Memoria fio 2012 by Instituto Oftalmológico Fernández-Vega

Memoria de Investigaciﾃｳn y Docencia. Aﾃ前 2012

Memoria de Investigación y Docencia. AÑO 2012

Presentación Faustino Blanco González Consejero de Sanidad del Principado de Asturias

Quiero en primer lugar agradecer al profesor Luis Fernández-Vega Sanz su invitación a presentar esta Memoria de Investigación y Docencia 2012 de la Fundación de Investigación Oftalmológica. Es una publicación en la que ustedes como lectores disfrutarán del privilegio de aproximarse con más profundidad al trabajo, la colaboración, el rigor y la inteligencia; la buena ciencia, en definitiva, que se produce en esta institución tan estrechamente vinculada a Asturias. Personalmente, la lectura de estos anales me ha servido para conocer mejor una organización fuertemente unida a la sanidad asturiana, en este caso privada, a la que nos sentimos vinculados por fuertes y entrañables lazos, sin olvidarnos del espacio público que siempre compartimos. Para mí es también un motivo de satisfacción poder transmitirles a través de estas notas algunas ideas acerca de cómo este consejero entiende la investigación sanitaria o el papel de los servicios públicos de salud en su relación con una Fundación del ámbito privado como esta, que en sus primeros cuatro años de existencia ya ha dado sobradas muestras de su enorme potencial en investigación oftalmológica de excelencia y su traslado a la clínica. Una fortaleza que no causará entre quienes, en alguna medida, hemos sido testigos de los 125 años de actividad oftal-

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mológica que atesora esta familia y que tiene su mejor expresión en el Instituto Oftalmológico que lleva su nombre. En la Consejería de Sanidad estamos convencidos de que el sector sanitario asturiano en su conjunto puede y debe ser un importante polo de atracción para la innovación; un sector de conocimiento estratégico, de desarrollo inteligente y, en consecuencia, de actividad y progreso económico. Unas cualidades que contribuirán a que la sanidad siga siendo uno de los servicios públicos mejor valorado por los ciudadanos. Asturias mantiene un buen nivel de investigación biomédica con una producción cercana a las 4.000 publicaciones científicas relacionadas con la salud en la última década. Con la próxima inauguración del nuevo Hospital Universitario Central de Asturias creemos que ha llegado el momento de aprovechar toda esta potente factoría hospitalaria y el conocimiento de su capital humano para impulsar la investigación de excelencia, el desarrollo y la innovación, que constituyen la base del progreso de una sociedad moderna. Esta es una de las razones por las que desde el Ejecutivo nos hemos aventurado en un proyecto participativo, ambicioso, complejo y apasionante, como es el de poner en marcha una Fundación para la Investigación e Innovación Biosanitaria de Asturias, la FINBA. La FINBA está llamada a ser ese elemento dinamizador en esta estrategia, con una organización que ofrecerá los servicios, las infraestructuras y el apoyo económico, administrativo, metodológico y logístico para facilitar el desarrollo de la investigación biosanitaria al más alto nivel. Estará ubicada en el entorno del nuevo Hospital Universitario Central de Asturias para fortalecer la innovación en ciencias de la salud, fomentando la cooperación, la coordinación, la programación conjunta, la internacionalización y la colaboración con otras entidades del ámbito público y privado. Queremos llegar lejos, y para lograrlo también nosotros, como explicó Isaac Newton en su célebre carta a Robert Hooke, debemos “subirnos a hombros de gigantes”. Tenemos que hacerlo a través de la cooperación de todos, el intercambio de ideas, inquietudes, experiencias y conocimiento, que son la médula de la investigación. La ciencia es una apasionante aventura, necesariamente cooperativa, donde la interacción es tan vital como el estudio o la propia reflexión personal, porque provoca inspiración, genera entusiasmo y eleva las expectativas. En todo esto, las personas que integran el Instituto Fernández-Vega tienen sobrada solvencia y reconocimiento. Somos conscientes de que la consecución de un objetivo tan ambicioso hace imprescindible contar con profesionales tan cualificados y entusiastas como los que integran esta Fundación de Investigación Oftalmológica y este Instituto Oftalmológico. Verdaderos gigantes de la medicina

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y la investigación que tienen un compromiso que renuevan continuamente con Asturias y que resulta tremendamente enriquecedor para la sociedad. Confío también en que con el tiempo todas las organizaciones reconocidas del ámbito sanitario sumen con generosidad a este proyecto un conocimiento del que no podemos prescindir para que la Fundación, que pronto verá la luz, sea patrimonio de todos. Estoy convencido de que la FINBA complementará la investigación oftalmológica de este Instituto y la producción científica asturiana, como lo hace ya su propia Fundación. También sé que será de gran utilidad para ambos avanzar en el camino de la excelencia, por el que transitan desde hace años con esfuerzo y brillantez cuatro generaciones de Fernández-Vega. Desde aquí pido el reconocimiento para esta organización, a la que animo a seguir tratando de convertir en realidad todas sus ideas e ilusiones, que, sin duda, redundarán en el bien de todos los asturianos haciendo progresar la ciencia y la investigación biomédica en el Principado de Asturias.

III

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Índice Presentación del Consejero de Sanidad del Principado de Asturias

1. Presentación del Prof. Luis Fernández-Vega Sanz

2. Presentación del Dr. Jesús Merayo Lloves

3. Estructura organizativa de la Fundación de Investigación Oftalmológica

Área de investigación

4. Investigación básica y traslacional

4.1. Unidad de superficie ocular y córnea

Caracterización de una nueva población de neuronas retinianas

Medicina regenerativa y terapia celular de la córnea: modelos experimentales

Queratocono

Efecto de los péptidos de origen sensorial en la integridad corneal

Estudio electrofisiológico de la inervación sensorial corneal

Análisis y definición de las propiedades de derivados polisacarídicos naturales sobre los tejidos corneales

Obtención y caracterización de las diferentes estirpes celulares corneales

Desarrollo de membranas soporte aptas para el crecimiento celular basadas en queratina

4.2. Unidad de neurobiología de la retina

4.3. Unidad de genética de ocular

5. Unidad de investigación clínica

5.1. Grupo de segmento anterior: superficie ocular, córnea, cirugía refractiva y cristalino

5.2. Grupo de vítreo-retina

5.3. Grupo de glaucoma

PROYECTO 1.

PROYECTO 2.

PROYECTO 3.

PROYECTO 4. PROYECTO 5.

PROYECTO 6.

PROYECTO 7.

PROYECTO 8.

PROYECTO 9.

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Área de docencia

6. Actividad docente

6.1. Estudios de pregrado

6.2. Estudios de post-grado

Sesiones de actualización

Seminarios Regionales de Oftalmología

II Jornadas de Optometría del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega

6.3. Otros estudios

6.4. Profesorado

7. Mecenazgo y participación en proyectos con financiación competitiva

7.1. Mecenazgo

7.2. Proyectos con financiación competitiva

8. Comunicación de la ciencia

8.1. Artículos originales

8.2. Publicaciones de libros y artículos de libros

8.3. Patentes

8.4. Comunicaciones a congresos y reuniones científicas

8.4.1. Comunicaciones a Congresos

8.4.2. Comunicaciones presentadas en el Congreso ARVO

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1. Presentación del

Prof. Luis Fernández-Vega Sanz En el año 2012 se cumplen 125 años del inicio, por mi bisabuelo Adolfo Fernández-Vega, de la actividad oftalmológica, que ha culminado en lo que hoy es el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega y los cuatro primeros años de la Fundación de Investigación Oftalmológica. Llegar hasta aquí es fruto del esfuerzo constante de cuatro generaciones de oftalmólogos cuyo espíritu de trabajo y búsqueda de la excelencia se ha transmitido a la Fundación. Si bien cuatro años no es mucho tiempo para evaluar la actividad investigadora, podemos decir que se han consolidado en este plazo las diferentes líneas de trabajo y se ha realizado una abundante producción científica y la transferencia a la clínica de los resultados de la investigación. Además se han afianzado los estudios de postgrado en colaboración con la Universidad de Oviedo, lo que permite transmitir a oftalmólogos, enfermeros, optometristas y jóvenes investigadores la capacidad docente generada por la actividad del Instituto y de la Fundación. Ha coincidido este periodo con una crisis económica muy acusada que ha hecho más valiosa las aportaciones recibidas de otras fundaciones y entidades, sin cuya colaboración no hubiera sido posible cumplir con los programas que nos propusimos en sus inicios. Quiero dejar constancia de nuestro agradecimiento a todos aquellos que nos han ayudado en nuestros fines, especialmente a la Fundación María Cristina Masaveu Peterson, que nos ha respaldado desde el comienzo, y también a la Fundación BBVA, Cajastur, Fundación Rafael del Pino, Fundación Ramón Areces, La Caixa, Caja Rural de Asturias, Fundación Mutua Madrileña, Staar Surgical, Novartis, AJL, así como al Gobierno del Principado de Asturias, Ministerio de Ciencia y Tecnología, a la Universidad de Oviedo y a las personas que a título individual y de forma desinteresada han contribuido al desarrollo de nuestros trabajos. A todos nuestro agradecimiento. Exponemos a continuación en esta memoria del 2012, un resumen de las labores realizadas en las distintas líneas de investigación, así como de la actividad docente que, dentro del Convenio Marco suscrito con la Universidad de Oviedo, hemos llevado a cabo. Aun cuando parece que la incertidumbre es la constante que permanece en las perspectivas económicas de nuestro país y su entorno, confiamos en que, con el trabajo de nuestro equipo, que suma más de 30 personas, y el apoyo recibido de las distintas entidades que nos ayudan, logremos cumplir con los fines de nuestra Fundación. Prof. Luis Fernández-Vega Sanz Catedrático de Oftalmología. Universidad de Oviedo Presidente. Fundación de Investigación Oftalmológica

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2. Presentación del

Dr. Jesús Merayo Lloves Tiene en sus manos el resumen del trabajo realizado desde la FIO a lo largo del año 2012. A nivel de investigación ya se presenta producción propia con publicaciones en las revistas de más impacto, una patente y transferencia de productos de la investigación a los pacientes. Se ha conseguido financiación competitiva de proyectos de investigación y fructíferas colaboraciones con la Universidad de Oviedo y otras, y con las empresas del sector de la visión. La capacidad docente es vehiculizada en 5 programas Máster y otros cursos de postgrado de los que se están beneficiando los alumnos españoles y extranjeros. Durante los próximos años y conscientes del entorno socio-económico que vivimos trataremos de consolidar las líneas de investigación más competitivas y desarrollar estratégicamente las investigaciones dedicadas a Medicina Regenerativa Ocular, donde se aplicarán los resultados de los estudios básicos de inervación, cicatrización y regeneración corneal que llevamos realizando estos 4 años. Esta actividad de investigación y docencia no podría ser viable sin estar pegada a la actividad clínica del IOFV, que es quien traspasa al laboratorio los problemas no resueltos para poder orientar adecuadamente las líneas de investigación a temas pertinentes que todavía ocasionan pérdida de visión e incluso ceguera. Es el verdadero motor de la FIO y lo que nos diferencia de otros centros de nuestro entorno. A todos los que nos ayudan a convertir en realidad nuestras ideas, muchas gracias. Estoy seguro que en el año próximo subiremos el listón todavía más alto a lo que pueden comprobar en las páginas siguientes. Fdo.: Dr. Jesús Merayo Lloves Profesor Titular de Oftalmología. Universidad de Oviedo Director de Investigación. Fundación de Investigación Oftalmológica

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3. Estructura organizativa de la Fundación de Investigación Oftalmológica Dirección de la Fundación de Investigación Oftalmológica

Investigación básica y traslacional

PATRONATO

INVESTIGADORES PRINCIPALES Prof. Carlos Belmonte Prof. Miguel Coca Dr. Álvaro Meana Dr. Jesús Merayo Prof. Neville Osborne

presidente Prof. Luis Fernández-Vega Sanz secretaria Dña. María Victoria Cueto-Felgueroso Botas vocales D. Álvaro Fernández-Vega Sanz D. Javier Fernández-Vega Sanz DIRECCIÓN DE INVESTIGACIÓN Y DOCENCIA Dr. Jesús Merayo Lloves EQUIPO ASESOR, GERENCIA Y GESTIÓN asesor del presidente: Prof. Carlos Belmonte gerencia: D. Gonzalo Macías D. Guzmán Suárez gestión: D. Rogelio Fernández COMISIÓN DE INVESTIGACIÓN Dr. José F. Alfonso Prof. Carlos Belmonte D. Gonzalo Macías Dr. Jesús Merayo.

INVESTIGADORES POST-DOCTORALES Dr. Ignacio Alcalde Dr. Carlos Alonso Dra. Lydia Álvarez Dra. Montserrat García Dr. Héctor González Dra. Belén Joglar INVESTIGADORES PRE-DOCTORALES Dña. Ana Fernández D. Omar González Dña. Almudena Iñigo Dña. Claudia Núñez Dña. Susana del Olmo Dña. Natalia Vázquez TRABAJOS DE FIN DE GRADO D. Francisco J. Colina D. Federico Bech ESTUDIANTE EN PRÁCTICAS D. Carson Petrash

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Investigación Clínica y Ensayos Clínicos

Área de Docencia

INVESTIGADORES PRINCIPALES Dr. José F. Alfonso Dr. Alvaro Fernández-Vega Prof. Luis Fernández-Vega Dr. Jesús Merayo Dr. Pedro Pablo Rodríguez

RECURSOS HUMANOS

INVESTIGADORES COLABORADORES Dr. Carlos Lisa Dra. Beatriz Fernández-Vega Dr. Manuel Riaño Dra. Eva Villota Dr. Manuel Yllera TÉCNICOS D. Miguel A. Álvarez Dña. Silvia Canga Dña. Carmen Carús Dña. Montse Gancedo Dña. Silvia García D. Javier Lozano Dña. Miriam Merino Dña. Ana Palacios Dña. Arancha Poo Dña. María Requejo Dña. Ana C. Riestra Dña. Joana Rodríguez D. Ignacio Serrano Dña. Gloria de la Torre D. Emilio Tudela Dña. Beatriz Valcárcel

coordinador de docencia Dr. Jesús Merayo profesorado docente del instituto oftalmológico fernández-vega y de la fundación de investigación oftalmológica y profesores invitados OFERTA FORMATIVA Pregrado Post-grado — Programa de Doctorado de la Universidad de Oviedo. — Programa de Títulos Propios de la Universidad de Oviedo. · Máster en Superficie Ocular, Córnea y Cristalino · Máster en Retina y Vítreo · Máster en Glaucoma · Máster en Optometría Clínica · Máster en Enfermería Oftalmológica · Curso de Experto Universitario en Cirugía Aditiva de la Córnea · Programa de Formación Continuada en Ciencias de la Visión

Servicios Comunes técnicos de laboratorio D. Manuel Chacón D. Enol Artime Secretaría Técnica Dña. Silvia Canga D. Ramón Mayor Dña. Gloria de la Torre

ÁREA DE INVESTIGACIÓN

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4. Investigación básica y traslacional 4.1.

UNIDAD DE SUPERFICIE OCULAR Y CÓRNEA INVESTIGADORES PRINCIPALES:

Prof. Carlos Belmonte Dr. Álvaro Meana Dr. Jesús Merayo INVESTIGADORES POST-DOCTORALES:

Dr. Ignacio Alcalde Dr. Carlos Alonso INVESTIGADORES PRE-DOCTORALES:

Dña. Ana Fernández D. Omar González Dña. Almudena Íñigo Dña. Natalia Vázquez TRABAJO DE FIN DE GRADO:

D. Francisco J. Colina D. Federico Bech

La unidad de superficie ocular y córnea tiene como misión investigar los mecanismos fisiopatológicos básicos relacionados con el trofismo, la regeneración, la inflamación y las alteraciones en la inervación de la superficie ocular. Sus disfunciones son el origen de enfermedades como el síndrome de ojo seco (30% de la población) y el dolor ocular (para el que no existe tratamiento efectivo). La comprensión de estos mecanismos es imprescindible también para una medicina regenerativa dirigida al tratamiento de enfermedades corneales que causan ceguera (queratocono y otras causas de trasplante). El fin último del trabajo en esta unidad es encontrar nuevos métodos diagnósticos y de tratamiento médico-quirúrgico que solucionen problemas clínicos no resueltos, y lograr transferir los resultados a la clínica para que se puedan beneficiar los pacientes cuanto antes.

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PROYECTO 1.

Participación de las fibras nerviosas termorreceptoras de la córnea en la regulación de la secreción lacrimal y en la aparición de sensaciones de molestia en animales, y su modificación con la edad. La córnea es la estructura del organismo que presenta una mayor densidad de terminaciones nerviosas sensitivas. Estas fibras nerviosas detectan estímulos ambientales que son transformados en sensaciones conscientes. Es posible que también recojan información sobre el microambiente celular de la córnea, contribuyendo a preservar su homeostasis. Sirven como sistema de alerta ante agresiones externas o estados de enfermedad. Nuestro grupo descubrió recientemente que las terminaciones sensoriales de frío de la superficie ocular contribuyen a la regulación de la secreción lacrimal. La alteración de estas fibras nerviosas podría derivar en la aparición de patologías relacionadas con la falta de lágrima en la superficie corneal. Las neuronas sensibles al frío expresan unos canales iónicos llamados TRPM8. Estas proteínas se activan en respuesta a temperaturas decrecientes y también con compuestos químicos que producen sensación de frescor, como el mentol. Se ha establecido que el canal TRPM8 es el sensor molecular de frío del organismo, de modo que las terminaciones nerviosas que lo contienen actúan como termorreceptores específicos para el frío. Estas terminaciones nerviosas son activadas en condiciones normales por leves variaciones de temperatura debidas a la evaporación de la película lacrimal, pero pueden también dispararse anómalamente tras una lesión, en patologías de la superficie ocular o como consecuencia de la sección de las fibras nerviosas durante la cirugía del polo anterior del ojo. Utilizando como modelo experimental un ratón transgénico en el que se ha unido la proteína fluorescente verde (GFP o Green Fluorescent Protein) al canal TRPM8 mediante ingeniería genética, podemos estudiar la morfología de la población de fibras nerviosas que responden al frío en la córnea y hemos analizado sus modificaciones morfológicas e inmunocitoquímicas como resultado del proceso de envejecimiento. Nuestro trabajo está mostrando que, con el transcurso del tiempo, la morfología y el número de fibras de frío sufre grandes cambios morfológicos y funcionales. Estos cambios parecen estar relacionados con las alteraciones en la producción de lágrima y la aparición de sensaciones de sequedad ocular y molestia que aparecen con la edad. En los experimentos llevados a cabo durante 2012 se han obtenido resultados que apuntan hacia la existencia en la córnea de dos subpoblaciones diferentes de fibras responsables al frío, y no de una sola como se creía hasta el momento. Mediante métodos de inmunohistoquímica y microscopía de fluorescencia avanzada hemos conseguido caracterizar el patrón neuroquímico de cada uno de los dos tipos neuronales. A través de registros electrofisiológicos de estas terminaciones hemos podido determinar que existen también dos poblaciones de fibras de alto y bajo umbral al frío. Todo ello apunta a que existe una población de neuronas

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cuyas terminaciones son responsables de la percepción de frío no intenso, mientras que la otra registra temperaturas más bajas y puede actuar también como mediador del dolor evocado por la sequedad y el enfriamiento corneales. Hemos investigado la evolución de las fibras de frío en ratones de avanzada edad. Las diferencias encontradas entre los animales jóvenes y los de mayor edad apuntan, por un lado ,a una regulación de la secreción lacrimal mediada por las fibras de frío; y, por otro lado, a que la desaparición selectiva de uno de los tipos de fibras de frío podría contribuir a la aparición de sensaciones de dolor en la córnea. Estos resultados están próximos a su publicación como trabajo realizado en colaboración con los centros que se enumeran abajo: Kovács I2, Luna L1, Quirce S1, Mizerska K 1, Callejo G3,4, Riestra A 5, Fernández-Sánchez L6, Meseguer VM1, Cuenca N6, Merayo-Lloves J5, Gasull3,4, Acosta MC1, Belmonte C1,5*, Gallar J1*. Abnormal activity of corneal cold thermoreceptors underlies the unpleasant sensations in dry eye disease (en preparación para «Nature Medicine»). 1

Instituto de Neurociencias, Universidad Miguel Hernández-CISC. San Juan de Alicante. Spain. 2 Department of Ophthalmology, Semmelwis University, Budapest. Hungary.3 Facultad de Medicina, Universitat de Barcelona, Barcelona. Spain. 4 Institut d’Investigacions Biomédiques Ausgust PI I Sunyer (IDIBAPS), Barcelona. Spain. 5 Fundación de Investigación Oftalmológica, Instituto Fernández-Vega, Oviedo. Spain. 6 Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Universidad de Alicante. San Vicente del Raspeig. Spain.

Fibras sensoriales de frío en la superficie corneal de un ratón TRPM8 KO.

