultivadas a 37°C, las lecturas de los cultivos se realizaron semanalmente. En específico en las muestras de esputo, líquido cefalorraquídeo y hemocultivo, entre los 14-20 días se detectó en todos los tubos de cultivo el crecimiento de colonias cremosas, lisas, no pigmentadas, de crecimiento lento, la codificación de los cultivos osciló entre 6-7, para descartar la presencia de BAAR a partir de las colonias aisladas se realizó la coloración de Ziehl-Neelsen. Para la clasificación e identificación de la cepa en estudio se utilizó el test de pruebas bioquímicas establecidas13. Para la confirmación diagnóstica se utilizó el estudio de las fracciones de ácidos micólicos micobacterianos mediante la técnica de cromatografía en capa delgada bidimensional según técnica descritas. La cepa aislada fue identificada como Mycobacterium avium tanto por las pruebas diagnóstica convencionales como por el patrón de las fracciones de ácidos micólicos micobacteriano encontrado14-16. Tras de haber obtenido el diagnóstico realizado por el Laboratorio Nacional de Referencia e Investgaciones de TB y Micobacterias del (IPK) el paciente fue sometido a tratamiento con Ciprofloxacina (500mg)/12 horas, Amikacina (500mg)/ diario, Ethambutol (250mg)/4 tabletas diarias, Claritromicina (500mg)/ 12 horas, tratamiento que mantiene durante 8 semana a excepción de la Amikacina que solo se utilizó durante 45 días. El paciente egresó el 20/10/08 ya con mejoría considerable de su estado general y de los valores de los estudios hematológicos. Hasta el momento el paciente ha mantenido la negatividad en todos los cultivos realizados. La incidencia de infecciones por micobacterias no tuberculosas se ha incrementado dramáticamente en las últimas décadas en paralelo al incremento de la población de inmunocomprometidos, especialmente después del advenimiento de la pandemia de SIDA7. La frecuencia de la infección oportunista por el complejo MAC aumentó dramáticamente aunque, en la actualidad, el tratamiento con las combinaciones de antirretrovirales de alta potencia ha aliviado la situación. En estos pacientes se produce frecuentemente la infección diseminada, asociada a una gran mortalidad, sobre todo en los que presentan recuentos de linfocitos CD4 <100 células/mm3. Este agente infeccioso afecta principalmente al tracto gastrointestinal y al pulmón, se manifiesta con fiebre, diarrea, pérdida de peso, dolor abdominal, sudación nocturna, tos, en la enfermedad pulmonar pueden predominar lesiones fibrocavitarias, micronódulos y bronquiectasias17. El Laboratorio de Micobacteriología juega un papel importante contra las enfermedades ocasionadas por micobacterias oportunistas principalmente en pacientes con deterioro en su barrera inmunológicas los cuales constituyen el mayor

grupo de riesgo. Estudios como este reafirman la importancia de fusionar los métodos convencionales diagnósticos establecidos para la �� clasificación e identificación micobacteriana, con algún método alternativo diagnóstico como es el estudio del patrón de las fracciones de ácidos micólicos, pues esto aporta una mayor información diagnóstica References 1. Caminero JA. Micobacterias Atípicas. BSCP Can Ped 2001;25:237-248. 2. Medina Cruz MV, Sauret J, Caminero JA. Enfermedades producidas por micobacterias ambientales. Méd Clin (Barc) 1999;113:621-630. 3. Martín-Casanova N, Bahrmand AR, Benndsen J, Ostergaar V, Cursio M, Fauville-Dufaux M, Feldman K, Havelkova M, Katila ML, Pareira MF, Rodríguez F, Pfyffer GE, Portaels, Rosselló Urgell, RuschGerdes, SGNTM, Tortoli E, Vincent V, Watt B. Non-tuberculous mycobacteria:patterns of isolation. A multi-country retrospective survey. Int J Tuberc Luna Dis 2004;8:1186-1193. 4. Katoch, VM. Infections due to non-tuberculous mycobacteria (NTM) Indian J Méd Res 2004;120:290-304. 5. Randall J O, Cernoch PL. Mycobacterial synovitis caused by show-growing nonchromogenicum species: eighteen cases and a review of the literatura. Arch Pathol Lab Med 2006;130:783-791. 6. Casal M. La aviumosis como infección emergente y su quimioterapia. Rev Esp Quioterapia 1997;10:131-137. 7. Gutherz, l., B. Damsker,E., E. J. Bottone, E. G. Ford, T. F. Midura, and J. M. Janda. Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare infections in patients with and without AIDS. J. Infect. Dis. . 1989;160:10371041. 8. Mederos LM, Rodríguez F, Blanco F, Cabrera J, Echemendia M, Montoro EH. Reporte de Mycobacterium avium-intracellulare asociado a micobacteriosis renal. Rev Cub Med Trop 2003;55:58-60. 9. Valerga M, Cugliari M, Cefalo E, Martín M. Infección por Mycobacterium avium en un paciente trasplantado renal. Enferm Infecc Microbiol Clin 2007;25:294-295. 10. Pérez I, Quintana-Beltrán P. Linfadenitis cervical por Mycobacterium avium en adulto. Enferm Infecc Microbiol Clin 2007;25 159-161. 11. Clark D, Lambert CM, Palmer K, Strachan R, Auki G. Monoarthritis cuased by Mycobacterium avium complex in a liver transplant recipient. Br J Rheumatol 1993;32:1099-1100. 12. Barcat D, Mercie P, Constans J. Disseminated Mycobacterium avium complex infection associated with bifocal synovitis in a patient with dermatomyositis. Clin Infect Dis 1998;26:1004-1005. 13. Casal M, Guerrero A, Martín N, Moreno S, Nogales MC. Diagnóstico microbiológico de las infecciones por micobacterias. En: Picazo JJ, editor. Procedimientos de la Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, 1999. 14. Levy-Frebault V, Goh KS, David HL. Mycolic acid analysis for clinical identification of Mycobacterium avium and related mycobacteria. J Clin Microbiol 1986;24:835-839. 15. Valero-Guillén PL, Martín-Luengo F. Cromatografía en capa delgada y cromatografía de gases en la identificación de micobacterias de importancia clínica. Enferm Infecc Microbiol Clin 1987;5:67-72. 16. Leite CQF, Souza CWO, Leite SRA. Identification of mycobacteria by thin layer chromatography analysis of mycolic and conventional biochemical method: four years of experience. Mem Insts Oswaldo Cruz. 1998;93;801805. 17. Han XY, J J Tarrand R, Infante K, L Jacobsond, Truong M. Clinical significance and epidemiologic analyses of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare among patients without AIDS. J. Clin. Microbiol. 2005;43:4407-4412.

Calidad de prescripción de antimicrobianos en servicios seleccionados en hospitales clínico quirúrgicos Quality of antimicrobials prescription in selected services in clinical surgical hospitals Ioana Mir Narbona a, Humberto Guanche Garcell a, Yanet Chappi Estévez b, Addys Díaz Piñera3b, Sandra Rodríguez Uribe3b, Irene Fiterre Lancis c, Raimy Enseñat Sánchez d, José Pisonero Sosias e, Gilberto Pardo Gómez e Master en enfermedades infecciosas, 2Master en Epidemiología, 3Especialista en Higiene y Epidemiología, 4Master en Infectología, 5Licenciada en Farmacia, 6 Especialista en Cirugía General, 7Doctor en CienciasaDepartamento de Epidemiologia Hospital Docente Clínico Quirúrgico ¨Joaquín Albarrán, bInstituto Nacional de Higiene Epidemiologia y Microbiologia, cServicio de Medicina Interna Hospital Docente Clínico Quirúrgico ¨Joaquín Albarrán, dDepartamento de Farmacia Hospital Docente Clínico Quirúrgico ¨Joaquín Albarrán, eServicio de Cirugia General Hospital Docente Clínico Quirúrgico ¨Joaquín Albarrán, Dirección para correspondencia Humberto Guanche Garcell Apdo Postal 14072, Marianao 14. La Habana, Cuba guanche@infomed.sld.cu

Recibido: 03/07/2009

Aceptado: 28/09/2009

Resumen

Abstract

Objetivo: Evaluar la calidad de prescripción de antimicrobianos en dos hospitales universitarios clínico quirúrgicos de La Habana. Método: Estudio de prevalencia puntual de pacientes ingresados en los servicios de cirugía general, medicina interna, urología, y unidades de cuidados críticos, en junio 2008. Se obtuvo información de aquellos que utilizaban antimicrobianos, la que fue analizada por expertos, que determinaron aquellos con prescripción inadecuada. Se calculó la proporción uso de antimicrobianos y la proporción de prescripción inadecuada. Resultados: El 25,3% y 33,2% de los pacientes utilizaban antimicrobianos en los hospitales. El servicio de medicina interna del hospital B tuvo una proporción de uso (28.7%) superior al hospital A (6.06%). El hospital A tuvo frecuencias de uso inadecuado (77,1%) superiores (p < 0,05), siendo las causas fundamentales el uso sin evidencias de infección, la elección incorrecta del tratamiento y la profilaxis impropia. Conclusión: Se demuestran deficiencias en la calidad de prescripción que requieren fortalecer políticas institucionales, controles de calidad y programas formativos sobre antimicrobianos.

Objective: To assess the quality of antimicrobials prescription in two university hospitals of Havana. Method: Puntual prevalence study were carry out in general surgery, internal medicine, urology, and critical care unit services, in June 2008. Information was obtained of those that used antimicrobials, the one that was analyzed by experts that determined those with inadequate prescription. It was calculated the proportion antimicrobials use and the proportion of inadequate prescription. Results: 25,3% and 33,2% of the patients used antimicrobials in hospitals. Internal medicine of the hospital B had an use proportion (28.7%) superior to the hospital A (6.06%). The hospital A highest frecuencies of inadequate use (77,1%) (p <0,05), being the fundamental causes the use without infection evidences, the incorrect election of the treatment and the inappropriate prophylaxis. Conclusion: Deficiencies are demonstrated in the quality of prescription that require to strengthen of political institutional, controls of quality and formative programs on antimicrobials.

Palabras clave: antimicrobianos/calidad prescripción, hospitales

Key Words: antimicrobials / quality, prescription, hospitals

Introducción Los antimicrobianos constituyen un recurso valioso en el manejo de las infecciones en instituciones de salud. Su uso indiscriminado, junto a otros factores, ha favorecido el desarrollo de la resistencia antimicrobiana, que es hoy un problema mundial, con importantes consecuencias en la calidad de los servicios de salud y su eficiencia1.

