Revista avft 4 2015 by felipe espino

las revistas e tr n e 1 ro la La Núme en Venezue biomédicas

Manuel Velasco, Editor Volumen 34, Número 4, 2015 ISSN 0798-0264 Depósito Legal pp. 198202DF62

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Contenido Análisis funcional de la actividad anti-tripanosoma de compuestos seleccionados Functional analysis of trypanocidal effect of selected compounds

Marcadores de resistencia en Leishmania: Susceptibilidad in vitro a drogas leishmanicidas vs retención de calceina en aislados de pacientes venezolanos con Leishmaniasis Cutánea Difusa Resistance markers in Leishmania: in vitro drug susceptibility vs leishmanicidas calcein retention in isolated venezuelan patients with diffuse cutaneous leishmaniasis Maritza Padrón-Nieves y Alicia Ponte-Sucre

Sobre un caso de intoxicación por el uso de la planta de estropajo o tusa (Luffa cylíndrica) en Venezuela About a case of intoxication by the use of the loofah sponge or tusa (Luffa cylíndrica) in Venezuela Yudith Guerrero, Betty Omaña, Alexis Rodríguez-Acosta

Determinación de la glucosa en sangre de equinos pura sangre de carrera medicados con fenilbutazona y flunixin meglumine Determination of glucose of blood in thoroughbred horses medicated with phenylbutazone and flunixin meglumine Abelardo Morales Briceño, Diana Villoria, Mario Rossini, Luís Rivero, Mariam Gómez, Hector Bello

62 Volumen 34, Número 4, 2015 ISSN 0798-0264

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3.1. Título del artículo, conciso pero informativo.

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Análisis funcional de la actividad anti-tripanosoma de compuestos seleccionados Functional analysis of trypanocidal effect of selected compounds

Abstract

La tripanosomiasis africana humana es una enfermedad transmitida por vectores, fatal si no se trata. La incidencia anual de pacientes solía ser muy alta, pero se ha reducido a menos de 10.000 por año. Esta declaración se esgrime para afirmar que no es necesario invertir en el desarrollo de nuevos fármacos contra la enfermedad del sueño. Sin embargo, la misma puede reaparecer, como en el pasado, cada vez más agresiva. Muy pocos compuestos están siendo analizados en entornos clínicos y la tasa de supervivencia de las moléculas es extremadamente baja; ninguno de los candidatos se encuentra en fase tres de evaluación clínica. En el marco de un proyecto multicéntrico, liderado por los Profesores Ulrike Holzgrabe y Gerhard Bringmann de la Universidad de Würzburg en Alemania, evaluamos previamente los cambios morfológicos y ultraestructurales producidos por compuestos líder sintetizados miembros de las familias estudiadas sobre Trypanosoma brucei. Los datos sugieren que las moléculas estudiadas podrían afectar el retículo endoplasmático (la bisnaftilamida biscuaternaria, 37) y la mitocondria y el cinetoplasto (la sal de N-Arylpyridinium, 88). En este trabajo determinamos si los compuestos 37 y 88 son parasitostáticos o parasiticidas, si actúan de forma sinérgica con las drogas clásicas y si afectan el estado metabólico de la célula. Nuestros resultados sugieren que 37 es parasiticida y 88 parasitostático, que ambos compuestos son sinérgicos con pentamidina y que 37 es sinérgico con eflornitina, y al igual que pentamidina y eflornitina, no altera la relación ADP / ATP o los niveles de glucosa del parásito, sugiriendo que su efecto no está asociado a la alteración del estado metabólico celular.

Human African Trypanosomiasis is a vector-borne disease, fatal if left untreated. The annual incidence of patients used to be outrageous, but it has dropped to less than 10,000 per year. This statement has been used to assert that it is not necessary to invest in the development of new drugs against sleeping sickness. However, the disease may return, increasingly aggressive. Only a small number of compounds are being analyzed in clinical settings and the survival rate of candidates is normally low; none of the candidates is actually in phase three evaluation.

Palabras clave: Trypanosoma brucei, enfermedad del sueño, bisnaftilamida biscuaternaria, sal de N-Arylpyridinium, efecto metabólico, sinergismo.

Previously we assessed the morphological and ultrastructural changes produced by members of families of compounds synthesized within the frame of our university consortium multicenter project, led by Professor Ulrike Holzgrabe and Gerhard Bringmann, University of Würzburg, Germany on Trypanosoma brucei. The data suggested that the endoplasmic reticulum membrane systems (for the bisquaternary bisnaphthalimide 37) and the mitochondria and kinetoplast (for the N-Arylpyridinium salt 88) might be the potential organelles targeted. Herein we have determined whether these compounds are parasitostatic or parasitocydal, act synergistically with classical trypanocydal drugs and if they affect the metabolic status of the cell. Our results suggest that 37 seems to be parasitocidal while 88 seems to be parasitostatic, but that both compounds exert a synergistic effect with pentamidine, and 37 eflornithine. We further determined 37 and 88 did not alter the parasite ADP/ATP ratio or the parasite glucose levels thus indicating that they do not alter the metabolic status of the parasite. Key words: Trypanosoma brucei, sleeping sickness, bisquaternary bisnaphthalimide, N-Arylpyridinium salt, metabolic effect, synergism.

AVFT

Resumen

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 34, número 3, 2015

A. Ponte-Sucre: Laboratorio de Fisiología Molecular, Instituto de Medicina Experimental, Escuela de Medicina Luis Razetti, Facultad de Medicina Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela, e-mail: aiponte@gmail.com

Introducción Unos pocos organismos son responsables de las principales enfermedades parasitarias del siglo XX y XXI. De hecho, la incidencia y el número de personas afectadas, y la desolación que estos organismos causan a los pacientes es enorme. Estos patógenos producen un ingente número de víctimas; sobre todo, pero no exclusivamente en los países en desarrollo. Entre estos organismos podemos mencionar los tripanosomas que causan la tripanosomiasis africana humana (HAT)1. Esta es una enfermedad transmitida por vectores, fatal si no se trata. Su incidencia anual solía ser muy alta. Sin embargo, recientemente se ha reducido a menos de 10.000 casos por año2. Este hecho se esgrime para destacar que “no es necesario invertir en el desarrollo de nuevos fármacos contra la enfermedad del sueño”3. Sin embargo, la misma puede resurgir como lo ha hecho en el pasado, y podría volver de una forma más agresiva. Muy pocos fármacos están siendo analizados clínicamente en diversas asociaciones sin fines de lucro, así como por la denominada Iniciativa Medicamentos para Enfermedades Olvidadas (DNDi por sus siglas en inglés)4. Sin embargo, la tasa de supervivencia de los candidatos es extremadamente baja, y ninguno de los compuestos analizados se encuentra en la tercera fase de evaluación clínica5.

Basados en el hecho de que la potencia de un compuesto (que se refleja en su IC50), no necesariamente se traduce en el “mejor fármaco a nivel de mercado” y de que, además de la actividad que las moléculas deben tener en contra de un organismo seleccionado, sus propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) son esenciales para la selección de candidatos para estudios con animales y preclínicos6, en un trabajo anterior, y con el objetivo de perfeccionar la selección de los candidatos a estudios preclínicos, analizamos la correlación entre la actividad anti-tripanosoma de moléculas de diferentes clases estructurales con los parámetros físico-químicos de los compuestos, para delinear la relación entre la estructura química y sus funciones biológicas7. Los datos sugieren que los índices de eficiencia de ligando pueden ser útiles para comprender la relación entre la potencia y las características químicas de los compuestos. En esa oportunidad describimos una buena correlación entre los parámetros físico-químicos de los compuestos seleccionados y los de moléculas comerciales cuyas dianas son organelos específicos. Estos resultados sugieren que nuestra aproximación podría ser útil para impulsar el diseño de compuestos con buenas actividades y propiedades farmacocinéticas aceptables para todas las familias de compuestos7. En este trabajo y a fin de profundizar en el análisis de la potencia de los compuestos líder hemos evaluado varias propiedades funcionales relacionadas con su acción sobre los parásitos. De hecho, analizamos si los mismos ejercen una función parasitostática o parasiticida, si actúan sinérgicamente con fármacos clásicos, y si afectan el estado metabóli-

co de la célula. Nuestros resultados sugieren que los mejores candidatos 37 y 88, son, parasiticida el primero y parasitostático el segundo. Sólo 37 es sinérgico con eflornitina, ambos con pentamidina. Finalmente, 37, al igual que pentamidina o eflornitina, no altera la relación ADP / ATP del parásito o sus niveles de glucosa. Estos resultados indican que su efecto no está relacionado con la alteración del metabolismo celular. Materiales y métodos La descripción de los compuestos usados está resumida en un trabajo previo7. Ellos pueden ser definidos como una bisnaftilamida biscuaternaria (37) y una sal de N-Arylpyridinium (88). Para evaluar la actividad tripanocida de los compuestos, se cultivaron formas sanguíneas monomórficas de Trypanosoma (T.) brucei (TC-221) en medio Baltz, a 37°C, 5% de CO2. El medio se suplementó con 16,7 % de suero fetal bovino inactivado por calor, 16 U ml-1 de penicilina, 16 mg ml-1 de estreptomicina y 0,0001% β-mercaptoetanol. La actividad de los compuestos se determinó mediante el ensayo de Azul de Alamar®. Brevemente, se incubó un número apropiado de tripanosomas (105 células ml-1) en placas de 96 pozos, con concentraciones crecientes de los compuestos en un volumen final de 200 ml. Después de 24 h de incubación a 37°C, 5% CO2, se añadieron 20 ml de Azul de Alamar a cada pozo; seguidamente las placas se incubaron en las mismas condiciones por 48 h y 72 h. Las placas se leyeron en un lector de ELISA (Oasys Expert 96) a una longitud de onda de 550 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm. La absorbancia registrada en los pozos incubados en ausencia de los compuestos determinó el 100% de crecimiento. La absorbancia resultante en cada uno de los otros pozos reflejó el crecimiento celular y su inhibición por los compuestos. Los valores de IC50 se calcularon por interpolación lineal8,9. Para determinar la actividad parasitostática o parasiticida de los compuestos se realizó el ensayo de susceptibilidad de Azul de Alamar. Seguidamente se recogieron las células de los pozos más cercanos a las concentraciones correspondientes al IC10, IC50 e IC90 de cada compuesto. Las células se lavaron dos veces con PBS y se sembraron de nuevo en las mismas condiciones, pero sin fármacos; se incubaron durante 48 h, recibieron 20 ml de Azul de Alamar y se incubaron durante 48 h adicionales para determinar su crecimiento adicional. Para determinar la actividad sinérgica de 37 y 88 se realizaron en paralelo curvas de susceptibilidad con Azul de Alamar para cada compuesto solo y para cada compuesto en presencia de concentraciones IC50 de pentamidina y eflornitina. Con este ensayo definimos el desplazamiento del IC50 de pentamidina y eflornitina hacia concentraciones superiores o inferiores por la acción de los compuestos utilizados. Para determinar las posibles dianas intracelulares de 37 y 88 las células se incubaron como normalmente para los

cubadas solas, sugiriendo que 37 podría ser parasiticida. Por el contrario, 88 presenta características de parasitostático; las células supervivientes recogidas de los pozos incubados incluso a IC90, reanudan su crecimiento al cabo de 48 h de ser incubadas solas.