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Neuronas del ganglio trigémino responsables de la sensación de frío en la superficie corneal (en verde). Se distinguen dos poblaciones diferentes de neuronas de respuesta a frío. Cada una de ellas presenta propiedades neuroquímicas distintas. Uno de los tipos colocaliza con marcadores relacionados dolor (en rojo) y podrían contribuir a las sensaciones dolorosas de la superficie ocular.

Actualmente se está estudiando mediante trazadores neuronales retrógrados la conexión existente entre los terminales sensoriales de la superficie ocular y las neuronas que regulan las glándulas lacrimales responsables de la hidratación de la córnea. Asimismo, pretendemos estudiar la morfología y los patrones de expresión diferencial de las neuronas sensoriales de frío en el ganglio trigémino como respuesta a la lesión o la denervación de la superficie corneal. Se han iniciado los experimentos sobre un modelo animal de cirugía refractiva utilizando ratones transgénicos TRPM8-EYFP y knock-out para TRPM8 (KO TRPM8) para analizar la regeneración de las fibras nerviosas corneales de frío durante la cicatrización corneal y valorar su contribución al dolor postquirúrgico y al síndrome de ojo seco. Paralelamente se ha establecido un sistema de análisis in vitro para estudiar las neuronas trigeminales sensibles al frío. Gracias a la caracterización neuroquímica realizada sobre secciones histológicas de ganglios trigéminos de ratón, podremos estudiar el comportamiento en cultivo de las neuronas de frío sometidas a distintas condiciones experimentales. Durante 2013 esperamos comprender mejor la contribución de estas neuronas TRPM8 positivas a la reparación corneal o los procesos inflamatorios. Los estudios derivados de esta línea de investigación forman parte de un proyecto subvencionado por el Ministerio de Economía y Competitividad en su convocatoria de 2011 (MICINN), coordinado por la Dra. Juana Gallar y el Prof. Carlos Belmonte.

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Cocultivo de neuronas de ganglio trigémino (visualizadas en verde) en contacto con células del estroma corneal.

Bases neurales fisiopatológicas del ojo seco: canales iónicos implicados en la alteración de la actividad de los nervios sensoriales y las sensaciones oculares anormales. Ministerio de Economía y Competitividad. Proyectos de Investigación Fundamental no Orientada. SAF2011-22500 Investigadora principal: Dra. Juana Gallar Martínez Investigador colaborador: Dr. Ignacio Alcalde

PROYECTO 2.

Caracterización de una nueva población de neuronas retinianas El canal iónico TRPM8 está relacionado con la percepción de la sensación de frío. Se ha localizado el canal TRPM8 en las terminaciones nerviosas de las neuronas sensoriales responsables de las sensaciones térmicas que se reparten por la superficie corporal. Y por ello hemos estudiado las fibras nerviosas que responden al frío y que se localizan en la córnea. Pero, además, existe evidencia en favor de la presencia de células y fibras nerviosas que presentan el canal TRPM8 en tejidos no expuestos a sensaciones térmicas. Tal es el caso de algunas fibras asociadas a pequeñas arterias de la túnica vascular del ojo que podrían estar regulando la tensión arterial. La exploración del globo ocular del ratón transgénico TRPM8-EYFP en busca de fibras nerviosas que expresan el canal TRPM8 nos ha permitido descubrir una nueva población de neuronas de la retina, en localizaciones no descritas hasta el momento para elementos EYFP+.

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Así, hemos descrito una nueva población discreta de células neuronales TRPM8+ con una distribución homogénea en la retina. Estas células dan lugar a dos plexos bien definidos en la capa plexiforme interna y son coincidentes con el patrón esperado para las células amacrinas de la retina. En 2012 empleamos una batería de marcadores específicos retinales, lo que nos ha permitido caracterizar la población neuronal como mayoritariamente colinérgica, por su inmunorreactividad a ChAT (Colín acetiltransferasa). En este estudio participan el Dr. Ignacio Alcalde, D. Manuel Chacón, Dr. José María García Fernández, Prof. Carlos Belmonte, Dr. Nicolás Cuenca y Prof. Pedro de la Villa. Además, se están llevando a cabo estudios encaminados a descubrir la función que puede tener el canal TRPM8 en la retina, ya que su función clásica es la de sensor de frío. Los primeros resultados del análisis funcional hechos en el laboratorio del Prof. Carlos Belmonte en Alicante mostraron que, en realidad, estas neuronas no responden a frío o a sus agonistas. Durante 2012 hemos conseguido demostrar por medios moleculares la presencia de TRPM8 en la retina del ratón, lo que refuerza nuestras observaciones anteriores. En un ratón Knock Out (KO) para el canal TRPM8 hemos podido comprobar que su retina posee menor cantidad de proteína TRPM8 que su homólogo silvestre. Hasta el momento no hemos podido aventurar una función para este tipo de células amacrinas ya que el ratón KO parece tener una visión normal.

PV EYFP En este detalle se observa que las células ganglionales y las TRPM8EYFP son poblaciones idénticas.

PV EYFP Área representativa de una preparación de retina de un ratón TRMP8-EYFP. Obsérvese la distribución homogénea de las neuronas amacrinas TRPM8-EYFP y la diferencia de tamaño con las células ganglionales positivas para parvalbúmina (pv).

EYFP CR Detalle de las neuronas ganglionales (en rojo) y las células amacrinas desplazadas (en verde) en la capa de las células ganglionales.

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Sin embargo, dado que la población está muy bien defi nida y corresponde tan solo a un tipo determinado de neurona, es interesante explorar la función de estas células. Hemos puesto a punto cultivos organotípicos de retina de ratones silvestres y KO para TRPM8 para poder determinar el papel de TRPM8 en la biología molecular de la retina.

PROYECTO 3.

Medicina regenerativa y terapia celular de la córnea: modelos experimentales El avance exponencial de la investigación en nuevas terapias regenerativas orientadas a la reparación de lesiones en el organismo hace necesario el desarrollo de modelos de experimentación para evaluar la eficacia de las técnicas disponibles para la aplicación de dichas terapias. Esta línea de investigación comenzó a funcionar desde los primeros momentos de la actividad investigadora de la FIO. La superficie ocular, como toda superficie externa del cuerpo, está expuesta a las agresiones de los factores ambientales, a traumatismos laborales, a procesos infecciosos y a los efectos degenerativos de la edad. La evolución clínica de las patologías oculares suele estar bien documentada gracias a la extensa experiencia de los profesionales de la salud. Sin embargo, los procesos histopatológicos y moleculares subyacentes siguen siendo bastante desconocidos. Los eventos registrados en sistemas experimentales in vitro no siempre se corresponden con lo observado in vivo. En nuestro grupo hemos desarrollado y estandarizado un modelo experimental de cicatrización corneal adaptado al ratón. Se eligió como modelo de lesión corneal la cirugía fotorrefractiva con láser excímer (PRK) por la uniformidad de la lesión corneal producida. De esta manera disponemos de una herramienta útil para la evaluación temporal de los eventos celulares sucedidos durante la cicatrización corneal y que sirve como patrón para la evaluación de estrategias terapéuticas en la superficie ocular. Sobre esta herramienta experimental podemos ensayar la efectividad de diferentes tratamientos para la reparación de la superficie ocular. Así, este modelo nos sirve para desarrollar la utilidad en clínica oftalmológica de terapias de medicina regenerativa basadas en la aplicación de diferentes derivados hemáticos (por ejemplo, el PRGF o el suero autólogo). Además es útil para estudiar la aplicación de células madre para la reparación de lesiones corneales, también para evaluar la tolerancia y la eficacia de fármacos que están siendo desarrollados por la industria.

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Medicina regenerativa de la córnea: evaluación de la actividad reparadora del PRGF (Plasma Rich in Growth Factors) in vivo Durante 2012 hemos llevado a cabo un ambicioso ensayo experimental en estrecha colaboración entre la FIO, IOFV y la empresa biotecnológica BTI (Biotechnology Institute) de Vitoria, dirigida por el Dr. Eduardo Anitua. El objetivo es trasladar a la superficie ocular una terapia regenerativa probada con éxito en otros territorios. Tradicionalmente la tecnología de PRGF (Plasma Rich in Growth Factors, desarrollada por la empresa BTI) se ha empleado con éxito en implantología y cirugía maxilofacial. En los últimos años se ha convertido en una terapia de referencia en medicina deportiva y traumatología, y recientemente se aplica en tratamientos de belleza. En algunos casos de gran dificultad clínica, en los que los pacientes no responden a un tratamiento convencional, se ha empleando el suero autólogo del paciente para tratar patologías de la superficie ocular como el ojo seco severo o las úlceras herpéticas. Recientemente, en nuestra clínica se ha iniciado la implantación del PRGF como terapia de medicina regenerativa para la superficie ocular. Antes de trasladar la aplicación a la clínica utilizamos nuestro modelo animal de lesión corneal por cirugía PRK en ratón para evaluar la capacidad del PRGF para mejorar el proceso de cicatrización y la conservación de la transparencia corneal. En 2012, los resultados obtenidos hasta el momento fueron expuestos en el Congreso Mundial de Investigación Oftalmológica (ARVO), celebrado en Fort Lauderdale, Florida: Plasma Rich in Growth Factors (PRGF-Endoret) accelerates corneal wound healing after PRK eye surgery, reducing haze formation Gorka Orive, Ignacio Alcalde, Francisco Muruzábal, María de la Fuente, Ana Fernández, Jesús Merayo-Lloves, Eduardo Anitua. 2012 Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting. Fort Lauderdale, FL (EE.UU.), mayo de 2012.

Nuestros resultados indican que el PRGF, en formulaciones especiales para el uso en la clínica oftalmológica, incrementa la velocidad de la regeneración corneal y mejora las cualidades ópticas de la córnea durante la reparación de una úlcera corneal. La cantidad de elementos cicatriciales durante la regeneración está disminuida significativamente tras la aplicación del tratamiento PRGF. Este hecho se traduce en una mejora en la transparencia de la córnea. La investigación básica sobre este sistema de derivados hemáticos ha dado como resultado la transferencia a la clínica de una nueva estrategia de terapéutica que se está empezando a emplear con resultados satisfactorios en nuestro centro. Fruto de estos ensayos experimentales se ha enviado recientemente un artículo a publicar en una revista de referencia en el área de la Oftalmología.

Evolución temporal de la cicatrización epitelial de una úlcera corneal tratada con diferentes derivados hemáticos.

Control

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Time 0

1 day

2 days

3 days

7 days

Plasma Rich in Growth Factors (PRGF-Endoret) stimulates corneal wound healing and reduces haze formation after PRK surgery Anitua E, Muruzábal F, Alcalde I, Merayo-Lloves J, Orive G. (2012). EXP. EYE RES (In review).

Además están preparados dos manuscritos más para publicar.

b) Terapia celular de la córnea: evaluación de la actividad reparadora de las células madre mesenquimales procedentes de lipoaspirados humanos Los trabajos realizados en el ámbito de la colaboración con el Dr. Marco Zeppieri, investigador del Hospital Universitario S.M. Misericordia de Udine (Italia), están encaminados al estudio de la utilización de las células madre en la reparación de lesiones de la córnea. Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo son capaces de diferenciarse a distintos tipos celulares en respuesta a su ambiente tisular y a señales celulares externas. Son capaces de originar, por ejemplo, células de tejido óseo, muscular o fibroblastos. Se ha conseguido diferenciarlas experimentalmente a fenotipos celulares muy semejantes en función y estructura a los queratocitos de la córnea. La aplicación exógena de estas células sobre la córnea dañada podría incrementar la velocidad de recuperación de la lesión. Esta técnica presenta la ventaja de que la fuente de estas células es autóloga, del mismo paciente, con lo que se evitan complicaciones de rechazo inmunológico. Además, pueden ser extraídas fácilmente y en gran cantidad mediante un lipoaspirado convencional. Nuestro grupo utilizó el modelo de lesión corneal por cirugía refractiva en ratón para evaluar la eficacia de las células madre mesenquimales procedentes de lipoaspirados para

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acelerar la reparación corneal. El análisis de la viabilidad de las células trasplantadas y su implicación en la reparación tisular se ha estudiado con técnicas inmunohistoquímicas. Para comprobar que el efecto regenerativo era debido a la presencia de células madre, tuvimos que diseñar un método para identificar las células implantadas en la córnea del animal receptor. Desarrollamos un método para introducir un marcador fluorescente en las células madre que nos permitiese controlar su integración en el tejido. Este compuesto no debía ser tóxico ni para las células madre ni para el tejido receptor. Pudimos comprobar que las células trasplantadas se integran funcionalmente en la córnea lesionada y contribuyen a la regeneración del tejido estromal y a la correcta disposición de las células epiteliales. Los resultados preliminares de estos estudios se han publicado recientemente en la revista «Current Eye Research»: Human adipose derived stem cells for the treatment of chemically burned rat cornea: Preliminary results Marco Zeppieri, Maria L. Salvetat, Antonio Beltrami, Daniela Cesselli, Natascha Bergamin, Rossella Russo, Ignacio Alcalde, Jesús Merayo, Paolo Brusini, Carlo Alberto Beltrami, Pier Camillo Parodi. Curr Eye Res (2013); 3814: 451: 63.

En los próximos meses se enviará una segunda publicación resultante de la segunda fase de estudios experimentales en animales. En los procesos experimentales participaron los Dres Marco Zeppieri e Ignacio Alcalde y los técnicos de laboratorio D. Manuel Chacón y D. Enol Artime.

Marcadas con un trazador vital verde, células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano integradas en el tejido corneal en regeneración de una rata.

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PROYECTO 4.

Queratocono Una de las patologías incapacitantes que frecuentemente se presenta en la consulta de córnea es el queratocono. Sus causas son heterogéneas y de su origen y evolución se conoce bastante poco. El debilitamiento de la matriz estromal de la córnea parece estar relacionado con la alteración de la acción de determinadas metaloproteasas. En este sentido se inició un estudio sobre botones corneales humanos con queratocono procedentes de donaciones del IOFV y de muestras seleccionadas del servicio de Anatomía Patológica del HUCA. Los hallazgos histopatológicos se podrán relacionar con las medidas biofísicas y de estesiometría recogidas de pacientes del IOFV diagnosticados de queratocono. En 2012 se incorporan al proyecto Dña. Almudena Íñigo, el Prof. Luis Quirós, del Departamento de Biología Funcional de la Universidad de Oviedo, y dos alumnos que realizan con nosotros su Trabajo de Fin de Grado. Gracias a la disponibilidad de muestras de tejidos corneales procedentes de pacientes trasplantados de córnea podemos diseñar cultivos primarios de queratocitos de córneas afectadas de queratocono. Estos cultivos son un sistema de estudio único y novedoso que permitirá el desarrollo de nuevos abordajes terapéuticos. Los Trabajos de Fin de Grado de D. Francisco Colina y de D. Federico Bech se basarán, en parte, en la puesta a punto de este sistema. Además, esta línea de investigación cuenta con financiación desde el año 2012. Esta financiación tiene subvención pública a través de un proyecto del Instituto de Salud Carlos III (Ministerio de Economía y Competitividad) y participación privada gracias a un convenio de colaboración con la Fundación La Caixa.

Micrografía de una región de una córnea humana con queratocono mostrando dos puntos de interrupción de la membrana de Bowmann.

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Desarrollo, caracterización y modulación de un modelo experimental de ectasia (queratocono) que permita el tratamiento regenerativo del tejido corneal Instituto de Salud Carlos III. Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación. Ministerio de Economía y Competitividad. Convocatoria de Ayudas de Proyectos de Investigación en Salud. PI11/02886. Investigador principal: Dr. Jesús Merayo Lloves.

Caracterización del queratocono mediante el estudio de inervación corneal e inmunohistoquímica de marcadores corneales. Estudio clínico y experimental Convenio de colaboración con la Fundación La Caixa.

Los estudios actuales se centran en la caracterización de marcadores específicos de queratocono. Hemos descrito que la córnea queratocónica carece de un tipo determinado de receptor de neurotrofi nas y que sobreexpresa una enzima concreta relacionada con la degradación de la matriz extracelular. Además, recientemente hemos encontrado una alteración en una proteína presente en el epitelio corneal y que se relaciona con la comunicación celular. La alteración de este marcador implica cambios organizativos en las células epiteliales e induce cambios en su fenotipo y en sus relaciones con las células vecinas. Hemos podido comprobar que la disminución de dicho marcador implica la desorganización del epitelio en las regiones de máximo adelgazamiento de la córnea patológica. Este marcador, junto con el expresado en matriz extracelular, parecen ser exclusivos del queratocono.

PROYECTO 5.

Efecto de los péptidos de origen sensorial en la integridad corneal La inervación mayoritaria presente en la córnea es de origen sensorial, con una escasa inervación de origen simpático y parasimpático. Dada la interrelación neurotrófica entre los tejidos de la córnea y su inervación, es lógico pensar que esta dependencia sea debida, en parte, al efecto de algún factor que se exprese en las terminaciones nerviosas y se libere por éstas.

P5.1.

Efecto de los neuropéptidos canónicos de origen sensorial Los péptidos de origen sensorial o neuropéptidos más abundantes en la córnea y en otros muchos tejidos (además de ser los principales mediadores de la inflamación neurogénica) son la sustancia p (SP), el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y la neurokinina A (NKA). El más estudiado de ellos en su papel durante los procesos reparativos de la córnea (además de ser uno de los mayoritarios) es la sustancia p, aunque sus mecanismos de acción no están muy claros por el momento. En la Unidad de Superficie Ocular II hemos detectado un efecto antagónico entre la sustancia p y el factor de crecimiento epidérmico (EGF, un factor secretado comúnmente por todos los epitelios, incluido el corneal, para regular su trofismo y reparación) tanto en una línea celular derivada del epitelio de la córnea central, como en células primarias de la córnea periférica.

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Estos resultados fueron presentados en el Congreso Internacional ARVO 2010 mediante la siguiente comunicación: Effect of Substance P and Epidermal Growth Factor in a Human CorneaL Epithelium Wound Healing Model in vitro C. Alonso-Ron, A. Aracil, J. Gallar, J. Merayo-Lloves, M. Chacón, C. Belmonte. 2010 Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting. Fort Lauderdale, FL (USA), mayo 2010.

También hemos estudiado el efecto de los otros dos péptidos sensoriales mayoritarios en la córnea, i.e. CGRP y NKA, sobre células primarias de la córnea periférica. En un futuro cercano, estos resultados junto a los anteriores se darán a conocer a la comunidad científica internacional mediante su publicación en una revista científica.

P5.2.

Identificación y efecto de otros péptidos de origen sensorial Tras un análisis exhaustivo de la expresión de genes de córneas humanas, nos centramos además (por su relación funcional y evolutiva) en la expresión de dos péptidos clásicamente estudiados en el aparato digestivo: la colecistoquinina (CCK) y la gastrina (GAST). Dicho interés estuvo determinado también en parte por las recientes descripciones de funciones de estas dos hormonas en el sistema nervioso central y periférico. Primeramente, confirmamos la expresión de ambos genes tanto en la línea celular derivada como en células primarias del epitelio de córnea central humana. Posteriormente, describimos la expresión de CCK, GAST y sus receptores celulares tanto en el epitelio corneal como en los cuerpos neuronales de las terminaciones nerviosas que lo inervan, presentes en el ganglio trigémino, en el modelo experimental de ratón. Fruto de este trabajo se presentó el proyecto de grado de Máster en Investigación en Neurociencias por la Universidad de Oviedo, cuyo título y autor son los siguientes: Expresión de colecistoquinina y gastrina en el epitelio corneal. Dña. Ana Fernández González

Recientemente, hemos finalizado la identificación y el contaje de las poblaciones neuronales del ganglio trigémino de ratón cuyas ramificaciones inervan la córnea y que expresan CCK, GAST y sus receptores. Este trabajo, se publicará próximamente bajo el siguiente título y autores (se acompaña copia del manuscrito en preparación). Expression of cholecystokinin, gastrin and its receptors in the mouse cornea. A. Fernández-González, C. Alonso-Ron, I. Alcalde, J. Gallar, A. Meana, J. Merayo-Lloves, C. Belmonte. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013 (under review).

Además, en otro estudio paralelo, descubrimos que ambos péptidos, CCK y GAST, tienen un efecto proliferativo en células primarias de epitelio de córnea periférica humana. Al mismo tiempo, comprobamos cómo los receptores de estos péptidos eran regulados en situación

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de reparación del tejido en las células del estroma corneal humano. Actualmente, estamos analizando los posibles mecanismos de regulación de estos receptores tras las lesiones corneales. Estos datos serán publicados a lo largo del año 2013.

PROYECTO 6.

Estudio electrofisiológico de la inervación sensorial corneal La Unidad de Superficie Ocular II está dotada de un sistema de registro electrofisiológico de terminaciones sensoriales únicas (“single nerve terminal recording”), originalmente descrito por el Prof. Carlos Belmonte y cedido por el Instituto de Neurociencias de Alicante a la Fundación de Investigación Oftalmológica. Mediante este sistema de registro neuroelectrofisiológico se han llevado a cabo los siguientes proyectos:

P6.1.

