Vega memoria web 05 05 15 by Instituto Oftalmológico Fernández-Vega

Memoria de investigaci贸n y docencia

2014

Memoria de Investigación y Docencia 2014

Índice

1. Carta del Presidente del Patronato Prof. Luis Fernández-Vega Sanz

2. Carta del Director de Investigación Dr. Jesús Merayo Lloves

3. Estructura Organizativa de la Fundación de Investigación Oftalmológica

Área de Investigación 4. Investigación básica y traslacional 13 4.1. SUPERFICIE OCULAR Y CÓRNEA 13 PROYECTO 1 Características morfológicas (P1.1) y funcionales (P1.2) de las terminaciones sensoriales corneales: efectos del envejecimiento, de la sequedad ocular y de la lesión quirúrgica. 17 PROYECTO 2 Activación y modulación farmacológica de receptores de dolor. 21 PROYECTO 3 Efectos tróficos de los nervios sensoriales sobre el tejido corneal en condiciones de normalidad y tras la lesión. Identificación de nuevos neuropéptidos y sus receptores en la córnea. 21 PROYECTO 4 Medicina regenerativa experimental de la córnea: Nanotecnología aplicada a la Oftalmología. 22 PROYECTO 5 Eficacia de derivados sacarídicos como agentes regenerativos de la córnea (Cacicol, INDREYE y SILCOR). 23 PROYECTO 6 Terapia celular de la córnea: Actividad reparadora de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. 25 PROYECTO 7 Estudio experimental del Queratocono: modelos experimentales, biomarcadores y fenotipos de queratocitos. 25 PROYECTO 8 Repercusiones oculares en un modelo de hipoxia intermitente en ratón como simulación del Síndrome de Apnea e Hipopnea del Sueño. 28 PROYECTO 9 Desarrollo y optimización de córneas por medio de Terapias Avanzadas y nuevos materiales derivados de la seda para su empleo en reconstrucción de la superficie ocular y queratoplastias. 30 PROYECTO 10 El trasplante de córneas en el siglo XXI. Estructura y logística de un futuro Banco de Tejidos en Oftalmología. 35 PROYECTO 11 Nuevos abordajes para el diagnóstico, tratamiento y regeneración de la patología de la superficie ocular. 38 PROYECTO 12 Biorreactores con sensores integrados para la monitorización del crecimiento celular en terapias avanzadas. 39 4.2. UNIDAD DE NEUROBIOLOGÍA DE LA RETINA

PROYECTO 1 La luz roja de baja intensidad atenúa los efectos negativos de la isquemia/reperfusión en la retina. 49 PROYECTO 2 La luz roja de baja intensidad atenúa la desorganización endotelial. 50

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PROYECTO 3 Proyecto Retineta. Retos de la sociedad 2014.

PROYECTO 4 Resultados preliminares de la aplicación de Rapamicina en los procesos de isquemia/reperfusión.

4.3. UNIDAD DE GENÉTICA OCULAR

PROYECTO 1 Validación de biomarcadores proteicos de glaucoma mediante

espectrometría de masas molecular. 59

PROYECTO 2 Biomarcadores genéticos del GPEX: Estudio de haplotipos del gen LOXL1 y su relación con el GPEX en la población española. 60 PROYECTO 3 Estudios de haplotipos del gen CFH y su relación con la degeneración de la mácula a sociada a la edad (DMAE) en la población española y búsqueda de biomarcadores génicos. 62 5. Unidad de Investigación Clínica 64 5.1. Grupo de Segmento Anterior: Superficie Ocular, Córnea, Cirugía Refractiva y Cristalino. 64 5.2. Grupo de Vítreo-Retina. 68 5.3. Grupo de Glaucoma. 70 Área de Docencia 6. Actividad docente 73 6.1. Estudios de Pregrado 74 6.2. Estudios de Post-Grado 74 6.3. Otros Estudios 80 6.4. Profesorado 80 7. Mecenazgo y participación en proyectos con financiación competitiva 81 7.1 Mecenazgo 81 7.2. Proyectos con financiación competitiva 84 8. Divulgación de la Investigación 91 8.1. Artículos Originales 91 8.2. Publicaciones Libros 92 8.3. Comunicaciones Congreso 2014 93 8.4. Comunicaciones Congreso ARVO 2014 94 8.5. Comunicaciones Congreso EVER 2014 95 Comunicaciones Presentadas en el Congreso ARVO 97 Comunicaciones Presentadas en el Congreso EVER 107

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Carta del Presidente del Patronato Prof. Luis Fernández-Vega Sanz La memoria de investigación y docencia de la FIO te permite volver la vista hacia atrás y comprobar como este proyecto que empezaba a caminar hace seis años se consolida en cada ejercicio y cumple sus objetivos fundacionales: profundizar en las bases fisiopatológicas de las enfermedades para mejorar la prevención, diagnóstico y tratamiento de las patologías que causan ceguera y alteraciones visuales. Además toda la actividad de investigación genera una alta capacidad de formación de investigadores de la que se benefician los alumnos de postgrado que están con nosotros durante el año académico. Con la idea que ha movido a varias generaciones de miembros de la familia Fernández-Vega referente a que la investigación de hoy es la curación del mañana seguiremos apoyando esta actividad investigadora, a pesar que a nadie se le escapa que en estos años de crisis económica el esfuerzo en financiar estas actividades no es tarea fácil. Como pueden comprobar en los datos que les presentamos a continuación ya tenemos resultados de la actividad propia y de acciones en colaboración con otros centros, que han sido publicadas en las revistas científicas de más impacto de nuestro área de conocimiento y han sido objeto de divulgación en los foros de más prestigio a nivel internacional como las reuniones de ARVO, EVER y a nivel nacional en los congresos de la Sociedad Española de Oftalmología o la de Cirugía Ocular Implanto-Refractiva. Un hecho diferencial de la FIO es la íntima relación con la actividad clínica, en este caso del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega. Esta comunicación permite actividades como la investigación en biomarcadores para el diagnóstico y tratamiento precoz de enfermedades, como el glaucoma o el queratocono, y la investigación en neuroprotección para conocer mejor los mecanismos de daño retiniano, y su progresión en las enfermedades que causan más ceguera en nuestro medio. Por último quiero agradecer el esfuerzo económico que realizan empresas y fundaciones de nuestro entorno y la colaboración desinteresada de los pacientes del Instituto que colaboran con las actividades de la FIO. A todos los que hacen posible el trabajo de la FIO, muchas gracias.

Prof. Luis Fernández-Vega Sanz Catedrático de Oftalmología de la Universidad de Oviedo Presidente de la Fundación de Investigación Oftalmológica

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Carta del Director de Investigación Dr. Jesús Merayo Lloves Se le atribuye a Pablo Picasso el dicho “La inspiración existe, pero tiene que encontrarte trabajando” y es un buen ejemplo para la actividad investigadora que se desarrolla en la FIO. Cuando se empieza un proyecto como el encargado por el Prof. Luis Fernández-Vega hace seis años se pasa una travesía del desierto hasta que los resultados son evidentes fuera de los laboratorios. En esta memoria del año 2014 se puede comprobar a través de las publicaciones, las comunicaciones científicas y los proyectos de investigación en los que trabajamos que se está aportando nuestro granito de arena para conocer mejor ciertas enfermedades oculares y obtener nuevos productos o servicios para resolver necesidades de los pacientes, que hasta ahora no han sido cubiertas. La FIO ha obtenido financiación en proyectos regionales del Gobierno del Principado de Asturias, nacionales y europeos compitiendo con los mejores grupos de investigación de nuestro entorno. También logra la confianza de la industria del sector para la realización de ensayos clínicos y proyectos de investigación más cercanos al laboratorio. Esta consolidación se consigue con el esfuerzo y trabajo diario de un equipo multidisciplinar que ha sabido optimizar los recursos y, también, gracias a las estrategias de colaboración con centros con los que compartimos la vocación investigadora. Como no podía ser de otra manera, cabe destacar la relación con la Universidad de Oviedo con la que compartimos diversos proyectos de investigación, y con la que se realizan 10 programas de postgrado, de forma que oftalmólogos, enfermeros, ópticos-optometristas e Investigadores realizan sus estudios de Doctorado, Master, o Experto Universitario aprovechando el potencial docente de los proyectos y la actividad clínica. Esta actividad docente también nos ayuda a ser mejores profesionales y a atraer nuevos talentos a nuestro proyecto. También podrán comprobar en la memoria, que en este camino no estamos solos pues tenemos el privilegio de poder contar con el apoyo de otras fundaciones e instituciones y también de pacientes que hacen posible que, con su ayuda económica, podamos llevar a buen fin nuestro trabajo. Queremos dejar constancia de nuestro agradecimiento a todos ellos y asegurarles que la inspiración nos va a encontrar trabajando, y que así lo vamos a poder mostrar al presentarles una memoria todavía mejor para el año 2015.

Dr. Jesús Merayo Lloves Profesor Titular de Oftalmología de la Universidad de Oviedo Director de Investigación y Docencia de la Fundación de Investigación Oftalmológica

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Estructura Organizativa de la Fundación de Investigación Oftalmológica Dirección de la Fundación de Investigación Oftalmológica PATRONATO Presidente

Prof. Luis Fernández-Vega

Secretaria

Dña. María Victoria Cueto-Felgueroso

Vocales

D. Álvaro Fernández-Vega y D. Javier Fernández-Vega

DIRECCIÓN DE INVESTIGACIÓN Y DOCENCIA

Dr. Jesús Merayo

EQUIPO ASESOR, GERENCIA Y GESTIÓN Asesor del Presidente Prof. Carlos Belmonte

Gerencia

D. Gonzalo Macías y D. Guzmán Suárez

Administración D. Alfredo Cernuda

COMISIÓN DE INVESTIGACIÓN Dr. José F. Alfonso Prof. Carlos Belmonte D. Gonzalo Macías Dr. Jesús Merayo

Área de Investigación Investigación básica y traslacional INVESTIGADORES PRINCIPALES Prof. Carlos Belmonte Prof. Miguel Coca Dr. Álvaro Meana Dr. Jesús Merayo Prof. Neville Osborne

INVESTIGADORES POST-DOCTORALES

Dr. Ignacio Alcalde Dra. Lydia Álvarez Dra. Montserrat García Dr. Héctor González

INVESTIGADORES PRE-DOCTORALES Dña. Ana Fernández D. Omar González Dña. Almudena Iñigo Dña. Claudia Núñez Dña. Susana del Olmo Dña. Natalia Vázquez

BECARIOS PRE-DOCTORALES D. Federico Bech

Investigación Clínica y Ensayos Clínicos INVESTIGADORES PRINCIPALES Dr. José F. Alfonso Dr. Álvaro Fernández-Vega Dra. Beatriz Fernández-Vega Prof. Luis Fernández-Vega Sanz Dr. Jesús Merayo Dr. Pedro Pablo Rodríguez

INVESTIGADORES COLABORADORES Dr. Luis Fernández-Vega Cueto-Felgueroso Dr. José I. Blázquez Dr. Carlos Lisa Dr. Hussein Amhaz Dra. Mónica Fernández-Vega Dra. Eva Villota Dr. Manuel Riaño Dr. Miguel Naveiras Dr. Mariano Yllera Dra. Carmen González Dr. Ignacio Rodríguez

FARMACIA HOSPITALARIA Dña. Ana C. Riestra

INFORMÁTICA Y TECNOLOGÍA INFORMACIÓN D. Miguel A. Álvarez

DEPARTAMENTO DE ÓPTICA - OPTOMETRÍA D. Manuel Álvarez D. Alberto Barros

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Dña. Marta Casalvázquez Dña. Silvia García D. Javier Lozano Dña. Andrea Malanda Dña. Henar Morchón Dña. Ana Palacios Dña. Arancha Poo Dña. María Rueda D. Ignacio Serrano Dña. Beatriz Valcárcel Dña. Elena del Val Dña. Rebeca Martínez

DEPARTAMENTO DE ENFERMERÍA Dña. César Arias D. Francisco Gallego Dña. Montserrat Gancedo Dña. Adriana Gómez Dña. Elena González Dña. Tamara Fernández D. Avelino Ojanguren Dña. María Requejo Dña. Yoana Rodríguez Dña. Natalia Rodríguez

DEPARTAMENTO DE PRUEBAS DIAGNÓSTICAS Dña. Carmen Carús Dña. Nadiuska Ferreira Dña. Esther Iglesias Dña. Mirian Merino Dña. Clara Quiroga D. Emilio Tudela

DEPARTAMENTO DE ADMINISTRACIÓN Dña. Silvia Canga Dña. Gloria de la Torre D. Ramón Mayor

Área de Docencia RECURSOS HUMANOS Coordinador de Docencia Dr. Jesús Merayo

ProfesorAdo del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega, de la Fundación de Investigación Oftalmológica, de la Universidad de Oviedo y Profesores invitados OFERTA FORMATIVA PREGRADO Formación Práctica Alumnos de la Licenciatura y grado en Medicina Prácticas de Empresas de Estudiantes de Grado

OFERTA FORMATIVA POSTGRADO OFICIAL Colaboración en el Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud de la Universidad de Oviedo

OFERTA FORMATIVA EN TÍTULOS PROPIOS DE LA UNIVERSIDAD DE OVIEDO GESTIONADOS POR LA FIO Máster en Superficie Ocular, Córnea, Cristalino y Cirugía Refractiva Máster en Retina y Vítreo Máster en Glaucoma Máster en Optometría Clínica Máster en Enfermería Oftalmológica Máster en Terapias Avanzadas y Medicina Regenerativa Curso de Experto Universitario en Cirugía Aditiva de la Córnea Curso de Experto Universitario en Lentes Fáquicas Epicapsulares Programa de Formación Continuada en Ciencias de la Visión Otros estudios

Servicios Comunes TÉCNICOS DE LABORATORIO D. Manuel Chacón D. Enol Artime Dña. Paola Braga

SECRETARÍA TÉCNICA Gestión de Proyectos Dña. Gloria de la Torre

Gestión de Ensayos Clínicos Dña. Silvia Canga

Gestión Administrativa D. Ramón Mayor

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ÁREA DE INVESTIGACIÓN 12

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Investigación básica y traslacional 4.1 UNIDAD DE SUPERFICIE OCULAR Y CÓRNEA OBJETIVOS: La unidad de superficie ocular y córnea tiene como misión investigar los mecanismos fisiopatológicos básicos relacionados con el trofismo, la regeneración, la inflamación y las alteraciones en la inervación de la superficie ocular. Sus disfunciones son el origen de enfermedades como el síndrome de ojo seco (30% de la población) y el dolor ocular (para el que no existe tratamiento efectivo). La comprensión de estos mecanismos es imprescindible para abordar la medicina regenerativa, ya sea con la mejora de los trasplantes clásicos o con la innovación en medicina regenerativa ocular y en terapias avanzadas como la terapia celular o la ingeniería de tejidos. El fin último del trabajo en esta unidad es encontrar nuevos métodos diagnósticos y de tratamiento médico-quirúrgico que solucionen problemas clínicos no resueltos, y lograr transferir los resultados a la clínica para que se puedan beneficiar los pacientes cuanto antes. Así, ya se ha transferido a la clínica y hay pacientes que se están beneficiando de las aplicaciones oculares del colirio de plasma rico en factores de crecimiento, las nuevas formas de conservación y la personalización de los trasplantes de córnea o tratamientos del dolor ocular. En esta anualidad del 2014 se ha conseguido también realizar una patente sobre marcadores de enfermedades inflamatorias de la córnea que tendrán aplicación en el diagnóstico de queratocono y de otra patología inflamatoria de la superficie ocular.

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Investigadores principales

Prof. Carlos Belmonte Martínez

Catedrático de Fisiología en las Facultades de Medicina de las Universidades de Valladolid y Alicante, ha sido fundador del Instituto de Neurociencias de la Universidad Miguel Hernández y el CSIC. Es Académico de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales y de la Academia Europaea y Premio Nacional de Investigación Biomédica. Ha participado en el diseño y planificación de las actividades científicas de la Fundación desde su inicio, donde investiga las bases neurobiológicas de la sensibilidad y el dolor ocular.

Dr. Jesús Merayo Lloves

Director de Investigación de la FIO e Investigador Principal. Doctor en Medicina y Médico Especialista en Oftalmología. Alta especialidad (Fellowship) en Inmunología Ocular y Uveítis (Universidad de Harvard, USA) y Cirugía Refractiva (FOSCAL-UNAB, Colombia). Diplomatura en Óptica y Optometría (USP-CEU, Madrid) y Máster en Dirección de Empresas (EAP. Madrid). Investigador experto en superficie e inflamación ocular. Tiene más de 90 publicaciones y un índice H 19. EL Dr. Merayo es profesor titular de la Universidad de Oviedo.

Dr. Álvaro Meana Infiesta

Doctor en Medicina. Investigador experto en trasplantes de tejidos y terapias avanzadas. Es Director del Centro Comunitario de tejidos del Principado de Asturias e investigador de la Universidad de Oviedo en la “Catedra de Empresa ALCON de Innovación en cirugía de la emetropía”.

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Investigadores Post-doctorales: Dr. Ignacio Alcalde

Investigadores Pre-doctorales: Dña. Ana Fernández D. Omar González Dña. Almudena Iñigo Dña. Natalia Vázquez Dña. Ana Riestra

Becario Pre-doctoral: D. Federico Bech

Técnicos de Laboratorio: D. Manuel Chacón D. Enol Artime Dña. Paola Braga

Investigadores Colaboradores de la Universidad de Oviedo: Grupo de Investigación Consolidado de Oftalmología, Ciencias de la Visión, y Terapias Avanzadas. ((Govita) FC-15-GRUPIN14-141) Durante el año 2014 fue presentado y aprobado el Grupo de Investigación Consolidado formado por profesores e investigadores de la Universidad de Oviedo, que realizan colaboraciones y proyectos con la FIO. Los miembros de este grupo son: Prof. Luis Fernández-Vega Dr. Jesús Merayo Dr. José F. Alfonso Dra. Begoña Baamonde Dr. Álvaro Meana Dr. Luís Manuel Quirós Dra. Olivia García Dr. Fernando Vázquez Dra. Belén Joglar Dra. Beatriz García El 22 de diciembre de 2014, la Consejería de Economía y Empleo, resolvió conceder la cantidad de 128.000 € para el desarrollo de las actividades del Grupo, entre octubre del 2014 y el 31 de diciembre de 2017.

Instituto de Neurociencias del Principado de Asturias (INEUROPA): Los Investigadores de la FIO forman parte del Instituto Universitario de Neurociencias. Tienen proyectos de colaboración docente (proyecto de máster en Neurociencias) y, además, realizan proyectos de Investigación (Modelos experimentales de SAHS y ojo seco) con los Dres.: L. Jorge Arias Marta Méndez Natalia Arias

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Líneas de Investigación La unidad de investigación en superficie ocular y córnea organiza su actividad en 3 líneas de investigación que, durante el año 2014 han desarrollado 11 proyectos.

Línea de Investigación de Inervación Ocular P1 Características morfológicas (P1.1) y funcionales (P1.2) de las terminaciones sensoriales corneales: efectos del envejecimiento, de la sequedad ocular y de la lesión quirúrgica.

Medicina Regenerativa de la Superficie Ocular P4 Medicina regenerativa experimental de la córnea:Nanotecnología aplicada a la Oftalmología.

P2 Activación y modulación farmacológica P5 Eficacia de derivados sacarídicos de receptores de dolor. como agentes regenerativos de la córnea (Cacicol, INDREYE y SILCOR).

Ingeniería Tisular P9 Desarrollo y optimización de córneas por medio de Terapias Avanzadas y nuevos materiales derivados de la seda para su empleo en reconstrucción de la superficie ocular y queratoplastias. P10 El trasplante de córneas en el siglo XXI. Estructura y logística de un futuro Banco de Tejidos en Oftalmología.

P3 Efectos tróficos de los nervios sensoriales sobre el tejido corneal en condiciones de normalidad y tras la lesión. Identificación de nuevos neuropéptidos y sus receptores en la córnea.

P6 Terapia celular de la córnea: Actividad P11 Nuevos abordajes para el reparadora de las células madre diagnóstico, tratamiento y regeneración mesenquimales derivadas de tejido de la patología de la superficie ocular. adiposo.

P8 Repercusiones oculares en un modelo de hipoxia intermitente en ratón como simulación del Síndrome de Apnea e Hipopnea del Sueño.

P7 Estudio experimental del Queratocono: modelos experimentales, biomarcadores y fenotipos de queratocitos.

P12 Biorreactores con sensores integrados para la monitorización del crecimiento celular en terapias avanzadas.

Las patologías de la superficie ocular afectan a una creciente proporción de la población en los países desarrollados. Hay patologías que no tienen tratamiento curativo en el momento actual como son el dolor neuropático, las alteraciones del trofismo ocular, y enfermedades que afectan al envejecimiento y calidad de vida de la población como son el ojo seco (30% de la población) o el queratocono. A lo largo de su corta existencia, la Unidad de Superficie Ocular ha recopilado un número importante de muestras de tejidos oculares patológicos procedentes de la actividad clínica del IOFV. Pronto se hizo necesaria la creación de una colección de muestras biológicas debidamente gestionada. Se han colectado más de 2.000 muestras en estos años. Estas muestras biológicas sirven actualmente como base para estudios encaminados a la caracterización de marcadores diagnósticos de distrofias corneales tales como el queratocono. A finales de 2009 comenzaron los trabajos de investigación del grupo con el establecimiento de un modelo animal de lesión corneal y regeneración tisular. Se utilizó un láser excímer para producir una lesión uniforme por ablación de tejido corneal similar a la PRK (Photo Refractive Keratectomy). Este modelo experimental ha servido como base para la implantación de una productiva línea de investigación en nuestro laboratorio que cuenta con numerosos proyectos de colaboración financiados. A continuación se resumen los avances más significativos alcanzados en los distintos proyectos de investigación del grupo durante 2014:

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PROYECTO 1 Características morfológicas (P1.1) y funcionales (P1.2) de las terminaciones sensoriales corneales: efectos del envejecimiento, de la sequedad ocular y de la lesión quirúrgica. PROYECTO 1.1 MORFOLOGÍA Los receptores nerviosos de la córnea están involucradas en la regulación de la secreción lacrimal y en la aparición de sensaciones dolorosas. La sensación de sequedad ocular aparece mayoritariamente en personas de avanzada edad y parece estar relacionada con la alteración de la actividad de un tipo determinado de terminaciones nerviosas. Los mecanismos nerviosos responsables del mantenimiento de una película lacrimal normal son todavía desconocidos. Comprender estos mecanismos regulatorios es muy importante, ya que parecen estar directamente relacionados con la aparición del síndrome de ojo seco. Las neuronas responsables de la regulación de la secreción lacrimal basal, es decir, del mantenimiento de una correcta hidratación de la superficie del ojo, tienen sus terminaciones receptoras en la conjuntiva y sobre todo en la córnea, que es la estructura con mayor cantidad de terminaciones sensitivas del cuerpo humano con más de 600 terminales por mm2. Nuestro grupo descubrió recientemente que las terminaciones de las neuronas responsables de la percepción del frío en la superficie ocular contribuyen a la regulación de la hidratación ocular. Estas neuronas presentan un canal iónico específico (TRPM8) que se ha dado en llamar el sensor molecular del frío. La alteración de las fibras nerviosas responsables de la sensación de frío podría ser responsable de la aparición de patologías relacionadas con la sequedad ocular en la superficie corneal y evocar sensaciones dolorosas o participar en procesos de inflamación. Así parecen indicarlo los estudios de la sensibilidad ocular en humanos, que muestran que los pacientes con enfermedad de ojo seco tienen alterada la sensibilidad corneal. En el caso de la sensación de frío, cuando los pacientes de ojo seco son expuestos a un estímulo frío (un pequeño flujo de aire frío dirigido a la córnea mediante un Estesiómetro de Belmonte) sus terminaciones sensitivas no reciben este estímulo como frío, sino como una sensación molesta, perciben sequedad y “arenilla en el ojo”. Muchas personas sienten esas molestias como dolor ocular cuando son expuestas a flujos de aire de temperaturas normales de “frío” (aire a 27° C). A nivel estructural, a medida que aumenta la edad, la morfología y el número de las fibras nerviosas de la córnea sufren grandes cambios. Durante este año se profundizó en el estudio de las neuronas receptoras de frío en nuestros modelos experimentales. Se consiguió la caracterización de dos tipos de receptores de frío en la córnea con funciones diferentes. La degeneración selectiva de las fibras TRPM8 de tipo I está relacionada con una desregulación en la secreción lagrimal basal en los animales de avanzada edad. Otras fibras (TRPM8 tipo II) presentan algunas características neuroquímicas y electrofisiológicas que las hacen candidatas a tener un papel importante en el componente inflamatorio o doloroso de la sequedad ocular. Estas fibras son las más abundantes en animales envejecidos. Las neuronas TRPM8 de tipo II presentan algunos marcadores clásicos de inflamación neurogénica como los péptidos CGRP o SP. Además, una de las características interesantes de parte de estas neuronas es su afinidad por factores de crecimiento nervioso. Las neuronas de tipo II expresan en su superficie el receptor de NGF de alta afinidad TrkA, que se relaciona también con procesos de inflamación neurogénica. Uno de los agonistas naturales del canal TRPM8 es el mentol. El mentol aplicado de forma tópica sobre la piel evoca sensación de frescor. Este efecto está mediado por la activación específica del canal TRPM8. Además, el mentol ha sido utilizado tradicionalmente como agente analgésico, antiprurinérgico o antiséptico en numerosos productos farmacéuticos. El efecto analgésico y antiinflamatorio local atribuible a la aplicación de mentol o a la acción del frío viene mediada por la modulación del canal TRPM8 y el correcto balance entre los dos tipos neuronales involucrados. Es posible que la desregulación del sistema neural de percepción de frío vía TRPM8 signifique la aparición de sensaciones molestas o dolorosas y que el sistema pueda ser “reparado” mediante la correcta modulación farmacológica de los factores. La presencia del receptor de NGF (TrkA) y de otros receptores de neurotrofinas como GDNF (en las neuronas de tipo I y sus terminales en la córnea) podría tener un papel importante en la neuroprotección ante la degeneración progresiva de las fibras nerviosas en el ojo seco. Los resultados de estos experimentos serán publicados próximamente en una revista de alto índice de impacto.

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aImplication of TRPM8 corneal cold sensory nerves in the development of dry eye symptoms in aged mice. Alcalde I, Íñigo-Portugués A, Fernández O, González-Coto AF, Alonso-Ron C, Artime E, Gallar J, Merayo-Lloves J, Belmonte C In preparation to send to Brain.

Neuronas del ganglio trigémino responsables de la sensación de frío en la superficie corneal (en verde). Se distinguen dos poblaciones diferentes de neuronas de respuesta a frío. Cada una de ellas presenta propiedades neuroquímicas distintas. En la línea superior se aprecian los dos tipos de neuronas diferenciados según su intensidad y la presencia del marcador periferina (en rojo). La fila inferior muestra en rojo las neuronas que contienen el neuropéptido CGRP (relacionado con dolor e inflamación) y su asociación con las neuronas TRPM8 (verde). Las neuronas visualizadas en azul emiten directamente sus prolongaciones terminales hacia la córnea y han sido identificadas mediante el trazador neuronal Fast Blue.

Los estudios derivados de esta línea de investigación forman parte de un proyecto subvencionado por el Ministerio de Economía y Competitividad en su convocatoria de 2011 (MICINN), coordinado por la Dra. Juana Gallar y que cuenta con el asesoramiento del Prof. Carlos Belmonte. aBases neurales fisiopatológicas del ojo seco: canales iónicos implicados en la alteración de la actividad de los nervios sensoriales y las sensaciones oculares anormales. Ministerio de Economía y Competitividad. Proyectos de Investigación Fundamental no Orientada. SAF2011-22500 Investigador principal: Juana Gallar Martínez En un sistema de análisis in vitro de neuronas trigeminales sensibles a frío se pueden evaluar los procesos moleculares asociados a TRPM8 que están implicados en la aparición del dolor ocular y en la inflamación neurogénica. De esta manera se ha comprobado que las neuronas que contienen TRPM8 en cultivo son sensibles a la adición de determinados factores de crecimiento como NGF, que promueven su supervivencia y crecimiento en situaciones de estrés celular. Así, será posible avanzar en la comprensión de este complejo sistema para diseñar una terapia neuroprotectora o reparadora sobre las terminaciones nerviosas de la superficie ocular alteradas por procesos patológicos como el ojo seco.

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Cultivo de neuronas de ganglio trigémino entre las que hay neuronas TRPM8 (visualizadas en verde-amarillo). Se ha utilizado un marcador rojo para cuantificar las emisiones protoplasmáticas de las neuronas en respuesta a diferentes factores de crecimiento. La imagen A corresponde a un cocultivo de neuronas trigeminales y células epiteliales de la córnea, en la que podemos observar la estrecha asociación entre los tipos celulares. Las imágenes B y D corresponden a experimentos en los que no se añadió factor de crecimiento. En la imagen C se observa la emisión de un mayor número de prolongaciones desde las neuronas tras la adición de factores de crecimiento específicos. Se puede observar que la emisión de filopodios es selectivamente más potente en las neuronas que tienen TRPM8 (verde-amarillentas).

Estos estudios se realizan gracias a la colaboración en investigación con la Obra Social La Caixa, que financia parte de estos trabajos desde 2014: aRegulación del canal de frío TRPM8: nuevas estrategias para la modulación del dolor ocular en la enfermedad de ojo seco. Obra Social La Caixa Convenio de colaboración en investigación Investigador principal: Ignacio Alcalde Los nuevos hallazgos en las características morfológicas y neuroquímicas de este modelo de estudio de ojo seco han sido presentados en congresos internacionales y nacionales: aDecreased basal tear in aged mice is linked to morphological and functional changes of corneal cold sensory nerve fibers. Íñigo-Portugués Almudena, Alcalde Ignacio, González-González Omar, Gallar Juana, Belmonte Carlos, Merayo-Lloves Jesús. 2014 European Association for Vision and Eye Research (EVER) Annual Meeting. Niza, (Francia), octubre de 2014. Cambios morfológicos y funcionales en las fibras nerviosas sensoriales de frío presentes en córneas de ratones ocurren junto con una disminución de la lágrima basal asociada a la edad. aJesús Merayo-Lloves, Almudena Íñigo-Portugués, Ignacio Alcalde Domínguez, Omar González-González. 90 Congreso de la Sociedad Española de Oftalmología (SEO). Bilbao, octubre de 2014.

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PROYECTO 1.2 FUNCIÓN Estudio electrofisiológico de la inervación sensorial corneal. Para llevar a cabo este proyecto, la Unidad de Superficie Ocular está dotada en el laboratorio II de un sistema de registro electrofisiológico de terminaciones sensoriales únicas (“single nerve terminal recording”) originalmente descrito por el Prof. Carlos Belmonte y cedido por el Instituto de Neurociencias de Alicante a la Fundación de Investigación Oftalmológica. Mediante este sistema de registro neuroelectrofisiológico se han llevado a cabo los siguientes proyectos. Se trata de un proyecto a cuatro años donde se realizan las siguientes actividades.

1.2.1 Efecto de los cambios de osmolaridad sobre terminales sensoriales de la córnea y su importancia en la génesis de sensaciones de sequedad ocular. Los termo-receptores corneales de frío parecen jugar un papel esencial en el mantenimiento de la secreción basal de la lágrima, como nuestro grupo de investigación demostró recientemente en colaboración con el Instituto de Neurociencias de Alicante (Parra et al., Nature Medicine, 2010). Recientemente, hemos obtenido datos conjuntos que sugieren también que los receptores corneales de frío median la sensación de sequedad en el ojo. Dado que en el ojo seco se ha detectado un aumento de la osmolaridad de la lágrima que se considera crítico para el inicio de la inflamación ocular en el ojo seco, hemos estudiado si este cambio de osmolaridad constituye un estímulo adicional a la génesis de las sensaciones de incomodidad y sequedad ocular típicas de esta enfermedad. En este estudio (en colaboración con el Dr. Andrés Parra) hemos obtenido datos experimentales que demuestran la existencia de una modulación de la actividad de las terminales corneales de frío por las variaciones de osmolaridad, de modo que las soluciones de NaCl con osmolaridad entre 300-360mOsm/L aumentan marcadamente las descargas de los termorreceptores de frío. Por el contrario, el registro en nociceptores polimodales de la córnea de ratón ha mostrado que estos sólo son estimulados por osmolaridades superiores a los 600mOsm/L. De ello se deduce que los termorreceptores de frío participan de modo más importante en la génesis de las sensaciones de dolor en el ojo seco. Se ha publicado el siguiente manuscrito: aTear fluid hyperosmolarity increases nerve impulse activity of cold thermoreceptor endings of the cornea. Pain. 2014. I.S.S.N. 0304-3959. Parra A.*, Gonzalez-Gonzalez O.*, Gallar J., Belmonte C.

1.2.2. Análisis electrofisiológico de las fibras sensoriales de la córnea en ratones transgénicos de canales TRP para comprobar el efecto en la sensibilidad ocular. El registro de terminaciones receptoras polimodales en la córnea de ratón no había sido posible hasta el momento. Durante los años 2013-2014 D. Omar González ha realizado la caracterización funcional y ha iniciado el estudio de los canales iónicos que sustentan la transducción de los diferentes tipos de estímulos en esta población de receptores de dolor, con la ventaja que representa la posibilidad de uso de ratones modificados genéticamente. Hoy en día se están registrando tanto los termo-receptores como los nociceptores polimodales en la córnea de ratón salvaje y en distintos animales modificados genéticamente (TRPV1, TRPA1, TRPM8) y se prepara un manuscrito describiendo las características funcionales de los receptores corneales en ratones silvestres y deprivados genéticamente de los canales TRPV1, TRPA1 y TRPM8: aFunctional properties of sensory receptor terminals of the mouse cornea. Gonzalez-Gonzalez O, Gallar J, Merayo-Lloves J, Belmonte C. (2015) Invest.Ophthal. Vis. Sci. (in preparation)

1.2.3. Estudio de la variación en número y actividad funcional de las fibras nerviosas corneales de frío en ratón con la edad. Como se cuenta en el proyecto 1.1., se han descubierto cambios en la morfología y en el número de las fibras corneales nerviosas que responden a frío entre ratones jóvenes y viejos. También, gracias a nuestras investigaciones, sabemos que existen dos poblaciones diferentes de fibras que responden al frío. Para completar ese estudio, se ha procedido al registro electrofisiológico de dichas terminales. Se han encontrado, corroborando los estudios previos, dos tipos funcionales diferentes de terminales corneales de frío en ratón: de alto y bajo umbral. Además, se ha estudiado la variación, en número, de cada tipo de terminales en ratones de 3 y 24 meses, observando la disminución con la edad de uno de los tipos. Con estos resultados se han enviado dos comunicaciones en forma de poster:

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aReduced Number And Altered Functional Activity Of Mouse Corneal Cold Sensory Nerve Fibers With Age Develop In Parallel With Decreased Basal Tearing. Gonzalez. O, Alcalde I, Iñigo-Portugués A, Gallar J, Merayo-Lloves J, Belmonte, C. ARVO ANNUAL MEETING 2014. aDecreased basal tearing rate developed with age is associated with reduced number and altered activity of corneal cold thermoreceptor fibers in mice. Gonzalez-Gonzalez O, Alcalde I, Iñigo-Portugués A, Gallar J, Belmonte, C., Merayo-Lloves J. 44th ANNUAL MEETING SOCIETY FOR NEUROSCIENCE

PROYECTO 2 Activación y modulación farmacológica de receptores de dolor. Para la evaluación de las terapias encaminadas a paliar el dolor y las molestias oculares que conlleva el síndrome de ojo seco, se ha desarrollado un método de estudio del comportamiento de los roedores que nos sirve para evaluar la eficacia analgésica de nuevos desarrollos farmacológicos. En este sentido, durante 2014 el Grupo de Superficie Ocular colaboró con la empresa Sylentis en el estudio de la eficacia de tecnologías de ARN de interferencia diseñadas específicamente para la modulación de los receptores TRP de dolor, sobre los modelos experimentales de lesión de la córnea desarrollados en la FIO. aEficacia del SYL1001 en un modelo experimental animal. Sylentis, Proyecto Innpacto INDRYE (en colaboración con la Universidad de Oviedo) Investigadores principales: Dra. Begoña Baamonde, Dr. Jesús Merayo Los resultados preliminares de estos ensayos nos permiten avanzar en el diseño de formulaciones terapéuticas más eficaces para el tratamiento del dolor ocular y postquirúrgico. Hasta el momento se sabe que el silenciamiento de la producción de ARN para los canales TRP relacionados con el dolor en la superficie ocular, es compatible con un proceso de reparación normal de la córnea y además promueve la restauración de algunos de los parámetros alterados en un modelo experimental de ojo seco neurodeprivativo.