Posteriormente las células se centrifugaron a 700 x g durante 5 min, se lavaron con PBS y se suspendieron en 200 ml de buffer para ser analizados por citometría de flujo. Para determinar el efecto de 37 y 88 sobre el metabolismo celular los tripanosomas fueron sembrados en placas de 96 pozos en 200 ml de medio a densidades iniciales de 104 células ml-1. Las células se incubaron durante 24 h a 37°C, 5% CO2 solas o en presencia de DMSO (<1%), florizidina (Sigma 274313-1G, 100 mM), DOG (Sigma D6134-1G, 5 mM), pentamidina (Aventis, IC50), o a la IC50 de 37 y 88. Posteriormente las células se centrifugaron a 700 x g durante 5 min, se lavaron con PBS y suspendieron hasta una densidad de 1x105 células ml-1. La relación ADP / ATP y el contenido de glucosa (Sigma MAK135 ADP / ATP Ratio Kit de ensayo, Kit de ensayo de Sigma GAHK20 glucosa (HK)) se determinaron utilizando un luminómetro, a 1 s de tiempo de detección. La relación ADP / ATP se calculó por la siguiente razón: RLUA1 - luminiscencia de ATP; RLUB – luminiscencia de ATP residual después de 10 min; RLUC - luminiscencia después de la conversión enzimática de ADP en ATP; ADP / ATP = (RLUC1-RLUB1) / RLUA1), siendo RLU la luminiscencia detectada en los canales A, B o C. Los niveles de glucosa se ensayaron en el sobrenadante de cada condición a través del ensayo de reducción de la hexoquinasa10. Los experimentos se realizaron al menos dos veces por cuadruplicado y el análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software Graph Pad Prism, versión 6. Resultados La susceptibilidad de los parásitos a los compuestos se determinó mediante el ensayo de Azul de Alamar. Seguidamente, se recogieron las células viables presentes en los pozos más cercanos a las concentraciones IC10, IC50 e IC90 para cada compuesto. Los parásitos se lavaron y sembraron de nuevo en las mismas condiciones, pero sin drogas. Las células se incubaron durante 48 h a 37°C y 5% CO2 y de nuevo se determinó su crecimiento mediante el ensayo de Azul de Alamar. Los resultados obtenidos se representan en la Fig. 1. Las células expuestas a concentraciones IC50 e IC90 de 37 no reanudan su crecimiento, incluso 48 h después de ser in-

La actividad de 37 y 88 se determinó usando el ensayo de Azul de Alamar. Las células vivas de los pozos más cercanos a IC10, IC50 e IC90, se lavaron y sembraron de nuevo en ausencia de fármacos. Las células se incubaron durante 48 h, recibieron 20 ml de Azul de Alamar y se incubaron 48 h adicionales para medir su crecimiento. La figura ilustra un experimento representativo. Para 37 se determinó la IC10 (0,030) mM, IC50 (0,150 mM) e IC90 (0,270 mM), al igual que para 88 IC10 (0,002 mM), IC50 (0,010 mM), IC90 (0,018 mM).

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 34, número 3, 2015

Figura 1

AVFT

ensayos de Azul de Alamar a concentraciones de IC50 de los respectivos compuestos durante 24 h. Al finalizar la incubación las células se suspendieron a una densidad de 2.5 106 ml-1 y se incubaron con los siguientes indicadores: a. en 4 μg ml-1 Hoechst en PBS durante 5 min a temperatura ambiente para marcar el núcleo. b. en 2,5 mM MitoTracker Red durante 30 min a 37°C, 5% de CO2 para marcar la mitocondria. c. en 10 mM Lysotracker, durante 1 h a 37°C, 5% CO2, para marcar los compartimientos ácidos. d. en 10 mM Fm 464 durante 10 min a 4°C, para marcar el sistema de retículo endoplásmico.

Con base a los resultados anteriores evaluamos el potencial efecto sinérgico de los compuestos con las drogas clásicas pentamidina y eflornitina. Para ello se incubaron los parásitos con 37 y 88 (a concentraciones de IC10, IC50 e IC90) solos, y para cada molécula en presencia de pentamidina (IC50, Fig. 2), o eflonitina (IC50, Fig. 3). El efecto sinérgico se demostró claramente para pentaminina y 37, ya que incluso cuando 37 se utilizó a concentraciones de IC10 en conjunto con pentamidina (IC50), las células no reanudaron su crecimiento a las 24 y 48 h de comenzado el experimento. Resultados similares se obtuvieron al utilizar 88 en conjunto con pentamidina (IC50) en las mediciones realizadas a las 24 h. Sin embargo, después de 48 h las células incubadas con pentamidina a su IC50, y 88 a su IC10, reanudaron el crecimiento hasta en un 30% del control sin droga. El efecto sinérgico también se demostró para eflornitina y 37 a las 24 y 48 h, al utilizar 37 a concentraciones de IC50. Este no fue el caso para el 88 y eflornitina (IC50), ya que incluso cuando 88 se utilizó a concentraciones IC90 las células continuaron su crecimiento.

Figura 2

Se incubaron las células en presencia de 37 y 88 (a IC10, IC50 e IC90). En paralelo, se incubaron las células con cada compuesto más el IC50 de pentamidina. A las 48 h, los pozos recibieron 20 ml de Azul de Alamar y se incubaron 48 h adicionales para evaluar el crecimiento celular. La figura ilustra un experimento representativo. La IC50 para pentamidina es 0,005 mM.

Figura 3

telial en parásitos tratados con pentamidina y eflornitina, así como con 37 y 88. Los resultados sugieren que sólo se evidencia una disminución en el marcaje con Mitotracker (no significativo) en todas las condiciones, en comparación con los parásitos no tratados. Estos resultados indican que en las condiciones ensayadas este método no permite identificar de forma específica las dianas intracelulares ya que los marcajes no distinguen el efecto de los compuestos con los que trabajamos con respecto a los controles positivos (datos no mostrados). Finalmente, y a fin de evaluar si 37 y 88 alteran el metabolismo del parásito determinamos la relación ADP / ATP y los niveles de glucosa en parásitos tratados y no tratados durante 24 h con los compuestos, comparado con el efecto ejercido por las drogas clásicas pentamidina y eflornitina. La DOG (control positivo) disminuye significativamente la relación ADP/ATP de las células tratadas luego de 24 h de incubación (Fig. 4). Sin embargo, ni las drogas clásicas ni los compuestos experimentales utilizados reproducen este efecto. De igual forma, aunque la DOG, disminuye los niveles de glucosa, las drogas clásicas y los compuestos experimentales no afectan este parámetro (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que 37 y 88 no afectan el metabolismo celular, al menos a las primeras 24 h de tratamiento. Figura 4

Se incubaron las células en presencia de 37 y 88 (a IC10, IC50 e IC90). En paralelo, se incubaron las células con cada compuesto más el IC50 de eflornitina. A las 48 h, los pozos recibieron 20 ml de Azul de Alamar y se incubaron 48 h adicionales para evaluar el crecimiento celular. La figura ilustra un experimento representativo. La IC50 para la eflornitina es 50 mM.

Estudios anteriores sugieren del retículo endoplasmático es la diana celular para la bisnaftilamida bicuaternaria (37) y la mitocondria y el cinetoplasto lo son para la sal de N-Arylpyridinium (88). Para confirmar esta aseveración, utilizamos la citometría de flujo para determinar cambios en el marcaje de organelos como el núcleo, los compartimientos ácidos, la mitocondria y el cinteoplasto, y el sistema retículo endo-

Los parásitos (104 ml-1) se incubaron 24 h a 37 ° C, 5% CO2 solas o en presencia de DMSO (<1%), florizidina (100 mM), DOG (5 mM), pentamidina (IC50), o a la IC50 de 37 y 88. La relación ADP / ATP y el contenido de glucosa se midieron utilizando un luminómetro, en 1 s de tiempo de detección. La relación ADP / ATP se calculó por la siguiente razón: RLUA1 - luminiscencia de ATP; RLUB – luminiscencia de ATP residual después de 10 min; RLUC - luminiscencia después de la conversión enzimática de ADP en ATP; ADP / ATP = (RLUC1-RLUB1) / RLUA1), siendo RLU la luminiscencia detectada en los canales A, B o C.

Nuestros resultados sugieren que 37 es parasiticida y 88 parasitostático, que ambos compuestos actúan de forma sinérgica con pentamidina y que 37 ejerce un efecto sinérgico con eflornitina; finalmente describimos que 37 y 88 no alteran la relación celular ADP / ATP o los niveles de glucosa del parásito, lo cual sugiere que su efecto no está asociado a la alteración del estado metabólico del parásito. El ensayo de la resazurina proporciona una fotografía puntual de la susceptibilidad de los parásitos a diversos compuestos8. Aunque este ensayo permite calcular valores de IC50 reproducibles, no otorga información sobre cómo es la acción de los mismos. Nuestros resultados sugieren que 37 es parasiticida, es decir, es capaz de destruir los parásitos. Por otra parte, los ensayos sugieren que 88 es parasitostático, es decir, es capaz de detener el crecimiento de los parásitos durante el tiempo en el cual el compuesto está presente en el cultivo. Al evaluar el potencial efecto sinérgico de los compuestos con las drogas clásicas pentamidina y eflornitina encontramos que este se evidencia al utilizar pentaminina y 37 (incluso a concentraciones IC10) y pentamidina y 88 (utilizado a concentraciones IC50, a las 24 h). El efecto sinérgico de pentamidina y 88 (a concentraciones IC50) se revierte a las 48 h; en estas condiciones las células reanudan su crecimiento hasta en un 30% del control no tratado.