Efecto de los cambios de osmolaridad sobre las terminales sensoriales de la córnea y su importancia en la génesis de sensaciones de sequedad ocular Los termo-receptores corneales de frío parecen jugar un papel esencial en el mantenimiento de la secreción basal de la lágrima, como nuestro grupo de investigación demostró recientemente en colaboración con el Instituto de Neurociencias de Alicante (Parra et al., Nature Medicine, 2010). Recientemente, hemos obtenido datos conjuntos que sugieren también que los receptores corneales de frío median la sensación de sequedad en el ojo (ver proyecto 1). Dado que en el ojo seco se ha detectado un aumento de la osmolaridad de la lágrima que se considera crítico para el inicio de la inflamación ocular en el ojo seco, hemos estudiado si este cambio de osmolaridad constituye un estímulo adicional de los receptores sensoriales corneales, que inervan la córnea, contribuyendo como estímulo adicional a la génesis de las sensaciones de incomodidad y sequedad ocular típicas de esta enfermedad. En este estudio (en colaboración con el Dr. Andrés Parra) hemos obtenido datos experimentales que demuestran la existencia de una modulación de la actividad de las terminales corneales de frío por las variaciones de osmolaridad, de modo que soluciones de NaCl con osmolaridad entre 300-360mOs/L aumentan marcadamente las descargas de los termorreceptores de frío. Por el contrario, el registro en nociceptores polimodales de la córnea de ratón ha mostrado que éstos solo son estimulados por osmolaridades superiores a los 600mOsm/L. De ello se deduce que los termorreceptores de frío participan de modo más importante en la génesis de las sensaciones de dolor en el ojo seco. Se han finalizado los experimentos y está en fase de finalización de escritura para su publicación el siguiente manuscrito:

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Influence of osmolarity on corneal sensory receptors. A. Parra, O. González, J. Gallar, J. Merayo, C. Belmonte. Invest Ophthal Vis Sci, 2013.

P6.2.

Caracterización funcional de las terminaciones sensoriales de la córnea: y de sus mecanismos de transducción El registro de terminaciones receptoras polimodales en la córnea de ratón había sido imposible hasta el momento. Este año, se ha conseguido por primera vez por D. Omar González en nuestro laboratorio, lo que nos ha permitido llevar a cabo su caracterización funcional e iniciar el estudio de los canales iónicos que sustentan la traducción de los diferentes tipos de estímulo en esta población de receptores de dolor, con la ventaja que representa la posibilidad de uso de ratones modificados genéticamente. Hoy en día se están registrando, tanto los termo-receptores como los nociceptores polimodales en la córnea de ratón salvaje y en distintos animales modificados genéticamente (TRPV1, TRPA1, TRPM8). Este estudio se encuentra en el último punto de análisis de los datos obtenidos estos últimos meses para su publicación.

P6.3.

Estudio del papel de la Ih en el patrón de disparo de las terminales termo-receptoras de frío de mamíferos En colaboración con el Dr. Patricio Orio y el Instituto de Neurociencias de Alicante se ha realizado una publicación sobre la corriente activada hiperpolarización (Ih), llevada a cabo por los canales HCN1, y su influencia en el patrón de disparo de las terminales sensoriales de frío. Role of Ih in the firing pattern of mammalian cold thermorector endings Orio P., Parra A., Madrid R., González O., Belmonte C., Viana F. Role of Ih in the firing pattern of mammalian cold thermoreceptor endings. J Neurophysiol. 2012. 108: 3009-3023

P6.4.

Estudio de los efectos del anestésico cloroformo sobre el canal TRPM8, expresado en las terminales corneales de frío El TRPM8 es un canal iónico, presente en las terminaciones sensoriales de frío de la córnea, que determina de modo crítico su sensibilidad a las bajas temperaturas y a algunos agentes que producen sensaciones de frío (por ejemplo, el mentol). Dentro de la colaboración que mantenemos en el estudio electrofisiológico de los receptores de frío con el Instituto de Neurociencias de Alicante, hemos analizado los determinantes de la activación de este canal. Los primeros resultados de este trabajo ya han sido presentados en el Foro Internacional de Neurociencias (FENs) 2012, celebrado en Barcelona, así como en la Reunión Internacional de Canales TRP 2012, celebrado en Valencia, bajo el título: Cold-activated TRPM8 channels are activated by the volatile anaesthetic chloroform Manenschijn J.A., Parra A., González O., Morenilla C., Belmonte C., Viana F. (J. Physiol, 2013, en preparación)

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P6.5.

Estudio de la actividad de las terminaciones sensoriales en córneas humanas Con la colaboración del grupo con el Prof. Luis Fernández-Vega y los Dres. Álvaro Meana y José Alfonso, hemos iniciado los intentos de registro de las terminales nerviosas corneales en ojo humano. De conseguirse, se caracterizarían por vez primera los receptores sensoriales de la superficie ocular en humanos, lo que abre numerosas posibilidades para el conocimiento de sus patologías y para nuevas aplicaciones terapéuticas en el tratamiento del dolor y las molestias que se originan en la superficie ocular.

PROYECTO 7.

Análisis y definición de las propiedades de derivados polisacarídicos naturales sobre los tejidos corneales Actualmente, se está trabajando en la definición de las propiedades de derivados sacarídicos presentes normalmente en el cuerpo humano sobre la regeneración del epitelio corneal como derivados del ácido hialurónico y otros. Este proyecto ha obtenido la financiación para los próximos tres años de la convocatoria INNPACTO con el proyecto INDREYE, donde la FIO colabora con la Universidad de Oviedo (Prof. Luis Quirós).

PROYECTO 8.

Obtención y caracterización de las diferentes estirpes celulares corneales Se han establecido y estandarizado diferentes protocolos para la extracción y expansión de las tres estirpes celulares corneales procedentes de anillos esclerocorneales, previamente usados en queratoplastias, y de tejidos animales. Asimismo, se ha desarrollado un stock celular para la siembra de modelos experimentales. Procedimientos experimentales:

Cultivo y expansión de células epiteliales corneales.

Cultivo y expansión de células estromales corneales.

Cultivo y expansión de células endoteliales corneales.

Caracterización y estandarización de los cultivos.

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PROYECTO 9.

Desarrollo de membranas soporte aptas para el crecimiento celular basadas en queratina La ceguera corneal produce más de 10 millones de casos de pérdida de visión en todo el mundo, y el paciente puede recuperar la visión en muchos casos con un trasplante de córnea. En las últimas décadas, el manejo del rechazo con fármacos inmunomodulares y los avances en la cirugía corneal, han permitido indicar más trasplantes y con mejores resultados no solo tectónicos, sino también refractivos, es decir, brindar al paciente una visión útil después del trasplante. El factor limitante son los tejidos donados. Aunque el modelo español de donación de órganos y tejidos es copiado en todo el mundo, debido a la reducción de donantes por accidentes y al envejecimiento de la población las donaciones no cubren la demanda y queda justificado el tratar de desarrollar tejidos artificiales por medio de terapias avanzadas e ingeniería de tejidos. En la FIO se están llevando a cabo: Estudios experimentales: 1.

Extracción y purificación de queratina.

Desarrollo de membranas soporte.

Estudios de biocompatibilidad y biodegradación in vitro.

Cultivo de endotelio corneal.

Cultivo de estroma corneal.

En este momento ya se tienen algunos resultados preliminares que serán presentados en el Congreso Internacional de ARVO 2013. Se ha conseguido financiación del programa INNPACTO para los próximos 3 años dentro del proyecto SILCOR para desarrollar córneas artificiales a partir de derivados de seda.

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4.2.

UNIDAD DE NEUROBIOLOGÍA DE LA RETINA INVESTIGADORES PRINCIPALES:

Prof. Neville Osborne CATEDRÁTICO EN BIOMEDICINA FUNDACIÓN BBVA INVESTIGADORAS:

Dra. Belén Joglar Dña. Claudia Núñez Dña. Susana del Olmo

Nuestro interés a largo plazo sigue enfocándose en entender cómo las células ganglionares de la retina pueden morir en enfermedades oculares como glaucoma y retinopatía diabética, y en su neuroprotección, donde nuevos agentes farmacológicos puedan ser usados en pacientes para aminorar la muerte de las células ganglionares y así preservar la visión. Las células ganglionares tienen numerosas mitocondrias, y las mitocondrias están envueltas en numerosas funciones metabólicas que incluyen el mantenimiento del pH intracelular y la producción de especies reactivas del oxígeno (ERO) que promueven y regulan la apoptosis. La producción de EROS como radicales hidroxilo libres, singlete de oxígeno, peróxido de hidrógeno, óxido nítrico y peroxinitrito está finamente equilibrada con sofisticados sistemas antioxidantes y reparadores localizados en la mitocondria. Algunos estudios sugieren que son éstos los orgánulos que son indispensables en el mantenimiento de la función neuronal y un daño contra ellos resulta en la muerte de las células ganglionares de retina en glaucoma. Esto conlleva, por lo tanto, que el mantenimiento de la función mitocondrial en algún modo beneficiará al paciente de glaucoma simplemente por ralentizar la muerte de las células ganglionares. Por lo tanto, durante los pasados meses nos hemos centrado en obtener más información de cómo se ven afectadas las mitocondrias por un daño por luz y deducir cómo una droga con los efectos combinados de la aspirina y el sulfuro de hidrógeno pueden proteger a las células en cultivo. Es sabido que la aspirina tiene acción neuroprotectora pero en altas concentraciones y la investigación trató de ver si la aspirina, combinada con el sulfuro de hidrógeno, podía ser más efectiva a concentraciones más bajas. Además, se han llevado a cabo algunos estudios iniciales con Dextras 1, que según algunos autores (Sang et al, 2011) se localiza e incrementa en células ganglionares de retina cuando se expone a las ratas a la luz. Como se sabe que Dextras 1 aumenta los niveles de óxido nítrico de modo que éste se vuelve tóxico, pensamos que puede ser de gran importancia. Sin embargo, no se han podido reproducir los resultados descritos por Sang y por ello se han tomado nuevos abordajes en este campo.

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INFORME DE ESTUDIOS: Influencia de la luz en proteínas de oxidación fosforilación (OXPHOS). OXPHOS produce casi todo el ATP necesario que se requiere para que la función neuronal se mantenga óptima y consiste en cinco complejos enzimáticos con múltiples subunidades: el complejo I es la NADH: ubiquinona oxidorreductasa, el complejo II o succinato reductasa, el complejo III o ubiquinona: citocromo coxidorreductasa, el complejo IV o citocromo c oxidasa y el complejo V que es la H+ATP sintasa. Los electrones entran a la cadena respiratoria bien en el complejo I o II y viajan vía centros redox en los complejos I, III y IV, y los protones son sacados al espacio intermembrana donde se aprovechan por el complejo V para fosforilar ADP a ATP. Se sabe que disfunciones en OXPHOS debidas a mutaciones de DNA nuclear o de DNA mitocondrial dan lugar a una reducción en la generación de ATP, incrementan la producción de especies reactivas del oxígeno y consecuentemente estrés oxidativo. De cualquier modo, tiene especial significación el hacer notar que solo se ve una clara depresión de la síntesis de ATP en mitocondrias aisladas (no sinápticas) cerebrales tras la inhibición de los complejos I, III o IV en un 60-70%. Esto incrementa la posibilidad intrigante de que la consecuencia inicial de que la inhibición limitada del transporte de electrones mitocondrial pueda ser el estrés oxidativo más que la reducción de ATP, como podría ocurrir debido a que la luz afecta directamente a los complejo OXPHOS. Usando un anticuerpo que localiza los complejos OXPHOS se mostraron cambios muy poco claros entre células RGC-5 expuestas a luz azul (465-570nm, 400lux durante 48 horas) y células mantenidas en la oscuridad (fig. 1). Sin embargo, cuando se emplearon anticuerpos

(Figura 1: Del OlmoAguado S, y col., 2012)

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para localizar individualmente los complejos OXPHOS, la influencia diferencial de la luz azul fue observada y confirmada mediante inmunocitoquímica de los cultivos. La figura 2 muestra cómo la luz azul causa un descenso de los complejos I y II, mientras que los complejos III y IV están aumentados. Estos hallazgos confirman que la luz azul tiene influencia en la función mitocondrial, pero no responde a la pregunta de si es debido a la acción directa o indirecta en todos los complejos o en específicos.

Figura 2: Del Olmo-Aguado S, y col., 2012

ESTUDIOS DE LUZ/DEXRAS 1 Nuestros estudios iniciales en células RGC-5 en cultivo mostraron que la luz azul (465470nm, 400 lux durante 48 horas) causaba un aumento de Dexras 1 tanto en el RNA como en la proteína (fig. 4). Estos datos están en concordancia con la conclusión de que Dexras 1 es una nueva molécula efectora de óxido nítrico fisiológico usada para aumentar la señalización de óxido nítrico. El óxido nítrico se encuentra generalmente aumentado en los tejidos nerviosos tras daños de varios tipos y significativamente esto va de la mano de un aumento en Dexras 1. Es también de interés notar que se propone que Dexras 1 está involucrado en la integración de la señal fótica y no fótica en el reloj circadiano y que ese proceso está parcialmente conducido por la liberación de glutamato/PACAP de las células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles. No obstante, decidimos no continuar con estos excitantes estudios iniciales in vitro ya que no se pudo reproducir la evidencia in situ (como la publicada por Sang et al., 2011) de que la luz causa una dramática elevación de Dexras 1 en las células ganglionares de la retina y qué antígeno se localiza específicamente en las células ganglionares retinales.

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Figura 3: Del Olmo-Aguado S, y col., 2012

1. Estudios con aspirina modificada químicamente, ACS14. Se conoce que los salicilatos como la aspirina interfieren en el tamponamiento de calcio de la mitocondria por su interacción con los complejos de poro de transición de permeabilidad, que están implicados en la toxicidad neuronal inducida por glutamato. Más aun, altas concentraciones de aspirina protegen a las neuronas en cultivo de la muerte celular inducida, tanto por glutamato como por kinato, y se ha mostrado cómo atenúan la isquemia retinal un situ. También ha sido publicado que una aspirina modificada químicamente (ACS14) con la habilidad de liberar sulfuro de hidrógeno (H2S) mantiene sus características positivas como aspirina in vivo pero no tiene el mismo efecto negativo en la mucosa gástrica. ACS14 es un análogo de la aspirina que contiene la fracción ditioletiona (ACS1), que se sabe que libera H2S. Se piensa que la liberación de H2S de ACS14 una vez llegado al canal alimentario da lugar a la influencia negativa irritante de la aspirina. Se ha mostrado también que el H2S tiene una variación en los efectos adicionales que incluyen la estimulación del glutatión, aumentando la función mitocondrial y activando los canales K sensibles a ATP (canales KATP). Ahora existen importantes evidencias que sugieren que el H2S tiene efectos neuroprotectores, vasodilatadores y antiinflamatorios en ciertas situaciones. Llevamos a cabo un estudio in vitro en células RGC-5 que poseen ciertas características de las células ganglionares de la retina. Las células fueron expuestas a un daño de estrés oxidativo y la efectividad de ACS14 como neuroprotector fue comparada con la de la aspirina. En diversos ensayos la capacidad neuroprotectora fue mucho más efectiva que la de la aspirina, contrarrestando los efectos del estrés oxidativo (fig. 5). Además, ACS14 estimula directamente el glutatión, mientras que la aspirina es ineficaz, y el efecto neuroprotector

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de ACS14 fue específicamente despuntado por el bloqueante no específico de canales de potasio glibenclamida. Además, el aumento de p-p38, Bcl-2, HO-1 y XIAP inducidos por estrés oxidativo fueron todos atenuados en mayor medida por ASC14 (20µM) que por aspirina (20µM).

Figura 4: Osborne NN y col., 20102

2. Trabajo futuro inmediato. Ahora estamos comenzando a centrarnos en dos genes relacionados con la muerte celular. Estos dos genes son PINK-1 y RTP801. RTP801 se sabe que tiene efectos variables en la supervivencia celular de células no neuronales pero induce muerte celular en todos los tipos neuronales ampliamente estudiados. Por lo contrario, se cree que PINK1 es un poderoso antioxidante y su disfunción puede estar relacionada con la muerte neuronal en la enfermedad de Parkinson. Por ello, una disminución de PINK1, por una u otra razón, podría participar en la causa de la muerte celular de las células ganglionares, como sucede en el glaucoma. También, una posible disminución de RTP801 en la retina podría incrementar la supervivencia de las células ganglionares.

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4.3.

UNIDAD DE GENÉTICA DE OCULAR INVESTIGADORES PRINCIPALES:

Prof. Miguel Coca Prados CATEDRÁTICO RAFAEL DEL PINO INVESTIGADORES POST-DOCTORALES:

Dra. Lydia Álvarez Dra. Montse García Dr. Héctor González ESTUDIANTE EN PRÁCTICAS:

D. Carson Petrash

PROYECTO 1.

Biomarcadores proteicos de glaucoma: análisis del proteoma de suero de pacientes con GPAA, GPXE y cataratas Un marcador biológico, o biomarcador, es una característica que es objetivamente medida y evaluada como indicador de un proceso biológico normal, de un proceso patogénico o de una respuesta farmacológica a una intervención terapéutica. Este proyecto persigue la identificación y aplicación de biomarcadores proteicos en el diagnóstico precoz y establecimiento de posibles dianas terapéuticas del glaucoma primario de ángulo abierto y del glaucoma exfoliativo. Hasta el momento no existen biomarcadores fiables para la enfermedad glaucomatosa, por lo que la identificación de éstos permitiría distinguir bioquímicamente entre los distintos tipos de glaucoma y estimar la progresión de la enfermedad. Y lo que es más importante, ayudarían a diagnosticar precozmente individuos afectados por esta patología y abordar el tratamiento de la enfermedad en etapas tempranas, reduciendo considerablemente la pérdida de visión que se va produciendo gradualmente en los pacientes glaucomatosos antes de ser diagnosticados. A su vez, los biomarcadores constituyen una ayuda indispensable para el reconocimiento de los sujetos más vulnerables en una población determinada, así como para el diseño de terapias específicas, o, lo que es lo mismo, para el desarrollo de tratamientos personalizados basados en el acervo genético único que presenta cada individuo. El glaucoma engloba un grupo de neuropatías ópticas, genéticamente heterogéneas, caracterizadas por causar ceguera progresiva e irreversible debida a la muerte apoptótica de células ganglionares de la retina. Esta enfermedad constituye la principal causa de ceguera

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en países industrializados y se estima que actualmente están afectadas más de 70 millones de personas en todo el mundo, y se estima que esta cifra alcance los 80 millones en 2020. En la mayoría de los casos, el comienzo es asintomático y únicamente existe acceso a los pacientes en estados tardíos de la enfermedad, una vez que la pérdida de visión es considerable y el paciente decide acudir a la consulta. Actualmente, esta pérdida de visión es irreversible, lo cual pone de manifiesto la gran importancia que tiene el estudio de los signos y síntomas precoces de la enfermedad, a fin de poder abordarla en sus estados iniciales, evitando su progresión y consiguiente pérdida irrecuperable de visión. De los distintos tipos de glaucoma, GPAA y GPXE están consideradas las formas clínicamente definidas más frecuentes en España y su incidencia se incrementa con la edad, a partir de los 40, con una prevalencia del 2% en mayores de 60 años. A diferencia del GPAA, GPXE es un glaucoma secundario, muy prevalente entre pacientes con síndrome pseudoexfoliativo y que se caracteriza por la presencia y acumulación de un material extracelular fibrilar en varios tejidos oculares del segmento anterior del ojo. Desde el punto de vista clínico, el GPXE es la forma más fácil de identificar entre los glaucomas y en países industrializados puede llegar al 50% entre los casos con glaucoma de ángulo abierto. Es por tanto imperativo diseñar estrategias de diagnóstico precoz para identificar entre la población individuos con un riesgo potencial o en un estadio muy temprano que permita un manejo de la enfermedad más personalizado. Con objeto de descubrir posibles biomarcadores de las patologías glaucomatosas más frecuentes, se ha diseñado un estudio cuyo esquema se muestra en la Figura 1. Este estudio ha sido dividido en dos fases. En la primera fase, denominada fase de descubrimiento (fase 1), han sido tomadas muestras de suero de pacientes con GPAA, GPXE y de individuos control (con cataratas). Inmediatamente después de la clasificación clínica de los pacientes y de la toma de muestra, las muestras de suero han sido analizadas en el laboratorio para identificar biomarcadores moleculares, por medio de la técnica 2D-DIGE (electroforesis diferencial en gel). Una vez los marcadores candidatos han sido identificados, se ha llevado a cabo la validación del estudio (fase 2) mediante análisis ELISA. El propósito de la validación es verificar la validez de los biomarcadores y evaluar su poder discriminatorio para ser usado como técnica de diagnóstico de GPAA y GPXE. A continuación se describen en profundidad las diferentes fases del estudio y algunos de los resultados relevantes obtenidos.