En pacientes hospitalizados se demuestran frecuencias variables de uso de antimicrobianos, ejemplos: en España (36%), Turquía (30,6%), Grecia (51,4%), Brasil (55,4%) y China (77,8%)2-6. En Cuba, evidencias de uso inadecuado fueron observadas en el estudio nacional de prevalencia de infecciones nosocomiales (2004) al demostrar que el

El propósito de nuestro estudio fue evaluar la calidad de prescripción de antimicrobianos en servicios seleccionados de dos hospitales universitarios clínicos quirúrgicos de la Ciudad de La Habana. Método Se realizó un estudio descriptivo de prevalencia puntual sobre la calidad de prescripción de antimicrobianos en servicios seleccionados (cirugía general, medicina interna, urología, unidades de cuidados críticos), en dos hospitales universitarios clínicos quirúrgicos de Ciudad de La Habana. Ambos hospitales son instituciones de atención de adultos de segundo nivel. El hospital A cuenta con una dotación de 700 camas y atiende población urbana de la capital del país y población rural de la periferia de la ciudad. El Hospital B tiene una dotación de 400 camas y atiende población urbana de la capital. Fueron evaluados la totalidad de los pacientes hospitalizados, en los servicios mencionados, un día para cada hospital, el mes de junio de 2008. Procedimiento para la evaluación de la calidad de la prescripción De los pacientes se obtuvo la siguiente información: edad, sexo, motivo de ingreso, presencia de infección y localización, enfermedades asociadas, estudios complementarios relativos a función renal y hepática, antimicrobianos utilizados (tipo, dosis, intervalo, duración del tratamiento) y los resultados de los estudios microbiológicos realizados. En una primera etapa cuatro investigadores (YCE, ADP, SRU, HGG) obtuvieron la información e identificaron aquello con probable prescripción inadecuada. Estos casos, en una segunda etapa, fueron analizados por expertos (IMN, RES, JPS, GPG, IFL), quienes basados en los principios de prescripción de antimicrobianos y las políticas institucionales, identificaron los pacientes con prescripción inadecuada de antimicrobianos. Finalmente los casos evaluados como prescripción inadecuada se clasificarán en una de las siguientes causas: 1. No indicado o no necesario. Se demuestra en pacientes en los cuales no existe proceso infeccioso que condicione el uso de antimicrobianos 2. Dosis o intervalo de dosis es incorrecta 3. Elección incorrecta del antimicrobiano: incluye cuando se utiliza una combinación impropia o no necesaria, se selecciona un antimicrobiano no apropiado para ese uso o es mas caro o tóxico 4. Cualquier combinación de los anteriores. 5. Indicación profiláctica incorrecta Análisis estadístico Toda la información fue incluida en una base de datos elaborada en JMP 5.1 (SAS Institute), donde se utilizara la téc-

nica estadística de análisis de distribución de frecuencias. Se calculó la proporción de uso de antimicrobianos (por 100 pacientes pesquisados) y la proporción de uso inadecuado de antimicrobianos (por 100 pacientes con antimicrobianos). Para identificar diferencias entre los hospitales se utilizó la prueba t de Student y la pruebaχ2, en tanto aplicables, considerándose significativo cualquier valor de p menor del 5 %. Resultados Fueron evaluados 138 pacientes en el hospital A, de lo cuales utilizaron antimicrobianos 35 pacientes (25,3%), mientras en el hospital B en 133 pacientes ingresados, 44 utilizaban antimicrobianos (33,2%). Los pacientes con antimicrobianos, en ambos hospitales, tuvieron características generales (antecedentes patológicos personales, diagnóstico principal al ingreso, tipo y localización de la infección) similares con excepción de la edad, la cual fue superior en el hospital B (p < 0,05). (Tabla 1) Tabla 1. Características generales de los pacientes que utilizaron antimicrobianos en servicios seleccionados de hospitales clínicos quirúrgicos

características Edad (media ± DE)(años) Antecedentes patológicos personales (No (%)) Hipertensión Arterial Diabetes mellitus Insuficiencia Respiratoria Insuficiencia Coronaria Cáncer Insuficiencia Renal Crónica Insuficiencia Hepática Diagnóstico principal al ingreso (No (%) Bronconeumonía Enfermedad Cerebrovascular Cáncer Insuficiencia Coronaria Otros Diagnósticos Tipo de infección al ingreso (No (%) adquirida en la comunidad nosocomial Localización de la infección (No (%) Respiratoria Urinaria Piel Otras

hospital A n = 35 60.7 (14.2)

hospital B n = 44 66.8 (20.8)*

17 (48.6) 10 (28.6) 7 (20.0) 6 (17.1) 1 (2,9) 1 (2,9) 0

16 (36.4) 10 (22.7) 8 (18.2) 7 (15.7) 8 (18.2) 1 (2,3) 2 (4.5)

11 (31.4) 3 (8.6) 1 (2,9) 2 (5.7) 17 (48.6)

16 (36.4) 4 (9.1) 3 (6.8) 1 (2,3) 20 (45.5)

21 (60.0) 0

25 (56.8) 1 (2,3)

13 (37.1) 1 (2,9) 2 (5.7) 5 (14.3)

19 (43.2) 3 (6.8) 0 4 (9.1)

.* P < 0.05

Las frecuencias de uso de antimicrobianos fueron ligeramente superiores en el Hospital B (p > 0,05), sin diferencias destacables entre los servicios, con excepción del servicio medicina interna de este hospital, en que la frecuencia fue muy superior (28,7%)(p < 0,001). En ambas instituciones las unidades de cuidados críticos (UCC) mostraron las frecuencias superiores (tabla 2). Referido a las frecuencias de uso inadecuado es evidente la mayor frecuencia en el hospital A (p < 0,05) (tabla 2). Por servicios, aunque se observan frecuencias superiores en los servicios de cirugía, UCC y urología en el hospital A, estas no son estadísticamente significativas entre hospitales (tabla 2).

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 28, número 2, 2009

20,6 % de los pacientes que utilizaron antimicrobianos en hospitales cubanos no tenían evidencia de infección7. Asimismo, se ha demostrado el incremento de la resistencia antimicrobiana en el ámbito hospitalario, con especial referencia para las cefalosporinas de tercera generación8, 9.

Tabla 2. Proporción de uso de antimicrobianos según servicio en hospitales clínico quirúrgicos Servicio

Hospital B

Cirugía

23.3

85.7

38,5

Medicina UCC

66 35

4 20

6.06 57.1

2 16

50 80

94 13

27 7

28,7 53,8

Urología

57.1

38,5

Total

138

25.3

77.1

133

33,1

N1 N2 %2 N3 %3

Hospital A

Pacientes ingresados Pacientes que utilizaron antimicrobianos Proporción de pacientes que utilizaron antimicrobianos Pacientes con uso irracional Proporción de pacientes con uso irracional de antimicrobianos

Otros factores que determinan la complejidad de los pacientes, no evaluados en este estudio, pueden ser determinantes de estos resultados.

Al analizar el uso para los servicios es evidente la mayor proporción de uso de antimicrobianos en las UCC, lo que esta en relación con la severidad 1 20,0 de las enfermedades de los pacientes y la pre16 59,3 sencia de enfermedades infecciosas adquiridas 3 42,9 en la comunidad o relacionadas con los cuidados 3 60,0 de salud13,14. Como parte del estudio de prevalen23 52,3 cia nacional de infección nosocomial7, se evaluó la frecuencia de uso de antimicrobianos en hospitales demostrándose en UCC de adultos el 40 % de los pacientes los utilizaban. N3

En los servicios de urología, las frecuencias se muestran elevadas, lo cual está en relación a la calidad de la presAl observar las causas de prescripción inadecuada, se cripción, fundamentalmente en relación a la adherencia a la constata que el uso de antimicrobianos sin evidencias de profilaxis perioperatoria, lo que se ha demostrado en otros infección, la elección incorrecta del tratamiento y la indica- estudios, y requieren acciones formativas15. ción profiláctica incorrecta, son causas fundamentales en Aun cuando el estudio evaluó la calidad de prescripción en ambos hospitales. Se destaca la mayor frecuencia de elecservicios seleccionados, las proporción de uso inadecuado ción impropia del tratamiento en el hospital A, debido fundase demostró elevada en ambos hospitales, sin lo compamentalmente a la combinación de ceftriaxona, amikacina y ramos con otras referencias, que reportan frecuencias de metronidazol en el manejo de infecciones adquiridas en la prescripción inadecuada menores del 50%8,16, demostráncomunidad (tabla 3). dose que las causas observadas son similares a lo reportado con anterioridad Tabla 3 .Causas de uso irracional por servicio en hospitales clínico quirúrgicos en las que se destaca Hospital A Hospital B el uso de antimicrobiaCausas Med Cir UCC Uro Total Med Cir UCC Uro Total nos cuando no existe No indicado o no necesario 3 2 5 8 1 3 12 evidencia de infección, Dosis o intervalo de dosis incorrecta 1 1 1 1 la elección incorrecElección incorrecta del antimicrobiano 1 1 11 13 4 1 5 ta del tratamiento y la Cualquier combinación de las anteriores 1 1 2 2 2 indicación profiláctica Indicación profiláctica incorrecta 1 1 1 3 6 4 1 5 incorrecta6,16. (Endnotes) Es importante considerar, en la evaluación de los resulta1 Master en enfermedades infecciosas dos, que el estudio realizado fue producto de una evalua2 Master en Epidemiología 3 Especialista en Higiene y Epidemiología ción puntual a servicios seleccionados en instituciones de 4 Master en Infectología salud, y que la información obtenida no permite un mayor 5 Licenciada en Farmacia nivel de profundidad en el análisis de los factores determi6 Especialista en Cirugía General nantes de las diferencias entre los hospitales. 7 Doctor en Ciencias

Discusión

No obstante, podemos concluir que es evidente que el uso inadecuado fue muy frecuente en ambas instituciones, lo que denota deficiencias en las políticas institucionales de usos de antimicrobianos y en los controles sobre la calidad su prescripción.

Las frecuencias de uso de antimicrobianos en los servicios evaluados en los hospitales clínicos quirúrgicos son simi- Referencias lares o menores a las reportadas en otros estudios2-6. Es importante destacar que entre los factores relacionados 1. Estrategia mundial de la OMS para contener la resistencia a los antimicrobianos. Organización Mundial de la Salud.2001. WHO/CDS/ con la resistencia antimicrobiana, la frecuencia de uso de CSR/2001.2. estos medicamentos parece ser un elemento de relevante importancia10. 2. Asensio A, Cantón R, Vaqué J, Roselló J. Utilización de antimicrobianos en los hospitales españoles (EPINE 1990-1999). Med Clin

La mayor proporción de uso en el servicio de medicina inter(Barc) 2002; 118(19):731-6. na puede depender de las características de las poblaciones que atienden ambas instituciones, con especial énfasis en la 3. Ulsuer G, Ozgunes I, Leblebicioglu H, and the Turkish antibiotic utilization study group. A multicenter point prevalence study of antimiedad, que en hospital B fue una población mas envejecida, crobial prescription frecuencies in hospitalized patient in Turkey. Ann en la cual la incidencia de infecciones respiratorias asociaClin Microbiol Antimicrob 2005;4:16. 11,12 das a otras enfermedades no transmisibles es mayor .

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Efectos de la administración crónica de alcohol sobre la conducta motora y su relación con el sistema colinérgico muscarinico en ratas Sprague Dawley bajo estrés discontinuos Chacón Lozsán Francisco J1, Bonfante-Cabarcas Rafael Armando1, Damelis Daza2 y Douglas Garcia2 Unidad de Bioquímica, 2Unidad de Salud Pública. Decanato de Ciencias de la Salud. Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”. Barquisimeto, Lara. Venezuela

*Autor de correspondencia. Dr. Douglas García. Unidad de Salud Pública, Decanato de Ciencias de la Salud. Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado Avenida Libertador con Andrés Bello, Barquisimeto, Lara, Venezuela. Código Postal: 3001. Teléfonos: 0251-2591854 Email: dmgarcia13@yahoo.com Este proyecto fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico Humanístico y Tecnológico de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, Barquisimeto, Venezuela bajo el proyecto número 015-ME-2005

Recibido: 06/07/2009

Aceptado: 28/09/2009

Resumen

Abstract

El alcohol y el estrés son problemas de salud pública que afectan el Receptor Colinérgico Muscarínico (RCM). En el presente trabajo se estudia el efecto de ambos fenómenos sobre la funcionalidad y densidad del RCM. Métodos: 43 ratas Sprague Dawley se dividieron en 4 grupos: Control (n=12), Estrés (n=11), Alcohol (n=10) y Alcohol-Estrés (n=10). A los grupos alcohol se le administró diariamente etanol al 10 % ad libitum y los grupos Estrés se sometieron a nado forzado a 5°C por 5 min tres veces/semana. Resultados: las ratas tratadas con alcohol presentaron adicción e hipermotilidad, siendo el efecto mayor en el grupo alcoholestrés. Escopolamina incremento la motilidad en todos los grupos. No hubo diferencias significativas entre los grupos en el desempeño en el Rotarod. La densidad de los RCM estuvo disminuida significativamente en Hipocampo en el grupo alcohol. Conclusión: el alcohol induce trastornos del RCM relacionados a hipermotilidad.