La glucosa es la fuente de energía preferencial de los tripanosomas. Estos son células que utilizan escasamente las mitocondrias para sintetizar ATP y el mecanismo preferencial de síntesis de esta fuente de energía depende de la glicólisis (en el citosol)14. Los tripanosomas están entre el tipo de células en las que la glicólisis está activa, incluso en presencia de oxígeno. En otro tipo de células la presencia de oxígeno disminuye el flujo glucolítico y favorece la producción de ATP via la fosforilación oxidativa. Bajos niveles de oxígeno en los tripanosomas disminuyen el consumo de glucosa y altas concentraciones de oxígeno inducen la glicólisis, probablemente para inducir la proliferación. Es más, se postula que el ATP producido durante la glicolisis no se utiliza para el crecimiento del parásito; sin embargo, ya que mediante la glicólisis sólo se producen dos moléculas de ATP, estos parásitos deben mantener su relación ADP / ATP muy controlada15.

El efecto sinérgico también se demostró para eflornitina y 37 (utilizado a concentraciones IC50) mas no para eflornitina y 88 (utilizado a concentraciones IC90). Estos resultados sugieren que el uso combinado de 37 y las drogas clásicas pentamidina y eflornitina podría ser beneficioso y confirman el efecto parasitostático de 88.

Por otra parte, las formas sanguíneas de tripanosoma no tienen una mitocondria “normal” sino una forma reducida de este organelo. No posee oxidasas de citocromo (pero si una oxidasa alternativa), el transporte de electrones no genera un potencial de membrana, y por lo tanto, no se utiliza para producir ATP mediante la fosforilación oxidativa. Al contrario, la ATPasa que normalmente sintetiza ATP en este compartimiento lo hidroliza con el fin de generar un potencial de membrana esencial para la importación de proteínas14.

La pentamidina es una droga cuya diana es la mitocondria. Esta droga es efectiva incluso en las formas sanguíneas de T. brucei que no expresan una cadena respiratoria completamente funcional11. Por su parte, la eflornitina, un análogo de aminoácidos, inhibe a la ornitina decarboxilasa durante la síntesis de las poliaminas12. Estudios anteriores realizados en el marco del consorcio mencionado sugieren que la diana celular para 37 es el retículo endoplasmático, mientras la mitocondria y el cinetoplasto lo son para 88. Nuestros resul-

Puesto que se ha demostrado que la inhibición del transporte de glucosa es parasiticida para T. brucei16 y para evidenciar si los compuestos 37 y 88 alteran el metabolismo parasitario y comprometen la relación celular ADP /ATP, evaluamos el efecto de ambos compuestos sobre este parámetro. Comparamos los efectos de 37 y 88 con florizidina, ya que el transporte de glucosa en las especies sanguíneas del parasito requiere iones sodio y el florizidin es un inhibidor de este tipo de transportadores en mamíferos17 y el desacoplante de la

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En este estudio profundizamos el análisis de dos compuestos líder sintetizados en el marco del consorcio liderado por los profesores Gerhard Bringmann y Ulrike Holzgrabe en la Universidad de Würzburg. Nuestro interés fue determinar si los mismos cumplen con propiedades que aumenten la probabilidad de su inclusión en ensayos con animales, preclínicos y clínicos. Específicamente evaluamos si la bisnaftilamida biscuaternaria (37) y la sal de N-Arylpyridinium (88) son parasitostáticos o parasiticidas, si actúan de forma sinérgica con las drogas clásicas pentamidina y eflornitina y si afectan el estado metabólico celular.

tados de citometría de flujo sugieren que en los parásitos tratados con pentamidina y eflornitina, al igual que con 37 y 88 se evidencia una disminución (no significativa) en el marcaje con Mitotracker, con respecto a los parásitos no tratados. Esto no ocurre con el resto de los marcadores utilizados, específicos para compartimientos açídicos, el núcleo y el sistema retículo endotelial. Los resultados globales sugieren que en las condiciones ensayadas la citometría de flujo no parece ser un método idóneo para la identificación específica de las dianas celulares de estos compuestos. Podríamos especular que debido a que los cultivos de tripanosomas son asincrónicos, aunque sean monomórficos como es el caso que nos ocupa13, no hay una reproducción simultánea de todos los miembros de la población. La variabilidad en los estadios de crecimiento podría entonces estar enmascarando el efecto específico de los compuestos sobre los organelos diana, debido a que la población de células con la característica morfológica específica debería ser muy pequeña.

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Discusión

fosforilación oxidativa CCCP, puesto que se ha demostrado su efecto específico sobre los tripanosomas18. Nuestros resultados sugieren que ni la relación ADP / ATP ni el consumo de glucosa se ven alterados por los compuestos 37 y 88 en estas condiciones, lo cual parecería evidenciar que estos compuestos no alteran el estado metabólico de la célula. En conclusión, en este trabajo describimos que el compuesto líder (37) es parasiticida y el 88 es parasitostático. Que ambos compuestos potencian el efecto de pentamidina y 37 el de eflornitina y sugieren que su efecto no está relacionado con una alteración del metabolismo celular. Estos resultados indican la ventaja que traería utilizar un compuesto como 37 para utilizarlo en combinación con pentamidina o eflornitina a fin de reducir los efectos adversos potenciales de estas drogas clásicas. Por otra parte sugieren que las propiedades parasitostáticas de 88, incluso a concentraciones cercanas al IC90 podrían ser explotadas para imitar el efecto de una vacunación con parasito inactivado. Esta acción inhabilitaría al parásito de continuar reproduciéndose por un tiempo, lo cual facilitaría la acción del sistema inmune. Agradecimientos A los miembros del consorcio SFB630 financiado por la Deutsche Forschung Gemainschaft, Alemania y a la Fundación Alejandro de Humboldt, Alemania por su apoyo financiero a APS. A Antje Fuß por su apoyo técnico en la realización de los experimentos.

Muth M, Hoerr V, Glaser M, Ponte-Sucre A, Moll H, Stich A, Holzgrabe U Antitrypanosomal activity of quaternary naphthalimide derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 2007; 17:1590–3.

10. Seyfang A, Duszenko M. Specificity of glucose transport in Trypanosoma brucei. Effective inhibition by phloretin and cytochalasin B. Eur J Biochem. 1991; 202(1):191-6. 11. Monzote Fidalgo L. Gille L. Mitochondria and Trypanosomatids: Targets and Drugs Pharm Res. 2011; 28:2758-70 12. Vincent IM, Creek D, Watson DG, Kamleh MA, Woods DJ, Wong PE, Burchmore RJ, Barrett M. A Molecular Mechanism for Eflornithine resistance in African Trypanosomes PLoS Pathog 6(11): e1001204. doi:10.1371/journal.ppat.1001204. 13. Matthews KR, Gull K. Cycles within cycles: the interplay between differentiation and cell division in Trypanosoma brucei. Parasitol Today. 1994; 10(12):473-6. 14. Bringaud F, Rivière L, Coustou V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Mol Biochem Parasitol. 2006; 149(1):1-9. 15. Haanstra JR, Kerkhoven EJ, van Tuijl A, Blits M, Wurst M, van Nuland R, Albert MA, Michels PAM, Bouwman J, Clayton C, Westerhoff H, Bakker BM1, A domino effect in drug action: from metabolic assault towards parasite differentiation Molecular Microbiology. 2011; 79(1), 94–108. 16. Haanstra JR, van Tuij A, van Dam J, van Winden W, Tielens AG, van Hellemond JJ, Bakker BM. Proliferating bloodstream-form Trypanosoma brucei use a negligible part of consumed glucose for anabolic processes. Int J Parasitol. 2012; 42(7):667-73. 17. Munoz-Antonia T, Richards FF, Ullu E. Differences in glucose transport between blood stream and procyclic forms of Trypanosoma brucei rhodesiense. Mol Biochem Parasitol. 1991; 47(1):73-81. 18. Stoppani AO, Docampo R, de Boiso JF, Frasch AC. Effect of inhibitors of electron transport and oxidative phosphorylation on Trypanosoma cruzi respiration and growth. Mol Biochem Parasitol. 1980; 2(1):3-21.

Referencias 1.

WHO. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organ Tech Rep Ser. 2012; 975: 1–100.

Bisser S, Courtioux B. Sleeping sickness: end of the epidemic outbreak? Rev Neurol (Paris). 2012; 168: 230-8

Stich A, Ponte-Sucre A, Holzgrabe U. Do we need new drugs against human African trypanosomiasis? Lancet Infect Dis. 2013; 13(9):733-4.

Burri C. Chemotherapy against human African trypanosomiasis: is there a road to success? Parasitology. 2010; 137(14):1987-94.

Barrett MP, Croft SL. Management of trypanosomiasis and leishmaniasis. Br Med Bull. 2012; 104:175-96.

Hou T, Wang J, Zhang W, Xu X. ADME evaluation in drug Discovery, 6. Can oral bioavailability in humans be effectively predicted by simple molecular property-based rules? J Chem Inf Model. 2007; 47:460–3.

Ponte-Sucre A, Bruhn H, Schirmeister T, Cecil A, Albert CR, Buechold C, Tischer M, Schlesinger S, Goebel T, Fuß A, Mathein D, Merget B, Sotriffer CA, Stich A, Krohne G, Engstler M, Bringmann G, Holzgrabe U. Anti-trypanosomal activities and structural chemical properties of selected compound classes. Parasitol Res. 2015; 114(2):501-12.

Mikus J, Steverding D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye Alamar Blue. Parasitol Int. 2000; 48(3):265-9.

