Revista avft 4 2012 by felipe espino

Contenido Selective Mastoparan inhibition of muscarinic activation of bovine tracheal smooth muscle Walid Hassan-Soto, Ramona González de Alfonzo, Itala Lippo de Becemberg, Marcelo J. Alfonzo, Lérida Guerra de González

Susceptibilidad in vitro de candida spp. aisladas de la cavidad oral de pacientes VIH/sida a itraconazol, clotrimazol y ketoconazol In vitro susceptibility of Candida spp. isolated fromthe oral cavity of HIV / AIDS patients to itraconazole, clotrimazole and ketoconazole Jerez Puebla, Fernández, Illnait, Perurena, Rodríguez I y Martínez G.

Efecto de la restricción física sobre el papel de los receptores 5-HT1A en la proliferación linfocitaria Matilde Medina Martel, Fili Fazzino; Lucimey Lima

Índice de autores 2012. Volumen 31

Volumen 31, Número 4, 2012

ISSN 0798-0264 Depósito Legal pp. 198202DF62 www.revistaavft.com e-mail: revista.avft@gmail.com

Sociedad Venezolana de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica Dirección: Escuela de Medicina José María Vargas, Cátedra de Farmacología, piso 3, Esquina Pirineos, San José. Caracas - Venezuela. Telfs.:(0212)5619871 - (0414)1361811 (0414) 3805405 Fax: (0212)3214385 www.revistaavft.com e-mail: revista.avft@gmail.com Historia de la revista: AVFT nació en 1982 como una necesidad de tener en Venezuela y Latinoamérica de una revista científica que publique la investigación farmacológica básica y clínica de nuestro país y América Latina, así como la investigación en otras ciencias básicas como Bioquímica, Fisiología, Fisiopatología e Inmunología. Simultáneamente con su creación, también se fundo la Sociedad Interamericana de Farmacología Clínica y Terapéutica y la Sociedad Venezolana de Farmacología y Terapéutica, inmediatamente AVFT se convirtió en el Órgano Oficial de las Sociedades Venezolanas de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica. Se solicito la indización en el Index Médico Latinoamericano y luego AVFT fue seleccionada en los Índices Extramed de la Organización Mundial de la Salud y en el Latinoamericano de Revistas Científicas de la Universidad Autónoma de México. Desde hace una década el FONACIT y el CDCH la apoyan económicamente y la han seleccionada en el Núcleo de Revistas del FONACIT. El FONACIT considera a AVFT como una de las revistas científicas venezolanas arbitradas con contenido más original y de mayor interés. Algunos investigadores connotados como Marcelo Alfonzo, ltala Lippo de Becemberg, Alicia Ponte Sucre, Anita Israel, Luigi Cubeddu, etc. han escogido a AVFT para publicar sus hallazgos básicos y clínicos por su arbitraje, difusión e indización. Actualmente se ha remozado el Comité Editorial y los formatos adecuándolos a las exigencias de índices internacionales como el SCI, Excerpta Medica y Current Contents. A partir de 2002 AVFT se publicará cuatrimestralmente dado la mayor demanda científica. AVFT tradicionalmente ha publicado las reuniones anuales de Farmacología, ASOVAC, Facultad de Farmacia, del Instituto de Medicina Experimental y de Congresos de Farmacología organizados en nuestro país. Periodicidad Trimestral Título abreviado: AVFT

Indices y Bases de Datos: AVFT está incluida en las bases de datos de publicaciones científicas en salud: REDALYC (Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal) ELSEVIER - Scopus de Excerpta Medica SCIELO (Scientific Electronic Library Online) BIREME (Centro Latinoamericano y del Caribe de Información en Ciencias de la Salud) LATINDEX (Sistema Regional de Información en Línea para Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal) Índice de Revistas Latinoamericanas en Ciencias (Universidad Nacional Autónoma de México) LIVECS (Literatura Venezolana de Ciencias de la Salud) LILACS (Literatura Latinoamericana y del Caribe en Ciencias de la Salud) PERIÓDICA (Índices de Revistas Latinoamericanas en Ciencias) REVENCYT (Índice y Biblioteca Electrónica de Revistas Venezolanas de Ciencias y Tecnología) SABER - UCV EBSCO Publishing PROQUEST CLACALIA (Conocimiento Latinoamericano y Caribeño de Libre Acceso)

Copyright Sociedad Venezolana de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica. Derechos reservados. Queda prohibida la reproducción total o parcial de todo el material contenido en la revista sin el consentimiento por escrito del editor en jefe. Patrocinadores Esta revista se financia gracias a los aportes que ofrecen el Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología (FONACIT), y Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la UCV (CDCH). Editor en Jefe Dr. Manuel Velasco Editor Ejecutivo Dr. César Contreras Editores Asociados Dr. Alfonzo Marcelo Dr. Bermúdez Valmore Dr. Cano Clímaco Dr. Contreras Freddy Dr. Cubeddu Luigi Dr. Magaldi Luís Dra. Mathison Yaira Lic. Ortiz Holger Dra. Salazar Mariselis Dra. Sosa Amparo Dra. Stern de Israel, Anita Comité Editorial Abadi Isaac (Venezuela) Acquatella Harry (Venezuela) Alcocer Luís (Méjico) Alfieri Anita (Venezuela) Álvarez De Mont Soto Melchor (España) Arciniegas Enrique (Venezuela)

Bianco Nicolás (Venezuela) Bravo Laura (Cuba) Bonilla Jairo (Colombia) Cabezas Gloria A. (Venezuela) Carmona Oswaldo (Venezuela) Carvajal Ana (Venezuela) Correa Maria Fernanda (Venezuela) Crippa Giuseppe (Italia) De Santis Juan (Venezuela) Di Prisco María C. (Venezuela) Dujovne Carlos A. (Estados Unidos) Fouillioux Christian (Venezuela) Fuenmayor Luis (Venezuela) Gómez Héctor J. (Estados Unidos) Gómez Juanita (Venezuela) Hernández Pieretti Otto (Venezuela) Israili Zafar (Estados Unidos) Lares Mary (Venezuela) Lechin Fuad (Venezuela) Levenson Jaime (Francia) Lynch Neil (Australia) Manfredi Roberto (Italia) Malka Samuel (Venezuela) Martínez Antonio Dalessandro (Venezuela) Mc Lean A.E.M. (Inglaterra) McNay John L. (Estados Unidos) Mederos Lilian (Cuba) Mejías Enrique J. (Venezuela) Meza Carolina (Venezuela) Moncada Salvador (Reino Unido) Moreno Alejandra (Mexico) Naranjo Claudio A. (Canadá) Ponte-Sucre Alicia (Venezuela) Prichard B.N.C. (Inglaterra) Ram Venkata (Estados Unidos) Ramos Alexis (Venezuela) Rivera María (Venezuela) Rodríguez R. Miguel A. (Venezuela) Salazar Margarita (Venezuela) Souki Aida (Venezuela) Urbina Adalberto (Venezuela)

Publicidad Felipe Alberto Espino A. Telf. 0212.881.1907 / 0416. 8116195 felipeespino7@gmail.com Copias de los artículos: Todo pedido de separatas deberá ser gestionado directamente con el editor en jefe, quien gestionará dicha solicitud ante la editorial encargada de la publicación.

Normas Esta revista cumple con los estándares de “Requerimientos uniformes para Manuscritos Publicados en Revistas Biomédicas” o normas de Vancouver. NEJM 2006; 336 (4):309-315

Correo electrónico Editor en Jefe: Dr. Manuel Velasco E-Mail: veIoscom@cantv.net www.scielo.org.ve

www.revistaavft.com Diseño de portada y diagramación Mayra Gabriela Espino Blanco Telefono: 0412-922.25.68

E-mail: mayraespino@gmail.com

Instrucciones a los Autores Alcance y política editorial La revista AVFT es una publicación biomédica periódica, arbitrada, de aparición semestral, destinada a promover la productividad científica de la comunidad nacional e internacional en todas las áreas de Ciencias de la Salud y Educación en Salud; la divulgación de artículos científicos y tecnológicos originales y artículos de revisión por invitación del Cómité Editorial. Está basada en la existencia de un Comité de Redacción, consistente en un EditorDirector, Editores asociados principales y Comisión Editorial y Redactora. Los manuscritos que publica pueden ser de autores nacionales o extranjeros, residentes o no en Venezuela, en castellano (con resumen en idioma inglés y castellano) y deben ser remitidos a la Redacción de la Revista. Los manuscritos deben ser trabajos inéditos. Su aceptación por el comité de redacción implica que no ha sido publicado ni está en proceso de publicación en otra revista, en forma parcial o total. El manuscrito debe ir acompañado de una carta solicitud firmada por el autor principal y el resto de los autores responsables del mismo. En caso de ser aceptado, el Comité de Redacción no se hace responsable con el contenido expresado en el trabajo publicado. Aquellos que no se acojan a las condiciones indicadas, que sean rechazados por lo menos por dos árbitros que dictaminen sobre su calidad y contenido, y que no cumplan con las instrucciones a los autores señalados en otro aparte, no serán publicados y devueltos en consecuencia a los autores. Forma de preparación de los manuscritos Para la publicación de trabajos científicos en la revista AVFT, los mismos estarán de acuerdo con los requisitos originales para su publicación en Revistas Biomédicas, según el Comité Internacional de Editores de Revistas Biomédicas (Annal of Internal Medicine 2006:126(1):36-47). Además, los editores asumen que los autores de los artículos conocen y han aplicado en sus estudios la ética de experimentación (Declaración de Helsinki). A tales efectos, los manuscritos deben seguir las instrucciones siguientes: 1. Mecanografiar original a doble espacio en idioma español, papel Bond blanco, 216 x 279 mm (tamaño carta) con márgenes por lo menos de 25 mm, en una sola cara del papel. Usar doble espacio en todo el original. Su longitud no debe exceder las 10 páginas, excluyendo el espacio destinado a figuras y leyendas (4-5) y tablas (4-5). 2. Cada uno de los componentes del original deberán comenzar en página aparte, en la secuencia siguiente: a. Página del título. b. Resumen y palabras claves. Se recomienda a los autores de los artículos al colocar las palabras clave utilicen el DECS (Descriptores en Ciencias de la Salud) que puede ser consultado en la siguiente dirección: http.//decs.bvs.br c. Texto. d. Agradecimientos. e. Referencias. f. Tablas: cada una de las tablas en páginas apartes, completas, con título y llamadas al pie de la tabla. g. Para la leyenda de las ilustraciones: use una hoja de papel distinta para comenzar cada sección. Enumere las páginas correlativamente empezando por el título. El número de la página deberá colocarse en el ángulo superior izquierdo de la misma. 3. La página del título deberá contener: 3.1. Título del artículo, conciso pero informativo. a. Corto encabezamiento de página, no mayor de cuarenta caracteres (contando letras y espacios) como pie de página, en la página del titulo con su respectiva identificación. b. Primer nombre de pila, segundo nombre de pila y apellido (con una llamada para identificar al pie de página el más alto grado académico que ostenta y lugar actual donde desempeña sus tareas el(los) autores. c. El nombre del departamento(s) o instituciones a quienes se les atribuye el trabajo. d. Nombre y dirección electrónica del autor a quien se le puede solicitar separatas o aclaratorias en relación con el manuscrito. e. La fuente que ha permitido auspiciar con ayuda económica: equipos, medicamentos o todo el conjunto. f. Debe colocarse la fecha en la cual fue consignado el manuscrito para la publicación. 4. La segunda página contiene un resumen en español y su versión en inglés, cada uno de los cuales tendrá un máximo de 150 palabras. En ambos textos se condensan: propósitos de la investigación, estudio, método empleado, resultados (datos específicos, significados estadísticos si fuese posible) y conclusiones. Favor hacer énfasis en los aspectos nuevos e importantes del estudio o de las observaciones. Inmediatamente después del resumen, proporcionar o identificar como tales: 3-10 palabras claves o frases cortas que ayuden a los indexadores

en la construcción de índices cruzados de su artículo y que puedan publicarse con el resumen, utilice los términos del encabezamiento temático (Medical Subject Heading) del Index Medicus, cuando sea posible. 5. En cuanto al texto, generalmente debe dividirse en: introducción, materiales y método, resultados y discusión. 6. Agradecimientos, sólo a las personas que han hecho contribuciones reales al estudio. 7. Las citas de los trabajos consultados seguirán los requisitos de uniformidad para manuscritos presentados a revistas Biomédicas, versión publicada en: Annal of Internal Medicine 2006; 126(1): 36-47. www.icmje.com. No se aceptarán trabajos que no se ajusten a las normas. 8. Tablas: En hoja aparte cada tabla, mecanografiada a doble espacio; no presentar tablas fotográficas; enumere las tablas correlativamente y proporcione un título breve para cada una; dé a cada columna un encabezamiento corto o abreviado; coloque material explicativo en notas al pie de la tabla y no en el encabezamiento; explique en notas al pie de la tabla las abreviaturas no estandarizadas usadas en cada tabla; identifique claramente las medidas estadísticas de las variables tales como desviación estándar y error estándar de la medida; no use líneas horizontales ni verticales: citar cada tabla en orden correlativo dentro del texto; citar la fuente de información al pie de la tabla si ésta no es original. 9. Ilustraciones: Deben ser de buena calidad; entregarlas separadas; las fotos, en papel brillante con fondo blanco, generalmente 9 x 12 cm. Las fotografías de especímenes anatómicos, o las de lesiones o de personas, deberán tener suficiente nitidez como para identificar claramente todos los detalles importantes. En caso de tratarse de fotos en colores, los gastos de su impresión correrán a cargo del autore(s) del trabajo. Lo mismo sucederá con las figuras que superen el número de cuatro. Todas las figuras deberán llevar un rótulo engomado en el reverso y en la parte superior de la ilustración indicando número de la figura, apellidos y nombres de los autores. No escribir en la parte posterior de la figura. Si usa fotografía de personas, trate de que ésta no sea identificable o acompañarla de autorización escrita de la misma. Las leyendas de las ilustraciones deben ser mecanografiadas a doble espacio en página aparte y usar el número que corresponde a cada ilustración. Cuando se usen símbolos y fechas, números o letras para identificar partes en las ilustraciones, identifíquelas y explíquelas claramente cada una en la leyenda. Si se trata de microfotografía, explique la escala e identifique el método de coloración. 10. Envíe un original y dos copias impresas en un sobre de papel grueso, incluyendo copias fotográficas y figuras entre cartones para evitar que se doblen, simultáneamente envíe una versión electrónica en CD o a través del e-mail: revista. avft@gmail.com, indicando el programa de archivo. Las fotografías deben venir en sobre aparte. Los originales deben acompañarse de una carta de presentación del autor en la que se responsabiliza de la correspondencia en relación a los originales. En ella debe declarar que conoce los originales y han sido aprobados por todos los autores; el tipo de artículo presentado, información sobre la no publicación anterior en otra revista, congresos donde ha sido presentado y si se ha usado como trabajo de ascenso. Acuerdo a asumir los costos de su impresión en caso de fotos a color, autorización para reproducir el material ya publicado o ilustraciones que identifiquen a personas. 11. Los artículos a publicarse, pueden ser: originales, revisiones, casos clínicos, y cartas al editor. 12. Cuando se refiere a originales, queda entendido que no se enviará artículo sobre un trabajo que haya sido publicado o que haya sido aceptado para su publicación en alguna parte. 13. Todos los trabajos serán consultados por lo menos por dos árbitros en la especialidad respectiva. 14. La revista AVFT, no se hace solidaria con las opiniones personales expresadas por los autores en sus trabajos, ni se responsabiliza por el estado en el que está redactado cada texto. 15. Todos los aspectos no previstos por el presente reglamento serán resueltos por el Comité Editorial de la Revista. 16. La revista apoya las políticas para registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journall Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de esas iniciativas pera el registro y divulgación internacional de Información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se aceptarán para publicación, a partir de 2007, los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayo Clínicos validados por los criterios establecidos por OMS e ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de Identificación se deberá registrar al final del resumen.

Editorial Es un honor que se me concede el poder escribir un editorial en esta prestigiosa revista venezolana con proyección internacional, registrada en los más importantes Índices y Bases de Datos como son SCIENCE CITATION INDEX, JOURNAL CITATION REPORT/SCIENCE EDITION, REDALYC, ELSERVIER, SCIELO, BIREME, LILACS, PERIODICA y otras más; pero es mucho más honroso cuando puedo tomar la ocasión para homenajear a un destacado médico venezolano, profesor universitario de muchos años, excelente amigo y quien además profesa algo que cada día es más raro como es un profundo amor por Dios y por la familia; me refiero al fundador y Editor principal de esta revista, AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica, el Dr. Manuel Velasco. La razón es que Manuel Velasco ha sido honrado por la Academia Nacional de Medicina al designarlo como ganador del Premio "Fundación Juan Alberto Olivares" en su décima segunda edición , “como un reconocimiento a su encomiable labor durante tantos años que ha prestado en el campo de la Farmacología”, premio que le será entregado el día 13 de diciembre del año en curso a las 10:00 a.m. en el Salón de Sesiones de esa Institución en el majestuoso Palacio de las Academias, en el edificio que fuera sede de la Universidad Central de Venezuela, Institución ícono de la educación superior en Venezuela, fundada en 1.721 como “Real y Pontificio Seminario Universidad Santa Rosa de Lima de Santiago de León del Valle Caracas”, la cual recibió el nombre de Universidad Central de Venezuela en 1826 siendo su sede el Seminario de Santa Rosa hasta el año 1.953 cuando pasa a la Ciudad Universitaria de Caracas, proyectada arquitectónicamente por el maestro Carlos Raúl Villanueva, declarada Patrimonio Cultural de la Humanidad por la UNESCO el 30 de Noviembre del año 2000. El Dr. Manuel de Jesús nació en la población de Santa Bárbara de Barinas el 28 de noviembre de hace algunos años; realizó estudios de secundaria en Los Teques y estudios de Medicina en la UCV obteniendo el título de Médico Cirujano en 1.968. Luego realizó internado de Medicina Interna con énfasis en Farmacología Clínica en el Hahnemann Medical College and Hospital, Philadelphia, Pa., USA de julio 1971 a junio 1972 bajo la supervisión del Dr. John Nodine, completando estos estudios con un Fellowship en Medicina Interna (Farmacología Clínica), en el Emory University School of Medicine, Atlanta, Ga., USA., desde julio de 1972 hasta diciembre de 1974. En la Universidad Nacional del Zulia, Maracaibo, Estado Zulia, en 1979 obtuvo el Doctorado en Medicina, realizando con tal fin la tesis: Vasodilatadores en Hipertensión, tema que marcaría en lo sucesivo su preferencia por la farmacoterapia cardiovascular, en el cual se ha destacado de manera sorprendente no sólo en Venezuela sino en toda Latinoamérica y lo ha colocado entre los líderes de esta parte del mundo en hipertensión arterial, patología de gran prevalencia en nuestros países. Su pasión por la farmacología clínica lo llevó a realizar el Curso avanzado de Farmacología Clínica en el Royal College of Physicians, Edinburgh, UK, en 1991, curso que alternó con Metodología de Radioisotopos en el Hahnemann Medical College and Hospital, Philadelphia, Pa., USA, 1971, Curso avanzado de Bioestadística en el Emory University School of Medicine, Atlanta, Ga., USA, 1972 y Curso Médico de Radioisotopos, Oak Ridge Associated Universities, Oak Ridge, Tenn., USA, 1974. Ha ejercido diferentes cargos docentes en el área de la farmacología, iniciando como preparador de farmacología en la Escuela de Medicina Luis Razetti en 1.966 hasta llegar a profesor titular en 1.983 y en la Escuela José María Vargas desde 1987 hasta 1.993 y luego Jefe del Departamento de Ciencias Fisiológicas de la Escuela de Medicina Vargas desde 1.993 hasta 1.997. Repite como Jefe de Cátedra de Farmacología 1997 hasta el 2003 y por sus innegables dotes en la dirección de esta cátedra fue nombrado Coordinador General de la Facultad de Medicina de la UCV del 2002 al 2005. Ha ejercido los siguientes cargos asistenciales: Médico Adjunto del Servicio de Cardiología del Hospital Vargas, Caracas, Venezuela, desde 1975; Médico Adjunto de la Unidad de Hipertensión, Hospital Vargas, desde 1976; Director de la Unidad de Farmacología Clínica, Hospital Vargas, desde 1976; Director de la Unidad de Hipertensión, Hospital Vargas, desde 1985 y Director de la Unidad de Farmacología Clínica Cardiovascular y Respiratoria de la Escuela de Medicina Vargas, desde 2002. Este infatigable investigador y docente ha recibido numerosos reconocimientos tanto en nuestro país como en el exterior, entre los que se encuentran reconocimiento por la Asociación Médica Americana , USA, 1974; Colegio Médico de Costa Rica, 1979; Sociedad de Cardiología de República Dominicana, 1980; Escuela de Medicina Vargas, UCV, 1985; Sociedad Interamericana de Farmacología Clínica y Terapéutica, Caracas, 1988 (Presidente Honorario Vitalicio); Fundación Procardias, Montevideo, Uruguay, 1990; Sociedad de Cardiología de Guayaquil, Ecuador, 1991; CONICIT, Sistema de Promoción al Investigador (PPI) - Nivel III, 1992 y muchos otros. Además de todos estos reconocimientos, un elemento que le ha significado un homenaje altamente meritorio son las diferentes condecoraciones que le han otorgado, como son: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