Alcohol consumption and stress are health problems, which affects the Cholinergic Muscarinic Receptor (CMR) system. Here we studied the effect of both phenomena on CMR functionality and densities. Methods: 43 Sprague Dawley rats were divided in 4 groups: Control (n=11), Stress (n=10), Alcohol (n=10) and Alcohol-Stress (n=9). Alcohol groups received 10% ethanol ad libitum in substitution of water every day, stress groups were submitted 3 days at week to 5 min force swimming at 5°C. Results: rats that had alcohol displayed addiction and hypermotility, the effect was higher at alcohol-stress group. Scopolamine significantly increased motility in all groups. No differences were observed at Rotarod performance. CMR density was decreased in hippocampus of rats belonging to alcohol group. Conclusion: alcohol induces motor disturbances related to CMR system.

Palabras Clave: Alcohol, Estrés, Receptor Muscarínico, Nado Forzado, Motilidad.

Key Words: Alcohol, Stress, Muscarinic Receptor, Forced Swimming, Motility.

Introducción Los receptores Colinérgico Muscarínico (RCMs) pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteínas G, distribuidos a lo largo del Sistema Nervioso Central (SNC) donde han sido involucrados en memoria y conducta motora. La relación entre alcoholismo y Sistema Colinérgico Muscarínico (SCM) ha sido abordada por diferentes autores. Freund

y Ballinger (1988) encontraron una disminución del 40% en la densidad de los RCM en corteza frontal de autopsias de pacientes con historia de alcoholismo. Brandâo y colaboradores (1995, 1999) encontraron una disminución en la expresión de la enzima colinacetiltransferasa en animales con consumo prolongado de etanol, asociado a una disminución

50 cm de diámetro, llenado hasta 30cm con agua a 5°C. El estrés fue realizado 3 veces/semana (lunes miércoles y viernes) entre 12 y 2 pm.

Desde el punto de vista conductual se ha observado que el consumo crónico de alcohol produce alteraciones en el SNC. En éste sentido, Nagahara y Handa (1999) observaron que los agonistas colinérgicos fueron incapaces de incrementar la memoria en ratas expuestas al alcohol durante el período fetal, mientras que los antagonistas producían un severo déficit de memoria. Beracochea y colaboradores (1992) demostraron que el consumo crónico de alcohol produce en animales un acelerado déficit para la resolución de un laberinto en T, cuando los intervalos entre los ensayos eran aumentados, efecto que fue revertido por agonistas colinérgicos administrados antes del ensayo. Hodges y colaboradores (1991) observaron que la ingesta de alcohol al 20% disminuía el desempeño de las ratas en el laberinto radial y en los test asociativos, el déficit cognitivo estuvo asociado al nivel de alcohol en sangre. Los animales tratados con alcohol mostraban mejoría al ser tratados con drogas colinérgicas y empeoraban con el uso de antagonistas.

Actividad locomotora. Fue medida individualmente en una caja de motilidad de 48x48x40cm, dividida en 4 cuadrantes, por un periodo de 10min, precedido de 5min de adaptación no cuantificable. El desplazamiento horizontal fue cuantificado como el número de veces que la rata se trasladaba de un cuadrante a otro. El desplazamiento vertical se cuantificó observando el número de veces que la rata levantaba sobre sus patas posteriores.

Entre los motivos más frecuentes para el consumo de bebidas alcohólicas se reportan: la ansiedad, los conflictos personales, el estrés y el estilo de vida. En ratas el estrés induce hipersensibilidad del SCM expresada en hipomotilidad horizontal y vertical (Carrizo y colaboradores., 1997), en inmovilidad durante el test de nado forzado o después de un estímulo eléctrico plantar, lo cual es potenciado si se produce una supersensibilidad colinérgica previa (Overstreet y colaboradores., 1986). Srikmanr y colaboradores (2006) relacionaron al SCM con la reversión del déficit de memoria producido por el estrés crónico. Además de existir cambios a nivel de las características cinéticas del RCM, el estrés agudo induce cambios en los marcadores colinérgicos presinápticos (Fatranska y colaboradores, 1987) y post-sinápticos (Estévez y colaboradores, 1984). En el presente trabajo se evalúa funcionalmente y molecularmente el RCM en ratas albinas sometidas simultáneamente a estrés y a consumo de alcohol. Materiales y Métodos Muestra. Se utilizaron 43 ratas Sprague Dawley con edades entre 1 y 2 meses, obtenidos del Bioterio Central de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA), divididas en 4 grupos: Control (6 hembras y 6 machos), Alcohol (5 hembras y 5 machos), Estrés (6 hembras y 5 machos) y Alcohol Estrés, (6 hembras y 4 machos). Los grupos Alcohol y Alcohol-estrés consumieron etanol al 10% en sustitución de agua a libre demanda y los grupos Estrés y AlcoholEstrés se sometieron a nado forzado. Los individuos fueron mantenidos en un bioterio con una temperatura promedio de 25°C centígrados, con ciclos diurnos y nocturnos de 12 horas, en jaulas de metal no oxidable de 41x51x15cm. El alimento basado en comprimidos de Ratarina fué suministrado ad libitum. Inducción de estrés. Consistió en colocar por 5min a cada individuo, en un recipiente de plástico de 1m de altura y

Movimientos estereotipados. Se realizo en un recipiente de vidrio transparente de 31 cm de diámetro y 31cm de altura en un cuarto aislado de ruido; después de 5 min de adaptación, se cuantificó la exploración vertical, el olfateo, el rascado con las patas posteriores, la actitud de limpieza de la nariz y de la cabeza con las patas anteriores, y el mordisqueo. La actividad locomotora y los movimientos estereotipados fueron medidos bajo tratamiento farmacológico con NaCl 0.9% o con escopolamina a dosis de 1 ml/Kg y 1mg/Kg, respectivamente, vía intraperitoneal. Las drogas fueron administradas posterior a una experiencia basal cuantificada, se espero 30min para proceder a iniciar la experiencia bajo el efecto de la droga. Memoria motora. Fue utilizado un Rotarod UGO47600 Ugo Basile Biological research apparatus. Inc). Los individuos fueron sometidos a 1 sesión diaria de 5min, por 3 días. Las rotaciones del Rotarod fueron mantenidas constantes en cada sesión e incrementadas cada día 5 rpm, iniciando el primer en 5rpm y terminan en 15rpm. En ésta prueba se midió el tiempo que permaneció cada individuo en el eje sin caer. Adicción al alcohol. Previo a la realización de ésta prueba los individuos fueron sometidos a ayuno total durante 24 horas. Cada individuo por separado fue colocado en jaulas metálicas de 29x26x26 cm, donde tuvieron acceso simultáneo en dispensadores diferentes a 100ml de agua y a 100 ml de etanol 10%. Se cuantificó diariamente el volumen de agua y alcohol consumido. Unión de Radioligandos. La densidad de Receptores Colinérgico Muscarínicos fue determinada a partir de homogeneizados de Corteza Frontal, Hipocampo, Tronco Encefálico y Corazón, utilizando [3H]-QNB como marcador a concentraciones saturantes (1000pM) y atropina 2 µM como ligando frío para cuantificar la unión inespecífica, de acuerdo a metodología descrita por Bonfante-Cabarcas y colaboradores (2002). Análisis de los datos. Los resultados fueron expresados en promedio ± el error estándar. La significancia estadística de la diferencia observada para determinada variable entre los grupos fue establecida mediante el test ANOVA seguido del post-test de Bonferroni, aceptándose como significativo un valor de p < 0.05.

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de la inervación colinérgica en hipocampo y destrucción de fibras colinérgicas, que no mejoraron al cesar el consumo de alcohol (Beracochea y colaboradores, 1992).

Resultados Ensayo de Adicción. El grupo Control presentó mayor consumo de agua durante el primer día el cual disminuyó hasta ser similar al consumo de alcohol. En el grupo Estrés el consumo de agua fue mayor al de alcohol. En el grupo Alcohol el consumo de alcohol fue mayor que el de agua los días 2 y 3. En el grupo Alcohol-Estrés el consumo de alcohol fue significativamente mayor al tercer día (figura 1). Actividad Locomotora. El grupo Alcohol y Alcohol-Estrés presentaron un mayor número de desplazamientos horizontales y verticales respectivamente al ser comparados con los grupos Control y Estrés, siendo la diferencia significativa. Escopolamina indujo un incremento significativo en la motilidad en ambas conductas en todos los grupos, habiendo una tendencia a igualarse las motilidades del grupo Control con respecto a los grupos Alcohol y Alcohol-Estrés, siendo la motilidad del grupo Estrés la menor, sin embargo, no se constato que estas diferencias fueran estadísticamente significativas (Tabla I). Movimientos Estereotipados. En la exploración vertical los grupos Estrés y Alcohol-Estrés presentaron un mayor

número de movimientos, los cuales fueron estadísticamente significativos al ser comparados con el grupo Control (Tabla II). En los grupos Alcohol, Estrés y Alcohol-Estrés se observó un mayor número de olfateos, los cuales fueron estadísticamente significativos respecto al grupo Control (Tabla II). Para los movimientos de rascado, limpieza de cabeza y mordisqueo no se observaron diferencias significativas entre los grupos experimentales (p>0.05) (Tabla II). La escopolamina incrementó significativamente la exploración vertical y olfateo en todos los grupos, no observándose bajo efecto de la droga diferencias significativas entre los grupos. Memoria Motora. En la Figura 2 se muestra el promedio global del tiempo de permanencia en el eje para los tres días, no observándose diferencias significativas. Ensayo de Radioligandos. El hipocampo de ratas sometidas a tratamiento con alcohol mostró una disminución significativa en la densidad de RCM, al ser comparados con los restantes grupos experimentales. En corteza frontal, tronco encefálico y corazón no se observaron diferencias (Figura 3).

Figura 1

Figura 1. Ensayo de adicción. Posterior a 45 de administración etanol en substitución de agua, a los individuos de cada grupo se les ofreció simultáneamente agua y alcohol en dispensadores separados, durante 3 días consecutivos, cuantificándose el volumen consumido para cada liquido por día. Observamos que el grupo AlcoholEstrés tendió a tomar menos líquidos, sin embargo, al tercer día el consumo de alcohol fue significativamente mayor, indicando una habituación al consumo de este liquido. *significa p < 0.05 al comparar respecto al consumo de alcohol el primer día.

Tabla I. Efectos del consumo de alcohol y el estrés sobre la motilidad espontánea en ratas albinas con y sin escopolamina Grupo

Horizontales

Verticales

Salina

Escopolamina

Salina

Control

7,25 ± 2.27

24,58 ± 6.43*

7,75 ± 2.73

Alcohol

11,18 ± 2.16

22,64 ± 4.60*

18,45 ± 2.67

Estrés

6,4 ± 1.29

13,9 ± 4.64*

7,9 ± 1.37

16,1 ± 2.97*

Alcohol-Estrés

14,2 ± 1.61

30 ± 5.21*

19 ± 4.05

25,50± 4.62

Escopolamina 22,75 ± 4.17* A

29,45 ± 4.48*

*p < 0.05 al analizar el efecto de escopolamina en cada grupo para cada movimiento; Ap < 0.05 al realizar análisis inter-grupo por ANOVA

Tabla II. Efectos del consumo de alcohol y el estrés sobre los movimientos estereotipados en ratas albinas. Efecto de la escopolamina Grupo

Exploración Vertical

Olfatear

Mordisquear

Limpiar Hocico

Salina

Droga

Salina

Droga

Salina

Droga

Salina

Droga

Control

11,17 ± 1.47

29,17 ± 3.79*

14.75 ± 1.5

28,83 ± 3.46*

3,25 ± 1.23

3,67 ± 0.92

5 ± 0.84

5,33 ± 1.3

Alcohol

16.1 ± 2.54

36.3 ± 4.68*

21.6 ± 1.61A

32.4 ± 2.03*

3.2 ± 1.59

3.5 ± 1.59

4.9 ± 0.88

5.6 ± 1.45

Estrés

21.3 ± 3.41A

35.1 ± 5.03*

23.8 ± 1.22A

32.7 ± 4.21*

3.7 ± 1.13

3.5 ± 0.99

5.6 ± 1

6 ± 1.34

Alcohol Estrés

21 ± 2.47A

43.44 ± 4.5*

23.11 ± 2.18A

40.89 ± 2.95*

3.11 ± 1.4

2 ± 0.82

4.22 ± 1.1

5.22 ± 1.34

*p < 0.05 al analizar el efecto de escopolamina en cada grupo para cada movimiento; Ap < 0.05 al realizar análisis inter-grupo por ANOVA

Figura 2. Efectos del alcohol y el estrés sobre la memoria motora en ratas albinas. En ésta prueba los individuos fueron sometidos a 1 sesión diaria de 5 minutos, por 3 días en un rotarod. Las rotaciones fueron mantenidas constantes en cada sesión e incrementadas cada día 5 rpm, iniciando el primer en 5 rpm y terminando en 25 rpm; se midió el tiempo de permanencia sobre el eje del Rotarod. En la figura se muestra el promedio global del tiempo de permanencia en el eje, no observándose diferencia significativa entre los grupos.