Marcadores de resistencia en Leishmania: Susceptibilidad in vitro a drogas leishmanicidas vs retención de calceina en aislados de pacientes venezolanos con Leishmaniasis Cutánea Difusa

Resumen

Abstract

La identificación de parásitos quimio-resistentes con marcadores celulares fáciles de cuantificar, no ha sido descrita en Leishmania. En este trabajo comparamos la susceptibilidad in vitro a drogas leishmanicidas vs. la retención intracelular de calceina, una medida indirecta de la actividad de los transportadores MDR1 y MRP1, en parásitos aislados de pacientes con Leishmaniasis Cutánea Difusa, con fracaso terapéutico a Glucantime. Estos hallazgos los comparamos con resultados obtenidos en especies de referencia de la Organización Mundial de la Salud. Encontramos que el ensayo de susceptibilidad a drogas leishmanicidas, es fácil, rápido y reproducible, mas no necesariamente predictivo de fenotipo quimio-resistente. Adicionalmente, la detección fluorométrica de la retención de calceina permitió diferenciar a los aislados de acuerdo a la funcionalidad de los transportadores ABC. Estos resultados sugieren que de validarse su utilidad, esta metodología podría incorporarse al esquema de diagnóstico y tratamiento de la leishmaniasis, como predictiva del éxito de la terapia leishmanicida.

Chemo-resistance screening with easy to quantify cell markers has not been implemented for leishmaniasis. Herein we compared Leishmania in vitro susceptibility to classical and experimental drugs and calcein retention by parasites isolated from patients suffering Diffuse Cutaneous Leishmaniasis that failed to respond to Glucantime. The results were compared with those obtained from WHO-reference Leishmania strains. Calcein is an ABC transporter substrate and its accumulation may reflect the functionality of both MDR1 and MRP1 transporters. Our results suggest that screening of promastigote´s drug susceptibility is an easy, fast and reproducible assay that might not be predictive of a phenotype confident with chemoresistance. Moreover, theys demonstrate that calcein retention differentiates the isolates according to the functionality of the different ABC transporters. Therefore, if validated, this methodology could be included in a diagnosis and treatment scheme for leishmaniasis as predictive for successful therapy. Palabras clave: Leishmania, susceptibilidad a fármacos, quimio-resistencia, retención de calceina, transportador ABC.

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Maritza Padrón-Nieves1 y Alicia Ponte-Sucre2 1 Cátedra de Farmacología y Toxicología. 2Cátedra de Fisiología Humana. 1,2Escuela Luis Razetti. Instituto de Medicina Experimental. Laboratorio de Fisiología Molecular Facultad de Medicina. Instituto de Medicina Experimental. Facultad de Medicina. Universidad Central de Venezuela Autor a quien se dirige la correspondencia: Maritza Padrón-Nieves. Oficina 204. Instituto de Medicina Experimental. Telf: (58-212) 605-3665. Fax: (58-212) 693-4351. Email: mpadron43@gmail.com

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Resistance markers in Leishmania: in vitro drug susceptibility vs leishmanicidas calcein retention in isolated venezuelan patients with diffuse cutaneous leishmaniasis

Introducción Leishmaniasis es el término descriptor de la clínica de la enfermedad causada por Leishmania (L.), parásito intracelular obligado de las células del sistema fagocítico monocitario1. En Venezuela, la leishmaniasis cutánea (98,8% de los casos), es endémica2. Para su tratamiento, el fármaco de elección es el antimoniato de meglumina3,4 (Glucantime®, de Aventis), o la Ulamina, fabricada en Venezuela5. Su administración es intramuscular, el tratamiento es doloroso, largo y con efectos secundarios importantes. Debido a ello el éxito de la terapia puede ser limitada. Adicionalmente puede haber fracaso terapéutico en algunos pacientes, y también recidivas. Desde los años 80 en Venezuela se usa alternativamente la inmunoterapia6.

La quimio-resistencia, definida como la disminución de la eficacia del medicamento en una población previamente susceptible, es una de las causas del fracaso terapéutico en la leishmaniasis7. La misma puede ser natural o innata (L. braziliensis al ketoconazol); o adquirida, al seleccionar parásitos con características que les permiten sobrevivir en presencia de la droga, al ser expuestos reiteradamente a dosis sub-óptimas de fármacos1,8. Al igual que en células de mamíferos, en Leishmania este fenómeno implica la disminución de la acumulación celular de fármacos, debido a la sobre-expresión de transportadores ABC (por ATP Binding Cassette) responsables de la eliminación efectiva de desechos celulares, toxinas ambientales y otros xenobióticos9,10. El primer transportador ABC descrito, y el más estudiado, fue el ABCB1 (glicoproteína P, P-gp, MDR). Sus sustratos son drogas hidrofóbicas, catiónicas o neutras11. Posteriormente, fueron identificados el ABCC1 (MRP, por su siglas en inglés, Multidrug Resistance-associated Protein), para drogas aniónicas12 y el ABCG2 (MXR, Mitoxantrone Resistance Protein o BCRP, Breast Cancer Resistance Protein) para drogas hidrofóbicas11. En Leishmania, Ouellette y colaboradores13, fueron pioneros al describir el círculo H, una estructura extracromosomal que contiene genes para los transportadores ABCC; el aumento de su expresión y función está asociado a la resistencia a drogas en Leishmania. Los mecanismos de quimio-resistencia pueden ser múltiples y no ser exclusivos para un tipo de droga. Es decir, diversos sistemas contribuirían a la preservación del fenotipo quimio-resistente. Por ejemplo, la expresión de marcadores de metaciclogénesis, y de transportadores asociados a la incorporación de nutrientes disminuye en Leishmania quimio-resistente; adicionalmente, la actividad de enzimas del metabolismo de la glucosa y los amino ácidos está alterada, al igual que los niveles de metabolitos involucrados en la homeostasis redox como pterina y tripanotiona y la actividad de la enzima dihidrofolato-reductasa / timidilato- sintetasa8. Estas alteraciones de la fisiología celular sugieren que la quimio-resistencia podría monitorearse por la determinación de marcadores celulares, tal y como fue propuesto por Croft y su grupo en 20061.

Actualmente para determinar este fenotipo en Leishmania se utiliza el modelo in vitro macrófago-amastigote. El mismo permite correlacionar la respuesta clínica a los medicamentos, con la disminución cuantitativa de la tasa de infección de los macrófagos a concentraciones crecientes de las drogas1. Sin embargo, es una técnica laboriosa y costosa, condiciones que desestimulan su aplicación clínica. Debido al aumento de la incidencia de casos de leishmaniasis con fracaso terapéutico, urge entonces identificar marcadores de resistencia sencillos y fáciles de implementar, para guiar la terapia leishmanicida. En nuestro estudio, pionero en Venezuela, evaluamos si la acumulación de calceina diferencia a los aislados de acuerdo a la funcionalidad de los transportadores ABC, y comparamos los resultados con aquellos que determinan la susceptibilidad de los parásitos a drogas clásicas y experimentales leishmanicidas. La prueba fluorescente que utiliza calceina acetoximetilada (calceina/AM–no fluorescente) es útil para demostrar quimio-resistencia mediada por transportadores ABC en parásitos y otras células14. La calceina/AM difunde a través de las membranas celulares, es degradada por esterasas endógenas y transformada en calceina fluorescente. Los transportadores ABC expresados en la célula eliminan la calceina, la cual no se acumula en el interior celular, por lo cual disminuye la fluorescencia intracelular15. El uso de inhibidores específicos para cada tipo de transportador, permite determinar la contribución funcional de cada uno de ellos. Nuestros resultados sugieren que de validarse su utilidad, esta metodología podría incorporarse al esquema de diagnóstico y tratamiento de la leishmaniasis, como predictiva del éxito de la terapia leishmanicida.

Métodos Se utilizaron especies de referencia, certificadas por la Organización Mundial de la Salud: Leishmania (V.) braziliensis (MHOM/BR/84/LTB300), Leishmania (L.) mexicana (MHOM/ BR/82/Bel21), Leishmania (L.) amazonensis (MHOM/BR/77/ LTB0016) y parásitos aislados de lesiones de tres pacientes con Leishmaniasis Cutánea Difusa con fracaso terapéutico de larga data, al tratamiento con Glucantime [VE2000MM, L. (L.) amazonensis; VE98MR, L. (L.) amazonensis; y VE96ZC, L. (L.) mexicana] identificados por análisis e hibridación molecular (Rodríguez N., comunicación personal). Los aislados se mantuvieron en nitrógeno líquido hasta su uso, se descongelaron según protocolos convencionales, para su crecimiento fueron sub-cultivados en medio semisólido de agarsangre/medio glucosado bajo criterios establecidos. Se evaluó la susceptibilidad de los promastigotes de las especies de referencia a las drogas leishmanicidas [pentamidina (0 a 150 µM) y anfotericina-B (0 a 10 µM)] y no leishmanicidas [glibenclamida (0 a 100 µM)]. Los parásitos (1 x 107 células ml-1) se sembraron y se incubaron a temperatura ambiente (TA). La droga se añadió al segundo día; se determinó la densidad celular

El análisis estadístico de los datos se realizó con los programas Microsoft Excel 2002® y Graph-Pad Prism5®. Los valores se presentan como la media ± el error estándar de al menos tres experimentos realizados por duplicado.

Resultados Inicialmente establecimos la susceptibilidad in vitro de las especies de referencia estudiadas. Para ello determinamos la GI50 para glibenclamida, anfotericina-B y pentamidina. En la Tabla I se listan los valores de GI50 obtenidos 72 h luego de añadir cada droga. Los resultados demuestran que las especies de referencia son más susceptibles a anfotericinaB que a pentamidina, como drogas leishmanicidas clásicas y confirman que glibenclamida es un agente leishmanicida moderado; adicionalmente, sugieren que la GI50 es un indicador confiable de la susceptibilidad diferencial de los promastigotes a los compuestos.

Cepa

Glibenclamida (µM)

Pentamidina (µM)

Anfotericina-B (µM)

LTB300

1,75

0,25

Bel21

4,56

1,05

LTB0016

13,28*

8,84

0,089**

*=Ponte-Sucre y col., 1998; ** =Silva-López y col., no publicado.