Orden Ex-Libris, Asociación de Escritores del Estado Miranda, 1985 Orden Leonidas Monasterios (Primera Clase), Asamblea Legislativa del Estado Miranda, 1986 Orden Roque Pinto, 1986 Orden Guaicaipuro (Primera Clase), Concejo Municipal del Distrito Guaicaipuro, Estado Miranda, 1988 Orden Teófilo Moros, Gobernación del Estado Miranda, 1993 Orden al Mérito en el Trabajo (Primera Clase), Ministerio de Sanidad y Asistencia Social, 1993 Orden José María Vargas (Primera Clase), Universidad Central de Venezuela, 1996 Orden Cecilio Acosta (Primera Clase), Gobernación del Estado Miranda, 1997 Orden Honor al Mérito, Gobernación del Estado Miranda, 1997 Orden Francisco de Venanzi, Universidad Central de Venezuela, 1998 Orden Dr. Humberto Fernández Morán (Primera Clase), Cepro-Salud, 2000 Visitante distinguido, Gobernación del Estado Zulia, 9 de Julio de 2001, Maracaibo. Venezuela Botón de Mérito, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, 9 de Julio de 2001, Maracaibo, Venezuela Orden General en Jefe José Laurencio Silva, Alcaldía de Tinaco, Estado Cojedes, 7 de Septiembre de 2001 Orden Universidad Central de Venezuela, Consejo Universitario de la UCV, 5 de Octubre de 2001, Caracas. Venezuela Presidente Honorario Vitalicio, Sociedad Venezolana de Farmacología Clínica y Terapéutica, 2001, jueves 8 de Noviembre de 2001, Hotel Caracas Hilton, Caracas. Venezuela.

Es miembro de casi 30 Sociedades Científicas venezolanas, norteamericanas y europeas y ha sido presidente o vicepresidente de innumerables congresos médicos. Relatar la vida de este insigne personaje de la medicina venezolana es casi imposible en tan poco espacio pero el espacio que ocupa en las mentes y corazones de gran número de médicos venezolanos compensa la falta de espacio en papel. Vaya para el Dr. Manuel Velasco todo mi reconocimiento y admiración por esta dilatada trayectoria y por el merecido homenaje que recibe en esta ocasión por la Academia Nacional de Medicina. César Contreras Editor Asociado

Selective Mastoparan inhibition of muscarinic activation of bovine tracheal smooth muscle Walid Hassan-Soto, 2Lérida Guerra de González, 3Ramona González de Alfonzo, 4Itala Lippo de Becemberg and 5Marcelo J. Alfonzo* Magister Scientiarum en Bioquímica. 2 Doctora en Bioquímica, 3 Doctora en Bioquímica, Biología Celular y Molecular, 4 Doctora en Medicina 5 Doctor en Bioquímica, Biología Celular y Molecular 1 1

Corresponding Author*: Dr. Marcelo J. Alfonzo. Sección de Biomembranas. Instituto de Medicina Experimental. Facultad de Medicina Universidad Central de Venezuela. Ciudad Universitaria. Caracas. Venezuela. Teléfono: 0212-605-3654. Email: hmag5@hotmail.com

Aceptado: 21/01/2012

Muscarinic activation of bovine tracheal smooth muscle (BTSM) leading to smooth muscle contraction involves the generation of two cGMP signals (20 and 60 s), being 20s peak associated with soluble (sGC) and the second (60s) to membrane-bound Natriuretic Peptide- receptor-Guanylylcyclases (NPR-GC). In this study, we showed that pre-incubation of isolated BTSM strips with mastoparan and superactive mastoparan (mastoparan 7) decreased significantly the muscarinic dependent contractile smooth muscle responses in dose-dependent and non-competitive manner. Moreover, mastoparan (50 nM) inhibited completely the BTSM-muscarinic contractile responses and affected dramatically the carbachol-dependent cGMP signals being the first cGMP signal inhibited in a 63 ± 5%, whereas the second signal disappeared. Mastoparan inhibition of muscarinic activation is specific since other spasmogens as serotonin and histamine fully contracted these BTSM strips under mastoparan treatment. Cyclic GMP levels were evaluated by exposing BTSM strips to activators of NO-sensitive sGC as Sodium Nitroprussiate (SNP) and Natriuretic Peptides as CNP-53 for membrane-bound NPR-GC. Thus, SNP and CNP increased in a binary way, in more than 20 fold cGMP levels at 30-40 s being both increments inhibited by mastoparan. Furthermore, the Gi/o-protein involvement on mastoparan inhibition of cGMP

elevations induced by CNP and SNP is suggested by Pertussis toxin pre-treatment, which reversed mastoparan effects. These results indicate that muscarinic signal transduction cascades leading to airway smooth muscle contractions involved two different guanylyl cyclases being both regulated by mastoparan-sensitive G-proteins. Abbreviations: ANP, Natriuretic Peptide type A; ASM, Airway Smooth Muscle; BTSM, Bovine Tracheal Smooth Muscle; CNP-53, Natriuretic Peptide type C-53; GPCR, G-Protein Coupled Receptor; Gq16, Heterotrimeric G protein subtype 16; Gi/o, Heterotrimeric G protein subtype i/o; m2AChR, muscarinic receptor type 2; m3AchR, muscarinic receptor type 3; NP, Natriuretic Peptides; NPR-GC, Natriuretic Peptides Receptor Guanylyl Cyclase; NPR-A, Natriuretic Peptides Receptor Guanylyl Cyclase type A ; NPR-B, Natriuretic Peptides Receptor Guanylyl Cyclase type B; PTX, Pertussis Toxin; sGC, soluble Guanylyl Cyclase; SNP, sodium nitroprusside; ODQ, 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one; PDE, cyclic nucleotide phosphosdi-esterase; TCA, tricloroacetic acid and BTSM, Bovine tracheal smooth muscle. Key words: Tracheal smooth muscle; carbachol; mastoparan; soluble guanylyl cyclase; Natriuretic Peptide Receptor-guanylyl cyclase.

Resumen La activación muscarínica del músculo liso de las vías aéreas relacionada a la contracción de dicho músculo liso esta asociada a la generación de dos señales de GMPc (20 y 60 s), siendo la señal de los 20s relacionado a la activación de la guanililciclasa soluble mientras que el pico de los 60s a la guanililciclasa unida membranas y sensible a péptidos natriuréticos (NPR-GC). En este trabajo, nosotros mostramos que la pre-incubación de fragmentos del músculo liso traqueal de bovino (BTSM) con mastoparan y su análogo superactivo (mastoparan 7), en una forma dosis dependiente, son capa-

ces de disminuir de manera significativa la actividad contráctil dependiente de agentes muscarinicos. Adicionalmente, mastoparan (50 nM) inhibió completamente la respuesta contráctil muscarinica del BTSM y afectó dramáticamente los picos de GMPc asociados a la activación muscarinica siendo la primera señal inhibida en un 63 ± 5%, mientras que la segunda señal desapareció completamente. Esta inhibición del mastoparan de la activación muscarínica es especifica ya que otros espamogenos como la serotonina y la histamina fueron capaces de inducir respuestas máximas en presen-

Volumen 31, número 4, 2012

Abstract

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

Recibido: 20/09/2011

cia del mastoparan y su análogos. Este efecto del mastoparan sobre los niveles del GMPc fue evaluado en presencia de otros agentes generadores de este segundo mensajero como son el nitroprusiato de sodio (SNP) que activa la guanililciclasa soluble sensible a NO y los péptidos natriureticos como el CNP-53 (CNP) activador de la NPR-GC asociada a membranas plasmáticas. Tanto, el SNP como el CNP aumentaron en mas de 50 veces los niveles de GMPc a los 30-40 s en forma bifasica, siendo estos incrementos inhibidos de manera significativa por el mastoparan. Ademas, se sugiere la participación de proteínas Gi/o en los efectos inhibitorios del mastoparan, porque la Toxina pertussis revertió los efectos inhibitorios. Estos resultados indican que la cascada de activación muscarinica que conduce a la contracción del músculo liso de las vías aéreas involucra a 2 diferentes guanililciclasas y ambas son reguladas por proteínas G sensibles al mastoparan. Palabras claves: Músculo liso traqueal, carbamilcolina, mastoparan, guanililciclasa soluble, guanililciclasa sensible a péptidos natriúreticos.

Introduction Muscarinic activation is physiologically responsible for the contraction of the airways smooth muscle (ASM)1. Thus, the interaction between ACh with its muscarinic receptors (mAChRs), causes the contraction of the ASM, the mucous secretion stimulation and increase in the ion transport through epithelia of the airways, which can be associated to bronchial hyper-reactivity presents in bronchial asthma2.

The muscarinic-dependent contraction of the ASM is initiated by mAChRs activation at the smooth muscle sarcolemma leading to the generation of the second messengers such as cGMP3, being this cyclic nucleotide involves, in both, the contraction3,4 or relaxation5 of the ASM. Airway smooth muscle cells have two sources of cGMP, one is associated with the activation of an hemoprotein, NO-sensitive guanylyl cyclase (sGC) mainly located at the cytoplasm and the second ones is related to Natriuretic Peptide Receptor guanylyl cyclases (NPR-GC) at the ASM sarcolemma6. Two mAChRs (m2 and m3) subtypes are present at tracheal smooth muscle with m2/m3 (4/1) ratio in most of smooth muscles studied7,8. These two receptors can interact, in opposite way, with the NPR-GC located at smooth muscle sarcolemma6,9. Thus, m2AChRs and m3AChRs are coupled to Gq16 and Gi/o proteins respectively, which mediate the NPRGC stimulation, via Gq16 10 and via Gi/o proteins, the inhibition of this NPR-GC6. These two G proteins are sensitive to mastoparan, a cationic tetradecapeptide isolated from the wasp venom Vespula lewisii11. Mastoparan activates directly G proteins increasing the GTP/GDP exchange activity, which mimics the GDP/GTP Exchange Factor (GEF) activity associated with some G proteins coupled receptors (GPCR)12.

Therefore, muscarinic activation of bovine tracheal smooth muscle (BTSM) is mediated by G-proteins and mastoparan can influence this activation. Thus, in the present work, we studied the effects of mastoparan on the muscarinic activation of BTSM, specifically on some biological activities induced by muscarinic agonist (carbachol): 1.- The ASM contractile responses and 2.- the cGMP signals associated with such activation. Furthermore, the mastoparan effects were evaluated in the presence of others tracheal smooth muscle cGMP elevating substances such as Sodium Nitroprusside (SNP), which is a NO donor and a classic activator of the sGC13 and the Natriuretic Peptides (CNP53) to stimulate the plasma membrane bound NPR-GC-B14 being both enzymes locate in this smooth muscle type. Materials and Methods Materials Atropine, carbachol, EDTA, glucose, histamine, serotonin and Pertussis toxin were purchased from Sigma Chemical Company. CNP, mastoparan and mastoparan 7 were obtained from American Peptide Co. Chemical reagents and salts were obtained from Merck and Fisher Co. Cyclic [8,5-3H]GMP (25-50 Ci/mmol) and Liquifluor were purchased from New England Nuclear. Diethylether from BDH-Chemicals GPR. Biotra Assay System TRK 500 for determination of cGMP from Amersham-GE. Preparation of Bovine tracheal smooth muscle Tracheal smooth muscle was dissected from fresh bovine tracheas obtained from the local slaughterhouse and transferred to the laboratory in solution Krebs Ringer- Bicarbonate (KRB), the composition of this KRB in mM is : NaCl 118.5; KCl 4.47; MgS04 1.18; KH2P04 1.18; CaCl2 2.54; NaHC03 24.9; Glucose 10; pH: 7.4. Once dissected the smooth muscle was placed in the buffer KRB bubbled with a mixture of 95% O2/5% CO2 at room temperature. Fresh KRB was replaced each 30 min. BTSM strips were employed within 3 hours, after dissection. Incubation of Smooth Muscle Fragments The evaluation of smooth muscle contraction and nucleotide concentration was performed using two procedures as previously described4. Procedure 1: Briefly, smooth muscle fragments were placed into an organ bath (20 mL) and equilibrated for 1 hr in KRB with 95% O2 and 5% CO2 (pH 7.4) at 37°, with medium replacement every 30 min. Strips were loaded with 1 g of tension, and the contraction was expressed as an increase in tension of these preparations, measured isometrically by using a force displacement transducer (Grass model FT03) attached to a polygraph (Grass model 7-B). After 1 hr of incubation, the different pharmacological agents (less than 20 μL) were added. Later, the bath was drained rapidly, and the strip was frozen in liquid nitrogen. The latter step took around 5 s. Procedure 2: Smooth muscle strips were placed into a specially designed multi-organ chamber with a volume of 400 mL.

These results suggest that mastoparans behave as “noncompetitive” inhibitors of smooth muscle contraction induced by muscarinic agonists. Figure 1A

Volumen 31, número 4, 2012

Measurement of Cyclic GMP Briefly, frozen samples were thawed and homogenized in 6% TCA as previously described4. TCA extractions were performed twice, and the insoluble material was removed by centrifugation at 1500x g for 10 min at 4°. The insoluble material was processed for protein determination as described later. The acid supernatants were combined, extracted twice with water-saturated diethylether to remove TCA, frozen in liquid nitrogen, and lyophilized. The acid-soluble lyophilized material was dissolved in a small volume of 50 mM Tris, 4 mM EDTA, pH 7.4, that was named the acid-soluble nucleotide extract, which was kept frozen at -80°. In each experiment, some untreated frozen strips were used to evaluate the cyclic nucleotide recovery following the procedure described latter. For this assay, 0.4 pmol of [3H]cGMP was added to some samples, and the recovery was between 95 and 98% for this labeled nucleotide. This recovery rate was assumed to be the same for all samples. cGMP was determined using a radioimmunoassay as previously described4 with a commercial kit (TRK 500) from Amersham. TCA-insoluble material was dissolved in 2 mL of 1 N NaOH and incubated at room temperature during overnight and later was diluted five times to determine total tissue protein content by using a procedure described elsewhere15.

However, we estimated EC50 values for CC in all curves with values around EC50 = 1.0 ± 0.3 x 10-7 M. In respect to MP ability to alter BTSM contractile activities, it was found that MP-7 acting in the pM range was more powerful than MP, in the nM range. In this sense, MP (50nM) inhibited completely the BTSM contraction induced by carbachol (1x10-4M). These maximal concentrations of mastoparan and carbachol were used through this study.

Figure 1B

Cyclic nucleotide values are presented as pmoles cGMP /mg of total tissue protein. There were no differences in the cyclic nucleotide responses to the agents tested under the two experimental procedures as above described.

Results BTSM strips, after 1 hr of stabilization using Procedure 1, were pre-incubated for 15 min under three different experimental conditions. Thus, the first condition was in the presence of mastoparan (MP), a second with super-active mastoparan analog as mastoparan 7 (MP-7) and a third, without mastoparans (Control condition). After, this pre-treatment, carbachol (CC) cumulative concentrations curves of the smooth muscle contractile activities were measured during 3 min, after each agonist addition. In Control condition, at CC amounts higher than 1 x 10-5 M, the smooth muscle contraction reached a plateau being maximal at 1 x 10-4 M CC. These carbachol concentration dependent activation curves as Control condition are shown in Figure 1A, B. In addition, the carbachol-dependent smooth muscle contractile responses were significantly affected by MP (Fig 1A) and MP-7 (Fig 1B). Moreover, both tetradecapeptides decreased, in a dose dependent manner, the BTSM maximal contractile activities.

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

This chamber has a system of aeration with 95% O2 and 5% CO2, and it is able to hold simultaneously some 16 strips at 37°, at 1g of tension. After addition of drugs, individual fragments were removed from the chamber, every 10 s and placed into liquid nitrogen (within less than 1s). Samples were kept in liquid nitrogen until nucleotide extraction was performed.

Figure 1. Carbachol cumulative concentration curves responses from BTSM, pretreated with mastoparan and mastoparan 7. The contractile activity was measured using Procedure 1 as described in Methods. Carbachol cumulative responses using concentrations from 1x10–9 M to 1x10–4 M were measured in recording period until 3 min. Mastoparan and mastoparan 7 were pre-incubated for 10 min before the muscarinic agonist (carbachol) addition. Figure 1A: Mastoparan: Experimental conditions: (■) Control, (▲) 0.5nM (▼) 1 nM (⊄) 5 nM (ϒ) 10 nM (∉) 50nM. Figure 1B: Mastoparan 7: Experimental conditions: (■) control, (▼) 5pM, (⊄) 10pM, (∉) 20pM. The maximal contractile activity was considered as 100% (3.2 ± 0.2 g) and this value was used to estimate other contractile responses. Each value is the mean ± SEM of three different tracheas assayed in duplicate. Statistical significant difference between the control with respect to mastoparan as indicated with asterisk (*p<0.05).