Figura 3

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Figura 2

Figura 3. Ensayo de Radioligando. La densidad de Receptores Colinérgico Muscarínicos fue determinada a partir de homogeneizados de Corteza Frontal, Hipocampo, Tronco Encefálico y Corazón, utilizando [3H]-QNB como marcador a concentraciones saturantes (1000 pM) y atropina 2 µM como ligando frío. Se observa que en el hipocampo de ratas sometidas a tratamiento con alcohol hubo una disminución significativa en la densidad de Receptores Colinérgico Muscarínicos al ser comparados con los restantes grupos experimentales. * significa p < 0.05.

Discusión En este trabajo observamos que el alcohol indujo un aumento de la motilidad en ratas Sprague Dawley, lo cual fue potenciado por estrés. En este sentido, Phillips y Shen (1996) demostraron que el alcohol administrado crónicamente produce un incremento de la motilidad en roedores. De la misma manera, Scibelli y Phillips (2009) demostraron que la administración aguda de etanol incrementa la actividad locomotora en ratones, efecto potenciado por escopolamina, indicando que ambas drogas actúan sinérgicamente regulando la motilidad. Dicho incremento podría estar relacionado con disfuncionalidad del SCM reflejo de la perdida de fibras colinérgicas, tal como ha sido demostrado en el SNC (Costa y Guizzetti, 1999), en la corteza somatosensorial (Miller y Rieck, 1993) y en el hipocampo (Beracochea y colaboradores, 1992). La demostración de que los niveles de la enzima colinacetiltransferasa y el transportador de colina de alta afinidad se encontraran bajos en individuos que han consumido alcohol, confirman la idea de la degeneración de neuronas colinérgicas causadas por el alcohol, ya que, ambas proteínas son marcadores presinápticos colinérgicos (Beracochea y colaboradores, 1992 y 1995). A nivel molecular observamos una disminución de los RCMs en hipocampo de ratas con administración crónica de alcohol. Similarmente, Freund y Ballinger (1991) encontraron en autopsias de pacientes con historia de alcoholismo una disminución del 30% en la densidad de los RCM en hipocampo, sin embargo, también observaron una subsensibilidad del 40% en la corteza frontal, en la corteza temporal y en el putamen. La subsensibilidad de los RCM, especialmente en hipocampo, podría estar relacionados con los déficits cognoscitivos (Beracohea y colaboradores, 1992) y al desarrollo de demencia tipo Alzheimer observados en individuos alcohólicos (Freund y Ballinger, 1992).

En este trabajo los efectos del alcohol sobre la conducta motora fueron consistentemente observados en ratas sometidas a estrés (ver tablas I y II, grupo alcohol-estrés). El hecho de que las ratas sometidas a estrés presenten hipermotilidad, sustenta la noción de que el alcohol induce neurodegeneración colinérgica muscarínica que supera las acciones tróficas del estrés. Dicho esto podemos sugerir que los aumentos de la motilidad espontánea y estereotipada observados en el presente trabajo son reflejo de una destrucción de las células colinérgicas en el SNC por consumo crónico de alcohol. Referencias 1. Freund G. Ballinger WE. Loss muscarinic cholinergic in the frontal cortex of alcohol abusers. Alcohol Clin Exp Res. 1988 oct; 12(5) 630-8 2. Brandâo F. Ribeiro da Silva A. Cadete Leite A. GM1 and piracetam do not revert the alcohol induced depletion of cholinergic innervation of rat hippocampal formation as revealed by choline acetyltransferase immunocytochemistry. Neuroscience 1995 jan; 64(2) 357-74 3. Brandâo F.; Ribeiro-Da-Silva A.; Cadete-Leite A. GM1 and piracetam do not revert the alcohol-induced depletion of cholinergic fibers in the hippocampal formation of the rat. Alcohol, Volume 19, Number 1, August 1999 , pp. 65-74(10)

4. Beracochea D. Micheau J. Jaffard R. Memory déficit following chronic alcohol consumption in mice: Relationship with hippocampal and cortical cholinergic activities. Pharmacol Biochem Beba. 1992 aug; 42(4) 749-53 5. Nagahara AH. Handa RJ. Fetal alcohol exposed rats exhibit differential repsonse to cholinergic drugs on a delay dependent memory task. Neurobiol Learn Mem. 1999 nov; 72(3): 230-43 6. Hodges H. Allen Y, Siden J, and Collaborators. The effects ofcholinergic drugs and cholinergic rich foetal neural transplants on alcohol induced déficits in radial maze preformance in rats. Behav Brain Res. 1991 apr; 43(1) 7-28 7. Carrizo E. Cano G. Suarez Roca H. Motor activity and qualitative autoradiographic análisis of muscarinic receptors in the brain of rat sujeted to the forced swarming test. Brain Res Bull. 1997; 42(2):133-9. 8. Overstree DH. Janowsky DS. Gillin JC. Stress induced immobility in rats with cholinergic supersensibility. Biol Psychiatry. 1986 jun; 21(7): 657-64 9. Srikumar BN, Raju TR, Shankaranarayana Rao BS. The involvement of cholinergic and noradrenergic systems in behavioral recovery following oxotremorine treatment to chronically stressed rats. Neuroscience. 2006 Dec;143(3):679-88. Epub 2006 Sep 27. 10. Fatranska MM. Budai D. Oprsalova Z. Kvetnansky R. Acetylcholine and its encimes in some brain areas of the trat under stress. Brain Res. 1987 oct; 424(1): 109-14 11. Estévez EE, Jerusalinsky D, Medina JH, De Robertis E. Cholinergic muscarinic receptors in rat cerebral cortex, basal ganglia and cerebellum undergo rapid and reversible changes after acute stress. Neuroscience. 1984 Dec;13(4):1353-7 12. Bonfante-Cabarcas R, Bravo I, Nello C, Gutiérrez-Reyes E, Loureiro Dos Santos NE, Moreno-Yanes JA. Pharmacological doses of Zn2+ induce muscarinic cholinergic supersensibility. J Biomed Sci. 2002 Nov-Dec;9(6 Pt 2):639-44 13. Costa LG, Guizzetti M. Muscarinic cholinergic receptor signal transduction as a potential target for the developmental neurotoxicity of ethanol. Biochem Pharmacol. 1999 Apr 1;57(7):721-6. 14. Phillips TJ, Shen EH. Neurochemical bases of locomotion and ethanol stimulant effects. Int Rev Neurobiol. 1996;39:243-82 15. Scibelli AC, Phillips TJ. Combined scopolamine and ethanol treatment results in a locomotor stimulant response suggestive of synergism that is not blocked by dopamine receptor antagonists. Alcohol Clin Exp Res. 2009 Mar;33(3):435-47. 16. Miller MW, Rieck RW. Effects of chronic ethanol administration on acetylcholinesterase activity in the somatosensory cortex and basal forebrain of the rat. Brain Res. 1993 Nov 5;627(1):104-12. 17. Freund G. Ballinger WE. Loss of synaptic receptors can precede morphologic changes induced by alcoholism. Alcohol Alcohol Suppl. 1991;1:385-91

Posible efecto antioxidante de la atorvastatina en individuos hiperlipidemicos Possible antioxidant effects of atorvastatin in hyperlipidemic individuals

Marielena Muñoz1, Mercedes Elena Márquez2, Maira Soledad Carrizales2, Rosalía de Carmen Sutil de Naranjo3, María Esther Gómez4, Elias Sukkar5, Yulimir Khlaid5, Yudith Peña6. Universidad de Carabobo. Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Medicina. Departamento de Farmacología. mmunoz@uc.edu.ve. Especialista en Bioquímica Clínica. Supervisora del Laboratorio del Departamento de Farmacología. Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo – Valencia. Venezuela. 2

Dra. en Ciencias Médicas. Profesor Titular Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo – Valencia. Venezuela.

Master en Educación. Mención Investigación. Profesor Titular Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo – Valencia. Venezuela. 3

T.S.U. en Tecnología en Alimentos. Coordinadora del Laboratorio de Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) y de Gases del Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo – Valencia. Venezuela. 4

Lic en Bioanálisis.

Lic. en Bioanálisis. Supervisora del Laboratorio del Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo – Valencia. Venezuela.

Recibido: 06/07/2009

Aceptado: 02/10/2009

Resumen

Abstract

La Atorvastatina es usada en el tratamiento de hiperlipidemias por su acción de inhibición de la 3-Hidroxi-3-Metilglutaril Coenzima A reductasa. Adicionalmente, se ha demostrado que pueden reducir el estrés oxidativo y la susceptibilidad de la LDL-C a la oxidación. Considerando estos efectos pleiotrópicos de la Atorvastatina, se propuso esta investigación con el Objetivo: Evaluar el posible efecto antioxidante de la Atorvastatina, sobre los niveles séricos de α-Tocoferol y Retinol en individuos hiperlipémicos. Metodología: previo consentimiento informado, a 30 individuos hiperlipidémicos, se les determino el perfil lipídico, (enzimático-colorimétrico) y vitaminas A y E (HPLC) antes y después de tratamiento por un corto período (7 días) con dosis diferentes de Atorvastatina según criterio médico. Resultados: el tratamiento con 10 mg disminuyó significativamente los Triglicéridos, el Colesterol Total y LDL-C, (p=0.0308), (p=0.031) y (p=0.0193), con un incremento del 2,26% en las HDL-C. La dosis de 20 mg intensificó significativamente el efecto mencionado para los triglicéridos, Colesterol total y LDL-C (p=0.0211), (p=0.0001) y (p=0.0001) respectivamente. Los valores de Vitaminas A y E presentaron un incremento significativo con la dosis de 20 mg. Conclusión: el tratamiento con Atorvastatina a las dosis de 10 y 20 mg disminuyó Triglicéridos, el Colesterol Total y LDL-C en una forma dosis-dependiente. Este efecto y el incremento de las vitaminas A y E reflejan no sólo un efecto hipolipidemiante, sino además a un efecto pleiotrópico, en este caso antioxidante.

The Atorvastatin is used in the treatment of hyperlipidaemia owing its action of inhibition 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Additionally, they have showed to reduce oxidative stress and the susceptibility of LDL-C to oxidation. Considering these pleiotropic effects of Atorvastatin this research was proposed with the Objective: To evaluate the possible antioxidant effect of the Atorvastatin on the serum levels of α-Tocopherol and Retinol in hyperlipidemia individuals. Methodology: prior informed consent, 30 individuals with hyperlipidemia, was analyzed for lipid profile (enzymatic-colorimetric) and vitamins A and E (HPLC) before and after short-term treatment (7 days) with different doses of Atorvastatin. Results: Treatment with 10 mg significantly decreased triglycerides, total cholesterol and LDL-C, (p = 0.0308), (p = 0.031) and (p = 0.0193), an increase of 2.26% in HDL-C. The dose of 20 mg intensified significantly the mentioned effect, triglycerides, total cholesterol and LDL-C (p = 0.0211), (p = 0.0001) and (p = 0.0001), respectively. The values of Vitamins A and E showed a significantly increase with dose of 20 mg. Conclusion: Treatment with Atorvastatin at doses of either 10 or 20 mg decreased triglycerides, total cholesterol and LDL-C in a dose-dependent manner. The effect and the increase of Vitamin A and E levels could reflect not only a lipid lowering effect, but also a pleiotrópico, in this case antioxidant effect.