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figura 1. Esquema del estudio dirigido a la búsqueda de biomarcadores de glaucoma (GPAA y GPXE).

Fase 1, Descubrimiento: Como se indica en el esquema de la Figura 1, el primer paso llevado a cabo en este estudio ha sido la selección y clasificación de pacientes. Todos los pacientes incluidos en este proyecto han sido reclutados y examinados por los oftalmólogos del IOFV. El criterio de diagnóstico para ambas formas de glaucoma ha sido la presencia de daño característico en el disco óptico con los correspondientes cambios en el campo visual y la presencia del ángulo abierto en la cámara anterior. Ninguno de los sujetos que ha participado en este estudio tiene alguna otra patología ocular clínicamente detectable como infección, retinopatía o maculopatía. En esta fase de descubrimiento se emplearon muestras de suero de un total de 149 pacientes, de los cuales 53 pacientes padecen GPAA, 45 padecen GPXE y 51 son individuos control con cataratas. De cada uno de los pacientes se recogieron muestras de sangre en tubos que favorecen el proceso de coagulación, para a continuación centrifugar las muestras a 1.800 rpm durante 18 min y a 4 ºC. Posteriormente se procedió a la recuperación del suero y a su inmediato almacenamiento a -80 ºC hasta el siguiente paso, en el que se ha llevado a cabo una preparación previa de la muestra. Es sabido que el suero es un fluido biológico complejo que consta de un alto contenido proteico (60-80 mg/ml) y en el que aproximadamente el 95 % está constituido por aproximadamente

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14 proteínas. La presencia de proteínas de alta abundancia provoca que la detección de las proteínas de media y baja abundancia en los análisis proteómicos sea todo un desafío. Este porcentaje supone un rango dinámico muy elevado y una dificultad añadida en la búsqueda de paneles de marcadores de baja proporción que sean capaces de determinar un diagnóstico correcto de ciertas patologías. Son numerosas las estrategias que se han empleado en los últimos tiempos para conseguir reducir el rango dinámico de concentraciones de proteína en este tipo de muestras biológicas complejas. Principalmente se ha utilizado la eliminación de proteínas mayoritarias mediante técnicas cromatográficas basadas en inmunoafinidad o intercambio iónico. Este tipo de procesamiento desemboca finalmente en un nuevo apantallamiento provocado por las proteínas que estaban consideradas inicialmente como de media abundancia debido al aumento en su cantidad en la muestra. Más recientemente se han desarrollado otro tipo de tecnologías, como el Proteominer, que permite explorar el contenido del proteoma más en profundidad sin llevar a cabo una depleción de proteínas mayoritarias sino una ecualización. La tecnología está basada en librerías de combinaciones de ligandos, compuestas por millones de hexapéptidos degenerados anclados a soporte cromatográfico de tal manera que al poner en contacto una muestra compleja cada proteína tenga la misma probabilidad de interaccionar con algún hexapéptido y quedar retenido en la resina. Como la proporción de cada tipo de hexapéptido es la misma, debido a la capacidad limitante de la columna, las proteínas mayoritarias ocupan rápidamente todos sus sitios de unión eliminándose el exceso. De la misma manera, cada proteína de baja abundancia es retenida en su ligando específico aumentando de esta manera su concentración. Este tipo de procesamientos mantiene invariable los niveles de expresión de las proteínas de media y baja abundancia. De esta manera se consigue identificar un mayor número de proteínas dentro de la misma muestra. Una vez las muestras han sido ecualizadas, se realizó una cuantificación de los niveles totales de proteína. El siguiente paso en esta fase de descubrimiento ha sido el análisis por electroforesis en gel diferencial (DIGE) de las muestras de suero. Esta es una forma de electroforesis donde dentro de un mismo gel pueden resolverse hasta 3 muestras diferentes debido al marcaje de cada una de ellas con reactivos fluorescentes perfectamente resueltos previamente a la electroforesis bidimensional. Se trata de una técnica utilizada para determinar cambios en la abundancia de ciertas proteínas y que supera las limitaciones de las electroforesis 2D tradicionales debidas a las variaciones inter-gel. Debido a que las proteínas de diferentes muestras son enfocadas en el mismo gel pueden ser directamente comparadas, reduciendo a la mitad el número total de geles a realizar para el mismo número de muestras. La inclusión de un estándar interno en uno de los canales de todos los geles, usado como canal normalizador, permite medir la abundancia de proteínas en cada muestra de manera relativa con respecto al canal estándar, reduciendo la variación entre geles y facilitando el alineamiento de las imágenes escaneadas. Una ventaja adicional es que es posible comparar de manera simultánea variaciones entre tres grupos diferentes, como son en este caso GPAA, GPXE y controles. Mediante este análisis se ha obtenido el mapa proteico del suero en el rango de pH 4-7 y que consta de 823 spots. En la Figura 2 puede verse una imagen representativa del gel del proteoma del suero humano.

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figura 2. Imagen representativa del gel 2D-PAGE del proteoma de suero humano de pacientes control (n=51), GPAA (n=53) y GPXE (n=42). Los spots estadísticamente más significativos son marcados en el gel con su correspondiente número de spot.

Una vez obtenidas las imágenes de cada uno de los geles y cada uno de sus canales, se llevó a cabo un análisis de expresión diferencial mediante el software Progenesis SameSpots. Los datos de los volúmenes normalizados de cada spot (área × intensidad) fueron expresados en notación matricial y fi ltrados mediante un valor de corte de FDR (tasa de falsos positivos) de 0.01. De este modo, el número de spots significativos fue de 214, ordenándose de mayor a menor poder de discriminación, en función de diferentes parámetros estadísticos. Estos spots fueron nuevamente fi ltrados con un corte específico (Gain ratio≥0.05), obteniéndose un total de 149 spots con expresión diferencial estadísticamente significativa, los cuales se indican en la Figura 2 con su correspondiente número identificativo de spot. Estos spots fueron seleccionados para su posterior identificación proteómica. Estos 149 spots que han satisfecho los criterios estadísticos convenidos fueron sometidos a digestión tríptica en gel y posterior análisis por espectrometría de masas molecular (MALDIMS/MS o nLC-MS/MS), lo que proporcionó la identidad proteica de 118 de los spots, revelándose un total de 35 identidades proteicas diferentes (en varios de los spots se identificó una misma proteína). Un total de 21 spots fueron identificados como queratinas, por lo que éstas no fueron incluidas en los subsecuentes análisis por tratarse de contaminación introducida del manejo del gel o durante el proceso de digestión tríptica. Finalmente, tan solo 10 spots han permanecido sin identificar, probablemente debido a su baja intensidad (bajos niveles de concentración proteica). Por tanto, los análisis llevados a cabo por espectrometría de masas revelaron la identidad de 35 proteínas expresadas diferencialmente en los grupos patológicos. Una vez se ha establecido un posible panel de biomarcadores, se procedió con la fase 2 del estudio.

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Fase 2, Validación: Se llevó a cabo la validación de 17 de las 35 proteínas candidatas mediante análisis ELISA (ensayo inmuno-enzimático). Para ello, se determinaron los niveles de estas proteínas en las muestras de suero de 30 pacientes con GPAA, 29 pacientes con GPXE y 29 controles. Solamente 10 muestras de pacientes con GPAA, 15 de pacientes con GPXE y 10 de controles han sido empleadas en el análisis previo por 2D-DIGE, mientras que las restantes procedieron de nuevos pacientes reclutados en el IOFV. Una vez determinada la concentración de cada una de las 17 proteínas, cuyos resultados han sido normalizados respecto a los gramos de proteína sérica total, se realizó un análisis de los datos con objeto de ver cuáles de las variables son las que tienen un poder de discriminación mayor entre los grupos. Mediante el uso de diferentes algoritmos de aprendizaje, como Naive Bayes, K-Nearest Neighbor, Random Forest y Classification Tree, se ha obtenido un panel de 6 proteínas que permite discriminar entre los grupos patológicos con una buena eficiencia en la separación. En la Tabla 4 se muestra el resultado obtenido en la clasificación para los grupos analizados. Según nuestros datos, es posible clasificar correctamente el 82,5% de los pacientes control y determinar la condición patológica en el 92,1% de los casos. Es digno de mencionar que se ha obtenido un 100% de eficacia en la discriminación de pacientes con GPAA frente a controles. Además, se obtiene una discriminación correcta entre los grupos GPAA y GPXE en el 86% de las muestras patológicas.

Test

DIAGNÓSTICO CLÍNICO Control

GPXE

GPAA

Control

PEXG

POAG

110

Error Rate

CA (%)

Sens.

Spec.

Discr. POAG vs PEXG

0.19

0.81

0.92

0.83

0.86

tabla 4. Resultados del test de diagnóstico que permite predecir clasificaciones entre los grupos GPAA, GPXE y controles en función del panel de los 6 biomarcadores obtenido.

Por tanto, y como resumen, en este proyecto se ha establecido un panel de 6 biomarcadores proteicos que proporcionan un diagnóstico correcto de la patología glaucomatosa en el 81% de los casos. Es decir, que mediante el análisis de una muestra de sangre es posible predecir y diagnosticar clínicamente si una persona es poseedora o no de GPAA o GPXE, con un elevado

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porcentaje de fiabilidad. En este momento se está desarrollando una metodología basada en el ensayo “multiplex”, que permitirá un análisis rápido, sensible y fiable de muestras de pacientes de IOFV. Por último, se pretenderá evaluar si este panel de biomarcadores puede ser empleado como método de diagnóstico precoz de la patología glaucomatosa. Con los resultados de este proyecto se está elaborando un manuscrito que será publicado en una revista científica de impacto internacional.

PROYECTO 2.

Estudio de polimorfismos entre los genes que codifican las proteínas expresadas diferencialmente en el suero de los individuos con glaucoma Una vez conocida la identidad de aquellas proteínas que aparecen expresadas diferencialmente en el suero de los individuos con GPAA y GPXE con respecto a los controles, hemos elegido las que consideramos que podrían ser más relevantes desde el punto de vista genético para hacer un análisis de polimorfismos en los genes que las codifican. Con esto se pretende determinar si esas diferencias de expresión pudieran ser debidas a mutaciones en estos genes. Para ello, entre los individuos que han participado en el estudio de proteómica diferencial, hemos elegido 16 con GPAA, cuyo ADN genómico será utilizado para la secuenciación de esos genes. Para este estudio, actualmente en proceso de realización, se utiliza otra técnica de “NextGeneration Sequencing” llamada captura de secuencia. Esta tecnología permite la secuenciación de regiones concretas del genoma mediante su captura en el ADN genómico, evitando la puesta a punto de miles de reacciones de PCR. De esta manera se consigue enriquecer de manera paralela varias regiones en un solo paso. Posteriormente, las regiones enriquecidas son secuenciadas. Para este procedimiento se utiliza el kit SureSelectXT2 Target Enrichment System de Illumina. Las posibles mutaciones encontradas en estos genes, en este grupo de individuos con GPAA, serán confirmadas en un mayor número de muestras de individuos con esta patología y se analizarán también en los controles mediante secuenciación convencional con el analizador genético ABI3130.

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PROYECTO 3.

Estudio de haplotipos del gen LOXL1 y su relación con GPXE en la población española El glaucoma de ángulo abierto, que es la forma mayoritaria de glaucoma, puede clasificarse en GPAA y en glaucoma secundario de ángulo abierto. GPXE es la forma más frecuente de glaucoma secundario de ángulo abierto y en países industrializados puede llegar al 50% entre los casos con glaucoma de ángulo abierto. Desde el punto de vista clínico, el GPXE es la forma más fácil de identificar entre los glaucomas, caracterizándose por su rápida progresión, alta resistencia a la medicación y, en general, un peor pronóstico que GPAA. GPXE es muy prevalente entre individuos con síndrome exfoliativo (SE). Este síndrome está también implicado en la etiología de otras formas de glaucoma como GPAA y glaucoma de ángulo cerrado, así como en la formación de cataratas y en la oclusión de la vena retinal. Además, está asociado a nivel sistémico con desórdenes vasculares, pérdida de la audición y Alzheimer. Los depósitos fibrilares, típicos del SE, se han encontrado no solo en tejidos del segmento anterior del ojo, sino también en tejidos de otros órganos como corazón, cerebro, piel, aorta y riñón. La etiología y patogénesis del glaucoma es muy compleja e intervienen múltiples factores tanto genéticos como ambientales. La prevalencia de SE/GPXE varía ampliamente entre diferentes poblaciones étnicas, debido principalmente a variaciones en su fondo genético. Así, por ejemplo, no se conocen casos de SE entre los esquimales de Groenlandia, mientras que su incidencia en Islandia y Finlandia es del 20-25%. Por otro lado, en EE.UU., los descendientes de españoles tienen una probabilidad 6 veces mayor que los descendientes anglosajones de desarrollar GPXE. En general, el proceso patológico en GPXE se caracteriza por una acumulación crónica de un producto fibrilar anormal como consecuencia de su producción excesiva, una eliminación insuficiente o de ambas posibilidades. Este material fibrilar es de producción multifocal por varios tipos de células, incluyendo células del epitelio del cristalino, del epitelio ciliar no pigmentado, endotelio trabecular, endotelio corneal, células vasculares endoteliales y células del iris. La teoría más extensamente aceptada sobre el origen biológico, químico y molecular del material exfoliativo responsable del síndrome exfoliativo, y que es causa del GPXE, es que se trata de una elastosis que afecta a las microfibrillas elásticas de las fibras de la zónula. Estas fibras se originan en el epitelio ciliar y se fijan alrededor del cristalino permitiendo la curvatura de este o acomodación. En el SE, dichas fibras están rodeadas de una matriz amorfa compuesta de elastina, tropoelastina, proteína P amiloide, vitronectina y componentes de las microfibrillas elásticas como fibrilina-1, glicoproteína asociada a microfibrilina (MAGP1), y las proteínas LTBP-1 y LTBP-2, que son proteínas de unión a la forma latente del factor de crecimiento transformante (TGF-b). Mediante cromatografía líquida acoplada

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a espectrometría de masas se ha encontrado que el material exfoliativo está integrado por fibrilina-1, fibulina-2 y vitronectina, los proteoglicanos sindecan y versican, una proteína chaperona clusterin, y lisina-oxidasa, entre otras proteínas. Esta última es una enzima que establece uniones covalentes con proteínas de la matriz extracelular (i.e., colágeno). Estudios de expresión génica en los tejidos del segmento anterior de individuos con SE indican que existe una superproducción de componentes elástico microfibrilares y de TGFb1, debido a un incremento en las interacciones proteicas como resultado de una disminución en su degradación proteolítica. Existe también un desequilibrio entre las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y sus inhibidores (TIMPs), y un aumento del estrés celular y estrés oxidativo. Como consecuencia, hay una acumulación de material fibrilar, dentro y fuera de los tejidos, que va en aumento con el tiempo. Todas estas observaciones están en consonancia con el descubrimiento en los últimos años de una fuerte asociación entre tres polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en el gen LOXL1 y SE/GPXE. Dos de estos SNPs son polimorfismos no sinónimos localizados en el exon 1 de LOXL1 (rs1048661 [R141L] y rs3825942 [G135D]) y el otro se localiza en el primer intrón del gen (rs2165241 [T]). Aunque estos polimorfismos fueron descubiertos en un estudio realizado entre individuos procedentes de Islandia y Suecia, este resultado fue confirmado posteriormente en otras poblaciones caucasianas, procedentes de EE.UU., Australia, Austria, Alemania, Italia y Finlandia, y también en otros grupos étnicos incluyendo individuos de Japón, India y China. Por otro lado, también se han identificado haplotipos en el promotor de LOXL1 asociados con SE/GPXE en una población caucasiana procedente de EE.UU. Esto sugiere que los SNPs en la región del promotor pueden influir en la expresión del gen LOXL1, resultando en la reducción en la actividad del enzima y en la predisposición a la enfermedad. Por otro lado, se ha demostrado que estos polimorfismos de LOXL1 no están asociados con glaucomas primarios. LOXL1, cuya estructura puede observarse en la Figura 3, es un miembro de la familia de enzimas lisina oxidasas que son esenciales para la formación, estabilización y remodelación de fibras elásticas, impidiendo la pérdida de elasticidad con la edad. Estos enzimas unen y depositan elastina y otras proteínas en el entramado de la matriz extracelular. La familia de las lisina oxidasas tiene 5 miembros que codifican la proteína LOX y las proteínas LOXlike (LOXL1-LOXL4). Todas estas proteínas tienen una estructura similar que consiste en 7 exones, seis de los cuales (exones 2-7) presentan una fuerte homología y codifican el dominio catalítico C-terminal de estas proteínas. La diferencia en la secuencia genética entre los genes LOX reside principalmente en el exón 1, que codifica el pro-péptido de la proteína. Algunos estudios han mostrado que el pro-péptido se une a tropoelastina y fibulina-5 y que esas interacciones son esenciales para la deposición del enzima sobre las fibras elásticas. Tras la unión de LOXL1 a la matriz extracelular, el pro-péptido es cortado para la activación catalítica del enzima.

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Exones 1-7 Intrones

3 4 5

Longitud gen: 25690 pb Longitud región codificada (mRNA): 2361 pb

Promotor figura 3. Estructura del gen LOXL1.

El gen LOXL1 se expresa en todos los tejidos oculares y extraoculares donde se ha visto acumulación del material típico del SE. Además, la expresión de este gen parece disminuir con la edad, lo cual es interesante ya que tanto el SE como el GPXE son enfermedades relacionadas con la edad. El propósito de este estudio, que se está llevando a cabo en la actualidad, es evaluar la asociación entre polimorfismos en el gen LOXL1 y GPXE en la población española, ya que, hasta el momento, no existe constancia bibliográfica sobre este tipo de estudios en nuestro país. Para ello contamos con las 96 muestras de ADN genómico que previamente hemos aislado de la sangre de individuos con GPXE y con las 327 muestras de ADN genómico aisladas de la sangre de individuos control. De forma resumida, el procedimiento que se está llevando a cabo es el siguiente: a partir de las muestras de ADN de GPXE se amplifica el gen LOXL1 en su totalidad, además de la zona correspondiente a su promotor. La amplificación de toda esta región se realiza en 4 fragmentos. Posteriormente, las 4 amplificaciones de cada muestra de ADN se normalizan, de manera que los 4 amplicones estén en cantidades equimolares para su secuenciación. Dicha secuenciación se realiza mediante un sistema de “Next-Generation Sequencing”, que implica la generación de librerías mediante el kit “TruSeq DNA sample preparation” de Illumina y la posterior secuenciación con “TruSeq SBS kit v3-HS” (50 –cycles) y “TruSeq PE Cluster Kit v2 – cBot-GA”. Una vez determinados los polimorfismos en LOXL1 para esta población con GPXE se secuencian, mediante secuenciación convencional con el analizador genético ABI3130, las regiones del gen donde estos se localicen en las muestras control.

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5. Unidad de Investigación Clínica La Unidad de Investigación Clínica se divide en los grupos de investigación: Unidad de Superficie Ocular, Unidad de Retina y la Unidad de Glaucoma. En la actualidad tiene los proyectos de investigación que se detallan a continuación:

5.1.

GRUPO DE SEGMENTO ANTERIOR: SUPERFICIE OCULAR, CÓRNEA, CIRUGÍA REFRACTIVA Y CRISTALINO Prof. Luis Fernández-Vega, Dr. José F. Alfonso, Dr. Jesús Merayo y Dra. María Fernández

5.1.1.

OPTIMIZACIÓN DEL NOMOGRAMA DE LENTES FÁQUICAS Con los datos recabados durante los últimos siete años se realiza un ajuste al nomograma para el implante de estas lentes, con el objetivo de evitar una de las complicaciones más severas en la cirugía con este tipo de lentes intraoculares (Dr. Alfonso).

5.1.2.

Ensayo Clínico Fase III “SANSIKA-NOVAGALI PHARMA” Study number: 2011-000160-97. Estudio de la eficacia de la ciclosporina A en el ojo seco. Título: A multicenter, randomized, double-masked, 2 parallel arm, vehicle controlled, 6 month phase III trial with a 6 month open label treatment safety follow-up, period to evaluate the efficacy and safety of cyclokat 1 mg/ml (ciclopsorin/cyclosporine) eye drops, emulsion administered once daily in adult patients with severe Dry Eye Disease (DED) NVG10E117 (N09F1001) (Dr. Merayo).

5.1.3.

QUERATOPLASTIA ENDOTELIAL DE MEMBRANA DE DESCEMET (DMEK) Estudio clínico intramural prospectivo de trasplante avanzado selectivo de endotelio para el tratamiento de la distrofia de Fuchs y la queratopatía bullosa. En colaboración con el Centro

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Comunitario de Sangre y Tejidos de Asturias se aíslan láminas de endotelio de donantes de córnea para implantarlas en pacientes con descompensación corneal. Se estudia la aceleración de la rehabilitación visual y la reducción de posibles complicaciones del trasplante clásico (Dr. Alfonso).