The powerful inhibition exerts by mastoparans on BTSM muscarinic activation suggests that mastoparans may be affecting the BTSM contractile machinery. To test that proposition using Procedure 1, a set of experiments performed with other classic spasmogens of TSM as 5 HT or histamine, which were assayed with the same BTSM strip, in which mastoparan blocked the muscarinic agonist activation. In this sense, the serotoninergic and histaminergic contractile responses were evaluated. A BTSM powerful contraction induced by 5-hydroxytryptamine (5-HT) or serotonin (1 x 10-4 M) is shown in Figure 2A. Similar set of experiments were performed with histamine (1x 10-3 M) and a mastoparan-insensitive potent histamine contractile response was observed, which is shown in Figure 2B. Both the serotoninergic and histaminergic contractile responses of BTSM were not affected by muscarinic antagonist atropine (1 x 10–4 M). However, selective 5 HT or histamine antagonists were not assayed to block these serotoninergic and histaminergic contractile responses because our main interest was to show that BTSM still physiologically active. These results suggest that mastoparan seems to be a specific inhibitor of this muscarinic activation system without affecting the smooth muscle sarcolemma integrity and the contractile machinery functionality. Figure 2A

75 Figure 2B

Figure 2. Serotonin and histamine induced BTSM contractile responses. Figure 2A. BTSM strips were stabilized for 1 h and later mastoparan (50 nM) was added for 10 min, followed by carbachol (CC) (1x 10-4 M), serotonin or 5- hydroxytryptamine (5-HT) (1x 10-4 M) and Atropine (AT) (1x10-4M) was added. Values between parentheses are the final concentration of drugs in the incubation media. This trace is representative of 3 experiments performed with 3 different tracheas. Figure 2B. BTSM strips were pre-treated for 10 min with mastoparan (50 nM), followed by carbachol (CC) (1x 10-4 M), and Histamine (His) (1 x10-3 M), and Atropine (AT) (1x10-4M) was added. Values between parentheses are the final concentration of drugs in the incubation media. This trace is representative of 3 experiments performed with 3 different tracheas.

Muscarinic activation of BTSM induced two cGMP signal peaks being the first peak at 20s and the second at 60 s as previously described4. In order to evaluate, these cGMP signals linked to muscarinic activation, several kinetic studies (0-70s) were undertaken. In this sense, mastoparan (50 nM) significantly altered the first signal (20s), that was partially inhibited 63 ± 2 % and the second signal (60s) disappeared (Figure 3). These results suggest that mastoparan is altering, both cGMP signals exerting a more profound effect on the 60 s peak, which is associated with the NPR-GC. Interestingly, the first signal (20s) was significantly inhibited by this tetradecapeptide. Taking into consideration, that mastoparan affected the two cGMP signals; it was decided to explore the origin of these two signals, which are related to specific guanylyl cyclases as above mentioned. The dramatic disappearance of the second peak (60s) was initially investigated. This second signal of cGMP is product of a cascade coupling mAChRs to NPR-GC9,10. CNP-53 is the specific ligand activator for the NPR-GC-B in BTSM14,16. From previous experiments, it was found that CNP53 (1x10-7 M) induced the maximal cGMP levels in the intact BTSM. Interestingly, in the “basal” condition, a cGMP binary pattern emerged under CNP (1x10-7 M) action, with a fast rise at 30 s in cGMP levels reaching maximal values (37 ± 2 pmol/ mg total tissue protein), followed by a slow decline remaining higher at 70s (Figure 4). However, in the presence of mastoparan, this distinct behavior remained but significant lower values were observed (Figure 4). It has been reported that NPR-GC-B is coupled to PTX and mastoparan-sensitive heterotrimeric Gi/o proteins9,10,16. Interestingly, PTX pre-treatment reversed the mastoparan inhibitory effect on the production of cGMP induced by CNP-53 at intact BTSM strips (Figure 4). On the other hand, the first cGMP signal (20s) is linked to mAChR activation at the plasma membrane triggering a signal transducing cascade that leads to the stimulation of an ODQsensitive sGC as previously reported4. This NO-sensitive sGC was evaluated using a NO donor such as Sodium Nitroprusside (SNP)13. Thus, SNP (50 µM) in BTSM strips produced a cGMP parabolic-like binary pattern reaching maximal values (35 ± 3 pmol/mg total tissue protein) around 40 s, followed by cGMP decrement to basal levels at 70s (Figure 5). Mastoparan (50nM) pre-incubation diminished in a significant way the levels of cGMP induced by SNP (Figure 5). Trying to unravel, these mastoparan effects on this “cGMP pool” linked to a NO sensitive GC, that a new approach was undertaken. At this step, we have to postulate the existence of a novel mastoparan-sensitive mAChR signaling transducing cascade at plasma membrane, which can induce the inhibition of a NO-sensitive sGC. It is well known that mAChR are GPCR systems coupled to PTX-sensitive G proteins17. In this sense, PTX pre-incubation reversed the mastoparan inhibition of the SNP-induced increments in isolated BTSM fragments, which is shown in Figure 5. These data suggest that an ODQ-sensitive NO-stimulated GC coupled to PTX and mastoparansensitive Gi/o proteins are present in BTSM cells.

Figure 3

Discussion

Figure 5

Mastoparan may affect specifically the signal cascades associated with the muscarinic activation at BTSM sarcolemma, which are initiated with a mAChRs coupled to heterotrimeric G-proteins17. These two molecular entities were evaluated. It found that mastoparan in nM range and mastoparan 7 in pM range did not change the muscarinic receptor activity expressed as [3H]QNB binding in plasma membranes fractions isolated from this same BTSM (data not shown). These results indicate that the most like candidates implicated in mastoparan effects are the heterotrimeric G-proteins coupled to these mAChRs. The G protein involvement on the mastoparan inhibition on BTSM muscarinic activation is supported by the ability of this G-protein activator to alter the generation of the two GMPc signals at 20s and 60s as previously described4. Mastoparan (50 nM) induced a potent inhibition of these cGMP signals, that is correlated with a significant reduction on the contrac-

Volumen 31, número 4, 2012

Figure 4

Here, we evaluated the effect of mastoparan11,12 in nM range and super-active analog mastoparan 718, in pM range, on the BTSM contraction induced by muscarinic agonist as carbachol (CC). Our original findings indicated that Mastoparans decreased the contractile maximal responses induced by CC without changing its EC50. One explanation for the decrement on the contractile maximal responses by mastoparans may be related to the ability of these tetradecapeptides to disturb the function and the contractile machinery of the BTSM type through cytotoxic mechanisms, which have been described in other biological models, specifically in the μM concentration19,20. This assumption is not supported by our results on the effects of classic TSM spasmogens as 5-HT and histamine21, which produced potent contractions even in the presence of mastoparan (nM). These findings can be explained since these bioactive amines have been claimed to exert their physiological effects on TSM through specific GPCRs. These receptors are the 5-HT2A for 5-HT and the H1HR for histamine. It is well known that 5-HT induced activation of 5-HT2A receptors mediates the functional effects of serotonin through activation of the Gq/11 protein and its downstream effector phospholipase C (PLC) leading to intracellular phosphatidyl- inositol turnover and Ca2+mobilization22. Likewise, the H1 histamine receptor (H1HR) mediates the functional effects of histamine through activation of the Gq/11-PLC pathway results in the synthesis of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) and 1,2-diacylglycerol, which in turn stimulate an increase in intracellular Ca2+ and the activation of protein kinase C (PKC) respectively21,23. These Gq/11 proteins are mastoparan-insensitive ones. The last facts can explain the mastoparan-insensitivity of the serotoninergic and histaminergic transducing cascades at BTSM. Furthermore, our results demonstrated that mastoparan inhibits selectively the muscarinic activation without altering other spasmogens transducing cascades at BTSM.

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

It is important to point out, that this work was performed in the absence PDE inhibitors.

tile maximal responses as here reported. After mastoparan preincubation, the kinetics of cGMP intracellular levels was evaluated following the muscarinic agonist exposure. Interestingly, the first cGMP signal (20s) decreased in more than 60% and the second signal peak (60s) vanished. The dramatic disappearance of the second peak of cGMP (60s) was under intense scrutiny. This cGMP peak is product of two opposite mAChRs-G-protein linked signaling cascades acting on a NPR-GC9,10. In this sense, m3AChR coupled to Gq16 protein activates24 whereas, m2AChR coupled to Gi/o proteins inhibits this NPR-GC9,10. Recently, we further recognized that muscarinic agonist and mastoparan activations of NPR-GC in isolated BTSM plasma membranes fraction involve this Gq16 protein9. This NPR-GC was evaluated in intact BSTM strips by a direct stimulation using CNP-53, selective ligand activator for this transmembrane GC enzyme as previously described16,14,24. On basal conditions, CNP increased in more than 18 fold the cGMP production reaching maximal values at 30 s and these cGMP levels decreased slowly and remained high at 60 s. These results are similar to ones reported in guinea pig TSM, where CNP caused a dose dependent rise in the tissue cGMP level, with a peak at 1 min, which is correlated to its smooth muscle relaxant effects25. The participation of Gi/o-proteins coupled to NPR-GC in mastoparan action was further supported using mastoparan preincubated BTSM strips and later exposed to CNP.

Under these experimental conditions, there was a significant reduction, more than 50%, of cGMP-dependent-CNP increments. However, PTX exposure, priori to, mastoparan and later CNP-53 addition, reverses mastoparan inhibition of CNP-dependent cGMP formation. These mastoparan-PTX sensitive changes in cGMP levels linked to NPR-GC may be explained since more than 50% of the NPR-GC activity presents in BTSM sarcolema seems to be coupled to Gi/o proteins as showed in previous work16. The Gq16 and Gi/o proteins are activated by mastoparan, being the former G-protein, an activator and the latter, an inhibitor of NPR-GC as previously reported10,24. It is intriguing that the Gi/o inhibitory effects on NPR-GC remained after 15 min, after mastoparan addition. It is possibly that the higher abundance of m2AChR/m3AChR ratio (4:1)6 coupled to Gi/o vs Gq16 may explain the persistence of Gi/o inhibition in intact BTSM. Moreover, it can be speculate that Gi/o subunits have more affinity than Gq16 subunits for the putative GPRM on NPR-GC16. However, more research has to be done to clarify these exciting results. All these evidences indicated that mastoparan inhibition of the second cGMP signal linked to NPR-GC is mediated by PTX-sensitive Gi/o proteins as previously mentioned. Muscarinic activation of BTSM displays a first peak of cGMP (20s), which is a product of an ODQ-sensitive-GC, stimulated

by a novel transducing cascade that does not involved the generation of NO, as previously reported4. This novel cascade involves a mAChR coupled to a G-protein, which targets a specific effector possibly an ODQ-sensitive-GC, anchored to the internal face of the BTSM sarcolemma. Experimental evidences from our group indicate that an ODQ-sensitive NOstimulated GC activity is translocated to the plasma membrane during muscarinic activation of BTSM26. These evidences seem to be similar to ones reported in other biological systems, where NO-sensitive GCs activities have been described at plasma membrane from cardiomyocytes27 and neurons28. Recently, it has been suggested that the α2β2 isoform of GC at plasma membrane site, may provide a localized pool of cGMP29, which seems to be in a similar trend suggested by our work. To assure that the mastoparan inhibition of the first peak is related to a NO sensitive GC, some further experiments were performed. On basal conditions, a NO donor such as SNP increased cGMP in BTSM strips, as expected. Hence, SNP induced a binary response, wherein, cGMP intracellular levels increased around 18-fold at 40 s followed by a reduction of the intracellular levels to basal levels around 70s being the maximal values (35 ± 2 pmoles cGMP/mg total tissue protein). Thus, in the absence of PDE inhibitors, comparable experimental results using SNP and other NO donors have been reported in canine TSM. These authors reported a concentration-related increase in cGMP content in about 18fold above basal levels within 2 min, that was accompanied by a concentration-dependent relaxation of canine TSM30. Interestingly, these SNP-dependent cGMP responses were affected by mastoparan, but this peptide did not affect the binary pattern but significantly decreased the maximal responses in about 45 ± 3 %. It is possible to postulate that this decrement on cGMP levels may be related to the membranebound NO-sensitive GC isoform in this TSM. These original findings on mastoparan affecting a NO-sensitive GC system and the fact that mastoparan can affect PTX-sensitive Gi/o-proteins31, induced us to perform further experiments with PTX. Under the last experimental conditions, PTX reversed the mastoparan inhibition on the cGMP augmentation-induced by SNP. These results suggest that a PTX-sensitive Gi/o protein may be responsible for this mastoparan inhibition of the SNP actions. The identification of mAChR subtype, the PTX-sensitive Gi/o-protein coupled to NO-sensitive sGC isoform, that are responsible of the first cGMP signal peak is under research in our group. The BTSM muscarinic activation is blocked by mastoparan as here described. This inhibition may be explained since an early exposure of intact TSM strips to mastoparans, previous to muscarinic agonist addition, can disrupt the muscarinic signal cascade. It is well known that mastoparan directly activates G proteins stimulating the GTP/GDPexchange12,31, which mimics the GEF activity associated with some agonist activated receptors31, which seems to be our case. Thus, this G-protein activator can dissociate these two G-proteins (Gi/o

Based in our results, it can be postulated that the first signal (20s) is a product of the activation of one mAChR subtype coupled to a novel mastoparan and PTX-sensitive-G protein that leads to the activation of the heterodimer NO stimulated-hemoprotein guanylyl cyclase possibly anchored to plasma membrane and the second signal peak is a product of a the activation of m3AChR coupled to the stimulation of mastoparan-sensitive PTX insensitive-Gq1624 to turn on a transmembrane-homodimer as NPRGC being inhibited by a mastoparan and PTX sensitive Gi/o proteins9,10. In addition, specific cGMP phosphodiesterases may be involved in the production of these two sharp and short life cGMP signal peaks. 33,34

Nevertheless, in the BTSM system, when each guanylyl cyclase type is directly stimulated by its selective ligands such as CNP-53 for NPR-GC14,16 and SNP for the NO sensitive GC13, a binary pattern emerged. Both activators induced a fast increment in more than 50 fold of cGMP, reaching maximal values between 30-40s, decreasing to basal values faster in the case of SNP-linked cGMP elevations, possibly under the action of powerful cyclic nucleotide PDE-5 as reported in this BTSM33,34. It is interesting that both SNP and CNP stimulations reach a maximal values around 35-37 pmoles cGMP/mg total tissue protein. It can be speculated that the latter cGMP intracellular concentration range seems to act as a threshold to trigger a fast cGMP hydrolyzing PDEs33-35, enzymes responsible for the cGMP levels declines to basal values as here described.

A disfunction of these mAChR signal transducing cascades has been implied in the pathophysiological mechanisms of bronchial asthma36 and Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD)37. In that sense, this work opens new pharmacological and therapeutical approaches for the treatment of these chronic respiratory diseases, in which, the ASM is involved. References 1.- Barnes PJ. Airway smooth muscle receptors. Recent Prog Med. 1990;81:184-192. 2.- Jacoby DB, Fryer AD. Anticholinergic therapy for airway diseases. Life Sci. 2001; 68: 2565-2572. 3.- Katsuki S, Murad F. Regulation of adenosine cyclic 3’,5’-monophosphate and guanosine cyclic 3’,5’-monophosphate levels and contractility in bovine tracheal smooth muscle. Mol Pharmacol. 1977;13: 330-341. 4.- Guerra de Gonzalez L, Misle A, Pacheco G, Napoleon de Herrera V, Gonzalez de Alfonzo R, Lippo de Becemberg I, Alfonzo MJ. Effects of 1H-[1,2,4] oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ) and Nomega(6)-nitro-L-arginine methyl ester (NAME) on cyclic GMP levels during muscarinic activation of tracheal smooth muscle. Biochem Pharmacol 1999; 58 :563-574. 5.- Carvajal J, Germain A, Huidobro-Toro J, Weiner C, Molecular Mechanism of cGMP-mediated Smooth Relaxation. J of Cell Physiology 2000;184: 409-420. 6.- Lucas K, Pitari C, Kazcrounian S, Ruiz-Stewart l, Park J, Schulz S, Chepenik K, Waldman SA. Guanylyl Cyclases and Signaling by Cyclic GMP. Pharmacol Rev 2000; 52: 375-413. 7.- Roffel A, Meurs H, Elzinga C, Zagsma J. Characterization of the muscarinic receptor subtype involved in phosphoinositide metabolism in bovine tracheal smooth muscle. Br J Pharmacol 1990; 99:293-296. 8.- Misle AJ, Lippo de Becemberg I, Gonzalez de Alfonzo R, Alfonzo MJ. Methoctramine binding sites sensitive to alkylation on muscarinic receptors from tracheal smooth muscle. Biochem Pharmacol. 1994; 48:191-195. 9.- Alfonzo MJ, Lippo de Becemberg I, Sanchez de Villaroel S, Napoleon de Herrera V, Misle AJ, Gonzalez de Alfonzo R. Two opposite signal transducing mechanisms regulate a G-protein-coupled guanylyl cyclase. Arch Biochem Biophys.1998; 350:19-25. 10.- Alfonzo M, Guerra L, Sánchez S, Francis G, Misle A, Napoleón de Y, Gonzalez R, Lippo I. Signal transduction pathways through mammalian guanylyl cyclases. New Advances in Cardiovascular Physiology and Pharmacology. 1998; 147-175. 11.- Hirai Y, Yasuhara T, Yoshida H, Nakajima T, Fujino M, Kitada C. A new mast cell degranulating peptide “mastoparan” in the venom of Vespula lewisii. Chem Pharm Bull (Tokyo). 1972; 27: 1942-1944. 12.- Higashijima T, Uzu S, Nakajima T, Ross E. Mastoparan a peptide toxin from wasp venom, mimics receptors by activating GTP-binding regulatory proteins (G proteins). J Biol Chem 1988; 263; 6491-6494. 13.- Arnold WP, Mittal CK, Katsuki S, Murad F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3’:5’-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977; 74: 3203-3207. 14.- Borges A, Sánchez S, Winand N, Lippo I, Alfonzo MJ, González R . Molecular and Biochemical Characterization of a CNP-sensitive Guanylyl Cyclase in Bovine Tracheal Smooth Muscle. Am J Respir Cell Mol Biol 2001; 25: 98-103. 15.- Bensadoun A, Weinstein D. Assay of proteins in the presence of interfering materials. Analytical Biochemistry 1976; 70: 241-250. 16.- Alfonzo MJ, de Aguilar EP, de Murillo AG, de Villarroel SS, de Alfonzo RG, Borges A, de Becemberg IL. Characterization of a G protein-coupled guanylyl cyclase B receptor from bovine tracheal smooth muscle. J Recept Signal Transduct Res. 2006; 26:269-297. 17.- Murthy KS, Makhlouf GM. Differential coupling of muscarinic m2 and m3 receptors to adenylyl cyclases V/VI in smooth muscle. Concurrent M2-mediated inhibition via Galphai3 and m3-mediated stimulation via Gbetagammaq. J Biol Chem. 1997; 272:21317-21324. 18.- Bavec A. Novel features of amphiphilic peptide Mas 7 in signalling via heterotrimeric G-proteins. J Pept Sci. 2004; 10: 691-699.