Palabras Claves: Hiperlipidemia, Atorvastatina, Antioxidantes.

Key words: Hyperlipidemia, Atorvastatin, Antioxidants.

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Introducción El efecto benéfico de la Atorvastatina, una estatina (inhibidora de la 3-Hidroxi-3-Metilglutaril Coenzima A reductasa) es atribuido a su eficacia en la disminución de los niveles de LDL-C; por otro lado, ha sido demostrado que puede reducir el estrés oxidativo y la susceptibilidad de la LDL-C a la oxidación; el conocimiento de dichos efectos constituye un aporte adicional al beneficio clínico del tratamiento1,2,3. Puesto que, las estatinas pueden bajar los lípidos y los antioxidantes disminuyen el estrés oxidativo, se ha sugerido que una combinación de estos fármacos puede verse como una propuesta atractiva en la reducción de los niveles de LDL oxidada y del riesgo de enfermedad cardiovascular1,4,5,6. Tomando en consideración el auge que han tenido las estatinas por sus efectos pleiotrópicos, es importante analizar los cambios que pueden experimentar algunos indicadores del balance oxidativo en el organismo después del tratamiento, a corto plazo, con Atorvastatina, sobre los niveles séricos de α-Tocoferol (Vitamina E) y Retinol (Vitamina A) en individuos hiperlipidémicos y de esta manera evaluar el posible efecto antioxidante de la Atorvastatina. Metodología Muestra: Estuvo constituida por 30 Funcionarios de una Policía Municipal en edades comprendidas entre 30 y 50 años, quienes previo consentimiento informado, presentaban Hiperlipidemia y no habían sido tratados con estatinas, no suplementados con antioxidantes, no fumadores, ni poseedores de otras patologías asociadas. Posteriormente se les aplicó tratamiento con Atorvastatina, a las dosis de 1020 mg según criterio médico. Se siguió un quema:

plan de trabajo de acuerdo al siguiente es-

a) Toma basal: Donde se determinaron por métodos enzimáticocolorimétricos: Colesterol Total, HDL-C, LDL-C, Triglicéridos TBRAS: Sustancias reactivas al acido tiobarbitúrico7 y por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) las Vitaminas A (Retinol) y E (α-tocoferol) b) 7 días de tratamiento con Atorvastatina 10-20 mg según criterio médico. c) 2da toma: Donde se determinaron: Colesterol Total, HDLC, LDL-C, Triglicéridos, TBARS y Vitaminas A (Retinol) y E (α-tocoferol). Se realizaron determinaciones de malondialdehido (MDA) por el método colorimétrico del acido tiobarbitúrico modificado, indicador de estrés oxidativo. Valor de referencia MDA: 1.34μmol/L7 La cuantificación de la concentración de alfa tocoferol y Retinol sérico se realizó por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC), según el método desarrollado por el Internacional Vitamin A Consultive Group y estandarizado para Vitamina A y E por Márquez y col. Valores de referencia antioxidante: Retinol (R-OH): Deficiente < 80 ug/dl. Suficiente >80 ug/dl Tocoferol (T-OH): Deficiente < 1300 ug/ dl. Suficiente >1300 ug/dl8.

Técnicas de análisis estadístico: Los resultados obtenidos fueron analizados a través del programa INSTAD 3 para Windows calculando medidas de tendencia central (promedios) y medidas de dispersión (desviación estándar). Se utilizaron métodos de análisis parametritos (“t” de student), se aplicó el Kolmogorov-Smirnov encontrándose distribución normal de los datos. Resultados La población en estudio estuvo constituida por 30 Funcionarios de una Policía Municipal en edades comprendidas entre 30 y 50 años. La distribución por sexo mostró un 57% del sexo masculino y 43% del sexo femenino (Grafico I). En la Tabla 1, se describen las características de la población en estudio presentados en promedios y desviaciones estándares así como también los valores máximo y mínimo de cada variable; el promedio de edad obtenido fue de 38,22 ± 6,46; los valores de Glicemia y de Presión Arterial media estuvieron dentro de los valores referenciales. Los lípidos séricos evidencian niveles por encima de los valores referenciales a excepción del HDL-C cuyo valor promedio fue de 41,33±8,74mg/dl. Los valores de TBARS disminuyeron significativamente (p≤0,05) al aplicar el tratamiento. En cuanto a los antioxidantes estudiados se encontró que el promedio de Retinol fue de 150,64±56,52μg/dl, considerándose suficiente según los valores de referencia mientras que el Tocoferol mostró un nivel deficiente de acuerdo a los valores referenciales (667,20±306,54μg/dl). El Tocoferol estandarizado a los lípidos mostró un promedio de 667,20±297,57μg/dl. La Tabla 2 se refleja la comparación de los lípidos antes y después del tratamiento a corto plazo con 10 mg de atorvastatina, donde el Colesterol Total disminuyo significativamente p= 0,0031. Igual comportamiento mostraron los niveles de LDL-C p=0,0193 y los Triglicéridos p=0,0308. Las HDL-C se mantuvieron en el tiempo siendo sus niveles semejantes a los valores basales. En el tratamiento con 20 mg de atorvastatina, (mostrados en la Tabla 3) se observó una disminución estadísticamente significativa para Colesterol Total p= 0,0001, LDL-C p= 0,0001 y Triglicéridos p= 0,0211. Por el contrario para HDL-C se observaron valores muy semejantes con respecto a los obtenidos antes de aplicar el tratamiento. En la Tabla 4 y 5 se comparan los antioxidantes antes y después del tratamiento a corto plazo con 10 mg y 20 mg de atorvastatina, no encontrándose diferencia estadísticamente significativa.. El Gráfico 2, se observa un aumento estadísticamente significativo entre los valores de Retinol con la dosis de 10 mg y 20 mg (p=0,0142) de atorvastatina. Esto también se encontró para los valores de Tocoferol para 10 mg y para 20 mg (p=0,0156). Así mismo, para el tocoferol estandarizado a los lípidos, se pudo observar aumento significativo con la dosis de 20 mg (p=0,0152).

Gráfico 2: Comparación de los niveles séricos de antioxidantes de la población en estudio según dosis de atorvastatina

Gráfico I: Distribución de la población en estudio según sexo

Fuente: Datos obtenidos de la investigación.

*Significación p≤ 0,05

Variables

Media

Desviación Estándar

Valor Mínimo

Valor Máxima

Edad Glicemia (mg/dl) Presión Arterial Sistólica Presión Arterial Diastólica Presión Arterial Media Colesterol Total (mg/dl) HDL Colesterol (mg/dl) LDL Colesterol(mg/dl) Triglicéridos (mg/dl) TBARS Basal (μmol/L) 7 días Retinol (R-OH) μg/dl Tocoferol (T-OH) μg/dl TOH Estandarizado a los lípidos

30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

38,22 90,23 124 74,33 90,88 216,33 41,33 134,3 216,96 2,69 1,18 150,64 667,20 667,20

6,46 9,71 10,70 7,28 7,47 31,91 8,74 40,79 101,15 2,45 0,98 56,52 306,54 297,57

30 72 110 60 76,67 163 23 60 85 0,26 0,16 98,83 353,19 335,02

50 109 140 80 100 297 63 248 465 7,94 3,98 312,41 1741 1733,2

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Tabla 1: Características de la población en estudio

Tabla 2: Comparación de los lípidos séricos en individuos hiperlipidemicos antes y después del tratamiento a corto plazo con 10 mg de atorvastatina Periodo Antes Después Desviación Estándar

Valor de p

34,92

*0,0031

Variables

Media

Desviación Estándar

Colesterol Total (mg/dl)

202,84

22,88

HDL Colesterol (mg/dl)

41,07

7,62

8,17

0,6864

LDL Colesterol(mg/dl)

123,76

32,99

94,23

30,52

*0,0193

Triglicéridos (mg/dl)

179,92

62,44

146,15

42,45

*0,0308

Media 165,23

*Significación p≤ 0,05

Tabla 3: Comparación de los lípidos séricos en individuos hiperlipidemicos antes y después del tratamiento a corto plazo con 20 mg de atorvastatina Período

Antes

Después

Variables

Media

Desviación Estándar

Media

Desviación Estándar

Valor de p

Colesterol Total (mg/dl) HDL Colesterol (mg/dl) LDL Colesterol(mg/dl)

17 17 17

226,64 41,52 142,35

34,54 9,74 45,16

162,23 39,88 87,58

29,85 8,83 34,08

*0,0001 0,5149 *0,0001

Triglicéridos (mg/dl)

245,29

116,85

174,52

74,72

*0,0211

*Significación p≤ 0,05

Tabla 4: Comparación de antioxidantes en individuos hiperlipidemicos antes y después del tratamiento a corto plazo con 10 mg de atorvastatina Periodo Antes Después Valor de p Variables n Media Desviación Estándar Media Desviación Estándar Retinol (R-OH) μg/dl 13 133,43 31,58 121,07 29,71 0,0919 Tocoferol (T-OH) μg/dl

577,19

127,97

519,65

117,64

0,1979

TOH estandarizado a los lípidos

556,13

151,56

519,64

110,29

0,4270

*Significación p≤ 0,05

Tabla 5: Comparación de antioxidantes en individuos hiperlipidemicos antes y después del tratamiento a corto plazo con 20 mg de atorvastatina Periodo

Antes

Después

Variables

Media

Desviación Estándar

Media

Desviación Estándar

Valor de p

Retinol (R-OH) μg/dl Tocoferol (T-OH) μg/dl

17 17

163,80 736,03

67,97 382,65

164,59 676,86

58,79 210,49

0,9711 0,4237

TOH estandarizado a los lípidos

736,03

375,32

676,87

214,32

0,4227

*Significación p≤ 0,05

Discusión La Hiperlipidemia mixta está asociada con un incremento de la incidencia en las enfermedades cardiovasculares (ECV). La misma cursa con un aumento en el Colesterol Total y de la fracción de su lipoproteína LDL-C así como también de los Triglicéridos9,10,11. El abordaje terapéutico en estos pacientes debe iniciarse con un programa dietético, sin embargo en la mayoría de los casos hay que hacerlo farmacologicamente. La presente investigación tuvo como objetivo evaluar el posible efecto antioxidante de la Atorvastatina (inhibidor de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa). Para ello se seleccionó un grupo de estudio homogéneo de edad, no fumadores, con glicemia y presión arterial dentro de la normalidad según Séptimo Informe del Comité Nacional sobre Prevención, Detección, Evaluación y Tratamiento de la Hipertensión Arterial12, constituido por individuos con hiperlipidemia a los cuales, se les aplico un tratamiento a corto plazo (agudo) con atorvastatina en dosis de 10 y 20 mg.