PROYECTO 3 Efectos tróficos de los nervios sensoriales sobre el tejido corneal en condiciones de normalidad y tras la lesión. Identificación de nuevos neuropéptidos y sus receptores en la córnea. En años anteriores se estudió en profundidad la presencia de péptidos de origen sensorial o neuropéptidos en la córnea y su posible papel como mediadores de la inflamación neurogénica y durante los procesos reparativos de la córnea. Los neuropéptidos mayoritarios de la córnea son la sustancia P (SP), el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y la neurokinina A (NKA). Nuestros resultados previos demuestran un efecto antagónico entre la sustancia P y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) en una línea celular derivada del epitelio de la córnea central. Tras un análisis de la expresión de genes de córneas humanas, el equipo investigador se ha centrado en la expresión de dos péptidos clásicamente estudiados en el aparato digestivo: la colecistoquinina (CCK) y la gastrina (GAST). Se ha descrito la expresión de ambos genes y de sus receptores celulares tanto en la línea celular como en el epitelio corneal del ratón y en los cuerpos neuronales de las terminaciones nerviosas que lo inervan, localizadas en el ganglio trigémino. Este trabajo se ha publicado en una revista líder en el campo de la investigación oftalmológica: aExpression of cholecystokinin, gastrin and their receptors in the mouse cornea. Ana F. González-Coto, Carlos Alonso-Ron, Ignacio Alcalde, Juana Gallar, Álvaro Meana, Jesús Merayo-Lloves, Carlos Belmonte. Invest Ophthalmol Vis Sci (2014); 55(3):1965-1975. (ISSN 0146-0404). IF: 3.441

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PROYECTO 4 Medicina regenerativa experimental de la córnea: Nanotecnología aplicada a la Oftalmología. La superficie ocular, como toda superficie externa del cuerpo, está expuesta a las agresiones de los factores ambientales, a traumatismos laborales, a procesos infecciosos y a los efectos degenerativos de la edad. La evolución clínica de las patologías oculares suele estar bien documentada gracias a la extensa experiencia de los profesionales de la salud. Sin embargo, la necesidad de poner solución a los procesos degenerativos de la superficie ocular lleva a la búsqueda de nuevas aproximaciones terapéuticas más eficientes. En nuestro grupo se ha desarrollado y estandarizado un modelo experimental de cicatrización y regeneración corneal adaptado al ratón. Se ha elegido la cirugía fotorrefractiva con láser excímer (PRK) como modelo de lesión corneal por la uniformidad de la lesión corneal producida. De esta manera se dispone de una plataforma muy útil para la evaluación de estrategias terapéuticas en la superficie ocular. El gran inconveniente de la mayoría de los fármacos actualmente comercializados sigue siendo la baja permanencia plasmática y la distribución indiscriminada en el organismo, lo que hace que las células sanas resulten también afectadas, originando una inevitable toxicidad sistémica. En Oftalmología, esta falta de especificidad, junto con los fenómenos de resistencia de la superficie ocular a la penetración de fármacos, representan los principales obstáculos en la eficacia clínica de los medicamentos de uso oftálmico. En colaboración con la Profesora Mª José Alonso, de la Universidad de Santiago de Compostela, se han desarrollado nuevas estrategias terapéuticas basadas en la nanotecnología aplicada al ojo. Dentro de la nanomedicina podemos encontrar un gran número de plataformas cuyo objetivo es que el fármaco alcance de la manera más eficaz la diana, tales como nanopartículas, nanocápsulas, liposomas, micelas, conjugados, etc. Las nanocápsulas representan una alternativa válida para la vehiculización de fármacos. La encapsulación de dichos fármacos en el núcleo oleoso del nanosistema ofrece una mayor solubilización y protección frente a la degradación en los fluidos biológicos. El tamaño y las características de superficie del nanosistema pueden facilitar su acumulación en el tejido mediante el efecto de incremento de la permeabilidad y retención (Enhanced Permeability and Retention effect). En el ámbito del proyecto SURFEYE se ha estudiado la capacidad regenerativa de varios desarrollos basados en nanocápsulas sobre la superficie ocular. Los propios componentes de los nanocarriers pueden per se tener propiedades regenerativas en el tejido, aparte de la carga farmacológica que se añada. aNuevos abordajes para el Diagnóstico, Tratamiento y Regeneración de la patología de la superficie ocular-SURFeye Ministerio de Economía y Competitividad Programa INNPACTO Investigador principal: Jesús Merayo En estos momentos iniciales se han probado sistemas de liberación controlada de fármacos diseñados para el tratamiento del ojo seco y de la inflamación de la superficie ocular. Los sistemas nanométricos permiten la liberación de fármacos inmunosupresores como la Ciclosporina A o de aditivos como la Vitamina A. Se ha comprobado que las nanocápsulas cargadas con Ciclosporina A tienen un efecto potente durante los primeros días de reparación tisular, reduciendo la respuesta inflamatoria tras la lesión. La Vitamina A, dirigida en estos sistemas, tiene un efecto regenerativo mayor al descrito mediante otras vías de administración. Esta serie de experimentos permitirá desarrollar tratamientos personalizados y de una elevada eficacia farmacocinética, comparada con las vías de administración tradicionales.

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Comparativa de la eficacia reparadora de sistemas nanométricos diseñados para uso oftalmológico en el tratamiento de ojo seco y procesos inflamatorios.

PROYECTO 5 Eficacia de derivados sacarídicos como agentes regenerativos de la córnea (Cacicol, INDREYE y SILCOR). Desde hace unos años colaboramos en un proyecto de investigación en terapias regenerativas gracias a la colaboración con los Laboratorios Thea, (Clermont-Ferrand, Francia) sobre la eficacia de un agente regenerativo biomimético (Cacicol) que presenta funciones similares a las del Heparán Sulfato como material regenerativo de la superficie ocular. En los últimos años, se han desarrollado nuevos tipos de agentes terapéuticos para la matriz extracelular con resultados alentadores en úlceras crónicas de la piel de origen diabético o vascular. Determinados polímeros sintéticos actúan como agentes regenerativos capaces de mimetizar la función de las moléculas de heparán sulfato destruidas, creando así un microambiente celular favorable para la regeneración tisular. El Cacicol es un biopolímero diseñado imitando proteoglicanos de heparán sulfato y tiene características de acumulación y estabilización de los factores de crecimiento con capacidad de unión a heparina. Es conocido por favorecer la cicatrización de heridas en distintas condiciones en diferentes sistemas in vivo. Recientemente se ha descrito la reparación eficaz de úlceras crónicas en seres humanos usando gotas de Cacicol. El tratamiento se aplicó sobre nuestro modelo experimental de lesión corneal y cicatrización en ratón, obteniéndose una elevada calidad de reparación tisular. Los resultados de este estudio fueron presentados en el congreso mundial de ARVO que se celebró en Orlando (EEUU) en mayo de 2014. aEffectiveness of regenerative drops (CACICOL) on corneal ulcers (post PRK) in an experimental animal model. Ana Cristina Riestra, Almudena Iñigo-Portugues, Enol Artime, Paola Braga, Jesus Merayo-Lloves, Ignacio Alcalde. 2014 Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting. Orlando, FL (EEUU), mayo de 2014.

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aEficacia de las gotas regenerativas (CACICOL) en úlceras corneales (post PRK) en un modelo animal experimental. Néstor Carreño, Ana Cristina Riestra, Jesús Merayo-Lloves, Ignacio Alcalde Domínguez. 90 Congreso de la Sociedad Española de Oftalmología (SEO). Bilbao, octubre de 2014. Trabajo galardonado con el Premio “Fundación Jesús de Gangoiti Barrera” Además, se han enviado dos publicaciones a revistas relevantes en el campo de la Oftalmología a partir de los resultados extraídos de esta investigación: aEfectos de nuevos Agentes Regenerativos biomiméticos (RGTA) sobre la cicatrización corneal en un modelo experimental de úlceras post-PRK. Effects of new biomimetic Regenerating Agents (RGTA) on corneal wound healing in an experimental model of Post-PRK Corneal Ulcers. Ignacio Alcalde, Almudena Íñigo-Portugués, Néstor Carreño, Ana C. Riestra y Jesús Merayo-Lloves. aArch Soc Esp Oftalm. Aceptado para su publicación (22/01/2015). Effectiveness of Cacicol Regenerative Drops on PostPRK Corneal Ulcers in an Experimental Animal Model. Ignacio Alcalde, Almudena Íñigo-Portugués, Céline Olmière, Beatriz García, Federico Bech, Enol Artime, Paola Braga and Jesús Merayo-Lloves. Enviado a Cornea. El grupo de investigación colabora en los proyectos SILCOR e INDREYE financiados mediante el programa INNPACTO del Ministerio de Economía y Competitividad, que estudian otros derivados sacarídicos en la superficie ocular empleando el modelo experimental. En este marco, investigamos en colaboración con el Profesor Luis Quirós y la Dra. Beatriz García, del Departamento de Biología Funcional de la Universidad de Oviedo. Se ha estudiado el papel de los glicosaminoglicanos (GAGs) específicos del tejido corneal en la fisiopatología de la superficie ocular. Los GAGs son heteropolisacáridos implicados en una amplísima variedad de procesos biológicos. Debido a su complejidad estructural, los GAGs han sido tradicionalmente considerados receptores de superficie celular capaces de interaccionar con microorganismos. Las determinaciones de microbiota mediante técnicas de PCR en ojo seco habían permitido detectar la presencia de patógenos conocidos, aún en casos de ausencia de signos de infección, pudiendo estar relacionado con presencia de inflamación o predisponer para una colonización microbiana anormal. Asimismo, el empleo de terapia antibiótica oral se había asociado con incremento de los síntomas de ojo seco, proponiéndose una relación importante entre las bacterias de superficie ocular, la función de la película lagrimal y la inflamación de la superficie ocular. Así, las variaciones en la distribución de los GAGs de la superficie ocular, que actuarían como receptores bacterianos, podrían suponer una mayor susceptibilidad para la aparición de infecciones bacterianas. Mediante experimentos de unión a una serie de microorganismos presentes en la microbiota normal y también patogénicos, evaluamos la capacidad de los diferentes GAGs para unir bacterias. Encontramos que en la córnea la unión se estableció preferentemente a través de cadenas de heparán sulfato, por cuanto este GAG tuvo el mayor efecto competidor sobre la unión en todos los microorganismos analizados, desplazándola como media en torno al 75 %. Este trabajo permite utilizar moléculas de GAGs como aditivos oculares antibacterianos, además de abrir perspectivas para la identificación de epitopos concretos de alta afinidad.

Inhibición de la unión bacteriana por GAGs a diferentes concentraciones. A, Staphyloccocus aureus; B, Staphyloccocus epidermidis; C, Streptococcus pneumoniae; D, Streptoccocus pyogenes; E, Escherichia coli; F, Klebsiella pneumoniae; G, Haemophilus influenzae; H, Neisseria gonorrhoeae, I, Pseudomonas aeruginosa, J, Serratia marcescens. , Heparán sulfato; o, Condroitín sulfato A; n, condroitina sulfato B; p, condroitina sulfato C; , mezcla equimolecular de todos los GAGs.

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PROYECTO 6 Terapia celular de la córnea: Actividad reparadora de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. Durante 2014 se aplicó esta terapia celular a la reparación de ectasias corneales experimentales. Las ectasias de la córnea, como el queratocono, se caracterizan por una pérdida de tejido que finalmente induce una deformación de la superficie ocular. Se han iniciado una serie de experimentos para evaluar el potencial regenerativo de las células madre mesenquimales en las ectasias corneales. Si la implantación de las células es correcta, se espera que contribuyan eficazmente a la construcción de nueva matriz extracelular. Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo son capaces de diferenciarse a distintos tipos celulares en respuesta a su ambiente tisular y a señales celulares externas. Son capaces de originar, por ejemplo, células de tejido óseo, muscular o fibroblastos. Se ha conseguido diferenciarlas experimentalmente a fenotipos celulares muy semejantes en función y estructura a los queratocitos de la córnea. La aplicación exógena de estas células sobre la córnea dañada podría incrementar la velocidad de recuperación de la lesión. Para el paciente esta técnica presenta la ventaja de que la fuente de estas células es autóloga, del mismo paciente, con lo que se evitan complicaciones de rechazo inmunológico. Además, pueden ser extraídas fácilmente y en gran cantidad mediante un lipoaspirado convencional.

Marcadas con un trazador vital verde, células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano integradas en el tejido corneal en regeneración de un ratón que presentaba una ectasia corneal.

PROYECTO 7 Estudio experimental del Queratocono: modelos experimentales, biomarcadores y fenotipos de queratocitos. Como cualquier órgano en el cuerpo humano, la córnea puede sufrir alteraciones patológicas de muy diversa condición, entre éstas, las distrofias corneales pertenecen a un grupo de patologías caracterizadas por el desarrollo de una estructura corneal aberrante, donde, el término ectasia corneal agrupa a las deformaciones corneales congénitas (queratocono y la degeneración marginal pelúcida) y las adquiridas o iatrogénicas (ectasia post-Excimer Laser). El queratocono es la ectasia corneal más frecuente. La incidencia en la población general ha sido estimada entre 5 y 23 por 10.000, dependiendo de los distintos autores. Y la prevalencia en un 5,4 por 10.000. Es una degeneración corneal bilateral y asimétrica caracterizada por un adelgazamiento de la córnea que conduce a una protrusión en forma de cono. La protrusión corneal causa un alto grado de miopía y un astigmatismo irregular, afectando a la calidad visual y haciendo del queratocono una enfermedad altamente incapacitante. Salvo en los estadios finales de la enfermedad, es imposible diagnosticar con un alto grado de confianza la patología del queratocono. El diagnóstico de queratocono se hace en la actualidad con técnicas de análisis de imagen (videoqueratosocopia) pero no existen marcadores biológicos que permitan realizar un diagnóstico precoz antes de que el paciente tenga síntomas de alteración de la visión. En lo referente a la investigación, se han caracterizado histológica y molecularmente una serie de marcadores específicos de queratocono. Según los resultados, la córnea queratocónica carece de un tipo determinado de receptor de neurotrofinas y sobreexpresa una enzima concreta relacionada con la degradación de la matriz extracelular. Además, se ha encontrado una alteración en una proteína

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presente en el epitelio corneal (β-Catenina) y que se relaciona con la comunicación celular. La alteración de este marcador implica cambios organizativos en las células epiteliales e induce cambios en su fenotipo y en sus relaciones con las células vecinas. Se ha podido comprobar que la disminución de dicho marcador implica la desorganización del epitelio en las regiones de máximo adelgazamiento de la córnea patológica. Este marcador, junto con el expresado en la matriz extracelular (metaloproteinasa 9), parecen ser característicos del queratocono. Además se ha encontrado un marcador exclusivo de córneas con queratocono, lo que facilita un mejor diagnóstico de la enfermedad en etapas tempranas de su desarrollo (antes de que la deformación sea excesiva). En colaboración con el Profesor Luis Quirós, de la Universidad de Oviedo, se ha desarrollado un método para diagnosticar queratocono basado en la observación de que, sorprendentemente, existe una mayor actividad heparanasa en muestras de pacientes que padecen dicha patología cuando se compara con sujetos sanos. Dicha actividad, puede ser detectada en muestras de lágrima del paciente. Este método puede ser empleado para monitorizar el efecto de una terapia en pacientes previamente diagnosticados con queratocono así como para seleccionar pacientes que son candidatos a someterse a cirugía refractiva corneal.

En las imágenes superiores de microscopía de fluorescencia se puede apreciar cómo se distribuye la β-catenina a lo largo de las membranas plasmáticas de células epiteliales sanas (marcaje verde) formando un patrón reticular. La MMP 9 (marcaje rojo) presenta una expresión baja en córneas sanas (punta de flecha). En la fila de abajo se muestran córneas humanas con queratocono. Se pueden observar claras alteraciones en cuanto a la distribución de la β-catenina y la MMP 9 con respecto a las córneas control. La β-catenina desaparece de la membrana plasmática de las células basales del epitelio y presenta una distribución anormal en las células superficiales (asterisco). Además, se puede observar un claro aumento de la expresión de MMP 9 sobre todo en las regiones basales del epitelio (puntas de flecha). Estas zonas coinciden con áreas donde la β-catenina no está presente.

Además, se han desarrollado una serie de aproximaciones experimentales de ectasias corneales similares a queratocono. Concretamente, se ha conseguido un modelo experimental que refleja fielmente las características morfológicas, así como las variaciones moleculares que se observan en los pacientes de queratocono. Este modelo significará una útil herramienta para la investigación de nuevas estrategias terapéuticas. Para inducir experimentalmente una ectasia similar al queratocono se induce la digestión enzimática parcial de la matriz extracelular de la córnea añadiendo inhibidores específicos de metaloproteinasas y proteasas selectivas. Uno de los proteoglicanos más abundantes y característico de la matriz extracelular de la córnea es el keratocan. La enzima β-EndoGalactosidasa degrada este proteoglicano y altera la organización local de la matriz extracelular. De esta manera se han conseguido modificaciones agudas de la superficie de la córnea, cuya morfología es semejante a la de los pacientes humanos con queratocono avanzado.

Fotografías que muestran las alteraciones producidas en la córnea de los animales de experimentación. Se puede observar una deformación cónica de la córnea (A, B), similar a la observada en el queratocono.

La histología de las córneas de los ratones analizados mostró un patrón estructural similar al de las córneas de queratocono humano estudiadas, con epitelios adelgazados, disrupciones en la capa de Bowman, alteración de las lamelas de colágeno estromales y proliferación de los queratocitos estromales en las zonas dañadas. La expresión de los marcadores moleculares como la β-Catenina y la MMP9 son muy similares a los obtenidos en estudios previos realizados en córneas humanas.

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En sistemas de cultivo de células corneales de pacientes con queratocono se comprobó que existe una variación elevada en la expresión de determinados genes. Por ejemplo, los niveles de metaloproteinasa 2 (MMP2), de laminina 1, de DOCK 9 o de keratocano están alterados en muestras de pacientes con queratocono.

Gráfico de columnas que muestra el Fold Change (2-ΔΔdCT) de los genes humanos entre individuos con queratocono e individuos sanos.

Por otro lado, mediante un sistema fluorimétrico, se ha comprobado que las células estromales de córneas con queratocono no presentan el receptor de neurotrofinas TrkA, tal y como está descrito anteriormente.

Inmunofluorescencia en placa de queratocitos estromales humanos de individuos sanos (Micrografía A) y con queratocono (Micrografía B) con un inmunomarcaje anti-TrkA (en fluorescencia verde) y núcleos contrateñidos con DAPI (Azul), en la que se puede observar la diferencia de expresión del marcador molecular.

Estas investigaciones están financiadas desde 2012 por un proyecto del Instituto de Salud Carlos III (Ministerio de Economía y Competitividad):

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aDesarrollo, caracterización y modulación de un modelo experimental de ectasia (queratocono) que permita el tratamiento regenerativo del tejido corneal. Instituto de Salud Carlos III. Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación. Ministerio de Economía y Competitividad. Convocatoria de Ayudas de Proyectos de Investigación en Salud. PI11/02886. Investigador principal: Jesús Merayo Lloves. Como resultado de la colaboración con el Profesor Luis Quirós de la Universidad de Oviedo, parte de estos resultados han sido enviados para su publicación en una revista relevante en el campo de la Oftalmología: aProteoglycans undergo differential expression in keratocone corneal stromal cells. Beatriz García, Olivia García-Suárez, Ignacio Alcalde, José F. Alfonso, Álvaro Meana, Fernando Vázquez, Jesús Merayo-Lloves and Luis M. Quirós. IOVS (2014). Enviado.

PROYECTO 8 Repercusiones oculares en un modelo de hipoxia intermitente en ratón como simulación del Síndrome de Apnea e Hipopnea del Sueño. La apnea del sueño es un problema de salud importante. Ya sea de origen central o periférico (obstructiva), la interrupción periódica de la ventilación durante el sueño se asocia con un aumento de la presión arterial y una elevada descarga del nervio simpático durante las horas de vigilia. También hay diferencia en la incidencia de la apnea del sueño en función del género. Las mujeres premenopáusicas presentan una menor incidencia de apnea del sueño, mientras que en las mujeres postmenopáusicas la incidencia es la misma que en los hombres. A pesar de que las mujeres premenopáusicas tienen una menor incidencia de la apnea del sueño, sí que experimentan apnea del sueño. Sin embargo, aún no se conoce, por ejemplo, si la presión arterial aumenta en las mujeres jóvenes con apnea del sueño. La hipoxia intermitente se utiliza como modelo experimental de la hipoxemia arterial que se produce durante la apnea del sueño. Tanto en animales como en humanos, la exposición repetida a la hipoxia aumenta la presión sanguínea y la descarga de los nervios simpáticos. Estas observaciones fueron recogidas en pacientes humanos. A la luz de la evidencia de que las mujeres premenopáusicas y las mujeres cuyos ovarios son plenamente funcionales, exhiben respuestas reducidas a una variedad de estímulos excitatorios simpáticos, los resultados en modelos animales muestran que las ratas hembras expuestas a episodios de hipoxia intermitente están protegidas contra la hipertensión asociada, y esta protección depende de presencia de hormonas sexuales femeninas. Las repercusiones de la apnea del sueño y de la hipoxia inducida en el proceso, están poco definidas a nivel ocular y pueden estar subestimadas en el diagnóstico clínico. El ojo es un órgano muy sensible a las alteraciones de la presión sanguínea y a la hipoxia, con patologías degenerativas asociadas a la hipertensión o a la hipoxia en la retina que pueden derivar en graves déficits de visión (glaucoma, degeneración macular, neuropatías de nervio óptico, etc.). Además, la córnea es una estructura avascular y transparente que depende de un delicado equilibrio para mantener sus cualidades ópticas. Las enfermedades de la córnea son la segunda causa de ceguera después de la catarata. La córnea puede perder su transparencia cuando se ve invadida por vasos sanguíneos procedentes de la conjuntiva. La neoangiogénesis en la córnea podría estar relacionada con estados de hipertensión arterial sistémica. De esta manera, la apnea del sueño sería un factor de riesgo en los pacientes que acuden a la consulta oftalmológica. El objetivo de este estudio fue estudiar la patología oftalmológica que puede estar en relación con el SAHS por medio de dos subproyectos que se pusieron en marcha en paralelo: Por un lado se investigaron las repercusiones oculares del efecto de la hipoxia intermitente como modelo de apnea del sueño. En colaboración con el Prof. Ramón Farré, de la Universitat de Barcelona, se diseñó un experimento en el que la hipoxia intermitente se aplicaba bajo condiciones de privación de producción de hormonas esteroideas, para comprobar si el género influye en los signos plausibles de la hipoxia. En la superficie ocular, la presencia de vasos sanguíneos en la córnea no parece tener relación con el proceso de hipoxia y sí parece tener una fuerte asociación con la carencia de hormonas (sería el caso de mujeres sin ovarios o postmenopáusicas). Además de vasos, estos individuos presentaban manchas blanquecinas en la córnea (leucomas).

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Sin embargo, se encontró una relación directa de la situación hipóxica con la presencia de un grupo de lesiones epiteliales a nivel microscópico similares a una citolisis parcelar o degeneración vacuolar. En cuanto a la retina, se utilizó un marcador fluorescente para identificar las células gliales de la retina. Estas células reaccionan ante estímulos nocivos como la hipertensión o la restricción de oxígeno sufriendo hipertrofia o atrofia. Las diferencias en la intensidad de la señal fluorescente registrada por densitometría en las muestras de retina indicaron, por un lado, una contribución importante del factor hormonal en el mantenimiento del espesor de la retina, independientemente de la exposición a hipoxia intermitente. Es conocido que la extirpación de las glándulas sexuales en las hembras (experimentos clásicos en rata) incrementa la hipertensión arterial media y puede contribuir a la degeneración parcial de la retina. En una serie de experimentos paralelos en colaboración con el Profesor Jorge Luis Arias, Catedrático de Psicobiología de la Universidad de Oviedo, se estudiaron las alteraciones de la superficie ocular y de la retina relacionadas con la hipertensión crónica. Es interesante reseñar que el modelo utilizado desarrolla también déficits cognitivos bajo condiciones de hipertensión crónica. En estos experimentos el déficit de oxígeno viene provocado por la hipertensión arterial crónica, que a la larga produce alteraciones cognitivas tanto en los animales de experimentación como en los pacientes humanos. Se ha constatado que en el modelo de experimentación, la aparición de los primeros signos neurológicos viene precedida por una evidente patología en la superficie de la córnea. De esta manera, la exploración oftalmológica podría convertirse en un valor predictivo de posibles trastornos neurológicos futuros, si se complementa con las exploraciones necesarias de otras especialidades. Además, en ambos modelos, los signos y síntomas oculares pueden hacer sospechar al clínico de determinadas patologías sistémicas. En estos experimentos participan además las Dras. Natalia Arias y Marta Méndez del Departamento de Psicología de la Universidad de Oviedo.

Ejemplos de alteraciones patológicas en la córnea en un modelo experimental de hipoxia e hipertensión arterial. La imagen A muestra el aspecto de la córnea de rata normal. En B y C se muestran vasos sanguíneos (puntas de flecha) y leucomas (asteriscos) en córneas de ratas con hipertensión arterial. La imagen 1 corresponde a un corte histológico de una córnea sana mientras que en la imagen 2 se observan las los signos histopatológicos relacionados con la situación de hipoxia. El marcador rojo (Isolectina B4) indica la presencia de vasos sanguíneos, rupturas epiteliales y desórdenes en el estroma.

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Mediante estudios de conducta se puede evaluar el grado en que afecta la reducción del aporte de oxígeno al cerebro en las capacidades cognitivas del individuo. A menudo, las alteraciones morfofuncionales a nivel del sistema nervioso central tienen una representación previa en otros lugares del organismo. Así, la enfermedad de Parkinson, por ejemplo, se manifiesta como agregados de proteína-synuclelin en el colon años antes de que aparezcan los primeros síntomas neurológicos. El estudio de las repercusiones oculares de la hipoxia y la hipertensión podría evidenciar de manera precoz una patología que más tarde se manifieste en el sistema nervioso central. Los resultados de estos experimentos parecen prometedores y apuntan a una nueva vía de diseño de herramientas diagnósticas de enfermedades sistémicas y neurodegenerativas basadas en la exploración no invasiva de la superficie ocular. Estos resultados han sido enviados a publicar en una revista de alto impacto: aAssessing the Brain throughout the Eye: Hepatic Encephalopathy Arias N., Méndez M., Alcalde I., Íñigo-Portugués A., Merayo-Lloves J., Arias J., Arias JL. PlosOne (aceptado para su publicación marzo 2015) Como fin último los modelos experimentales pueden servir para evaluar la eficacia de estrategias diagnósticas y terapéuticas para evitar el estrés oxidativo a nivel de las células retinianas, probar fármacos antiangiogénicos, etc.

PROYECTO 9 Desarrollo y optimización de córneas por medio de Terapias Avanzadas y nuevos materiales derivados de la seda para su empleo en reconstrucción de la superficie ocular y queratoplastias. Programa INNPACTO IPT-2012-1029-010000 – Duración: Agosto 2012 – Diciembre 2015 Este proyecto está enfocado al desarrollo de tecnología que facilite la producción de diversos modelos de regeneración corneal. Para ello se están llevando a cabo trabajos tendentes a la obtención de biomateriales que se adapten a las necesidades de la Ingeniería Tisular en el campo de la Oftalmología y que sean bien tolerados tras la cirugía. Así mismo, comprende el desarrollo de biorreactores donde cultivar las células en condiciones que imiten las fisiológicas y que por tanto faciliten el crecimiento y la correcta diferenciación de las células.

Fase 1. Desarrollo del proceso de fabricación Durante el año 2012 se abordó la fase 1 del presente proyecto, consistiendo en una revisión del estado del arte, una definición de las necesidades médicas no resueltas y una toma de datos para el correcto desarrollo del proyecto.

Fase 2. Desarrollo del proceso de fabricación de material corneal mediante Ingeniería Tisular y tecnologías de fabricación. Esta fase se inició durante el año 2013 con la creación de un stock celular corneal con el que poder comprobar la biocompatibilidad de los diferentes scaffolds desarrollados por nuestros colaboradores: el Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA), la Fundación Prodintec y la Universidad de Oviedo (Figura 1). Figura 1. Scaffolds desarrollados por nuestros colaboradores. A: queratina-quitosano (Universidad de Oviedo); B: fibroína (IMIDA); C: PLA y D: Vero Clear (Fundación Prodintec). Asimismo, con la colaboración de la Fundación Prodintec, se diseñaron distintos prototipos de biorreactores (Figura 2) para el manejo y transporte de los scaffolds desarrollados, que evitaban su rotura y favorecían su manejabilidad. Estos prototipos han sido utilizados para la realización de las pruebas in vitro durante el desarrollo de la fase 3 del proyecto.

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Figura 2. Secuencia del proceso de adaptación de los scaffolds desarrollados al prototipo de biorreactor.

Fase 3. Pruebas in vitro y análisis funcional de los scaffolds. Durante la presente anualidad, se ha procedido a realizar la validación de los diferentes scaffolds diseñados. Para ello, se han estudiado sus características mecánicas, ópticas y de manejo, así como el comportamiento celular, en particular la adhesión de las células corneales al scaffold y su caracterización fenotípica

1. Pruebas de adhesión de las células a los scaffold. El seguimiento del crecimiento celular se ha realizado mediante un microscopio invertido de contraste de fases, comparando el crecimiento celular sobre los scaffolds desarrollados (Figura 3 y 4), con el crecimiento sobre el plástico de cultivo celular convencional. Las células corneales mostraron tener habilidad para adherirse y proliferar, manteniendo su morfología, no mostrando diferencias con respecto al crecimiento sobre el plástico de cultivo celular, en todos los scaffolds que se han evaluado. Así se pudo observar que las células limbares presentan una forma típica redondeada, poliédrica o con forma de adoquín, las células estromales se muestran como células grandes y planas con prolongaciones que les confieren una forma fusiforme o estrellada y las células endoteliales son células planas hexagonales que se unen formando un mosaico mediante numerosas uniones comunicantes. Si bien en este último caso, las células endoteliales muestran una morfología más diferenciada que la presentada en el plástico de cultivo celular convencional.

Figura 3. Imágenes de contraste de fases de cultivos corneales (A y D: células limbares; B y E: células estromales; C y F: células endoteliales) sobre los scaffolds desarrollados (A, B y C: queratina-quitosano; D, E y F: fibroína).

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Figura 4. Imágenes de contraste de fases de cultivos corneales (A y C: células limbares; B y D: células estromales) sobre los scaffolds desarrollados (A y B: PLA; C y D: Vero Clear).

2. Caracterización fenotípica de los scaffolds con células. Para la correcta caracterización de las diferentes estirpes celulares expandidas sobre los scaffolds, se ha realizado un análisis de los marcadores morfológicos (citoqueratina, p63, vimentina, ZO-1 y Na+/K+ ATPasa) a nivel de inmunocitoquímica (Figura 5). Tradicionalmente, las citoqueratinas son utilizadas para la caracterización de las células epiteliales. Recientemente, la proteína nuclear p63 (un miembro de la familia p53) ha sido propuesta como marcador para identificar a las células madre limbares. Por su parte, las células estromales corneales son originadas en la cresta neural y posteriormente se diferencian a células mesenquimales. Es por ello que, un marcador de células mesenquimales como la vimentina es ampliamente utilizado para su caracterización. Finalmente, en el caso de las células endoteliales y a falta de un marcador específico para la caracterización de este tipo celular, la actividad de la Na+/K+ ATPasa, asociada con la función de transporte de fluidos para mantener la transparencia corneal, o la expresión de la proteína de unión celular ZO-1, involucrada en Figura 5. Inmunotinción de cultivos corneales (A y D: células limbares marcadas contra la formación de complejos que permiten el citoqueratina y p63; B y E: células estromales marcadas contra vimentina; C y F: células transporte pasivo de elementos, son utilizados endoteliales marcadas contra Na+/K+ ATPasa (C) y ZO-1 (F) sobre los scaffolds desarrollados (A, B y C: queratina-quitosano; D, E y F: fibroína). para la caracterización de estas células.

Figura 6. Inmunotinción de cultivos corneales (A y C: células limbares marcadas contra citoqueratina y p63; B y D: células estromales marcadas contra vimentina) sobre los scaffolds desarrollados (A y B: PLA; C y D: Vero Clear).

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3. Pruebas de manejabilidad y mecánicas de los scaffolds. Se llevaron a cabo estudios de las cualidades quirúrgicas de los prototipos desarrollados, para ello se escogió como modelo el uso de introductores de endotelios “Endosaver® corneal endothelium delivery” (Figura 7). Este procedimiento implica introducir el scaffold en el Endosaver®, formar un pequeño cilindro enrollando la membrana sobre sí misma, e introducirla en la cámara anterior de un ojo mediante una mínima incisión quirúrgica. En este aspecto, se ha logrado introducir con éxito membranas de queratina-quitosano y fibroína en un ojo enucleado de conejo “New Zealand”. No obstante, se han tenido problemas con alguno de los prototipos diseñados (PLA y Vero Clear) a la hora de introducirlos ya que su capacidad de plegamiento resultó ser muy reducida.