Volumen 31, número 4, 2012

Until now, the BTSM muscarinic activation is unique biological system that involves two cGMP signals as second messengers4,10. In addition, this activation is a highly regulated biological process, which starts with m2/m3AChRs coupled to two mastoparan-sensitive G proteins, leading to a fine time regulation and stimulation of two guanylyl cyclases that accomplish the generation of these two cGMP signal peaks.

Finally, this work unravels some of complex molecular mechanisms associated with the muscarinic activation of ASM. This latter activation is the most physiologically and pharmacologically relevant because it’s a neurotransmitter-linked stimulation of ASM.

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

and Gq16) into their respective GTP and subunits. This latter dissociation process may produce a transient desensitization of the muscarinic agonist signal transducing cascade machinery presents in BTSM. Under these last conditions, the “activated mAChRs” are not longer able to signal down inside the BTSM cells. Consequently, the BTSM became unresponsive to muscarinic agonist addition as described in this work. During the completion of this work, similar results by mastoparan disrupting another cyclic nucleotide (cAMP) system as β-adrenoceptor-G(s) signaling present in1321N1 human astrocytoma cells have been reported20. These authors suggest that mastoparan changes the localization of Gα(s) from plasma membranes (lipid rafts) into the cytoplasm, where it is not available to activate membrane-adenylyl cyclase. Whatever is the molecular mechanism of mastoparan action, it is well know its ability to dissociate this crucial heterotrimer GDPβinto their respective GTP and the dimmer32 leaving these subunits to interact freely with their intracellular specific targets.

19.- Jones S, Howl J. Charge delocalization and the design of novel mastoparan analogues: enhanced cytotoxicity and secretory efficacy of [Lys5, Lys8, Aib10] MP. Regul Pept. 2004;15;121:121-128.

30.- Zhou HL, Torphy TJ. Relationship between cyclic guanosine monophosphate accumulation and relaxation of canine trachealis induced by nitrovasodilators. J Pharmacol Exp Ther.1991;258:972-978.

20.- Sugama J, Yu JZ, Rasenick MM, Nakahata N. Mastoparan inhibits betaadrenoceptor-G(s) signaling by changing the localization of Galpha(s) in lipid rafts. Cell Signal 2007; 19: 2247-2254.

31.- Higashijima T, Burnier J, Ross EM. Regulation of Gi and Go by mastoparan, related amphiphilic peptides, and hydrophobic amines. Mechanism and structural determinants of activity. J Biol Chem. 1990; 265:14176-14186.

21.- Pype JL, Mak JC, Dupont M, Verleden GM, Barnes PJ. Desensitization of the histamine H1-receptor and transcriptional down-regulation of histamine H1receptor gene expression in bovine tracheal smooth muscle. Br J Pharmacol 1998;125:1477-84.

32.- Oldham WM, Hamm HE. How do receptors activate G proteins? Adv Protein Chem. 2007;74: 67-93.

22.- Shi J, Zemaitaitis B, Muma NA. Phosphorylation of Gq11 Protein Contributes to Agonist-Induced Desensitization of 5-HT2A Receptor Signaling. Mol Pharmacol. 2007; 71:303-313. 23.- Leurs R, Smit MJ, Timmerman H.Molecular Pharmacological aspects of histamine receptors. Pharmacol Ther. 1995;66:413-463. 24.- Bruges G, Borges A, Sanchez de Villarroel S, Lippo de Becemberg I, Francis de Toba G, Placeres F, Gonzalez de Alfonzo R, Alfonzo MJ. Coupling of M3 acetylcholine receptor to Gq16 activates a natriuretic peptide receptor guanylyl cyclase. J Recept Signal Transduct Res. 2007; 27:189-216. 25.- Takagi K, Araki N, Suzuki K Relaxant effect of C-type natriuretic peptide on guinea-pig tracheal smooth muscle. Arzneimittelforschung.1992; 42:13291331. 26.- Placeres Uray F., Gonzalez de Alfonzo R., Lippo de Becemberg I. and Alfonzo MJ. Muscarinic agonists acting through M2 acetylcholine receptors stimulate the migration of an NO-sensitive guanylyl cyclase to the plasma membrane of bovine tracheal smooth muscle. J Recept Signal Transduct Res. 2010; 30: 10-23. 27.- Agulló L, Garcia-Dorado D, Escalona N, Ruiz-Meana M, Mirabet M, Inserte J, Soler-Soler J. Membrane association of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase in cardiomyocytes. Cardiov. Res 2005; 68:65-74. 28.- Bidmon HJ, Mohlberg H, Habermann G, Buse E, Zilles K, Behrends S. Cerebellar localization of the NO-receptive soluble guanylyl cyclase subunits-alpha(2)/ beta (1) in non-human primates. Cell Tissue Res. 2006; 326:707-714. 29.- Belligham M, Evans TJ. The 22 isoform of guanylyl cyclase mediates plasma membrane localized nitric oxide signaling. Cellular Signalling 2007, 19; 2183-2193.

33.- Shahid M, van Amsterdam RG, de Boer J, ten Berge RE, Nicholson CD, Zaagsma J. The presence of five cyclic nucleotide phosphodiesterase isoenzyme activities in bovine tracheal smooth muscle and the functional effects of selective inhibitors. Br J Pharmacol. 1991;104: 471-477. 34.- Guerra de Gonzalez L, González de Alfonzo R, Lippo de Becemberg I, Alfonzo MJ. Cyclic nucleotide-dependent phosphodiesterases (PDEI) inhibition by muscarinic antagonists in bovine tracheal smooth muscle. Biochem Pharmacol. 2004; 68:651-658. 35.- Rybalkin SD,Yan C,Bornfeldt KE, Beavo JA. Cyclic GMP phosphodiesterases and regulation of smooth muscle function. Circ Res.2003; 93:280-291. 36.- Coulson FR, Fryer AD. Muscarinic acetylcholine receptors and airway diseases. Pharmacol Ther. 2003 98:59-69. Review. 37.- Gosens R,Zaagsma J,Meurs H,Halayko AJ. Muscarinic receptor signaling in the pathophysiology of asthma and COPD. Respir Res. 2006; 7:73-86. Review.

Acknowlegments: This work was supported by Grants from Consejo de Desarrollo Científico Humanístico UCV, PI 09.00.6464.2006/2 and PG 09.7410.2008/1 to (RGA), 09.7726.2009 (ILB). WalidHassan is Graduate Student at Curso de Postgrado en Ciencias Fisiológicas. Facultad de Medicina. Universidad Central de Venezuela and he holds a fellowship from Misión Ciencia from Ministerio del Poder Popular para la Ciencia, Tecnología e Industrias Intermedias (MPPCTII) at Venezuela.

Aceptado: 16/09/2012

Resumen

Abstract

Introducción: La candidiasis orofaríngea (COF) permanece como una de las principales infecciones oportunistas en pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), y aunque su incidencia ha disminuido con la introducción de la terapia antirretroviral de alta eficacia, continúa siendo una afección característica en estos pacientes. Materiales y Métodos: En el presente trabajo se realizó un estudio de susceptibilidad in vitro mediante la metodología del CLSI, frente a itraconazol, ketoconazol y clotrimazol de 144 aislamientos clínicos de Candida, aisladas de la cavidad oral de pacientes infectados con el VIH/sida con cuadros clínicos de COF. Resultados: La identificación de los aislamientos demostró que más del 90 % pertenecían a Candida albicans. Al determinar el patrón general de susceptibilidad frente a los azoles estudiados mediante el método de microdilución en caldo del documento M27-A2 del Clinical and Laboratory Standard Institute, C. albicans exhibió valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) en un rango de 0,01 a 8µg/mL para el itraconazol y el ketoconazol y de 0,01 a 2 µg/mL para el clotrimazol. Sólo el 2,1 % de los aislamientos mostró franca resistencia frente al itraconazol, en tanto que el 3,5 % quedó clasificado dentro de la categoría “susceptible dosis-dependiente” para este triazol. La mayoría de los aislamientos de C. albicans mostraron valores de CMI frente al ketoconazol y al clotrimazol menores a 0.06 µg/mL, siendo de un 96,9% (129 aislamientos) y de un 97,7% (129 aislamientos), respectivamente. El clotrimazol tuvo una mejor actividad in vitro comparado con los restantes azoles frente a los aislamientos estudiados. Conclusión: Candida spp. Mostró una elevada sensibilidad in vitro a los azoles estudiados. Se hace necesario continuar realizando estudios epidemiológicos para determinar los patrones de susceptibilidad y tasas de resistencias frente a los agentes antifúngicos.

Introduction: The oropharyngeal candidiasis (OFC) remains as one of the principal opportunistic infections in patients infected with the human immunodeficiency virus (HIV) and with the acquired immunodeficiency syndrome (aids), and although his incidence has declined with the introduction of the highly active anti-retroviral therapy (HAART), remains as a typical complaint in these patients. Materials and Methods: A study of antifungal in vitro susceptibility testing, following the CLSI methodology, was realized against itraconazole, ketoconazole and clotrimazole of 144 clinical isolations of Candida, isolated from the oral cavity of patients infected with HIV/ aids, with clinical pictures of OFC. Results: The isolation’s identification, demonstrated that more than 90% belonged to Candida albicans. The determination of the general pattern of susceptibility, following the document M27-A2 of the Clinical and Laboratory Standard Institute, against to the studied azoles by means of the method of microdilution in liquid medium, show that the majority of C. albicans isolates showed values of MIC against ketoconazole and clotrimazole lower than 0.06 µg/mL, representing a 96,9% (129 isolations) and a 97,7% (129 isolations), respectively. C. albicans exhibited the widest range of minimal inhibitory concentration (MIC). Only 2.1% of the isolations showed resistance against to itraconazole, while 3.5 % remained classified in the category “sensible dose - dependent” for this triazole. The majority of the strains showed values of MIC against ketoconazole and clotrimazole below 0.06 µg/mL. The clotrimazole had a better in vitro activity compared with the remaining azoles opposite to the isolations. Conclusion: Candida spp. showed a high in vitro sensibility to the azoles studied. It becomes necessary the maintenance of epidemiologic studies for the determination of susceptibility patterns and of resistances rates against to the antifungal agents.

Palabras claves: susceptibilidad in vitro; Candida; itraconazol; ketoconazol; clotrimazol, candidiasis orofaríngea; VIH/sida.

Keywords: in vitro antifungal susceptibility testing; Candida; itraconazole; ketoconazole; clotrimazole, oropharyngeal candidiasis; HIV/aids.

Volumen 31, número 4, 2012

Recibido: 06/02/0012

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

Jerez Puebla LE, Fernández CM, Illnait MT, Perurena MR, Rodríguez I y Martínez G. Laboratorio Nacional de Referencia de Micología INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL "PEDRO KOURÍ" Autopista Novia del Mediodía, km 6 ½. La Habana, Cuba Autor para correspondencia: Luis E. Jerez (email: ljerezp@ipk.sld.cu)

Declaro que no hay conflicto de intereses en este artículo de investigación. Agradecimientos: Deseamos agradecer a Ana María, Ada, Rosa, Mayra, compañeras del Departamento de Medios de cultivo y esterilización y fregado por toda la ayuda dada. Introducción La candidiasis orofaríngea (COF) es la infección fúngica más frecuente entre los pacientes infectados por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), y ha sido estimado que más del 90% de estos pacientes desarrollan esta infección oportunista en algún momento durante la progresión de su enfermedad1. Hasta la introducción de los nuevos triazoles en la década de 1990 y su amplio uso tanto para el tratamiento de las micosis superficiales como el de las sistémicas, no se consideraba imprescindible el disponer de métodos de estudio de la susceptibilidad in vitro a los antifúngicos. Aunque es indudable el valor terapéutico de los azoles, en los últimos años se han observado episodios de COF que no han respondido adecuadamente a este tratamiento y se han descrito aislamientos clínicos que han sido resistentes in vitro a ketoconazol, fluconazol y/o a itraconazol2-4.

Dentro de los métodos de referencia para realizar los estudios de susceptibilidad in vitro en levaduras, destacan los recomendados por el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), anteriormente denominado NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Esta institución ha desarrollado y publicado un método de referencia aprobado para las pruebas de microdilución en caldo de especies de Candida (documento M27-A2 del CLSI) para determinar la susceptibilidad a varios agentes antimicóticos5. Recientemente, este método se ha modificado en el documento M27-A3 del CLSI, el cual incorpora puntos de corte para el voriconazol, posaconazol y a las equinocandinas para la pruebas de susceptibilidad en levaduras de importancia clínica. Los puntos de corte interpretativos motivados por los datos, determinados con el uso de este método, están disponibles para pruebas de susceptibilidad de especies de Candida al fluconazol, al itraconazol, al voriconazol, a la flucitosina y a las equinocandinas6. En resumen, estas metodologías de referencia constituyen las pruebas de referencia para determinar la susceptibilidad in vitro en levaduras de importancia médica6,7.

Materiales y métodos Ciento cuarenta y cuatro aislamientos de Candida, procedentes de exudados micológicos de la cavidad bucal de 137 individuos de ambos sexos seropositivos al VIH, sin discriminar el estadio de la infección, atendidos en el período comprendido entre septiembre de 2007 a marzo de 2008 fueron estudiados en el Laboratorio Nacional de Referencia de Micología del Instituto “Pedro Kourí”, Cuba. Todos tenían diagnóstico clínico de candidiasis orofaríngea y ninguno había llevado tratamiento antifúngico previo. Estos aislamientos se encontraban conservados en agua destilada estéril a temperatura ambiente. Antes de realizar las pruebas de identificación fenotípicas cada aislamiento fue subcultivado al menos dos veces en agar papa-dextrosa para asegurar su pureza y viabilidad. La identificación de los aislamientos fue llevada a cabo mediante el uso del sistema comercial de identificación de levadura API 20C (bioMérieux, Inc, Hazelwood, Mo.). Antifúngicos: Se ensayaron tres antifúngicos: itraconazol, ketoconazol y clotrimazol, (SIGMA I 6657, SIGMA K 1003, y SIGMA C 2812, respectivamente) con una potencia del 100%. Prueba de Susceptibilidad in vitro: Las CMI de los tres derivados azólicos fueron determinadas en placas de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) de 96 pocillos siguiendo el método de microdilución en medio líquido del documento M27-A2 del CLSI y de la metodología propuesta por el EUCAST. Se dispensó el medio de cultivo RPMI 1640 a razón de 200 μL/pozo en la 1era columna y 100 μL/pozo de la 3era a la 12ma. Posteriormente se añadieron 100 μL/pozo de la solución del antifúngico diluido 1:100 en dimetilsulfóxido en el mismo medio de cultivo en las columnas 2 y 3. A partir de esta última, se realizaron diluciones seriadas al doble hasta la columna 11 descartándose 100 μL/pozos. De esta forma se obtuvo un gradiente de concentración desde la columna 2 a la 11 de 16 μg/mL hasta 0.03 μg/mL. Las placas así preparadas fueron debidamente rotuladas y almacenadas a – 70 °C hasta el momento de su utilización. Una vez inoculadas los aislamientos de Candida spp. las concentraciones finales probadas de los antifúngicos ensayados estuvieron comprendidas entre 0.01 y 8 μg/mL. Se utilizaron las cepas Candida krusei ATCC 6258 y Candida parapsilosis ATCC 22019 como controles de la calidad.

Por todo lo anterior, es importante que se desarrollen trabajos locales en diferentes regiones que permitan evaluar la tendencia de la susceptibilidad in vitro de los aislamientos de Candida.

Se determinó la CMI 50 como la concentración más baja del antifúngico que inhibió el 50% del crecimiento de la especie de Candida, respecto a su control de crecimiento.

Objetivo Determinar los niveles de susceptibilidad in vitro de aislamientos de Candida spp. aislados de la cavidad oral de pacientes infectados por el VIH/sida a tres antimicóticos de uso común, disponibles en nuestro laboratorio en el momento del estudio: itraconazol, ketoconazol y clotrimazol.

Se asumieron los criterios de sensibilidad (<0.125 µg/mL) y resistencia (>1 µg/mL) aprobados por el CLSI para especies de Candida en medio RPMI 1640 para el itraconazol, quedando en la categoría sensible-dosis dependientes (S-DD) aquellos aislamientos cuyas CMI estuvieron en el intervalo de 0,125 a 0,5 µg/mL

Especies aisladas

Itraconazol

Ketoconazol

Clotrimazol

CMI50 Rango CMI (μg/ (μg/mL) mL)

Rango Rango CMI50 CMI50 CMI CMI (μg/mL) (μg/mL) (μg/mL) (μg/mL)

C. albicans (132)

0.01-8

0.01

0.01-2

0.01

C. lusitaniae (2)

0.01-0.125 0.01

0.01

Candida sp (2)

0.01

0.010.06

0.01

C. tropicalis (2)

0.01

C. parapsilosis (2)

0.01-0.03

0.01

0.03

C. guilliermondii (1) 0.01

0.01

0.03

C. glabrata (1)

0.01

C. utilis (1)

0.01

C. famata (1)

0.01

(n)

0.01

Todos los aislamientos de especies de Candida diferentes a C. albicans fueron sensibles al itraconazol. Sólo 3 aislamientos de C. albicans (2.3%) mostraron resistencia a este triazol y 5 aislamientos de esta especie (3.8%) quedaron clasificadas dentro de la categoría sensible-dosis dependiente. La CMI para los restantes azoles evaluados fue menor a 0,125 µg/mL en la gran mayoría de los aislamientos, como se muestra en la Tabla No.2.

>1 μg/mL

<0.125 μg/mL

0.25-0.5 μg/mL

>1 μg/mL

124

129

C. lusitaniae (2)

130 2

1 -

Candida sp (2)

C. tropicalis (2)

C. parapsilosis (2)

C. guilliermondii (1)

C. glabrata (1)

C. utilis (1)

C. famata (1)

Clotrimazol

Leyenda: S: sensible; S-DD: Sensible dosis dependiente; R: resistente.

Las proporciones de aislamientos para las cuales las CMI de ketoconazol y clotrimazol presentaron valores inferiores a 0.06 μg/mL fueron de un 96.9% y 97.7%, respectivamente, para las especies de Candida albicans estudiadas. En C. albicans solo se reportaron tres aislamientos con valores de CMI superiores a 1 μg/mL para el ketoconazol; entretanto para el clotrimazol solo hubo una cepa que mostró un valor de CMI superior a 1 μg/mL y otra que presentó un valor de 0.25 μg/mL. Figura 2. Distribución de los valores de CMI frente a Candida albicans con porcentajes acumulativos de inhibición

Volumen 31, número 4, 2012

lamientos de Candida frente a los tres derivados azólicos evaluados.

C. albicans (132)

Ketoconazol

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

Tabla No.1. Distribución de los valores de rango y CMI50 de los 144 ais-

0.25-0.5 μg/mL

C. albicans exhibió para los tres derivados azólicos, el rango más amplio respecto al del resto de las especies, destacando solo un aislamiento de C. famata obtenido, el cual demostró un alto grado de resistencia frente al ketoconazol. Los valores de CMI de los tres derivados azólicos de los aislamientos son reflejados en la Tabla No.1.

<0.125 μg/mL

En este estudio, la identificación de los aislamientos aislados a partir de los exudados realizados mostró un gran predominio de C. albicans (91,7%) con respecto a las restantes especies “no albicans” identificadas (8.3%).