Al analizar el perfil lipídico de la población estudiada, los valores promedio de Colesterol Total, LDL-C y Triglicéridos, se ubicaron fuera de los valores referenciales según el Consenso Venezolano de lípidos13, por lo tanto se partió de un grupo de pacientes hiperlipidémicos. Una vez aplicado el tratamiento a corto plazo con atorvastatina, se observo una disminución significativa en dichos lípidos; al desglosarlos se observa que el Colesterol Total disminuyo en un 81,4% con la dosis de 10 mg, efecto menor es reportado por Cangemi y cols.4, quienes administraron atorvastatina también en dosis de 10 mg y a los 3 días observaron una disminución del colesterol en 24,9%. En este orden de ideas, otros investigadores14, estudiaron 41 pacientes dislipidémicos de los cuales 26 eran hipercolesterolémicos y 21 cursaban con hiperlipidemia mixta (aumento de Colesterol Total y Triglicéridos) los cuales recibieron 10 mg de atorvastatina por 6 semanas observando un efecto mayor como hipocolesterolémico. En contraste con este ultimo estudio, los resultados obtenidos en esta investigación muestran que la atorvastatina a 10 mg disminuyó significativamente tanto Colesterol Total como Triglicéridos. En relación a la LDL-C (lipoproteína altamente aterogénica), estudios realizados por Poli, A15 encontraron que la atorvastatina fue una de las estatinas más efectivas no solo por sus efectos sobre la LDL-C, sino también por su capacidad de disminuir los niveles de Triglicéridos y la capacidad de modificar la composición de la lipoproteína en una forma no aterogénica; reportando una sustancial disminución de los niveles de LDL-C (entre 40-60 mg/dl) en pacientes con eventos cardiovasculares, comparado con altos niveles previos. Los resultados obtenidos en esta investiga-

ción muestran una disminución significativa de los valores de LDL-C, luego de aplicado el tratamiento a corto plazo con atorvastatina en un 76,13% con la dosis de 10 mg/día y con la dosis de 20 mg diarios descendieron las LDL-C en un 61,52% en tan solo 7 días de tratamiento reforzando lo antes dicho sobre la efectividad del fármaco, y coincidiendo con lo ya reportado por Marchesi y col.16, quienes encontraron una disminución del 75% en las LDL-C después de tratamiento con 10 mg de atorvastaina por 7 días. Igualmente en los niveles de Triglicéridos fue encontrada una disminución del 81,2% y de 71,14% con el tratamiento a corto plazo de la atorvastatina en dosis de 10 y 20 mg respectivamente. Así mismo, la eficacia de la atorvastatina sobre los lípidos en general (Triglicéridos, Colesterol Total y sus fracciones: LDL-C y HDL-C) fue reportada por Jeetesh y cols.17, quienes realizaron un estudio de 33 pacientes hiperlipidémicos por 4 semanas los cuales recibieron 10 mg/día del fármaco observando una reducción significativa de Colesterol Total, LDL-C y Triglicéridos, mientras que no observaron cambios en las HDL-C, en el presente estudio, a esta dosis la atorvastatina incremento en un 2,26% la HDL-C. En estudios recientes, las estatinas han sido señaladas como potentes inhibidoras de estrés oxidativo; de hecho Violi y col18 demostraron que en pacientes con hipercolesterolemia, la administración de una estatina tuvo relación con la reducción de isoprostanos urinarios, marcadores de estrés oxidativo y con la normalización de los niveles circulantes de Vitamina E, indicando que estos fármacos contribuyen a modificar el estado antioxidante. En investigaciones realizadas4, en 30 pacientes hipercolesterolémicos, a los cuales se les administro dieta mas atorvastatina en dosis de 10 mg/día encontraron un incremento en los niveles de Vitamina E y una disminución de Colesterol Total indicando un independiente y temprano efecto antioxidante de la atorvastatina al modificar los niveles de Vitamina E. En relación a los resultados obtenidos en este estudio se observó que los individuos hiperlipidémicos luego del tratamiento a corto plazo con atorvastatina, mostraron una leve disminución de los niveles séricos de las Vitaminas A y E, debido probablemente a que la hiperlipidemia indujo incremento de la peroxidación lipídica en un 43,86% reflejado en los valores de TBARS, lo que trajo como consecuencia el consumo de las vitaminas antioxidantes. Sin embargo se observa una tendencia al aumento, cuando se administra la atorvastatina en 20 mg/día, siendo significativo cuando es analizado estadísticamente, lo que indica que a mayor dosis se modifican los valores de las vitaminas. Es necesario recordar que este estudio es a corto plazo y que los resultados obtenidos pudieran conllevar a un aumento en los

La mejora del estrés oxidativo, observado en esta investigación y reflejado con el retorno de los lípidos a los valores de referencia, pudiera ser atribuido al tratamiento con la atorvastatina, coincidiendo con los estudios realizados por Kural y cols21, quienes concluyeron que la terapia con la atorvastatina en pacientes hiperlipidémicos disminuye el estrés oxidativo especialmente en pacientes con valores de HDL-C ubicados dentro de los valores referenciales considerados normales., situación semejante a la observada en el presente estudio. Numerosos investigadores han analizado el rol de las vitaminas A, E y C en los procesos oxidativos denominándolas incluso barredoras de radicales libres1,22,23,24. Adicionalmente, a la Vitamina E se le han atribuido efectos regulatorios de la agregación plaquetaria, inhibición de las fosfolipasa A2, modulación de prostaglandinas y leucotrienos actuando de esta manera en los procesos inflamatorios23,25,26. En el mismo orden de ideas, Tousoulis y cols.27 evaluaron el efecto de la administración de bajas dosis de atorvastatina (10mg/día), y Vitamina E (400 UI/día) sobre marcadores inflamatorios asociados a un elevado estatus de estrés oxidativo en pacientes con hipercolesterolemia y ateroesclerosis avanzada; para ello estudiaron 38 pacientes, donde unos recibieron atorvastatina y otros atorvastatina más vitamina E, encontrando una disminución significativa de los marcadores inflamatorios con atorvastatina concluyendo entonces que el tratamiento con bajas dosis del fármaco mejoran la función endotelial y reducen la expresión de citoquinas proinflamatorias, efectos también deprimidos por la vitamina E. En consecuencia y basándose en los resultados obtenidos en los pacientes hiperlipidémicos, el tratamiento con atorvastatina por un corto periodo de tiempo (7 días) a la dosis de 10 y 20mg disminuyó los Triglicéridos, el Colesterol Total

y su fracción LDL-C en una forma dosis-dependiente, con un incremento del 2,26% en las HDL-C solo con la dosis de 10mg de atorvastatina. Similar a estos hallazgos, se observó que con las vitaminas antioxidantes A y E, a la dosis de 10mg de atorvastatina, la concentración de dichas vitaminas disminuyó discretamente; asumiendo la depleción de los depósitos de Vitaminas A y E como un mecanismo compensatorio del organismo, ante el incremento del estrés oxidativo inducido por la hiperlipidemia. Al analizar el comportamiento a la dosis de 20 mg de atorvastatina, se encontró un aumento significativo en los valores de ambas vitaminas, lo cual permite inferir que a mayor dosis de atorvastatina se incrementan las concentraciones séricas de las vitaminas antioxidantes A y E y por ende ofertan su mayor disponibilidad para controlar el estrés oxidativo. Estos efectos reflejan no solo un efecto hipolipidemiante, sino además un efecto pleiotrópico: antioxidante de la atorvastatina. Referencias 1. Rosenson, R. (2004) Statins in atherosclerosis: lipids lowering agents with antioxidant capabilities Review. Atherosclerosis 173, 1-12. 2. Cangemi R. Loffredo L. Carnevale R. Pignatelli P. Violi F. (2008a). Statins enhance circulating vitamin E. Int J Cardiol. 11:123(2):172-4. 3.

Liao, J.K. Laufs U. (2005). Pleiotropic effects of statins. Annu Rev Pharmacol Toxicol 45:89-118.

4. Cangemi R. Loffredo L. Carnevale R. PerriL. Patrizi MP. Sanguigni V. Pignatelli P. Violi F. (2008b). Early decrease of oxidative stress by atorvastatin in hypercholesterolaemic patients: effect on circulating vitamin E. Eur Heart J. 29(1): 54-62. 5. Kapur, NK.; Musunuru, K. (2008). Clinical efficacy and safety of statins in managing cardiovascular risk. Vasc Health Risk Manag.: 4(2):341-53. 6. Kowalski, J.; Pawlicki, L.; Grycewicz, J.; Blaszczyk, J.; Irmanski, R.; Ceglinski, T.; Kowalczyk, E.(2004) Plasma antioxidative activity during atorvastatin and fluvastatin therapy used in coronary Herat disease primary prevention. Fundam Cin Pharmacol. 18(1):93-6. 7. Cano C, Bermúdez V, Sulbaràn G, Morales R, Medina M, Amell A, Souki A, Ambard M, Nuñez M, Garcia D, Restrepo H, Vargas M.E, Seyfi H y Cruz S. (2001). Influencia de la edad y el sexo en el balance oxidación/antioxidación. Arch. Ven. Farmacol. Ter. 20(1):63-68. 8. Márquez, M.; Yépez, C.E.; Sutil-Naranjo, R.; Rincón, M. (2002). Aspectos básicos y determinación de lãs vitaminas antioxidantes E y A. Investigación Clínica 43:191-204. 9. Van Ganse, E.; Laforest, L.; Burke, T.; Phatak, H.; Souchet, T. (2007) Mixed Dyslipidemia among patients using lipid-lowering therapy in French general practice: an observational study. Clin Ther. 29(8): 1671-81. 10. Avisar I.; Brook JG. Wolfovitz E. (2008). Atorvastatin monotherapy vs. combination therapy in the management of patients with combined hyperlipidemia. Eur J Intern Med. 19(3):203-8. 11. Nicholls, S.J.; Tuzcu, E.M.; Sipahi, I.; Grasso, A.W.; Schoenhagen, P.; Hu, T.; Wolski, K.; Crowe, T.;Desai, M.Y.; Hazen, S.L.; Kapadia, S.R.; Nissen, S.E. (2007) Statins high-density. Lipoprotein cholesterol, and regression of coronary atherosclerosis. JAMA 7.297(5): 499-508. 12. Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detecction, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure (JNC7).

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niveles séricos de las vitaminas en estudios a largo plazo donde posiblemente al disminuir los lípidos por efecto de la atorvastatina, desciende la peroxidación lipídica, por ende el estrés oxidativo y por lo tanto el consumo de las vitaminas antioxidantes tendiendo a mejorar la circulación de las vitaminas en el tiempo. En este sentido, ya en el 2000 Kawai y cols.19, señalaron que los niveles de vitaminas disminuyeron durante el estrés oxidativo debido a que los glóbulos rojos utilizan los almacenes séricos para protegerse del daño producido por los procesos oxidativo; en este orden de ideas en el 2004 Kolwalski y col6 encontraron una reducción significativa en los valores de MDA en eritrocitos y plasma, concluyendo que la capacidad antioxidante de la atorvastatina condujo a disminuir el estrés oxidativo, hallazgo semejante observado en la presente investigación. Otros estudios sobre como interviene la atorvastatina en el estrés oxidativo fue descrito por Delliaux y cols.20, quienes analizaron los efectos de la atorvastatina sobre el estado oxidante-antioxidante inducido por el ejercicio en 10 pacientes dislipidémicos que recibieron 10 mg/día del fármaco por 6 meses y 13 sujetos sedentarios a los cuales les fue medido las sustancias reactivas al acido tiobarbitúrico (TBARS), encontrando que la atorvastatina redujo la actividad oxidante-antioxidante y el estrés oxidativo inducido por el ejercicio.