Figura 7. Introducción de una membrana de queratina-quitosano en cámara anterior.

Por otro lado se llevó a cabo la evaluación de las propiedades mecánicas, en seco y tras 24 horas de hidratación en solución salina de fragmentos de fibroína de 30x10 mm y 10 µm de espesor, mediante ensayo de resistencia a la tracción (Figura 8), analizándose cada tipo de muestra por triplicado (Tabla 1).

Figura 8. Curvas de estrés-deformación mostrando el comportamiento de films de fibroína de 10 µm de grosor, en seco e hidratados 24h en solución salina, durante los ensayos de resistencia a la tracción.

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Tabla 1. Propiedades mecánicas en seco y tras 24 horas de hidratación en PBS1X de fragmentos de fibroína de 30 x 10 mm y 10 µm de grosor, mediante ensayo de resistencia a la tracción. Los datos se muestran como media ± st dev.

Se observó que la hidratación disminuyó drásticamente la resistencia a la tracción (2,1 MPa), si comparamos estos valores con los de la membrana en seco (21,5 MPa), sin embargo la deformación en el momento de ruptura se incrementa de una forma muy significativa y con ello su elasticidad. No obstante, la resistencia sigue siendo más que suficiente para garantizar la óptima manipulación de la membrana.

4. Pruebas ópticas de los scaffolds. Los modelos experimentales desarrollados fueron caracterizados con medidas de transparencia (absorbancia y transmitancia) para evaluar la calidad óptica de los mismos (Figura 9). Se observó que en el espectro visible, región del espectro electromagnético que el ojo humano es capaz de percibir, y que corresponde a longitudes de onda de entre 400 y 700 nm, los scaffolds de fibroína muestran excelentes características ópticas, transmitiendo cerca de un 90 % de la luz. En conclusión, los resultados hasta el momento nos han permitido desarrollar diferentes scaffolds para su empleo en la reconstrucción de la superficie ocular. De todos ellos, el scaffold desarrollado a partir de fibroína es el que hasta el momento ha mostrado una mejor adaptabilidad a las necesidades médico-quirúrgicas de la córnea, siendo por ello el candidato seleccionado para los estudios in vivo pendientes de desarrollar en la fase 4 del proyecto, la cual dará comienzo en la próxima anualidad.

Figura 9. Propiedades ópticas (absorbancia y transmitancia) de scaffolds de fibroína.

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PROYECTO 10 El trasplante de córneas en el siglo XXI. Estructura y logística de un futuro Banco de Tejidos en Oftalmología. Fundación Mutua Madrileña – Duración: Mayo 2013 – Mayo 2015 El objetivo que persigue el presente proyecto es la creación de un Banco de Tejidos Oftálmicos que permita el aprovechamiento máximo de los tejidos que se extraen de donantes y que habitualmente son desechados. Para ello, se propone la creación y el desarrollo de la siguiente metodología: 1. Desarrollo de un Biobanco de estructuras y células del globo ocular para investigación biomédica y/o técnicas de Ingeniería Tisular. 2. Extracción de proteínas de distintas estructuras del globo ocular para la obtención de productos útiles en terapéutica.

Fase 1. Puesta en marcha del Biobanco. Durante el presente año se han iniciado los trámites para el registro del Biobanco. Para ello, se ha comunicado a la Dirección del Biobanco del Principado de Asturias un escrito expresando nuestro interés en formar parte del mismo, quedando a la espera de aportar toda la documentación necesaria (protocolos de recogida de datos, historias clínicas…), que se ha venido desarrollando durante la presente anualidad, para que se haga efecto. Uno de los beneficios del presente proyecto ha sido la puesta a punto de un método de congelación de córneas. Hay que tener en cuenta que la córnea es un tejido que se conserva útil para trasplante durante un periodo de tiempo determinado en función de la temperatura y del medio de conservación. La limitación de la vida útil de las córneas, unido a su baja disponibilidad, el hecho de que las donaciones no son programables y que los trasplantes son intervenciones más o menos urgentes, hacen que la congelación de córneas sea una alternativa atractiva a los medios de conservación actuales, ya que permitiría mantener las córneas viables durante años, permitiéndonos disponer en todo momento de una córnea apta para trasplante, lo que en el caso de una urgencia puede evitar la pérdida del globo ocular. Por ello, durante la presente anualidad se ha procedido a buscar un sistema de congelación de estromas que permita su utilización en los trasplantes lamelares anteriores, siendo los resultados de estas córneas, en términos de viabilidad, transparencia y manejabilidad lo más similares posibles a los de las córneas frescas. Con el objetivo de desarrollar los ensayos de congelación de estromas, se han utilizado córneas procedentes de donantes de tejido ocular procesadas en el Banco de Tejidos de Asturias. Las córneas seleccionadas para estos ensayos han sido córneas con un alto recuento endotelial a las que previamente se les había extraído la membrana de Descemet y el endotelio para la obtención de lamelas posteriores para trasplante tipo DMEK. Tras la separación del endotelio, si el estroma no se empleaba en un trasplante urgente se destinó a los ensayos de congelación/descongelación. Estos ensayos han mostrado que los protocolos actualmente empleados para la congelación/descongelación de tejido corneal no repercuten negativamente en las características ópticas del estroma ni en la viabilidad de los queratocitos estromales que lo pueblan, habiendo mostrado una tasa de proliferación equiparable a los cultivos en los que se hubo utilizado tejido fresco. Una vez establecido el protocolo de congelación, se han congelado 20 estromas para trasplante, habiéndose empleado 6 de estos injertos para trasplante lamelar anterior. Los resultados obtenidos en esta primera fase son muy positivos y actualmente se está realizando el seguimiento de estos pacientes para valorar los resultados a largo plazo. La congelación de córneas es ahora una de las rutinas de nuestro Biobanco. De esta forma, se ha logrado uno de los objetivos del presente proyecto: la realización de dos trasplantes clínicos eficaces, un lamelar posterior (DMEK) y un lamelar anterior (DALK) a partir de una sola córnea. Otra de las aportaciones al Biobanco ha sido la creación de colecciones celulares a partir de los tejidos del globo ocular no empleados en terapéutica, así como colecciones histológicas de los mismos, para su uso compartido con otros investigadores. En los últimos años el grupo de Ingeniería Tisular de la Unidad de Superficie Ocular ha venido desarrollando protocolos de cultivo de las diferentes estirpes celulares corneales (Figura 1), lo cual ha permitido una aportación constante de material celular para el desarrollo de los diferentes proyectos llevados a cabo tanto por nuestra Unidad, como por cualquier otro equipo investigador que lo solicite.

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Figura 1. Inmunofluorescencia para la caracterización de las células corneales humanas (A: células limbares; B: células estromales; C: células endoteliales).

Fase 2. Extracción de proteínas de distintas estructuras del globo ocular para la obtención de productos útiles en terapéutica. El colágeno es la proteína más abundante de origen animal constituyendo aproximadamente entre el 25 y 30% de todas las proteínas de los organismos animales. Es además un componente importante de todos los tejidos conectivos del cuerpo, músculo, dientes, hueso y piel, y también se encuentra en el tejido intersticial de todos los órganos. En el campo de los biomateriales, resalta por su aplicabilidad en la ingeniería de tejidos habiendo demostrado que permite la adhesión y proliferación celular. Actualmente el colágeno utilizado es principalmente de origen porcino y bovino pero, debido a las posibilidades de transmisión de zoonosis, se están buscando nuevas fuentes de extracción. Diversos grupos han publicado la posibilidad de utilizar partes del globo ocular habitualmente no utilizadas en trasplante para la obtención de nuevos productos y/o proteínas de interés terapéutico, describiendo la posibilidad de extracción de colágeno tipo I a partir de varias estructuras, entre ellas la esclera. Teniendo en cuenta lo anteriormente descrito, durante la primera fase de este proyecto se han probado diferentes protocolos de extracción y purificación para la obtención de colágeno tipo I a partir de escleras humanas. Para poder indicar el rendimiento de los diferentes protocolos, ha sido necesario cuantificar la cantidad de colágeno extraído, para ello se utilizó una técnica colorimétrica de cuantificación del % de hidroxiprolina (aminoácido característico del colágeno, cuya cantidad en una muestra se puede extrapolar a la cantidad de colágeno total). Los productos obtenidos con los diferentes protocolos han sido caracterizados para asegurar que el producto era colágeno tipo I, para ello se han comparado con colágeno comercial mediante la técnica de Western Blot (Figura 2). Una vez extraído y caracterizado, el colágeno será utilizado para la obtención de estructuras tridimensionales, para ello en una primera etapa, se ha comprobado la posibilidad de producir dichas estructuras empleando colágeno comercial tipo I purificado a partir de cola de rata. Para ello, se utilizaron distintos protocolos hasta obtener una estructura que cumpliera con unos requisitos mínimos de transparencia, manejabilidad y biocompatibilidad.

Figura 2. Inmunodetección de colágeno I mediante la técnica de Western Blot.

Finalmente, se estableció una metodología basada en una evaporación gradual y una cantidad de proteína de 3mg/cm2 como la óptima para la creación de membranas (Figura 3).

Figura 3. Membrana de colágeno comercial tipo I.

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Para aumentar la manejabilidad de las estructuras obtenidas, se añadió una etapa de entrecruzamiento de las fibras de colágeno mediante la exposición a radiación UV a una longitud de onda de 254nm con una intensidad de 22,4J. Tras esta exposición, las membranas aumentaron sensiblemente su manejabilidad así como se garantizaba su esterilidad, permitiendo poder estudiar su biocompatiblidad con el stock generado de células corneales. Estos tres tipos celulares han mostrado una buena adhesión y proliferación en este tipo de membranas, manteniendo además su morfología y los marcadores fenotípicos característicos de cada tipo celular (Figura 4).

Figura 4. Micrografía mostrando los marcadores característicos de las células corneales humanas cultivadas sobre estructuras de colágeno comercial tipo I (A: células limbares; B: células estromales; C: células endoteliales).

Una vez establecido el protocolo de fabricación de estructuras tridimensionales a partir del colágeno comercial, se iniciaron los trabajos para la creación de estructuras a partir del colágeno obtenido de esclera. En este caso, no ha sido posible la obtención de membranas con unas características equiparables a las obtenidas con el colágeno comercial, muy posiblemente debido a la presencia de impurezas. Esto hace que, durante la siguiente anualidad del proyecto, se pretenda continuar optimizando los protocolos con el fin de obtener colágeno con un alto grado de pureza que permita la creación de estructuras tridimensionales con características equiparables al colágeno comercial.

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PROYECTO 11 Nuevos abordajes para el diagnóstico, tratamiento y regeneración de la patología de la superficie ocular. Convocatoria Retos-Colaboración RTC-2014-2375-1 – Duración: Junio 2014 – Diciembre 2016 El objetivo de este proyecto consiste en establecer tratamientos innovadores de cara a la inflamación ocular, tratamientos personalizados para la regeneración de la superficie ocular basados en derivados hemáticos, así como sistemas de diagnóstico personalizados. Por otro lado, dada la dificultad de penetración de los fármacos en la superficie ocular y la baja tolerancia de esta a diferentes compuestos químicos, incluidos los fármacos, se va a trabajar en sistemas innovadores de drug delivery o liberación controlada, tanto para fármacos en desarrollo como para fármacos en el mercado. También se realizarán desarrollos de materiales, diseños y procesos de fabricación para lentes de contacto. Durante la presente anualidad la aportación de nuestra Unidad de Investigación a este proyecto ha consistido en la realización de la comparativa del PRGF-Endoret® y el suero autólogo con respecto al suero bovino fetal (SBF) que se utiliza en los medios de cultivo convencionales. Los medios de cultivo convencionales llevan en su composición además de proteínas xenogénicas (SBF) factores de crecimiento como EGF, insulina, transferrina, selenio etc. El objetivo que se ha perseguido ha sido desarrollar un medio de cultivo del limbo donde los factores xenogénicos se sustituyan por el PRGF-Endoret® o suero autólogo. Los factores plaquetarios obtenidos a partir de PRGF-Endoret® o de suero autólogo, son factores de crecimiento autólogos que tienen un efecto reparador de la superficie ocular en diversas patologías (ojo seco, reacción de injerto contra huésped, úlceras complejas…) y que han demostrado in vitro la capacidad de incrementar el crecimiento de las células corneales. Para este estudio se han procesado 14 limbos esclerocorneales a partir de córneas procesadas en el IOFV para trasplante endotelial. Los limbos se diseccionaron bajo microscopio quirúrgico y se fragmentaron en explantes de 1-2 mm que se sembraron en placas Petri de cultivo celular de 35 mm de diámetro (8 explantes por placa). Como medio de cultivo se comparó el medio de cultivo complejo (HAM-F12/DMEM con: insulina, EGF, triiodotironina, hidrocortisona, adenina, toxina colérica) suplementado con 10% SBF, frente al mismo medio suplementado con colirio de PRGF-Endoret® o suero humano al 10%. Para comparar los efectos de los diversos medios de cultivo se han estudiado los siguientes parámetros: • • • •

Número de explantes de limbo con crecimiento celular. Área de crecimiento de los explantes en los diversos medios. Expresión de marcadores de célula epitelial (citoqueratina). Expresión de marcadores de célula stem limbar (p63).

Los resultados obtenidos muestran que tanto los cultivos en medio suplementado con SBF como los suplementados con PRGF-Endoret® o suero humano muestran una expresión positiva para los marcadores citoqueratina y p63 (Figura 1). Sin embargo, se han observado diferencias entre los diferentes cultivos en el área de crecimiento (Figura 2). En este sentido los cultivos realizados con el medio de cultivo suplementado con PRGF-Endoret® o con suero humano han mostrado un mayor área de crecimiento (60,03±21,74 mm y 46,48±16,41 mm) que los suplementados con SBF (39,95±14,26 mm) observándose diferencias significativas (p<0,05) entre el PRGF-Endoret® y el SBF. Además hubo mayor número de crecimiento de explantes en los cultivos suplementados con PRGF-Endoret® (76,79%) y suero humano (58,93%) que en los suplementados con SBF (48,21%) volviéndose de nuevo a ver diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre el grupo PRGF-Endoret® y el de SBF (Figura 2).

Figura 1. Micrografías de contraste de fases de células stem limbares después de 7 días de cultivo (A: en presencia de PRGF-Endoret®; B: en presencia de SBF; C: en presencia de suero humano). Micrografías de inmunofluorescencia para citoqueratina (D: en presencia de PRGF-Endoret®; E: en presencia de SBF; F: en presencia de suero humano) y para p63 (G: en presencia de PRGF-Endoret®; H: en presencia de SBF; I: en presencia de suero humano).

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Figura 2. Área de crecimiento en mm (A) y porcentaje de cultivos celulares satisfactorios (B) después de 7 días de cultivo. Los resultados se expresan como media ± SEM. **p<0,05.

Por todo lo anterior se ha visto que el PRGF-Endoret® y el suero humano mejoran el crecimiento celular, manteniendo los marcadores característicos de las células limbares pudiendo ser utilizados como sustitutos del suero xenogénico para el cultivo y expansión de las células corneales. Durante las siguientes anualidades se pretende continuar en esta línea optimizando aún más los medios de cultivo para células corneales eliminando cualquier componente xenogénico, para la obtención de un medio de cultivo completamente autólogo.

PROYECTO 12 Biorreactores con sensores integrados para la monitorización del crecimiento celular en terapias avanzadas. Las Terapias Avanzadas conforman un área de la Medicina que ha experimentado un enorme crecimiento en los últimos años y está proporcionando grandes posibilidades terapéuticas a muchos pacientes. Las operaciones de trasplante de tejidos están limitadas por la disponibilidad de donantes, por lo que el hecho de disponer de tejidos artificiales facilita la realización de este tipo de operaciones reduciendo los tiempos de espera de los pacientes. Los medios a través de los cuales la Ingeniera Tisular busca la “fabricación” de tejidos han de desarrollarse en dos materias complementarias: 1.- El cultivo de material celular. Para reproducir la funcionalidad de un tejido “original” se hace necesario cultivar o hacer crecer de manera significativa al grupo o grupos de células que desempeñen la función original. 2.- El diseño, desarrollo y fabricación de estructuras (biorreactores) en las cuales sea posible realizar un crecimiento celular controlado.

Figura 1. Cultivo de epitelio, estroma y endotelio corneal.

En el caso de la oftalmología, en las últimas décadas las vías de investigación abiertas están tratando de imitar los procesos biológicos y “cultivar” tejidos en el laboratorio para abastecer la demanda sin recurrir a los trasplantes. Gracias a estas técnicas, se han logrado obtener a escala de laboratorio cultivos celulares corneales sobre diferentes superficies para su posterior trasplante, sin embargo, los actuales frascos de cultivo celular no están adecuadamente diseñados para monitorizar estos tipos de cultivos celulares. Así, a pesar de que el crecimiento de las células sobre dichas superficies es adecuado, el producto obtenido no tiene una completa monitorización de los parámetros físico-químicos acontecidos durante el proceso de cultivo lo que podría favorecer el crecimiento celular estableciendo las variables adecuadas.

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El poder contar con un sistema de monitorización continuo de variables como crecimiento celular y contaminación microbiológica supondría un salto en la calidad y eficiencia del proceso de obtención de estos tejidos. Durante el año 2014 se ha trabajado junto con la empresa de electróquímica Dropsens en un proyecto de investigación, financiado por el FYCIT, para el diseño de sensores integrados en biorreactores de cultivo de tejido celular corneal. El diseño de diferentes sensores (para detección de impedancia, pH, gases y temperatura) junto con el plan de integración de los mismos en biorreactores celulares permitirá obtener una completa monitorización de los diferentes parámetros físico-químicos y crecimiento celular involucrados en el cultivo de tejidos. Como resultado se obtendrá un mayor control del cultivo y la posibilidad de fijar con claridad y exactitud las condiciones más adecuadas para el crecimiento de cada tipo celular. El desarrollo de proyecto, que comenzó el 1 de julio de 2013 y finalizará el 31 de Diciembre de 2014, se puede desglosar en 5 hitos: • • • •

Hito 1: Diseño de sensores para la monitorización de sistemas de cultivo celular y microbiológico. Hito 2: Estudio de la respuesta de los sensores. Hito 3: Estudio de las posibilidades de integración de la fase sensora en los biorreactores. Hito 4: Estudio de las respuesta de los biorreactores con sensores integrados

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4.2. UNIDAD DE NEUROBIOLOGÍA DE LA RETINA OBJETIVOS Su objetivo principal es profundizar en el estudio de los mecanismos fisiopatológicos que dañan y protegen las estructuras oculares, muy enfocados en patología retiniana. Su actividad principal ha sido reproducir en los laboratorios de la FIO los modelos experimentales de daño y protección de las células ganglionares de la retina por la luz, y en concreto el papel de las mitocondrias en la muerte celular. Estos estudios tienen traslación a la clínica en el abordaje innovador de enfermedades que están entre las primeras causas de ceguera, como el glaucoma, evitando los factores que condicionan su progresión y aportando medidas terapéuticas protectoras de la retina. Además, realiza colaboraciones en problemas clínicos no resueltos de la parte anterior del ojo, como la protección o daño del endotelio corneal.

EQUIPO INVESTIGADOR

Investigadores principales Prof. Neville Osborne El Prof. Neville Osborne ha realizado la mayor parte de su carrera profesional en la Universidad de Oxford (Reino Unido), donde ha sido director e Investigador Principal del Laboratorio Nuffield de Oftalmología hasta su incorporación en 2009 al proyecto de la FIO para formar a jóvenes investigadores en el campo de la neurobiología ocular. Para su incorporación a la FIO ha obtenido la “Cátedra en Biomedicina Fundación BBVA” que financia en parte los trabajos de esta unidad de investigación.

Investigadores pre-doctorales Dña. Susana del Olmo Licenciada en Biología por la Universidad de León y Máster en Ciencias de la Visión por la Universidad de Valladolid. Con la aceptación de su tercera publicación sobre el tema, presentará su tesis doctoral durante el presente curso en la Universidad de Oviedo.

Dña. Claudia Núñez Licenciada en Biotecnología por la Universidad de León. Inició su vinculación a la FIO con su asignatura de “prácticas de empresa” y posteriormente fue contratada como becaria de postgrado.

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Líneas de investigación El Grupo de Neurobiología de la Retina dirigido por el Catedrático de la Universidad de Oxford, el Profesor Neville Osborne, estudia los mecanismos por los que se producen ciertas enfermedades degenerativas de la retina, entre otras el glaucoma y la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Este grupo de investigación no sólo tiene como objetivo comprender las causas de estas enfermedades, sino que trata de encontrar dianas terapéuticas que puedan ayudar a tratar estos procesos neurodegenerativos en un futuro. El glaucoma es una patología multifactorial que deriva en una neuropatía óptica y constituye una de las principales causas de ceguera irreversible en el mundo con una prevalencia que oscila entre el 1,5% y el 2% en los mayores de 40 años. Según datos de la Organización Mundial de la Salud, el número de casos de glaucoma identificados en el mundo se incrementa en 2,4 millones cada año. Existen diferentes tipos de glaucoma, aunque el más frecuente es el glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA), que representa el 60% de los casos. Se conocen varios factores de riesgo que hacen más probable su aparición, como una elevada presión intraocular, antecedentes familiares y la existencia de miopía o diabetes. Es una neuropatía óptica que se caracteriza por la pérdida progresiva de fibras nerviosas de la retina y el nervio óptico, el tipo celular que conforma la capa más interna de la retina: las células ganglionares de la retina (CGRs). El nervio óptico está compuesto por los axones de estas CGRs y su integridad es vital para transmitir hasta el cerebro la información visual captada por los fotorreceptores. Comprender los eventos que conducen a la pérdida de CGRs en el glaucoma y otras patologías, ofrece la posibilidad de aplicar diferentes estrategias en el desarrollo de tratamientos para estos pacientes. Hasta la fecha, el tratamiento del GPAA se ha centrado en la disminución de la presión intraocular y la administración de sustancias neuroprotectoras. Las investigaciones de los últimos años han arrojado datos fascinantes sobre el mecanismo fisiopatológico de daño neuronal a nivel celular e histoquímico. La muerte celular axonal puede ser causada, entre otros factores, como resultado de aminoácidos excitatorios, por ejemplo el glutamato, que es un neurotransmisor. La excitotoxicidad de las CGRs es mediada por sobreestimulación de un subtipo de receptor de glutamato, el N-methyl- D aspartato (NMDA). Desafortunadamente, ensayos clínicos con sustancias bloqueantes de estos receptores de glutamato (por ejemplo la memantina) han arrojado datos pocos esperanzadores para estas estrategias. Por ello, es necesario seguir investigando en líneas que abran nuevas vías para posibles tratamientos. Dentro de este propósito, una de las líneas más destacadas del grupo del Profesor Osborne es el estudio de la luz y el efecto que ésta tiene en pacientes con DMAE o glaucoma. Se ha observado que las longitudes de onda corta de la luz visible (la luz del sol, la luz blanca de lámparas y diferentes utensilios de la vida cotidiana) podrían ejercer un efecto negativo en pacientes con dichas enfermedades, pudiendo acelerar el desarrollo de las mismas. Durante estos años, el grupo de Neurobiología de la Retina ha centrado sus estudios en cómo esas diferentes longitudes de onda afectan directamente a las mitocondrias, orgánulo celular encargado de producir la energía de la célula. Las CGRs son un tipo celular con gran cantidad de mitocondrias y muy dependientes de éstas, ya que requieren de mucha energía para realizar su función. En pacientes con glaucoma y DMAE, las mitocondrias se ven afectadas, y las células pueden ver su estado energético tan disminuido que llegue a afectar a su viabilidad y acaben muriendo, provocando el subsecuente agravamiento de la enfermedad. Se ha descubierto, como se explicará más adelante, que la luz afecta directamente a las mitocondrias de estas CGR, de ahí que parte de las líneas de investigación del grupo se centren en conocer los diferentes efectos de las diferentes longitudes de onda en las mismas. Paralelamente a estos estudios de la luz, el grupo del Profesor Osborne también trabaja en el conocimiento a nivel molecular de estas enfermedades, lo cual nos permite entender su mecanismo de acción, y por tanto dar lugar a nuevos tratamientos más específicos y efectivos. La búsqueda de sustancias que tengan un efecto neuroprotector y puedan utilizarse como tratamiento en las diferentes enfermedades neurodegenerativas de la retina es por lo tanto otra de las prioridades de estudio del grupo conformado por estos tres investigadores.

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a) Determinar los efectos de la luz en los tejidos oculares: prevención de determinadas patologías. Además de la piel, los ojos son los órganos más susceptibles a la luz tanto solar como artificial, por lo tanto están expuestos al daño que ésta puede causar. La radiación solar a la que se expone el ojo se encuentra dentro del rango de las ondas ultravioleta (UV) B, (280 a 315 nm), UV-A (315 a 400 nm) y la luz visible (400 – 800 nm). La luz se transmite a través del ojo y directamente llega al cerebro dónde se comunica con la región de la vista así como con los ritmos circadianos. Por lo tanto, no se puede decir que la luz absorbida por los tejidos no sea benigna. Bajo ciertas circunstancias el ojo puede ser dañado por la radiación de la luz solar o artificial. Los factores primarios que determinan si la radiación de la misma puede dañar al ojo humano son propiedades como la intensidad, longitud de onda de emisión y longitud de onda recibida por los tejidos oculares así como la edad del receptor y si ese ojo sufre o no de alguna patología. Por lo general, cuanto mayor es la intensidad de la luz, más capaz es ésta de dañar el ojo. La luz, que según lo explicado, de manera ordinaria no debería ser perjudicial, pero sí es cierto que puede causar daño agudo en caso de ser lo suficientemente intensa, Se sabe, por ejemplo, que el ojo puede ser dañado temporal o permanentemente por la exposición a la luz solar reflejada de la nieve (ceguera de la nieve, snow blindness) o por mirar fijamente al sol durante un eclipse ya que en ese momento hay un aumento en la radiación UV que se produce, lo cual se suma al adelgazamiento de la capa protectora de ozono. De manera similar, el ojo puede ser susceptible de daño por fuentes de luz artificial que emiten UV-A o UV-B. El daño lumínico acumulativo suele provenir de exposiciones menos intensas durante largos períodos de tiempo y suele ser el resultado de una pérdida de protección antioxidante encubierta relacionada con la edad. La radiación ambiental, del sol o de fuentes de luz artificiales, contiene cantidades variables de UV-C (100-280 nm), UV-B, UV-A así como de luz visible. Cuanto más corta es la longitud de onda de la luz, mayor es su energía y por lo tanto mayor el potencial que tiene para causar daño a los tejidos biológicos. En contraste, las longitudes de onda largas son menos energéticas, pero pueden penetrar más profundamente en los tejidos. Para que ocurra una reacción fotoquímica, las longitudes de onda emitidas desde una fuente deben ser absorbidas en un tejido ocular concreto. Tanto los ojos de primates como de humanos poseen unas características de filtración de la luz únicas que determinan en que área del ojo se absorberán las diferentes longitudes de onda de la luz (fig. 1). Toda la radiación que se encuentra por debajo de los 295 nm se filtra en la córnea humana, esto engloba a toda la radiación UV-C y a parte de la UV-B. Posteriormente esta radiación se encuentra con el cristalino. Las características de transmisión de la luz de esta estructura ocular, cambian de manera notable con la edad. En adultos el cristalino absorbe luz UV-B por encima de los 295 nm y toda la radiación UV-A. En humanos no adultos, especialmente en los niños, el cristalino transmite un pequeño rango de luz UV-B (320 nm) a la retina, mientras que los cristalinos más envejecidos filtran una mayor cantidad de la luz visible de onda corta perteneciente al espectro azul (400 – 500 nm). Las características de transmisión a lo largo de los tejidos oculares son también diferentes entre especies. Los cristalinos de los mamíferos que no son primates permiten el paso de la luz UV más larga de 295 nm a la retina.

Figura 1. Transmisión de la luz ultravioleta en el ojo humano adulto. La córnea absorbe radiación UV de longitudes inferiores a 295 nm. Parte de la radiación UV-A y UV-B transmitida por la córnea se absorbe en el cristalino. Sólo la luz visible (aproximadamente de 400 a 800 nm) alcanza la retina.

La mayoría del daño que se produce por la luz ambiental a los ojos tanto adultos como jóvenes, se evita gracias a que el ojo se encuentra protegido por un sistema muy eficiente de antioxidantes. Además, hay pigmentos protectores que se localizan en las retinas y cristalinos de ojos jóvenes y adultos que absorben la radiación ambiente y disipan su energía sin causar daño. De manera normal, en la mácula de la retina (zona central) se encuentran moléculas antioxidantes como luteína y zeaxantano, así como vitamina E, glutatión y otros antioxidantes que se localizan en la extensión de los tejidos oculares para proteger a la retina contra daños tanto inflamatorios como foto-oxidativos. Desafortunadamente, con la edad estos agentes protectores se ven mermados. Alrededor de los 40 años de vida, se ocasiona una disminución en la producción de las enzimas antioxidantes oculares, así como de los antioxidantes de bajo peso molecular, y por lo tanto la retina pierde su protección contra la toxicidad de las especies reactivas del oxígeno (EROs). Además, el contenido y función de la cardiolipina, molécula que facilita la retención del citocromo C en las mitocondrias, se ve disminuida de manera progresiva en humanos de más edad, llegando a tener niveles hasta de un 60% del valor detectado en niños por lo que su labor de prevención de la apoptosis se ve también disminuida. El citocromo c es un transportador de electrones hidrosoluble que se encuentra en el espacio intermembrana de la mitocondria, y es responsable del desarrollo de la vía apoptótica (muerte celular programada) relacionada con la mitocondria.

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El epitelio pigmentario de la retina y la coroides contienen otro pigmento, melanina, que absorbe luz UV y luz visible de onda corta protegiendo así a la retina contra el daño lumínico. Con la edad, la melanina ocular se ve afectada por la luz y pierde su efectividad protectora contra ese daño. De la misma manera, los pigmentos protectores son modificados químicamente y debido a esa transformación esos pigmentos también pueden dañar tanto al cristalino como a la retina por la exposición a la radiación ambiente.

b) Establecer el mecanismo general por el cual la luz causa daño al tejido ocular: conocimiento de las posibles dianas terapéuticas. La exposición crónica a la radiación lumínica poco intensa daña al tejido ocular a través de reacciones de foto-oxidación. En este tipo de reacciones de oxidación, los cromóforos situados en los tejidos oculares absorben UV o luz visible, y producen EROs como superóxidos y singletes de oxígeno, los cuales dañan a esos tejidos. Estos cromóforos pueden ser endógenos (naturalmente contenidos) o exógenos (dirigidos a esos tejidos, como principios activos, nanopartículas, etc.) que se hayan acumulado en el ojo. La absorción de la luz por lo general excita al cromóforo hasta un estado transitorio de singlete. El exceso de energía del cromóforo puede ser disipado y emitido como fluorescencia o utilizado en el cruce intersistema hacia el estado de triplete. Así el cromóforo puede volver a su estado energético inicial por disipación de la energía en exceso o por fosforescencia. Las EROs generadas durante ese proceso pueden causar un daño transitorio en las células. La retina en el ojo de los mamíferos está compuesta por diferentes tipos celulares, entre ellos las células llamadas fotorreceptores. Hay dos tipos de fotorreceptores, los conos y los bastones, que son los tipos celulares que procesan la luz recibida y la transforman en señales electroquímicas. El resto de células de la retina se corresponden con la llamada parte neural (CGRs, amacrinas, bipolares y horizontales) que transducen las señales lumínicas a lo largo de la retina y hacia el nervio óptico. Tras la capa de células fotorreceptoras se encuentra el epitelio pigmentario de la retina (EPR) formado por células en monocapa que se separan de la coroides gracias a la membrana de Bruch. Las células del EPR son la monocapa celular más distal de la retina, y transportan iones, agua y productos metabólicos finales del espacio subretiniano a la sangre y llevan nutrientes como glucosa, retinol y ácidos grasos en la dirección contraria, desde la sangre a los fotorreceptores. Es más, las células del EPR fagocitan los segmentos externos de los fotorreceptores dañados por la luz mediante un proceso regulado por los ritmos circadianos, en el que reciclan a los mismos mediante digestión, y posteriormente devuelven los elementos esenciales de sus componentes al resto de los fotorreceptores. Aun así, hay una parte de material no digerido que se acumula de manera progresiva con la edad, y se almacena en los lisosomas como un pigmento o cromóforo llamado lipofuscina que puede absorber determinado tipo de luz del espectro visible. La luz azul de longitud de onda corta (430 nm) de manera significativa daña la retina de adultos. Los estudios llevados a cabo en animales incluyendo primates muestran como cortas exposiciones a la luz, de menos de 12 horas, a relativamente alta intensidad, pueden inducir daños en los fotorreceptores y en las células del EPR. El efecto foto-tóxico mayor, fue el producido por la luz de longitudes de onda cercanas a los 430 nm, de ahí la denominación de “hazard blue light”. El daño por luz observado en retinas de ratas sometidas a experimentos, da lugar a una degeneración retiniana que exhibe signos de degeneración macular asociada a la edad (DMAE) de tipo atrófica entre los que se incluyen la degeneración tanto de fotorreceptores como de EPR y atrofia de los coriocapilares. El daño fotópico observado en las células del EPR es dependiente de oxígeno y se puede ver disminuido por antioxidantes, lo cual sugiere que el efecto de la luz azul está asociado con el estrés oxidativo. Los cambios dramáticos observados en los fotorreceptores y el EPR tras la exposición a la luz hicieron que las investigaciones se dirigiesen a encontrar cromóforos potenciales que pudieran ser capaces de absorber la luz de la región azul del espectro y convertir esa energía excesiva en la producción de intermediarios reactivos. El daño a fotorreceptores puede ser mediado por la rodopsina la cual se ve afectada por la luz azul, causando un bleaching fotorreversible de esta molécula y además incrementando la generación de intermediarios tóxicos de la vía de formación de la rodopsina. Hay varios cromóforos endógenos del RPE entre los que se encuentran la melanina, la enzima mitocondrial citocromo C oxidasa y la riboflavina que pueden actuar como fotosensibilizadores potenciales y pueden ser responsables de que esta luz visible de longitud de onda corta, dañe el EPR. La forma reducida de la citocromo C oxidasa absorbe principalmente luz azul con un máximo de absorción en 440 nm. La luz azul (425 ± 20 nm) puede inducir la generación de EROs por citocromos mitocondriales, inhibir la citocromo C oxidasa y causar por lo tanto una depleción de ATP así como una acumulación de calcio e iniciar la cascada de muerte celular programada o apoptosis.