Seguidamente se determinó el efecto de concentraciones cercanas al GI90 para las especies de referencia (tres y siete veces mayor al GI50 de las drogas utilizadas) sobre el crecimiento de los parásitos. Los datos se resumen en la Tabla II. Al comparar la supervivencia de las especies con la de los aislados se obtuvieron las siguientes series de susceptibilidad; para pentamidina (LTB0016 > LTB300 = VE2000MM = VE98MR > Bel21 > VE96ZC) y anfotericina-B (LTB0016 >> LTB300 > Bel21 >> VE96ZC = VE2000MM > VE98MR), como agentes leishmanicidas clásicos, y para glibenclamida (LTB0016 >> LTB300 > VE98MR > VE96ZC > VE2000MM = Bel21). Estos datos demuestran que los aislados de los pacientes estudiados son menos susceptibles a las altas concentraciones de las drogas ensayadas, que las especies de referencia, con una supervivencia cercana, o superior al 50%, excepto en el caso de VE98MR y VE2000MM ensayados con pentamidina. Para determinar si la evaluación de la acumulación basal de calceina, nos permitía llegar a conclusiones similares, en base a la expresión funcional de los transportadores ABC, evaluamos este parámetro en los aislados de pacientes con fracaso terapéutico al Glucantime en condiciones control (sin drogas) y en presencia de inhibidores como verapamil, ciclosporina-A y glibenclamida. La retención basal en todos los casos fue de 301 a 382 unidades arbritarias de fluorescencia. Tabla II. Porcentaje de supervivencia de Leishmania spp. a concentraciones máximas de glibenclamida, pentamidina y anfotericina-B LTB300 Bel21 LTB0016 VE2000MM VE98MR glibenclamida 3X pentamidina 7X anfotericina-B 4X

VE96ZC

20**

NX = valor del GI50 multiplicado por N en mM para cada droga utilizada. Valores cercanos al IC90 para todas las drogas *Ponte-Sucre y col., 1998. ** = Silva-López y col., no publicado

La Tabla III resume las concentraciones efectivas (CE50, expresadas en µM) necesarias para aumentar en un 50% la acumulación de calceina en las especies y aislados. Glibenclamida aumentó la acumulación de calceina en todos los casos. La serie de susceptibilidad fue: Bel21 > VE98MR > VE96ZC > VE2000MM > LTB300 >> LTB0016. Nuestros resultados no se deben a la inhibición de canales de potasio Ikr por la glibenclamida17,18, ya que en experimentos realizados con genisteina

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Se evaluó la retención basal de calceina en alícuotas de 100 µl (4 x 108 células ml-1). Para ello se utilizó el protocolo del kit VybrantTM optimizado en el laboratorio17. Alícuotas de 100 µl (4 x 108 células ml-1 se incubaron 30 min a TA en presencia de concentrationes crecientes de ciclosporina-A y verapamil, y glibenclamida; seguidamente se incubaron 30 min a TA en oscuridad, en presencia de calceina/AM (0,25 µM); para detener la reacción, las células se centrifugaron 5 seg a 200 x g; posteriormente, se lavó la preparación con medio glucosado frío y finalmente, se resuspendieron las células en 200 µl del mismo medio. La retención de calceina fue medida como fluorescencia específica en un espectrofluorímetro Perkin Elmer Victor2 Wallac (Finlandia) a λem = 517 nm (λex = 494 nm). La glibenclamida es un inhibidor de transportadores ABCC1 (MRP1) y además de canales de potasio Ikr17,18,19. La ciclosporina-A es un bloqueador de amplio espectro, no competitivo, preferencialmente para transportadores ABCB4 (MDR4)20,21,22. El verapamil es un inhibidor selectivo de los transportadores ABCB1 (MDR1)21,22,23. Se incluyeron dos blancos: B1: alícuota de células solas y B2: alícuota de células con etanol, DMSO y PBS, y un control: C: alícuota de células con calceina.

Tabla I. Concentración Inhibitoria de crecimiento celular 50 (GI50) de las cepas de referencia a las 72 horas

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durante las próximas 24, 48 y 72 h. Se construyeron curvas dosis respuesta y se estableció la GI50, parámetro propuesto por el National Cancer Institute para fijar la concentración de droga que causa 50% de inhibición del crecimiento celular. Su cálculo corrige el valor encontrado en base a la densidad celular a tiempo cero, para cada droga16. Al determinar este parámetro (GI50) para cada especie de referencia y para cada droga, calculamos el porcentaje de crecimiento de cada aislado en presencia concentraciones de 3 a 7 veces el GI50 (≈ GI90 para las especies de referencia) de pentamidina (12,5 µM), anfotericina-B (1 µM) y glibenclamida (100 µM).

(0,02 a 10 μM) a concentraciones en las cuales este compuesto sólo actúa sobre canales de potasio y no sobre MDR1, MRP1 o ABCG217 encontramos que la genisteina (datos no mostrados) no aumentó el porcentaje de retención de calceina en ninguna de las especies, demostrando que la glibenclamida actuó bloqueando transportadores MRP1. Por su parte, verapamil y

ciclosporina-A, a las concentraciones utilizadas (hasta mM), aumentaron la acumulación de calceina sólo en algunas especies y aislados. La susceptibilidad para verapamil fue: (VE2000MM > LTB0016 >LTB300 >>>>> Bel21, VE98MR, VE96ZC) y para ciclosporina-A (VE96ZC = VE98MR > Bel21 > LTB300 >>>>> LTB0016, VE2000MM).

Tabla III. Concentración efectiva de verapamil, ciclosporina A y glibenclamida necesarias para aumentar 50% la retención de calceina de las especies de referencia y aislados de pacientes Verapamil (mM) Ciclosporina-A (mM) Glibenclamida (mM)

LTB300

Bel 21

LTB0016*

VE2000MM

VE98MR

VE96ZC

10,90 + 8,00

>mM

3,0 + 0,8

0,10 + 0,08

>mM

83,40 + 4,00

17,80 + 13,00

>mM

1,20 + 7,00

1,28 + 0,75

6,76 + 4,50

0,43 + 0,26

60,00 + 26,00

5,40 + 2,90

1,80 + 0,97

2,80 + 2,09

* Machuca y col., 2006, > mM, concentraciones superiores a mM

Discusión El aumento de la incidencia de casos de leishmaniasis con fracaso quimioterapéutico resalta la urgencia de seleccionar marcadores de resistencia útiles para identificar parásitos con este fenotipo. En nuestro estudio, pionero en Venezuela, comparamos la susceptibilidad a drogas leishmanicidas de aislados de pacientes con fracaso terapéutico a Glucantime, con la capacidad de los aislados de acumular calceina, substrato de los transportadores ABC y su sensibilidad a inhibidores específicos de los mismos.

Los aislados VE2000MM y VE98MR fueron identificados como L. amazonensis, mientras que VE96ZC lo fue como L., mexicana (Dra. Noris Rodriguez, comunicación personal). Debido a ello en nuestro estudio se compararon los resultados obtenidos con los de las especies de referencia correspondientes. Se incluyó L. braziliensis LTB300 como control negativo. La susceptibilidad in vitro de las especies de referencia a dos agentes leishmanicidas (anfotericina-B y pentamidina), y a una sulfonilurea (glibenclamida) fue similar a la encontrada previamente24,25. Adicionalmente, nuestros datos demuestran que los aislados fueron en general menos susceptibles a anfotericina-B y glibenclamida que sus especies homólogas, con un porcentaje de supervivencia cercano o superior al 50%, a altas concentraciones de las drogas. Por su parte, con pentamidina, sólo el aislado VE96ZC tuvo un porcentaje de supervivencia superior a 50% a altas concentraciones de la droga. Estos resultados indican que la susceptibilidad a drogas en promastigotes es un método fácil, rápido y reproducible, más no necesariamente predictivo de fenotipo quimio-resistente. Sin embargo, la validación de estos hallazgos en un mayor número de aislados es más que deseable. Seguidamente comparamos la acumulación de calceina entre los aislados de pacientes y las especies de referencia. Adicionalmente evaluamos su modulación por inhibidores competitivos

como verapamil, ciclosporina-A y glibenclamda. Este ensayo es válido como medida indirecta de la funcionalidad de los transportadores MDR y MRP en muchos tipos celulares8,26. Los aislados difieren en su comportamiento con LTB300; es por ello que esta especie no será incluida en el siguiente análisis. Rautio y colaboradores27 han definido la fortaleza de los inhibidores de transportadores ABC como alta (A, con IC50 < de 1 µM), media (M, con IC50 1µM < 15 µM) y baja (B, con IC50 > de 15 µM)27. Este análisis además permite establecer el tipo de transportadores preferencialmente expresado en un tipo celular, al utilizar inhibidores selectivos, tal y como se realizó en este trabajo. Basados en nuestros resultados concluimos entonces que, ciclosporina-A es un inhibidor tipo B para el aislado VE2000MM y para LTB0016 (insensibles a la droga hasta niveles mM); y es un inhibidor tipo M para los aislados VE96ZC y VE98MR. Como ciclosporina-A es un inhibidor selectivo de transportadores MDR4, podemos concluir que los mismos deben estar medianamente expresados en VE96ZC y VE98MR (sensibles a la droga entre 1 y 15 µM). Para estos mismos aislados, verapamil es un inhibidor tipo B (insensibles a la droga hasta niveles mM). Sin embargo, es un inhibidor tipo A para el aislado VE2000MM y tipo M para LTB0016. Como verapamil inhibe preferencialmente transportadores MDR1, podemos concluir que los mismos no estén expresados o no son funcionales en VE96ZC y VE98MR, mas si en VE2000M. Verapamil y ciclosporina-A son inhibidores tipo B para Bel21, sugiriendo que esta cepa no expresa (o no son funcionales) ni MDR1 ni MDR4. Finalmente, acorde con la clasificación presentada, glibenclamida es un inhibidor tipo A para Bel21, B para LTB0016, y M para los aislados. Estos datos sugieren la expresión funcional de transportadores MRP1 en los aislados, susceptibles a concentraciones de glibenclamida entre 1 y 15 µM, más no así en LTB0016, tal y como había sido demostrado anteriormente17. En conclusión, en este trabajo Encontramos diferencias al comparar la susceptibilidad y la expresión de transportadores ABC

AGRADECIMIENTOS Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico, Universidad Central de Venezuela (UCV), PI 09-00-7115-2008, PG 09-007378-2008; Programa de Asistencia a Eventos ICC-09-0022-2012. Coordinación de Investigación de la Facultad de Medicina UCV, CI-ADM-134/2009 y Fundación Alejandro de Humboldt, Alemania, por los financiamientos recibidos. Los parásitos fueron donados por la Dra Noris Rodríguez, Instituto de Biomedicina, Universidad Central de Venezuela (UCV) y por el Dr. Lee Schnurr, Universidad de Jerusalén.