Itraconazol

>1 μg/mL (R)

Resultados

Especies aisladas (n)

0.25-0.5 μg/mL (S-DD)

Análisis Estadístico Utilizando el programa estadístico EpiInfo versión 5.01, se establecieron los rangos de susceptibilidad de los valores obtenidos para las drogas utilizadas, así como fueron determinados los porcentajes acumulativos de CMI frente a las diferentes concentraciones de las drogas empleadas.

Tabla No. 2. Distribución de los valores de la susceptibilidad in vitro de los 144 aislamientos de Candida frente a los tres derivados azólicos evaluados.

<0.125 μg/mL (S)

La lectura de los resultados se realizó visualmente, llevándose a cabo con la ayuda de un visor de aumento (Gallenkamp, CNW-325).

Discusión La candidiasis orofaríngea causada por levaduras del género Candida, principalmente Candida albicans, es la infección oportunista más comúnmente diagnosticada en pacientes infectados por el VIH/sida8,9. Aunque esta infección no suele

comprometer la vida, la inmunosupresión sostenida vista en estos pacientes facilita la recurrencia de la infección10. C. albicans sigue siendo la especie de levadura más frecuentemente aislada a partir de cualquier proceso infeccioso en el hombre. Aún cuando en los últimos años se está experimentando un cambio epidemiológico en estas infecciones, de un amplio predominio de C. albicans a un porcentaje más elevado de especies diferentes a C. albicans, esta sigue siendo la especie más importante desde el punto de vista patogénico, clínico y epidemiológico11-13. En este estudio obtuvimos un alto porcentaje de aislamientos de C. albicans, lo cual confirma su predominio en las infecciones orales de pacientes infectados por el VIH/sida. Este resultado es semejante a lo reportado por Kuriyama et al.14 en Inglaterra, en donde a partir de 618 aislamientos clínicos de Candida encontraron un 93.2% de la especie C. albicans. Igualmente, en estudios realizados en México por SánchezVargas et al.15, por Badiee et al.16 en Irán, y Hamza et al.17 En Tanzania, demostraron un 83.5%, 50%, y 83,4% respectivamente, de aislamientos de Candida albicans procedentes de este tipo de pacientes. No obstante, otros trabajos notificados en la literatura internacional en estos últimos años explican el cambio epidemiológico que están experimentando las infecciones por el género Candida: de un amplio y casi absoluto predominio de Candida albicans a un mayor porcentaje de las especies “no albicans”. Ejemplo de ello lo demuestran los trabajos de Belazi et al.18 en Grecia; Pfaller et al.19 en Estados Unidos de Norteamérica; Skrodeniene et al.20 en Lituania, y Lee et al.21 en Sudcorea, todos los cuales aislaron e identificaron un porcentaje de especies “no albicans”, como C. krusei, C. tropicalis, C. glabrata y C. parapsilosis que variaron desde un 4% hasta un 22%.

Aún cuando no se cuentan con puntos de cortes en el documento del CLSI que clasifiquen en sensibles o resistentes in vitro a aislamientos de Candida frente al ketoconazol y el clotrimazol, antifúngicos que se evaluaron en este estudio, nos dimos a la tarea de determinar los valores de CMI frente a estos imidazoles que son de amplio uso en Cuba en el tratamiento de micosis superficiales, cutáneas y mucocutáneas23. Hasta la fecha el clotrimazol ha sido utilizado como un agente de referencia para evaluar antimicóticos de nuevas generaciones. Se utiliza con gran frecuencia en la candidiasis oral y vulvovaginal como agente tópico, por su amplio espectro de acción en la candidiasis mucocutánea y por su disponibilidad debido al bajo costo de este imidazol24. Aunque son pocos los reportes en la literatura acerca de la susceptibilidad in vitro al clotrimazol en levaduras, algunos estudios como el de Pelletier et al.24 realizado en los Estados Unidos de Norteamérica con 87 niños infectados por el VIH que presentaban una candidiasis orofaríngea, obtuvieron como resultado que la resistencia in vitro al clotrimazol, considerándola por presentar una CMI superior a 1 µg/mL, estaba altamente asociado con una resistencia clínica a la terapia con derivados azólicos; y que la resistencia in vitro al clotrimazol se correla-

cionaba con una candidiasis refractaria a nivel de mucosa24. Otra investigación realizada por Hamza et al.17 en Tanzania en la cual evaluó más de 200 aislamientos de Candida frente al clotrimazol y otros derivados azólicos encontraron una alta sensibilidad frente a este imidazol, resultado semejante al reportado en este estudio. En cuanto al ketoconazol, agente imidazólico de amplio espectro, obtuvimos un alto grado de sensibilidad in vitro en los aislamientos evaluados. Resultados similares han sido reportados por Dieng et al.25 en Senegal y Alexander et al.26 en los Estados Unidos, los cuales evidenciaron en la mayoría de aislamientos de Candida spp procedentes de pacientes infectados por el VIH/sida que presentaban lesiones orales, unas CMI inferiores a 0,125 µg/mL. De interés fue el hallazgo de una cepa de C. famata con una CMI de 8 µg/mL frente al ketoconazol. No obstante a ser una especie poco descrita en infecciones humanas causadas por levaduras, Migliorati et al.27 en los Estados Unidos, y Odio28 en Costa Rica han reportados aislamientos de C. famata con CMI elevadas frente a este imidazol en pacientes VIH/sida con cuadros clínicos de candidiasis orofaríngea y con infecciones fúngicas invasivas, respectivamente. El itraconazol, derivado triazólico de amplio espectro de acción, tuvo una actividad similar a los restantes azoles. Del total de aislamientos estudiados, solo 3 (todas C. albicans) mostraron resistencia frente al itraconazol, para un 2,3% de resistencia. Resultados similares de resistencia frente a este triazol fueron obtenidos por Magaldi et al.29 en Venezuela, Sant’Ana et al.2 en Brasil y Alexander et al.26 quienes reportaron porcentajes de resistencia inferiores al 4% en cada caso. En este trabajo, 5 aislamientos (3.5%), de la especie C. albicans, quedaron clasificados dentro de la categoría “susceptible dosis-dependiente” (SDD), para el itraconazol. En esta categoría quedan incluidas todas los aislamientos cuya CMI presenta un valor intermedio entre los de sensibilidad y resistencia, para las cuales el empleo in vivo de altas dosis del antifúngico, pudiera favorecer una respuesta exitosa al tratamiento30. Las actividades comparativas de los antifúngicos azólicos contra los aislamientos clínicos de C. albicans mostraron que el clotrimazol tuvo una actividad ligeramente superior que el ketoconazol y más efectiva comparada con el itraconazol al inhibir a más del 90% de los aislamientos a una concentración de 0,01 μg/mL. Estos resultados son similares a los obtenidos por Martínez-Suárez y Rodríguez Tudela, quienes en un estudio comparativo de cinco derivados azólicos (ketoconazol, itraconazol, fluconazol, miconazol y clotrimazol) encontraron que las CMIs más bajas correspondieron al ketoconazol, clotrimazol y miconazol31. En un trabajo más reciente desarrollado por Kuriyama et al.14 en Inglaterra, evaluaron 10 agentes antifúngicos, y de ellos el ketoconazol tuvo los valores de actividad in vitro más bajas frente a Candida albicans. Los resultados obtenidos de la susceptibilidad in vitro de las especies de Candida estudiadas demuestran la alta eficacia de los derivados azólicos empleados como buenas opciones

Conclusiones C. albicans continúa siendo la principal especie dentro del género Candida aislada de procesos infecciosos en humanos. Es importante, por tanto, conocer los niveles de sensibilidad y resistencia frente a los azoles que más comúnmente se utilizan en nuestro medio. En este estudio evidenciamos una baja sensibilidad in vitro de los aislamientos de Candida estudiados frente a los azoles evaluados. Referencias 1. Thompson GR 3rd, Patel PK, Kirkpatrick WR, Westbrook SD, Berg D, Erlandsen J, Redding SW, Patterson TF. Oropharyngeal candidiasis in the era of antiretroviral therapy. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2010; 109:488-95. 2. Sant'Ana Pde L, Milan EP, Martinez R, Queiroz-Telles F, Ferreira MS, Alcântara AP, Carvalho MT, Colombo AL. Multicenter Brazilian study of oral Candida species isolated from AIDS patients. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002; 97:253-7. 3. Kuriyama T, Williams DW, Bagg J, Coulter WA, Ready D, Lewis MA. In vitro susceptibility of oral Candida to seven antifungal agents. Oral Microbiol Immunol. 2005; 20:349-53. 4. Gaitan -Cepeda LA, Ceballos Salobreña A, López Ortega K, Arzate Mora N, Jiménez Soriano Y. Oral lesions and immune reconstitution syndrome in HIV+/AIDS patients receiving highly active antiretroviral therapy. Epidemiological evidence. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2008; 13:85-93. 5. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts: Approved standard, 3rd. ed. CLSI document M27-A3. Wayne, PA: CLSI, 2008. 6. Johnson E M. Issues in antifungal susceptibility testing. J Antimicrob Chemother 2008; 61 Suppl 1: i13-8. 7. Arikan S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Med Mycol 2007; 45: 569-87. 8. da Silva CA, Costa Dourado MI, Dahia SR, Harzheim E, Rutherford GW. Oral manifestations of HIV infection in patients receiving highly active antiretroviral therapy (HAART) in Bahia, Brazil. J Public Health Dent. 2008; 68:178-81. 9. Thompson GR 3rd, Patel PK, Kirkpatrick WR, Westbrook SD, Berg D, Erlandsen J, Redding SW, Patterson TF. Oropharyngeal candidiasis in the era of antiretroviral therapy. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2010; 109:488-95. 10. Thompson GR 3rd, Patel PK, Kirkpatrick WR, Westbrook SD, Berg D, Erlandsen J, Redding SW, Patterson TF. Oropharyngeal candidiasis in the era of antiretroviral therapy. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2010;109:488-95.

12. Dongari-Bagtzoglou A, Dwivedi P, Ioannidou E, Shaqman M, Hull D, Burleson J. Oral Candida infection and colonization in solid organ transplant recipients. Oral Microbiol Immunol. 2009; 24:249-54. 13. Rosenbach A, Dignard D, Pierce JV, Whiteway M, Kumamoto CA. Adaptations of Candida albicans for growth in the mammalian intestinal tract. Eukaryot Cell. 2010; 9:1075-86. 14. Kuriyama T, Williams DW, Bagg J, Coulter WA, Ready D, Lewis MA. In vitro susceptibility of oral Candida to seven antifungal agents. Oral Microbiol Immunol. 2005; 20:349-53. 15. Sánchez-Vargas LO, Ortiz-López NG, Villar M, Moragues MD, Aguirre JA, CashatCruz M, Lopez-Ribot JL, et al. Oral Candida isolates colonizing or infecting human immunodeficiency virus-infected and healthy persons in Mexico. J Clin Microbiol. 2005; 43: 4159–62. 16. Badiee P, Alborzi A, Davarpanah MA, Shakiba E. Distributions and antifungal susceptibility of Candida species from mucosal sites in HIV positive patients. Arch Iran Med. 2010; 13:282-7. 17. Hamza OJ, Matee MI, Moshi MJ, Simon EN, Mugusi F, Mikx FH, Helderman WH, Rijs AJ, van der Ven AJ, Verweij PE. Species distribution and in vitro antifungal susceptibility of oral yeast isolates from Tanzanian HIV-infected patients with primary and recurrent oropharyngeal candidiasis. BMC Microbiol. 2008; 12:135-38. 18. Belazi M, Velegraki A, Koussidou-Eremondi T, Andreadis D, Hini S, Arsenis G, Eliopoulou C, Destouni E, Antoniades D. Oral Candida isolates in patients undergoing radiotherapy for head and neck cancer: prevalence, azole susceptibility profiles and response to antifungal treatment. Oral Microbiol Immunol. 2004; 19: 347-51. 19. Pfaller MA, Boyken L, Hollis RJ, Messer SA, Tendolkar S, Diekema DJ. In vitro susceptibilities of Candida spp. to caspofungin: four years of global surveillance. J Clin Microbiol. 2006; 44:760-3. 20. Skrodeniene E, Dambrauskiene A, Vitkauskiene A. Susceptibility of yeasts to antifungal agents in Kaunas University of Medicine Hospital. Medicina (Kaunas). 2006; 42:294-9. 21. Lee JS, Shin JH, Lee K, Kim MN, Shin BM, Uh Y, Lee WG, Lee HS, Chang CL, Kim SH, Shin MG, Suh SP, Ryang DW. Species distribution and susceptibility to azole antifungals of Candida bloodstream isolates from eight university hospitals in Korea. Yonsei Med J. 2007; 48:779-86. 22. Cuenca-Estrella M, Rodriguez-Tudela JL. The current role of the reference procedures by CLSI and EUCAST in the detection of resistance to antifungal agents in vitro. Expert Rev Anti Infect Ther. 2010; 8:267-76. 23. Llovera-Suárez V, Fernández CM. Susceptibilidad in vitro de aislamientos vaginales de Candida frente a clotrimazol y nistatina. Rev Cubana Med Trop. 2003; 55:135-45. 24. Pelletier R, Peter J, Antin C, Gonzalez C, Wood L, Walsh TJ. Emergence of resistance of Candida albicans to clotrimazole in human immunodeficiency virus-infected children: in vitro and clinical correlations. J Clin Microbiol. 2000; 38:1563-8. 25. Dieng Y, Faye-Niang MA, Ndour-Diop A, Sow PS, Dieng T, Soumare M, et al. Antifungal drug susceptibility of Candida causing oropharyngeal candidiasis in HIV infected patients. Dakar Med. 2001; 46(1):4-7. 26. Alexander BD, Byrne TC, Kelly L. Smith T, Kimberly E. Hanson A, Kevin J. Anstrom, JR. Perfect L, Reller B. Comparative Evaluation of Etest and Sensititre YeastOne panels against the Clinical and Laboratory Standards Institute M27-A2 reference broth microdilution method for testing Candida susceptibility to seven antifungal agents. J Clin Microbiol. 2007; 45: 698–706. 27. Migliorati CA, Birman EG, Cury AE. Oropharyngeal candidiasis in HIV-infected patients under treatment with protease inhibitors. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2004; 98(3):301-10. 28. Odio CM. Antifungal therapy for infants, children and adolescents with suspected or documented invasive fungal infection. Drugs Today (Barc). 2010; 46 Suppl C: 33-46. 29. Magaldi S, Mata S, Hartung C, Verde G, Deibis L, Roldán Y, Marcano C. In vitro susceptibility of 137 Candida sp. isolates from HIV positive patients to several antifungal drugs. Mycopathologia. 2001; 149:63-8. 30. Walmsley S, King S, McGeer A, Ye Yanna, Richardson S. Oropharyngeal candidiasis in patients with human immunodeficiency virus: Correlation of clinical outcome with in vitro resitance, serum azole levels and immunosuppression. CID. 2001;32:1554-61. 31. Martínez-Suárez JV, Rodríguez-Tudela JL. Patterns of in vitro activity of itraconazole and imidazole antifungal agents against Candida albicans with decreased susceptibility to fluconazole from Spain. Antimicrob Agents Chemother. 1995; 39:1512-16. 32. Rex JH, Pfaller MA., Walsh TJ, Chaturvedi V, Espinel-Ingroff A, Ghannoum MA, Gosey LL, Odds FC, Rinaldi MG, Sheehan DJ, Warnock DW. Antifungal susceptibility testing: practical aspects and current challenges. Clin Microbiol Rev. 2001; 14:643-58.

Volumen 31, número 4, 2012

Las pruebas de susceptibilidad in vitro han demostrado tener gran utilidad en los estudios epidemiológicos, de vigilancia de los patrones de susceptibilidad en poblaciones de microorganismos a determinados antimicrobianos, como se evidencia en este estudio donde predominó un alto grado de sensibilidad a los azoles estudiados frente a las especies de Candida, así como, para el descubrimiento de nuevos fármacos y para predecir posibles fracasos terapéuticos en la práctica médica32. Por lo anterior, es de vital importancia continuar desarrollando trabajos de investigación que permitan optimizar, la correlación de los resultados in vitro con la respuesta in vivo para aquellos fármacos, en los que aún no se disponen de puntos de cortes estandarizados de sensibilidad y resistencia, y de esa forma contar con una vigilancia de la resistencia a los antimicóticos que se utilizan en la práctica clínica.

11. Tsang CS, Chu FC, Leung WK, Jin LJ, Samaranayake LP, Siu SC. Phospholipase, proteinase and haemolytic activities of Candida albicans isolated from oral cavities of patients with type 2 diabetes mellitus. J Med Microbiol. 2007; 56(10):1393-8.

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

terapéuticas en la candidiasis orofaríngea, teniendo en cuenta que dichos estudios en levaduras constituyen una herramienta beneficiosa en predecir el éxito clínico, pero permanece solo como uno de varios factores que pueden impactar en la respuesta clínica32.

Efecto de Alendronato y Pamidronato administrado por vía subcutánea en la densidad mineral ósea en animales de experimentación Effect of Alendronate and Pamidronate administered subcutaneously in bone mineral density in experimental animals Autores: Virga Carolina, Aguzzi Alejandra, De Leonardi Adriana. Lugar de trabajo: Cátedra de Farmacología y Terapéutica B, Departamento de Patología Bucal, Facultad de Odontología UNC. Correspondencia: Prof. Dra. Carolina Virga. Haya de la Torre s/n Ciudad Universitaria Córdoba Argentina. (cp 5009) tel: 0351-155493860, fax: 54-351-4337438. cvirga@odo.unc.edu.ar

Recibido: 12/08/2012

Aceptado: 21/10/2012

Resumen

Los bifosfonatos constituyen un grupo de fármacos capaces de modular el recambio óseo y disminuir su remodelado cuando existe una reabsorción excesiva. El objetivo de este estudio fue investigar por diagnóstico radiográfico, el efecto de formulaciones subcutáneas en base a Alendronato (AL) y Pamidronato (PA) a nivel óseo. Materiales y métodos: las fórmulas farmacéuticas fueron preparadas con una dosificación para AL de 0,5 mg/Kg de peso, y para PA de 0,6 mg/ Kg. Se les adicionó buffer especiales, con un pH final de 5,5 en medios estériles. El control (C) fue solución fisiológica. El efecto de Al y PA se evaluó en ratas machos Wistar normales (n=64), con un peso de 160 ± 20 g, divididas en 4 grupos. La droga se inyectó en forma subcutánea en tiempos 0, 7, 15, 30, 60 y 90 días postquirúrgica. Se tomaron radiografías de las tibias, inmediatamente posterior a la cirugía y en cada uno de los tiempos experimentales. Las placas fueron reveladas en forma automática con aparato Kodac XP (1100) Las muestras fueron analizadas con el Software Image ProPlus versión 4,1 de Media Cibernetics. Este software mide densidad óptica obteniendo valores numéricos que son registros

de las siguientes zonas: hueso medular, hueso cortical, zona problema y área circundante a la zona problema. La comparación de los datos fue realizada por análisis de la variancia. Resultados: los estudios radiográficos demostraron que AL desde el día 0 comienza a aumentar la densidad mineral ósea promedio (DMO), encontrándose el pico máximo a los 30 días con un valor de 157,9 DMO, comenzando a declinar hasta el día 60 donde los valores se estabilizan, llegando al día 90 con un valor de 156,1. PA se comporta igual al inicio del tratamiento pero tiene su pico máximo a los 45 días con un valor de 161,8, declinando en los días posteriores y estabilizándose a los 90 días con un valor de 156,2. El control permanece en el tiempo con valores estables a partir de los 15 días por debajo de 152,4. (P <0,001). Conclusión: Este estudio sugiere que la aplicación subcutánea de bisfosfonatos puede ser efectiva como un complemento en la terapia para la reducción de la resorción ósea después de las cirugías orales. Palabras clave: Bisfosfonatos. Reabsorción ósea. Implantes dentales.