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c) Estudio de la influencia de la luz visual en la mitocondria: estrategias neuroprotectoras. Las mitocondrias se encuentran en altas densidades en los fotorreceptores de la retina así como en los axones de las CGR a la altura del globo ocular. Existen evidencias experimentales que muestran como claramente la luz del espectro visible puede afectar a la función mitocondrial y como esta luz azul de onda corta, que de manera general se define por encontrarse entre los 400 y 450 nm en la zona violeta/azul del espectro, afecta a la función mitocondrial de manera diferente a como lo hacen las ondas de la luz de longitudes de onda larga (a partir de los 750 nm en adelante) situadas en el lado opuesto del espectro. De manera significativa, la luz azul de onda corta opuesta a la luz roja, afecta de manera negativa a la función mitocondrial. Se ha propuesto que de las mitocondrias situadas en los diferentes tipos celulares, aquellas que están en alta densidad en los axones de las CGR son las que pueden verse más afectadas por la luz azul perteneciente al espectro visual de la luz normal, principalmente porque la retina externa (EPR y fotorreceptores) se encuentra protegida en parte por los carotenoides maculares localizados en los axones de los fotorreceptores y en la capa plexiforme externa de la retina, absorbiendo con una máxima sobre los 450 nm (fig. 2). Una de nuestras hipótesis de trabajo consiste en que la mitocondria en las CGR, de manera normal no se ven afectadas por esta luz azul, pero cuando estas CGR se encuentran comprometidas como ocurre en enfermedades de tipo glaucoma o retinopatía diabética la incidencia de este tipo de luz puede tener una consecuencia negativa en la supervivencia de estos tipos celulares (fig. 3).

Figura 2. Esquema de ojo humano con detalle de la retina. Sobre el 1% del número total de receptores que se localiza en la fóvea están protegidos por los pigmentos maculares que absorben luz azul.

Figura 3. Esquema de mitocondrias pertenecientes a células ganglionares de retina (RGC) en presencia o ausencia de longitudes de onda corta (SWL) en diferentes condiciones y su relación con la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS). En este esquema se propone que en ausencia de SWL alcanzando la retina, como ocurre durante la noche (cuadrante superior izquierdo, A), las mitocondrias de las RGC funcionan de manera óptima para producir energía en forma de ATP, así como de ROS requeridas para varias funciones celulares normales. Un escenario similar se produce cuando la luz del día incide sobre las retinas (cuadrante superior derecho, B) en el que aunque aumente ligeramente la producción de ROS, ésta se mantiene en rango. Cuando las mitocondrias de las RGC se ven afectadas, como ocurre en el glaucoma, diabetes, envejecimiento y en ciertos tipos de neuropatías ópticas heredadas (cuadrante inferior izquierdo, C) la producción de ATP se ve afectada y por lo tanto compromete a la generación de ROS que causa de manera progresiva estrés oxidativo y eventualmente la muerte celular. Se propone que este escenario es exacerbado por la influencia de SWL en las mitocondrias de RGC según se muestra en la figura D (cuadrante inferior derecho).

Durante la respiración normal de la mitocondria, los electrones que se obtienen de la oxidación de los sustratos respiratorios (NADH y FADH2) son transferidos a lo largo de la cadena de transportadores (complejos I, II, III y IV) que están situados en la membrana mitocondrial interna (fig. 4).

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Figura 4. La cadena de transporte de electrones genera niveles óptimos de ATP y radicales libres cuando existe suficiente oxígeno disponible para unirse al complejo IV o citocromo c oxidasa. Este proceso requiere los sustratos NADH y FADH2, para que donen los electrones (flechas negras) a la cadena de transporte de electrones a los complejos I y II y transferirlos a lo largo de la cadena por otros transportadores (ubiquinona: Q, complejo III, citocromo c: Cyt C y complejo IV también llamado citocromo C oxidasa) también situados en la membrana mitocondrial interna. En los complejos I, III y IV los electrones se emplean para translocar protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana (flujo representado por las flechas rojas finas). Este proceso genera un gradiente de potencial proto-electroquímico a lo largo de la membrana mitocondrial interna, conocida como fuerza protón-motriz. Esta fuerza (marcada con flechas gruesas rojas) se usa para actividades que disipen este gradiente, incluyendo la generación de ATP por la enzima ATP-sintasa, principal vía para retornar los protones a la matriz. Tanto la luz azul como la roja son absorbidas particularmente por el complejo IV. La luz azul es también absorbida por los complejos I y II y probablemente otros componentes de la mitocondria.

Los electrones de las moléculas NADH y FADH2 se incorporan a la cadena de transporte de electrones en los complejos I y II respectivamente. En los complejos I III y IV, los electrones transmitidos se utilizan para la traslocación de protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana. Este proceso genera un gradiente de potencial electroquímico dependiente de protones que produce a su vez una fuerza protón motriz que ayuda a la generación de ATP por la ATPsintasa, principal proceso por el que los protones regresan al espacio de la matriz mitocondrial. El complejo IV o citocromo oxidasa es el sitio primario en el que se consume oxígeno y por ello es un sitio primordial en la fosforilación oxidativa y en la generación de ATP. Numerosos estudios han mostrado que la luz que incide en la retina (400 – 780 nm) es absorbida por complejos enzimáticos, particularmente la citocromo oxidasa (COX) del sistema mitocondrial de transporte de electrones. Esta COX absorbe tanto la parte azul como la parte roja del espectro de luz visible y existen evidencias para sugerir que los diferentes tipos de luz alteran las características de este complejo IV de una u otra forma, de manera que el flujo de electrones/protones de la respiración mitocondrial se ve reducido (luz azul) o incrementado (luz roja). Otra enzima mitocondrial, el citocromo P450, también es capaz de absorber la luz de longitudes de onda que rodean los 450 nm cuando se une a monóxido de carbono. Flavinas como la riboflavina (vitamina B2) y los flavoproteín nucleótidos son componentes esenciales de muchos sistemas enzimáticos tanto mitocondriales como citosólicos. El espectro de absorción de las flavinas se encuentra entre los 450 y los 520 nm y cuando se activan inducen la oxidación de diferentes sustancias así como la generación de peróxido de hidrógeno. Estas flavinas incluyen al complejo I, al complejo II y a la proteína “Apoptosis inducing factor” (AIF). Las porfirinas también son diana de la luz azul y han sido estudiadas de manera amplia en el contexto de la terapia fotodinámica. Se han encontrado también presentes en la membrana mitocondrial interna, por lo que son también potenciales dianas de la luz azul en esta localización. Mientras que la manera precisa en la que las diferentes longitudes de onda afectan a la función mitocondrial está aún por establecer, hay evidencias claras de que la luz azul afecta a varios complejos de la cadena de transporte de electrones mientras que la luz roja tiene asociado su sitio de acción al complejo IV (fig. 4). Se sabe que la retina humana se protege en parte de las longitudes de onda cortas dañinas gracias a la córnea que absorbe luz en longitudes por debajo de los 295 nm, y por el cristalino que absorbe longitudes inferiores a los 400 nm. Las CGRs conforman una red axonal repleta de mitocondrias que están expuestas por completo a esa luz incidente en parte filtrada por estas estructuras previas, pero a la que llega el espectro visible completo de 400 a 900 nm aproximadamente, así como alguna longitud de onda perteneciente al infrarrojo. Nuestros estudios recientes han demostrado que de manera inequívoca la luz azul, opuesta en el espectro de la luz visible a la luz roja, tiene un efecto negativo en mitocondrias aisladas y que causa muerte celular en ensayos in vitro al contrario que la luz roja. Existen muchas evidencias en la actualidad sobre los efectos beneficiosos que se generan en los tejidos expuestos a altas intensidades de luz roja (más de 10.000 lux). Este proceso conocido también como fotobiomodulación o NIR-fototerapia (Near infrarred phototherapy) es capaz de favorecer la cicatrización de heridas, causar la propagación del complemento, atenuar la muerte celular provocada por diferentes daños en varios tipos de células en cultivo y mejorar las tasas de recuperación de tejidos blandos

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dañados como por ejemplo ocurre en infartos de miocardio. El mecanismo por el cual esta terapia presenta estos efectos positivos está muy relacionado con la COX ya que como hemos dicho esta luz roja aumenta la función mitocondrial y de esta forma reduce el estrés oxidativo, la inflamación y la muerte celular (fig. 5). Es importante también remarcar que las longitudes de onda largas NIR a altas intensidades tienen la habilidad de penetrar profundamente a través de los tejidos y se ha mostrado como son capaces incluso de llegar al cerebro donde pueden mejorar daños traumáticos. En el caso del ojo, la fototerapia-NIR ha sido empleada para proteger contra la muerte a fotorreceptoFigura 5. Resumen de los efectos positivos reportados que se detectan res in situ así como para mitigar la degeneración inducida por con el uso de luz de onda larga cercana al infrarrojo. Se muestran los oxígeno. Es más, la luz infrarroja induce regeneración nerviosa efectos de esta terapia NIR aplicados en diferentes regímenes tanto en incluso en daño neuronal cerebral in situ. Por lo tanto es estudios de laboratorio como en síntomas clínicos en el hombre. posible que esta terapia de luz roja penetre a través del resto de tejidos del ojo hasta alcanzar a las CGR donde esa influencia positiva podría traducirse en una activación de las mitocondrias de las mismas. El posible uso terapéutico del tratamiento con NIR a través de los tejidos blandos del ojo externo facilita de esta manera una posible vía de administración que atenúe la pérdida o muerte celular de las CGR en patologías como el glaucoma u otras enfermedades retinianas. Nuestros actuales estudios en animales aún en progreso dan soporte a estos posibles tratamientos ya que por ejemplo la luz roja de baja intensidad (2500 lux) no tiene efecto negativo en las células en cultivo cuando es administrada por un corto período de tiempo (fig. 6). Figura 6. Resultados de un ensayo de viabilidad. La gráfica muestra el resultado de un ensayo de viabilidad llevado a cabo con el método de la reducción de Resazurina, en el que se muestra el efecto de luz azul (465 – 470 nm, 400 lux), blanca (400 – 800 nm, 1000 lux) y roja (625 – 635 nm, 1000 lux) durante 24 o 48 horas, en la supervivencia de células RGC-5 (línea celular estable de células que expresan marcadores de CGRs) en cultivo. Se puede ver cómo la luz roja no tiene casi influencia en las mismas, mientras que la luz blanca y particularmente la azul reducen de manera significativa la supervivencia celular. Los resultados se expresan como la media ±SEM para los diferentes valores obtenidos.

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PROYECTO 1 La luz roja de baja intensidad atenúa los efectos negativos de la isquemia/reperfusión en la retina. La isquemia es un proceso que priva a los tejidos afectados de 3 requerimientos básicos: oxígeno, sustratos metabólicos y eliminación de los productos de deshecho (Osborne et al 2004). La pérdida de estos requerimientos disminuye la respuesta homeostática en los primeros momentos y, con el tiempo, produce daño en los tejidos. Más aún, la reperfusión también puede dañar las células que, hasta ese momento, se han mantenido potencialmente salvables durante ese periodo de daño reversible. Es conveniente tener en cuenta que la retina tiene 3 vías de suplemento sanguíneo: El suplemento de sangre a la retina, el suplemento de sangre coroideo y el suplemento de sangre de la cabeza del nervio óptico. La isquemia causa, bien por unas u otras vías, que este suplemento sanguíneo se vea afectado y por lo tanto está implicada en una gran variedad de enfermedades oculares. En modelos de isquemia de retina holangiótica (retinas que carecen de arteria central, como ejemplo, las retinas de rata y humano) la obstrucción ocurre mediante los suplementos sanguíneos coroidales y retinianos. Ésta situación ocurre cuando la presión intraocular es elevada, como se ha llevado a cabo en nuestros estudios en modelo animal de rata Wistar. En estos casos, los fotorreceptores se ven afectados por daños tanto funcionales como estructurales, pero en menor medida que la retina interna y las CGRs, que presentan muerte celular al igual que en la patología del glaucoma. En el caso de los conejos su retina es meriangiótica (parcialmente vascularizada) y ocurre la situación inversa, indicando cómo en la fisiopatología la variación entre especies tiene gran importancia. La explicación para éste fenómeno en retinas vascularizadas no es aún clara, pero quizás esté relacionada con la habilidad excepcional que tienen los fotorreceptores para extraer energía de fuentes disponibles de manera anaeróbica. La compleja fisiopatología de la isquemia retiniana enfatiza la dinámica relación que existe entre la retina y su suplemento vascular. La reducción incipiente del aporte sanguíneo coroideo, retiniano o de la cabeza del nervio óptico por separado causará diferentes patologías retinianas que aquellas desarrolladas cuando todos los aportes se ven afectados al mismo tiempo. La merma de la energía celular almacenada hasta el umbral crítico (que puede variar para tipo celular de la retina) desencadena ondas de despolarización, así como una serie de eventos moleculares conocidos como la “cascada isquémica” (que también puede variar para cada tipo celular de la retina) sin estar relacionada de manera directa con el mecanismo inicial del compromiso vascular. Por lo tanto, diferentes tipos de cambios vasculares en el aporte sanguíneo de la cabeza del nervio óptico se sugieren como responsables de patologías retinianas similares, como se propone en el caso del glaucoma (Osborne et al., 2004). En nuestros experimentos, los animales fueron anestesiados y colocados en un dispositivo estereotáxico para inducir una isquemia experimental. En cada animal se utilizó un ojo como control y en el otro se indujo un aumento de presión intraocular (PIO) que llegó a alcanzar los 140 mmHg (fig.7). La elevación de esta PIO fue mantenida durante 60 minutos y la isquemia fue confirmada por el blanqueamiento del fondo de ojo. Éste proceso fue llevado a cabo en oscuridad o bajo un dispositivo emisor de luz roja dirigido a través de la pupila. La misma intensidad de luz roja aplicada a células RGC5 (línea celular estable de CGRs de retina) en cultivo, a una distancia similar a la empleada en los animales, no causó ningún daño en estos cultivos durante este mismo periodo de 60 minutos. La figura 8 muestra cómo una isquemia con 7 días de reperfusión provoca efectos significativos en la inmunolocalización normal de diferentes antígenos en secciones de retina, siendo estos cambios menos evidentes cuando la luz roja fue utilizada durante el proceso. Este hecho se ve reflejado para las proteínas ligantes de calcio de bajo peso molecular (calretinina y calbindina) y también para la proteína acetiltransferasa de colina (ChAT). En las secciones control la localización de la calretinina en los somas se ven en la capa nuclear interna y en la capa de CGRs con el característico tri-estrato de terminales en la capa plexiforme interna. La inmunorreactividad de la calbindina está predominantemente asociada a las células horizontales y a las dendritas de la capa plexiforme externa. La localización de ChAT se caracteriza en las secciones control por 2 capas de terminales en la capa plexiforme interna y cuerpos celulares en ambos lados. Los cambios claros en la inmunolocalización de calbindina, calretinina y ChAT, causados por la isquemia/reperfusión son obviamente meno-

Figura 7. Protocolo experimental utilizado en los estudios. La isquemia fue inducida por aumento de la PIO en uno de los ojos del animal hasta 140 mmHg durante 60 minutos. Durante este período, en la mitad de los animales se aplicó la luz roja dirigida hacia la pupila del animal, mientras que la otra mitad del estudio fue llevada a cabo en oscuridad. Se analizaron diferentes parámetros a diversos tiempos de reperfusión para evaluar si los efectos negativos de la isquemia podían ser atenuados con la luz roja.

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res cuando la luz roja se utilizó en el proceso. Este fue también el caso para otra de las proteínas utilizadas como marcador de daño en la retina, la proteína fibrilar glial ácida (GFAP) que está asociada en mayor medida con astrocitos y el final del pie de las células de Müller en la capa de las CGRs y la capa de fibras nerviosas de la retina. Tras la isquemia/reperfusión se observa una intensa elevación de la expresión de GFAP en las células de Müller a lo largo de la retina, que está más reducida de nuevo cuando el dispositivo de luz roja fue empleado. Figura 8. Esta figura muestra la inmunorreactividad para varios antígenos (GFAP, ChAT, calretinina, calbindina) en retinas control o aquellas afectadas por la isquemia, ambas en presencia o ausencia de luz roja. La expresión de GFAP se aumenta en las retinas isquémicas en las que aparece, no solo en los pies de las células de Müller y en astrocitos, sino también en el resto del cuerpo de estas células de Müller y se expande a lo largo de la retina. La isquemia reperfusión causa una clara disminución en la expresión de ChAT, calretinina y calbindina. En las retinas control de las ratas expuestas a la luz roja, la distribución de las expresiones es igual a la observada en los ojos control no expuestos. Así mismo se observa como en los ojos isquémicos sometidos a la luz roja los efectos de la isquemia se ven atenuados.

El examen de las secciones de retina también mostró cómo tras 15 días de reperfusión se veía una disminución del número de CGRs identificadas por inmunolocalización con el marcador nuclear Brn3a así como una pérdida de espesor en el total de la retina (fig. 9D). Secciones de retina de excentricidades similares sugieren que cuando la luz roja fue empleada, el daño causado por la isquemia/ repercusión fue atenuado (fig. 9D). La densidad de las CGRs positivas para el marcador celular Brn3a (que son prácticamente todas) es variable, siendo inferior en la retina periférica que en la media o en la parte central, como se puede ver en las preparaciones de tipo flat del total de la retina (fig. 9A). Figura 9. Resumen de los estudios en CGRs. En esta figura se muestran las secciones de retina de excentricidad similar procesadas para la inmunolocalización de Brn3a (de color verde, es un marcador nuclear de las CGRs) y el marcador nuclear genérico DAPI (azul). El número de células Brna3 positivas no es significativamente diferente en presencia o ausencia de luz roja en retinas control. El daño de isquemia/reperfusión causó claramente una disminución del número de estas células así como un adelgazamiento en la retina, en contraste con las retinas isquémicas tratadas con la luz roja donde este hecho parece atenuarse. La densidad de las CGRs varía en los diferentes puntos de la retina como se muestra en las fotografías de la expresión de inmunorreactividad a Brn3a de los montajes in toto (fig. 9A). Las zonas centrales de la retina muestran una densidad superior a la que se observa en las áreas periféricas. El número de CGRs positivas a Brn3a fue determinado de manera cuantitativa y plasmado en las figuras 9B y 9C. Los recuentos referidos a áreas de 0.3 mm2 se reflejan en la figura 9C, recogidos en el eje temporal a nasal, mientras que la cuantificación referida a las secciones de 6 mm2 se observa en la figura 9B. En ambas se observa como el tratamiento con luz roja parece atenuar estos efectos negativos de la isquemia/ reperfusión.

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Los análisis cuantitativos del número de células positivas para Brn3a en áreas de 0,3mm2, medidas en dirección temporal a nasal, pasando por la región del nervio óptico se muestran en la figura 9C. Se puede ver, cómo la isquemia/reperfusión muestra claramente un descenso de CGRs de retina Brn3a positivas en todas las áreas, cuando estas son comparadas con la cantidad de células en retinas control o tratadas con luz roja. El daño causado por la isquemia/reperfusión causó una pérdida de aproximadamente el 30% de las células Brn3a positivas, mientras que en presencia de luz roja, esta pérdida fue claramente atenuada.

PROYECTO 2 La luz roja de baja intensidad atenúa la desorganización endotelial. Durante los experimentos para ver la eficacia de la luz roja en el modelo de isquemia/reperfusión, se hubo de tener en cuenta que la aplicación de esta luz atravesaba otros tejidos oculares, la córnea y el cristalino. Se analizó por lo tanto, el efecto de la isquemia/ reperfusión de la córnea en presencia y ausencia de luz roja. El endotelio corneal normal es una capa única de células localizada en la superficie posterior de la córnea como se muestra en la figura 10. Para entender la función del endotelio, es importante recordar que la córnea no contiene vasos sanguíneos. En tejidos con vasos sanguíneos, el oxígeno y los nutrientes en sangre son capaces de atravesar las paredes de los capilares para nutrir a las células de los tejidos. En la córnea, la mayoría del oxígeno proviene del aire y atraviesa la película lacrimal, para posteriormente alcanzar la córnea. La mayoría de los nutrientes que necesitan las células corneales están presentes en el humor acuoso. Normalmente, pequeñas cantidades de humor acuoso penetran lentamente entre las células endoteliales y alcanzan las capas centrales del tejido corneal (estroma) donde los nutrientes se vuelven disponibles para el resto de tipos celulares de la córnea. El endotelio contiene proteínas en su membrana externa que actúan como bombas que ayudan a drenar el fluido de nuevo fuera de la córnea, equilibrando así el flujo de fluido en este tejido. Habitualmente el ratio de fluido que penetra en la córnea es igual al ratio de fluido eliminado y este equilibrio ayuda a que la córnea se mantenga transparente y permite que la luz pase a través de ella. Si las células endoteliales decrecen en número, no habrá suficientes para permitir el paso del fluido o para drenar de manera eficaz. Esto puede resultar en un edema Figura 10. Diagrama de la estructura del globo ocular en el que se muestra la posicorneal que causa una inflamación, una disrupción ción del endotelio corneal. Más a la derecha, sección histológica de la córnea en la de la compleja estructura de la córnea y una permaque se observa como el endotelio está compuesto únicamente por una capa celular. nente opacificación de la misma. Actualmente, la única opción para restaurar la visión normal consiste en eliminar la córnea opacificada y trasplantar una nueva. Anualmente se llevan a cabo en USA alrededor de 40.000 cirugías de trasplante de córnea de las cuales aproximadamente el 40% se deben a disfunciones endoteliales. El endotelio corneal es un tejido muy frágil y el número de células que contiene suele decrecer con la edad. Aún así hay causas adicionales de pérdida de estas células, por ejemplo, su número se puede ver reducido tras ciertas cirugías oftálmicas como pueden ser la extracción de cataratas y la posterior implantación de lentes intraoculares, así como traumatismos accidentales en la córnea o como resultado del estrés causado en esta capa por enfermedades como el glaucoma o la diabetes. Es interesante cómo el trasplante de córnea por sí mismo puede causar también la pérdida de células endoteliales, incluso en periodos de varios años tras la cirugía. Las células endoteliales corneales en condiciones fisiológicas normales, tienen una capacidad de replicación finita. En muchos tejidos y órganos, cuando las células mueren, otras células del tejido se dividen para reemplazarlas. El hecho de que la densidad de las células endoteliales (número de células por mm2) decrezca con la edad indica de manera fehaciente que estas células no se dividen o que al menos no se dividen lo suficiente como para al menos reemplazar a las perdidas. En lugar de divisiones celulares como método para mantener la capa de endotelio corneal, las células restantes simplemente se hacen más grandes y se diseminan para llenar las áreas que han dejado vacías las células que se han ido perdiendo. Este método de regeneración del endotelio permite su funcionamiento más o menos normal, aún así, si se pierden muchas células y la densidad cae por debajo de un umbral concreto

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(de la media de una densidad celular en un adulto de alrededor de 2.000 células/mm2 hasta 400-500 células/mm2), quedan muy pocas células para mantener la barrera entre el estroma corneal y el humor acuoso y el fluido penetra de manera libre a la córnea, causando edema y posible ceguera corneal. Es por lo tanto una necesidad clara a nivel mundial el encontrar nuevos métodos para prevenir o disminuir esta pérdida de células endoteliales, así como métodos que incrementen la densidad de las mismas en pacientes que potencialmente pueden sufrir ceguera corneal debida a recuentos bajos de células endoteliales. Una forma de incrementar la densidad de células endoteliales podría ser simplemente utilizar terapia de luz roja de una manera apropiada según se sugiere en nuestros estudios actuales. En nuestros experimentos, la desorganización corneal y la pérdida de estas células fue inducida mediante el aumento de la PIO por el método de isquemia descrito previamente (ver fig. 7). Es de interés remarcar que en este contexto, la pérdida de células de endotelio corneal es conocida en pacientes de glaucoma en los que la presión intraocular es también elevada. El daño en este caso es más un daño mecánico que un insulto isquémico a la capa más interna de la córnea. La figura 11 muestra las células del endotelio corneal in situ, en ratas sometidas a isquemia y a diferentes tiempos de reperfusión, tras la disrupción mecánica causada por la elevación de la PIO. Las córneas fueron teñidas para observar la actividad mitocondrial con el marcador JC-1, un complejo monomérico con emisión de fluorescencia verde, que cuando es procesado por las mitocondrias activas (más polarizadas) se convierte en un polímero con emisión de fluorescencia en rojo. Las córneas control presentaban en esta capa de endotelio muy poca fluorescencia roja incluso en presencia de la luz roja, lo cual sugiere que las mitocondrias en células endoteliales corneales sanas no son especialmente activas. En cambio, inmediatamente tras ser sometidas al estrés mecánico mediante la elevación de la PIO, muchas mitocondrias de estas células parecen despolarizarse y la tinción roja se hace presente (analizadas directamente tras el daño, tiempo 0). Es más, la disrupción de la apariencia normal de mosaico del endotelio corneal, es claramente perceptible. De manera significativa, las mitocondrias tras 90 minutos o 3 días desde el insulto mecánico, no parecen seguir con ese nivel de despolarización.

Figura 11. Imágenes de la capa de endotelio corneal teñidas en vivo. Células del endotelio corneal en córneas control (ojos en los que no se ha elevado la presión intraocular), tanto en ausencia como en presencia de la luz roja, muestran la típica disposición en mosaico que se observa gracias a la acumulación citoplasmática del componente monomérico de la tinción para ver actividad mitocondrial, JC-1. Tras el daño mecánico recibido por el aumento de presión el mosaico se observa interrumpido, apareciendo agujeros en ciertas áreas. Alrededor de estas áreas especialmente, se observa un aumento en la fluorescencia roja debida al procesamiento del monómero verde por las mitocondrias activas, dando lugar a la fluorescencia roja, activación que se vio incrementada en presencia de la luz roja. La aparición de la fluorescencia roja de las mitocondrias activadas tras el daño mecánico parece transitoria y no es visible a tiempos posteriores (90 minutos y 3 días). En el caso de presencia de la luz durante el daño, algunas mitocondrias parecen mantener la activación hasta incluso 90 minutos después de producirse el daño.

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La luz roja aplicada durante el daño mecánico incrementó el número de mitocondrias activas observadas justo tras el insulto. En los tiempos siguientes de 90 minutos, se observó cómo esta activación mitocondrial se mantuvo elevada, hasta su disminución a los 3 días. Interpretamos estos datos para mostrar cómo el endotelio corneal presenta activación mitocondrial cuando se ve alterado durante un corto periodo de tiempo para contrarrestar el daño. Es importante remarcar que este proceso es incrementado y mantenido durante un periodo de tiempo más largo en presencia de la luz roja. Las células endoteliales en vivo forman esa típica apariencia de mosaico gracias a las uniones estrechas que se forman entre la monocapa celular (uniones de tipo Zonula Occludens). Éstas están compuestas por diferentes tipos de proteínas de membrana como claudinas, ocludinas y moléculas de adhesión, proteínas asociadas a la membrana como las Zonulas Occludens ZO-1, ZO-2 y ZO-3, así como filamentos de actina. ZO-1 es una proteína de membrana de 220kDa, que en un principio fue descrita como un componente de las uniones estrechas tanto en células epiteliales como endoteliales. Además, para mantener la función de barrera en epitelios, ZO-1 se ha descrito también como una proteína de señalización celular para múltiples tipos de células, contribuyendo así a la regulación de la proliferación y diferenciación de las mismas. La figura 12 muestra la tinción de las uniones estrechas ZO-1 (en color rojo) que separa de manera individual a las células endoteliales en córneas control y en córneas sometidas a los daños mecánicos en presencia o ausencia de luz roja. La apariencia típica de mosaico de esta capa de endotelio se ve claramente en las retinas control teñidas para ZO-1 y DAPI (marcador nuclear en color azul). Tras 60 minutos de aumento de la PIO, la capa de endotelio corneal aparece interrumpida, y la tinción ZO-1 está claramente desorganizada. En presencia de luz roja este hecho está atenuado. Los resultados muestran claramente cómo la luz roja parece disminuir el daño mecánico que por este método se causa al endotelio corneal.

Figura 12. Imágenes de endotelio corneal analizado tras fijar las córneas y realizar tinciones específicas. Corneas analizadas in toto en las que se tiñó para ver la expresión de DAPI (marcador nuclear, azul) y de ZO-1 (proteína de membrana celular encargada de uniones intercelulares, rojo). El aspecto fisiológico de mosaico es evidente en córneas control sometidas o no a la luz roja. La rotura del endotelio es clara en las corneas isquémicas, aunque ésta se ve reducida en el caso de las córneas bajo el tratamiento de la luz roja durante el daño.

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En la figura 13 se observan secciones de córneas en las que se inmunolocaliza ZO-1 para corroborar las conclusiones mostradas en la figura 12. La PIO elevada parece causar un daño en las células endoteliales que desemboca en la pérdida de las mismas, y este proceso parece ser atenuado cuando durante el daño mecánico se aplica la luz roja.

Figura 13. Imágenes de secciones transversales endotelio corneal analizado tras fijar las córneas y realizar tinciones específicas. Imágenes de Secciones transversales de córnea en las que se observa la expresión de DAPI (marcador nuclear, azul) y de ZO-1 (proteína de membrana celular encargada de uniones intercelulares, rojo). En ambas córneas control, con o sin tratamiento de luz roja durante el insulto, el endotelio aparece teñido con una línea roja continua. Se puede ver en la tinción con DAPI como los núcleos de cada célula siguen una continuidad en esto controles. En las córneas que han sufrido el daño mecánico se observa como esta línea roja es discontinua, aunque en el caso de las córneas tratadas con luz roja durante esos 60 minutos de insulto se ve como esta línea es más estable y se percibe una menor cantidad de superficie desprovista de células.

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PROYECTO 3 Proyecto Retineta. Retos de la sociedad 2014.

Todos estos estudios previos realizados en el contexto de las líneas de investigación que han marcado la pauta en este laboratorio, han servido para que al grupo de Neurobiología de la Retina se le haya concedido un proyecto de financiación a nivel estatal, enmarcado dentro del Programa Estatal de Investigación, Desarrollo e Innovación Orientada a los Retos de la Sociedad perteneciente al Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y de Innovación del Ministerio de Economía y Competitividad. En este proyecto de tres años de duración, el Departamento de Neurobiología de la Retina de la Fundación de Investigación Oftalmológica va de la mano del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega y cuenta con la colaboración de la Fundación asturiana ITMA, expertos en el campo de los materiales. El propósito del mismo, que ha sido clasificado con el nombre de RETINETA, es el “Desarrollo de Nanomateriales luminiscentes para la Neuroprotección y Nanoterapia de patologías oculares en un modelo experimental de daño retiniano por luz”.

El presente proyecto pretende realizar un desarrollo experimental traslacional de inmediata aplicación clínica mediante el estudio de la capacidad neuroprotectora de un innovador sistema de modulación de luz, que puede permitir exponer la retina a luz protectora y bloquear la que induce daño. El sistema de “conversión espectral de luz” mediante nanomateriales luminiscentes ha sido desarrollado por el ITMA y tiene aplicaciones ya transferidas a la industria de la generación de energía solar. Con esta acción se pretende adaptarlo a la industria biomédica. El Instituto Oftalmológico Fernández-Vega ha detectado las necesidades clínicas no resueltas en enfermedades neurodegenerativas de transcendencia epidemiológica como el glaucoma o la degeneración macular asociada a la edad y otras (rosácea ocular, cataratas) que pueden estar relacionadas o agravadas con la exposición a determinadas fuentes de luz y hay datos clínicos donde determinadas longitudes de onda pueden ser protectoras para las mismas. Además cuenta en su personal con unidades de optometría expertas en fotometría, radiometría e iluminación para la medida de parámetros biofísicos y con profesionales de la visión especializados en daño retiniano y de otras estructuras oculares que aportarán desde estudios epidemiológicos a la colaboración clínica en los modelos experimentales. La Fundación de Investigación Oftalmológica ha desarrollado modelos experimentales de daño/protección por luz en cultivos experimentales de retina y modelos experimentales animales de isquemia y neurodegeneración que pueden ser empleados y adaptados para comprobar la eficacia de los sistemas de conversión espectral de luz.

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La posibilidad del uso de estos nuevos nanomateriales como ayuda de valor añadido a la lente oftálmica, lentes de contacto, prótesis intraoculares y/o colirios, se plantea como un área innovadora de gran interés por su versatilidad y adaptabilidad, especialmente en estas enfermedades cuya presentación clínica y progresión puede estar relacionada con la incidencia de la luz de ciertas longitudes de onda y que eventualmente puede ser detenida la progresión o daño con exposición a longitudes de onda “terapéuticas o protectoras”. De ahí, la importancia de la posibilidad de crear películas luminiscentes que redistribuyan el espectro de la radiación visible incidente, filtrando selectivamente las longitudes de onda nocivas y desplazándolas hacia longitudes de onda beneficiosas. El objetivo principal del proyecto es diseñar y desarrollar ayudas de valor añadido a las prótesis oculares (a modo de películas sobre el material de la lente) y otras formas de vehicular los nanomateriales luminiscentes, que permitan la conversión espectral de la luz. Con ello se desarrollarían productos nanoterapéuticos para el campo de las enfermedades degenerativas oculares y en general en el campo de la neuroprotección. Este proyecto fue concedido en Junio de este mismo año, y desde entonces los hitos llevados a cabo incluyen: - La elaboración de un estudio epidemiológico de las principales enfermedades oculares con especial atención a las neurodegenerativas de la retina en base a hábitos de vida y exposición lumínica. - La toma de datos para el desarrollo del proyecto. - La definición de las necesidades médicas no resueltas profundizando en los campos de la medicina regenerativa ocular. - La búsqueda de soluciones biocompatibles así como la evaluación de la posible elaboración de colirios que incorporen las propiedades de los nanomateriales luminiscentes.

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PROYECTO 4 Resultados preliminares de la aplicación de Rapamicina en los procesos de isquemia/reperfusión. La rapamicina es un compuesto producido por Streptomyces Hygroscopicus con importantes propiedades inmunosupresoras, antibióticas y antiproliferativas. Su importancia como posible tratamiento frente al glaucoma radica en que se sabe que es bien tolerada cuando se administra en humanos, de hecho, su uso ya está extendido, por ejemplo, para la prevención de rechazos en diferentes tipos de trasplantes, entre los que destaca el trasplante de riñón. Esta rapamicina actúa sobre REDD1, una proteína que forma parte de la vía de señalización mTOR (Figura 14). Es más, existen estudios que muestran como el efecto protector de la rapamicina radica en que incrementa la función mitocondrial (Bonawitz et al. 2007). Como se ha mencionado previamente, el aumento de la actividad mitocondrial podría ayudar a producir la energía necesaria para las RCGs que se encontrasen en una situación comprometida, ayudando a que éstas no desencadenasen procesos de muerte celular. La diana de la rapamicina en mamíferos o mTOR (por sus siglas en inglés, mammalian Target of Rapamycin) es el componente llave de los complejos de proteína mTORC1 y mTORC2, juega un papel crítico en diversas funciones como por ejemplo, en el desarrollo celular, la regeneración tisular y la reparación, y también gobierna la muerte celular durante la apoptosis o la autofagia. Es sabido que REDD1 está sobre-expresado en neuronas dopaminérgicas en pacientes de Parkinson y altamente expresado en células de modelos de dicha enfermedad. En glaucoma, se ha hipotetizado que el suministro de sangre a las CGRs está por debajo del óptimo. Una respuesta adaptativa importante a una tensión baja de oxígeno o hipoxia conlleva una supresión de los procesos celulares sensibles a la energía y es en parte mediado, a través de la inhibición del complejo mTORC1. Esto involucra a la proteína inducible por hipoxia/ bajo oxígeno REDD1 para causar la inhibición de la actividad de mTORC1. Nuestros estudios sobre la expresión de esta proteína a lo largo de este año, mostraron como tanto el ARNm REDD1, como la misma proteína, se encuentran presentes en las retinas de mamífero y como su localización principal se identificaba con las CGRs. Además, las RGC-5 en cultivo mueren tras un daño con luz azul o con cloruro de cobalto (CoCl2) (agente mimético de hipoxia) y en ambos casos se ve sobre-expresada la expresión de REDD1 durante el proceso. Hay que destacar que en estos estudios preliminares se ve como de manera significativa, tanto un silenciamiento del ARNm de REDD1 como la rapamicina, contrarrestan los efectos negativos de la luz azul y el CoCl2, manteniendo así la supervivencia de las RGC-5. Estos estudios combinados indican que la rapamicina podría ser capaz de frenar el proceso de muerte celular de las CGR in situ mediante el incremento de la función mitocondrial.