5.1.4

QUANTIFERON EN UVEÍTIS CON EDEMA MACULAR CRÓNICO Estudio clínico intramural retrospectivo de serie de casos para estudiar la implicación de la TBC latente como causa de edema macular en uveítis crónicas. Se realizan pruebas inmunológicas de última generación para determinar la implicación de la TBC en el caso y de confirmarse se adapta el tratamiento y se evalúa la respuesta al mismo (Dr. Merayo)

5.1.5

PRGF Estudio clínico de serie de casos intramural retrospectivo para estudiar el efecto de la terapia avanzada con hemoderivados para el tratamiento del ojo seco severo refractario de etiología múltiple. Análisis de efectividad y tolerancia (Dr. Merayo).

5.1.6

ESTESIOMETRÍA EN QUERATOCONO Estudio clínico intramural prospectivo comparativo de tres cohortes para comparar la sensibilidad corneal tras el implante de anillos intraestromales mediante láser de femtosegundo frente al uso de lentes de contacto rígidas (Dres. Merayo y Alfonso).

5.1.7

OSMOLARIDAD DE LA LÁGRIMA EN QUERATOCONO Estudio clínico intramural prospectivo comparativo de tres cohortes para comparar la osmolaridad de la lágrima tras diferentes tratamientos para el queratocono (Dres. Merayo y Alfonso).

5.1.8

ENSAYO CLÍNICO LABORATORIOS THEA Promotor: Laboratorios THEA. Study number: 021188/34. Título: Evaluación de la eficacia y la seguridad de T2380 (combinación fija de lidocaína, fenilefrina y tropicamida) intracameral para la midriasis y la anestesia en cirugía de cataratas con facoemulsificación. Asimismo, a lo largo del año 2012 se siguen realizando los estudios de Segmentos Intracorneales, Lentes Difractivas Tóricas y Segmentos Intracorneales con ICL que se vienen desarrollando desde hace unos años con el fin de mejorar e implantar nuevos procesos y procedimientos en la práctica clínica.

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5.2.

GRUPO DE VÍTREO-RETINA Dr. Álvaro Fernández-Vega, Dra. Beatriz Fernández-Vega, Dra. Eva Villota y Dr. Santiago Morales

5.2.1.

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN: POSURDEX EN EMD (ALLERGAN) Estudio multicéntrico, fase 3, enmascarado, aleatorizado, controlado con simulador, con una duración de 3 años, para “Evaluar la seguridad y eficacia del sistema aplicador DEX PS DDS” (Sistema de liberación del fármaco dexametasona en el segmento posterior) de 700 µg y 350 µg en el tratamiento de pacientes con edema macular en retinopatía diabética (Dr. Alvaro Fernández-Vega).

5.2.2

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA VIVID Promotor: BAYER. Study number: BAY 86-5321/91745. V 2.0. Título: A randomized, double masked, active controlled, phase III study of the efficacy and safety of repeated doses of intravitreal VEGF Trap-Eye in subjects with diabetic macular edema.

5.2.3

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA. FOVEA Promotor: SANOFI-AVENTIS. Study number: FOV2304/CLIN/201/P. Título: 6 month, Phase II, Double-masked, Multicenter, Randomized, Placebo-controlled Parallel Group Study to Assess to Safety and Efficacy of Topical Administration of two concentrations of FOV2304 (1% and 2%) Twice daily for the treatment of center involving clinically significant macular edema associated with diabetic retinopathy.

5.2.4

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA. OZURDEX Promotor: ALLERGAN. Study number: 206-207-024. Título: Estudio, aleatorizado, abierto y multicéntrico, para comparar la eficacia y la seguridad del sistema de liberación de dexametasona en el segmento anterior (DEX PS DDS) de 700 nanogramos y de ranibizumab en pacientes con edema macular diabético.

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5.3.

GRUPO DE GLAUCOMA Dr. Pedro Pablo Rodríguez Calvo, Dra. Isabel Santos

5.3.1

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA LUMINGAN Promotor: ALLERGAN. Study number: 192024-054. Título: Estudio, aleatorizado y multicéntrico, con doble enmascaramiento y paralelo, de dos años de duración, sobre la seguridad del Lumingan 0,1 mg/ml comparado con Lumingan 0,13 mg/ml en pacientes con glaucoma o hipertensión ocular.

ÁREA DE DOCENCIA

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6. Actividad docente La actividad clínica y de investigación del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega y la Fundación de Investigación Oftalmológica generan una alta capacidad docente que se materializa en los estudios de grado y post-grado en colaboración con la Universidad de Oviedo y otras instituciones académicas. El objetivo final es la formación de investigadores profesionales de la Oftalmología y Ciencias de la Visión altamente cualificados. Aunque somos conscientes del coste que conlleva la formación, sabemos que nos hace conocer mejor la actividad clínica y nos permite difundir el conocimiento para una mejora en la oftalmología.

6.1.

ESTUDIOS DE PREGRADO El Instituto Oftalmológico es un hospital docente de la Universidad de Oviedo donde cursan las prácticas alumnos de la Facultad de Medicina. Cincuenta y cuatro (54) alumnos realizaron sus prácticas clínicas de Oftalmología. A través de nuestro convenio con la Universidad de Oviedo han asistido a nuestras prácticas de empresa cinco (5) alumnos de la Facultad de Biología y una (1) alumna de la Facultad de Matemáticas.

De la Universidad San Pablo CEU, a través de convenio UniversidadEmpresa, realizaron las prácticas del grado en Óptica, Optometría y Audiología: Dña. Adriana Meana Cadrecha Dña. Jimena Alonso Álvarez

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6.2.

ESTUDIOS DE POST-GRADO

6.2.1.

Títulos Oficiales Alumnos del Programa de Doctorado Dña. Ana C. Riestra Ayora, Dña. Ana Fernández González, D. Dagoberto Almanzar Brito (República Dominicana), D. Miguel Naveiras Torres-Quiroga, D. Guilherme Hermeto Ferrara (Brasil), D. Alejandro Tello Hernández (Colombia), D. Virgilio Galvis Ramírez (Colombia) y D. Jorge Eugenio Valdez García (México).

6.2.2.

Títulos Propios de la Universidad de Oviedo Máster en Superficie Ocular, Córnea, Cristalino y Cirugía Aditiva Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship en el sistema de E.E.U.U.) que pretende dar una alta especialización al oftalmólogo en la investigación traslacional, prevención, diagnóstico y tratamiento médico quirúrgico en el área de la superficie ocular, córnea, cristalino y cirugía refractiva. El objetivo final es que el oftalmólogo sea autosuficiente en el manejo de la patología de la subespecialidad. Este máster está destinado a oftalmólogos con interés en la sub-especialidad de la Superficie Ocular, Córnea, Cristalino y Cirugía Refractiva con vocación investigadora y docente. Alumna curso 2012-13: Dña. María Fernández Rodríguez Becada por el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega

Máster en Optometría Clínica Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship de EEUU) que pretende subespecializar al Óptico-Optometrista para que pueda integrarse en equipos multidisciplinares de las clínicas oftalmológicas o departamentos oftalmológicos. El objetivo final es que el óptico-optometrista sea autosuficiente en la aplicación de medidas optométricas como ayuda al manejo integral del paciente oftalmológico y que pueda desarrollar la aplicación del método científico de la subespecialidad. Está destinado a ópticos-optometristas con interés en la optometría clínica y con vocación investigadora y docente.

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Alumnas curso 2012-13: Dña. Elena del Val Sánchez-Pacheco, Dña. Sara Ceballos Burgos y Dña. María Carmen Fernández Merayo y Dña. Ana Palacios Bustamante Becadas por el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega

Máster en Enfermería Oftalmológica Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship de EEUU) que pretende subespecializar al DUE (Diplomado Universitario en Enfermería) para que pueda integrarse en equipos multidisciplinares de las clínicas oftalmológicas o departamentos oftalmológicos. El objetivo final es que el DUE sea autosuficiente en la aplicación de medidas optométricas como ayuda al manejo integral del paciente oftalmológico y que pueda desarrollar la aplicación del método científico de la subespecialidad. Está destinado a DUES con interés en la optometría clínica y con vocación investigadora y docente. Alumnas curso 2012-13: Dña. Elena González López, Dña. Irene Alonso Fernández y Dña. Paula Manilla Ruiz Becadas por el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega

Máster en Retina y Vítreo Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship del sistema de EE.UU.) que pretende subespecializar al oftalmólogo en la investigación traslacional, prevención, diagnóstico y tratamiento médico quirúrgico en el área de vítreo-retina. El objetivo final es que el oftalmólogo sea autosuficiente en el manejo de la patología de la subespecialidad. Alumno curso 2012-13: D. Santiago Morales Orozco Becado por Laboratorios NOVARTIS con una beca de 18.000 euros

Máster en Glaucoma Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship del sistema de EE.UU.) que pretende subespecializar al oftalmólogo en la investigación traslacional, prevención, diagnóstico y tratamiento médico quirúrgico en el área de glaucoma. El objetivo fi nal es que el oftalmólogo sea autosuficiente en el manejo de la patología de la subespecialidad. Alumna curso 2012-13: Dña. Isabel Santos Rodríguez-Vigil Becada por el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega

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Curso de Experto Universitario en Cirugía Aditiva de la Córnea Curso de experto universitario que pretende formar al oftalmólogo experto en córnea y cirugía del segmento anterior en las técnicas de cirugía aditiva de la córnea para la corrección ortopédica y refractiva de las ectasias corneales (queratocono, degeneración marginal pelúcida de la córnea, ectasias iatrogénica, traumática y otras). Además, el oftalmólogo podrá formarse en investigación traslacional en queratocono y técnicas de cirugía aditiva de la córnea. El objetivo final es que el oftalmólogo sea autosuficiente en el manejo de la patología susceptible de ser tratada con cirugía aditiva de la córnea. Alumnos curso 2012-13: Dña. Filipa Daniela Ferreira Rodrigues, Dña. Julia Méndez Díaz, D. Luciano Perone, D. Roberto Albertazzi, Dña. María Emilia Odóriz, D. Javier Claver Laria, D. Juan José Pérez Santonja, Dña. Lucía Ibares Frías, D. Walter Marco y D. Marco Zeppieri Becados por el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega con el 80% de la matrícula

Programa de Formación Continuada en Ciencias de la Visión El objetivo de este programa es acreditar la formación continuada en Oftalmología y Ciencias de la Visión en la Universidad de Oviedo. Esta actividad cuenta con el patrocinio de los laboratorios ALCON, AJL, THEA, BAUSCH & LOMB y ANGELINI.Todos los oftalmólogos del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega están matriculados en este programa, así como Dña. Carmen Rubiera Alija y Dña. Carla Castro Santalla, médicos residentes del Hospital Universitario Central de Asturias. Los alumnos están becados por el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega con el 80% de la matrícula. Asignaturas del Programa de Formación Continuada en Ciencias de la Visión.

a. Sesiones clínicas coordinador de la asignatura: Dr. José F. Alfonso Sánchez. Todos los lunes a las 8:30 por los oftalmólogos del IOFV. — “Modelo viscoelástico de la córnea”, 9 de enero de 2012. ponente: Prof. José Luis Suárez Sierra. — “Análisis clínico del genoma. IMOMA y DREAMgenics: presente, futuro y su aplicación a la oftalmología”, 5 de noviembre de 2012. ponentes: Dr. Juan Cadiñanos y Dr. Gonzalo R. Ordóñez. — “Resultados del VEGF-TRAP en DMAE”, 29 de noviembre de 2012. ponente: Lab. BAYER.

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b. Sesiones bibliográficas coordinador de la asignatura: Dr. Carlos Alonso Ron. — “Keratin films for ocular surface reconstruction”, 17 de enero de 2012. ponente: Dr. Álvaro Meana Infiesta. — “Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009”, 28 de febrero de 2012. ponente: Dña. Susana del Olmo Aguado. — “Myopia Control with Orthokeratology Contact Lenses in Spain (MCOS): Study Design and General Baseline Characteristics”, 20 de marzo de 2012. ponente: D. Manuel Álvarez Prada. — “Randomized Trial of Treatment of Amblyopia in Children Aged 7 to 17 Years”, 24 de abril de 2012. ponente: Dña. María Rueda Mansilla. — “Inflammatory response to contact lenses in patients with keratoconus compared with myopic subjects”, 12 de junio de 2012. ponente: D. Ignacio Serrano Peláez.

c. Seminarios de Investigación coordinador de la asignatura: Dr. Ignacio Alcalde. — “Novedades de la investigación clínica en síndrome de apneas-hipopneas del sueño (SAHS). Aspectos oftalmológicos.” 11 de enero de 2012. ponente: Dr. Joaquín DuránCantolla. — “Capacidades y áreas de conocimiento del departamento de I+D+i de CTIC-Centro Tecnológico”, 14 de marzo de 2012. ponente: D. Eduardo Álvarez. — “Electrochromic filters and new developments in coatings for ophthalmic lenses”, 21 de marzo de 2012. ponente: D. Antoni Vilajoana Mas. — “Fundamento y diseño de las lentes intraoculares difractivas multifocales”, 16 de abril de 2012. ponente: D. Norberto López Gil. — “Análisis estadístico en Oftalmología. Algunos casos prácticos”, 25 de abril de 2012. ponente: Prof. Norberto Octavio Corral Blanco. — “Formación en Enfermería: grado y postgrado”, 27 de abril de 2012. ponente: D. Rubén Martín Payo. — “Biomateriales derivados de la seda, Ingeniería Tisular y reconstrucción de tejido ocular”, 22 de mayo de 2012. ponente: D. José Luis Cenis. — “Terapia Génica en Oftalmología”, 1 de junio de 2012. ponente: Prof. Jesús Prieto Valtueña.

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— “Optimization of the ablation profiles in customized treatments for laser corneal refractive surgery”, 28 de junio de 2012. ponente: D. Samuel Arba Mosquera. — “Natural products as lead therapeutic agents against diabetic eye disease”, 15 de octubre de 2012. ponente: Prof. Mark Petrash. — “Enfermedades raras de la piel. Diagnóstico y tratamiento mediante terapias regenerativas”, 17 de octubre de 2012. ponente: Dra. Marcela del Río. — “Laser ablation ICP-MS: a new tool in biological and medical applications”, 31 de octubre de 20112. ponente: Dra. Beatriz Fernández García. — “Photoluminescent Quantum Dots for multiplexed bioanalysis and imaging”, 7 de noviembre de 2012. ponente. Prof. José Manuel Costa Fernández. — “Current concepts on energy concentrators, lumininescent materials and spectral conversión. Exploring ophthalmic applications”, 5 de diciembre de 2012. ponente: Dr. Amador Menéndez-Velázquez y Dr. David Gómez.

d. Sesiones de actualización coordinador de la asignatura: D. Miguel Naveiras Torres-Quiroga. — “Conjuntivitis”, 15 de marzo de 2012. ponente: Prof. Jesús Merayo. — “Patología de la córnea”, 29 de marzo de 2012. ponente: Prof. Jesús Merayo. — “Plegado de LIOS”, 5 de noviembre de 2012. ponente: D. Avelino Ojanguren.

e. Seminarios regionales de Oftalmología coordinadora de la asignatura: Dra. Begoña Baamonde. Estos seminarios son organizados por la Cátedra de Oftalmología de la Universidad de Oviedo y el Servicio de Oftalmología del HUCA. — Seminario del 25 de febrero de 2012 •

Conferencia: “Manejo actual del queratocono”. Dr. A. Arias.

•

Comunicaciones: “Papel del oftalmólogo en los tumores hipofisarios”. Dres. P. Talavero, C. Burgueño, T. Parra. “Estrías angioides y pseudoxantoma elástico”. Dres. A. García López, C. González Castaño y R. Salazar.

Memoria de Investigación y Docencia. AÑO 2012

— Seminario del 14 de abril de 2012 •

Conferencia: “Actualización en terapia antiangiogénica en la DMAE”. Dr. L. Arias Barquet (Barcelona).

•

Comunicaciones: “Cultivo y preparación de tejido para queratoplastia endotelial”. Dres. M. Naveiras y A. Meana. “Afectación corneal por rosacea”. Dres. D. Almanzar y J. Merayo.

— Seminario del 2 de junio de 2012 •

Conferencia: “Tumores intraoculares”. Dr. J. L. Encinas (Madrid).

•

Comunicaciones: “Brote de queratoconjuntivitis epidémica en un hospital de tercer nivel”. Dres. Álvarez-Fernández y C. Junceda (Oviedo). “Resultados funcionales de la cirugía de DR con y sin rexis de la membrana limitante interna”. Dras. Costales y C. González Castaño (Oviedo).

— Seminario del 27 de octubre de 2012 •

Conferencias: “Actualización en segmentos intracorneales”. Dr. Albertazzi. “Actualización en entrecruzamiento del colágeno con la luz ultravioleta”. Dres. M. Espionasa y S. Daya.

•

Comunicaciones: “Queratitis ulcerativa periférica post implante de segmentos intracorneales”. Dres. D. Almanzar y C. Lisa.

— Seminario del 15 de diciembre de 2012 •

Conferencias: “Neuro-oftalmología de la esclerosis múltiple”. Dr. O. Franch. “Neuropatías ópticas no glaucomatosas”. Dr. A. Gálvez.

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f. Curso monográfico de actualización del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega Curso Internacional de Superficie Ocular y Córnea del Instituto Oftalmológico FernándezVega, “Queratoplastias y terapias regenerativas de la córnea”. Más de doscientos oftalmólogos asistieron los días 11 y 12 de mayo a este curso. Bajo la dirección del Dr. José F. Alfonso y el Dr. Jesús Merayo, prestigiosos oftalmólogos nacionales e internacionales participaron en las distintas sesiones que se desarrollaron durante el curso. En este encuentro se puso de manifiesto que el trasplante de córneas artificiales se ha presentado como una alternativa posible al de córneas humanas. Podría ver la luz en un futuro no muy lejano y nos permitiría la realización de un mayor número de implantes. Este nuevo reto ha sido introducido por los doctores Álvaro Meana, Investigador Principal de la Fundación de Investigación Oftalmológica (FIO) del citado Instituto, quien dio a conocer los resultados de cultivos de endotelio corneal, y por Per Faherholm, de la Universidad de Linköpins, en Suecia, quien mostró el trasplante de córnea artificial como una técnica en experimentación y expuso los resultados del ensayo clínico que ha realizado en diez pacientes en los últimos cuatro años. En este marco, el profesor Luis Fernández-Vega, director médico del Instituto y presidente de la Sociedad Española de Oftalmología, hizo una revisión de todas las técnicas de trasplante de córnea y de cómo han ido evolucionando, desde las penetrantes hasta las lamelares. En este

Acto de inauguración del Curso Monográfico.

Memoria de Investigación y Docencia. AÑO 2012

punto, hizo hincapié en que este tipo de trasplantes parciales ofrecen una serie de ventajas importantes. Concretamente reducen el riesgo de rechazo al 2 por ciento frente al 20 por ciento de los totales “porque se implanta menos tejido, se mantiene la integridad de la pared ocular durante toda la cirugía y se disminuye la realización de suturas. Además se mejora la agudeza visual del paciente, se acelera su rehabilitación visual y la córnea de un mismo donante puede servir para dos pacientes”.

g. III Jornadas de Enfermería Oftalmológica del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega El viernes 19 y el sábado 20 de octubre del año 2012 han tenido lugar en el salón de actos “Ramón Castroviejo”, del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega (IOFV), las III Jornadas de Enfermería Oftalmológica. Acudieron a la cita 78 enfermeros de distintas ciudades de España. El principal objetivo del evento era dar a conocer la enfermería oftalmológica a los enfermeros generalistas que trabajan dentro del ámbito hospitalario y asistencial. El Profesor Luis Fernández-Vega Sanz, Director Médico del IOFV, comentó en el acto de bienvenida a los asistentes la importancia de la celebración de eventos como este para que los profesionales puedan compartir información y mostrar las novedades y avances tecnológicos del sector.

El Prof. Luis FernándezVega Sanz y D. Avelino Ojanguren Fernández en el acto de apertura de las III Jornadas de Enfermería.

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h. II Jornadas de Optometría del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega Las II Jornadas de Optometría del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega (IOFV) se desarrollaron el sábado 24 y domingo 25 de noviembre de 2012. Asistieron más de un centenar de profesionales de la visión, tanto de Asturias como de Galicia, Cantabria, País Vasco y Madrid. Entre los participantes cabe destacar la presencia de los representantes de las Delegaciones Regionales del Colegio de Ópticos-Optometristas de Asturias y del Colegio de ÓpticosOptometristas de Cantabria, País Vasco, Navarra y La Rioja; los oftalmólogos Dr. José F. Alfonso y Dr. Jesús Merayo; el presidente de la Sociedad Gallega de Optometría Clínica, D. Pablo Charlón; los profesores de la Universidad de Valladolid, Dr. Raúl Martín; Universidad Europea de Madrid, Dr. César Villa; Universidad de Sevilla, Dª María José Bautista y D. José A. Fuentes Najas. Se trataron temas relacionados con el queratocono, la contactología, la investigación, optometría pediátrica y diferentes técnicas de exploración, como la retinografía.