Referencias 1. Croft SL, Sundar S, Fairlamb AH. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev 2006; 19: 111-26.

14. Essodaïgui M, Broxterman HJ, Garnier-Suillerot A. Kinetic analysis of calcein and calcein-acetoxymethylesterv efflux mediated by the multidrug resistance protein and P-glycoprotein. Biochemistry 1998; 37: 2243-50. 15. Essodaïgui M, Frezard F, Moreira ES, et al. Energy-dependent efflux from Leishmania promastigotes of substrates of the mammalian multidrug resistance pumps. Mol Biochem Parasitol 1999; 100: 73-84. 16. National Cancer Institute. Special Concentration Parameters GI50, TGI, and LC50. 2011. consultado el 01-04-2011. Disponible en: http://dtp.nci.nih.gov/docs/compare/ compare methodology.html 17. Machuca C, Rodríguez A, Herrera M et al. Metabolic adaptations induced by resistance to an ABC transporter blocker glibenclamide in Leishmania amazonensis. Exp Parasitol 2006; 114:1-9. 18. Inagaki N, Gonoi T, Clement JP 4th, et al. Reconstitution of IKATP: an inward rectifier subunit plus the sulfonylurea receptor. Science. 1995; 270:1166-70 19. Haskó G, Deitch HA, Németh ZH, et al. Inhibitors of ATP-Binding Cassette Transporters Suppress Interleukin-12 p40 Production and Major Histocompatibility Complex II Up-Regulation in Macrophages. J. Pharmacol Exp Ther 2001; 301: 103-110. 20. Qadir M, O’Loughlin KL, Fricke SM, et al. Cyclosporin A is a broad-spectrum multidrug resistance modulator. Clin Cancer Res. 2005; 11: 2320-6. 21. Couture L, Nash JA, Turgeon J. The ATP-Binding Cassette Transporters and Their Implication in Drug Disposition: A Special Look at the Heart. Pharm Rev 2006; 58:244258. 22. Bansal T, Jaggi M, Khar RK et al. Emerging Significance of Flavonoids as P-Glycoprotein Inhibitors in Cancer Chemotherapy. J Pharm Pharmaceut Sci 2009; 12:46-78. 23. Natera S, Machuca C, Padrón-Nieves M, et al. Proficiency of drug-resistant parasites. Int J Antimicrobioal Agents 2007; 29: 637-42.

3. Zerpa O, Ulrich M, Borges R, et al. Epidemiological aspects of human and canine visceral leishmaniasis in Venezuela.Rev Panam Salud Publica. 2003; 13:239-45.

24. Lunardi F, Guzela M, Rodrigues AT, et al. Trypanocidal and leishmanicidal properties of substitution-containing chalcones. Antimicrob Agents Chemother. 2003; 47: 144951

4. Navarro P, Colmenares LA, Rosales R, Postalian A, Coraspe V, Silva S. Tratamiento de la leishmanisis tegumentaria americana con meglumina. Informed 2009; 11: 73-78.

25. Lima NMF, Correia CS, León LL, et al. Antileishmanial activity of lapachol analogues. Mem Inst Osw Cruz 2004; 99: 757-61.

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2. Rodríguez N, De Lima H, Aguilar CM, et al. Molecular epidemiology of cutaneous leishmaniasis in Venezuela. Trans R Soc Trop Med Hyg 2002; 96: S1/105-09.

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de los aislados de pacientes con las especies de referencia. Nuestros resultados sugieren que (a) el ensayo de susceptibilidad en promastigotes de Leishmania es fácil, rápido y reproducible, y podría ser predictivo de la resistencia a antimoniales, (b) la evaluación de la acumulación de calceina como ensayo cualitativo de la expresión y/o funcionalidad de los diversos transportadores ABC podría ser un marcador celular interesante de continuar evaluando por lo cual, es imperativo la validación de estos hallazgos en un mayor número de aislados.

5. Vázquez de Ricciardi L. Terapéutica antileishmania: revisando el pasado, el presente y el futuro. Gac Med Caracas, 2009; 117: 93-111.

26. Golstein PE, Boom A, van Geffel J, Jacobs P, Masereel B, Beauwens R. P-glycoprotein inhibition by glibenclamide and related compounds. Pflugers Arch 1999; 437: 652-60.

6. Convit J, Castellanos PL, Rondón A, Pinardi M, Ulrich M, Castes M, Bloom B, Garcia L. Inmunotherapy versus Chemotherapy in localised cutaneous leishmaniasis. Lancet 1987; 1: 401-05. 7. World Health Organziation. Control of the leishmaniasis. Technical report series. 949. Geneva, 2010 8. Ponte-Sucre A. Physiological consequences of drug resistance in Leishmania and their relevance for chemotherapy. Kinetoplastid Biol Dis 2003; 28: 2-14. 9. Blackmore CG, Mc Naughton PA, vanVen HW. Multidrug transporters in prokaryotic and eukaryotic cells: physiological functions and transport mechanisms. Mol Membr Biol 2001; 18: 97-103. 10. Leslie E, Deeley R, Cole S. Multidrug resistance proteins: role of P-glycoprotein, MRP1, MRP2 and BCRP (ABCG2) in tissue defense. Toxicol. Appl Pharmacol 2005; 204: 216-237. 11. Higgins CF. Multiple molecular mechanisms for multidrug resistance transporters Nature 2007; 446: 749-57. 12. Cole SP, Bhardwaj G, Gerlach JH, et al. Overexpression of a transporter gene in multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science 1992; 258: 1650-54. 13. Ouellette M, Fase-Fowler F, Borst P. The amplified H circle of methotrexate-resistant Leishmania tarentolae contains a novel P-glycoprotein gene. EMBO J 1990; 9: 1027-

27. Rautio J, Humpreys J,Webster L. et al. In vitro P-glycoprotein inhibition assays for assesment of clinical drug interaction potential of new drug candidates: A recommendation for probe substrates. Drug Metab and Disp 2006; 34:786-792.

Sobre un caso de intoxicación

por el uso de la planta de estropajo o tusa (Luffa cylíndrica) en Venezuela About a case of intoxication by the use of the loofah sponge or tusa (Luffa cylíndrica) in Venezuela Yudith Guerrero1,2, Betty Omaña1, Alexis Rodríguez-Acosta2,3 1 Servicio de Toxicología Médica, Hospital “Doctor Leopoldo Manrique Terrero”. 2 Sección de Ultraestructura Toxinológica, Instituto Anatómico, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela. 3 Sección de Inmunoquímica, Instituto de Medicina Tropical, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Resumen

Abstract

Objetivo: En algunas regiones del mundo, las plantas originan importantes problemas clínicos, causando gran morbilidad y mortalidad, principalmente después de la intoxicación no intencional. Aquí se plantea como objetivo principal, describir un caso de intoxicación con la planta de estropajo (Luffa cylindrica) por el uso inadecuado como instilación nasal.

Objective: In some regions of the world, the plants are important clinical problems, causing great morbidity and mortality, mainly after the non intentional intoxications. In this work an intoxication case is described, by the topic use of an extract of the scouring pad plant (Luffa cylindrica), when it was badly used as nasal medication to treat a chronic sinusitis.

Método: La descripción de la planta utilizada permitió identificar a la familia de las Cucurbitaceas y la especie involucrada. El análisis clínico otorrinolaringológico permitió evidenciar un cuadro agudo, grave con obstrucción de vías aéreas superiores.

Methods: In this case, the description of the used plant allowed to identify the Cucurbitaceous family and the involved species (Luffa cylindrica). The clinical analysis allowed evidencing an acute severe case with respiratory obstruction.

Resultados: Se relata un cuadro de intoxicación, por uso tópico de extracto de la planta de estropajo (Luffa cylíndrica), cuando fue utilizado como medicamento nasal para tratar una sinusitis crónica. El paciente presentó 4 horas después de la instilación, disfonía, con un intenso edema de úvula. Se encontraba confundido, con cefalea, así como con acentuada odinofagia y dificultad respiratoria. Conclusión: Tras revisión de la literatura, se permite plantear que se trata del primer caso referido o publicado de esta inusual intoxicación y daño de vías aéreas superiores ocasionado por esta planta. Fue tratado con oxígeno, hidrocortisona, clorfeniramina y adrenalina (SOS). El paciente se recuperó después de 48 h de tratamiento sintomático. Palabras clave: edema de úvula; estropajo; Luffa cylindrica; plantas tóxicas; sinusitis, tusa.

Results: In this work an intoxication case is described, by the topic use of an extract of the scouring pad plant (Luffa cylindrica), when it was used as nasal medication to treat a chronic sinusitis. Four hours after the instillation, the patient presented, dysphonia, with an intense uvula edema. He was confused, with headache, as well as a severe odynophagia and breathing difficulty. Conclusion: The revision of the literature, allowed us to propose that it is the first described case of this unusual intoxication. The patient was treated with oxygen, hydrocortisone, chlorpheniramine and adrenaline (SOS). He recovered after 48 h of symptomatic treatment. Key words: uvula, edema; loofah sponge; Luffa cylíndrica; odynophagia; toxic plants; sinusitis, tusa.