Figura 14: Vías de señalización de la diana de la rapamicina. mTOR (Mammalian target of rapamycin complex 1) integra señales de nutrientes (aminoácidos), factores de crecimiento, señales de energía (ATP) y varias señales de estrés como es el caso de la hipoxia (donde RTP801, también conocido como REDD1 es activado) o daño del ADN que regula la síntesis de proteínas, metabolismo mitocondrial, metabolismo de los lípidos y autofagia. La rapamicina interrumpe el ensamblaje del complejo proteico mTORC1, inhibiendo de esta manera la señalización de mTOR.

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Por todo ello, se ha dado comienzo a los estudios de los efectos de la rapamicina como posible agente neuroprotector de la retina en el modelo de daño explicado con anterioridad de isquemia/reperfusión. La rapamicina fue administrada en las ratas Wistar vía inyección intraperitoneal desde unos días antes a la realización de la isquemia. Las inyecciones diarias se mantuvieron hasta la eutanasia de los animales. Para el estudio preliminar de la expresión de marcadores de daño se extrajo el ARNm y se comprobó la expresión del ARNm de la proteína HO-1 así como de GFAP (mencionadas anteriormente) (Figura 15). Estos estudios iniciales muestran como la rapamicina parece disminuir la expresión de estos marcadores de daño, aunque se continúan con los ensayos para determinar el efecto real de esta rapamicina como neuroprotector.

Figura 15. Representación del análisis estadístico preliminar del efecto de la rapamicina en el modelo de isquemia/reperfusión. Se observa el análisis estadístico de la expresión de los marcadores de daño en la retina: HO-1 (A) y GFAP (B). En ambos casos, la rapamicina por sí sola no parece tener ningún efecto significativo en la expresión de ambos ARNm. Por otro lado, se ve como la isquemia aumenta de manera significativa la expresión del ARNm de estas dos proteínas indicativas de daño celular. En el caso de los ojos de los animales tratados con rapamicina, esta expresión se ve disminuida para ambos marcadores.

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4.3 Unidad de Genética Ocular OBJETIVOS El incremento en la esperanza de vida y la disminución de la tasa de natalidad tienen un efecto directo en la proporción de personas mayores de 65 años, grupo poblacional que está aumentando más rápidamente en la mayoría de países desarrollados, incluyendo España. Durante el envejecimiento aumenta el riesgo de padecer ciertas enfermedades, entre las que se encuentran las enfermedades neurodegenerativas. El ojo, considerado como una extensión de nuestro cerebro, no está exento a padecer patologías neurodegenerativas asociadas al envejecimiento, como son el glaucoma y la degeneración de la mácula asociada a la edad (DMAE). Nuestras líneas de investigación tratan de abordar estos problemas de salud pública de gran impacto, ya que tanto el glaucoma como la DMAE son las principales causas de ceguera irreversible en España, y en el mundo. El carácter multidisciplinar de nuestro equipo permite abordar las patologías oculares más relevantes con múltiples “visiones”. Durante el año 2014 la unidad de genética ha centrado sus esfuerzos en potenciar las líneas de investigación dedicadas al diagnóstico precoz del glaucoma mediante biomarcadores proteicos, al estudio de genes de riesgo asociados con la Degeneración de la Mácula Asociada a la Edad (DMAE) y el glaucoma, y al papel que desempeña el zinc y otros elementos esenciales en patologías oculares. Nuestros objetivo último es poder trasladar los resultados obtenidos a la medicina clínica, con el fin de avanzar en la prevención, el diagnóstico precoz, la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y el tratamiento personalizado de las enfermedades oculares más devastadoras. A continuación se describen los proyectos de investigación concretos, con los resultados más relevantes conseguidos a lo largo del año 2014.

EQUIPO INVESTIGADOR

Investigador principal Prof. Miguel Coca-Prados Titular de la “Cátedra Rafael del Pino en Oftalmología en la Fundación de Investigación Oftalmológica”. Doctor en Ciencias Biológicas por la Universidad de Salamanca. Profesor Emérito por la Universidad de Yale (EE.UU)

INVESTIGADORES POST-DOCTORALES Dra. Lydia Álvarez Doctora en Biología y experta en Genética y Biología Molecular.

Dr. Héctor González Doctor en Química y experto en Proteómica y Metalómica.

Dra. Montserrat García Doctora en Biología y experta en Transcriptómica y Bioinformática y que cuenta con la ayuda del subprograma Torres Quevedo cofinanciado por el Fondo Social Europeo.

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Líneas de investigación Éstas líneas, que cuentan con la financiación de la Fundación Rafael del Pino, están perfectamente integradas y coordinadas, existiendo una sinergia total entre ellas con el fin último de trasladar los resultados a la práctica clínica.

PROYECTO 1 Validación de biomarcadores proteicos de glaucoma mediante espectrometría de masas molecular El glaucoma tiene, mayoritariamente, un comienzo asintomático y únicamente existe acceso a los pacientes en estados tardíos de la enfermedad, una vez que la pérdida de la visión es considerable e irreversible. De ahí la gran importancia que tiene el estudio de los signos y síntomas precoces a fin de poder abordarla en sus estados iniciales, evitando su progresión y consiguiente daño irrecuperable en la visión. El glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) y el glaucoma pseudoexfoliativo (GPEX) se encuentran entre los tipos de glaucoma más prevalentes. Dadas las dificultades existentes para realizar un diagnóstico precoz del glaucoma con las técnicas actuales, resulta imperativo diseñar nuevas estrategias para identificar entre la población individuos en estadios tempranos de la enfermedad, así como para el seguimiento de individuos con riesgo de desarrollarla. Por ello, una de nuestras líneas de investigación aborda la búsqueda de biomarcadores de glaucoma en suero con objeto de desarrollar un test de diagnóstico de glaucoma no invasivo, de fácil acceso a los profesionales de la salud y aplicable a grandes cohortes poblacionales. Nuestro grupo de investigación ha trabajado en la búsqueda de biomarcadores proteicos para el diagnóstico de las patologías glaucomatosas más frecuentes, i.e., GPAA y GPEX. En este estudio, publicado en el año 2014, (Comparative proteomic study in serum of patients with primary open-angle glaucoma and pseudoexfoliation glaucoma J. Proteomics, 2014, 98, 65-78), se han encontrado alteraciones en el suero de pacientes con GPAA y GPEX comparados con controles sanos. Se ha podido establecer un panel de biomarcadores candidatos, que forman parte de una red relacionada con la regulación de la respuesta inmune y de procesos inflamatorios. Este estudio proporciona una nueva base para validar las proteínas identificadas como biomarcadores de glaucoma en un cribado multiplexado a gran escala. Resulta imprescindible realizar una validación de los biomarcadores, consistente en el proceso de acreditación de los biomarcadores candidatos mediante el empleo de tecnologías analíticas robustas, reproducibles y cuantitativas sobre un elevado número de muestras. Habitualmente, las metodologías están basadas en inmunoensayos, aunque son poco adecuadas para el control rápido y simultáneo del nivel de muchos biomarcadores en ensayos de rutina. En los últimos años, la Espectrometría de Masas en el modo de adquisición MRM (“multiple reaction monitoring”) se ha consolidado como una técnica de referencia debido a su gran sensibilidad, selectividad, y capacidad de detección. Gracias a nuestra colaboración con el Grupo de Investigación de Isótopos Estables Enriquecidos de la Universidad de Oviedo, dirigido por el Prof. Jose Ignacio García Alonso, se está desarrollando una metodología de cuantificación de proteínas basadas en péptidos diana que permiten análisis cuantitativos a gran escala, resultando muy útiles en la etapa de cualificación de biomarcadores e indispensable en la aplicación de un test de diagnóstico clínico de rutina. Hasta la fecha, se ha comenzado con la puesta a punto de la metodología para 3 de las proteínas candidatas a biomarcadores: Apolipoproteína AIV, complemento C3 y vitronectina. Con este objetivo, se está empleando la metodología “bottom-up proteomics” para la identificación y cuantificación de la proteína de interés a partir de sus péptidos característicos (ver Figura 1). Esta metodología consiste en realizar una hidrólisis enzimática de la muestra (i.e., tripsina) para obtener los péptidos trípticos característicos. Para llevar a cabo la cuantificación, al digerido se le añade una cantidad conocida de un péptido análogo al de interés pero enriquecido isotópicamente. Esta mezcla se analiza mediante cromatografía de líquidos acoplada a un espectrómetro de masas en tándem (HPLC-ESIMSMS), empleándose un triple cuadrupolo en el modo Figura 1. Esquema general del procedimiento desarrollado MRM. Con este análisis se alcanza una alta selectividad y sensibilidad en la determinación permitiendo llevar a cabo determinaciones de proteínas en niveles de partes por billón (ppb). A continuación se describen las etapas específicas llevadas a cabo.

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- Selección de péptidos proteotípicos de las proteínas candidatas a biomarcadores. Se ha llevado a cabo una hidrólisis enzimática de los patrones de las tres proteínas seleccionadas, i.e., Apolipoproteína AIV, complemento C3 y vitronectina, identificándose los péptidos generados y eligiendo aquellos que son proteotípicos. Posteriormente, se han optimizado las transiciones por MRM (Multiple Reaction Monitoring) en el analizador triple cuadrupolo, empleando los estándares de los péptidos, con objeto de seleccionar los iones precursores, que han sido fragmentados en la celda de colisión del analizador de masas triple cuadrupolo. Figura 2. Cromatograma de una mezcla de seis péptidos adquirido mediante Estas transiciones se han empleado en la optimización HPLC-ESI-QqQ en modo MRM. de la separación cromatográfica de los seis péptidos y también en la optimización de todas las variables que afectan a la ionización en la fuente de electrospray (ESI). En la Figura 2 se muestra un cromatograma de la separación de una mezcla con los 6 péptidos preparada a partir de las disoluciones estándar. -Caracterización de los péptidos de abundancia natural y enriquecidos isotópicamente. Los seis péptidos de abundancia isotópica natural se han adquirido comercialmente y purificado mediante HPLC-UV para poder controlar la trazabilidad de todo el proceso. En la actualidad se está realizando la cuantificación de cada péptido por hidrólisis de aminoácidos y su comparación con el resultado obtenido mediante HPLC-IR-MS. Los péptidos enriquecidos isotópicamente se sintetizarán con un sintetizador de péptidos automático. Una vez que los péptidos de abundancia isotópica natural estén cuantificados, se emplearán para determinar la concentración de los péptidos enriquecidos mediante dilución isotópica inversa, y estos serán usados como trazadores. Una vez optimizada la puesta a punto, se procederá al análisis cuantitativo de estas proteínas en el suero de pacientes con glaucoma y controles de una mayor cohorte poblacional. Al mismo tiempo, iniciaremos la puesta a punto de las restantes proteínas que forman parte del panel de candidatos a biomarcadores de glaucoma.

PROYECTO 2 Biomarcadores genéticos del GPEX: Estudio de haplotipos del gen LOXL1 y su relación con el GPEX en la población española. El glaucoma pseudoexfoliativo (GPEX) se desarrolla y es muy prevalente entre individuos con síndrome exfoliativo (SE), siendo la forma más frecuente de glaucoma secundario de ángulo abierto. La asociación del gen Lysyl Oxidase-Like 1 (LOXL1) con SE/GPEX ha sido estudiada en poblaciones de diverso origen geográfico, confirmando a este gen como el factor de riesgo genético más importante conocido hasta la fecha para estas patologías. Sin embargo, las frecuencias de los alelos de riesgo de los polimorfismos de un sólo nucleótido (SNPs) más importantes descritos en LOXL1, son también elevadas entre la población control (individuos sin enfermedades oculares relevantes), y varían entre distintos grupos étnicos e incluso entre poblaciones dentro del mismo país. En este trabajo se han identificado todos los SNPs existentes a lo largo del gen LOXL1, así como en las regiones 3´y 5´ del mismo, en pacientes españoles con GPEX. En concreto, se han identificado un total de 212 SNPs, de los cuales 49 presentaron frecuencias alélicas con diferencias significativas entre los pacientes con GPEX y los controles, y otros 66 que no habían sido previamente descritos. Entre los SNPs identificados, hemos seleccionado los 5 SNPs más relevantes: rs16958477 (localizado en la zona del promotor), rs1048661 (en el exón 1), rs3825942 (en el exón 1), rs2165241 (en el intrón 1) y rs3522 (en el exón 7), y estudiado su asociación con el GPXE en nuestra población. Las frecuencias alélicas de los SPNs rs16958477, rs1048661, rs3825942, y rs2165241 fueron significativamente diferentes entre GPEX y controles. La susceptibilidad a desarrollar la enfermedad aumenta aproximadamente entre 2 veces, en individuos con el alelo de riesgo del SNP rs16958477, y 20 veces, en individuos con el alelo de riesgo del SNP rs3825942. Sin embargo el SNP rs3522 muestra frecuencias alélicas y genotípicas similares en pacientes y controles.

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Por otro lado, al comparar las frecuencias genotípicas para los SNPs rs16958477, rs1048661, rs3825942 y rs2165241 se encontraron también diferencias significativas. Por ejemplo, la frecuencia del genotipo GG del SNP rs3825942 es significativamente más alta en pacientes con GPEX que en los controles, así, la presencia de este genotipo supone un incremento de 20 veces en la probabilidad de desarrollar PEXG. En cambio los genotipos GA y AA, para este mismo SNP, podrían proteger de la enfermedad. Finalmente, el genotipo AA se ha detectado exclusivamente en controles. En resumen, las frecuencias alélicas y genotípicas de los SNPs estudiados del gen LOXL1 indican que el alelo G de los SNPs rs1048661 y rs3825942, y el alelo T del SNP rs2165241 son probablemente las principales variantes genéticas que confieren riesgo de padecer GPEX en la población española. Estos resultados están en consonancia con los descritos para otras poblaciones caucásicas. Por otro lado, el análisis de los haplotipos de riesgo para los SNPs rs16958477, rs1048661, rs3825942 y rs2165241, mostró que el haplotipo CGGT, compuesto por los 4 alelos de riesgo, y el haplotipo AGGT, con el alelo protector del SNP rs16958477 y los 3 alelos de riesgo de los otros 3 SNPs, están significativamente asociados con GPEX, confiriendo un incremento de más de dos veces en la susceptibilidad a la enfermedad. En contraste los haplotipos ATGC y AGAC resultaron ser protectores, en nuestra población. Aunque alguno de los 2 haplotipos de riesgo (CGGT y AGGT) está presente en el 80% de los pacientes con GPEX de nuestra población, incrementando más de 4 veces el riesgo de padecer la enfermedad en relación al resto de los haplotipos identificados (ATGC, AGAC, CTGC y AGGC), y más de 55 veces en relación al haplotipo con menor riesgo (AGAC), estos haplotipos fueron encontrados también en el 46% de los individuos control. La identificación de los SNPs asociados al GPXE representa un primer paso para valorar el riesgo genético relativo de un individuo a padecer esta enfermedad. Sin embargo, la elevada prevalencia de los alelos/haplotipos de riesgo entre los individuos control, junto con las diferencias encontradas entre razas (por ejemplo entre poblaciones caucásicas y asiáticas), limita el valor predictivo de los SNPs asociados con el GPEX. Aun así, aunque estas variantes no sean causantes de GPEX, no se puede descartar que podrían estar en equilibrio de ligamiento con otras variantes de LOXL1, responsables de la enfermedad. La identificación de todos los SNPs localizados en la región del gen LOXL1 abre las puertas a nuevos trabajos para identificar dichas variantes. Además, otros genes, y/o otros factores ambientales están probablemente involucrados en el desarrollo de GPEX. Los resultados obtenidos han sido presentados en forma de Póster en el Congreso Internacional EVER (Niza, Octubre, 2014), habiendo sido galardonado con el premio “EVER 2014 Poster Prize”. Este trabajo ha sido enviado para su publicación en una revista científica de prestigio internacional.

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PROYECTO 3 Estudios de haplotipos del gen CFH y su relación con la degeneración de la mácula asociada a la edad (DMAE) en la población española y búsqueda de biomarcadores génicos. La degeneración de la mácula asociada a la edad (DMAE) es la principal causa de ceguera irreversible entre personas mayores de 65 años. Al menos 60 millones de personas padecen esta patología a nivel mundial, y se espera que esta cifra se triplique en los próximos 13 años. La prevalencia de la DMAE aumenta con la edad, afectando al 2% de la población de edad inferior a 40 años y al 30% de las personas mayores de 70 años. Los síntomas son muy diferentes en cada persona pero en líneas generales se observan indicios como líneas rectas que se ven distorsionadas, ver palabras borrosas y áreas oscuras en el centro del campo visual (Figura 4).

Figura 4: La imagen de la izquierda ilustra la percepción visual normal, mientras que la de la derecha refleja la visión consecuencia de la DMAE.

La DMAE se define como una patología compleja multifactorial por la convergencia de múltiples factores de riesgo, siendo los más importantes la edad, el tabaquismo, la dieta y el genético. Numerosas evidencias indican que los procesos inflamatorios en concreto, el sistema del complemento, juegan un papel clave en el desarrollo de esta enfermedad. Además existen genes asociados a DMAE, destacando Fibl5, ABCA4, ApoE, HTRA1 y ARMS2; genes pertenecientes al sistema del complemento: CFH, CFB, C2, C3 y CFI y a “pathways” relacionadas con el sistema inmunitario: HLA, CXCR1, CCR3, TLR3 y TLR4. Los estudios del “Genome-wide association” (GWAS) han puesto de manifiesto que el gen CFH tiene una fuerte asociación con la DMAE. Estos estudios demuestran un mayor riesgo de desarrollar DMAE en individuos que llevan la sustitución T>C en el exón 9 del gen CFH, que se traduce en un cambio aminoacídico de tirosina a histidina en la posición 402 (Y402H, rs1061170) de la proteína codificada por este gen. Por otra parte también se han descrito haplotipos para CFH con una relación protectora frente a la DMAE, como por ejemplo el integrado por los alelos T (SNP rs3753394), C (SNP rs529825), G (SNP rs800292), T (SNP rs3766404), G (SNP rs203674), T (SNP rs1061170) ,A (SNP rs375396) y G (SNP rs1065489). En esta línea de investigación, hemos evaluado la asociación entre polimorfismos en el gen CFH y la DMAE en una población española (136 pacientes diagnosticados con DMAE y 106 controles), ya que aunque recientemente se han publicado estudios en este campo en la población española, estudios preliminares realizados por nuestro grupo de investigación han puesto de manifiesto la asociación de la DMAE con polimorfismos del gen no descritos hasta ahora. La DMAE no causa dolor alguno al paciente y su diagnóstico se basa en la observación por el personal clínico de una disfunción visual y en la presencia de características maculares específicas. La DMAE presenta dos formas clínicas (forma seca y forma húmeda) con diferente progresión y pronóstico de la patología. En el caso de la forma seca, la patología avanza de un modo tan lento que los pacientes apenas pueden percibir cambios en su visión.

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En el caso de la forma húmeda, la patología avanza de forma rápida pudiendo desencadenar en una pérdida de visión total en ambos ojos. Debido a esta diferente progresión de la enfermedad, nuestro estudio analiza también qué polimorfismos del gen CFH tienen asociación con las distintas formas clínicas de la DMAE. Estos estudios pueden en un futuro sentar las bases de posibles sistemas de prevención distintivos para cada forma clínica. La identificación de polimorfismos (SNPs) y el análisis de los haplotipos asociados a la DMAE en nuestra población es sin duda el primer paso a realizar para la identificación de individuos que puedan padecer esa patología y valorar el riesgo genético en los familiares de primer orden de los pacientes afectados, para proponer sistemas de diagnóstico precoz de la enfermedad y la personalización del tratamiento. Los resultados obtenidos han dado lugar a un artículo científico que se encuentra en fase de preparación y será publicado próximamente en una revista científica de prestigio internacional.

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Unidad de Investigación Clínica Objetivos: La Unidad de Investigación clínica es una característica diferencial de la tradición del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega y realiza fundamentalmente análisis de resultados “outcome análisis” y ensayos clínicos. Esta actividad se viene haciendo desde varias generaciones en el IOFV si bien la metodología se ha ido adaptando a cada momento. El contar con una masa crítica de más de 100.000 pacientes al año, 8.000 cirugías y bases de datos informatizadas para manejar la información, hacen que podamos saber que lentes intraoculares son las más apropiadas a cada paciente o como se puede indicar de forma individualizada un tratamiento ortopédico y refractivo a un paciente con una degeneración progresiva de la córnea como es el queratocono o cómo se puede innovar en el tratamiento quirúrgico del glaucoma, retina o trasplantes de córnea. Además, desde la creación de la FIO, la investigación clínica sirve a la Fundación para aportar problemas no resueltos y fenotipado de pacientes para la profundización en el estudio de las enfermedades.

5.1. Grupo de Segmento Anterior: Superficie Ocular, Córnea, Cirugía Refractiva y Cristalino (Prof. Luis Fernández-Vega Sanz,

Dr. José F. Alfonso, Dr. Jesús Merayo, Dr. Luis Fernández-Vega Cueto-Felgueroso, Dr. José Blázquez, Dr. Carlos Lisa, Dr. Manuel Riaño, Dr. Mariano Yllera, Dr. Miguel Naveiras) Investigadores Principales: Prof. Luis Fernández-Vega Sanz, Dr. José F. Alfonso, Dr. Jesús Merayo

Investigadores Colaboradores: Dr. Luis Fernández-Vega Cueto-Felgueroso, Dr. José Blázquez, Dr. Carlos Lisa, Dr. Manuel Riaño, Dr. Mariano Yllera, Dr. Miguel Naveiras

Colaboran también enfermeros/as, ópticos-optometristas y personal técnico del IOFV.

PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN 1. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN DE LA UNIDAD CLÍNICA DE CIRUGÍA REFRACTIVA 1.1.

CIRUGÍA CORNEAL

1.1.1. Estudio observacional del efecto del plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) en la queratectomía fotorefractiva (PRK). Uno de los factores limitantes en la cirugía refractiva corneal asistida

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por láser excimer es el desarrollo de opacidades corneales o haze, que no solo puede comprometer el resultado refractivo sino también disminuir la agudeza visual, incluso con la mejor corrección. Para evitar esta opacidad se seleccionan los pacientes con miopías bajas y se aplican fármacos antimetaolitos como la mitomicina C.

Por los estudios de laboratorio que se han desarrollado conjuntamente entre el IOFV, la FIO y BTI (Biotecnology Institute, Vitoria) sabemos la capacidad del PRGF para disminuir los miofibroblastos en la respuesta cicatricial de la córnea y estos queratocitos activados son en parte responsables del Haze. El estudio pretende conocer la efectividad de la aplicación tópica del colirio autólogo de PRGF endoret en los pacientes operados de cirugía refractiva y su eficacia en el haze, dolor y calidad de visión tras PRK. 1.1.2.

Estudio de Biomarcadores de patologías de superficie ocular en lágrima Objetivo final: detectar marcadores diagnósticos y terapéuticos en lágrima para mejorar el diagnóstico, realizar tratamientos con base fisiopatológica y monitorizar resultados de tratamientos. Estos estudios se hacen en colaboración con los investigadores de la Universidad de Oviedo y Empresas como Bioftalmics.

1.2. CIRUGÍA NO CORNEAL 1.2.1.

Análisis de resultados de las lentes de epicristalinianas (ICL). Tesis Doctoral de D. Dagoberto Almanzar. Se aborda el problema de la aparición de cataratas tras el implante de lentes intraoculares epicristalinianas y como se ha solucionado con los nuevos diseños de ICL.

1.2.2.

Análisis de resultados de Lentes ICL tóricas: El objetivo es la estabilidad de las ICL tóricas. Hasta la fecha, se han recogido y analizado datos sobre una muestra de 500 pacientes de más de un año de seguimiento. Los resultados se han comunicado en congresos de la especialidad y en tres publicaciones.

2. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN DE LA UNIDAD CLÍNICA DE CIRUGÍA CRISTALINO 2.1. 2.2.

Estudio de la necesidad de láser yag en pacientes con implantes de lentes intraoculares difractivas. Se obtienen resultados sobre que lentes intraoculares producen más opacidad de capsula posterior que es tratada con capsulotomía con láser yag para mejorar la agudeza visual.

2.3.

Estudio Observacional de la Eficacia del los AINES en la cirugía de cataratas con LIO difractiva.

2.4.

Optimización del nomograma de lentes intraoculares fáquicas: Con los datos recabados durante los últimos diez años se realiza un ajuste al nomograma para el implante de estas lentes, con el objetivo de evitar una de las complicaciones más severas en la cirugía con este tipo de lentes intraoculares

En colaboración con la empresa AJL se están desarrollando lentes intraoculares multifocales, lentes intraoculares con capacidad polimérica y desarrollo de anillos capsulares poliméricos

3. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN DE LA UNIDAD CLÍNICA DE QUERATOCONO Y CIRUGÍA ADITIVA DE LA CÓRNEA. 3.1. Análisis de resultados del implante de anillos intraestromales (ICRS) para la corrección del queratocono. (Ver publica ciones). Estudio prospectivo en el que hasta la fecha están incluidos más de 2.000 pacientes. 3.2.

Desarrollo de una clasificación quirúrgica para el implante de ICRS (ver publicaciones). El objetivo es la definición de un nomograma para la indicación ortopédica y refractiva de los ICRS en queratocono.

3.3.

Desarrollo de nuevos anillos intraestromales para la indicación personalizada.

3.4.

Protocolo Clínico de Fenotipado de Queratocono. Análisis de resultados. Base de datos para el fenotipado de queratocono.

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Aplicaciones en la detección de biomarcadores.

3.5.

Desarrollo de una herramienta predictiva para el implante de ICRS. Evaluación de resultados en pacientes externos.

3.6.

Análisis de resultados del implante de ICRS para la corrección del astigmatismo en los trasplantes de córnea.

3.7. Rehabilitación visual en queratocono: ICRS+ICL. Estudio prospectivo sobre córneas queratocónicas sometidas a una intervención con segmentos intraestromales y que han presentado un defecto refractivo susceptible de ser corregido con una lente fáquica. Sobre el análisis de los datos hallados se podrá proporcionar al paciente una opción terapéutica novedosa.

4. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN DE LA UNIDAD CLÍNICA DE QUERATOPLASTIAS 4.1. Análisis de resultados de queratoplastia pseudopenetrante protegida (PPK) 4.2.

Análisis de resultados del implante de endotelio corneal

4.3. Queratoplastia lamelar con córneas criopreservadas 4.4. Sensibilidad corneal en pacientes con queratoplastia tratados con PRGF

5. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN DE LA UNIDAD CLÍNICA DE SUPERFICIE E INFLAMACIÓN OCULAR 5.1.

PRGF en Patología de la Superficie Ocular. Base de datos para el estudio de la eficacia del PRGF en la patología de la superficie ocular. IC: Dña. Ana C. Riestra, Dña. Esther Vazquez.

5.2. Sensibilidad corneal en voluntarios sanos y pacientes con patologías de la superficie ocular. Estudiar su variación con tratamientos con fármacos de aplicación en superficie ocular conocidos y nuevos (mentol) 5.3.

SAHS y Patología Ocular. Evaluar el riesgo de padecer SAHS (síndrome de apnea-hipoapnea sueño) en pacientes con patologías oftalmológicas (Insuficiencia límbica, glaucoma, oclusiones vasculares, DMAE)

5.4.

Presunta Tuberculosis latente en pacientes con patología inflamatoria ocular.

5.5.

Ensayos clínicos

5.5.1. SANSIKA Promotor: NOVAGALI PHARMA. Study number: 2011-000160-97 Título: Estudio de la eficacia de la ciclosporina A en el ojo seco. A multicenter, randomized, double-masked, 2 parallel arm, vehicle controlled, 6 month phase III trial with a 6 month open label treatment safety follow-up, period to evaluate the efficacy and safety of cyclokat 1 mg/ml (ciclosporin/cyclosporine) eye drops, emulsion administered once daily in adult patients with severe Dry Eye Disease (DED) NVG10E117 (N09F1001) (Dr. Merayo) 5.5.2. CACICOL Promotor: Théa Study Number: LT4020-PIII-12/11 Título: Efficacy and Safety assessment of T4020 versus vehicle in patients with chronic neurotrophic keratitis or corneal ulcer- Phase III study, international, multicentre, randomised, double- masked, 2 parallel groups, versus vehicle, in 124 evaluable patients treated for 28 days (Dr. Merayo)

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5.5.3. DOMPÉ Promotor: Pharmanet, Dompé Study Number: NGF0212 Título: Neurotrophic Keratitis- Evaluation of safety and efficacy of RHNGF in patients with stage 2 and 3 Neurotrophic Keratitis (Dr. Merayo) 5.5.4. SYL 1001 Promotor: Sylentis SAU Título: Ensayo piloto para evaluar la seguridad y el efecto del SYL1001 en pacientes con dolor ocular (Dr. Merayo) 5.5.5. SYSTANE Promotor: Alcon Study Number: M-13-027 SEV Título: Evaluation of clinical outcomes following treatment with Systane Balance in Dry Eye Patients with Lipid Deficiency (Dr. Merayo) 5.5.6. PRGF Promotor: BTI Título: Ensayo multicéntrico, por un periodo de 3 meses, para evaluar la eficacia y la seguridad del colirio de PRGF, administrado cuatro veces al día en pacientes adultos con enfermedad de ojo seco (EOS) moderado a grave (Dr. Merayo y Dr. Alfonso) 5.5.7.

ADVISE (Test Adenoplus)

Promotor: Nicox Título: Estudio epidemiológico, prospectivo, multicéntrico y abierto que evalúa las características y la frecuencia de la conjuntivitis adenovírica diagnosticada mediante el Test AdenoPlus™ en pacientes enfermos de conjuntivitis aguda (Dr. Merayo) 5.5.8. AKC023 Promotor: Allergan Study Number: 192371-023 Título: A Multicenter, Randomized, Double-masked, Parallel-group, Vehicle-controlled, Clinical Study of Cyclosporine Ophthalmic Emulsion 0.1% for the Treatment of Atopic Keratoconjunctivitis (Dr. Merayo) 5.5.9.

AMO

Promotor: Abbot Medical Optics Inc. Study Number: EROV- 108- COMP Título: Investigación clínica de seguimiento post- comercialización de la lente intraocular (LIO) de mayor alcance de visión comercializada (Dr. Alfonso)

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5.2. Grupo de Vítreo-Retina

(Dr. Álvaro Fernández-Vega, Dra. Beatriz Fernández-Vega, Dra. Eva Villota, Dr. Manuel Riaño, Dra. Carmen González, Dr. Santiago Morales, Dr. Carlos M. Rangel) Investigadores Principales: Dr. Álvaro Fernández-Vega y Dra. Beatriz Fernández-Vega.

Investigadores Colaboradores: Dra. Eva Villota, Dr. Manuel Riaño, Dra. Carmen González, Dr. Santiago Morales y Dr. Carlos M. Rangel. Colaboran también enfermeros/as, ópticos-optometristas y personal técnico del IOFV.

1. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN - Análisis de resultados del agujero macular. Evolución con y sin cirugía de Membrana limitante interna

2. ENSAYOS CLÍNICOS 2.1. VIVID Promotor: BAYER Study number: BAY 86-5321/91745. V 2.0. Título: A randomized, double masked, active controlled, phase III study of the efficacy and safety of repeated doses of intravitreal VEGF Trap-Eye in subjects with diabetic macular edema. (Dra. Beatriz Fernández- Vega) 2.2. OCTAVE Promotor: Novartis Study Number: CRFB002A2405 Título: A 24-month, phase IIIb, randomized, single- masked, multicenter study assessing the efficacy and safety of three alternative treatment regimens of 0,5mg ranibizumab intravitreal injections guided by functional and/ or anatomical criteria, in patients with neovascular age- related macular degeneration (Dr. Álvaro Fernández-Vega) 2.3. COMO Promotor: Allergan Study Number: MAF-AGN-OPH-RET-004 Título: A 12- Month, Multicentre, Randomised, Parallel Group Study to Compare the Efficacy and Safety of Ozurdex versus Lucentis in Patients with Branch Retinal Vein Occlusion (Dr. Álvaro Fernández-Vega) 2.4. POLARIS Promotor: Bayer Pharma Study Number: AG- BAY- RAN- 2012- 02 Título: Estudio prospectivo no intervencionista para valorar la eficacia del régimen de tratamiento actual con anti factor de crecimiento endotelial vascular (Anti- VEGF) en pacientes con edema macular diabético (EMD) con afectación central (Dr. Álvaro Fernández-Vega)

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2.5. INEYE Promotor: Sociedad Española de Retina y Vítreo Study Number: CRFB002AES03T Título: Ensayo clínico en fase IV, abierto, aleatorizado, de 3 brazos, multicéntrico y de 12 meses de duración, para evaluar la eficacia y seguridad de dos regímenes de tratamiento, bimensual o PRN flexible individualizado de “tratar y extender”, versus un régimen PRN según criterios de estabilización mediante evaluaciones mensuales de inyecciones intravítreas de ranibizumab 0,5 mg en pacientes naïve con neovascularización coroidea secundaria a la degeneración macular relacionada con la edad. (Dr. Álvaro Fernández-Vega) 2.6. TREND Promotor: NOVARTIS Study Number: CRFB002A2411 Título: Estudi8 Fase IIIb multicéntrico, randomizado, de 12 meses de seguimiento con evaluador de la agudeza visual enmascarado, para evaluar la eficacia y la seguridad de ranibizumab 0,5mg en un régimen de tratar y extender comparado con un régimen mensual, en pacientes con degeneración macular neovascular asociada a la edad. (Dr. Álvaro Fernández-Vega) 2.7. DME- 024 Promotor: ALLERGAN Study Number: 206 207-024 Título: Estudio multicéntrico, abierto y aleatorio comparando la eficacia y seguridad del sistema de liberación de fármacos en el segmento posterior Dexametasona de 700 microgramos con Ranibizumab en pacientes con Edema Macular Diabético. (Dr. Álvaro Fernández-Vega) 2.8. MYPATHWAY Promotor: NOVARTIS Study Number: NOV- MIO- 2012- 01 Título: Estudio descriptivo retrospectivo sobre el manejo de pacientes miopes magnos con y sin neovascularización coroidea (NVC) miópica seguidos por el retinólogo. (Dr. Álvaro Fernández-Vega) 2.9. SOLARIS Promotor: Ophtotech Study Number: OPH1004 Título: FASE III doble enmascarada para estudio de eficacia y seguridad en administración intravítrea con Fovista (anti PDGF) administrado en combinación con Avastin, o Eylea con Avastin, o monoterapia con Eylea en pacientes con DMAE húmeda subfoveal (Dr. Álvaro Fernández-Vega)

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5.3. Grupo de Glaucoma (Dr. Pedro Pablo Rodríguez, Dr. Ignacio Rodríguez) INVESTIGADORES PRINCIPAL: Dr. Pedro Pablo Rodríguez

INVESTIGADOR COLABORADOR: Dr. Ignacio Rodríguez

1. PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN - SAHS. Estudio del Síndrome de Apnea e hipoapnea durante el sueño en pacientes con glaucoma de baja tensión.