Traducción de la Versión Original en inglés publicada en 2003. 13. Consenso Venezolano de Lipidos. International Lipid Information Bureau. Capitulo Venezuela. Park Davis, 2000. pp 1-39. 14. Cihan Örem, Hüseyin Avni Uydu, Remzi Yilmaz, Mustafa Gökce, Merih Baykan, Selcuk Eminagaoglu and Aslm Örem (2004) The Effect of Atorvastatin Treatment on the Fibrinolytic System in Dyslipimemic Patients Japanese Hear Journal. 45(6)977-987. 15. Poli A (2007). Atorvastatin: pharmacological characteristics and lipidlowering effects. Drugs. 67(1): 3-15. 16. Marchesi S, Lupattelli G, Siepi D, Schillaci G, Vaudo G, Roscini AR, Sinzinger H, Mannarino E. (2000) Short-term atorvastatin treatment improves endothelial function in hypercholesterolemic women. J, Cardiovasc Pharmacol. 36(5):617-21. 17. Jeetesh, V. Patel, Sandeep Gupta, Frank Lie, and Hughes Elizabeth A. (2005). Efficacy and Safety of Atorvastatin in South Asian Patients with Dyslipidemia: An Open Label Noncomparative Pilot Study. Vasc Health Risk Manag.; 1(4): 351–356. 18. Violi, F.; Cangemi, R. (2008) Statin treatment as a confounding factor in human trial with vitamin E. J Nutr. 138(6):1179-81. 19. Kawai, Y.; Shimomitsu, T.; Takanami Y.: Murase, N.; Katsumura, T.; Maruyama, C. (2000). Vitamine E Levels Changes in Serum and Red Blood Cells Due To Acute Exhaustive Exercise in Collegiate Women. Journal of Nutritonal Sciences. 46. 119-124. 20. Delliaux, S.; Steinberg JG.; Bechis, G.; Paganelli, F.; Oliver, C.; Lesavre, N.; Jammes, Y. (2007). Statins alter oxidant-antioxidant status and lower exercise-induced oxidative stress. Int J Clin Pharmacol Trer. 45(4):244-52. 21. Kural, B.V.; Orem, C.; Uydu, H.A.; Alver, A.; Orem, A. (2004). The effects of lipid-lowering therapy on paraoxanase activities and their relationships with the oxidant-antioxidant system in patients with dyslipidemia. Coron Artery Dis. 15(5):277-83. 22. Yépez, R.D.; Rivas de Yépez, C.E.; Sutil de Naranjo R.; Márquez, A. (2006) Vitaminas antioxidantes y catarata. Revista Oftalmológica Venezolana. 62(2):55-64.

23. Barbosa K, Bressan J, Zulet M, Martínez Hernández J. (2008) Influence of dietary intake on plasma biomarkers of oxidative stress in humans. An Sist Sanit Navar. 1;31(3):259-280. 24. Durant, R; Klouche, K; Delbosc, S; Morena, M; Amigues, L; Beraud, J; Canaud, B; Cristol, J.( 2004.) Superoxide anion overproduction in sepsis: effects of vitamin E and simvastatin. Shock. 22(1):34-39. 25. Márquez, M; Yépez, C; Sutil de Naranjo, R; Rincón, M. (2003) Vitaminas E y A: Aspectos Básicos y su importancia en la Aterosclerosis. Clínica de Dislipidemias. Dpto. de Farmacología, Escuela de Medicina, Facultad de Ciencias de la Salud. Editado por Universidad de Carabobo-Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico, Venezuela. 26. Tam, L.S.; Li, E.K.; Leung, V.Y.; Griffith, J.F.; Benzie, I.F.; Lim, P.L.; Whitne, B.; Lee, V.W.; Lee, K.K.; Thomas, G.N.; Tomlinson, B. (2005). Effects of vitamins C and E on oxidative stress markers and endothelial function in patients with systemic lupus erythematosus: a double blind, placebo controlled pilot study. J Rheumatol. 32(2):275-82. 27. Tousoulis, D.; Antoniades C.; Vassiliadou, C.; Toutouza, M.; Pitsavos, C.; Tentolouris, C.; Trikas, A.; Stefanadis, C. (2005). Effects of combined administration of low dose atorrvastatin and vitamin E on inflammatory markers and endothelial function in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 7(7):1126-32.

Iatrogenic equine

metabolic syndrome in thoroughbred horses Abelardo Morales, Francisco García, Víctor Bermúdez, María Morales, Luís Leal, Pedro López, Gilberto Planas, Carlos Rodríguez. Department of Veterinary Pathology Faculty of Veterinary Science, Central University of Venezuela, Aragua State (AM, FG, VB); National Racetrack “La Rinconada” Caracas Venezuela (LL, PL, GP, CR). Maternity “Concepción Palacios” Caracas, Venezuela (MM). Corresponds author: Abelardo Morales Department of Veterinary Pathology Faculty of Veterinary Science, Central University of Venezuela, Aragua State. Building 3, office 3, Campus Maracay. Phone: 058 0243 550 60 29. Telefax: 058 0243 550 60 29. Cell phone: 058 0414 4563101

Aceptado: 02/10/2009

Summaries Reasons for performing study: Equine metabolic syndrome (EMS) is a cluster of problem that includes obesity, insulin resistance and laminitis. In EMS peripheral adipocytes synthesize adipokines which are analogous to cortisol, resulting in Cushing syndrome like-signs and insulin resistance. The used of dexamethasone and triancinolone is very common and not permitted. Hypothesis or Objectives: The objective of this study was to describe metabolic syndrome iatrogenic in Thoroughbred horses. Methods: Were studied 22 Thoroughbred horses (12 female and 10 male), between 2-5 years old, in the national race Track “La Rinconada” Caracas-Venezuela. All equine were euthanized and study by necropsy. Samples were collected from the adrenal glands, gastric mucosa, pancreas, kidneys, liver, spleen, lungs, heart and adenohypofisys. Tissue sections were prepared and stained with Hematoxilin & Eosin (H&E) for light microscopy. Results: Clinical signs were polyury, polydipsy and secondary diabetes mellitus, recurrent infection, lethargie, laminitis and weight loss syndrome. Were isolates of recurrent in-

fection: Salmonella sp., E. coli, Streptococcus sp, Staphylococcus, Enterococcus faecalis and Enterobacter cloacae. Necropsy revealed: weight loss, loss fatty subcutaneous, xantomathosis of subcutaneous tissue. Abscess in coxal tuberous, facial and shoulder region. Liver was swollen, friable and icteric. Renal cortical and papillary necrosis. Equine gastric ulcer syndrome severed. Liver with periacinar necrosis with a prominent acinar pattern and fatty degeneration severed. Necrosis and vacuolar (glycogen) degeneration islets of langerhans, fibrosis and chronic. Renal cortical and medullary necrosis, acute tubular necrosis and glycogen nephrosis, glomerulonephritis membranous. Hemorrhages in adrenal cortex and atrophy cortical. Conclusions: These results suggest a iatrogenic EMS in Thoroughbred associated with overdose and chronic dexamethasone and triancinolona. Potential relevance: This article is a clinical study, laboratory, bacterial, macroscopic and histopathological describing the clinical pathologic presentation of metabolic syndrome pathological in Thoroughbreds horses associated with overdose and chronic dexamethasone and triancinolona. Keys words: Equine, metabolic, Thoroughbred, iatrogenic.

Introduction The term metabolic syndrome (MS) refers to a clustering of risk factors of metabolic origin that promote the development of cardiovascular disease and type 2 diabetes. Metabolic syndrome includes such pathological factors as insulin resistance, hyperinsulinemia, abdominal obesity, impaired glucose tolerance, type 2 diabetes, microalbuminuria, high level of triglycerides, low level of HDL cholesterol, elevated blood pressure, and proinflammatory and prothrombotic state (Pacholczvk et al 2008). Equine metabolic syndrome (EMS) is a cluster of problem that includes obesity, insu-

lin resistance and laminitis. In EMS peripheral adipocytes synthesize adipokines which are analogous to cortisol, resulting in Cushing syndrome like-signs and insulin resistance. In Venezuela phenylbutazone and furosemide only are permitted in the racecourse of Thoroughbred horses. The used of dexamethasone and triancinolone is very common in horses and not permitted in national race trak from Venezuela. Certain management practices tend to promote the development of obesity (metabolic syndrome) in mature horses as they enter their teenage years. These manage-

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Recibido: 08/09/2009

ment practices include the provision of starch-rich (high glycemic index) and fat-supplemented rations to healthy horses that are relatively inactive. Some horse breeds and ponies appear to be genetically predisposed to metabolic syndrome. The accretion of intra-abdominal adiposity by equids is associated with the development of insulin insensitivity (hyperinsulinemia), glucose intolerance, dyslipidemia, hypertension, and insidious-onset laminitis (Johnson 2002; Eustace 2002). Omental adipocytes are metabolically active, secreting free fatty acids and hormonally active mediators including cortisol, leptin, and resistin that might contribute to persistence and worsening of insulin refractoriness and the obese phenotype. We have hypothesized that obesity-associated laminitis arises as a consequence of vascular changes and a hypercoagulable state, similar to the development of atherosclerosis in human type 2 diabetes (Johnson 2002). Several molecular mechanisms that might serve to explain the development of insulin insensitivity as a result of excessive adiposity have been incriminated (Johnson 2002). Obesity, insulin resistance, hyperinsulinemia and hypertriglyceridemia are components of an equine metabolic syndrome phenotype associated with increased laminitis risk in horses. Links between these conditions and laminitis must still be elucidated, but human medicine provides candidate mechanisms for future study, including inflammation associated with obesity, vascular compromise induced by insulin resistance, and endothelial dysfunction (Geor and Frank 2009). Clinically affected horses range in age from 6 to 20 years, but rarely are these horses presented initially as geriatric horses, unless undiagnosed until this time. Breed predilection has been observed and has been reported for some pony breeds, domesticated Spanish mustangs, Peruvian Paso’s, Paso Fines, European Warmbloods, American Saddlebreds, and Morgan Horses. One common similarity among affected horses is a tendency for obesity; specific locations of fat deposition include crest of the neck, over the gluteus region, and in geldings commonly the prepuce is quite thickened with adipose tissue. Affected female horses are noted for their difficulty in being successfully bred and demonstrate abnormal ovarian cycling activity. Managers of affected horses describe these horses to “live on air” and in many cases this is despite a significant effort implemented to try to improve the horses’ body condition. Upon examination of these horses, either with an ultrasound or during exploration of the peritoneal cavity significant intraabdominal fat is observed. In many cases, the presenting complaint includes a history of laminitis, many clinicians have observed the strong association between the development of laminitis in horses with EMS. The objective of this study was to describe metabolic syndrome iatrogenic in Thoroughbred horses. Material and methods Animals: Were studied 22 Thoroughbred horses (12 female and 10 male), between 2-5 years old, in the National Race Track “La Rinconada” Caracas-Venezuela. Clinical signs: were polyury, polydipsy, secondary diabetes mellitus, recurrent infection of skin, lethargie, laminitis and weight loss syndrome (Figure 1). All equine were treatment

with dexamethasone (2,2 mg/kg IA weekly for 2 months) and triamcinolone (0,09 mg/kg IM weekly for 2 months). Hematological and Biochemistry: Bloods of sample were colleted ante mortem (Aluja and Constantino 2002). Samples were process to measure with automatic prosecution equipment: Hemoglobin g/L, Hematocrit %, Protein g/L, Leucocytes x109 /L. Urea Nitrogen mmol/L, Creatinine µmol/L, Glucosa mmol/L, cholesterol mmol/L, Cortisol nmol/L, Bilirrubin Total µmol/L, Unconj µmol/L, Conj µmol/L. Alkaline phosphatase U/L, Lactate dehydrogenase U/L, Sorbitol dehydrogenase U/L, Creatin Phosphokinase U/L, Transaminases Aspartate amino U/L, Alanine amino UL, Albumin and Globulin. Necropsy and histology: All equine were euthanized and study by necropsy (Aluja and Constantino 2002). Samples of tissue were collected from the adrenal glands, gastric mucosa, pancreas, kidneys, liver, spleen, lungs, heart, skin and adenohypofisys (Aluja and Constantino 2002).. Tissue sections were prepared and stained with Hematoxilin & Eosin (H&E) for light microscopy (Banks 1996) Culture: Were isolates of recurrent infection: Salmonella sp., E. coli, Streptococcus sp, Staphylococcus, Enterococcus faecalis and Enterobacter cloacae. Antibiogram revealed whose resistance to gentamicin, ciprofloxacin and nalidixic acid. Results Necropsy: revealed weight loss, loss fatty subcutaneous, xantomathosis of subcutaneous tissue (Figure1). Abscess in coxal tuberous, facial and shoulder region. Multiples hemorrhages in the adrenal cortex (Figure 2). Liver was swollen, friable with fibrosis chronic and icteric. Multifocal necrotic areas were present in the other lobes (Figure 8). Renal cortical and papillary necrosis, acute tubular necrosis (Figure 4). Nine equine (female) presented pyelonefritis abscess and cystitis. Spleen presented severed congestion, hemorrhage. Equine gastric ulcer syndrome severed and ten with colitis chronic (Figure 6). Edema and hemorrhage pulmonary. Petechiae epicardial hemorrhage. Two horses with epicardial abscess. Severe laminitis chronic were observed in all cases with the distal phalanx is torn from the inner hoof wall cells of the lamellar epidermis survive, proliferatite to form the weak, flaky lamellar wedge. The hoof distal phalangeal bond had weakened and the distal phalanx had descended into the hoof capsule. Acrescent-shaped zone of necrosis. Osteomyelitis were observed in 16 equine. Histology: Liver with periacinar necrosis with a prominent acinar pattern and fatty degeneration severed (Figure 9). Centre-acinar necrosis and billirubin cluster. Necrosis and vacuolar (glycogen) degeneration islets of langerhans, fibrosis and chronic. Renal cortical and medullary necrosis, acute tubular necrosis, degeneration vacuolar and glycogen nephrosis, glomerulonephritis membranous (Figure 5). Hemorrhages in adrenal cortex, capsule thickening and atrophy cortical with coagulation necrosis of zona glomerulosa, coagulation necrosis focal zona fasciculata and coagulation necrosis, congestion of the zona reticularis (Figure 3). Spleen germinal center development within the lymphoid follicles should be noted as decreased. Reactive extramedullary hematopoiesis may be seen in conjunction with conditions that

