Ecologia microbiana. Los microorganismos y algunas de sus aplicaciones (1a ed.)

ISBN 978-958-775-671-5

ECOLOGÍA

MICROBIANA los microorganismos y algunas de sus aplicaciones

FACULTAD DE CIENCIAS DIRECCIÓN DE BIENESTAR DIRECCIÓN DE BIENESTAR UNIVERSITARIO ÁREA DE ACOMPAÑAMIENTO INTEGRAL PROGRAMA GESTIÓN DE PROYECTOS

ECOM IC Ecolog ía Microbiana Los Microorganismos y algunas de sus aplicaciones Primera Edición, enero, 2016 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS ISBN XXXX-XXXX

contacto ecomic_fcbog@unal.edu.co

U niv er sidad N aciona l S ede B ogotá

de

C olom bi a

Cra 45 No 26-85 Edificio Uriel Gutiérrez w w w . u na l . edu . co

proyectoug_bog@unal.edu.co /gestiondeproyectosUN ugp.unal.edu.co issuu.com/gestiondeproyectos

Rector Ignacio Mantilla Vicerrector Diego Fernando Hernández Director Bienestar Sede Bogotá Oscar Oliveros Coordinadora Programa Gestión de Proyectos Elizabeth Moreno Decano Facultad de Ciencias Jaime Aguirre Ceballos Director Bienestar Ciencias Luis Fernando Ospina Directora Departamento de Biología Consuelo Burbano Montenegro Grupo de Investigación Asociado Fisiología del Estrés y Biodiversidad en Plantas y Microorganismos Directora Grupo de Investigación Luz Marina Melgarejo Directora Grupo Ecología Microbiana Jimena Sánchez Nieves Editora María Angélica Leal Leal Corrección de Estilo Diana Consuelo Luque Villegas Portada Ilustración: Marisol Leal Leal Diagramación y Diseño Fernando Rodríguez (PGP) Impresor GRACOM Gráficas Comerciales

2

Reservados todos los derechos morales de esta edición para la Universidad Nacional de Colombia y el Grupo de Ecología Microbiana.

Atribución - Sin Derivar - No Comercial Esta Obra deberá ser citada del siguiente modo: Autores del Capítulo (2015). Nombre del Capítulo. En: Leal María: Ecología Microbiana: Los Microorganismos y algunas de sus aplicaciones. Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia. con el apoyo de Universidad Antonio Nariño Grupo de Astrobiología - Universidad Nacional

ecología microbiana Los microorganismos y alg unas de sus aplicaciones

GR U PO ECOLOGÍA M ICROBI AN A ECOM IC Marí a Angélica Leal Leal edi tora

3

de dicator ia ag r a decimie n to s 4

Este libro está dedicado a todo aquel que ha soñado o sueña con ser científico, con escudriñar los misterios de nuestro planeta y con llegar a comprender, así sea mínimamente, los fenómenos que la vida oculta. A todo aquel que se apasiona por los microorganismos. Igualmente, a nuestras familias y amigos, quienes nos apoyaron en el proceso. Pero, sobre todo, a nuestro planeta que es el que sustenta todas nuestras ideas, afanes y curiosidades.

Agradecemos al Programa de Gestión de Proyectos de la Universidad Nacional, pues ha sido un apoyo para la publicación de este libro, especialmente a Elizabeth Moreno y Andrea Fandiño. A Bienestar de la Facultad de Ciencias; al profesor Luis Fernando Ospina por creer en nuestros esfuerzos y darnos el apoyo para este proyecto. Al diseñador Fernando Rodríguez que hizo posible que este libro sea el producto final que es hoy. A la diseñadora Marisol Leal por su colaboración con la ilustración de la portada. A Diana Luque, la correctora de estilo, que hizo su mejor esfuerzo para que el libro tuviera la coherencia adecuada para nuestros lectores. A la profesora Luz Marina Melgarejo por su apoyo incondicional a la línea de Ecología Microbiana. A la profesora Consuelo Burbano por su mente abierta a las nuevas ideas y el apoyo a las mismas. A las universidades que nos han formado, y a cada una de las facultades, departamentos y docentes que nos han construido en el camino de la academia. A la Universidad Nacional por cada uno de sus programas y por ser la cuna y madre de nuestros sueños y proyectos. A la Universidad Antonio Nariño por su constante cooperación en nuestros proyectos. A nuestras familias y amigos por apoyar esta iniciativa.