2. ENSAYOS CLÍNICOS 2.1. LUMIGAN Promotor: ALLERGAN Study number: 192024-054 Título: Estudio, aleatorizado, y multicéntrico con doble enmascaramiento y paralelo de dos años de duración sobre la seguridad del Lumigan 0,1 mg/ml comparado con Lumigan 0,13 mg/ml en pacientes con glaucoma o hipertensión ocular. 2.2. V2000/2012 Promotor: BIOPHTALMIC APPLIED RESEARCH/ AJL OPHTALMIC Study number: V2000/2012 Título: Análisis comparativo de dos variantes en el posicionamiento del implante acrílico Esnoper V2000 en la esclerectomía profunda no perforante.

ÁREA DE DOCENCIA

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Actividad docente

La actividad clínica y de investigación del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega y la Fundación de Investigación Oftalmológica generan una alta capacidad docente, que se materializa en los estudios de grado y post-grado en colaboración con la Universidad de Oviedo y otras Instituciones Académicas. El objetivo final es la formación de investigadores profesionales de la oftalmología y ciencias de la visión, altamente cualificados. Aunque somos conscientes del coste que conlleva la formación, desde la FIO, se apuesta de forma estratégica por ella, ya que es la clave para mantener el cuidado de los pacientes y la actividad investigadora en niveles de excelencia. Por ello, desde que se fundó la FIO se ha dimensionado y regularizado lo que ya se venía haciendo bien en el IOFV. Esto ha sido posible con el acuerdo marco de colaboración con la Universidad de Oviedo y el desarrollo de acuerdos específicos.

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6.1. Estudios de Pregrado El Instituto Oftalmológico es un Hospital Docente de la Universidad de Oviedo donde cursan prácticas alumnos de la Facultad de Medicina, dentro de las Asignaturas Proyecto 1 y Proyecto 2, así como en la especialidad de Oftalmología. A lo largo del año 2014, se ha acogido a más de 60 estudiantes y se estima ese mismo número para el curso 2015. Además de la formación a los futuros médicos en oftalmología, el IOFV y la FIO acogen la asignatura de “Prácticas de Empresa” de los grados de Biología (5 alumnos / curso) y Matemáticas (2 alumnos / curso) de la Universidad de Oviedo. Por otra parte, en el año 2014, dos alumnas de la Facultad de Biología obtuvieron dos becas “Banco de Santander” durante 3 meses en la FIO. Finalmente, realizó prácticas de grado una alumna del grado de Optometría de la Universidad San Pablo-CEU.

6.2. Estudios de Postgrado Títulos Oficiales Alumnos del Programa de Doctorado en Medicina D. Dagoberto Almanzar Brito (Republica Dominicana), Dña. Ana Fernández González, D. Virgilio Galvis Ramírez (Colombia), D. Guilherme Hermeto Ferrara (Brasil), D. Carlos Lisa Fernández, D. Miguel Naveiras Torres-Quiroga, D. Alejandro Tello Hernández (Colombia), Dña. Susana del Olmo Aguado, Dña. Ana C. Riestra Ayora, D. Jorge Eugenio Valdez García (México) y D. Tomás Villacampa. Alumnos del Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud Línea de Investigación de “Oftalmología y Ciencias de la Visión” D. Luis Fernández-Vega Cueto-Felgueroso, D. Carlos A. Rodríguez Barrientos (México), D. Omar González González, Dña. Almudena Iñigo Portugués, Dña. Natalia Vázquez Moreno y Dña. Claudia Núñez Álvarez. Coordinador en la Comisión Académica: Prof. Jesús Merayo Lloves Miembros de la línea de investigación y directores de tesis: Prof. Luis Fernández-Vega, Prof. Jesús Merayo, Prof. José F. Alfonso, Prof. Neville Osborne, Prof. Begoña Baamonde, Prof. Álvaro Meana, Prof. Luis Quirós.

Títulos Propios de la Universidad de Oviedo Máster en Superficie Ocular, Córnea, Cristalino y Cirugía Aditiva. Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship en el sistema de E.E.U.U.) que pretende dar una alta especialización al oftalmólogo en la investigación traslacional, prevención, diagnóstico y tratamiento médico quirúrgico en el área de la superficie ocular, córnea, cristalino y cirugía refractiva. El objetivo final es que el oftalmólogo sea autosuficiente en el manejo de la patología de la subespecialidad. Este máster está destinado a oftalmólogos con interés en la sub-especialidad de la Superficie Ocular, Córnea, Cristalino y Cirugía Refractiva con vocación investigadora y docente. a Alumnos del Máster: D. Luis Fernández-Vega Cueto-Felgueroso D. Néstor Iván Carreño Jaimes

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Máster en Optometría Clínica. Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship de EEUU) que pretende subespecializar al Óptico-Optometrista para que pueda integrarse en equipos multidisciplinares de las clínicas oftalmológicas o departamentos oftalmológicos. El objetivo final es que el Óptico–Optometrista sea autosuficiente en la aplicación de medidas optométricas como ayuda al manejo integral del paciente oftalmológico y que pueda desarrollar la aplicación del método científico de la subespecialidad. Está destinado a ópticos-optometristas con interés en la optometría clínica y con vocación investigadora y docente. a Alumno del Máster: D. Alberto Barros Suárez

Máster en Enfermería Oftalmológica. Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship de EEUU) que pretende subespecializar al DUE (Diplomado Universitario en Enfermería) para que pueda integrarse en equipos multidisciplinares de las clínicas oftalmológicas o departamentos oftalmológicos. El objetivo final es que los DUES sean autosuficientes en la aplicación de conocimientos oftalmológicos como ayuda al manejo integral del paciente oftalmológico dentro y fuera del quirófano, y que pueda desarrollar la aplicación del método científico a la subespecialidad. a Alumnas del Máster: Dña. Adriana Gómez Menéndez Dña. María Suárez García Dña. Natalia González Blázquez

Máster en Retina y Vítreo. Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship del sistema de EE.UU.) que pretende subespecializar al oftalmólogo en la investigación traslacional, prevención, diagnóstico y tratamiento médico quirúrgico en el área de vítreo-retina. El objetivo final es que el oftalmólogo sea autosuficiente en el manejo de la patología de la subespecialidad. a Alumnos del Máster: D. Carlos Mario Rangel Guadrón D. Andrés Alejandro Flor Herrera

Máster en Glaucoma. Máster profesionalizador clínico y de investigación (equivalente a los fellowship del sistema de EE.UU.) que pretende subespecializar al oftalmólogo en la investigación traslacional, prevención, diagnóstico y tratamiento médico quirúrgico en el área de glaucoma. El objetivo final es que el oftalmólogo sea autosuficiente en el manejo de la patología de la subespecialidad. a Alumno del Máster: D. Ignacio Rodríguez Uña

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Máster en Terapias Avanzadas y Medicina Regenerativa. El Máster tiene una duración de 9 meses organizado con un total de 60 créditos ECTS. MÓDULO 1: Marco regulatorio, bioseguridad y control de calidad en ATMP MÓDULO 2: Metodología básica de los cultivos celulares y las técnicas de terapia génica, terapia celular e ingeniería tisular MÓDULO 3: Implicaciones de las ATMP en los modelos de negocio, limitaciones éticas y protocolos de investigación y transferencia tecnológica. MÓDULO 4: Trabajo de investigación Al finalizar del Máster el alumno deberá ser capaz de: • Conocer el marco regulatorio europeo y nacional en el área de terapias avanzadas “advanced therapy medicinal products (ATMP), conocer las buenas prácticas de laboratorio, bioseguridad y riesgos en ATMP, y control de calidad en ATMP. • Conocer la metodología básica de los cultivos celulares y las técnicas de terapia génica, terapia celular e ingeniería tisular • Conocer las implicaciones de las ATMP en los modelos negocio, limitaciones éticas y protocolos de investigación y transferencia tecnológica • Saber realizar un proyecto y trabajo de investigación en ATMP a Alumno del Máster: D. Carlos Alberto Rodríguez Barrientos

Curso de Experto Universitario en Cirugía Aditiva de la Córnea. Curso de experto universitario que pretende formar al oftalmólogo experto en córnea y cirugía del segmento anterior en las técnicas de cirugía aditiva de la córnea para la corrección ortopédica y refractiva de las ectasias corneales (queratocono, degeneración marginal pelúcida de la córnea, ectasias iatrogénica, traumática y otras) Además, el oftalmólogo, podrá formarse en investigación traslacional en queratocono y técnicas de cirugía aditiva de la córnea. El objetivo final es que el oftalmólogo sea autosuficiente en el manejo de la patología susceptible de ser tratada con cirugía aditiva de la córnea. a Alumnos del curso: D. Luis Fernández-Vega Cueto-Felgueroso D. Néstor Iván Carreño Jaimes

Curso de Experto Universitario en Lentes Fáquicas epicapsulares. Curso de experto universitario que pretende formar al oftalmólogo experto en córnea y cirugía de lentes fáquicas epicapsulares. a Alumnos del curso: D. Luis Fernández-Vega Cueto-Felgueroso D. Néstor Iván Carreño Jaimes

Programa de Formación Continuada en Ciencias de la Visión. El objetivo de este programa es acreditar la formación continuada en oftalmología y ciencias de la visión en la Universidad de Oviedo. Esta actividad cuenta con el patrocinio de los laboratorios ALCON, THÉA, BAUSCH & LOMB y ANGELINI. Todos los oftalmólogos del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega están matriculados en este programa y algunos de los médicos residentes del Hospital Central de Asturias.

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Asignaturas del Programa de Formación Continuada en Ciencias de la Visión 1. Sesiones Clínicas. Coordinador de la Asignatura: Dr. José F. Alfonso Sánchez. - “NEVANAC”. 16 de junio. Ponente: Dña. Carlota Vidal. - “Antiinflamación no esteroideos en la cirugía de catarata”. 3 de noviembre. Ponente: Dr. Jesús Merayo Lloves. - “Antiinflamación no esteroideos en la cirugía de catarata II”. 10 de noviembre. Ponente: Dr. Jesús Merayo Lloves. - “Sarcoidosis ocular”. 17 de noviembre. Ponente: Dr. Ignacio Rodríguez Uña. - “Casos Clínicos”. 1 de diciembre. Ponente: Dr. Jesús Merayo Lloves. - “Casos Clínicos”. 15 de diciembre. Ponente: Dr. Jesús Merayo Lloves.

2. Sesiones Bibliográficas. Coordinador de la Asignatura: Dña. Susana del Olmo Aguado - “Extracellular recording of corneal nerve terminal impulses”. 21 de enero. Ponente: D. Omar González González - “Establecimiento de cultivos primarios neuronales”. 11 de febrero. Ponente: Dña. Almudena Iñigo Portugués. - “Aproximaciones genómicas a patologías humanas, arrays de expresión”. 11 de marzo. Ponente: D. Federico Bech. - “Detención de muerte celular “in vitro”. Estudios de proliferación y viabilidad celular”. 8 de abril. Ponente: Dña. Claudia Núñez Álvarez - “Trasplantes de membrana amniótica en la patología ocular”. 13 de mayo. Ponente: Dña. Natalia Vázquez Moreno. - “Cambios funcionales en las terminaciones corneales de frío de ratón con la edad. Posible relación con ojo seco”. 31 de diciembre. Ponente: D. Omar González González

3. Seminarios de Investigación. Coordinador de la Asignatura: Dr. Ignacio Alcalde domínguez - “Localización del receptor TRPV1 en el ojo”. 31 de enero. Ponente: Prof. Carmen Martínez. - “Técnicas ópticas de diagnóstico”. 31 de enero. Ponente: Prof. Santiago Mar. - “Medida de la investigación: Los indicadores bibliométricos”. 5 de febrero. Ponente: Dña. Berta Velasco. - “Marco regulatorio en Terapias Avanzadas”. 7 de febrero. Ponente: Dña. Natividad Cuende. - “Desarrollo de un sistema de diagnóstico de insuficiencia límbica para uso oftalmológico: un ejemplo de las aplicaciones de la genética molecular a las demandas clínicas”. 19 de febrero. Ponente: D. Iker García. - “Corneal biomechanics: Measurement, modification and simulation”. 19 de marzo. Ponente: Dña. Sabine Kling. - “Epigenética y desarrollo”. 26 de marzo. Ponente: Dr. Mario Fernández Fraga - “Líneas de investigación de la Unidad de Oftalmología del Hospital Clinic”. 25 de abril. Ponente: Prof. Alfredo Adán Civera.

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- “Topografía (OCT) y aberraciones del segmento anterior en aplicaciones clínicas de queratocono y cataratas”. 23 de mayo. Ponente: Dr. Pablo Pérez Merino. - “Enfermedad de Alzheimer, 100 años después”. 24 de septiembre. Ponente: Dra. Eva María Carro Díaz. - “Aplicación de los nanomedicamentos en Oftalmología”. 31 de octubre. Ponente: Dra. Eva María Carro Díaz. - “Actividad física y nutrición: motores de la evolución”. 26 de noviembre. Ponente: Dr. Sabino Padilla. - “Nuevos conceptos en lentes intraoculares”. 11 de diciembre. Ponente: D. Pablo Artal.

4. Seminarios Regionales de Oftalmología. Coordinador de la Asignatura: Dra. Begoña Baamonde. Estos seminarios son organizados por la Cátedra de Oftalmología de la Universidad de Oviedo y el Servicio de Oftalmología del HUCA. - 15 de febrero de 2014

• CONFERENCIA

“Avances en el abordaje médico-quirúrgico de las uveítis posteriores”. Dr. A. Adán.

• COMUNICACIONES

“Retinopatía paraneoplásica o autoinmune: a propósito de un caso”. Dres. G. Pérez Carro, R. Fernández Alonso, L. López Negrete, ML Taboada Martínez. “Implante exprés en el manejo del glaucoma refractario primeros resultados”. Dres. J. Galindo Bocero, C. Junceda Moreno, M. Cuetos García, S. Laria Blanco.

- 26 de abril de 2014

• COMUNICACIONES

“Membrana amniótica. Conservación. Indicaciones. Técnica quirúrgica”. Dra. Begoña Baamonde Arbaiza.

- 14 de junio de 2014

• CONFERENCIA

“Lentes ajustables a la luz: una forma de conseguir la emetropía en la cirugía de la catarata”. Dr. J. Cezón.

• COMUNICACIONES:

“Metástasis oculares como primera manifestación de carcinoma” Dres. I. Santos, A. Sampedro “Algunos casos interesantes en patología palpebral y orbitaria” Dres. Cubillas, JJ. Barbón

- 25 de octubre de 2014

• CONFERENCIA

“Queratocono pediátrico: Diagnóstico y tratamiento”. Dr. Celis, Alcázar de San Juan

• COMUNICACIONES

“Metilfenidato y cataratas pediátricas: a propósito de un caso”. Dres. Macías Franco, D. Álvarez Fernández, P. Rozas Reyes “Síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada asociado a otros síndromes autoinmunes”. Dres. A. García Alonso, R. Sánchez Ávila

- 13 de diciembre de 2014

• CONFERENCIA

“Actualización en escleritis”. Dra. M.T. Sainz de la Maza

• COMUNICACIONES

“Análisis del comportamiento atípico de algunas LIOS hidrófobas”. Dres. M. Franco Benito, M. Cuesta Lasso, J. Sánchez Cañizal “Reconstrucción de defectos palpebrales mediante doble colgajo lateral”. Dres. I. Garzo García, A. Toribio García, E. Pérez Díez

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5. Curso Monográfico de Actualización del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega. El Instituto Oftalmológico Fernández-Vega organizó los días 23 y 24 de mayo el IV Curso de Actualización de Retina y Vítreo, en el que se presentaron importantes avances diagnósticos y terapéuticos, tanto en el área médica como en el área quirúrgica, producidos en los últimos tres años. Entre ellos, destaca el descubrimiento de nuevos fármacos prometedores para combatir la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) en forma seca, patología que a día de hoy aún no tiene tratamiento y cuya prevalencia va en aumento en nuestra sociedad. Más de 200 especialistas de toda España se dieron cita en el salón de actos de nuestra clínica para conocer de la mano de más de una veintena de reconocidos ponentes lo último en tratamientos que abren las puertas a la curación, en un futuro no muy lejano, de todo tipo de patologías. A lo largo de las dos jornadas hubo espacio para hablar de tecnología puntera, técnicas quirúrgicas de último cuño y nuevos tratamientos de enfermedades. El congreso de este año abordó en profundidad las novedades en técnicas quirúrgicas, tecnologías y maniobras útiles en la cirugía de vítreo y retina, que abrieron el curso en forma de vídeo-simposium. Entre ellas, las microincisiones quirúrgicas y las nuevas OCT (escáneres de retina). Se expusieron, asimismo, los ensayos clínicos para el tratamiento de la DMAE seca -enfermedad hasta el momento sin tratamiento- con fármacos prometedores como el Lampalizumab, y se debatió sobre el estado actual del tratamiento de la DMAE húmeda. Asimismo, hablaron sobre la Ocriplasmina, un nuevo fármaco que pinchado en el ojo permite tratar algunas enfermedades que antes solo tenían tratamiento quirúrgico, como la tracción vítreo-macular y algunos agujeros maculares. Se profundizó en enfermedades retinianas que causan un gran impacto sobre la población (por su alta frecuencia y el número de cegueras legales que producen), como la retinopatía diabética, la miopía magna o las trombosis venosas retinianas. Y también se dio un repaso a la actualización del conocimiento sobre enfermedades raras, como las hereditarias de la retina, en las que empieza a haber algunas posibilidades de tratamiento, bien mediante terapia génica o mediante la colocación de chips electrónicos pre o subretinianos. Dirigido por el Dr. Álvaro Fernández-Vega Sanz, jefe de la unidad de Retina y Vítreo del Instituto Oftalmológico, este curso se organizó en forma de discusiones muy activas en las que tanto los ponentes como el público trataron de dar respuesta a complicaciones que se pueden dar en retina médica. De hecho, la última jornada estuvo dedicada por completo a la presentación y discusión de casos clínicos.

Formación de Médicos Residentes. Coordinador: Dr. José F. Alfonso El IOFV está acreditado para la formación de médicos residentes de oftalmología y recibe periódicamente a oftalmólogos en formación para realizar estancias cortas. La acción formativa es de especial importancia en subespecialidades como la de córnea, cirugía refractiva y catarata, donde la oferta de formación en los sistemas públicos de salud es muy limitada. Aunque esta oferta formativa tiene especial dedicación a los MIR de los hospitales de Asturias, también está abierta a nivel nacional e internacional. Así en el último curso han rotado por el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega oftalmólogos en formación de diversas provincias españolas y Portugal: Dña. María del Carmen Costales Álvarez Hospital Universitario Central de Asturias Dña. Irene Garzo García Complejo Asistencial de León

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Dña. Cristina González García Hospital Clínico San Carlos (Madrid) D. Edwin Mark Escobar Luján Hospital Universitario de Salamanca Dña. Diana Carolina Urbaneja Mejías Hospital General Universitario Gregorio Marañón (Madrid) D. Javier García Bella Hospital Clínico San Carlos (Madrid) Dña. Inés Gómez Martins de Almeida Centro Hospitalar entre Douro e Vouga. Sta. María Da Feira (Portugal) D. Darío Álvarez Fernández Hospital Universitario Central de Asturias D. Javier Galindo Bocero Hospital Universitario Central de Asturias D. Marco Filipe Ferreira Rego Hospitais da Universidades de Coimbra (Portugal)

Rotación de Residente de Farmacia Hospitalaria Dña. Carmen Fontela Bulnes Complejo Hospitalario de Navarra

6.3. Otros estudios. Del Instituto de Enseñanza Secundaria Cerdeño y del Centro OVIDA Formación realizaron prácticas en nuestro centro alumnos pertenecientes al Grado Medio en Imagen para el diagnóstico, Grado Superior en Imagen para el diagnóstico, Grado Superior en Instalaciones de Telecomunicaciones, Grado Medio en Farmacia y Parafarmacia, Grado Medio en Archivo, Grado Superior en Anatomía Patológica y Citología

6.4. Profesorado. Profesores de la Universidad de Oviedo, Instituto Oftalmológico Fernández-Vega y la Fundación de Investigación Oftalmológica: Prof. Luis Fernández-Vega Sanz, Dr. Álvaro Fernández-Vega Sanz, Dr. Javier Fernández-Vega Sanz, Dr. José F. Alfonso Sánchez, Dra. Beatriz Fernández- Vega, Dra. Lucía Fernández Vega, Dr. Hussein Amhad, Dr. Abdelhamid Abdelhamid, Dr. Mariano Yllera, Dr. Manuel Riaño, Dr. Jose I. Blázquez, Dr. Pedro Pablo Rodríguez, Dra. Eva Villota, Dr. Carlos Lisa, Dra. Begoña Baamonde Arbaiza, Dr. Jesús Merayo Lloves, Dr. Álvaro Meana Infiesta, Dr. Ignacio Alcalde Domínguez, Dra. Montserrat García, D. Manuel Álvarez Prada, Dña. Henar Morchón, D. Alberto Barros, Dña. Elena del Val, Dña. Carmen Fernández. D. Borja Piquero, Dña. Silvia García Peláez, D. Javier Lozano Sanroma, D. Avelino Ojanguren Fernández, Dña. María Rueda Mansilla, D. Ignacio Serrano Peláez, Dña. Vanesa Marina Renes y Dña. Ana C. Riestra.

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Mecenazgo y participación en proyectos con financiación competitiva 7.1. Mecenazgo El Instituto Oftalmológico Fernández-Vega colabora con la Fundación de Investigación Oftalmológica mediante aportaciones económicas y la cesión de sus instalaciones para los laboratorios en los que desarrolla, básicamente, su cometido. También los profesionales del Instituto participan en proyectos con la FIO y personal del instituto colabora en actividades de administración, gerencia y gestión.

La Fundación María Cristina Masaveu Peterson nos ayuda desde el inicio de nuestra actividad. Su apoyo se dirige a las tres líneas de investigación que desarrollamos. En diciembre de 2013, renovó su compromiso con nuestro trabajo para el año 2014.

La Fundación Rafael del Pino tiene suscrito un convenio de colaboración con nuestra Fundación, dentro del cual, el Dr. Miguel Coca Prados, que ha desarrollado su carrera profesional en la Universidad de Yale (EEUU), es investigador titular de la “Cátedra Rafael del Pino” desde el año 2009.

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Fundación BBVA, ha reconocido al Profesor Neville Osborne de la Universidad de Oxford con la “Cátedra en Biomedicina Fundación BBVA” en la FIO desde el año 2009. El Profesor Neville Osborne realiza sus estudios como Investigador principal dentro del laboratorio de Neurobiología de la Retina, con el fin último de profundizar en el conocimiento de patologías oculares neurodegenerativas.

La Fundación Ramón Areces presta especialmente su colaboración a proyectos relacionados con patologías de la superficie ocular.

La Caixa colabora con la Fundación a través de la financiación del proyecto “Regulación del canal de frío TRPM8: nuevas estrategias para la modulación del dolor ocular en la enfermedad de ojo seco.”

La compañía STAAR Surgical, colabora con la Investigación Clínica que se desarrolla en la Fundación de Investigación Oftalmológica: “Análisis de resultados de Lentes intraoculares epicristalinianas”.

Esta entidad bancaria colabora con la Fundación de Investigación Oftalmológica, aportando su ayuda para el desarrollo de diferentes trabajos de investigación

Memoria de Investigación y Docencia 2014

AJL colabora en Investigación Clínica con el proyecto de “Análisis de resultados de segmentos de anillos intracorneales”

Los laboratorios BAUSCH + LOMB, THÉA, ALCON Y ANGELINI, colaboran con el área docente de la Fundación de Investigación Oftalmológica, a través del patrocinio de los seminarios, que se realizan dentro del Programa de Formación Continuada en Ciencias de la Visión.

Zeiss contribuye a la realización de distintos proyectos de investigación clínica, que se llevan a cabo en la Fundación de Investigación Oftalmológica

Los estudios realizados en el laboratorio de Neurobiología de la Retina contaron con la colaboración de la Fundación Endesa, que así presta su apoyo a la investigación dirigida por el Prof. Neville Osborne en la FIO.

La Fundación también cuenta con el apoyo económico desde el año 2009 de D. Juan Carlos Guerra Zunzunegui y de D. Tomás Rey Gómez. La FIO agradece las donaciones, para proyectos de investigación, de los pacientes que, voluntariamente y de una forma anónima, vienen colaborando con nuestra actividad.

Memoria de Investigación y Docencia 2014

7.2. Proyectos con financiación competitiva 7.2.1. Europeos. Proyectos concedidos al Instituto Oftalmológico Fernández-Vega, en los que colabora la Fundación de Investigación Oftalmológica.

TITULO DEL PROYECTO:

Design of Biocompatible and Customized Interfaces, Surface and Coating for Intra Ocular Lens (IOLs)

ENTIDAD FINANCIADORA:

Instituto de Desarrollo Económico del Principado de Asturias (IDEPA). Red Internacional M-era-Net.

REFERENCIA:

IDE/2013/000026.

DURACIÓN:

Desde 01/07/2013 hasta 30/06/2015.

IMPORTE:

119.814,71 Euros.

TITULO DEL PROYECTO:

Desarrollo de nuevos procesos de fabricación de segmentos de anillos intracorneales (ICRS) basados en microtecnologías de producción totalmente monitorizadas CUSTOM ICRS

ENTIDAD FINANCIADORA:

Instituto de Desarrollo Económico del Principado de Asturias (IDEPA). Red Internacional Manunet.

REFERENCIA:

IDE/2014/000625.

DURACIÓN:

Desde 01/09/2014 hasta 31/12/2015.

IMPORTE:

115.893,13 Euros.

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7.2.2. NACIONALES Proyectos concedidos a la Fundación de Investigación Oftalmológica.

TITULO DEL PROYECTO:

Desarrollo, caracterización y modulación de un modelo experimental de ectasia (queratocono) que permita el tratamiento regenerativo del tejido ocular.

ENTIDAD FINANCIADORA:

Ministerio de Ciencia e Innovación. Instituto de Salud Carlos III.

REFERENCIA:

PI11/02886.

DURACIÓN:

Desde 01/01/2012 a 31/12/2014.

IMPORTE:

104.362,50 Euros.

TITULO DEL PROYECTO:

Validación de Biomarcadores del Glaucoma: traslación clínica.

ENTIDAD FINANCIADORA:

Ministerio de Economía y Competitividad. Instituto de Salud Carlos III.

REFERENCIA:

PI13/01961.

DURACIÓN:

Desde 01/01/2014 a 31/12/2016.

IMPORTE:

69.575,00 Euros.

TITULO DEL PROYECTO:

Desarrollo y optimización de córneas por medio de terapias avanzadas y nuevos materiales derivados de la seda para su empleo en reconstrucción de la superficie ocular y queratoplastias (SYLCOR)

ENTIDAD FINANCIADORA:

Ministerio de Economía y Competitividad. Convocatoria INNPACTO 2012.

REFERENCIA:

IPT-2012-1029-010000.

DURACIÓN:

Desde 01/08/2012 a 31/12/2015.

IMPORTE:

30.000 Euros (subcontrata)

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TITULO DEL PROYECTO:

Soluciones innovadoras para el tratamiento y diagnóstico del ojo seco (INDREYE)

ENTIDAD FINANCIADORA:

Ministerio de Economía y Competitividad. Convocatoria INNPACTO 2012.

REFERENCIA:

IPT-2012-0438-010000.

DURACIÓN:

Desde 01/08/2012 a 31/12/2015.

IMPORTE:

8.500 Euros (subcontrata)

TITULO DEL PROYECTO:

Estudio experimental de la aplicación tópica del Plasma Rico en Factores de Crecimiento (PRGF) en la regeneración corneal.

ENTIDAD FINANCIADORA:

Fundación Mutua Madrileña.

REFERENCIA: DURACIÓN:

Desde 01/01/2012 a 31/12/2014.

IMPORTE:

25.000 Euros.

TITULO DEL PROYECTO:

El trasplante de córneas en el siglo XXI. Estructura y logística de un futuro Banco de Tejidos en Oftalmología.

ENTIDAD FINANCIADORA:

Fundación Mutua Madrileña.

REFERENCIA: DURACIÓN:

Desde 01/01/2013 a 31/12/2014.

IMPORTE:

25.000 Euros.

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TITULO DEL PROYECTO:

Nuevos abordajes para el diagnóstico, tratamiento y regeneración de la patología de la superficie ocular (SURF-eye)

ENTIDAD FINANCIADORA:

Ministerio de Economía y Competitividad. Retos-Colaboración 2014

REFERENCIA:

RTC-2014-2375-1.

DURACIÓN:

Desde 01/07/2014 a 31/12/2016.

IMPORTE:

138.233,00 Euros

TITULO DEL PROYECTO:

Desarrollo de nanomateriales luminiscentes para la neuroprotección y nanoterapia de patologías oculares en un modelo experimental de daño retiniano por luz

ENTIDAD FINANCIADORA:

Ministerio de Economía y Competitividad. Retos-Colaboración 2014

REFERENCIA:

RTC-2014-3055-1.

DURACIÓN:

Desde 01/07/2014 a 31/12/2016.

IMPORTE:

642.866 Euros

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Proyectos concedidos al Instituto Oftalmológico Fernández-Vega, en los que colabora la Fundación de Investigación Oftalmológica.

TITULO DEL PROYECTO:

Desarrollo y optimización de córneas por medio de terapias avanzadas y nuevos materiales derivados de la seda para su empleo en reconstrucción de la superficie ocular y queratoplastias (SYLCOR)

ENTIDAD FINANCIADORA:

Ministerio de Economía y Competitividad. Convocatoria INNPACTO 2012.

REFERENCIA:

IPT-2012-1029-010000.

DURACIÓN:

Desde 01/08/2012 a 31/12/2015.

IMPORTE:

895.459,06 Euros (préstamo)

TITULO DEL PROYECTO:

Estudios de Haplotipos del Gen y su relación con la degeneración de la Mácula asociada a la edad (Dmae) en la población Española y búsqueda de Biomarcadores Génicos

ENTIDAD FINANCIADORA:

Ministerio de Economía y Competitividad. Convocatoria Programa Torres Quevedo conv. 2012.

REFERENCIA:

IPQ-12-05444.

DURACIÓN:

Desde 01/11/2013 a 31/10/2016.

IMPORTE:

58.436,82 Euros

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7.2.3. REGIONALES Proyectos concedidos al Instituto Oftalmológico Fernández-Vega, en los que colabora la Fundación de Investigación Oftalmológica.

TITULO DEL PROYECTO:

Biorreactores con sensores integrados para la monitorización del crecimiento celular en terapias avanzadas (SENSCEL)

ENTIDAD FINANCIADORA:

Gobierno del Principado de Asturias. Fundación para el Fomento en Asturias de la Investigación Científica Aplicada y Tecnológica (FICYT)

REFERENCIA:

IE 13-142C2.

DURACIÓN:

Desde 01/07/2013 a 31/12/2014.

IMPORTE:

53.907,00 Euros.

TITULO DEL PROYECTO:

Diagnóstico precoz del glaucoma: aplicación de nuevas tecnologías para la determinación de biomarcadores séricos.

ENTIDAD FINANCIADORA:

Gobierno del Principado de Asturias. Fundación para el Fomento en Asturias de la Investigación Científica Aplicada y Tecnológica (FICYT)

REFERENCIA:

IE 13-031.

DURACIÓN:

Desde 01/07/2013 a 31/12/2014.

IMPORTE:

76.203,06 Euros.

TITULO DEL PROYECTO:

El ciclo redox Zinc-metalotioneína como diana terapéutica en el tratamiento de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE)

ENTIDAD FINANCIADORA:

Gobierno del Principado de Asturias. Fundación para el Fomento en Asturias de la Investigación Científica Aplicada y Tecnológica (FICYT)

REFERENCIA:

IE14-030.

DURACIÓN:

Desde 01/07/2014 a 31/12/2015.

IMPORTE:

117.490,62 Euros.

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TITULO DEL PROYECTO:

Implantes Oculares personalizados y sensores a partir de grafeno y nanopartículas para aplicaciones Biomédicas (GRAPH-EYES)

ENTIDAD FINANCIADORA:

Consejería de economía y empleo del Principado de Asturias. Subvenciones dirigidas a la ejecución de proyectos de I+D diferenciales o tractores en el Principado de Asturias

REFERENCIA:

IDE/2014/000737

DURACIÓN:

Desde 01/11/2014 a 31/12/2015.

IMPORTE:

176.270,15 Euros.

Proyectos con financiación privada.

TITULO DEL PROYECTO:

Test the effectiveness of purified (extract) tea tree oil ophthalmic product (TTO) to kill demódex mites.

ENTIDAD FINANCIADORA:

Laboratorios THÉA

DURACIÓN:

Desde 01/07/2014 a 30/06/2015

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Divulgación de la Investigación 8.1. Artículos Originales Publicaciones del Grupo de Superficie Ocular y Córnea 1. Gonzalez-Coto AF, Alonso-Ron C, Alcalde I, Gallar J, Meana Á, Merayo-Lloves J, Belmonte C. Expression of Cholecystokinin, Gastrin and Their Receptors in the Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2014; 55:1965-1975. DOI: 10.1167/IOVS.13-12068. 2. Parra, A, Gonzalez-Gonzalez, O, Gallar, J., Belmonte, C. Tear fluid hyperosmolality increases nerve impulse activity of cold thermoreceptor endings of the cornea, Pain. 2014 Aug; 155(8):1481-91. Doi: 10.1016.