El Dr. Raúl Martín Herranz, profesor de la Universidad de Valladolid, durante su intervención en las Jornadas.

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6.2.2.1. FORMACIÓN DE MÉDICOS RESIDENTES coordinador: Dr. José F. Alfonso El IOFV está acreditado para la formación de médicos residentes de Oftalmología y recibe periódicamente a oftalmólogos en formación para realizar estancias cortas. La acción formativa es de especial importancia en subespecialidades como la de córnea, cirugía refractiva y catarata, donde la oferta de formación en los sistemas públicos de salud es muy limitada. Aunque esta oferta formativa tiene especial dedicación a los MIR de los hospitales de Asturias, también está abierta a nivel nacional e internacional. Así, en el último curso han rotado por el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega oftalmólogos en formación de muy diversas provincias españolas y de países como Argentina o Portugal. Dña. Gloria Guerra Calleja, D. Samuel Laria Blanco, Dña. Raquel Salazar Méndez, Dña Bárbara Martín Escuer, Dña. Isabel Santos Rodríguez-Vigil, Dña. Mª Emilia Odóriz, Dña Alina Adriana Ivanescu, Dña. Julia Méndez Díaz, D. Scout Anderson García-Pacheco, Dña. Filipa Daniela Ferreira Rodrigues y Dña. Alba García López

6.3.

OTROS ESTUDIOS Alumnos del Instituto de Enseñanza Secundaria de Cerdeño de Técnico auxiliar de farmacia, Técnico especialista en radiodiagnóstico y Técnico de laboratorio cursan sus prácticas en nuestro centro. Auxiliares de Enfermería del Centro de Estudios del Principado (CEP Europeo Formación) también realizan sus prácticas en el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega Del centro OVIDA Formación han realizado sus prácticas Técnicos de Anatomía Patológica.

6.4.

PROFESORADO Profesores de la Universidad de Oviedo, Instituto Oftalmológico Fernández-Vega y la Fundación de Investigación Oftalmológica: Prof. Luis Fernández-Vega Sanz, D. Álvaro Fernández-Vega Sanz, D. Javier Fernández-Vega Sanz, Dr. José F. Alfonso Sánchez, Dra. Begoña Baamonde Arbaiza, Dr. Jesús Merayo Lloves, Dr. Álvaro Meana Infiesta, D. Pedro Pablo Rodríguez Calvo, Dr. Ignacio Alcalde Domínguez, D. Manuel Álvarez Prada, Dña. Silvia García Peláez, D. Javier Lozano Sanroma, D. Avelino Ojanguren Fernández, Dña. Susana del Olmo Aguado, Dña. María Rueda Mansilla y D. Ignacio Serrano Peláez.

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7. Mecenazgo y participación

en proyectos con financiación competitiva 7.1. MECENAZGO El Instituto Oftalmológico Fernández-Vega colabora con la Fundación de Investigación Oftalmológica mediante aportaciones económicas y la cesión de sus instalaciones para los laboratorios en los que desarrolla, básicamente, su cometido. También los profesionales del Instituto participan en proyectos con la FIO.

La Fundación Mª Cristina Masaveu Petterson colabora con las distintas líneas de investigación de la Fundación de Investigación Oftalmológica.

La colaboración con CAJASTUR se ha reflejado en varios proyectos desde el 2009 hasta el 2012.

La Fundación Rafael del Pino tiene suscrito un convenio con la Fundación de Investigación Oftalmológica para apoyar los estudios realizados por el Profesor Miguel Coca-Prados, Catedrático Rafael del Pino, en el laboratorio de Genética Ocular.

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La Cátedra en Biomedicina Fundación BBVA es un convenio entre la Fundación de Investigación Oftalmológica y la Fundación BBVA para que el Profesor Neville Osborne realice sus estudios dentro del laboratorio de Neurobiología de la Retina.

La Fundación Ramón Areces presta su colaboración a varios apartados dentro de las unidades de investigación.

Esta entidad bancaria colabora con la Fundación de Investigación Oftalmológica mediante la financiación de una beca de la que es titular Dña Almudena Iñigo Portugues, Investigadora Pre-doctoral del Laboratorio de Superficie Ocular.

La Caixa colabora con la Fundación a través de la financiación del proyecto “Caracterización del queratocono mediante el estudio de inervación corneal e inmunohistorquímica de marcadores corneales. Estudio clínico y experimental”, que se desarrollará a lo largo de los años 2012 y 2013.

La compañía STAAR Surgical colabora con la investigación clínica que se desarrolla en la Fundación de Investigación Oftalmológica.

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AJL colabora en la investigación clínica y con el patrocinio de los seminarios de docencia que se realizan en la Fundación.

El laboratorio NOVARTIS colabora con la Fundación de Investigación Oftalmológica mediante una beca de la que es titular D. Santiago Morales Orozco, oftalmólogo que está realizando el Máster en Retina que realiza la Universidad de Oviedo y la Fundación de Investigación Oftalmológica.

Los laboratorios BAUSCH + LOMB, THÉA, ALCON Y ANGELINI colaboran con el área docente de la Fundación de Investigación Oftalmológica a través del patrocinio de los seminarios, que se realizan dentro del Programa de Formación Continuada en Ciencias de la Visión.

La Fundación también cuenta con el apoyo económico desde el año 2009 de D. Juan Carlos Guerra Zunzunegui y de D. Tomás Rey Gómez.

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La FIO agradece las donaciones para proyectos de investigación de los pacientes que voluntariamente y de una forma anónima vienen colaborando con nuestra actividad.

7.2.

PROYECTOS CON FINANCIACIÓN COMPETITIVA

7.2.1.

Nacionales Proyectos concedidos a la Fundación de Investigación Oftalmológica

TÍTULO DEL PROYECTO

Desarrollo, caracterización y modulación de un modelo experimental de ectasia (queratocono) que permita el tratamiento regenerativo del tejido ocular

ENTIDAD FINANCIADORA

Ministerio de Ciencia e Innovación. Instituto de Salud Carlos III

REFERENCIA

PI11/02886

DURACIÓN

Desde 1/1/2012 a 31/12/2014

IMPORTE

104.362,50 euros

TÍTULO DEL PROYECTO

Estudio experimental de la aplicación tópica del Plasma Rico en Factores de Crecimiento (PRGF) en la regeneración corneal

ENTIDAD FINANCIADORA

Fundación Mutua Madrileña

REFERENCIA

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DURACIÓN

Desde 1/1/2012 a 31/12/2013

IMPORTE

25.000 euros

Proyectos concedidos al Instituto Oftalmológico Fernández-Vega en los que colabora la Fundación de Investigación Oftalmológica

TÍTULO DEL PROYECTO

Customized Eye Care Oftalmología Personalizada (CEYEC)

ENTIDAD FINANCIADORA

Ministerio de Ciencia e Innovación. Centro para el Desarrollo Tecnológico Industrial

REFERENCIA

CEN-20091021

DURACIÓN

Desde 1/9/2009 a 31/12/2012

IMPORTE

897.571 euros

TÍTULO DEL PROYECTO

Desarrollo y optimización de córneas por medio de terapias avanzadas y nuevos materiales derivados de la seda para su empleo en reconstrucción de la superficie ocular y queratoplastias (SYLCOR)

ENTIDAD FINANCIADORA

Ministerio de Economía y Competitividad. Convocatoria INNPACTO 2012

REFERENCIA

IPT-2012-1029-010000

DURACIÓN

Desde 1/8/2012 a 31/12/2015

IMPORTE

895.459,06 euros (préstamo)

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7.2.2.

TÍTULO DEL PROYECTO

Empleo de scaffolds mediante la tecnología de “organ printing” en el desarrollo de endotelios corneales artificiales

ENTIDAD FINANCIADORA

Instituto de Desarrollo Económico del Principado de Asturias (IDEPA). Convocatoria INNOVA-IDEPA

REFERENCIA

IDE/2012/000302

DURACIÓN

Desde 28/11/2012 a 29/11/2013

IMPORTE

46.975,46 euros

Regionales Proyectos concedidos al Instituto Oftalmológico Fernández-Vega en los que colabora la Fundación de Investigación Oftalmológica

TÍTULO DEL PROYECTO

Implicación de los microRNAs en el diagnóstico de patologías oculares.

ENTIDAD FINANCIADORA

Gobierno del Principado de Asturias. Programa Jovellanos. Fundación para el Fomento en Asturias de la Investigación Científica Aplicada y la Tecnología (FICYT)

REFERENCIA

ITE09-126

Memoria de Investigación y Docencia. AÑO 2012

DURACIÓN

Desde el 6/7/2011 a 31/12/2012

IMPORTE

30.596 euros

TÍTULO DEL PROYECTO

Sensores electroquímicos miniaturizados

ENTIDAD FINANCIADORA

Gobierno del Principado de Asturias. Fundación para el Fomento en Asturias de la Investigación Científica Aplicada y la Tecnología (FICYT)

REFERENCIA

IE09-324C1

DURACIÓN

Desde 1/5/2011 a 31/12/2012

IMPORTE

58.575 euros

TÍTULO DEL PROYECTO

Estudio viabilidad desarrollo de un simulador corneal (SIMCOR)

ENTIDAD FINANCIADORA

Gobierno del Principado de Asturias. Fundación para el Fomento en Asturias de la Investigación Científica Aplicada y la Tecnología (FICYT)

REFERENCIA

IE09-562C1

DURACIÓN

Desde 1/3/2012 a 30/6/2012

IMPORTE

18.727 euros

Memoria de Investigaciﾃｳn y Docencia. Aﾃ前 2012

8. Comunicaciﾃｳn de la Ciencia

Memoria de Investigación y Docencia. AÑO 2012

8.1.

ARTÍCULOS ORIGINALES Unidad de Superficie Ocular autor: Marcos S, Requejo-Isidro J, Merayo- Lloves J, Acua AU, Hornillos V, Carrillo E, PérezMerino P, Del Olmo-Aguado S, Del Águila C, Amat-Guerri F, Rivas L. título: Fluorescent labeling of Acanthamoeba assessed in situ from corneal sectioned microscopy. ref. revista/libro: Biomed Opt. Express. 2012 October 1:3(10):2489-2499. Indice de Impacto: 2,333. Citaciones: 0. autor: Marco Zeppieri, Maria L. Salvetat, Antonio Beltrami, Daniela Cesselli, Natascha Bergamin, Rossella Russo, Ignacio Alcalde, Jesús Merayo, Paolo Brusini, Carlo Alberto Beltrami, Pier Camillo Parodi. título: Human adipose derived stem cells for the treatment of chemically burned rat cornea: Preliminary results. ref. revista/libro: Curr Eye Res (2013). In press. Indice de Impacto: 1,280. Citaciones: 0. autor: Meseguer V, Yeranddy Aguiar Y, Fajardo O, Tajada S, Denlinger B, Talavera A, Luis E, Manenschjin J-A, Pérez-García MT, López López JR, Belmonte C, Talavera K, Viana F (2011) título: TRPA1 channels are neuronal sensors for bacterial endotoxins (Nat Neurosci. Under 2nd review). autor: Gomis A, Meini S, Valenti C, Giuliani S, Belmonte C, Maggi CA título: Blockade of nociceptive sensory afferent activity of the rat knee joint by the bradykinin B2 receptor antagonist fasitibant (Osteoarthritis & Cartilage, accepted). autor: Orio P, Parra A, Madrid R, Belmonte C, Viana F. (2012). título: Role of hyperpolarization activated currents in the firing pattern of cold thermoreceptor endings. J. Neurophysiol. (doi:10.1152/jn.01033.2011). autor: de la Peña E, Mälkiä A, Vara H, Caires R, Ballesta JJ, Belmonte C, Viana F. título: Closure of thermosensitive TREK-1 potassium channels by physiological cooling regulates the excitability of immature hippocampal networks. PLoS One. 2012; 7(12): e52475. autor: Zhang X, Mak S, Parra A, Denlinger B, Li L, Belmonte C, McNaughton PA. (2012). título: Direct inhibition of cold-activated ion channel TRPM8 by the Gαq G-protein subunit. Nat Cell Biol. 14: 851-858 (doi: 10.1038/ncb2529) autor: Pertusa M, Madrid R, Morenilla-Palao C, Belmonte C, Viana F (2012). título: N-glycosylation of TRPM8 channels modulates the temperature sensitivity of coldthermoreceptor neurons. J Biol Chem. 287: 18218-18229.

Memoria de Investigación y Docencia. AÑO 2012

autor: Gallego P, Pérez-Merino P, Ibares-Frías L, Mayo-Iscar A, Merayo-Lloves J, MartínezGarcía C. título: Scleral changes induced by atropine in chicks as an experimental model of myopia. ref. revista/libro: Ophthalmic and Physicological, 2012. clave: A Categoría A (Oftalmología). Índice de Impacto: 1,259. Índice de Citación: NA. Posición que ocupa la revista en el área: 33/56 ISSN: 1475-1313.

Unidad de Neurobiología de la Retina autor: Osborne NN, Del Olmo-Aguado S. título: Maintenance of retinal ganglion cell mitochondrial functions as a neuroprotective strategy in glaucoma. ref. revista/libro: Current Opinion and Pharmacology, 2013 Feb; 13(1): 16-22. doi:10.1016/j. coph.2012.09.002. Epub 2012 Sep 20. Indice de Impacto: 6,856. Citaciones: 1. autor: Del Olmo-Aguado S, Manso AG, Osborne NN. título: Light Might Directly Affect Retinal Ganglion Cell Mitochondria to Potentially Influence Function. ref. revista/libro: Photochemistry and Photobiology, 2012 Feb 25. doi: 10.1111/j.17511097.2012.01120.x. Indice de Impacto: 2,413. Citaciones: 1. autor: Kamalden TA, Ji D, Osborne NN. título: Rotenone-induced death of RGC-5 cells is caspase independent, involves the JNK and p38 pathways and is attenuated by specific green tea flavonoids. ref. revista/libro: Neurochemical Research, 2012 May: 37(5):1091-101.doi:10.1007/s11064012-0713-5. Epub 2012 Feb 15. Indice de Impacto: 2,240. Citaciones: 1. autor: Osborne NN, Ji D, Majid AS, Del Soldata P, Sparatore A. título: Glutamate oxidative injury to RGC-5 cells in culture is necrostatin sensitive and blunted by a hydrogen sulfide (H2S)-releasing derivate of aspirin (ACS14). ref. revista/libro: Neurochemical International, 2012 Mar; 60(4):365-78.doi:10.1016/j. neuint.2012.01.015. Epub 2012 Jan 28. Indice de Impacto: 2,857. Citaciones: 2.

Unidad de Genética Ocular autor: Alvarez L, Gonzalez-Iglesias H, García M, Ghosh S, Sanz-Medel A, Coca-Prados M. título: The Stoichiometric Transition from Zn6Cu1-Metallothionein to Zn7-Metallothionein Underlies the Up-regulation of Metallothionein (MT) Expression: QUANTITATIVE ANALYSIS OF MT-METAL LOAD IN EYE CELLS. ref. revista/libro: The Journal of Biological Chemistry, 2012 Aug 17; 287(34): 28456-69. Epub 2012 Jun 21. Indice de Impacto: 4,773. Citaciones: 1.

Investigación Clínica

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autor: Alfonso JF, Fernández-Vega L, Lisa C, Fernandes P, Jorge J, Mico RM. título: Central vault after phakic intraocular lens implantation: Correlation with anterior chamber depth, white-to-white distance, spherical equivalent, and patient age. ref. revista/libro: Journal of Cataract and Refractive Surgery. Volume 38. Issue 1. Pages: 46-53. doi: 10.1016/j.jcrs. 2011.07.035. Published: Jan 2012. Indice de Impacto: 2,264. Citaciones: 0. autor: Alfonso JF, Fernández-Vega L, Blazquez Jl, Montes-Mico R título: Visual function comparison of 2 aspheric multifocal intraocular lenses. ref. revista/libro: Journal of Cataract and Refractive Surgery. Volume 38. Issue 2. Pages 242-248. doi: 10.1016/j.jcrs.2011. 08. 034. Published: Feb 2012. Indice de Impacto: 2,264. Citaciones: 2. autor: Coscarelli S, Ferrara G, Alfonso JF, Ferrara P, Merayo-Lloves J, Araujo LPN, Machado AP, Lyra JM, Torquetti L. título: Intrastromal corneal ring segment implantation to correct astigmatism after penetrating keratoplasty. ref. revista/libro: Journal of Cataract and Refractive Surgery. Volume 38. Issue 6. Pages 1006-1013. doi: 10.1016/j.jcrs.2011.12.037. Published: Jun 2012. Indice de Impacto: 2,264. Citaciones: 1. autor: Alfonso JF, Lisa C, Merayo-Lloves J, Fernández-Vega Cueto L, Montes-Mico, R. título: Intrastromal corneal ring segment implantation in paracentral keratoconus with coincident topographic and coma axis. ref. revista/libro: Journal of Cataract and Refractive Surgery. Volume 38. Issue 9. Pages 157682. Published: 2012-Sep. Indice de Impacto: 2,264. Citaciones: 0. autor: Ferrara G, Torquettyi L, Ferrara P, Merayo-Lloves J. título: Intrastromal corneal ring segments: visual outcomes from a large case series. ref. revista/libro: Clim Experimental Ophthalmol, 2012 Jul; 40 (5): 433-9. doi:10.1111/j.14429071.2011.02698.x. Indice de Impacto: 1,977. Citaciones: 2.

autor: Alfonso JF, Lisa C, Fernández-Vega Cueto L, Fernandes P, González-Meijone JM, Montés Mico R. título: Comparison of visual and refractive results of Toric implantable Collamer Lens with bioptics for myopic astigmatism. ref. revista/libro: Graefes Arch Clin Exp. Ophthalmol, 2012 Sep 23 (Epub ahead of print). Indice de Impacto: 2,170. Citaciones: 0. autor: Alfonso JF, Fernández-Vega L, Lisa C, Fernandes P, González-Meijone JM, Montés Mico R. título: Long-term evaluation of the central vault after phakic Collamer® lens (ICL) implantation using OCT. ref. revista/libro: Graefes Arch Clin Exp. Ophthalmol, 2012 Dec; 250(12): 1807-1812.

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doi:10.1007/s00417-012-1957-0. Epub 2012 Feb 28. Indice de Impacto: 2,170. Citaciones: 0. autor: Carreño E, Porteño, Galarreta D, Merayo J. título: Interface fluid syndrome associated with cataract surgery. ref. revista/libro: Journal of Refractive Surgery, 2012; 28: 243-244 clave: A Categoría A (Oftalmología). Índice de Impacto: NA. Índice de Citación: NA. Posición que ocupa la revista en el área: 15/56. ISSN: NA. Indice de Impacto: 2,541. Citaciones: 1. autor: Coscarelli S, Ferrara G, Alfonso JF, Ferrara P, Merayo-Lloves J, Araujo LP, Machado AP, Lyra JM, Torquetti L. título: Intrastromal corneal ring segment implantation to correct astigmatism after penetrating keratoplasty. ref. revista/libro: Journal of Cataract & Refractive Surgery, 2012; 38: 1006-1013 clave: A Categoría A (Oftalmología). Índice de Impacto: NA. Índice de Citación: NA. Posición que ocupa la revista en el área:. ISSN: NA. Indice de Impacto: 2,264. Citaciones: 1. autor: Alfonso J, Lisa C, Merayo-Lloves J, Fernández-Vega Cueto L, Montes-Mico R. título: Ferrara-type intracorneal ring segments in keratoconus with coincident topographic and comatic axis. ref. revista/libro: Journal of Cataract & Refractive Surgery, 2012 clave: A Categoría A (Oftalmología). Índice de Impacto: 2,184. Índice de Citación: NA. Posición que ocupa la revista en el área: 8/56 ISSN: NA.

Memoria de Investigación y Docencia. AÑO 2012

8.2.

PUBLICACIONES DE LIBROS Y ARTÍCULOS DE LIBROS autor: Merayo-Lloves J., Vitale A. título: Chapter: Free living amebas and amebiasis. Foster CS, Vitale AT (Eds). In Diagnosis and treatment of Uveitis. 2nd edition. Pp. 579-586. editorial: Jaypee-Highlights Medical Publishers inc. New Deli, India, 2013. clave: A, CL (Oftalmología) DR 9.51. isbn: 978-93-5025-572-8. autor: T. Wheeler-Schilling, J. Kremers and E. Zrenner título: The Neurobiological Basis of Ocular Surface Sensation in Normal and Pathological Conditions C. Belmonte. In A Vision for Horizon 2020 - A European Strategic Roadmap for Vision Research and Ophthalmology. Eds. European Vision Institute Shaker Verlag, Aachen, Germany, 2012.

8.3.

PATENTES Solicitud de patente europea nº EP13382059.7, titulada “Method for the diagnosis of glaucoma based on the determination of serum protein levels”.