En muchos países, las plantas son una causa común de intoxicación, siendo común en niños pequeños. En el Primer Mundo la ingestión de plantas es responsable de un número significativo de todas las consultas, pero los envenenamientos graves son raros2,3. En Escandinavia, las plantas fueron responsables de 5% de los casos de intoxicación pediátrica y el 28% de llamadas a un centro de información de veneno4. El envenenamiento por plantas en el mundo desarrollado es fundamentalmente un problema de los niños pequeños que ponen cosas en su boca mientras exploran su entorno. Sin embargo, en el Tercer Mundo, el envenenamiento por plantas es un problema clínico importante. La intoxicación con ellas causan un número importante de muertes cada año en el sur de Asia y casi todas las muertes resultan de suicidio o de homicidio5-8. La intoxicación con frutas inmaduras del árbol de ackee (Blighia sapida) en el Caribe y África occidental seguramente causa decenas a cientos de muertes cada año9. En Centroamérica se describe una neuropatía aguda con el uso de tullidora (Karwinskia humboldtiana) una fruta de uso común. En el caso estudiado en este trabajo, el paciente desarrolla un cuadro inflamatorio difuso de las vías aéreas superiores, que ocasionó un ingente edema de úvula y glotis, que pudo desencadenar una muerte por asfixia, causado por la instilación nasal de una solución de estropajo (Luffa cilíndrica). Tras revisión de la literatura, podemos plantear que se trata del primer caso descrito de esta inusual intoxicación y daño de vías aéreas superiores ocasionado por esta planta. Descripción del caso Este paciente de 55 años de edad, natural de Colombia, sexo masculino, sin antecedentes particulares, pero con una sinusitis crónica, deseando utilizar un tratamiento folklórico, que se sugiere hacer inspiraciones con vapores de estropajo (Luffa cylíndrica), para despejar los senos nasales y paranasales, decide acelerar el tratamiento instilándose la solución hervida de Luffa cilíndrica en gotas nasales. Se presenta a la consulta con incapacidad para hablar, siendo los datos aportados por familiar. El paciente presentó 4 horas después de la instilación, disfonía, con un severo edema de úvula. Se encontraba confundido, con cefalea, así como con intensa odinofagia y dificultad respiratoria.

Fig.1. Intenso edema de úvula

El balance biológico no presentaba particularidades. Electrocardiograma con ritmo sinusal normal. Las funciones renales y hepáticas fueron normales. El paciente fue hospitalizado, se le indicó dieta absoluta y se hidrató con soluciones salinas y de dextrosa alternadas por 24 horas. Hidrocortisona: 500 mg, endovenoso y luego cada 6 horas; clorfeniramina: 1 ampolla 5 mg y luego cada 8 horas; oxígeno: 3 - 4 litros/ por catéter o mascarilla nasal (SOS); adrenalina: 0.4 mL vía subcutánea (SOS). A las 12 horas de hospitalización: en mejores condiciones generales, hidratado, afebríl. ORL: úvula y faringe menos edematosa, mejora disfonía y odinofagia, mejoría para tragar líquidos. El balance biológico sin alteraciones que reportar. En vista de aparición de cifras tensionales elevadas 135/95 mmHg, se indicó: captopril 25 mg sublingual y luego 2 veces al día con control de tensión arterial. Se inició dieta líquida hiperprotéica de 1500 m en 24h. A las 17 horas de hospitalización: se indicó captopril 25 mg, vía oral. Cada 8 horas, por persistencia de cifras tensiónales elevadas: 142/87 mmHg. A las 48 horas de hospitalización: paciente en mejores condiciones generales, a febril con mejoría de sintomatología:

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Hay numerosas plantas que contienen sustancias químicas o que las acumulan, las cuales son venenosas para los seres humanos. Las consecuencias de la intoxicación pueden variar desde irritaciones menores y hasta casos graves, donde el individuo presenta una gran suma de sufrimiento y puede morir. Podrían facilitarse las cosas si las plantas pudieran clasificarse en dos grupos, venenosos y no venenosas. Sin embargo, ello no se puede hacer, porque muchos factores son responsables de los principios tóxicos en las plantas. Lo que puede ser una especie de planta inofensiva en una circunstancia podría ser mortal en otro1.

Al examen físico, es un paciente de raza negra, afebril, hidratado con prurito cutáneo leve, no presencia de erupción, pupilas isocóricas reactivas a la luz. Tensión arterial: 149/87 mmHg,; temperatura: 37 ºC. Boca: hipertrofia y edema de úvula acentuado (Fig. 1), faringe congestiva, amígdalas hipertróficas. Fosas nasales: eritema de mucosa e hipertrofia de cornete inferior y medio. Cuello móvil sin daños aparentes. Cardiopulmonar: ruidos cardiacos normales, sin soplos y frecuencia cardiaca: 95 pulsaciones/min. Respiratorio: ruidos respiratorios normales en ambos campos pulmonares, sin agregados, con frecuencia respiratoria: 18 por minuto. Abdomen: blando, no doloroso a palpación, sin megalias aparentes. Neurológico: consciente, orientado, marcha normal. Lenguaje por señas. Por dificultad para hablar.

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Introducción

no había disfonía ni odinofagia, disminución de eritema de mocosa nasal, amígdalas menos hiperémicas, voz normal y audible. Toleró vía oral. Se indicó dieta blanda. En vista de mejoría de sintomatología y paraclínica normal se indicó su egreso.

traron actividad diurética en ratas10 y molusquicida (fracción triterpénica). La isocucurbitacina B demostró actividad citotóxica in vitro. Algunos de estas sustancias, en su actividad aislada o sinérgicamente, fueron posiblemente las responsables de este cuadro de intoxicación.

Indicaciones de egreso: Cita control en 48 horas por Consulta Externa. Tratamiento ambulatorio: prednisona vía oral, clorfeniramina vía oral cada 8 horas por 5 días.

Estas plantas contienen principios nombrados elaterinas11, donde sobresale la alfaelaterina, levógira fisiológicamente inactiva y la beta-elaterina dextrógira y de enorme actividad laxante, probablemente por lo irritante sobre la mucosa.

Control a las 48 horas de egreso: refiere secreción fétida por fosa nasal, sin referir otra sintomatología. Se indicó: amoxacilina-acido clavulanico 500 mg. Vía oral, cada 8 horas por 14 días. Gotas nasales de monosulfa, cada 4 horas. Paciente no acudió a citas sucesivas. Discusión La Luffa cylíndrica, cuyos nombres comunes son: tusa, estropajo, esponjilla, pertenece a la Familia de las Cucurbitaceae. Crece en África y Asia tropical, siendo Japón el principal productor3. Las fibras de sus frutos maduros son empleados en medicina tradicional China desde el siglo X d.C. Pertenece al grupo de plantas industriales, es una enredadera anual, con hojas grandes lobuladas y flores masculinas amarillas, los frutos son cilíndricos alargados y gruesos (Fig. 2). Fig.2. Fruto de la Luffa cilíndrica

En su composición química se encuentran principios activos, tales como los triterpenos: cucurbitacinas B y D, isocucurbitacinas B, neocucurbitacinas A y B, y gigsogenina. Otros como: buchinina (principio amargo), huffanina y buchina (alcaloides), saponinas, luperósidos A-H (partes aéreas), metacarboxi-fenilalanina, elaterina, y citrulina (semillas). Los extractos acuosos y etanólicos (95%), de los frutos demos-

Esta sustancia activa de la planta, también tiene efecto antiinflamatorio12 (inhibiendo la IL-1 y TNFa en ratones), pero asimismo causa daño celular directo sobre numerosos tejidos in vitro. Esto podría explicar su efecto tóxico que se describe13. En general, los cuadros más severos se han observado en enfermos que utilizaron el jugo de cucurbitáceas sin diluir y en instilación directa en las fosas nasales como ocurrió en nuestro paciente. En un estudio de 42 pacientes con angioedema14 ocasionado por el uso de otra cucurbitacea rica en elaterina la Ecballium elaterium 93% de los casos tenía antecedentes de atopia y el cuadro clínico de angioedema que se desarrolló rápidamente tras la administración del jugo, sugiere que estas reacciones fueron mediadas por un mecanismo de hipersensibilidad tipo I (mediada por IgE). Hay numerosos agentes vegetales que favorecen los principios tóxicos en algunas plantas. Alguna especie de planta individual o sus variedades podrían diferir en su contenido venenoso, de acuerdo a su estadio de madurez. En algunas plantas, hay un aumento en su habilidad de envenenar en sus etapas avanzadas del crecimiento, mientras otras el riesgo disminuye. En otras, el veneno se halla en las plantas frescas pero no en las deshidratadas15. El tratamiento para la mayoría de intoxicaciones por plantas es sintomático y los antídotos específicos se utilizan en sólo unas pocas. Aquí, se describe un cuadro de intoxicación y probablemente una reacción anafilactoide, por uso tópico de extracto de la planta de estropajo (Luffa cylíndrica), cuando fue utilizado como medicamento nasal para tratar una sinusitis crónica, en forma equivocada, ya que la etnomedicina lo sugiere para ser usado como inhalación de sus vapores, que permitan el drenaje de secreciones mucosas o mucopurulentas de los senos nasales congestionados. El paciente presentó 4 horas después de la instilación, disfonía, con un crecido edema de úvula. Llegó a la consulta con cefalea, así como con intensa odinofagia y dificultad respiratoria, que pudo comprometer la vida del paciente. Los síntomas se desarrollaron muy rápidamente y se parecían a una reacción alérgica. En este caso, la descripción de la planta ingerida permitió identificar a la familia de las cucurbitáceas y la especie involucrada, lo cual, tras revisión de la literatura, nos permite plantear que se trata del primer caso descrito de esta inusual intoxicación y daño de vías aéreas superiores ocasionado por esta planta.

Fue tratado con oxígeno, hidrocortisona, clorfeniramina y adrenalina (SOS). El paciente se recuperó después de 48 h de tratamiento sintomático.

Eddleston M, Persson H. Acute plant poisoning and antitoxin antibodies. J Toxicol Clin Toxicol 2003; 41:309-315.

Wolfle J, Kowalewski S. Epidemiology of ingestions in a regional poison control center over twenty years. Vet Hum Toxicol 1995; 37: 367–368.

Krenzelok EP, Jacobsen TD. Plant exposures. A national profile of the most common plant genera. Vet Hum Toxicol. 1997; 39: 248–249.

Lamminpaa A, Kinos M. Plant poisonings in children. Hum Exp Toxicol. 1996; 15:245-249.

Narendranathan M, Das KVK, Vijayaraghavan G. Prognostic factors in Cerebra odollum poisoning. Indian Heart J 1975; 27:283–286.

Hoque F. Incidence and clinical pattern of acute poisoning in a district hospital. Bangladesh Med J 1986;15:13–17.

Eddleston M, Ariaratnam CA, Meyer PW, Perera G, Kularatne SAM, Attapatu M, et al. Epidemic of self-poisoning with seeds of the yellow oleander tree (Thevetia peruviana) in northern Sri Lanka. Trop Med Int Health. 1999; 4:266–273.