Publicaciones del Grupo de Neurobiología de la Retina 1. Ugarte M, Osborne NN. Recent advances in the understanding of the role of zinc in ocular tissues. Metallomics. 2014 Feb; 6(2):189-200. 2. Ugarte M, Grime GW, Osborne NN. Distribution of trace elements in the mammalian retina and cornea by use of particle-induced X-ray emission (PIXE): localisation of zinc does not correlate with that of metallothioneins. Metallomics. 2014 Feb; 6(2):189-200. 3. Osborne NN, Núñez-Álvarez C, Del Olmo Aguado S. The effect of visual blue light on mitochondrial function associated with retinal ganglions cells. Experimental Eye Research. 2014 Sep 2; 128C:8-14. 4. Osborne NN, Núñez-Álvarez C, Del Olmo Aguado S. Targeting mitochondrial dysfunction as in aging and glaucoma. Drug Discovery Today. 2014 Oct; 19(10):1613-22.

Publicaciones del Grupo de Genética Ocular 1. González-Iglesias H, Álvarez L, García M, Petrash C, Sanz-Medel A, Coca- Prados M. Metallothioneins (MTs) in the human eye: a perspective article on the zinc-MT redox cycle. Metallomics. (2014) 6(2):201-208. Doi: 10.1039/c3mt00298e. 2. González-Iglesias H, Álvarez L, García M, Escribano J, Rodríguez-Calvo PP, Fernández-Vega L, Coca-Prados M. Comparative proteomic study in serum of patients with primary open-angle glaucoma and pseudoexfoliation glaucoma. J. Proteomics. (2014) 98:65-78. Doi: 10.1016/j.jprot.2013.12.006 3. Coca-Prados M. The blood-aqueous barrier in health and disease. J. Glaucoma. (2014) Oct- Nov: S36-8. Doi: 10.1097/ IJG.0000000000000107.

Memoria de Investigación y Docencia 2014

4. González de Vega R, Fernández-Sánchez ML, González-Iglesias H, Coca Prados M, and Sanz-Medel A. Quantitative selenium speciation by HPLC-ICP-MS(IDA) and simultaneous activity measurements in human vitreous humor. Analytical and Bioanalytical Chemistry. (2014) doi: 10.1007/s00216-014-8241-6 5. Alsalem JA, Patel D, Susarla R, Coca-Prados M, Bland R, Walker EA, Rauz S, Wallace GR. Characterization of vitamin D production by human ocular barrier cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. (2014) 55(4):2140-2147. Doi: 10.1167/iovs.13-13019.

Publicaciones de la Unidad de Investigación Clínica 1. Alfonso JF, Knorz M, Fernandez-Vega L, Rincón JL, Suarez E, Titke C, Kohnen T. Clinical outcomes after bilateral implantation of an apodized +3.0 D toric diffractive multifocal intraocular lens. J Cataract Refract Surg. 2014 Jan; 40 (1):51-9. 2. Torquetti L, Ferrara G, Almeida F, Cunha L, Araujo LP, Machado A, Marcelo-Lyra, Merayo-Lloves J, Ferrara P. Intrastromal corneal ring segments implantation in patients with keratoconus: 10-year follow-up.Journal of Refractive Surgery. 2014 Jan; 30:22-U23 3. Anitua E, Muruzabal F, de la Fuente M, Merayo-Lloves J, Orive G. Effects of heat-treatment on plasma rich in growth factors-derived autologous eye drop. Experimental Eye Research. 2014 Feb; 119: 27-34. Doi: 10.1016/j.exer.2013.12.005 4. Fernández-Vega Cueto L, Tresserra F, de la Paz MF. De novo growth of a capillary hemangioma of the conjunctiva. Arch Soc Esp Oftalmol. 2014 Mar; 89(3):127-9. Doi: 10.1016/j.oftal.2012.10.010. 5. Alfonso JF, Lisa C, Alfonso-Bartolozzi B, Pérez-Vives C, Montés-Micó R.Collagen copolymer toric phakic intraocular lens for myopic astigmatism: one-year follow-up. Journal Cataract Refractive Surgery. 2014 Jul; 40(7): 1155-62 doi: 10.1016/j. jcrs.2013.11.034 6. Monnereau C, Quilendrino R, Dapena I, Liarakos VS, Alfonso JF, Arnalich-Montiel F, Böhnke M, Pereira NC, Dirisamer M, Parker J, Droutsas K, Geerling G, Gerten G, Hashemi H, Kobayashi A, Naveiras M, Oganesyan O, Orduña Domingo E, Priglinger S, Stodulka P, Torrano Silva J Jr, Venzano D, Vetter JM, Yiu E, Melles GR. Multicenter study of descemet membrane endothelial keratoplasty: first case series of 18 surgeons. JAMA Ophthalmol. 2014 Oct; 132(10):1192-8. Doi: 10.1001/jamaophthalmol.2014.1710. 7. Blanco-Mezquita T, Espandar L, Torres R, Álvarez-Barcia A, Cantalapiedra-Rodríguez R, Martínez-García C, Merayo-Lloves J. Does Mitomycin C Cause Toxicity in the Cornea After Photorefractive Keratectomy? A Comparative Wound- Healing Study in a Refractive Surgery Animal Model. Cornea. 2014 Nov.; 33: 1225-31 doi: 10.1097/ICO.0000000000000219 8. Riestra, AC., Manipulación de anticuerpos monoclonales en oftalmología. Farmacotécnia Volumen 4. Nº1 enero- abril 2014. Sociedad Española de Farmacia Hospitalaria (SEFH). ISSN 2386-4311.

8.2. Publicaciones Libros Merayo-Lloves J. Galarreta Mira D, Cordovés L, Riestra A. Manejo de la endoftalmitis en cirugía de la catarata., 39 páginas Ediciones Mayo, Barcelona, España, 2014 Clave A, L (Oftalmología) ISBN: 978-84-9905-181-9. Merayo-Lloves J, Riestra A., Lisa C., Alfonso JF.; Fernández-Vega L. Alternativas a los corticoides en cirugía refractive. En: Mesa Redonda del 90 congreso de la Sociedad Española de Oftalmología. «Inmunomoduladores y antiinflamatorios: Más allá de los corticoides”  Alejandro Portero Benito y Ester Carreño Salas (eds.). Audiovisual y Marketing, Madrid, España, 2014 Clave A, CL (Oftalmología) ISBN: 8489085552 Baamonde B., Merayo-Lloves J, Alfonso JF, Castro J., Fernández-Vega L. Técnicas de Exploración en Oftalmología. Cuaderno de Prácticas curso 2014-15 Fundación de Investigación Oftalmológica, Oviedo (España), 2014 Clave A, CL (Oftalmología) ISBN: 978-84-617-2328-7

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8.3. Comunicaciones Congreso 2014 Congresos Internacionales — 19º ESCRS Winter Meeting. 15 de febrero. Ljubljana. — Advisor “EAME Allergan Dry Eye advisory”. Del 28 de febrero al 1 de marzo. Valencia. — IV Congreso Internacional Barranquilla Facorefractiva. Del 6 al 8 Marzo. Barranquilla. — XII Reunión anual del SECOIR- GESOC. Del 14 al 17 de marzo. Madrid. — 5º World Congress on Controversies in Ophthalmology, COPHy. Del 19 al 22 de marzo. Lisboa. — World Ophthalmology Congress. Del 2 al 6 de abril. Tokio. — 23 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica Optom 2014. Del 4 al 6 abril. Madrid. — ASCRS- ASOA Symposium and Congress. Del 25 al 29 de abril. Boston. — Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO. Del 4 al 8 de mayo. Orlando. — 29 Congreso de la SECOIR. Del 14 al 17 de mayo. Alicante. — United Kingdom & Ireland Society of Cataract & Refractive Surgeons, UKISCRS. Del 19 al 20 de mayo. Birmingham. — Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visão, CIOCV. Del 24 al 25 de mayo. Braga. — European Cornea Conference. Del 13 al 15 de junio. Porto. — International simposium on ocular pharmacology and pharmaceutics, ISOPT. Del 19 al 22 de junio. Reikiavik. — Association for Vision and Eye Research, EVER 2014. Del 1 al 4 de septiembre. Niza. — 11th International ICL Experts Symposium. Del 11 al 12 de septiembre. Wembley. — VI Experts Meeting on the surgical management of Keratoconus. 12 de septiembre. Londres. — European Society of Cataract and Refractive Surgeons, ECRS. Del 13 al 17 de septiembre. Londres. — Eurocornea. Del 15 al 18 de septiembre. Londres. — 15th World Congress on pain (IASP). 6 de octubre. Buenos Aires. — American Academy of Ophthalmology. Del 19 al 22 de octubre. Chicago. — Refractiva 2014. 15 de noviembre. Oporto. — Cornea Society/ Eye Bank Association of America (EBAA) Fall Educational Symposium. 17 de noviembre. Chicago. — III Encuentro Internacional de Anillos de Ferrara. Del 6 al 9 de noviembre. Belo Horizonte, Brasil. — Annual Meeting of the Philippine Academy of Ophthalmology, Philippine Cornea Society in conjunction with the ASCRS. Del 13 al 15 de noviembre. Manila. — 44th Annual Meeting Society for Neuroscience. 15 de noviembre. Washington DC. — 45 Congreso de la Sociedad Catalana de Oftalmología. Del 27 al 29 de Noviembre. Barcelona. — MitOx 2014 Oxford University. Del 9 al 10 de diciembre. Oxford.

Memoria de Investigación y Docencia 2014

Congresos Nacionales — Faco Elche. Febrero. Elche. — IX Congreso Sociedad Española de Glaucoma. Del 13 al 15 de marzo. Murcia. — VII World Keratoconus Society. Del 14 al 15 de mayo. Alicante. — Cimos Sevilla Refractiva 2014. Del 24 al 26 de abril. Sevilla. — II Simposium Quirón de Oftalmología. Del 30 al 31 de mayo. A Coruña. — Reunión de Actualización en Superficie Ocular. Del 6 al 7 de junio. Segovia. — VII Encuentro La Toja Faco- refractiva. Del 19 al 21 de junio. La Toja. — Atlantic Meeting. Del 5 al 6 julio. Barcelona. — 89 Congreso de la Sociedad Española de Oftalmología (SEO). Del 1 al 4 de octubre. Bilbao. — V congreso de Microbiología industrial y Biotecnología Microbiana. Del 15 al 17 de octubre. Oviedo. — Asociación Española de Tecnología y Cirugía de Implantes, Refractiva y Cornea, ASETCIRC- V Congreso.

Del 4 al 5 de noviembre. Madrid.

— Femtofaco Summit. 21 de noviembre. Oviedo (IOFV). — Viser Meeting. Del 22 al 23 de noviembre. Santiago de Compostela. — 45 Congreso de la Sociedad Catalana de Oftalmología. Del 27 al 29 de noviembre. Barcelona. — Reunión Anual de la Sociedad Oftalmológica de Madrid. 20 diciembre. Madrid.

8.4. Comunicaciones Congreso ARVO 2014 Acera, A., Soria, J., Villarrubia, A., Elortza, F., Azkargorta, M., Alvarez de Toledo, J., Rodriguez-Agirretxe, I., Merayo-Lloves, J., Suarez-Cortes, T. M. y Keratoconus CeyeC group (2014). “Label free LC-MS/MS quantitative analysis of aqueous humor proteome from keratoconus and myopic controls patients”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 4218. Albertazzi, R., Ferlini, L., Rao, G., Merayo-Lloves, J. y Alfonso, J. (2014). “Software-based assesment of intrastromal rings surgical plan for keratoconus”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 4225. Belmonte, C., Parra, A., Gonzalez, O., Merayo-Lloves, J. y Gallar, J. (2014). “Activity of Corneal Cold Thermoreceptor Nerve Endings Encodes Tear Fluid Hyperosmolality in Mice”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 3057. Ferlini, L., Albertazzi, R., Rao, G., Merayo-Lloves, J. y Alfonso, J. (2014). “Outcomes of intrastromal rings combination results for treatment of central ectasias”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 4231. Galvis, V., Acera, A., Tello, A., Merayo-Lloves, J., Suarez-Cortes, T. M. y Keratoconus CeyeC group (2014). “SF-36 as a quantitative assessment of the quality of life in patients with keratoconus and its relationship to severity of the disease”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 4209. Gonzalez Gonzalez, O., Alcalde, I., Iñigo-Portugues, A., Gallar, J., Merayo-Lloves, J. y Belmonte, C. (2014). “Reduced number and altered functional activity of mouse corneal cold sensory nerve fibers with ag4e develop in parallel with decreased basal tearing” ARVO Meeting Abstracts 55(5): 3665.

Memoria de Investigación y Docencia 2014

Ibares-Frias, L., Gallego, P., Cantalapiedra, R., Merayo-Lloves, J. y Martinez-Garcia, C. (2014). “Quantitative and qualitativeg study of wound healing after Ferrara ICRS implantantion in hens”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 5148. Meana, A., Cenis, J. L., Aznar-Cervantes, S. D., Chacon M., Vazquez N., Cereijo, D., Rodriguez-Cortes, J. A., Alvarez, D. y Merayo-Lloves, J. (2014). “Silk Fibroin Membranes as a Carrier for the Treatment of Corneal Lesions”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 1450. Merayo-Lloves, J., Meana, A., Riestra, A. C., Vazquez, N., Chacon, M., Orive, G. y Anitua, E. (2014). “PRGF-Endoret(R) as a substitute of Fetal Bovine Sera for the culture of human corneal limbal stem cells”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 4695. Muruzabal, F. J., De la Fuente, M., Merayo-Lloves, J., Orive, G. y Anitua, E. (2014). “Comparing the biological outcomes of autologous serum versus plasma rich in growth factors (PRGF-Endoret) eye drops on ocular surface wound healing”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 4689. Riestra, A. C., Iñigo-Portugues, A., Artime, E., Braga, P., Merayo-Lloves, J. y Alcalde, I. (2014). “Effectiveness of regenerative drops (CACICOL) on corneal ulcers (post-PRK) in an experimental animal model”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 5176. Suarez-Cortes, T. M., Soria, J., Acera, A., Gonzalez, N., Iloro, I., Elortza, F., Merayo-Lloves, J. y Keratoconus CeyeC Group (2014). “Human tear peptide/protein profiling study of Keratoconus grades by SPE-MALDI-TOF Mass Spectrometry analyses”. ARVO Meeting Abstracts 55(5): 2006. Coca-Prados M, Alvarez L, Garcia M, Escribano J, Rodriguez-Calvo PP, Fernandez-Vega L, Gonzalez-Iglesias H. “Differential proteomics study in serum of patients with primary open-angle glaucoma and pseudoexfoliation glaucoma. Poster Communication, Florida”(EE.UU.), (Mayo 2014). Abstract # 2357/B0033. Acosta MC, Mizerska, Katarzyna K, Luna C, Berbel D, Sesma J, Cuenca N, Belmonte, C., Gallar J. “Age-Related Changes in Morphological and Functional Characteristics of Corneal Nerves and Wound Healing Rate of Guinea Pigs” Poster Communication, Florida (EE.UU.) Gallar J, Santiago B, M.Carmen Acosta, Belmonte, C. “In vivo Functional Characterization of Trigeminal Neurons Innervating the Eye and Periocular Tissues” Poster Communication, Florida (EE.UU.)

8.5. Comunicaciones Congreso EVER 2014 Del Olmo-Aguado S, Nuñez-Álvarez C and N. Osborne N. “Rapamycin down-regulates REDD1 to blunt cell death: a potential way to maintain retinal ganglion cell function as in glaucoma” Poster Communication, Niza (Francia), (Noviembre 2014). Núñez-Álvarez C, del Olmo-Aguado S, Merayo-Lloves J and N. Osborne N. “Red light has the capacity to blunt corneal endothelial cell damage in situ” Poster Communication, Niza (Francia), (Noviembre 2014). Álvarez L, García M, González-Iglesias H, Escribano J, Rodríguez-Calvo PP, Fernández-Vega L and Coca-Prados M. “Lysyl Oxidase-Like 1 Gene Haplotypes and their Association with Pseudoexfoliation Glaucoma in the Spanish Population.” Poster Communication, Niza (Francia), (Noviembre 2014). Íñigo-Portugués A., Alcalde I., González-González O., Gallar J., Belmonte C., Merayo-Lloves J. “Decreased basal tear in aged mice is linked to morphological and functional changes of corneal cold sensory nerve fibers.” Poster Communication, Niza (Francia), (Noviembre 2014) Íñigo Portugués A., Meana A., Vázquez N., Chacón M., Riestra Ana C., Orive G, Merayo- Lloves J. “Substitutes of fetal bovine sera for the culture of human.” Poster Communication, Niza (Francia), (Noviembre 2014)

COMUNICACIONES PRESENTADAS EN EL CONGRESO ARVO

González-González, Omar1, 2; Alcalde, Ignacio1, 2; Íñigo-Portugués, Almudena1, 2; Gallar, Juana3; Merayo-Lloves, Jesus1, 2; Belmonte, Carlos1, 3

3665 - A0179

1Fundación

de Investigación Oftalmológica. Instituto Oftalmológico Fernández-Vega. Oviedo. Spain. 2 Universidad de Oviedo, Oviedo, Spain. 3Instituto de Neurociencias. Universidad Miguel Hernández-CSIC. San Juan de Alicante. Spain.

RESULTS

INTRODUCTION Wetness of the ocular surface is maintained by continuous tear fluid secretion. Alterations in tear secretion result in Dry Eye a disease highly prevalent, particularly among aged persons [1]. Transient receptor potential melastatin-8 (TRPM8) is a cold channel expressed in trigeminal ganglion (TG) neurons and their corneal afferent projections. TRPM8 channels are activated by moderate cold (15-30 ºC).They are expressed in cold thermoreceptors, that sense small oscillations in ambient temperature and change their discharge accordingly [2]. Nerve endings are the parts of the sensory nerve fiber responsible for transducing physical and chemical stimuli into nerve signals. Ultimately evoking sensations; accordingly, nerve terminal density is directly related to corneal sensitivity [3].

Fig. 1. Density of sub-basal cold nerve fibers in the cornea of TRPM8-EYFP mice. A, B, C, D: Immunostaining of TRPM8-EYFP positive nerve fibers at different ages, indicated in parentheses. E: Changes in the density of corneal nerve fibers of the sub-basal plexus in TRPM8-EYFP mice as a function of age. *p<0.05; **p<0,01; ***p<0,001.

MATERIALS & METHODS Corneas were obtained from transgenic TRPM8-EYFP mice of different postnatal days age (p90, p180, p270, p360, p540 and p720). Whole-mounted corneas were studied using immunohistochemical staining. We identify TRPM8 cold sensory fibers and terminals with a rabbit polyclonal antibody against GFP (Molecular Probes; A11122). The secondary antibody used is a biotilynated goat anti-rabbit IgG (Vector Laboratories; #BA-1000). Samples were revealed using ABCPeroxidase technique [1]. Innervation densities were determined in a 0,25 mm2 central area and in two peripheral zones from each quadrant. Singles images were obtained with a Leica DM6000 microscope station. Image analysis was carried out using ImageJ software (NIH) and statistical studies were performed with IBM SPSS Statistics 19 software. Basal tearing was measured in anesthetized animals, using Phenol Red threads (Menicon). Extracellular electrical activity of single sensory nerve endings of the corneal surface was recorded in excised eyes [2, 4], of C57bl6/J mice (p90, n=6 and p720, n=18) and superfused with saline solution of the following composition (in mM): NaCl (128), KCl (5), NaH2PO4 (1), NaHCO3 (26), CaCl2 (2.4), MgCl2 (1.3) and Glucose (10) at room temperature, bubbled with carbogen gas (5 % CO2 and 95 % O2). Only recordings containing a single unit, clearly distinguished from noise (~10 V peak-to-peak) and identifiable by its waveform and firing pattern were used for further analysis.

Fig. 2 Density of corneal cold epithelial nerve terminals in TRPM8-EYFP mice. A, B, C, D: Immunostaining of TRPM8-EYFP positive nerve terminals at different ages, indicated in parentheses. E: Change in epithelial nerve terminal density in TRPM8-EYFP mice as a function of age. *p<0.05; **p<0,01; ***p<0,001.

Two different functional types of nerve endings responding to cooling were found (Fig. 3): Low Threshold Cold (LTC) fibers, with a cooling threshold of 32 ± 0.2 ºC, high background activity (6.26 ± 0.8 imp.s-1) and vigorous firing response to cooling (29.5 ± 2.1 imp.s-1), and High Threshold Cold (HTC) fibers with a cooling threshold of 27.5 ± 0.4 ºC, very low frequency background (0.49 ± 0.1 imp.s-1) and weak responses to cooling (5.4 ± 0.6 imp.s-1) (Fig. 4). In p90 mice 5 ± 1.7% of the total attempts to find a terminal were successful in finding a LTC ending. This success rate was reduced to 2.6 ± 0.7% in p720 mice. Success rates for HTC endings was 2.2 ± 1.1% in p90 mice and 2.8 ± 0.8% in p720 mice (Figure 5). Noteworthy, in p720 mice, nerve endings displaying mixed features of LTC and HTC terminals, Mixed-Type cold endings (MTC) sharing characterisitics of both groups were found (2.4%). They possibly correspond to age-damaged LTC endings Basal tearing values (Fig. 6) also decreased with age (1.9 ± 0.2 mm, 1.3 ± 0.2 mm corresponding to p90 and p720, respectively), varying in parallel with the number of TRPM8 sub-basal branches and epithelial terminals (See figures 1E and 2E).

REFERENCES

CONCLUSIONS

1. Marfurt CF, Cox J, Deek S, Dvorscak L (2010). Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res 90:478-492. 2. Parra A, Madrid R, Echevarria D, del Olmo S, Morenilla-Palao C, Acosta MC, Gallar J, Dhaka A, Viana F, Belmonte C (2010). Ocular surface wetness is regulated by TRPM8-dependent cold thermoreceptors of the cornea. Nat Med 16:1396-1399. 3. Dvorscak L and Marfurt CF (2008). Age-related changes in rat epithelial nerve density. Invest Ophthalmol Vis Sci 49:910-916. 4. Brock J, McLachlan EM, Belmonte C (1998). Tetrodotoxin-resistant impulses in single nerve terminals signalling pain. J Physiol 512: 211-217.

- The density of corneal nerve fibers and terminals decreases with age. Both exhibit changes in their morphology. - According to their firing pattern, two functional types of cold-sensitive nerve terminals were identified in young mice: LTC and HTC nerve fibers. - Aging alters background activity and responsiveness to cold in a fraction of corneal cold-sensitive fibers, affecting more markedly the population of LTC nerve fibers. - Reduction in density and sensitivity to cold of corneal afferent fibers and terminals is associated with a lowering of basal tearing rate, supporting the hypothesis that sensory input from ocular surface cold thermoreceptors contribute to the maintenance of basal tearing.

Fig. 3. Example of the firing of nerve terminal impulses in lowand high- threshold cold terminals during a cooling ramp. A, High-threshold cold sensitive fiber. B, Low-threshold cold sensitive fiber. In both, A and B, the upper trace correspond to the firing frequency of the ending, in impulses per second and the lower trace to the temperature in the recording chamber in Celsius degrees.

Fig. 4. Functional properties of low- and high-threshold cold sensitive terminals. Cold sensitive terminals were classified attending to three different parameters: background activity at 34 ºC in impulses per second (X axis), cooling threshold in Celsius degrees (Y axis) and firing response to cooling in impulses per second (z axis).

Fig. 5. Percentage of succesful attempts of recording an active cold nerve terminal and its variation with aging. Probability to pick up a LTC or a HTC expressed as percent of the total number of seals randomly made on the mouse corneal surface in P90 and P720 mice.

Fig. 6. Changes in mouse basal tear rate related-age.

Memoria de investigación y docencia. AÑO 2014 · COMUNICACIONES AL CONGRESO ARVO

REDUCED NUMBER AND ALTERED FUNCTIONAL ACTIVITY OF MOUSE CORNEAL COLD SENSORY NERVE FIBERS WITH AGE DEVELOP IN PARALLEL WITH DECREASED BASAL TEARING

Supported in part by Fundación Mª Cristina Masaveu Peterson, Fundación Ramón Areces and Caja Rural de Asturias.

SAF2008-00529. From the Ministerio de Economía y Competitividad

Memoria de investigación y docencia. AÑO 2014 · COMUNICACIONES AL CONGRESO EVER

Memoria de investigación y docencia. AÑO 2014 · COMUNICACIONES AL CONGRESO ARVO

Dysregulated basal tearing rate developed with age is associated with reduced number and altered activity of corneal cold thermoreceptor fibers in mice González-González, Omar1, 2; Alcalde, Ignacio1, 2; Íñigo-Portugués, Almudena1, 2; Gallar, Juana3; Belmonte, Carlos1, 3 ;Merayo-Lloves, Jesus1, 2

336 – GG3

1Fundación

INTRODUCTION

MATERIALS & METHODS

Dry eye syndrome is a painful condition caused by inadequate or altered film on the ocular surface [1] and is highly prevalent, particularly among aged persons [2]. TRPM8 (Transient Receptor Potential Melastatin type 8) belongs to a select group of ion channels which are gated by changes in temperature (15-30ºC), are expressed in corneal sensory nerves, sense oscillations in ambient temperature and change their discharge accordingly [3]. Nerve endings are the parts of the sensory nerve fiber responsible for transducing physical and chemical stimuli into nerve signals, ultimately evoking sensations; accordingly, nerve terminal density is directly related to corneal sensitivity [4].

Corneas were obtained from transgenic TRPM8-EYFP mice of different postnatal days age (p90, p180, p270, p360, p540 and p720).Whole-mounted corneas were studied using immunohistochemical staining. We identify TRPM8 cold sensory fibers and terminals with a rabbit polyclonal antibody against GFP (Molecular Probes; A11122). The secondary antibody used is a biotilynated goat anti-rabbit IgG (Vector Laboratories; #BA-1000). Samples were revealed using ABC-Peroxidase technique [2]. Innervation densities were determined in a 0,25 mm2 central area and in two peripheral zones from each quadrant. Singles images were obtained with a Leica DM6000 microscope station. Image analysis was carried out using ImageJ software (NIH) and statistical studies were performed with IBM SPSS Statistics 19 software. Basal tearing was measured in anesthetized animals, using Phenol Red threads (Menicon). Extracellular electrical activity of single sensory nerve endings of the corneal surface was recorded in excised eyes [3, 5], of C57bl6/J mice (p90, n=6 and p720, n=18) and superfused with saline solution of the following composition (in mM): NaCl (128), KCl (5), NaH2PO4 (1), NaHCO3 (26), CaCl2 (2.4), MgCl2 (1.3) and Glucose (10) at room temperature, bubbled with carbogen gas (5 % CO2 and 95 % O2). Only recordings containing a single unit, clearly distinguished from noise (~10 V peak-to-peak) and identifiable by its waveform and firing pattern were used for further analysis.

RESULTS

Cornealfibers of the sub-basal plexusrunparalleltoeachother, giving perpendicular branches and theirnerveterminalsascendingtowardsthe superficial epitheliallayers (Figs. 1A-D, 2A-D). Comparedwith p720 mice (Fig. 1D) , TRPM8+ fibers of p90 mice are shorter (Fig. 1A) and exhibited 7 axons per leash (Fig. 1A), versus only 2-3 axons in p720 mice (Fig. 1D). MoreoverTRPM8+ fibers of p90 mice show a characteristicbeadedmorphology (Fig. 1A) and ramify in theuppermostepitheliumlayers as a cluster of beadednerveterminals (Fig. 2A). In p720 mice, TRPM8+ fiberslackbeads (Fig. 1D) and theirterminalsend as a single ordoublebulbous terminal branch (Fig. 2D). The total number of TRPM8+ sub-basal nerve filaments and epithelial terminals decreased non-linearly with age. Corneal density of TRPM8+ subbasal nerve fibers was significantly (p<0,001) larger in p90 mice (126.37 ± 5.87 fibers/mm2) in comparisonwith p720 mice (91.57 ± 4.18 fibers/mm2) (Fig. 1E). Also, density of TRPM8+ nerve terminals was significantly higher (p<0,001) in p90 mice (156.15 ± 8.01 endings/mm2) in comparison with p720 mice (111.17 ± 5.59 endings/mm2) (Fig. 2E). Two different functional types of nerve endings responding to cooling were found (Fig. 3): Low-Threshold Cold (LTC) fibers, with a cooling threshold of 32 ± 0.2 ºC, high background activity (6.26 ± 0.8 imp.s-1) and vigorous firing response to cooling (29.5 ± 2.1 imp.s-1), and High-Threshold Cold (HTC) fibers with a cooling threshold of 27.5 ± 0.4 ºC, very low frequency background (0.49 ± 0.1 imp.s-1) and weak responses to cooling (5.4 ± 0.6 imp.s-1) (Fig. 4). In p90 mice 5 ± 1.7% of the total attempts to find a terminal were successful in finding a LTC ending. This success rate was reduced to 2.6 ± 0.7% in p720 mice. Success rates for HTC endings was 2.2 ± 1.1% in p90 mice and 2.8 ± 0.8% in p720 mice (Figure 5). Noteworthy, in p720 mice, nerve endings displaying mixed features of LTC and HTC terminals, Mixed-Type cold endings (MTC) sharing characterisitics of both groups were found (2.4%). They possibly correspond to age-damaged LTC endings Basal tearing values (Fig. 6) increased significantly with age (1.58 ± 0.18 mm, 10.86 ± 1.79 mm corresponding to p90 and p720, respectively, p<0.001).

Fig. 3. Example of the firing of nerve terminal impulses in low- and high- threshold cold terminals during a cooling ramp.A, Low-threshold cold sensitive fiber. B, Highthreshold cold sensitive fiber. In both, A and B, the upper trace correspond to the firing frequency of the ending, in impulses per second and the lower trace to the temperature in the recording chamber in Celsius degrees.

Fig. 4. Functional properties of low- and high-threshold cold sensitive terminals. Cold sensitive terminals were classified attending to three different parameters: background activity at 34 ºC in impulses per second (X axis), firing response to cooling in impulses per second (Y axis) and cooling threshold in Celsius degrees (z axis).

Fig. 1. Density of sub-basal cold nerve fibers in the cornea of TRPM8-EYFP mice. A, B, C, D: Immunostaining of TRPM8EYFP positive nerve fibers at different ages, indicated in parentheses. E: Changes in the density of corneal nerve fibers of the sub-basal plexus in TRPM8-EYFP mice as a function of age. *p<0.05; **p<0,01; ***p<0,001. Fig. 2 Density of corneal cold epithelial nerve terminals in TRPM8-EYFP mice. A, B, C, D: Immunostaining of TRPM8EYFP positive nerve terminals at different ages, indicated in parentheses. E: Change in epithelialnerve terminal density in TRPM8-EYFP mice as a functionofage. *p<0.05; **p<0,01; ***p<0,001.

REFERENCES

CONCLUSIONS

1. Kurose M, Meng I (2013). Dry eye modifies the thermal and menthol responses in rat corneal primary afferent cool cells. J Neurophysiol 110: 495–504, 2013. 2. Marfurt CF, Cox J, Deek S, Dvorscak L (2010). Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res 90:478-492. 3. Parra A, Madrid R, Echevarria D, del Olmo S, Morenilla-Palao C, Acosta MC, Gallar J, Dhaka A, Viana F, Belmonte C (2010). Ocular surface wetness is regulated by TRPM8-dependent cold thermoreceptors of the cornea. Nat Med 16:1396-1399. 4. Dvorscak L and Marfurt CF (2008). Age-related changes in rat epithelial nerve density. Invest Ophthalmol Vis Sci 49:910-916. 5. Brock J, McLachlan EM, Belmonte C (1998). Tetrodotoxin-resistant impulses in single nerve terminals signalling pain. J Physiol 512: 211-217.

- The density of corneal nerve fibers and terminals decreases with age. Both exhibit changes in their morphology. - According to their firing pattern, two functional types of cold-sensitive nerve terminals were identified in young mice: LTC and HTC nerve fibers. - Aging alters background activity and responsiveness to cold in a fraction of corneal cold-sensitive fibers, affecting more markedly the population of LTC nerve fibers. -Dysregulation of basal tearingratewereidentified in agedmice and could be

relatedwiththedisorders in morphologicalandfunctionalproperties of corneal cold sensoryneurons.

Fig. 6. Changes in mouse basal tear rate related-age.

Supported in part by Fundación Mª Cristina Masaveu Peterson, Fundación Ramón Areces and Caja Rural de Asturias.

SAF2008-00529. From the Ministerio de Economía y Competitividad

Memoria de investigaciﾃｳn y docencia. Aﾃ前 2014 ﾂｷ COMUNICACIONES AL CONGRESO ARVO

Ana Cristina Riestra1,2, Almudena Iñigo-Portugues1,2, Enol Artime1, Paola Braga1, Ignacio Alcalde1,2, Jesús Merayo-Lloves1,2 1.Fundación de Investigación Oftalmológica, Instituto Oftalmológico Fernández-Vega and 2.Universidad de Oviedo, Oviedo, Spain 5176 - A0397

INTRODUCTION

METHODS

Corneal ulcers remain difficult to treat. Treatment consists of instillation of artificial tears, autologous serum or even growth factors and elimination of toxic agents; however, such treatment may be insufficient.

Mice were subjected to PRK surgery with a 2.0 mm ablation zone on the central cornea and 45 mm of depth on a VISX Star S2 excimer laser.

Over the past few years, new types of matrix therapy agents provided encouraging results, accelerating the healing of chronic skin ulcers of diabetic or vascular origin. In the domain of ophthalmology, RGTA (regenerating agent) formulations have been reported to show encouraging results in the treatment of corneal ulcers and dystrophies of various etiologies.

Corneas were treated topically with one drop of CACICOL or its vehicle 1 hour and 48 hours after injury. Control groups received either HD (hematIc derivative – gold standard) or BSS (Irrigation Balanced Salt Solution – negative control) in the same posology. Clinical and histopathological events were evaluated at 1, 2, 3 and 7 days after surgery.

The purpose of this study is to evaluate the effectiveness of the topical application of CACICOL, a new matrix regenerative therapy based on heparan sulfate derivatives, in an experimental mice model of corneal ulcer after photorefractive keratectomy (PRK).

For histological analysis, sections were obtained through the central region of the corneas and used to analyze the general aspect of injured and healed corneas using hematoxylin and eosin staining. Adjacent sections were used to immunofluorescence analysis using antibodies to Ki67 (proliferation), αSMA (myofibroblast transformation), E Cadherin (assembly of epithelial cells) and neuronal class III β-tubulin (innervation). TUNEL assay was performed to estimate the number of apoptotic cells.

RESULTS 1.

Corneas treated topically with CACICOL showed a greater degree of transparency compared to BSS or HD treated mice and a higher speed of closure of the wounded area during the first 24 hours.

Figure 1. Evolution of closure of the lesion

Figure 2. Two representative images corresponding to mice submitted to PRK and treated for 7 days. A: treated with vehicle. B: Treated with Cacicol

24 hours after treatment with CACICOL, a marked reduction (-50%) of the apoptotic cell density was observed but CACICOL seemed not to affect the proliferation rate during the wound healing process.

Figure 3. Proportion of fibrotic cells in the stroma, day 7

Figure 4. Nerve fiber density at the epithelium after 7 days of treatment with vehicle or CACICOL.