Ecología Microbiana: Los microorganismos y algunas de sus aplicaciones busca introducirlo en esta área del conocimiento, a través de un espectro de aplicaciones de los microorganismos en relación con su entorno, es un libro para todo aquel que esté interesado en investigar en este campo. El texto que ahora tiene en sus manos, si bien no abarca una gran extensión de temas, sí pretende dar una mirada integral a los que aquí se presentan. Este es un libro recomendado para personas con un conocimiento previo en ciencias biológicas, particularmente microbiología; sin embargo, esperamos que aquellos que se están introduciendo en el estudio de los microorganismos encuentren en este material perspectivas que permitan ampliar el horizonte y un punto de referencia para plantear nuevas ideas.

P r e se n taci ó n

Lector:

La presente edición surge como resultado del arduo trabajo del equipo de investigadores y estudiantes que conforman el grupo de Ecología Microbiana, y de las recopilaciones hechas con los años, que han sido difundidas dentro del grupo en las actividades propias de la discusión y el hacer ciencia.

Esperamos que usted, apreciado lector, pueda observar el gran trabajo que hemos desarrollado durante este periodo de tiempo no solo a nivel de resultados académicos sino de formación de talento humano, pues sin este sería imposible tener en sus manos este ejemplar. Queremos mostrar un trabajo con el apoyo de científicos, con una amplia experiencia en sus áreas específicas, lo que manifiesta nuestro compromiso con la calidad y el mejoramiento diario de la ciencia en nuestro país. Esperamos que disfrute este libro y que sea de gran provecho para su conocimiento.

Gracias por leernos.

María Angélica Leal Leal Editora Bióloga. Universidad Nacional de Colombia

5

con t e n i d o 6

1 2 3 4 5

p.5

Rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal ( pgpr ) una alternativa en la búsqueda de la agricultura sostenible

p.33 Aspectos generales en micorremediación

p.63 Halófilos y termofilos, ecología y aplicaciones

p.79 Biodeterioro y perspectivas de investigación

p.107

Hongos formadores de micorrizas arbusculares ecología y aplicación con un enfoque en gramíneas

1 RIZOBACTERIAS PROMOTOR AS DE CRECIMIENTO V EGETA L ( PGP R ) una alternativa en la búsq ueda de la ag ricultura sostenible

7

Vanegas, Javier1 Boyacá, Johanna2 Pantoja, Luisa2 Navarro, Juan3 Torres, Edwin3 Pabón, Paula4 Ramírez, Nataly2 Robles, Alejandra4 Pereira, Paola5 Barriga, Oscar4

1. Biólogo. MSc.Microbiología. PhD. Biotecnología.

Docente departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Antonio Nariño 2 Bacterióloga. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca 3 Estudiante Ingeniería Agronómica.

Universidad Nacional de Colombia 4 Biólogo(a). Universidad Nacional de Colombia 5 Ingeniera Agrónoma. Universidad Nacional de Colombia

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

1. Introducción Las actividades desarrolladas por el hombre en la agricultura moderna han ocasionado la reducción o desaparición de ecosistemas naturales y problemas ambientales asociados a la degradación de tierras, contaminación de aguas, agotamiento de aguas subterráneas y cambios climáticos (Rather y Mukhtar, 2014). Por ejemplo, el uso intensivo de fertilizantes ha conducido a la eutroficación de aguas, la producción de gases de invernadero (Jackson, Burger y Cavagnaro, 2008) y potenciales problemas de salud humana, que van desde enfermedades respiratorias hasta la formación de cánceres (Ladha y Reddy, 2003). No obstante, el uso de bacterias ha logrado disminuir el uso de fertilizantes sin afectar la productividad de cultivos de interés comercial (Kennedy, Choudhury y Kecskés, 2004; López-Ceballos, 2011; Bhattacharyya y Jha, 2012). El uso de productos microbianos ofrece varias ventajas frente a los productos químicos usados en la agricultura ya que estos se consideran productos seguros; ninguna sustancia tóxica ni microbiológica se acumula en la cadena alimenticia.