COMUNICACIONES PRESENTADAS EN EL CONGRESO ARVO

J. Merayo-Lloves1, J.F. Alfonso 1. C. Lisa1, D. Almanzar1 M. Naveiras1, B. Baamonde1 1Fundación

de Investigacion Oftalmologica. Instituto Oftalmologico Fernandez-Vega. Oviedo (Spain).

4057/D1045

INTRODUCTION

RESULTS

Keratoconus has been classically defined as condition in which the cornea assumes a conical shape as result of noninflammatory thinning and protrusion1. Intracorneal Rings Segments (ICRS) have been used to correct ectatic corneal diseases in order to reduce the corneal steepening, reduce the irregular astigmatism and improve the visual acuity 2-6. Its implantation is an effective procedure for keratoconus treatment, being more effective for moderate than severe keratoconus7. The ICRS may delay the progression of the keratoconus, eliminate or postponed the need for corneal grafting surgery8.

Mean UDVA was 0.17 + 0.14 before and 0.41 + 0.28 after surgery (P < 0.001). CDVA changed from 0.70 + 0.18 before to 0.80 + 0.17 after surgery (P < 0.0001). The efficacy index was 0.60. 5 of the eyes lost 1 lines of CDVA, 17 eyes had unchanged their CDVA, 15 eyes gained 1 line, 9 eyes gained 2 lines, 7 eyes gained 3 lines and 3 eyes gained 4 lines of CDVA. The safety index was 1.14. Spherical equivalent and astigmatism components were highly reduced after ICRS implantation (P<0.01). Target and surgical induced astigmatism revealed that 78.6 % of eyes were + 1.00 D. No complications were observed. .

MATERIALS & METHODS

Snellen uncorrected distance visual acuity (UDVA), best corrected visual acuity (CDVA) and residual refractive errors were recorded before and after 6 months post-Ferrara Type ICRS implantation after tunnel creation with femtosecond laser in 56 eyes of 49 patients with keratoconus. Power vector and Alpins method were used to analyze refractive outcomes after the surgery.

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Ferrara-type Intracorneal Rings Segments in Keratoconus with Coincident Topographic and Comatic Axis.

CONCLUSIONS ICRS implantation in paracentral keratoconus when the topographic and comatic axis are included by the intracorneal segment, provided good visual and refractive outcomes, indicating that it is a predictable and safe procedure for refractive correction of this type of keratoconus. OD

REFERENCES 1- Rabinowitz YS. Keratoconus. Surv Ophthalmol 1998; 42:297-319 2- Colin J, Velou S. Implantation of intacs and refractive intraocular lens to correct keratoconus. J Cataract Refract Surg 2003;29:832-834 3-Asbell PA, Ucakhan OO. Long term follow up of intacs from a single center. J Cataract Refract Surg 2001; 27:1456-1468 4- Colin J, Cochener B, Savary G, Malet F. Correcting keratoconus with intracorneal rings. J Cataract refract Surg 2000; 26:1117-1122 5- Siganos D, Ferrara P, Chatzinikolas K, Bessis N, Papastergiou G. Ferrara intrastromal corneal rings for the correction of keratoconus. J Cataract Refract Surg 2002; 28:1947-1951 6- Assil KK, Barret AM, Fouraker BD, Schanlin DJ. One year results of the intrastromal corneal ring nonfunctional human eyes; the instrastromal Corneal Rings Study Group. Arch Ophthalmol 1995; 113-159-167 7- José F. Alfonso & Carlos Lisa & Luis Fernández-Vega & David Madrid-Costa, Robert-MontésMico. Intrastromal corneal ring segment implantation in 219 keratoconic eyes at different stages Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol (2011) 249:1705–1712 8- Torquetti L, Fabri R, Ferrara P. Long-term follow up on intrastromal corneal ring segments in keratoconus. J cataract Refract Surg 2009;35:1768-1773 Supported in part by a grant from Fundación Cristina Masaveu Petersont and Caja Asturias, Principado de Asturias, Spain.

Memoria de Investigaciﾃｳn y Docencia. Aﾃ前 2012 | COMUNICACIONES AL CONGRESO ARVO

Supported in part by a grant from Fundaciﾃｳn Cristina Masaveu Peterson and CajAstur. Principado de Asturias. Spain

Ana Fernández-González*, Carlos Alonso-Ron*, Manuel Chacón, Álvaro Meana, Jesús Merayo-Lloves, Carlos Belmonte. Fundación de Investigación Oftalmológica. Oviedo (Spain). * These authors contributed equally to the work.

3578/D956

• The effect of the HA Hyaluronic acid (HA) participates in the proliferation and migration of Effect of hyaluronan molecular mass on proliferation of human epithelial limbal cells. We studied the effect of HA of different molecular masses (50, 150, 440, 1000 and 5200 kDa) on the proliferation of cultured on the proliferation of epithelial cells during corneal wound healing. Promotion of corneal epithelial wound healing by exogenous HA was already shown 20 years ago limbal epithelial cells from two donors, whose ages were 63 (A) and 70 (B). First of all, we treat the cells for 16 hours. As it can human limbal epithelial be seen on figure 2, only cells from one donor (A) respond to HA. In that case, treament of HA 50 kDa 1 Qg/mL, HA 440 kDa cell depends on its MM (Nishida et al., 1991) 10 Qg/mL and 5200 kDa 10 Qg/mL, were more effective. and concentration. We previously find the expression of the hyaluronan receptors CD44 and A B RHAMM in corneal epithelium. • There is a donorThe mechanisms by which HA stimulate cellular migration and/or proliferation in the corneal related variability in the epithelium are poorly understood. Although it has been suggested that HA effects on human corneal proliferative response of epithelium wound healing are mediated through CD44 (Gomes et al., 2004), there was no studies about human limbal epithelial the implication of RHAMM, even despite of its description as a differentiation marker in corneal cells. The time of epithelium (Ahmad et al., 2008). Taking into account those previous studies, we indentified the isotypes of CD44 and RHAMM treatment may also expressed by human epithelial cells in vitro, as well as their subcelullar localization. Moreover, we also influence this behavior. Fig. 2. Effect of hyaluronan Molecular Mass on proliferation of human epithelial limbal cells treated for 16 hours. showed that both CD44 and RHAMM co-localize in the basal cell layer of mice corneal epithelium (ARVO 2011, 280/D744).

Proliferation of cultured cells from donors of 63 (A) and 70 (B) years old treated for 16 hours with HA of 50, 150, 440, 1000 and 5200 kDa. For statistical analysis t-student test were used. In some cases, data population did not follow a Gaussian distribution so that a Mann-Whitney U-test was used.

• Treatment for 16 hours In corneal epithelial wound healing there is a previous cell migration stage, We decided to treat cells for a longer time, i.e. 48 hours. For these experiments, cells from donors of 49 (A) and 68 (B) years old with 10 Qg/mL HA of were used. Again, and as it can be seen in figure 3, only cells from one donor (A) respond to HA, and it was the biggest polymer 50, 150 and 440 kDA followed by a proliferation and differentiation stage. inhibits migration of During closure of a wound in the central corneal epithelium, first of all, cells from margins start to (5200 kDa) with the highest concentration (10 Qg/mL) the one which caused a significant increase in cell proliferation. SV40-HCE cells in BSA migrate for covering the denude area. It is not clear yet whether it is a migration of individual cells, a A B mass movement with maintenance of cell-to-cell adhesion or both processes simultaneously. However, but not in FNC. after migrating and once denude area is covered, cells proliferate and differentiate until cornea reaches its normal thickness (Lu et al., 2001; Suzuki et al., 2003). It is important to realize that cell migration and proliferation are processes incompatibles at the same time, mainly because of cytoskeleton compromise (Nieto, 2011).

Cells can produce a pericellular coat of HA for proliferating, differentiating and/or migrating. During last years, it is known that hyaluronan is not only present in the extracellular matrix, but also cells can create a pericellular coat of this glycoside. The synthesis of this coat uses to be related to cell migration, invasiveness, proliferation and/or differentiation phenomena. Moreover, hyaluronan may be added exogenously, creating the pericellular coat and evocating cell responses depending on the molecular mass of the polymer (Toole, 2004).

We studied the effect of the Molecular Mass (MM) of the HA on proliferation and migration of human corneal epithelial cells. • Hyaluronic acid of 50, 150 and 1000 kDa were purchased from Sigma. Hyaluronic acid of 440 and 5200 kDa were a kind gift of Prof. Dr. E. A. Balazs from the Matrix Biology Institute (Edgewater, NJ). • Corneal limbi from human donors were mechanically and enzymatically (tripsine) disaggregated, leaving an epithelial cell suspension. Then, cells were seeded over 3T3 (murine and irradiated) fibroblasts and grown in “QN medium” (FBS, adenine, insuline, CTX, T3, hydrocortisone) for 3-5 d. After that, EGF was added to the medium and, when cultures reached around 80% confluence, cells were plated for the experiments. Before assays, culture plates were overnight fasted.

Fig. 3. Effect of hyaluronan Molecular Mass on proliferation of human epithelial limbal cells treated for 48 hours. Proliferation of cultured cells from donors whose ages were 49 (A) and 68 (B). The MM of HA was the same as explained in Fig. 2, but in that case a treatment of 48 hours was used. The same statistical analysis was also used.

Effect of hyaluronan molecular mass on migration of SV40-HCE cells over different substrates. Cell migration and proliferation are critical stages in corneal epithelial wound healing, and both processes cannot occur at the same time (see above). Thus, we study the effect of HA MM on cell migration, but now we used SV40-HCE cells instead of primary cultures for technical reasons and the concentration was always 10 Qg/mL. First off all, cells were treated for 16 hours and plated in bovine serum albumin (BSA, which is not an extracellular matrix ECM – protein) or fibronectin (FNC) coated inserts. Figure 4 shows that HA 50, 150 and 5200 kDa inhibits migration in BSA (A) whereas it does not in FNC.

Fig. 4. Effect of HA MM on migration of SV40-HCE cells in BSA and FNC treated for 16 hours. Migration of SV40-HCE cells treated for 16 hours with HA of different MM (see somewhere above) in BSA (A) and FNC (B). For statistical analysis, a Mann-Whitney U-test was use.* p < 0.05; N = 4.

Again, we study the effect of a treatment for a longer time: 24 hours. Moreover, we test the migration in other two ECM proteins: vitronectin (VTN) and collagen-I (COLI). As it can be seen in figure 5, while all HA inhibits migration in BSA (A), nothings occurs in FNC (B), VTN (C) or COL-I (D). 10x

20x

Figure 1. Human corneal epithelial limbal cells.

• Simian virus 40-inmortalized human corneal epithelium (SV40-HCE) cells (Araki-Sasaki et al., 1995) were provided by Riken Biosource Center (Tokyo, Japan) and routinely grown in medium with FBS. Before experiments, culture plates were overnight fasted. • For measuring cell proliferation, a commercial DNA fluorescence-based kit (CyQuant®, Invitrogen) was used. For the assays, instructions of the manufacturer were followed. • For measuring cell migration, a commercial Boyden Chamber-based kit (QCM®, Millipore) was used. For the assays, instructions of the manufacturer were followed.

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Influence of the Molecular Mass of the Hyaluronan on Corneal Epithelium Cell Proliferation and Migration in vitro.

• For all the MM tested, HA treatment for 24 hours with 10 Qg/mL HA inhibits migration of SV40-HCE cells in BSA, but not in FNC, VTN and COL1.

REFERENCES Ahmad S, Kolli S, Li DQ, De Paiva CS, Pryzborski S, Dimmick I, Amstrong L, Figueiredo FC, Lako M (2008). Stem Cells 26: 1609-1619. Araki-Sasaki K, Ohashi Y, Sasabe T, Hayashi K, Watanabe H, Tano Y, Handa H (1995). Invest Ophthalmol Vis Sci 36: 614-621. Gomes JA, Amankwah R, Powell-Richards A, Dua HS (2004). Br J Ophthalmol 88: 821-825. Lu L, Reinach PS, Kao WW (2001). Exp Biol Med 226: 653-664. Nieto MA (2011). Annu Rev Cell Dep Biol 27: 16.1-16.30. Nishida T, Nakamura M, Mishina H, Otori T (1991). Exp Eye Res 53: 753-758. Suzuki K, Saito J, Yanai R, Yamada N, Chikama T, Seki K, Nishida T. (2003) Prog Retin Eye Res. 22: 113-33. Toole BP (2004). Nat Rev Cancer 4: 528-539.

ACKNOWLEDGEMENTS This work was supported in part by…

Fig. 5. Effect of HA MM on migration of SV40-HCE cells in BSA, FNC, VTN and COL1 treated for 24 hours. Migration of SV40-HCE cells treated for 24 hours with HA of different MM (see somewhere above) in BSA (A), FNC (B), VTN (C) and COL-1 (D). For statistical analysis, a Mann-Whitney U-test was used.

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Corneal Sensitivity in Keratoconus Patients with Gas Esthesiometer A. C. Riestra1, J.F. Alfonso1, D. Almanzar1,. J. Merayo-Lloves, M. Naveiras1

1Fundación

de Investigacion Oftalmologica. Instituto Oftalmologico Fernandez-Vega. Oviedo (Spain).

RESULTS

Keratoconus has been defined as a disorder characterized by a conical ectasia of the cornea in the absence of clinical signs of corneal inflammation. Typically, the pathology shows central or inferior corneal thinning with increased curvature at the apex of the cone. The confocal microscopy has been used to study the architecture of the living human corneal sub-basal nerve plexus and has showed alterations in the sub basal nerve plexus in keratoconic patients with a evidence of significant reduction density compared with normal1 and increased nerve tortuosity2. The decrease in the nerve fiber bundle counts precedes impairment of corneal sensitivity and appears to allow early detection of beginning neuropathy3. Dry eye syndrome and fibromyalgia shows alterations in corneal sensitivity, related to damage to the corneal sensory innervation4,5. We have used Belmonte㼿s no-contact gas esthesiometer to asses the corneal sensitivity in keratoconic patients.

There were differences between healthy (n=40) and keratoconus (n=26) eyes for mechanical sensitivity threshold (78.5㼼23.5 vs 92,69㼼33.5, p=0,043) and for chemical sensitivity threshold (26.88㼼11.9 vs 41.27㼼12.8, p=0,0001). Between HNCL and KNCL (25.33㼼10.2vs39.23㼼8.8, p=0.027), HCL and KCL (27.5㼼13.1 vs 43.3㼼15.9, p=0.03) and KCL and HNCL(43.3㼼15.9 vs 25.33㼼10.2, p=0,002) for chemical sensitivity threshold. p=0.043

p=0.0001

p=0.027

MATERIALS & METHODS 135 eyes of of 68 patiens were included and divided in four groups: Healthy subjects Non Contact Lens users (HNCL), healthy subjects contact lens users (HCL), Keratoconus Non Contact Lens Users (KNCL), and Keratoconus Contact Lens Users (KCL). Corneal sensitivity was measured at the center of the cornea with Belmonte㼿s non-contact gas esthesiometer (Ocular Pain Meter, Deriva, Spain). Mechanical (air jets at flow rates from 0-200 mL/min, reaching the corneal surface at 34ºC) and chemical (air containing 0-90% CO2, 10 ml/min below mechanical threshold and temperature at the cornea of 34ºC) , and thermal stimuli (cooled air at sub threshold flow rates changing corneal basal temperature +/-1 㼻C) were applied to the cornea to determine the sensitivity threshold for each stimulus modality. Data of the 20-29 years group (n=65) were analyzed using the Statistical Package for the Social Sciences software (SPSS18.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Significant differences were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) and Bonferroni tests.

Belmonte㼿s Esthesiometer

1804/A267

INTRODUCTION

Dark eyes

HNCL

100%

HCL

91,7%

KNCL

69,2%

KCL

53,8%

TOTAL

Included eyes per group of 20-29 years

p=0.03

CONCLUSIONS Keratoconus patients showed corneal hypoesthesia after mechanical and chemical stimulation, increased in contact lens users. These alterations in the functional corneal sensation could be related with the anatomical changes in the nerves structures.

REFERENCES 1- Patel DV, McGhee CJN. Mapping the corneal sub-basal nerve plexus in keratoconus by in vivo laser scanning confocal microscopy. Invest ophthalmol Vis sci.2006; 47:1348-1351 2- Niederer R, Perumal D, Sherwin T, McGhee NJ. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea. IOVS, 2008; 49:7:2964-2970 3- Rosemberg M, Tervo T, Immonen IJ, Muller L, Gronhagen-Riska C, Vesaluoma MH. Corneal sructure and sensitivity in type 1 diabetes mellitus. IOVS 2000; 41:10:2915-2921 4- Bourcier T, Acosta C, Borderie V, Borras F, Gallar J, Bury T, Laroche L, Belmonte C. Decreased corneal sensitivity in patients with dry eye. IOVS 2005; 46:7:2341-2345 5- Gallar J, Morales C, Freire V, Acosta MC, Belmonte C, Duran J. Decreased corneal sensitivity and tear production in fibromyalgia. IOVS, 2009; 50:9:4129-4134

Supported in part by:

Miguel Naveiras1, Karen Arriozola2,3, Dagoberto Almanzar4A, Eva Villota-Deleu3, Alvaro Fernandez Vega3, Jesus Merayo-Lloves4B,5 1Ocular surface, cornea and uveitis, Fundación Investigación Oftalmológica (FIO-IOFV), Oviedo, Spain; 2Facultad de Medicina, Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey (ITESM), Monterrey, Mexico;3Instituto oftalmológico Fernández-Vega, Oviedo, Spain; ACornea ocular surface and uveitis, BOcular surface and uveitis, 4Fundación de Investigación Oftalmológica - (FIO/IOFV), Oviedo, Spain; 5Facultad de Medicina. Oftalmología, Universidad de Oviedo, Oviedo, Spain.

Tuberculosis (TB) still poses a major health problem with an estimated one-third of the world population affected by latent infection.[1-6] Of those, 5-10% will progress to active infection. In Europe, Spain ranks second in prevalence with 18 TB cases per 100,000 inhabitants.[7, 9] Intraocular involvement is estimated to occur in 1.4% of pulmonary TB cases,[1, 2] increasing to 2.8-11.4% in HIV-positive patients.[2] While primary ocular infection is rare,[1, 11] lesions are usually due to immune-mediated reaction to TB antigens from an insidious infection.[12] “Manifest presumed ocular TB“ (MPOTB) has been defined as evidence of M. tuberculosis at an extraocular location, observable ocular lesions not attributable to other causes, and an adequate response to anti-TB medication.[8] The most common clinical findings are solitary or multiple choroidal nodules, retinal vasculitis, and choroiditis.[10] In recent years, the interferon gamma release assay (IGRA) has proven to be more specific than the tuberculin skin test (TST) (76% sensitivity, 98% specificity [13-16]). It is independent of cross reactivity with the bacille Calmette-Guerin (BCG) vaccination, which was widely used in northwestern Spain in the past.

MATERIALS & METHODS To evaluate the prevalence and treatment outcome of manifest presumed ocular tuberculosis (TB), 48 consecutive Spanish Caucasian patients with moderate to severe uveitis were referred our clinic and tested by IGRA for the presence of TB. The mean age was 55.1㼼19.4 years (range, 15-88 years), 60.4% were female, and 39.6% were male. For 41 of the patients, the rationale for testing was to aid in the diagnosis of a uveitis of unknown origin. For 7 patients, the purpose was to rule out TB involvement in a known uveitis prior to implementation of immunosuppressive therapy. The IGRA was performed using Quantiferon-TB Gold IT test (QFT, Cellestis Inc., Carnegie, Australia). Inclusion criteria for MPOTB were the presence of clinical findings consistent with TB in the MEEI uveitis screening survey and in the ophthalmic examination, a positive IGRA, and lack of other cause demonstrated by ancillary testing. None of the patients had a compromised immune system because of HIV infection. Anti-tuberculosis therapy (ATT) was initiated by referring each patient to an internal medicine specialist. In addition, steroids and immunosuppressant drugs were prescribed on a case-by-case basis. Patients were classified according to the International Uveitis Study Group, and cases were monitored by a single ophthalmologist (JM) using the SUN Working Group activity score.[11, 17] Best spectacle corrected visual acuity (BSCVA) was determined at referral and after 6 months of treatment. At the same time, macular mean central subfield thickness (CSFt), central subfield volume (CSFv), and mean central EDTRS thickness were determined by optical coherence tomography (OCT, Topcon 3D OCT-10000, Topcon Inc., Paramus, NJ, USA). (Figure 1) Statistical analysis Data were recorded in an Excel file (Microsoft, Richmond, CA, USA) and then analysed with Statistical Procedures for the Social Sciences (v17, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). The mean and standard deviation of continuous variables were calculated. Source population demographics for each patient were analysed by frequency tables. Two-sided chi-square tests were used for discontinuous variables, and t-tests for independent samples were used for continuous variables. The Levine test was used where applicable to determine if the data were normally distributed. BSCVA and OCT measurements were analysed per affected eye, and the Wilcoxon ranked sign test was used for paired data. Decimal BSCVA values were converted to LogMAR for comparison, and CSFt values were logarithmically transformed prior to statistical analysis.[18, 19] P-values of <0.05 were considered statistically significant.