Abstract Bisphosphonates are a class of drugs capable of modulating bone turnover and decrease their repairs when there is excessive reabsorbtion. The aim of this study was to investigate radiographic diagnostic of subcutaneous formulations based on Alendronate (AL) and Pamidronate (PA). Materials and methods: The pharmaceutical formulations were prepared with dosing for AL of 0.5 mg / kg weight, and BP of 0.6 mg / kg. They added special buffer with a pH of 5.5 in sterile media. The control (C) was saline. Results: Radiographic studies showed that AL from day 0 begins to increase mean bone mineral density (BMD), finding the peak at 30 days with a

value of 157.9, beginning to decline until day 60 where the values stabilize, reaching at day 90 with a value of 156.1. PA behaves just the start of treatment but has its peak at 45 days with a value of 161.8, declining in the following days and stabilized after 90 days with a value of 156.2. The control remains in stable values over time from 15 days down from 152.4. (P <0.001). Conclusion: This study suggests that subcutaneous application of bisphosphonates may be effective as an addon therapy to reduce bone reabsorbtion after oral surgery. Keywords: Bisphosphonates. Bone reabsorbtion. Dental implant.

La acumulación ósea de bifosfonato luego de tratamientos prolongados produce una extrema inhibición de la tasa de remodelación lo que aumenta el riesgo de fractura o cambios en las propiedades materiales del hueso, con la misma consecuencia; retardo en la consolidación de fracturas y osteonecrosis de la mandíbula, lo que ha obligado a replantear cual es la duración prudente del tratamiento de la osteoporosis con estos fármacos. (5,6) Estos fármacos actúan sobre el metabolismo y función de los osteoclastos; son liberados durante la resorción ósea e internalizados por los osteoclastos permitiendo la inhibición de la resorción ósea y favoreciendo la inducción de la apoptosis de los osteoclastos. Al no ocurrir reabsorción ósea y liberación de las proteínas inductoras de hueso como la proteína nitrogenada ILG1, ILG 0, el hueso viejo no se regenera y no forma nuevo tejido óseo. (7,8) Alendronato. Este medicamento es de uso oral, se usa para tratar la enfermedad de Paget de los huesos, para prevenir o tratar la osteoporosis, para tratar la hipercalcemia. Se calcula que la vida media de ésta es de unos 10 años. Al ingerir una tableta, el paciente no se puede sentar o parar por un mínimo de 30 minutos, ya que puede causar problemas graves de estómago o esófago por lo que debe permanecer parado por lo menos 30 minutos después de tomar esta medicina. Se debe tomar alendronato exactamente como lo indique el médico tratante. No se debe usar este medicamento en cantidades mayores o por más tiempo de lo recomendado (9-11) El Pamidronato pertenece a la clase de los amino-bisfosfonatos. Aunque no se conoce con exactitud su mecanismo de acción, se acepta que estos compuestos actúan principalmente por inhibición de la resorción ósea. Esta droga se adsorbe a la superficie mineralizada expuesta en las superficies de erosión del hueso, a las que cubre anclando su grupo geminal P-C-P en la hidroxiapatita orientando su grupo amino hacia los osteoclastos, las células responsables de la osteólisis. La presencia de pamidronato impide la adhesión de los osteoclastos a la superficie de erosión así como su activación y con ello disminuye la cantidad y la profundidad de las excavaciones en el tejido mineralizado (lagunas de Howship). En los esquemas de administración oral, inhibe la función resortiva del osteoclasto, sin afectar su vitalidad (acción no citotóxica), preservando la modulación fisiológica de la actividad de las células óseas. Se postula que la carencia de actividad citotóxica sobre el osteoclasto permite corregir los trastornos metabólicos del hueso sin perturbar la calidad

Materiales y Métodos 1- Preparación de las formulaciones: Se prepararon soluciones de AL y PA para ser aplicados por vía subcutánea. La fórmula farmacéutica con AL se hizo con una dosificación de 0.5 mg/Kg de peso corporal, y la de PA con una dosificación de 0,6 mg/Kg de peso corporal. Se les adicionó buffers especiales, con un pH final de 5,5 en medios estériles. El Control empleado(C) fue solución salina. 2- Animales de experimentación: Cuarenta y ocho ratas macho de la línea Wistar de peso 160 ± 20 g, fueron divididas en 3 grupos de 16 ratas cada uno. . Los animales de este grupo recibieron semanalmente 0,3 ml/100 g de peso corporal de solución salina por vía subcutánea cercana a la intervención quirúrgica y recibieron agua corriente de red como agua de bebida. Otro grupo (AL) se le administró semanalmente 0,5 mg de AL/Kg de peso corporal por vía subcutánea profunda en el miembro posterior izquierdo cercano a la zona quirúrgica. El tercer grupo recibió tratamiento con (PA) durante el tiempo el experimento y con las mismas condiciones quirúrgicas. Los animales se mantuvieron en bioterio en jaulas colectivas con alimento balanceado y agua de bebida ad libitum, a una temperatura de 22-26 ºC, con un ciclo luz-oscuridad: 12hs-12hs durante el tiempo que duró el experimento. El manejo de los animales siguió los lineamientos del Nacional Institute of Health (NIH) para el uso y cuidado de animales de experimentación (Publication N. 85-23, Rev 1985). Los animales fueron anestesiados con una solución de ketamina/xilazina en relación 8 mg/1.28mg respectivamente por cada 100 g de peso corporal. Previa asepsia del campo quirúrgico con yodopovidona, se hizo con bisturí Bard Parker y hoja Nº 15, una incisión longitudinal en las tibias y se decoló la facsia hasta llegar a exponer el hueso. Con una fresa número 6 y rotación manual para no producir necrosis ósea, se realizó una cavidad en la parte plana de cada tibia hasta llegar al hueso medular. Dicha cavidad no fue rellenada con ningún material. Luego de realizadas las intervenciones quirúrgicas, se recolocaron los planos en posición y se suturó la herida con hilo reabsorbible. Al finalizar los experimentos se procedió a la eutanasia de los animales mediante inyección intracardíaca de cloruro de potasio, bajo anestesia general. 3- Estudios radiográficos: Los tiempos experimentales fueron 7, 15, 30, 60, 90 días. Se tomaron radiografías de las tibias, inmediatamente posterior a la cirugía y en cada uno de los tiempos experimentales. Se utilizó aparato de Rx DSJ 70 KW de rendimiento, por técnica de cono corto, con tiempo de exposición de 0,4 décimas de segundo. Dis-

Volumen 31, número 4, 2012

Los bifosfonatos son fármacos seguros y efectivos para el tratamiento de enfermedades con reabsorción ósea, incluyendo osteoporosis, enfermedad de Paget, e hipercalcemia relacionada con malignidad, basado en su capacidad de disminuir la tasa de recambio óseo a través de la inhibición de la diferenciación de osteoclastos y la disminución de su actividad y sobrevida. (1-4)

del tejido mineralizado. (12-14) El objetivo de este estudio fue investigar por diagnóstico radiográfico, el efecto de formulaciones subcutáneas en base a Alendronato (AL) y Pamidronato (PA) a nivel óseo.

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

Introducción

tancia foco-placa 5 cm con películas radiográficas Kodak de alta sensibilidad de tamaño3 x 4 cm. periapicales. Las placas fueron reveladas en forma automática con aparato Kodac XP (1100).

Gráfico 1

Las muestras fueron analizadas con el Software Image ProPlus versión 4,1 de Media Cibernetics, diseñado para trabajar con microscopios confocales Olympus. Este software mide densidad óptica (escala de grises) obteniendo valores numéricos que son registros de las siguientes zonas: hueso medular, hueso cortical, zona problema y área circundante a la zona problema. 4- Estudios estadísticos: La comparación de los datos fue realizada por análisis de la variancia a dos criterios de clasificación (tratamientos: C, AL, PA, y tiempos de tratamiento: 0, 7. 15, 30 60 y 90 días). Se estableció nivel de significación a p<0,05 Resultados El análisis de las radiografías muestra para AL a los 0 días un DMO promedio de 144,3 llegando a los 90 días a un valor de 156,1. Para PA los valores fueron a los 0 días 140,0 y a los 90 días 156,2. El C registró un valor de 153,7 el primer día de tratamiento, llegando a los 90 días a un promedio de 154,1. (Tabla 1)

Gráfico 2

Tabla 1: Promedio de densidad óptica

0 días

7 días

15 días

30 días

45 días

60 días

90 días

Alendronato

144,3

149,5 152,2 157,6 157,9

157,5

156,1

Pamidronato

140,0

147,8 152,8 158,5 161,8

157,2

156,2

Control

153,7

153,8 154,0 154,6 153,8

154,7

154,1

Al comparar los valores de DMO, AL desde el día 0 comienza a aumentar la DMO promedio encontrándose el pico máximo a los 30 días con un valor de 157,9 de DMO y empieza a declinar hasta el día 60 donde los valores se estabilizan, llegando al día 90 con un valor de 156,1. PA se comporta igual que AL al inicio del tratamiento pero tiene su pico máximo a los 45 días con un valor de 169,6, declinando en los días posteriores y estabilizándose a los 90 días con un valor de 156,7. El C revela el comportamiento de fisiológico del hueso frente a un proceso inflamatorio provocado por injuria, con valores estables a partir de los 30 días. (Gráfico 1) Al realizar las pruebas estadísticas se evidenció que no hubo diferencias significativas en ningún tiempo para los grupos experimentales. Al comparar AL con grupo C se encontraron diferencias significativas a los 30 días (p=0,004) y a los 45 días (p=0,004); mientras que al analizar PA con el grupo C se hallaron diferencias estadísticamente significativas a los a los 7 días (p=0,007), a los 15 días (p=0,005) y a los 30 días (p=0,03). (Gráfico 2)

Discusión Nuestro modelo experimental en ratas macho tiende a reproducir el ambiente periimplantario, haciendo una cirugía en el hueso y evaluando sólo el efecto de las drogas en la neoformación ósea, elemento indispensable como soporte de futuros implantes dentales. Muchos autores han informado las complicaciones de utilizar tanto AL como PA por las distintas vías de administración. Una de estas complicaciones es la osteonecrosis maxilar producida en los pacientes con patologías sistémicas como

el cáncer, que reciben bisfosfonatos por vía intravenosa como el PA y zolendronato, y pacientes que reciben bisfosfonatos orales para el tratamiento de la osteoporosis (15-17).

Referencias

Es por ello que nuestro estudio analizó la efectividad de estas drogas, por vía subcutánea en la zona de la cirugía, para evitar efectos colaterales indeseables. Para evidenciar los efectos colaterales por acción sistémica, estudiamos radiográficamente las patas contralaterales sin cirugía. Los datos revelaron, en todos los grupos experimentales, un comportamiento estable en el tiempo sin cambios en la DMO, lo que estaría indicando la ausencia de acción farmacológica por efecto sistémico.

2. R ussell RG. Bisphosphonates: The first 40years. 2011 May 1. 3. Leu C-T, Luegmayr Eva, Freedman LP, et al. (2006) Relative binding affinities of bisphosphonates for human bone and relationship to antiresorptive afficacy. Bone 38: 628-636. 4. Van Beek ER, Cohen LH, Leroy IM, et al. (2003) Differenciating the mechanisms of antiresorptive action of nitrogen containing bisphosphonates. Bone 33: 805-11. 5. Merigo E, Manfredi M, Meleti M, et al. (2006) Bone necrosis of the jaws associated with bisphosphonate treatment: a report of twentynine cases. Acta Biomed 77:109-17. 6. Batch JA, Couper JJ, Rodda C, et al. (2003) Use of bisphosphonate therapy for osteoporosis in childhood and adolescence. J Paediatr Child Health 39: 88-92.

Nuestra investigación reveló que si bien PA fue más efectivo que AL, ambas drogas, en esta forma farmacéutica, promueven la neoformación ósea, con valores similares de promedio de DMO en los tiempos experimentales largos. En contraste con nuestros resultados Yaffe A. y col han demostrado que AL después de 1, 2 y 3 semanas (durante la fase de formación de hueso), no aumentó la cantidad de hueso o de la densidad ósea visual en el tiempo, comparado con el control. Cuando AL se inyectó de 3, 4 y 5 semanas, la masa ósea aumentó en un 70% y 166%, respectivamente, en comparación con el control (19). Por otro lado Ammann P. y col confirmaron que el tratamiento local con PA en una sola dosis administrado en forma subcutánea conduce a un aumento significativo en la DMO, el volumen y la fuerza de curación de fracturas en ratas. Si bien no es el mismo modelo experimental ya que usan ratas hembras ovacterizadas y una sola dosificación. Coincidimos en los resultados frente a PA, con la diferencia que nuestro plan estratégico de tratamiento incluye una dosis semanal (20). En conclusión, este estudio sugiere que la aplicación subcutánea de bisfosfonatos puede ser efectiva como un complemento en la terapia para la reducción de la resorción ósea después de las cirugías orales

Chiandussi S, Biasotto M, Dore F, et al. (2006) Clinical and diagnostic imaging of bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaws. Dentomaxillofac Radiol 35:236-43.

9. Ascott-Evans BH, Guanabens N, Kivinen S, et al. (2003) Alendronate prevents loss of bone density associated with discontinuation of hormone replacement therapy: a randomized controlled trial. Archives of Internal Medicine 163:789-94. 10. Bagger YZ, Tanko LB, Alexandersen P, et al. (2003) Alendronate has a residual effect on bone mass in postmenopausal danish women up to 7 years after treatment withdrawal. Bone 33:301-7. 11. Bergstrom JD, Bostedor RG, Masarachia PJ, et al. (2000) Alendronate is a specific, nanomolar inhibitor of farnesyl diphosphate synthase. Arch Biochem Biophys 373:231-41. 12. Zacharin M, Bateman J. (2002) Pamidronate treatment of osteogenesis imperfecta: lack of correlation between clinical severity, age at onset of treatment, predicted collagen mutation and treatment response. J Pediatr Endocrinol Metab 15:163-74. 13. Maksymowych WP, Lambert R, Jhangri GS, et al. (2001) Clinical and radiological melioration of refractory peripheral spondyloarthritis by pulse intravenous pamidronate therapy. J Rheumatol 28:144-55. 14. Krieg MA, Seydoux C, Sandini L, et al. (2001) Intravenous pamidronate as treatment for osteoporosis after heart transplantation: a prospective study. Osteoporos Int 12:112-6. 15. Marx RE. (2003) Pamidronate (Aredia) and Zoledronate (Zometa) induced avascular necrosis of the jaws: A growing epidemic. J Oral Maxillofac Surg 61:1115-7. 16. Ruggiero SL, Mehrotra B, Rosenberg TJ, et al. (2004) Osteonecrosis of the jaws associated with the use of bisphosphonates: a review of 63 cases. J Oral Maxillofac Surg 62:527-34. 17. Bagan JV, Murillo J, Jiménez Y, et al. (2005) Avascular jaw osteonecrosis in association with cancer chemotherapy: series of 10 cases. J Oral Pathol Med 34:120-3. 18. Altundal H, Guvener O. (2004) The effect of alendronate on resorption of the alveolar bone following tooth extraction. Int J Oral Maxillofac Surg 33:286-93. 19. Yaffe A; Kollerman R; Bahar H; et al. (2003) The influence of alendronate on bone formation and resorption in a rat ectopic bone development model. J Periodontol 74(1): 44-50. 20. Cruz Júnior AF, Buchpiguel C, Guarniero R, Barbieri A. (2011) Pamidronate and zoledronate effects in the increment of bone mineral density and histomorphometry in rats. Acta Cirúrgica brasileira 26(2):114-20.

Volumen 31, número 4, 2012

7. Migliorati CA, Schubert MM, Peterson DE, et al. (2005) Bisphosphonate-associated osteonecrosis of mandibular and maxillary bone. Cancer 104:83-93.

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

Es sabido que el incremento en la DMO es sólo uno de los aspectos del fortalecimiento óseo. Otras variables influyen también, como por ejemplo la configuración trabecular del hueso, el tamaño, la forma, la arquitectura ósea y el índice de recambio óseo (18).

1. Licata AA. Discovery, clinical development and therapeutic uses of Bisphosphonates. Ann Pharmacother. 2005; 39:668-77.

Efecto de la restricción física sobre el papel de los receptores 5-HT1A en la proliferación linfocitaria Matilde Medina Martel1, Fili Fazzino2; Lucimey Lima3 1.Cátedra de Bioquímica “C”. Escuela de Bioanálisis. Universidad Central de Venezuela. PhD en Bioquímica. Tesis realizada en el laboratorio de Neuroquímica del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. 2.Laboratorio de Neuroquímica. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. MSc en Microbiología. 3.Laboratorio de Neuroquímica. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. MD, PhD en Bioquímica. Correspondencia: Dra. Lucimey Lima, correo: lucimeylima@gmail.com

Recibido: 21/06/2012

Aceptado: 24/08/2012

Resumen

Abstract

El estrés afecta el sistema inmunológico, sin embargo, no hay reportes sobre receptores de serotonina en linfocitos. Se estudiaron los receptores 5-HT1A y la proliferación linfocitaria de ratas macho adultas luego de restricción física. Fueron colocadas en cajas de Plexiglass durante 5 horas diarias por 1, 3 ó 5 días. Se extrajo sangre cardíaca, se aislaron los linfocitos por gradiente de densidades y adhesión al plástico; se cultivaron con el agonista 8-hidroxi-di-n-propil-aminotetralina (8-OH-DPAT) ó el antagonista N-(2-(4-(2-metoxifenil)-1piperazinetil)-N-(2-piridinil) ciclohexanocarboxamida (WAY100635) de los receptores 5-HT1A y del mitógeno concanavalina A. La proliferación se midió con sales de tetrazolio. La 8-OH-DPAT no afectó la proliferación. El WAY-100635 disminuyó la proliferación. La restricción física aumentó la sensibilidad al efecto del WAY-100635, lo cual podría deberse a cambios en la expresión o a una modulación funcional de los receptores por efecto del estrés, como se ha reportado previamente en cerebro de rata.