Thomas K, Dayal AK, Narasimhan, Ganesh A, Sheshadri MS, Cherian AM, et al. Metabolic and cardiac effects of Clistanthus collinus poisoning. J Assoc Physicians India 1991; 39: 312–314.

Sherratt HSA. Jamaican vomiting sickness. In: de Wolff FA, editor. Handbook of clinical neurology, Vol 65. Intoxications of the nervous system, part II. Amsterdam: Elsevier Science; 1995. pp. 79–113.

10. Bruneton, Plantes toxiques : végétaux dangereux pour l’homme et les animaux, Tec & Doc éditions, Paris, 2005. 11. Culbreth DMR. A Manual of Materia Medica and Pharmacology. (Eds.) Lea Brothers & Co, USA. 1917. 12. Sezik E, Yesilada E. Clinical effects of the fruit juice of Ecbalium elaterium in the treatment of sinusitis. J Toxicol Clin Toxicol 1995; 33: 381-383. 13. Yesilada E, Tanaka S, Sezik E, Tabata M. Isolation of an anti-inflammatory principle from the fruit juice of Ecballium elaterium. J Nat Prod 1988; 51: 504-508. 14. Satar S, Gokel Y, Toprak N, Sebe A. Life-threatening uvular angioedema caused by Ecbalium elaterium. Eur J Emerg Med 2001; 8: 337-339. 15. Flesch F, Krencker E. Intoxications par les végétaux, EMC (Elsevier Masson SAS, Paris) Urgences 2007; .24 :116–A07.

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Referencias

Determinación de la glucosa en sangre

de equinos pura sangre de carrera medicados con fenilbutazona y flunixin meglumine Determination of glucose of blood in thoroughbred horses medicated with phenylbutazone and flunixin meglumine

Abelardo Morales Briceño¹³, Diana Villoria³, Mario Rossini¹, Luís Rivero¹, Mariam Gómez², Hector Bello³ ¹Departamento de Patología Facultad de Ciencias Veterinarias, Facultad de ²Agronomia, Universidad Central de Venezuela Maracay, Estado Aragua Venezuela, ³División de Sanidad Animal Junta Liquidadora Instituto Nacional de Hipódromos “La Rinconada” Caracas Venezuela. Email: aamorales13@gmail.com.

Resumen 62

Se plantea como objetivo describir los niveles de glucosa en sangre asociados a la administración de fenilbutazona y flunixin meglumine respectivamente en equinos. Se estudiaron 7 equinos Pura Sangre de Carrera de 2 años de edad, tres de sexo hembra y cuatro de sexo macho. Fueron tomadas muestras de sangre previa a la medicación. La fenilbutazona fue administrada vía endovenosa a una dosis 4,4mg/kg a tres caballos y el flunixin meglumine fue administrada en dosis de 1,1mg/kg a 3 caballos por vía endovenosa. Los niveles de glucemia fueron estudiados a la 1 hora, 2 horas, 3 horas y 4 horas post medicación de los fármacos en estudio. Los resultados expresados en mg/dL fueron: fenilbutazona 1 hora: 108-126-131, 2 hora: 112-128-130, 3 hora: 115-130-131 y 4 hora: 130-132-134 para flunixin meglumine 1 hora: 111-106110, 2 hora: 114-106-113, 3 hora: 111-108-111 y 4 hora: 111112-114. En conclusión se observan cambios significativos glucosa en sangre en los equinos medicados con fenilbutazona y flunixin meglumine respectivamente. PALABRAS CLAVES: equinos, glucosa, fenilbutazona, flunixin meglumine.

Abstract The aim of this study was to describe the levels of blood glucose associated with the administration of phenylbutazone and flunixin meglumine in horses respectively. We studied 7 thoroughbred race horses 2 years of age, sex three female and four male sex. Blood samples were taken prior to medication. Phenylbutazone was administered intravenously at a dose 4.4 mg / kg to three horses and flunixin meglumine was administered at doses of 1.1 mg / kg to 3 horses intravenously. Blood glucose levels were studied at 1 hour, 2 hours, 3 hours and 4 hours after medication of the study drugs. The results expressed in mg / dL were: phenylbutazone 1 hour: 108-126-131, 2 hours: 112-128-130, 3 hours: 115-130-131 and 4 hours: 130-132-134 for flunixin meglumine 1 hour: 111106-110, 2 hours: 114-106-113, 3 hours: 111-108-111 and 4 hours: 111-112-114. In conclusion, we observed significant changes in blood glucose in horses medicated with phenylbutazone and flunixin meglumine respectively. Keywords: equine, glucose, phenylbutazone, flunixin meglumine.

Materiales y metodos Se estudiaron 7 equinos Pura Sangre de Carrera de 2 años de edad, tres de sexo hembra y cuatro de sexo macho. Fueron tomadas muestras de sangre previa a la medicación. Todos los ejemplares se mantuvieron en ayuna antes y durante el experimento. La fenilbutazona fue administrada vía endovenosa a una dosis 4,4mg/kg a tres caballos y el flunixin meglumine fue administrada en dosis de 1mg/kg a 3 caballos por vía endovenosa. Los niveles de glucemia fueron estudiados a la 1 hora, 2 horas, 3 horas y 4 horas post medicación de los fármacos en estudio. Se empleo un glucómetro marca Abbott y (Blood Glucosa Test strips marca Abbott CPE0807130) para la determinación de glucosa en sangre. Resultados Los valores de glucosa previo al tratamiento con antinflamatorios no esteroideos fueron en promedio de 90-113mg/dL. Los niveles de glucosa con la administración de fenilbutazona y flunixin meglumine se muestran en tabla 1.

Tabla 1.- Niveles de glucosa en horas en caballos Pura Sangre de Carreras en el Hipódromo “La Rinconada”. Previo tratamiento Glucosa mg/dl

Hora 1 mg/dl

Hora 2 mg/dl

Hora 3 mg/dl

Hora 4 mg/dl

Fenilbutazona (3) equinos

90- 110- 100

108-126-131

112-128-130

115-130-131

130-132-134

Flunixin meglumine(3)

100-108-112

111-106-110

114-106-113

111-108-111

111-112-114

113

114

113

115

110

Fármaco

Solución fisiológica (1) equinos

Grafico 1.- Niveles de glucosa en horas en caballos Pura Sangre de Carreras en el Hipódromo “La Rinconada”.

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 34, número 3, 2015

La fenilbutazona es un anti-inflamatorio no esteroideo (AINES), del grupo de las pirazolonas. Este actúa sobre el proceso inflamatorio, mediante la inhibición de alguno de los pasos del metabolismo del acido araquidonico. En equinos la concentración máxima en sangre se consigue a las 2-3 horas de su administración oral (biodisponibilidad del 70%) (Botana, et al., 2002; MacAllister, 1983). Con dosis suficientemente elevadas, los sistemas enzimáticos de metabolismo del fármaco (oxidasas de función mixta), se saturan y se produce la acumulación del mismo. De esta forma la semivida varía entre 3-10horas (Botana, et al., 2002). Presenta una gran liposolubilidad el volumen de distribución es bajo (alrededor de 0.1L/kg) debido a su alta afinidad por las proteínas plasmáticas (principalmente albúmina), cuyo nivel de unión es de 99% (Jones, 2005). La flunixin meglumine es un potente antinflamatorio no esteroideo de uso oral o parenteral (Botana, et al., 2002). Este inhibe las protaglandinas y leucotrienos, reestablece la presión sanguínea y atenúa el daño a los endotelios capilares (Botana, et al., 2002). Se observan niveles plasmáticos máximos de 3 ug/ml a los 30 minutos por vía oral y 10 ug/ml por vía endovenosa reflejando rápida absorción, casi un 80%, por vía digestiva. Por ambas vías se detecta una rápida declinación de los niveles máximos pudiendo observarse en orina como flunixin libre o sus metabolitos solo hasta 48 horas posterior a la última administración. No se describen, por ahora, efectos tóxicos de la droga incluso, al utilizar cinco veces la dosis recomendada

por un período de 5 días (Botana, et al., 2002). En virtud de esta importante área de estudio se plantea como objetivo describir los niveles de glucosa en sangre asociados a la administración de fenilbutazona y flunixin meglumine respectivamente en equinos.

AVFT

Introduccion

Discusión Se observaron cambios en los niveles de glucosa en los equinos medicados con antinflamatorios no esteroideos. Los niveles de glucosa en los equinos medicados con fenilbutazona fueron mayores en comparación con los caballos medicados con flunixin meglumine así como en el equino no medicado. Estos resultados coinciden con los reportados en la literatura (Jones, 2005; MacAllister, 1983). Los niveles de glucosa asociados a la administración de flunixin meglumine fueron superiores en comparación con el equino no medicado, pero inferiores con los equinos tratados con fenilbutazona. Estos resultados son similares a los reportados en la literatura para equinos Pura Sangre de Carreras (Colahan, 2002) y para Ponies (Fessler, et al., 2002). En conclusión se observan cambios significativos glucosa en sangre en los equinos medicados con fenilbutazona y flunixin meglumine respectivamente.

Referencias Botana L, Landoni F, Martín T. Farmacología y terapéutica Veterinaria. Madrid - España, 2002. pp 3-690. Colahan PT, Bailey JE, Chou CC, Johnson M, Rice BL, Jones GL, Cheeks JP. Effect of flunixin meglumine on selected physiologic and performance parameters of athletically conditioned thoroughbred horses subjected to an incremental exercise stress test. Vet Ther. 2002 Spring;3(1):37-48. Fessler JF, Bottoms GD, Roesel OF, Moore AB, Frauenfelder HC, Boon GD. Endotoxin-induced change in hemograms, plasma enzymes, and blood chemical values in anesthetized ponies: effects of flunixin meglumine. Am J Vet Res. 1982 Jan;43(1):140-4. Gunson D, Soma L. Renal papillary necrosis in horses after phenylbutazone and water deprivation. Vet Pathol. 1983 Sep;20(5):603-10.

Jones PG. Phenylbutazone and equine research. Vet Rec 2005 Apr 23; 156(17): 554-5. MacAllister C. Effects of toxic doses of phenylbutazone in ponies. Am J Vet Res. 1983 Dec;44(12):2277-9. Mackay R, French T, Nguyen H, Mayhew I. Effects of large doses of phenylbutazone administration to horses. Am J Vet Res. 1983 May;44(5):77480.