3210/A55

RESULTS

INTRODUCTION

Prevalence and type of manifest ocular tuberculosis Nineteen of 49 (39.6%) patients with clinical findings consistent with TB were positive when tested by QFT, and were diagnosed with presumed intraocular TB. The mean age of QFT-positive patients was 62.6㼼16.2 years, which was significantly older than the . QFT-negative subjects, 50.1㼼19.9 years (p<0.05). Slightly more than half of the QFT-positive subjects were female, 52.6%.(p<0.05). The mean follow-up was 6.4㼼2.7 months. By frequency of uveitis occurrence, 51.7% were posterior, 27.6% anterior, 10.3% panuveitis, and 10.3% scleritis. (p>0.05). Subgroup analysis. For the subgroup in which the rationale for testing was to diagnose a uveitis of unknown origin, the prevalence of presumed ocular TB was 39%. In the second subgroup, composed of patients tested to rule out TB before initiating immunosuppression of a known uveitis, the prevalence was 42.9% (p>0.05). Extraocular involvement, adverse effects to ATT, and control rates Extraocular TB involvement was present in 26.3% (80% single lung nodule, 25% disseminated nodules). Elevated hepatic enzymes were present in 15.8% of treated patients. After six months of treatment, uveitis was considered controlled in 94.7% of cases. There were no remissions. Visual acuity and macular thickness BSCVA at referral improved slightly after six months of treatment, but not significantly. As with the BSCVA, macular central subfield thickness (CST), macular central subfield volume (CSV) and EDTRS macular thickness improved, decreasing after six months of treatment, but the changes were not statistically significant. (Table 1) EYES AFFECTED WITH UVEITIS WITH 6M FOLLOW-UP

EXAMINATION

N Mean±SD Difference P-value

BSCVA

OCT CST

OCT CSV

OCT EDTRSt

At referral

6 months

At referral

6 months

At referral

6 months

At referral

(logMAR)

( m)

( m3)

( m)

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Presumed ocular tuberculosis in patients with chronic uveitis and macular edema.

OCT EDTRSt 6 months ( m)

0.12±0.4 311.00±9 280.81±1 0.24±0.7 288.25±1 263±113. 0.21±0.38 8 4.67 12.23 5 19.59 78 -0.03 -30.19 -0.03 -25.25

Table 1. BSCVA and OCT measurements BSCVA CST CSV EDTRS SD

= = = = =

Best spectacle corrected visual acuity Central subfield thickness Central subfield volume EDTRS macular thickness Standard deviation

0.15±0.59

0.273

0.128

0.223

0.327

DISCUSSION Given the high incidence of TB in Europe, especially in Spain, [7,9], we hypothesized that testing our patients with chronic uveitis, macular edema, and manifest ocular presumed TB would reveal a significant level of TB involvement. Further, we thought that ATT would reduce macular edema and possibly improve BSCVA. We chose the QFT IGRA to minimize the chance of detecting false positives. We found a remarkable 39.6% of TB involvement in this HIV-free series, which is consistent with the 32.2%-45.8% reported in a comparable population.[16]. Concomitant extraocular TB involvement was 52% in the literature, and 21.1% in our series. Duration of ATT is still controversial [7, 23, 24]; patients in our series were treated for at least 6 months. ATT has been reported to be efficacious in controlling inflammation in 90% of cases.[4] Likewise, it was effective in 94.7% of our patients. While the acuity and retinal thickness changes that we measured were not statistically significant, BSCVA was maintained and macular CSFt OCT measurements improved an average of 30.2 m after 6 months of ATT. The lack of significant BSCVA improvement may be due to long term sequelae of chronic macular edema, secondary cataract, and limited sample size. The main side effect to ATT was temporary elevation liver enzymes without further complication, in 15.8%; similar to recent reports of 14.1% and 20%.[4, 11]

CONCLUSIONS For our study population, manifest presumed ocular TB frequently occurred in chronic uveitic cases with macular edema. Treatment with steroids, immunosuppressants, and ATT was safe and effective. Prompt, aggressive medical immunosuppression improves uveitis outcome.[27] In our series, it reduced ocular inflammation, controlled macular edema, and at conserved visual function for at least six months. REFERENCES 1. Bramante CT, Talbot EA, Rathinam SR, Stevens R, Zegans ME: Diagnosis of ocular tuberculosis: a role for new testing modalities? Int Ophthalmol Clin 2007, 47(3):45-62. 2. Sharma A, Thapa B, Lavaju P: Ocular tuberculosis: an update. Nepal J Ophthalmol 2011, 3(5):52-67. 3. Kurup SK, Buggage RR, Clarke GL, Ursea R, Lim WK, Nussenblatt RB: Gamma interferon assay as an alternative to PPD skin testing in selected patients with granulomatous intraocular inflammatory disease. Can J Ophthalmol 2006, 41(6):737-740. 4. Raviglione MC OR: Tuberculosis. In Harrison's Principles of Internal Medicine. 18th edition. Edited by Anonymous New York: McGraw-Hill; 2011:. 5. Yew WW, Leung CC: Update in tuberculosis 2007. Am J Respir Crit Care Med 2008, 177(5):479-485. 6. Cardona PJ, Ruiz-Manzano J: On the nature of Mycobacterium tuberculosis-latent bacilli. Eur Respir J 2004, 24(6):1044-1051. 7. Anonymous Global tuberculosis control: WHO report 2011. In Edited by Anonymous Geneva, Switzerland: World Health Organization; 2011:[Anonymous ]

Figures 1. OCT images at referral and 6 months after treatment

This research was supported with an educational scholarship by SECOIR and AJL, Spain.

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Memoria de Investigaciﾃｳn y Docencia. Aﾃ前 2012 | COMUNICACIONES AL CONGRESO ARVO

Supported in part by a grant from Fundaciﾃｳn Cristina Masaveu Peterson & CajAstur. P. de Asturias. Spain

Susana del Olmo-Aguado1,2 and Neville N Osborne1 1Fundación

de Investigación Oftalmológica. Instituto Oftalmológico Fernández-Vega. Oviedo (Spain). 2University of Oviedo, Oviedo, Spain

INTRODUCTION Previous studies have shown that light impinging on the retina in situ has the capacity to kill neuronal and non-neuronal cells in vitro by interacting directly with mitochondrial constituents. A number of fluorophores are associated with mitochondria which can potentially absorb different wave-lengths of light, and includes cytochrome oxidase which is part of the mitochondrial complex IV system or various forms of flavin proteins which include complex I and complex II. The aim of the present study was to gain further insight as to how RGC-5 cells die in culture and investigate whether specific wavelengths of light affect defined oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes of mitochondria.

The localisation of cytochrome c (green, A and D) and Mitotracker (red, B and E) in RGC-5 cells maintained in the dark (A, B, C) or after a blue light insult (400lux for 12 hours) (D, E, F). Cytochrome c is located to mitochondria and co-localises with Mitotracker in the dark maintained cells (A, B, C). A light insult clearly shows that some cytochrome c is now located outside Mitotracker stained mitochondria and present in the cytosol (D, E, F).

MATERIALS & METHODS Semi-confluent cultures of RGC-5 (a cell line with certain ganglion cell properties) cells were exposed to blue (465-470nm, 400 lux), white (400-800nm, 1000 lux) or red (625-635nm, 1000 lux) light over 24 or 48 hours. Thereafter cells in 96-well plates were analysed for viability (MTT procedure) and their inner membrane potential (JC-1). Proteins from cells in culture were also extracted and individual OXPHOS complexes quantified by electrophoresis/western blotting. RGC-5 cells on coverslips were also processed for the localisation of mitochondria (mitotracker) or the presence of cytochrome-c. In addition immunocytochemistry was used to localise individual OXPHOS complexes.

RGC-5 cell survival in culture following exposure to either blue (465-470nm, 400 lux), white (450-700nm, 1000 lux) or red (625-635nm, 1000 lux) light over 24 and 48 hour.

CII

CIII

CIV

Panel shows how individual mitochondrial complexes in RGC-5 cells are affected following a blue light insult (400 lux, 24 hours) using western blot and inmunocitochemistry analysis. Figure shows results for NADH ubiquinone oxidoreductase (complex I, CI) where antibodies that either recognises complex I subunit NDUFB8 or NDUFV1 were used. It can be seen that blue light caused a small but significant increase in complex I when using an antibody for the NDUFV1 subunit. Results for succinate dehydrogenase complex protein (complex II, CII) show that blue light caused a down-regulation of complex II. Ubiquinol cytochrome c oxidoreductase complex protein (complex III, CIII) appear up-regulated by blue light. Cytochrome c oxidoreductase complex protein (complex IV, CIV) is also up-regulated. Results are mean values ± SEMs where n=4 and significant (* p < 0.05) values were determined by a Student’s paired t-test.

Memoria de Investigación y Docencia. AÑO 2012 | COMUNICACIONES AL CONGRESO ARVO

782/A659

SUMMARY OF RESULTS AND CONCLUSIONS Blue and white light caused a loss of cell viability with blue light being much more effective. Red light had a negligible influence on cell viability. Double staining of cells with DAPI and either JC-1, mitotracker or cytochrome-c showed that blue light caused a change in the membrane electrochemical potential, mitochondrial morphology and the release of mitochondrial located cytochrome-c into the cytoplasm. Analysis of individual OXPHOS complexes by immunocytochemistry and western blotting showed differential effects. Complex II is down-regulated and complex I unaffected or shightly up-regulated , while complex III, IV and V are upregulated. Of the light that impinges on the retina, the blue light component in particular affects mitochondrial functions negatively as might occur with the many mitochondria located to ganglion cells in situ. The present studies also suggest that blue light has an influence on fluorophores associated with complex II, III, IV and V of mitochondrial OXPHOS. Susana del Olmo Aguado and Neville N. Osborne acknowledge the following institutions for their support:

This figure shows that a blue light insult (400 lux for 12 hours) (B) to RGC-5 cells causes a change in mitochondrial inner membrane electrochemical potential by use of JC-1 dye while is not the case in cells maintained in dark condictions.

M. Garcia1, L. Alvarez1, H. González1, M. Coca-Prados1,2 1Fundación

de Investigación Oftalmológica. Instituto Oftalmológico Fernández-Vega, Oviedo (Spain). of Ophthalmology and Visual Science, Yale University School of Medicine, New Haven, CT (USA).

INTRODUCTION 1. Heat Map of tissue-specific ocular genes.

3. Hypothalamic-pituitary axis in the human eye Hypothalamus

MATERIALS & METHODS

Releasing hormone

A total of six pairs of whole globes (12 eyes) from adult normal donors (cadavers), ranging in age from 66 to 80 years old, were used in this study. Eyes were obtained through the National Disease Research Interchange, (Philadelphia, PA). The procedures conformed to the tenets of the Declaration of Helsinki. Each eye was dissected 24h postmortem into 8 tissues: cornea, trabecular meshwork (TM), iris, lens, ciliary body (CB), retina, retinal pigment epithelium (RPE), and sclera. Total RNA was isolated from each tissue with TRIzol® Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA), and further purified with RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). RNA concentration was determined using a Picodrop microlitre spectrophotometer (Picodrop, Cambridge, UK). The quality of the RNA was verified with a bioanalyzer, and samples with RIN scores above 7.5 were further processed to examine the whole-genome expression profiling using the Illumina BeadChip array platform (HumanHT-12 v4.0 Expression BeadChip Kit) (Illumina, San Diego, CA). cRNA labeling and hybridization to the chip and array data analysis were carried out at the Genome Analysis Platform (CIC bioGUNE, Derio, Spain). Hierarchical cluster analysis was performed with ArrayStar software, version 4 (DNASTAR, Inc, Madison, WI). Gene Ontology and Pathway analysis were performed by The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID).

TRH (Retina)

CONCLUSIONS We have generated the transcriptomes of all the human ocular tissues from single eyes, and identified clusters of genes that are restricted to each tissue. The microarray data analysis of the transcriptome profiles revealed the identification of components of a hypothalamic-pituitary-thyroid axis in the eye, suggesting the presence of physiological processes involved in the metabolic control of thyroid hormones and neuro-endocrine signaling.

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Target Gland

Stimulating hormone

Target gland hormone Thyroid hormones Arbitrary units (AU)

3.1 Hypothalamic-pituitary–prolactin axis PRL (Retina), PRLR (Iris)

GNRH GNRH1 (Retina) GNRHR (Lens)

FSH

3.2 Hypothalamic–pituitary–gonadal axis

Fig 3. Hypothalamic-pituitary axis in the human eye. Components of the hypothalamicpituitary axis are expressed in human ocular tissues, suggesting potential neuro-endocrine communication systems. 3.1 Hypothalamic-pituitary-prolactin axis: TRH : thyrotropin-releasing hormone, PRL: prolactin; PRLR: prolactin receptor; TSH: thyroid stimulating hormone. 3.2 Hypothalamic-pituitary-gonadal axis: GNRH1: gonadotropin-releasing hormone 1; GNRHR: gonadotropin-releasing hormone receptor; FSH: follicle stimulating hormone; LH: luteinizing hormone.

4. Thyroid hormones in the eye TG (Precursor of T3 and T4)

Fig 1. Hierarchical cluster and Heat Map of genes expressed in human ocular tissues. The row at the top shows the clustering information in the form of a dendogram and the similarity relationships among tissues. A total of 52 biological replicas were processed by microarray and analyzed: cornea (6), trabecular meshwork (TM) (5), iris (6), ciliary body (CB) (10), retinal pigment epithelium (RPE) (6), sclera (3), lens (8), and retina (8). The column at the left of the heat map shows clusters of genes expressed at different abundance. The data analysis was performed with ArrayStar (Lasergene) software. This analysis reveals tissue specific gene clusters in human ocular tissues.

TPO Lens

2. Gene Ontology of tissue-specific ocular genes. P-value 3.79E-07 5.98E-04 6.73E-04 5.84E-04 6.43E-04 7.37E-04 3.15E-04 3.96E-10 5.84E-08 6.05E-05 6.43E-05 1.17E-04 3.68E-04 4.90E-04 4.90E-04 5.94E-04 6.82E-04 9.12E-04

DIO3 DIO1 RT3 Inactivation

DIO1, DIO2

THRA (receptor of T3) THRB (receptor of T3)

DIO3 DIO1 T2

Not detected in the eye

Inactivation 4.1 Activation/ Inactivation of thyroid hormones Arbitrary units (AU)

Tissue Description Epidermis development Cornea Cell junction organization Tissue development Neuropeptide signaling pathway TM Response to pain Muscle organ development Iris Cartilage condensation Lens development in camera-type eye Visual perception, sensory perception of light stimulus, sensory perception Lens Neurological system process Cellular biogenic amine catabolic process Sodium ion transport Monovalent inorganic cation transport Positive regulation of vasodilation CB Vasodilation Receptor-mediated endocytosis Vitamin transport Regulation of biological quality Sensory perception of light stimulus, visual perception, vision, sensory perception, cognition, sensory transduction Detection of light stimulus, phototransduction, detection of abiotic stimulus, detection of external stimulus, detection of stimulus, response to light stimulus Ion transport, cation transport Cell morphogenesis, cell projection organization, cell morphogenesis involved in neuron differentiation, cell morphogenesis involved in differentiation, cell projection Retina morphogenesis, cellular component morphogenesis, cell part morphogenesis, neuron projection development, axonogenesis, neuron projection morphogenesis Metal ion transmembrane transporter activity, ionic channel, substrate specific channel activity, cation channel activity, channel activity, ion channel activity, passive transmembrane transporter activity Calcium transport, di-, tri-valent inorganic cation transport, calcium ion transport Synaptic transmission, transmission of nerve impulse, cell-cell signaling Angiogenesis, blood vessel development, angiogenesis, vasculature development, RPE blood vessel morphogenesis, extracellular region part, developmental protein, differentiation Striated muscle contraction, muscle contraction, muscle system process Sclera Sarcomere, myofibrili, contractile fiber part, contractile fiber part, contractile fiber

Not detected in the eye

Deiodination (Activation)

Arbitrary units (AU)

Comparison of transcriptomes of same tissue-type from one eye and its contralateral eye revealed small or no significant differences. However, it showed significant variability in the relative abundance of gene expression among donors. The analysis of microarray data revealed the identification of clusters of genes highly restricted to a specific tissue (see Fig 1, Fig 2). We detected the expression of genes encoding components of the hypothalamic-pituitary-thyroid axis (see Fig 3), including thyrotropin-releasing hormone (TRH) and prolactin (PRL) in the retina, and the prolactin receptor (PRLR) in the iris (see Fig 3.1). We also detected the expression of gonadotropin-releasing hormone (GNRH1), in the retina; and gonadotropin-releasing hormone receptor (GNRHR) in the lens (see Fig 3.2), suggesting the potential synthesis and secretion, within the eye, of mediators of steroidogenic functions. Finally, we found expression of genes involved in the synthesis of thyroid hormones, triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4). These are important homeostatic regulators, acting via nuclear thyroid hormone receptors (THRA and THRB), in virtually all tissues during development and throughout postnatal life. Within the eye we detected the gene expression of components of thyroid signaling, including thyroid transporters and enzymes involved in the synthesis and metabolism of thyroid hormones: i) THRA, in all ocular tissues (see Fig 4.4); ii) Thyroid peroxidase (TPO), in the lens (see Fig 4.3); iii) SLC16A12, a membrane bound transporter of T3, in RPE>retina>sclera>CB>cornea (see Fig 4.2); iv) Type-2 deiodinase (DIO2), in TM>CB>RPE>iris>sclera>cornea>retina; and Type-2 deiodinase (DIO3), in CB (see Fig 4.1). The expression of DIO3 in the CB, an enzyme involved in the inactivation of the thyroid hormones T3 and T4, suggested a role in thyroid hormone homeostasis by protecting tissues in the anterior segment of the eye from an excess of thyroid hormones. Recent studies have shown that the development of cones required their protection from thyroid hormones by over-expressing DIO3 (Ng et al 2010). Our present observations suggested that there is a potential intraocular site of synthesis of thyroid hormones, independent from the thyroid gland.

Pituitary gland TSH (Not detected in the eye)

4.2 Synthesis of thyroid hormones Arbitrary units (AU)

RESULTS

Arbitrary units (AU)

The purpose of this work was: i) to compare same tissue-type transcript profiles from the eyes of the same donor; ii) to identify tissue-specific genes; iii) and to identify novel neuro-endocrine axis networks.

1576/D797

4.3 Thyroid receptors

3.00E-21

4.4 Transporters of T3 and T4

1.60E-12 4.40E-09 6.10E-07

2.00E-06

SLC16A12

16000

Arbitrary units (AU)

2Department

Arbitrary units (AU)

YALE UNIVERSITY School of Medicine

Arbitrary units (AU)

Memoria de Investigación y Docencia. AÑO 2012 | COMUNICACIONES AL CONGRESO ARVO

Transcriptomes Analysis of Normal Eye Donors: Discovery of TissueSpecific genes and Identification of Neuro-Endocrine Systems.

14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

1.10E-06 1.30E-06 4.40E-05 5.40E-07 1.20E-05

Fig 2. Functional classification. Gene Ontology categories of tissue specific genes in ocular human tissues. Top DAVID annotated biological processes including the EASE score (p-value). Supported by: CENIT-CeyeC research grant CEN-20091021 from the Spanish Ministry of Innovation and Development, Fundación de Investigación Oftalmológica Fernández-Vega, Fundación Ma Cristina Masaveu Petterson, Fundación Rafael del Pino, and Programa Jovellanos (FYCIT, PCTI).

Cornea

Iris

Lens

Retina

RPE

Sclera

Fig 4. Thyroid hormones and metabolism in the eye. Levels of gene expression (in arbitrary units) of different components involved in the synthesis of thyroid hormones and their metabolism in human ocular tissues. 4.1. Activation/Inactivation of thyroid hormones: DIO1: type I, iodothyronine deiodinase; DIO2: type II, iodothyronine deiodinase; DIO3: type III, iodothyronine deiodinase. 4.2. Synthesis of thyroid hormones: TG: thyroglobulin; TPO: thyroid peroxidase. 4.3. Thyroid receptors: THRA: thyroid hormone receptor, alpha; THRB: thyroid hormone receptor, beta. 4.4. Transporters involved in the cellular uptake of T3 (triiodothyronine) and T4 (thyroxine): i) sodium iodide symporter (SLC5A5); ii) sodium/bile acid cotransporter (SLC10A3); iii) solute carrier organic anion transporters (SLCO2A1, SLCO2B1, SLCO3A1, SLCO4A1); iv) amino acid transporter light chain, L system (SLC7A5, SLC7A6, SLC7A8); v) activators of dibasic and neutral amino acid transport (SLC3A2); vi) monocarboxylic acid transporters (SLC16A2, SLC16A3, SLC16A8, SLC16A12).