Hematology and biochemistry: value average were Hemoglobin 52-60 g/L, Hematocrit 30-28%, Protein 25-32 g/L, Leucocytes 5,3-6,2 x 109/L. Urea Nitrogen 19-21 mmol/L, Creatinine 125-130 µmol/L, Glucosa 7,27-8,8 mmol/L, cholesterol 4,7-5,4 mmol/L, Cortisol 450-520 nmol/L, Bilirrubin Total 25,2-29,5 µmol/L, Unconj 16,6-18,2 µmol/L, Conj 9,611,3 µmol/L. Alkaline phosphatase 61,0 -62 U/L, Lactate dehydrogenase 17,7-18,1 U/L, Sorbitol dehydrogenase 2,23,6 U/L, Creatin Phosphokinase 46,4-48,1 U/L, Transaminases Aspartate amino 167,2- 170 U/L, Alanine amino 3,84,7 UL. Albumin 22-26 g/L, Globulin 21-25 g/L. Culture: Were isolates of recurrent infection: Salmonella sp., E. coli, Streptococcus sp, Staphylococcus, Enterococcus faecalis and Enterobacter cloacae. Antibiogram revealed whose resistance to gentamicin, ciprofloxacin and nalidixic acid.

Figure 3

Adrenal glands histology showed hemorrhages in with coagulation necrosis ciculata and coagulation & Eosin 10X)

of equine with iatrogenic equine metabolic syndrome adrenal cortex, capsule thickening and atrophy cortical of zona glomerulosa, coagulation necrosis focal zona fasnecrosis, congestion of the zona reticularis (Hematoxilin

Figure 4

Figure 1

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 28, número 2, 2009

target the destruction of lymphocytes. Decreased cellularity of the lymphoid follicles, marginal zone and red pulp region were presented. Chronic gastritis surface, erosion focal and hyperkeratosis infiltrated of lymphocytes in the lamina propria (Figure 7). Chronic colitis lymphoplasmocitic. Laminitis and osteomyelitis were showed cause failure of the hoofdistal phalanx bond the epidermal lamellae are stretched beyond their normal limits and significant epidermal lamellar necrosis.

Kydney of equine with iatrogenic equine metabolic syndrome Renal cortical and papillary necrosis, acute tubular necrosis. Equine with iatrogenic equine metabolic syndrome with weight loss. Abscess in coxal tuberous, facial and shoulder region and lesion of skin.

Figure 5

Figure 2

Adrenal glands of equine with atrophic and multiples hemorrhages in the adrenal cortex Kidneys histology of equine with iatrogenic equine metabolic syndrome acute tubular necrosis and severed degeneration vacuolar. (Hematoxilin & Eosin 20X).

Figure 6

Figure 7

Gastric mucosa histology of equine with iatrogenic equine metabolic syndrome showed chronic gastritis surface, focal ulcer, erosion focal and hyperkeratosis infiltrated of lymphocytes in the lamina propria. (Hematoxilin & Eosin 10 X). Gastric mucosa of equine with iatrogenic equine metabolic syndrome with equine gastric ulcer syndrome severed, multiple ulcers and focal erosion with exposition of lamina propria

Figure 8

Figure 9

Liver of equine with iatrogenic equine metabolic syndrome, swollen, friable with fibrosis chronic and icteric. Multifocal necrotic areas were present in the other lobes

Liver histology of equine with iatrogenic equine metabolic syndrome with periacinar necrosis with a prominent acinar pattern and fatty degeneration severed (Figure 9). Centre-acinar necrosis and billirubin cluster (Hematoxilin & Eosin 20X).

Discussion

Hardman J and Limbird 2003). Interestingly the active adipocytes contain an enzyme called 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type-1 (11betaHSD-1). This enzyme has the critical function of turning inactive cortisone into active cortisol which is the active glucocorticoid. This production of cortisol occurs locally and exerts both paracrine (local) and autocrine (back to the originating cell) effects. Therefore, these adipocytes, due to the presence of 11betaHSD-1 have the capacity to maintain and perpetuate themselves. The overall extent to which 11betaHSD-1 generated cortisol exerts effects in the body as a whole, remains to be determined. New strategies aimed at inhibiting omental 11betaHSD-1 production are believed to be potentially useful for the management of metabolic syndrome. Moreover, although the effects of GC are apparent it is important to recognize that this is not a condition of abnormal adrenal function. Even though glucocorticoid are involved in the pathogenesis of disease, since adrenal function is normal, diagnostic assays designed for detection of altered circulating cortisol levels are within normal limits; subsequently,

These results suggest of an iatrogenic EMS in Thoroughbred. The metabolic syndrome is a common and complex disorder combining obesity, dyslipidemia, hypertension, and insulin resistance. It is a primary risk factor for diabetes and cardiovascular disease. We showed for the first time that the metabolic syndrome is associated with a higher fraction of oxidized LDL and thus with higher levels of circulating oxidized LDL. Hyperinsulinemia and impaired glycaemic control, independent of lipid levels, were associated with increased in vivo LDL oxidation, as reflected by the higher prevalence of high oxidized LDL. High levels of oxidized LDL were associated with increased risk of future myocardial infarction, even after adjustment for LDL-cholesterol and other established cardiovascular risk factors (Jubb et al 1984; Pacholczvk et al 2008). Situations of glucocorticoid excess such as stress or pituitary dysfunction may stimulate the production of hormonally active adipocytes that lead to metabolic syndrome (Botana et al 2002; Eustace 2008;

therapeutic strategies aimed at treating pituitary dysfunction will have no effect on horses with EMS unless there is concurrent pituitary dysfunction present. Studies are now required to determine the exact mechanisms responsible for the increased predisposition to laminitis observed in horses with equine metabolic syndrome (Geor and Frank 2009). In Venezuela is a very common the chronic treatment of dexamethasone and triamcinolone in Thoroughbreds. Cumulative doses of dexamethasone and triamcinolone induce EMS, possibly associated with training, and career management practices. The lesions, necropsy and histology observed in this study are similar to the EMS, with the exception of obesity (Donald 1996; Jubb et al 1984). The multiple organ failures complicating the clinical and compromises the horse’s life. Immunosuppression appears to be one of the consequences that lead to chronic and recurrent in these horses, not responsive to therapy. This syndrome leads to huge economic losses each year in the equine industry. In conclusion our reported a iatrogenic equine metabolic syndrome in Thoroughbred horses from Venezuela associated with overdose and chronic dexamethasone and triancinolona.

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Índices acumulativos de autores Volumen 28 - 2009 Aguzzi Alejandra, Almaguer Marisol Díaz, Aramburú Guillermo,

2009; 28(1): 19, 28 2009; 28(2): 51 2009; 28(1): 19

Benedetta Piergentili, 2009; 28(2): 54 Bermúdez Víctor, 2009; 28(2): 77 Bonfante-Cabarcas Rafael Armando, 2009; 28(2): 66 Bravo Fariñas Laura, 2009; 28(1): 23 Brunocilla Eugenio, 2009; 28(2): 54 Carrizales Maira Soledad, Castro-Escarpulli, Graciela, Correa María Fernanda, Chacón Lozsán Francisco J, Chappi Estévez Yanet, Chávez E. Paredes C,

2009; 28(2): 71 2009; 28(1): 23 2009; 28(1): 36 2009; 28(2): 66 2009; 28(2): 63 2009; 28(1): 43

Daubront Yumar Vanessa, Daza Damelis, Dentale Nicola, Díaz Piñera Addys,

2009; 28(1): 40 2009; 28(2): 66 2009; 28(2): 54 2009; 28(2): 63

Enseñat Sánchez Raimy,

2009; 28(2): 63

Fernández Abreu Anabel, Fiorino Sirio, Fiterre Lancis Irene, Fonseca Gómez C,

2009; 28(1): 23 2009; 28(2): 48 2009; 28(2): 63 2009; 28(2): 61

García Douglas, García Francisco, García Grechen, Gómez Gilberto Pardo, Gómez-Barrios Juan Vicente, González-Mujica Freddy, Guanche Garcell Humberto,

2009; 28(2): 66 2009; 28(2): 77 2009; 28(2): 51 2009; 28(2): 63 2009; 28(1): 2 2009; 28(1): 40 2009; 28(2): 63

Hasegawa Masahisa,

2009; 28(1): 40

Khlaid Yulimir,

2009; 28(2): 71

Leal Luís, López Pedro,

2009; 28(2): 77 2009; 28(2): 77

Majano Mendoza Amanda, Manfredi Roberto, Manfredi Roberto, María Esther Gómez, Márquez M. A. Márquez Mercedes Elena, Martínez Motas Isabel, Martínez Romero María Rosarys, Mederos Cuervo Lilian, Mederos Cuervo LM, Mir Narbona Ioana, Montoro Cardoso Ernesto, Morales Abelardo, Morales María, Motta Norma, Mújica Andrés, Muñoz Marielena, Núñez Fidel,

2009; 28(1): 23 2009; 28(1): 12 2009; 28(2): 48, 54 2009; 28(2): 71 2009; 28(1): 43 2009; 28(2): 71 2009; 28(1): 23 2009; 28(2): 51 2009; 28(1): 23 2009; 28(2): 61 2009; 28(2): 63 2009; 28(2): 51, 61 2009; 28(2): 77 2009; 28(2): 77 2009; 28(1): 40 2009; 28(1): 36 2009; 28(2): 71 2009; 28(1): 23

Peña Yudith, Pisonero Sosias José, Planas Gilberto, Pomier Suárez O, Pultrone Cristian,

2009; 28(2): 71 2009; 28(2): 63 2009; 28(2): 77 2009; 28(2): 61 2009; 28(2): 54

Ramírez A., Ramírez Álvarez Margarita, Ricco Verónica, Rodríguez Carlos, Rodríguez María, Rodríguez Uribe Sandra, Rondón J Cristians G. C.,

2009; 28(1): 43 2009; 28(1): 23 2009; 28(1): 19 2009; 28(2): 77 2009; 28(1): 40 2009; 28(2): 63 2009; 28(1): 43

Sabbatani Sergio, 2009; 28(2): 48 Sánchez M María del Rosario. 2009; 28(1): 31, 36 Sardiña Aragón Misleidis, 2009; 28(2): 51 Sukkar Elias, 2009; 28(2): 71 Sutil de Naranjo Rosalía de Carmen, 2009; 28(2): 71 Tortorici Víctor, Trujillo Avalos A,

2009; 28(1): 2 2009; 28(2): 61

Virga Carolina,

2009; 28(1): 19, 28