Stress affects the immune system, however, little is known about the effects on specific modifications of lymphocytes serotonin receptors. The effects of restraint stress on the role of 5-HT1A receptors in lymphocyte proliferation were evaluated in male adult rats. They were placed in Plexiglass boxes, during 5 daily hours for 1, 3 or 5 consecutive days. Next day a blood sample was obtained by cardiac punction. Lymphocytes were isolated by density gradient and adhesion to plastic. They were cultured with agonist 8-hydroxydi-n-propyl-aminotetralin (8-OH-DPAT) or antagonist N-(2-(4(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl) ethyl)-N-(2-pyridiyl) cyclohexanecarboxamide (WAY-100635) of 5-HT1A receptors and the mitogen concanavalin A. Proliferation was measured by tetrazolium salts. 8-OH-DPAT did not modify cell proliferation; WAY-100635 diminished it. Restraint stress increased the susceptibility to effect of WAY-100635. These results suggest changes in the expression or functional modulation of 5-HT1A receptors in lymphocytes by stress, similar to previous reports on serotonergic system in rat brain.

Palabras clave: estrés, linfocitos, receptores 5-HT1A

Key words: stress, 5-HT1A receptors, lymphocytes.

Introducción La serotonina (5-HT) ejerce efectos biológicos a través de la unión a siete tipos de receptores específicos, 5-HT1 a 5-HT7, los cuales han sido clasificados, a su vez, en varios subtipos según sus características moleculares y farmacológicas (Hoyer y col., 2002; Hannon y Hoyer, 2008). Los receptores 5-HT1A participan en la regulación de procesos fisiológicos como: alimentación (Kow y col., 1992), actividad gastrointestinal (Pan y Galligan, 1995), emotividad (Julius, 1998), nocicepción (Erb y col., 1997), funciones inmunes (Aune y col., 1994) y neuroendocrinas (Hoyer y col., 2002) y están involucrados en la fisiopatogenia de desórdenes afectivos como ansiedad y la depresión mayor (Fajardo y col., 2003). Se expresan a nivel

del sistema nervioso central (Radja y col., 1992; Hoyer y col., 2002) y en varios tejidos a nivel periférico, como bazo, riñón neonatal, intestino (Kobilka y col., 1987) y células del sistema inmune(Aune y col., 1993). Los receptores 5-HT1A han sido caracterizados en linfocitos T humanos (Aune y col., 1993) y de rata (Sempere y col., 2003) y participan en la regulación de la proliferación en respuesta a mitógenos (Sempere y col., 2004; González y col., 2007). Los glucocorticoides y el estrés pueden producir cambios en la expresión (Chalmers y col., 1993; Kieran y col., 2010) y en la función (Matsuzaki y col., 2009) de los receptores 5-HT1A

Animales. Se emplearon ratas Sprague-Dawley, macho, adultas, de 250 ± 30 gramos de peso, expuestas a ciclos de luzoscuridad de 12 horas, a temperatura controlada y con libre acceso a agua y alimentos. Restricción física. Las ratas fueron introducidas en celdas de Plexiglass bien ventiladas especialmente diseñadas para tal fin y elaboradas en el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas de acuerdo con pautas establecidas (Kvetnansky y col., 1992; Sempere y col., 2003), durante 5 horas diarias por 1, 3 ó 5 días consecutivos. Los animales no fueron sometidos a compresión, ni a dolor. Las ratas del grupo control permanecieron en jaulas individuales con una mínima intervención, únicamente durante el aseo de las jaulas, realizado en forma interdiaria. El protocolo fue aprobado por el Comité de Etica del IVIC.

Análisis estadístico. Se empleó el programa Excel de Microsoft para el cálculo de promedios, desviación estándar, error estándar y aplicación de la prueba t de Student. El programa InStat, versión 3, se empleó para realizar los análisis de varianza (ANOVA). Los resultados se expresaron como la media ± el error estándar de la media y se consideró estadísticamente significativo un valor de p<0,05 (Sokal y Rohlf, 1979). Resultados Efecto de la Concanavalina A. La Con A produjo un incremento significativo de la proliferación basal tanto en controles como en animales sometidos a 1, 3 ó 5 días de restricción física (datos no mostrados). Restricción física por un día 8-OH-DPAT: no produjo cambios en la proliferación linfocitaria basal (F4,15=0,131; p=0,969) o en presencia de Con A (F4,15=0,354, p=0,837) de ratas controles, ni en la proliferación basal (F4,10=1,487; p=0,278) o en presencia de Con A (F4,10=0,059; p=0,992) de las ratas sometidas a restricción. No se observaron diferencias entre controles y sometidos a restricción respecto a la proliferación basal (F9,25=0,747; p=0,664) o en presencia de Con A (F9,25=0,444; p=0,897) (Figura 1). Figura 1

Obtención de las muestras.Al día siguiente a la última sesión de estrés, entre 8:00 y 9:00 a.m., las ratas fueron anestesiadas con dietil-éter y se les extrajo sangre por punción cardíaca, la cual fue mezclada con heparina sódica, 1000 UI/ml, a una proporción de 200 µl (200 UI)por cada 10 ml de sangre, y empleada posteriormente para la obtención de linfocitos. Linfocitos. Se aislaron por gradiente de densidades (Boyum, 1968) mediante el uso de Histopaque 1.077 g/L (Sigma) y adhesión diferencial al plástico durante 1 hora a 37°C en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Sigma suplementado con suero fetal bovino al 10% y gentamicina 100 mg% (Sempere y col., 2004). Ensayos de cultivo. Se emplearon placas de cultivo de 96 pozos de fondo cóncavo, a razón de 2x105 células viables/ pozo y se evaluó el efecto del agonista de los receptores serotonérgicos 5-HT1A, la 8-hidroxi-di-n-propil-aminotetralina (8-OH-DPAT) y del antagonista (N-(2-(4-(2-metoxifenil)-1piperazinetil)-N-(2-piridinil) ciclohexanocarboxamida trihidrocloruro (WAY-100635) a diferentes concentraciones, en ausencia o en presencia de Con A, un mitógeno de linfocitos T, a una concentración sub-óptima de 2 μg/ml (Sempere y col., 2004). El grado de proliferación se midió a las 72 horas mediante el empleo de sales de tetrazolio (MTT) y la medición

Volumen 31, número 4, 2012

Materiales y métodos

de la densidad óptica a 540 nm (Mossmann, 1983) en un lector de microplacas Tekan Genios.

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

a nivel central y podrían tener repercusiones similares a nivel linfocitario, lo que resultaría un enlace entre estrés, receptores 5-HT1A y alteraciones funcionales de los linfocitos T. Los efectos del estrés sobre el sistema inmunitario dependen, entre otras cosas, del tiempo de exposición al agente estresante (Bowers y col., 2008), pero el impacto del mismo sobre estos receptores a nivel linfocitario, ha sido poco estudiado. Por todo lo antes mencionado, este trabajo tiene como principal objetivo estudiar el efecto de tres protocolos de estrés por restricción física, con diferencias en la duración, sobre el papel de los receptores 5-HT1A en la proliferación linfocitaria basal y en respuesta al mitógeno concanavalina A (Con A).

Efecto del agonista 8-OH-DPAT sobre la proliferación de linfocitos de ratas controles (A) y sometidas a 1 día de restricción física (B), en ausencia y en presencia de Con A. (A) Sin Con A (F4,15=0,131; p=0,969); (A) Con A (F4,15=0,3537; p=0,838). (B) Sin Con A (F4,10=1,487; p=0,278); (B) Con A (F4,10=0,059; p=0,992). Sin Con A (A) respecto a Sin Con A (B) (F9,25=0,747; p=0,664); Con A (A) respecto a Con A (B) (F9,25=0,444; p=0,897). (a)=p<0,05 respecto a sin Con A. (A), n=4; (B), n=3.

WAY-100365: no produjo cambios en la proliferación basal de ratas controles (F4,15=0,932; p=0,472), pero sí en presencia de Con A (F4,15=3,620, p=0,029). Este antagonista produjo cambios significativos en la proliferación basal (F4,10=5,120; p=0,017) y en presencia de Con A (F4,10=4,860; p=0,019) en el grupo sometido a restricción. La proliferación basal no fue diferente entre controles y sometidos a restricción (F9,25=1,956; p=0,089). La proliferación en presencia de Con A fue diferente entre controles y sometidos a restricción (F9,25=4,128; p=0,002) (Figura 2).

Figura 2

WAY-100365: no produjo cambios en la proliferación basal de ratas controles (F4,25=0,796; p=0,539), pero si en presencia de Con A (F4,25=3,597, p=0,019). En el grupo sometido a restricción, el WAY-100635 no produjo cambios significativos en la proliferación basal (F4,25=2,698; p=0,054), pero sí en presencia de Con A (F4,25=6,231; p=0,001). No hubo diferencias entre controles y sometidos a restricción con respecto a la proliferación basal (F9,50=1,629; p=0,132), pero sí en presencia de Con A (F9,50=5,368; p<0,0001) (Figura 4). Figura 4

Efecto del antagonista WAY-100635 sobre la proliferación de linfocitos de ratas controles (A) y sometidos a 1 día de restricción física (B) en ausencia y en presencia de Con A. (A) Sin Con A (F4,15=0,932; p=0,472); (A) Con A (F4,15=3,620; p=0,0295). (B) Sin Con A (F4,10=5,120; p=0,017); (B) Con A (F4,10=4,860; p=0,019). Sin Con A (A) respecto a Sin Con A (B) (F9,25=1,956; p=0,089); Con A (A) respecto a Con A (B) (F9,25=4,128; p=0,002). (a)=p<0,05 respecto a sin Con A; (b)=p<0,05 respecto a 0 Con A, (c)=p<0,05 respecto a 12,5 Con A; (d)=p<0,05 respecto a 0 sin Con A, (e)=p<0,05 respecto a 12,5 sin Con A. (A), n=4; (B), n=3.

Restricción física por tres días 8-OH-DPAT: no produjo cambios en la proliferación linfocitaria de ratas controles en ausencia (F4,25=0,353; p=0,840) o en presencia de Con A (F4,25=0,114, p=0,976), ni de ratas sometidas a restricción en ausencia (F4,25=0,860; p=0,501) o en presencia de Con A (F4,25=0,032; p=0,998). No se observaron diferencias entre controles y sometidos a restricción con respecto a la proliferación basal (F9,50=0,738; p=0,672) o en presencia de Con A (F9,50=1,486; p=0,179) (Figura 3). Figura 3

Efecto del agonista 8-OH-DPAT sobre la proliferación de linfocitos de ratas controles (A) y sometidas a 3 días de restricción física (B) en ausencia y en presencia de Con A. (A) Sin Con A (F4,25=0,353; p=0,840); (A) Con A (F4,25=0,114; p=0,976). (B) Sin Con A (F4,25=0,860; p=0,501); (B) Con A (F4,25=0,032; p=0,998). Sin Con A (A) respecto a Sin Con A (B) (F9,50=0,738; p=0,672); Con A (A) respecto a Con A (B) (F9,50=1,486; p=0,179). (a)= p<0,05 respecto a sin Con A. (A), n=6; (B), n=6.

Efecto del antagonista WAY-100635 sobre la proliferación de linfocitos de ratas controles (A) y sometidas a restricción física por 3 días (B) en ausencia y en presencia de Con A. (A) Sin Con A (F4,25=0,796; p=0,539); (A) Con A (F4,25=3,597; p=0,019). (B) Sin Con A (F4,25=2,698; p=0,054); (B) Con A (F4,25=6,231; p=0,001). Sin Con A (A) respecto a Sin Con A (B) (F9,50=1,629; p=0,132), Con A (A) respecto a Con A (B) (F9,50=5,368; p<0,0001). (a)=p<0,05 respecto a sin Con A, (b)=p<0,05 respecto a 0 μM + Con A, (c)=p<0,05 respecto a 12,5 μM, (d)= p<0,05 respecto a 25 μM, (e)= p<0,05 respecto a 50 μM, (f)= p<0,05 respecto a 0 μM sin Con A. (A) y (B), n=6.

Restricción física por cinco días 8-OH-DPAT: no produjo cambios en la proliferación basal (F4,25=0,519; p=0,723) o en presencia de Con A (F4,25=0,450, p=0,771) de ratas controles; ni en la proliferación basal (F4,25=0,654; p=0,629) o en presencia de Con A (F4,25=0,372; p=0,826) del grupo sometido a restricción. No se observaron diferencias entre controles y sometidos a restricción con respecto a la proliferación basal (F9,50=1,138; p=0,355) o en presencia de Con A (F9,50=0,743; p=0,668) (Figura 5). WAY-100365: en ratas controles, el WAY-100635 no produjo cambios en la proliferación basal (F4,25=1,589; p=0,208), pero sí en presencia de Con A (F4,25=4,107, p=0,011). En el grupo sometido a restricción, este antagonista no produjo cambios significativos en la proliferación basal (F4,25=2,182; p=0,100), pero si en presencia de Con A (F4,25=7,077; p=0,0006). No hubo diferencias entre controles y sometidos a restricción con respecto a la proliferación basal (F9,50=1,763; p=0,099) pero sí en presencia de Con A (F9,50=5,208; p<0,0001) (Figura 6).

Figura 6

Efecto del antagonista WAY-100635 sobre la proliferación de linfocitos de ratas controles (A) y sometidas a 5 días de restricción (B) en ausencia y en presencia de Con A. (A) Sin Con A (F4,25=1,589; p=0,208); (A) Con A (F4,25=4,107; p=0,011). (B) Sin Con A (F4,25=2,182; p=0,100); (B) Con A (F4,25=7,077; p=0,0006). Sin Con A (A) respecto a Sin Con A (B) (F9,50=1,763; p=0,099); Con A (A) respecto a Con A (B) (F9,50=5,208; p<0,0001). (a)=p<0,05 respecto a sin Con A, (b)=p<0,05 respecto a 0 Con A, (c)=p<0,05 respecto a 12,5 Con A, (d)= p<0,05 respecto a 25 Con A, (e)= p<0,05 respecto a 50 μM, (f)= p<0,05 respecto a 0 μM sin Con A. (A) y (B), n=6.

Discusión El agonista de los receptores 5-HT1A, la 8-OH-DPAT, no produjo incrementos significativos en la proliferación linfocitaria basal o en respuesta a la Con A, tanto en controles como en ratas sometidas a restricción física por 1, 3 ó 5 días. Estos resultados coinciden con trabajos previos (Sempere y col., 2004) realizados en ratas no estresadas, en los cuales se observó que la 8-OH-DPAT, en un amplio rango de concentraciones, no modificó la proliferación de linfocitos de rata, ni en condiciones basales, ni en presencia del mitógeno. Se

El WAY-100635, un antagonista silencioso y altamente selectivo de los receptores 5-HT1A, produjo disminución de la proliferación linfocitaria, tanto en ausencia como en presencia de Con A. Estudios previos han demostrado este efecto inhibidor del WAY-100635 sobre la proliferación de linfocitos T de ratas no estresadas (Sempere y col., 2004) y de humanos (González y col., 2007) en cultivo, pero no se había evaluado el impacto del estrés sobre el efecto inhibitorio del WAY-100635 en la proliferación linfocitaria. Aune y col. (1994) demostraron que los antagonistas de los receptores 5-HT1A, metitepina, NAN-190 y pindobind,producían disminución de la proliferación de linfocitos T humanos, lo cual estuvo asociado al aumento en los niveles de AMPc intracelulares.En presencia de Con A, los linfocitos mostraron una mayor sensibilidad al efecto inhibitorio del antagonista WAY-100635, tanto en controles como en estresados. Esto podría deberse al aumento del número de sitios 5-HT1A reportado en estas células después del tratamiento in vivo con Con A (Aune y col., 1993; Sempere y col., 2003), así como del ARNm y la proteína de estos receptores (Abdouh y col, 2001). La restricción física moduló el efecto inhibidor de este antagonista sobre la proliferación celular, ya que los estresados fueron más sensibles a la droga, posiblemente debido al incremento en su expresión,a alteraciones funcionales que afectaran el acoplamiento de estos receptores a proteínas G o a cambios en la expresión de proteínas asociadas a vías de señalización intracelular, lo que incluye a las proteínas G, como se ha demostrado en el rafe dorsal de rata (Fairchild y col., 2003) y en otros tipos de receptores acoplados a proteínas G (Javan y col., 2006), esto en respuesta a tratamiento con glucocorticoides y ala exposición a estrés, respectivamente.

Volumen 31, número 4, 2012

Efecto del agonista 8-OH-DPAT sobre la proliferación de linfocitos de ratas controles (A) y sometidas a restricción física por 5 días (B) en ausencia y en presencia de Con A. (A) Sin Con A (F4,25=0,519; p=0,723); (A) Con A (F4,25=0,450; p=0,771). (B) Sin Con A (F4,25=0,654; p=0,629); (B) Con A (F4,25=0,372; p=0,826). Sin Con A (A) respecto a Sin Con A (B) (F9,50=1,138; p=0,355); Con A (A) respecto a Con A (B) (F9,50=0,743; p=0,668). (a)=p<0,05 respecto a sin Con A. (A) y (B), n=6.

ha reportado que la 8-OH-DPAT disminuye el efecto inhibitorio que ejercen antagonistas de los receptores 5-HT1A como metitepina (Aune y col., 1994) ode agonistasβ-adrenérgicos como isoproterenol (Sempere y col., 2004) sobre la proliferación de linfocitos T cultivados en presencia de mitógenos. El restablecimiento de la proliferación linfocitaria en presencia de la 8-OH-DPAT podría producirse a través de la modulación de los niveles intracelulares de AMPc (Mizrahi y col., 2004), ya que el incremento del AMPc intracelular disminuye la proliferación y su disminución la aumenta (Naderi y col., 2005), por lo cual la estimulación de los receptores 5-HT1A favorecería la proliferación a través de la disminución de los niveles intracelulares de AMPc (Sempere y col., 2004, Lima y col., 2007).La 8-OH-DPAT tiene una alta afinidad por los receptores 5-HT1A, pero puede unirse con menor afinidad a los receptores 5-HT7 (Faure y col, 2006; Filip y Bader, 2009), por lo cual no podría descartarse que la ausencia de efecto observada en presencia de este agonista sobre la proliferación se deba parcialmente a la activación de los receptores 5-HT7,los cuales han sido identificados en linfocitos (Arroyo, 2009; León Ponte y col., 2009) y podrían aumentar el contenido intracelular de AMPc al ser estimulados en estas células (Hoyer y col., 2002). También podría considerarse un efecto máximo de los receptores 5-HT1A que no permita modificaciones ocasionadas por el agonista.