Unlike vehicle, corneas treated with CACICOL presented a thickness and an epithelial cytoarchitecture, based on E-cadherin labeling, similar to uninjured corneas, indicating a better organized regenerating process.

4. Analysis of αSMA profiles in the stroma showed that CACICOL reduced or delayed the presence of myofibroblasts (-58%) in the stroma compared to BSS (p<0.001). 5. Animals treated for 7 days with CACICOL showed an increased epithelial nerve terminal density of 62%.

DISCUSSION

CONCLUSIONS

One important aspect in corneal healing is the consecution of the transparency of the tissue. CACICOL showed a slightly better recovery of transparency levels compared to HD and BSS from the first day of treatment. Regarding the speed of closure of the wounded area we observed a marked difference between CACICOL and HD treatment (p<0.001).

In a model of laser induced cornea surgical lesions, RGTA (CACICOL) topical application could be involved in facilitating the correct assembly of epithelial cells, improving nerve regeneration, avoiding myofibroblast scarring formation or promoting the deposition of newly generated extracellular matrix.

We found that corneas treated with CACICOL for 7 days were comparable to uninjured corneas in thickness. This result could point to a role on matrix deposition promotion of CACICOL. Following by a rigourous counting of each positive recognizable αSMA element in the stroma, we conclude that CACICOL inhibits or delays the presence of fibrotic cells in the stroma with statistically significant differences to both BSS and vehicle (p<0.001). Finally we described a putative neuroregenerative effect of CACICOL in corneas submitted to a PRK experimental lesion.

REFERENCES - Aifa, A., J. Gueudry, A. Portmann, A. Delcampe, and M. Muraine, Topical Treatment with a New Matrix Therapy Agent (RGTA) for the Treatment of Corneal Neurotrophic Ulcers. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2012. 53(13): p. 8181-5 - Merayo-Lloves, J., T. Blanco-Mezquita, L. Ibares-Frias, L. Fabiani, A. Alvarez-Barcia, and C. Martinez-Garcia, Induction of controlled wound healing with PMMA segments in the deep stroma in corneas of hens. Eur J Ophthalmol, 2010. 20(1): p. 62-70..

Memoria de investigación y docencia. AÑO 2014 · COMUNICACIONES AL CONGRESO ARVO

EFFECTIVENESS OF REGENERATIVE DROPS (CACICOL) ON CORNEAL ULCERS (POST PRK) IN AN EXPERIMENTAL ANIMAL MODEL

Supported in part by:

Memoria de investigación y docencia. AÑO 2014 · COMUNICACIONES AL CONGRESO ARVO

Differential proteomics study in serum of patients with primary openangle glaucoma and pseudoexfoliation glaucoma M. Coca-Prados1,2, L. Álvarez1, M. García1, J. Escribano3, P. P. Rodríguez-Calvo1, L. Fernández-Vega1, and H. González-Iglesias1 YALE UNIVERSITY School of Medicine

1Fundación

de Investigación Oftalmológica. Instituto Oftalmológico Fernández-Vega, Oviedo, Asturias, Spain. & Visual Science, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, United States. 3Laboratorio de Genética Molecular Humana, Universidad de Castilla-La Mancha, Albacete, Castilla-La Mancha, Spain.

2357 - B0033

2Ophthalmology

INTRODUCTION

RESULTS

Primary Open-Angle Glaucoma (POAG) and Pseudoexfoliation Glaucoma (PEXG) are among the most prevalent types of glaucoma in developed countries. Investigations conducted in the field of differential proteomics in search for molecular biomarkers for glaucoma diagnostic and management, in readily available biological fluids, have been limited [1]. In the present work, we carried out a comparative differential proteomic analysis of blood serum from patients with POAG, PEXG, and healthy controls. The aim was to identify proteins quantitatively altered, which are significantly discriminatory between glaucoma patients and healthy subjects [2].

STUDY DESIGN

Study population

Protein equalization

1.  Bhattacharya SK, Lee RK, Grus FH, Seventh ARVO/Pfizer Ophthalmics Research Institute Conference Working Group. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2013, 54(1):121-131. 2.  González-Iglesias H, Álvarez L, García M, Escribano J, Rodríguez-Calvo PP, Fernández-Vega L, Coca-Prados M, J. Proteomics. 2014, 98:65-78.

Q14624 P01008 P02787 P02768 P04004 P01859 P02743 P01009 P06727 O14791 P0C0L4 O75636 P02647 P02766

2D-DIGE

Verification on newly recruited subjects

Protein name Complement factor H Fibulin-1 Complement C3 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 Antithrombin-III Serotransferrin Serum albumin Vitronectin Ig gamma-2 chain C region Serum amyloid P-component Alpha-1 antitrypsin Apolipoprotein A-IV Apolipoprotein L1 Complement C4-A Ficolin-3 Apolipoprotein A-I Transthyretin

Gene symbol No of spots (spot numbers) CFH 3 (30, 1127, 31, 36) FBLN1 1 (55) C3 5 (100, 1153, 113, 1128, 1145) ITIH4 SERPINC1 TF ALB VTN IGHG2 APCS SERPINA1 APOA4 APOL1 C4A FCN3 APOA1 TTR

New cohort’s patient recruitment

5 (192, 593, 549, 617, 506) 10 (297, 281, 287, 507, 565, 745, 1907, 739, 423, 422) 4 (274, 373, 360, 346) 10 (462, 467, 446, 438, 436, 447, 2812, 433, 358, 291) 11 (564, 561, 651, 1086, 3550, 1109, 557, 536, 652, 661, 658) 1 (627) 4 (746, 1611, 1908, 1840) 3 (749, 734, 740)) 1 (959) 4 (1045, 964, 941, 960) 2 (1308, 1375) 3 (1359, 1372, 3556) 4 (1911, 1906, 1917, 1920) 1 (2768)

Altered Proteins Identification (MALDI TOF/TOF and nLC-MS/MS)

Multiple Reaction Monitoring-Mass Spectrometry (MRM-MS)

n=53

2D-DIGE

ELISA Quantification

Mascot Score Histogram CFAH_HUMAN Mass: 143680 Score: 110 Expect: 5.3e-06 Matches: 11

Quantification of candidate biomarkers

Statistical Analysis

Functional Pathways Analysis

Candidate markers

Diagnostic test for glaucoma screening

APOA4, TF, C3, APOL1, IGHG2, C4A

C) Product ion M2+ 613.8

A) Selection of the peptide by HPLC-ESI-MS Selected peptide ALDFAVGEYNK

! Sequence is unique ! High sensitivity ! Soluble in water ! Unmodify groups

518.3

! Labelling 13C2-Glycine

B) Scan of the T3 Peptide

A) Enzymatic digestion

13C T* 2 3 Previously quantified

Reduction S-S, DTT

13C

Blocked SH, IAA

0.1 mL serum Urea Buffer

Cleaning sample by:

2-peptide

Tripsin 37ºC, 3h

B) Scan of target Peptide

Normal Vision

1) HPLC-RP-UV 2) HPLC-SCX-UV Serum Tryptic peptides

C) Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Glaucoma

Figure 1. Study design. Step 1, Differential expression analysis; Step 2, Elisa screening; Step 3, Validation by MRM-MS.

pI 4 MW 150-

36 55

176

455451

110

Ranking UniProt

113 100 90

226 274 288 235 276 281 284 287 346 564 571 431 283 192 297 373 397 372 528 566 291 358 536 422 423 533 447 351 658 651 740 749 594 296 360 514 661 433 606 627 739 593 436 699 652 506 544 565 438 446 745 617 734 462 467 507 952 1007967 959 964 666 609 559 645 941 636 1086 1127 851 830 953 746 1055 3544 997 938 958 1145 1045 1109 960 1153 968 1039 966 1184 1282 1128 1219 1214 1211 1379 1329 1212 1468 1375 1483 1308 450

8070-

605

4538-

557 561

1316

13191371 1397

1390

1461 1848

30-

143515371382 1840

1611

1906 1920

1911 1917

1907

3560 2708

153550

2768

1406 1359

1908 2167

1372

1846

3559 2760

P08603 P23142 P01024 Q14624

P01008

Fibulin-1 Complement C3 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 Antithrombin-III

6 7

P02787 P02768

Serotransferrin Serum albumin

P04004

Vitronectin

19 20

2812 3552

21 22 23 24

kDa

25 26 27

Figure 2. A.- 2D-DIGE analysis of serum proteome. Equalized serum samples (53 POAG, 45 PEXG, 51 Control) were analyzed by 2D-DIGE, resulting in 149 significantly altered spots, marked in the gel and subsequently identified. B.- Principal Component Analysis (PCA). Projection on the axes of the most significant spots for each group.

Protein name Complement factor H

1 2 3 4

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

3556

Overall, this work identified a panel of candidates for glaucoma biomarkers that they are part of a network linked to regulating immune and inflammatory-related processes. This study provides a new basis to validate the identified proteins as biomarkers of glaucoma in a large-scale-multiplexed screening in serum. The data from this study offers new perspectives in the discovery of glaucoma biomarkers in serum of POAG and PEXG patients.

REFERENCES

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

serum

blood

Compression of the dynamic range of proteins

serum

RESULTS

Ranking UniProt 1 P08603 2 P23142 3 P01024

n>600

Sample collection/ Serum preparation

Equalization of serum proteins with ProteoMinerTM, two-dimensional fluorescent difference gel electrophoresis (2D-DIGE), matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time of flight MALDI-TOF/TOF, nano-liquid-chromatography tandem mass spectrometry (nLC-MS-MS), functional analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com), and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

A total of 202 blood samples from subjects with POAG (n=73), PEXG (n=59), and controls (cataract, n=70) were analyzed following the proteomic workflow showed in Figure 1. In the first step, after 2D-DIGE analysis of n=149 equalized sera, we established the identity of 149 significantly altered spots resulting in the identification of 35 distinct proteins. The proteomic workflow implemented revealed that these proteins were altered in patients with glaucoma relative to healthy controls. The functional analysis identified the signaling network of these proteins correlated to an immunological and inflammatory pathway. In the second step, the top-17-ranked proteins of the 35 panel were analyzed by ELISA on n=53 non-equalized sera samples from newly recruited subjects (POAG, PEXG and control), and confirmed their alteration in individual protein levels. Stepwise discriminant analysis of the ELISA data resulted in a six-protein panel (APOA4, TF, C3, APOL1, IGHG2, C4A) that was used to generate multivariate predictive models. These models achieved a diagnostic efficiency of 81% (correct assignment), specificity of 83%, and sensitivity of 92%. Specifically, 100% efficacy was reached in the discrimination of the POAG group from control, and 86% efficacy in the discrimination of POAG from PEXG. In the ongoing third step, the clinical validation of candidate biomarkers is being carried out at large scale by means of Multiple Reaction Monitoring-based Mass Spectrometry (MRM-MS).

Potential Candidate Markers

n=149

Step 3: Validation (ongoing)

Step 2: Elisa screening

Step 1: Differential expression analysis

MATERIALS & METHODS

CONCLUSIONS

P01859 Ig gamma-2 chain C region P02743 Serum amyloid P-component P01009 Alpha-1 antitrypsin P06727 Apolipoprotein A-IV O14791 Apolipoprotein L1 P0C0L4 Complement C4-A O75636 Ficolin-3 P02647 Apolipoprotein A-I P02766 Transthyretin P27169 Serum paraoxonase/ arylesterase 1 Q15485 Ficolin-2 Q03591 Complement factor H-related protein 1 P02748 Complement component C9 P22352 Glutathione peroxidase 3 P01860 Ig gamma-3 chain C region Q9BXR6 Complement factor H-related protein 5 Q6UX53 Methyltransferase-like protein 7B P02774 Vitamin D-binding protein P06681 Complement C2

Figure 3. Functional pathway analysis (IPA). The highest scoring network (Antigen presentation, humoral immune response, inflammatory response; score 52) has been obtained from the 35 proteins identified.

Gene symbol No of spots (spot numbers) CFH FBLN1 C3 ITIH4

3 (30, 1127, 31, 36) 1 (55) 5 (100, 1153, 113, 1128, 1145) 5 (192, 593, 549, 617, 506)

SERPINC1

10 (297, 281, 287, 507, 565, 745, 1907, 739, 423, 422) 4 (274, 373, 360, 346) 10 (462, 467, 446, 438, 436, 447, 2812, 433, 358, 291) VTN 11 (564, 561, 651, 1086, 3550, 1109, 557, 536, 652, 661, 658) IGHG2 1 (627) APCS 4 (746, 1611, 1908, 1840) SERPINA1 3 (749, 734, 740)) APOA4 1 (959) APOL1 4 (1045, 964, 941, 960) C4A 2 (1308, 1375) FCN3 3 (1359, 1372, 3556) APOA1 4 (1911, 1906, 1917, 1920) TTR 1 (2768) PON1 3 (952, 967, 968) TF ALB

FCN2 CFHR1

2 (1219, 1184) 2 (958, 953)

C9 GPX3 IGHG3 CFHR5

4 (528, 533, 283, 514) 1 (2167) 1 (636) 1 (397)

METTL7B

1 (645)

GC C2

1 (666) 1 (699) 1 (830)

P19823 P00734

Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 Prothrombin

ITIH2

29 30 31

P02649 P02741

Apolipoprotein E C-reactive protein

APOE CRP

P10909

Clusterin

CLU

P01871

Ig mu chain C region

IGHM

11 (451, 1211, 1319, 455, 450, 1212, 1316, 1282, 1371, 1390, 1397) 1 (351)

34 35

P01834 Ig kappa chain C region O00187 Mannan-binding lectin serine protease 2

IGKC MASP2

1 (1846) 1 (3560)

7 (966, 1039, 1382, 1406, 276, 288, 296) 5 (1379, 1435, 1468, 1483, 1537) 1 (1848)

Table 1. Identification of the most-differentially-altered proteins. The identity of the 149 spots shown in Figure 2 was established, resulting in the identification of 35 distinct proteins differentially expressed between the three sample groups.

SUPPORTED BY: CENIT-20091021

FACULTAD DE MEDICINA

Gene name

POAG group mg/dL APOA4 9.14 ± 3.01 C3 422.27 ± 62.40 TTR 152.25 ± 47.75 TF 445.86 ± 181.71 VTN 103.89 ± 40.52 FBLN1 26.61 ± 7.89 APOA1 234.04 ± 48.58 SERPINA1 289.65 ± 65.72 CFH 121.45 ±27.81 APOL1 8.47 ± 3.05 FCN3 114.74 ± 26.64 IGHG2 826.84 ± 265.30 ITIH4 543.34 ± 275.33 ALB 3695.73 ± 1066.51 SERPINC1 76.41 ± 10.80 C4A 0.15 ± 0.05 APCS 15.25 ± 9.00

PEXG group mg/dL 5.18 ± 1.55 311.28 ± 36.95 98.32 ± 40.59 289.62 ± 56.89 74.93 ± 23.50 21.26 ± 6.76 199.99 ± 28.36 226.98 ± 59.32 102.39 ± 27.62 7.87 ± 3.14 88.79 ± 19.15 800.59 ± 223.03 362.38 ± 189.81 4092.33 ± 954.84 80.39 ± 13.95 0.15 ± 0.05 19.43 ± 13.71

Kruskal-Wallis Test Control group FOLD CHANGE (Non-parametric ANOVA) mg/dL POAG vs CT PEXG vs CT POAG vs PEXG POAG vs CT PEXG vs CT POAG vs PEXG 3.44 ± 0.85 2.7 1.5 1.8 p < 0.001 p > 0.05 p < 0.01 276.40 ± 36.07 1.5 1.1 1.4 p < 0.001 p > 0.05 p < 0.001 82.81 ± 25.60 1.8 1.2 1.5 p < 0.001 p > 0.05 p < 0.01 263.44 ± 57.89 1.7 1.1 1.5 p < 0.001 p > 0.05 p < 0. 01 47.22 ± 12.06 2.2 1.6 1.4 p < 0.001 p < 0.01 p > 0.05 14.10 ± 3.88 1.9 1,5 1,3 p < 0.001 p < 0.05 p > 0.05 183.56 ± 37.04 1.3 1.1 1.2 p < 0.001 p > 0.05 p > 0.05 192.30 ± 58.78 1.5 1.2 1.3 p < 0.001 p > 0.05 p < 0.05 93.60 ± 33.54 1.3 1.1 1.2 p < 0.01 p > 0.05 p > 0.05 5.90 ± 2.28 1.4 1.3 1.1 p < 0.05 p > 0.05 p > 0.05 85.30 ± 21.66 1.3 1.0 1.3 p < 0.01 p > 0.05 p < 0.05 1144.26 ± 402.83 0.7 0.7 1.0 p < 0.05 p < 0.05 p > 0.05 372.13 ± 222.88 1.5 1.0 1.5 p > 0.05 p > 0.05 p > 0.05 3364.20 ± 792.07 1.1 1.2 0.9 p > 0.05 p > 0.05 p > 0.05 81.36 ± 13.06 0.9 1.0 1.0 p > 0.05 p > 0.05 p > 0.05 0.19 ± 0.03 0.8 0.8 1.0 p < 0.05 p > 0.05 p > 0.05 18.42 ± 14.19 0.8 1.1 0.8 p > 0.05 p > 0.05 p > 0.05

Table 2. ELISA Screening. The 17-top-ranked differentially-altered serum proteins were quantified by ELISA on sera samples (non-equalized) from a new population (20 POAG, 14 PEXG and 19 control). The concentrations (mg protein/dL serum, expressed as mean value ± SD) for each of the proteins estimated by ELISA in POAG, PEXG and control groups are shown, as are the fold-change and the Kruskal-Wallis Test (nonparametric ANOVA). Protein panel: C3, APOA4, Method 1 Naive Bayes 2 kNN 3 Classification Tree 4 Random Forest 5 AdaBookst.M1

C4A, TF, IGHG2 and APOL1

Evaluation Results CA Sens 0.7987 0.8214 0.6948 0.8214 0.7078 0.8036 0.7078 0.8571 0.8117 0.8214

Clinical Diagnosis

CT CT 33 PEXG 5 POAG 0 Total 38 Error Rate CA (%) 0.19 0.81

PEXG 7 23 2 32 Sens. 0.92

Spec 0.9286 0.8673 0.8571 0.8367 0.9490

AUC 0.9583 0.9228 0.8154 0.9042 0.9210

POAG Total 0 40 7 35 33 35 40 110 Spec. POAG vs PEXG 0.83 0.86

Table 3. Machine learning models. Stepwise discriminant analysis was performed, resulting in a six protein panel: C3, APOA4, C4A, TF, IGHG2 and APOL1. Multivariate predictive models were generated, and the best classification efficiency was obtained training the data with Naive Bayes with area under the curve (AUC) of 96%. Table 4. Confusion matrix by means of Random Naive Bayes algorithm when comparing CT, PEXG and POAG groups. Each column corresponds to a correct class, and rows represent the predicted classes. Diagnostic efficiency reached 81% (correct assignment, CA), and a specificity (Spec.) of 83% and sensitivity (Sens.) of 92% were obtained.

COMUNICACIONES PRESENTADAS EN EL CONGRESO EVER

Memoria de investigaciﾃｳn y docencia. Aﾃ前 2014 ﾂｷ COMUNICACIONES AL CONGRESO EVER

Memoria de investigación y docencia. AÑO 2014 · COMUNICACIONES AL CONGRESO EVER

DECREASED BASAL TEAR IN AGED MICE IS LINKED TO MORPHOLOGICAL AND FUNCTIONAL CHANGES IN CORNEAL SENSORY NERVE FIBERS Íñigo-Portugués, Almudena1, 2; Alcalde, Ignacio1, 2; González-González, Omar1, 2; Gallar, Juana3; Belmonte, Carlos1, 3; Merayo-Lloves, Jesus1, 2 1Fundación

TRPM8 subbasal nerve fibers of young TRPM8-EYFP mice were shorter and showed 7-9 axons per leash and a characteristic beaded morphology (fig. 1A) and nerve terminals were found in the uppermost epithelium layers as a cluster of beaded (fig. 2A). In aged mice, TRPM8 subbasal fibers were long, poorly ramified and lacked beads (fig. 1B) and ended as single or double terminals (fig. 2B). Morphologically, fibers (fig. 1D, E) andnerveterminals(fig. 2D, E) of TRPM8-KO micewere resembledthosefound in p720 TRPM8-EYFP mice. Corneal densityof TRPM8 subbasalnervefiberswassignificantlylarger (p<0.001) in p90 mice (126.37 ± 5.87 fibers/mm2) in comparisonwith p720 mice (91.57 ± 4.18 fibers/mm2) (fig. 1C), anddensityof TRPM8 nerveterminalswassignificantlyhigher (p<0.001) in p90 mice (156.15 ± 8.01 endings/mm2) in comparisonwith p720 mice (111.17 ± 5.59 endings/mm2) (fig. 2C) in TRPM8-EYFP mice. No differences in thenumberoffibers in subbasalplexusbetween p90 and p540 TRPM8-KO micewereobserved (fig. 1F), whiledensityofnerveterminalsofp540 TRPM8-KO (105,11 ± 8,09)waslower (p<0.001) in comparisonwith p90 TRPM8-KO (158.13 ± 9.45). The total numberof TRPM8 fibers in subbasalplexuswassignificantlylarger in TRPM8-KO micethan TRPM8-EYFP (p<0.001). Also, in p540 TRPM8-EYFP micethedensityof TRPM8 nerveterminalswassignificantlyhigher (p<0.001) comparedwith p540 TRPM8-KO. Fig. 1. Density of sub-basal cold nerve fibers in the cornea of TRPM8-EYFP and TRPM8-KO mice. A, B, D, E: Immunostaining of TRPM8-EYFP positive nerve fibers at different ages, indicated in parentheses. C, F: Changes in the density of corneal nerve fibers of the sub-basal plexus in different mice as a function of age. *p<0.05; **p<0,01; ***p<0,001.

MATERIALS & METHODS Corneas and TG wereobtainedfromtransgenic TRPM8-EYFP andknock out TRPM8-EYFP (TRPM8-KO) miceofdifferentagesrangingfrom 90 to 720 postnatal days. W h o l e - m o u n t e d c o r n e a s werestudiedusingimmunohistochemicalstaining. TRPM8 wereidentifiedusing ABC-Peroxidase technique [1]. Innervationdensitiesweredetermined in a 0,25 mm2 central areaand in twoperipheralzonesfromeachquadrant. TG wereprocessedforinmunofluorescencelabelingagainstperipherin (Millipore), neurofilament 200 (Sigma-Aldrich) and TrkA (Millipore). Imageswereobtainedwith a Leica DM6000 microscopestation. Imageanalysiswascarried out usingImageJ software (NIH) andstatisticalstudieswereperformedwith IBM SPSS Statistics 19 software. Basal tearingwasmeasured in anesthetizedanimals, usingPhenol Red threads (Menicon). Extracellularelectricalactivityof single sensorynerveendingsofthe corneal surfacewasrecorded in excisedeyes [2, 4], of C57BL6/J miceandsuperfusedwithsalinesolutionandGlucose at roomtemperature, bubbledwithcarbogen gas (5 % CO2 and 95 % O2). Onlyrecordingscontaining a single unit, clearlydistinguishedfromnoise (~10 V peak-to-peak) andidentifiable by itswaveformandfiringpatternwereusedforfurtheranalysis.

REFERENCES 1. Marfurt CF, Cox J, Deek S, Dvorscak L (2010). Anatomy of thehumancornealinnervation. ExpEye Res 90:478-492. 2. Parra A, Madrid R, Echevarria D, del Olmo S, Morenilla-Palao C, Acosta MC, Gallar J, Dhaka A, Viana F, Belmonte C (2010). Ocular surfacewetnessisregulatedby TRPM8-dependent coldthermoreceptors of the cornea. NatMed 16:1396-1399. 3. Dvorscak L and Marfurt CF (2008). Age-relatedchanges in ratepithelialnervedensity. InvestOphthalmol Vis Sci 49:910-916. 4. Brock J, McLachlan EM, Belmonte C (1998). Tetrodotoxin-resistant impulses in single nerveterminalssignallingpain. J Physiol 512: 211-217.

RESULTS

INTRODUCTION Wetness of the ocular surfaceismaintainedbycontinuoustear fluid secretion. Alterations in tearsecretionresult in DryEye a diseasehighlyprevalent, particularlyamongagedpersons [1]. Transient receptor potential melastatin-8 (TRPM8) is a cold channel expressed in trigeminal ganglion (TG) neurons and their corneal afferent projections. TRPM8 channels are activated by moderate cold (15-30 ºC).They are expressed in coldthermoreceptors, thatsensesmalloscillations in ambienttemperature and changetheirdischargeaccordingly [2]. Nerveendings are theparts of thesensorynervefiberresponsiblefortransducingphysical and chemicalstimuliintonervesignals. Ultimatelyevokingsensations; a c c o r d i n g l y , n e r v e t e r m i n a l densityisdirectlyrelatedtocornealsensitivity [3].

eS054

Fig. 2. Density of corneal cold epithelial nerve terminals in TRPM8-EYFP and TRPM8-KO mice. A, B, D, E: Immunostainingof TRPM8-EYFP positive nerve terminals at different ages, indicated in parentheses. C, F: Change in epithelialnerveterminalsdensity indifferentmiceas a function of age. *p<0.05; **p<0,01; ***p<0,001.

Fig. 6. Changes in mouse basal tear rate related-age.

Two different functional types of nerve endings responding to cooling were found: Low Threshold Cold (LTC) fibers, with high background activity (6.26 ± 0.8 imp.s-1), vigorous firing response to cooling (29.5 ± 2.1 imp.s-1) and a cooling threshold of 32 ± 0.2 ºC; and High Threshold Cold (HTC) fibers with very low frequency background (0.49 ± 0.1 imp.s-1), weak responses to cooling (5.4 ± 0.6 imp.s-1) and a cooling threshold of 27.5 ± 0.4 ºC (fig. 3). In p90 mice 5 ± 1.7% of the total attempts to find a terminal were successful in finding a LTC endings and 2.2 ± 1.1% for HTC endings. Success rate was reduced to 2.6 ± 0.7% in LTC and augmented to 2.8 ± 0.8% in HTC in p720 mice (fig.4). Noteworthy, in p720 mice, nerve endings displaying mixed features of LTC and HTC terminals, MixedType cold endings (MTC), sharing characteristics of both groups were found (2.4%). They possibly correspond to age-damaged LTC endings.

In TG wereobservedtwopopulationof TRPM8 cold sensoryneurons: intense EYFP fluorescence (IF) andweakEYFP fluorescence (WF) (fig. 5B, G). In total amountof TRPM8 TG neurons, 10% expressed IF in p90 miceandtheirdensitydidn’tchange in p720 mice, and 8% expressed WF in p90 miceand 13% in p720 mice (p<0.05). TRPM8 neuronswith IF andperipherinwere 44% ofthe total amountof TRPM8 neurons in p90 mice versus 32% in p720 (p<0.01). Moreover, in p90 mice TRPM8 neuronswith WF andperipherinwere 24% versus 34% in p720 (p<0.01) (fig. A-E). Besides, 7% oftheneuronswith TRPM8 co-expressed NF200 were IF in p90 miceand 11% in p720 mice. TRPM8 and NF200 neuronswere WF in 8% in p90 miceand 10% in p720 mice (fig. 5F-J).

Basal tearing rate increased significantly with age (1.58 ± 0,18 mm, 10,86 ± 1,79 mm corresponding to p90 and p720, respectively, p<0.001) (fig. 6).

Fig. 3. Functional properties of low- and high-threshold cold sensitive terminals regarding age. Cold sensitive terminals in p90 and p720 were classified attending to three different parameters: background activity at 34 ºC in impulses per second (X axis), firing response to cooling in impulses per second (Y axis) and cooling threshold in Celsius degrees (Z axis).

Fig. 4. Percentage of successful attempts of recording an active cold nerve terminal at different ages. Probability to pick up a LTC or a HTC expressed as percent of the total number of seals randomly made on the mouse corneal surface in P90 and P720 mice.

Fig. 5. Inmunostaining of TG longitudinal section of p90 TRPM8-EYFP mice. A, F: nuclear staining DAPI. B, G: Positive TRPM8 neurons. C: Postive peripherin neurons. H: positive NF200 neurons. D, I: Merge. Arrows indicate colocalization of intense TRPM8-EYFP fluorescence and peripherin or NF200 positive somas. Arrowheads show TRPM8-EYFP weak fluorescence and peripherin or NF200 neurons. E, J: Percentage of different neural population of TG in p90 TRPM8-

EYFP

CONCLUSIONS - Thedensityof corneal nervefibersandterminalsdecreaseswithage. Bothexhibitchanges in theirmorphology. - Twofunctionaltypesof cold-sensitivenerveterminalswereidentified in youngmice: LTC and HTC nervefibers. Theirproportionchangewithaging, affecting more markedlythepopulationof LTC nervefibers. - Accordingtoneurochemicalproperties, two TRPM8 populationsofneuronswerefound in TG: intense EYFP fluorescenceandweakEYFP fluorescence. - Dysregulation of basal tearing rate were identified in aged mice and could be related with the disorders in morphological, functional and neurochemical properties of corneal cold sensory neurons.

Supported in part by Fundación Mª Cristina Masaveu Peterson, Fundación Ramón Areces and Caja Rural de Asturias. SAF2008-00529. From the Ministerio de Economía y Competitividad

Memoria de investigaciﾃｳn y docencia. Aﾃ前 2014 ﾂｷ COMUNICACIONES AL CONGRESO EVER

Susana del Olmo-Aguado, Claudia Núñez-Álvarez and Neville N. Osborne

Fundación de Investigación Oftalmológica, Instituto Oftalmológico Fernández-Vega, Oviedo, Spain

PURPOSE

Freshly dissected retinas (mice, rat) were processed by conventional western blot techniques, subjected to mRNA analysis by real-time qPCR or fixed in 4% paraformaldehyde. A single human retina was also fixed and frozen sections of retina processed for immunohistochemistry using antibodies to identify RTP801 (Enzo LS), Brn3a (SantaCruz Biotech) and OXPHOS (MitoSciences). RGC-5 cells (50,000/ml) maintained in culture for 24 hours were exposed to CoCl2 a hypoxia inducer or rapamycin for defined times and subjected to histological analysis and immunohistochemistry.

Mouse retina ONL

ONL

INL

GCL

Rat retina ONL

ONL

INL

GCL

Human retina ONL

ONL

INL

GCL

Fig A. In mouse, rat and human retinas immunoreactive RTP801 is predominantly present in the retinal ganglion cell layer (middle images). Blue DAPI staining shows cell nuclei.

Retinal tissues content both, mRNA and RTP801 protein, as o b s e r v e d i n We s t e r n b l o t s a n d q P C R a n a l y s e s . Immunoreactivity assays revealed that most of the RTP801 signal was located in the ganglion cell layer (GCL), especially in the mouse and rat retinas. Some specific RTP801 immunoreactivity was also located in the internal nuclear layer (INL) and other retinal layers, particularly in the human retina. RTP801 immunoreactivity in the ganglion cell layer of rat sections was observed, in some cases, in ganglion cells because of its co-localisation with Brn3a (nuclear marker). Some ganglion cells stained positively for Brn3a, but contained little if any RTP801 and some DAPI-positive cells in the GCL did not stain for either RTP801 or Brn3a. In RGC-5 cells the double staining with RTP801 and the mitochondrial marker OXPHOS, displayed a similar punctate appearance in the cytoplasm of RGC-5 cells, in which, RTP801 is shown as a cytoplasmic protein that could be partially associated to OXPHOS. Moreover, RGC-5 cells exposed to CoCl2 caused a degree of DNA breakdown and an elevated in the expression of RTP801. Rapamycin had no apparent negative effect on RGC-5cells.

Fig E. Double “staining” of control RGC-5 cells for RTP801 and OXPHOS in conjunction with the nuclear dye DAPI (blue).

RTP801

OXPHOS

Control

RTP801/OXPHOS/DAPI

CoCl2

Fig F. CoCl2 treatment (500µM, 12 hours) enhances RTP801 immunoreactivity (image on the right) in RGC-5 cells and has a negative influence indicated by the presence of fewer DAPI blue cell nuclei.

RTP801

Brn3a

RTP801/Brn3a/DAPI

Fig B. Co-localisation of RTP801 and Brn3a: Brn3a cells co-localizing with RTP801 ( ), Brn3a positive cells containing little if any RTP801 ( ) and some ganglion cells that were no positive for any of them ( ).

Mouse Rat retina retina

Mouse Rat kidney kidne us y

D 35kD a

RTP801

Actin

28kD a 45kD a

Quantitative PCR (Fig. C) and western blot (Fig. D) data to show the evidence for the presence of RTP801 in the retina and lens of mice and rats and also RGC-5 cells. Equivalent amounts of protein extracts recognize two species, 35kDa and 28kDa, of RTP801 immunoreactivity in western blots of the kidneys, but only the 28kDa form in the retinal samples. qPCR data are all relative to GAPDH. Results are mean values ± SEMs where n=4.

Control

METHODS

RESULTS

CoCl2

The stress-related protein REDD1 or RTP801 is triggered by adverse environmental conditions and inhibits the mammalian target of rapamycin (mTOR) to elicit various responses that include enhancement of oxidative stress and the control of autophagy. The purpose of the present study was to deduce whether down-regulation of RTP801 in cell cultures blunts an insult of oxidative stress and also see whether RTP801 is located to retinal ganglion cells and to be a potential target for the treatment of glaucoma.

eF008

Rapamycin

Memoria de investigación y docencia. AÑO 2014 · COMUNICACIONES AL CONGRESO EVER

Rapamycin down-regulates REDD1 to blunt cell death: a potential way to maintain retinal ganglion cell function as in glaucoma.

DAPI

Phase contrast

Merge

Fig G. RGC-5 cells in culture exposed to either CoCl2 (300µM) or rapamycin (10mM) for 24 hours. DAPI staining (left); phase contrast pictures (middle); phase contrast pictures and DAPI (right). Cells exposed to CoCl2 exhibit nuclear fragmentation that results in cell death. In contrast cells are unaffected by treatment with rapamycin.

CONCLUSIONS RTP801 or REDD1 is present in the retina and immunohistochemistry suggests that retinal ganglion cells express the protein in significant amounts. Studies on cells in culture show RTP801 to be up-regulated by CoCl2 to cause cell death. Future experiments will be aimed at targeting RTP801 with rapamycin to attenuate ganglion cell death in situ with the aim of providing a new treatment strategy for glaucoma.

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CNA, SOA and NNO gratefully acknowledge Enol Artime Gutierrez for the Animal house Services. Authors also acknowledge Fundación BBVA, Novartis Lab. and Fundación MªCristina Masaveu Peterson for their support.

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Instituto Oftalmológico Fernández- Vega Fundación de Investigación Oftalmológica Avda. Dres. Fernández -Vega, 34 33012 Oviedo · Asturias · España T. 985 240 141 instituto@fernandez-vega.com info@fio.as www.fernandez-vega.com

Depósito legal: AS 4206-2011