AVFT Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica

Figura 5

Con respecto al tiempo de estrés, luego de 1 día de restricción se observó una mayor susceptibilidad de los linfocitos al efecto inhibitorio del WAY-100635 en ausencia de Con A, lo cual difiere de lo observado a 3 y 5 días de restricción. Sin embargo, en presencia del mitógeno, la suceptibilidad al WAY100635 fue similar entre los tres protocolos. Esta diferencia podría deberse al desarrollo de mecanismos adaptativoscelulares al estrés sostenido por 3 y 5 días. Estos mecanismos podrían incluir cambios en la modulación de receptores de 5-HT y de mediadores de estrés como glucocorticoides, neuropéptidos y catecolaminas.Otros investigadores han reportado que el tiempo es crítico en cuanto a los efectos del estrés sobre la respuesta proliferativa linfocitaria (Bauer y col., 2001; Silberman y col., 2004; Satoh y col, 2006; Frick y col., 2009), pero esto es difícil de determinar porque depende de diversos factores inherentes al modelo en estudio (especie, sexo, edad, tejido, entre otros). Sin embargo, varios aspectos son comunes entre los diferentes sistemas estudiados. Estos resultados nos indican que el estrés no sólo es un modulador de los receptores 5-HT1A a nivel cerebral (Kieran y col, 2010; Morrison y col, 2011; Jovanovic y col., 2011),tejido en el que se ha asociado a alteraciones en varios parámetros del sistema serotonérgico central que están involucradas en trastornos depresivos o de ansiedad (Savitz y col., 2009; Fajardo y col. 2003), sino que también sucede a nivel linfocitario.Esta relación estrés-receptores serotonérgicos-linfocitos, aunque ha sido poco estudiada, podría ser clave en la fisiopatogenia de las alteraciones inmunitarias reportadas en individuos estresados (Cohen y col., 2007; Miller y col., 2009) y en deprimidos (Weinstein y col., 2010).

Conclusiones 92

Aunque el agonista 8-OH-DPAT no aumentó la proliferación linfocitaria en presencia de una concentración sub-óptima de Con A, no puede descartarse que este efecto se deba, al menos parcialmente, a la activación de otros receptores serotonérgicos como los receptores 5-HT7 o a un estado ya activado de estos receptores. No obstante, el efecto inhibitorio producido por un antagonista altamente específico y silencioso como el WAY-100635, indica que los receptores 5-HT1A son susceptibles de bloqueo y desempeñan un papel importante en la proliferación linfocitaria. En cuanto al tiempo de estrés, la diferencia principal entre los tres protocolos se observó en ausencia del mitógeno y podría reflejar cambios adaptativos en la expresión y función de receptores celulares luego de estrés prolongado cuando se añade una estimulación como la ocasionada por la Con A. La mayor sensibilidad al antagonista WAY-100635 en presencia de Con A por parte de los linfocitos provenientes de animales sometidos a 1, 3 y 5 días de restricción respecto a sus controles, sugiere que la restricción física podría modular la actividad de los receptores 5-HT1A a través de cambios en la expresión de los mismos, de las proteínas Gi/o u otras proteínas involucradas

en las vías de señalización, sobre todo en condiciones de activación celular. Estos resultados sustentan la importancia de profundizar en el estudio de los efectos moduladores del estrés sobre la función del sistema serotonérgico linfocitario para conocer su participación en la fisiopatogenia de desórdenes inmunitarios o psiquiátricos que se producen como consecuencia de situaciones de estrés prolongado. Agradecimientos. FONACIT, Proyecto G-1387. CDCH de la Universidad Central de Venezuela por el financiamiento de la Beca Sueldo Nacional de la Prof. Matilde Medina M.

Referencias Abdouh, M.,Storring, J. M., Riad, M., Paquette, Y., Albert, P. R., Drobetsky, E., Kouassi, E. (2001)Transcriptional mechanisms for induction of 5-HT1A receptor mRNA and protein in activated B and T lymphocytes.J. Biol. Chem., 276: 4382-4388. Arroyo, R. D. (2009).Expresión de los receptores 5-HT7 en linfocitos de ratassometidasaestrés. Trabajo especial de gradoparaoptar al título de Magister Scientiarum. InstitutoVenezolano de InvestigacionesCientíficas. Aune, T. M., Golden, H. W., McGrath, K. M. (1994) Inhibitors of serotonin synthesis and antagonists of serotonin 1A receptors inhibit T lymphocyte function in Vitro and cell-mediated immunity in vivo. J. Immunol., 153: 489-498. Aune, T. M., McGrath, K. M., Sarr, T., Bombara, M.P., Kelley, K. (1993) Expression of 5-HT1a receptors on activated human T cells. The Journal of Immunology, 151: 1175-1183. Bauer, M. E.,Perks, P., Lightman, S. L., Shanks, N. (2001)Restraint stress is associated with changes in glucocorticoidimmunoregulation. Physiol. Behav., 73: 525-532. Bøyum, A. (1968) Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. J. clin. Invest. 21: 77-79. Bowers, S.L., Bilbo, S. D., Dhabbar, F. S., Nelson, R.J. (2008) Stressor-specific alterations in corticosterone and immune responses in mice. Brain, Behav and Immun., 22: 105-113. Chalmers, D.T., Kwak, S.P., Mansour, A., Akil, H., Watson, S.J. (1993) Corticosteroids regulate brain hippocampal 5-HT1A receptor mRNA expression. J. Neurosc., 13: 914-923. Cohen, F., Kemeny, M. E., Zegans, L. S., Johnson, P., Kearney, K. A., Sittes, D. P. (2007). Immune function declines with unemployment and recovers after stressor termination. Psychosom. Med. 69: 225-234. Erb, C.,Klein, J., Köppen, A., Löffelholz, K., Jeltsch, H., Cassel, J. C. (1997) Modulation of hippocampal acetylcholine release after fimbria-fornix lesions and septal transplantation in rats.Neurosc. Lett., 231: 5-8. Fairchild, G.,Leitch, M. M., Ingram, C. D. (2003)Acute and chronic effects of corticosterone on 5-HT1A receptor-mediated autoinhibition in the rat dorsal raphe nucleus. Neuropharmacology, 45: 925-934. Fajardo, O., Galeno, J., Urbina, M., Carreira, I., Lima, L. (2003) Serotonin, serotonin 5-HT(1A) receptors and dopamine in blood peripheral lymphocytes of major depression patients. IntImmunopharmacol., 3: 1345-1352. Faure, C., Mnie-Filali, O., Scarna, H., Debonnel, G., Haddjeri, N. (2006)Effects of the 5-HT7receptorantagonistSB-269970 on rat hormonal and temperatureresponses to the 5-HT1A/7receptoragonist8-OH-DPAT. Neurosc. Lett., 404: 122-126. Filip, M., Bader, M. (2009)Overview on 5-HTreceptors and theirrole in physiology and pathology of the central nervous system. Pharmacol. Rep., 61: 761-777. Frick, L. R., Arcos, M. L., Rapanelli, M., Zappia M. P., Brocco, M., Mongini, C., Genaro, A. M., Cremaschi, G. A. (2009)Chronicrestraint stress impairs T-cellimmunity and promotestumor progression in mice. Stress, 12: 134-143. González, A., Fazzino, F., Castillo, M., Mata, S., Lima, L. (2007) Serotonin, 5-HT1A serotonin receptors and proliferation of lymphocytes in major depression patients. Neuroimmunomodulation, 14: 8-15. Hannon, J., Hoyer, D. (2008) Molecular biology of 5-HT receptors. Behav. Brain Res., 195: 198-213. Hoyer, D., Hannon, J.P., Graeme, M., (2002) Molecular, pharmacological and functional diversity of 5-HT receptors.Pharmacol. Biochem. Behav., 71: 533-554. Javan, M.,Kazemi, B., Ahmadiani, A., Motamedi, F. (2006)Dexamethasone mimics

the inhibitory effect of chronic pain on the development of tolerance to morphine analgesia and compensates for morphine induced changes in G proteins gene expression.Brain Res., 1104: 73-79.

Morrison, K. E., Swallows CL, Cooper, MA. (2011)Effects of dominance status on conditioned defeat and expression of 5-HT1A and 5-HT2A receptors. Physiol. Behav., 104:283-90.

Jovanovic, H., Perski, A., Berglund, H., Savic, I. (2011) Chronic stress is linked to 5-HT(1A) receptor changes and functional disintegration of the limbic networks. Neuroimage, 55: 1178-1188.

Mossmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods., 65: 55-63.

Julius, D. (1998) Serotonin receptor knockouts: a moody subject.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 95: 15153-15154. Kieran, N., XM, O., AH, I. (2010) Chronic social defeat downregulates the 5-HT1A receptor but not Freud-1 or NUDR in the rat prefrontal cortex. NeurosciLett.; 469: 380-384. Kobilka, B. K.,Frielle, T., Collins, S., Yang-Feng, T., Kobilka, T. S., Francke, U., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. (1987) An intronless gene encoding a potential member of the family of receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins.Nature, 329: 75-79. Kow, L. M.,Tsai, Y. F., Wang, L., Pfaff, D. W. (1992) Electrophysiological analyses of serotonergic actions on neurons in hypothalamic ventromedial nucleus in vitro: receptor subtypes involved and implications for regulation of feeding and lordosis behaviors. Chin. J. Physiol., 35: 105-121. Kvetnansky, R.,Goldstein, D. S., Weise, V. K., Holmes, C., Szemeredi, K., Bagdy, G., Kopin, I. J. (1992)Effects of handling or immobilization on plasma levels of 3,4-dihydroxyphenylalanine, catecholamines, and metabolites in rats.J.Neurochem., 58: 2296-2302. León-Ponte, M., Ahern, G.A., O’Connell, P. J. (2007) Serotonin provides an accesory signal to enhance T-cell activation by signaling through the 5-HT7 receptor. Blood, 109: 3139-3146. Lima, L., Urbina, M., Fazzino, F., Carreira, I., Mata, S. (2007)Theserotonergic system in peripheral lymphocytes of major depression patients. Recent Advances and Research Updates., 8: 183-189. Matsuzaki, H., Izumi, T., Matsumoto, M., Togashi, H., Yamaguchi, T., Yoshida, T., Watanabe, M., Yoshioka, M. (2009).Early postnatal stress affects 5-HT1A receptor function in the medial prefrontal cortex in adult rats. Eur. J. Pharmacol., 615: 76-82. Miller, G., Rohleder, N., Cole, S. W. (2009) Chronic interpersonal stress predicts activation of Pro- and Anti-inflammatory signalling pathways six months later. Psychosom. Med., 71: 57-62.

Naderi, S., Wang, J. Y. J., Chen, T. T., Gutzkow, K. B., Blomhoff, H. K. (2005)cAMPmediated inhibition of DNA replication and S phase progression: involvement of Rb, p21Cip1,and PCNA. Mol. Biol. Cell., 16: 1527-1542. Pan, H., Galligan, J. J. (1995)Effects of 5-HT1A and 5-HT4 receptor agonists on slow synaptic potentials in enteric neurons.Eur. J. Pharmacol., 278: 67-74. Radja, F., Daval, G., Hamon, M., Vergé, D. (1992) Pharmacological and physicochemical properties of pre-versus postsynaptic 5-hydroxytryptamine1A receptor binding sites in the rat brain: a quantitative autoradiographic study. Journal of Neurochemistry, 58: 1338-1346. Savitz, J., Lucki, I., Drevets, WC. (2009) 5-HT(1A) receptor function in major depressive disorder. Prog. Neurobiol., 88: 17-31. Satoh, E., Edamatsu, H., Omata, Y. (2006) Acute restraint stress enhances calcium mobilization and proliferative response in splenic lymphocytes from mice. Stress, 9: 223-30. Sempere, T., Cedeño, N., Urbina, M., Lima, L. (2003) 8-[3H]-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin binding sites in blood lymphocytes of rats and the modulation by mitogens and immobilization. J. Neuroimmunol., 138: 8-16. Sempere, T., Urbina, M., Lima, L. (2004) 5-HT1A and β-adrenergic receptors regulate proliferation of rat blood lymphocytes. Neuroimmunomodulation, 11: 307-315. Silberman, D. M.,Ayelli-Edgar, V., Zorrilla-Zubilete, M., Zieher, L. M., Genaro, A. M. (2004)Impaired T-cell dependent humoral response and its relationship with T lymphocyte sensitivity to stress hormones in a chronic mild stress model of depression. Brain Behav. Immun., 18: 81-90. Sokal, R. R., Rohlf, F. J. (1979) Biometria, principios y métodos estadísticos en la investigación biológica. Primera Edición, H. Blume Ediciones, España. Weinstein, A. A., Deuster, P., Francis, J. L., Bonsall, R.W., Tracy, R. P., Kop, W. J. (2010) Neurohormonal and inflammatory hyper-responsiveness to acute mental stress in depression. Biol. Psychol. Doi:10.1016/ j.biopsycho.2010.01.016.

Mizrahi, C., Stojanovic, A., Urbina, M., Carreira, I., Lima, L. (2004) Differential cAMP levels and serotonin effects in blood peripheral mononuclear cells and lymphocytes from major depression patients. Int. Immunopharmacol. , 4: 1125-1133.

Daniel J. Aparicio Escrito durante el año de cumplimiento del artículo 8 de la Ley del Ejercicio de la Medicina en el medio rural Caicara del Orinoco (Estado Bolívar). Contiene el poema “Ni Negro, Ni Blanco; Antirracista” ganador de Mención Honorifica en el Segundo Certamen Literario “art&mañas” de la Fundación Cultural Omnilife, Guadalajara, México. El brindis y lanzamiento oficial del libro fue el 16 de Agosto de 2012 en la Casa de la Cultura del Municipio Cabimas, Estado Zulia, contando tanto con televisoras regionales (“Zuliana de Televisión” y “Grupo Audiovisual de la Alcaldía de Cabimas”) y prensa nacional (Diario “Qué Pasa” y “Panorama”), así como con representantes de distintas agrupaciones y sociedades culturales. Facetas, Macetas Y Otras Lancetas… Facetas… máscaras que escogemos a diario, y presentamos a todos según nuestra voluntad y sentimiento. Macetas… palabra tan compleja y de varios significados como la anterior, resume paisajes, lugares, fronteras, pero también los golpes del destino. Lancetas… las rosas no son rosas sin sus espinas, del mundo visualizamos injusticias, falsedades, mediocridades, y exigimos un cambio pero del cual también formamos parte al no recordar que las espinas nacen desde nuestro interior.

Índice de autores 2012. Volumen 31 A

Acevedo Carmen H., 2012; 31 (3):62 Aguzzi Alejandra, 2012; 31 (2):37; (4):85 Alfonzo Marcelo J., 2012; 31 (4):72 Alfonzo Pablo, 2012; 31 (3):62 Alzaibar Juan. C, 2012; 31 (2):32 Angarita Ana, 2012; 31 (1):17 Angulo Yuraima, 2012; 31 (3):62 Arrieta Darwuin, 2012; 31 (2):34

B Balli María, 2012; 31 (3):62 Becerra Sánchez Arian, 2012; 31 (2):23 Bello Hector, 2012; 31 (2):32 Bravo Luisa, 2012; 31 (3):62 Briceño Luis, 2012; 31 (3):62 Brito Gómez María I., 2012; 31 (3):62

C Caldera Aura; 2012; 31 (1):17 Cárdenas María C., 2012; 31 (3):62 Casar Henry, 2012; 31 (3):62 Castellano Antonio, 2012; 31 (3):62 Cohen Sabban Hugo; 2012; 31 (1):6 Cova Zully. 2012; 31 (3):62 Chanan Sanad, 2012; 31 (3):62 Chávez Romero Perla B., 2012; 31 (2):23 Cheng Carmen; 2012; 31 (3):67

D 93

D´Vicente Jesús, 2012; 31 (3):62 De Haccis Yajaira, 2012; 31 (3):62 De Leonardi Adriana. 2012; 31 (4):85

H Haro Norna, 2012; 31 (3):62 Hassan-Soto Walid, 2012; 31 (4):72 Hurtado Aisha; 2012; 31 (1):17 Hurtado Doris, 2012; 31 (3):62

L Lima Lucimey; 2012; 31 (4):89 Linares Evelin, 2012; 31 (3):62 Linco Antonio, 2012; 31 (3):62 Lippo de Becemberg Itala, 2012; 31 (4):72 López Milagro, 2012; 31 (3):62

M Maestracci Felipe, 2012; 31 (3):62 Maniglia Gema, 2012; 31 (2):34 Marcial Tulio, 2012; 31 (2):34 Marín Carmen, 2012; 31 (3):62 Márquez María, 2012; 31 (3):62 Márquez Teodoro, 2012; 31 (3):62 Martínez G. 2012; 31 (4):80 Medina Martel Matilde, 2012; 31 (4):89 Mejías María, 2012; 31 (3):62 Méndez Gisela; 2012; 31 (1):17 Milano Balentina; 2012; 31 (1):17 Morales Abelardo, 2012; 31 (2):32; 34 Morales Aries, 2012; 31 (3):62 Morales Julio, 2012; 31 (3):62 Moreno Evelin, 2012; 31 (3):62 Moreno García María A. 2012; 31(2):23; 51 Muñoz Danilo, 2012; 31 (3):62 Muñoz Escobedo José J. 2012; 31 (2):23; 51

Nahan Royel, 2012; 31 (3):62

E Estrella Rosa Linda, 2012; 31 (3):62

Odreman Imeria; 2012; 31 (1):17

F Fazzino Fili; 2012; 31 (4):89 Fernández Jerez Puebla, , 2012; 31 (4):80 Flores Sergio, 2012; 31 (2):34

G García Francisco, 2012; 31 (2):34 García Jesús, 2012; 31 (3):62 García Robles Mayra J., 2012; 31 (2):51 Gil Zaida, 2012; 31 (3):62 Goncalves Teresa; 2012; 31 (1):17 González de Alfonzo Ramona, 2012; 31 (4):72 González Y. María; 2012; 31 (1):6; 11; 17: (3):62; 67 Grieko Francisco; 2012; 31 (3):67 Guerra de González Lérida; 2012; 31 (4):72 Guía Pablo, 2012; 31 (3):62

P Paiva Rafael; 2012; 31 (3):67 Perazo Flor, 2012; 31 (3):62 Pérez Alcibíades; 2012; 31 (3):67 Perurena Illnait, , 2012; 31 (4):80

Q Quijada Gladys, 2012; 31 (3):62 Quintero Alberto; 2012; 31 (1):17 Quintero Grecia, 2012; 31 (3):62 Quintero Miguel; 2012; 31 (1):17

Rany Leslie, 2012; 31 (3):62 Reveles Hernández Gabriela, 2012; 31 (2):51 Ricco Verónica, 2012; 31 (2):37 Rocha Aleida, 2012; 31 (3):62 Rodríguez de Marquis M.; 2012; 31 (1):11 Rodríguez I; 2012; 31 (4):80 Rojas Mary, 2012; 31 (3):62 Rossini Mario. 2012; 31 (2):34

S Sánchez Elsa, 2012; 31 (2):34 Serrano Karla, 2012; 31 (3):62 Sinai Fragoza G. 2012; 31 (3):44 Suárez Mabel, 2012; 31 (3):62

Torrealba José, 2012; 31 (3):62 Tovar Luis, 2012; 31 (3):62

Uscátegui Deysy, 2012; 31 (3):62

V Valencia Marcela, 2012; 31 (3):62 Valero Zuleima; 2012; 31 (1):17 Vallejo Mariela, 2012; 31 (2):32 Varela Castillo Laura, 2012; 31 (2):23 Velásquez Guillermo; 2012; 31 (3):67 Vesga Vivas David, 2012; 31 (3):62 Villalobos Marilyn, 2012; 31 (3):62 Villamizar José; 2012; 31 (1):17 Villavicencio Carmen C, 2012; 31 (3):62 Villega María, 2012; 31 (3):62 Villoria L Diana C., 2012; 31 (2):32 Virga Carolina, 2012; 31 (4):85 Virga María C, 2012; 31 (2):37