Los organismos objetivos raramente desarrollan resistencia y su uso no resulta perjudicial en procesos ecológicos o ambientales (Wu et al., 2005).

Estas bacterias, con la capacidad de promover el crecimiento vegetal, han sido denominadas PGPR (por sus siglas en inglés) (Kloepper y Schroth, 1978). Estas pueden habitar la superficie de las raíces y son denominadas bacterias rizosféricas. La rizósfera se define como la zona del suelo alrededor de la raíz que se ve influenciada por la actividad metabólica de la planta (Zúñiga, 2010). En esta interacción, la planta aporta compuestos como azúcares, ácidos grasos y vitaminas; mientras que los microorganismos contribuyen con moléculas que actúan sobre la inmunidad vegetal o el crecimiento y morfogénesis de la planta (Höflich, Wiehe y Kühn, 1994; El-Tarabily y Sivasithamparam, 2006; Richardson et al., 2009; Esquivel et al., 2013). Las PGPR que colonizan los tejidos vegetales internos de la planta se han denominado microorganismos endófitos (Zúñiga, 2010). Entre los endófitos más estudiados están aislamientos como Azospirillum sp., Herbaspirillum sp. y Gluconacetobacter diazotrophicus; además de microorganismos con la capacidad de formar nódulos en raíces como Rhizobium sp. y Bradyrhizobium sp. (Bécquer et al., 2008).

Las PGPR se pueden clasificar en dos grupos: (i) PGPR que promueven el crecimiento vegetal y (ii) PGPR que suprimen fitopatógenos (Bashan y Holguin 1998).

En esta revisión nos hemos enfocado en el primer grupo, ya que las PGPR tienen diferentes mecanismos para estimular el crecimiento vegetal, tales como la fijación biológica de nitrógeno (N), el aumento de la disponibilidad y la absorción de nutrientes en la rizósfera, la solubilización de nutrientes como los fosfatos, la síntesis de sideróforos y el aumento del área superficial de las raíces mediante la producción de reguladores de crecimiento y la producción de la ACC (1-aminociclopropano-1-carboxilato) deaminasa (Vessey, 2003; Kennedy, Choudhury y Kecskés, 2004; Bach y Díaz, 2008).

9

2. Actividad Promotora de Crecimiento Vegetal Uno de los grupos más estudiados en la promoción del crecimiento son las bacterias con la capacidad de fijar N, también denominadas diazótrofos (Vessey et al., 2003; Kennedy Kennedy, Choudhury y Kecskés, 2004; Lucy, Reed y Glick, 2004; Fuentes y Caballero, 2006; Bhattacharjee, Singh y Mukhopadhyay, 2008; Bhattacharyya y Jha, 2012). Estos diazótrofos han promovido el crecimiento en cultivos como maíz, arroz, trigo, sorgo y caña de azúcar, especialmente (Choudhury y Kennedy, 2004; Bhattacharyya y Jha 2012). El desarrollo de inoculantes bacterianos con diazótrofos es cada vez más relevante, no solo por la importancia del N para el establecimiento de cultivos de interés comercial sino por el aumento en el precio de la fertilización nitrogenada (Adesemoye y Kloepper, 2009). Los diazótrofos de vida libre rizosféricos más empleados son Azotobacter, Clostridium, Azospirillum, y endófitos como Herbaspirillum, Burkholderia y Azoarcus (ver revisión de Choudhury y Kennedy, 2004).

Para que exista un efecto benéfico por inoculación de una PGPR, esta debe colonizar la raíz, sobrevivir, multiplicarse y competir en la rizósfera (Bashan, Holguin y de Bashan, 2004; Barea et al., 2005). La supervivencia de una PGPR depende de factores como los contenidos de materia orgánica, la fracción arcillosa (Bashan, Holguin y de Bashan, 2004), el tipo de suelo, el balance de agua, las prácticas agrícolas como la fertilización, el control químico de enfermedades y los genotipos (Fages, 1994). Esto explica las inconsistencias de los resultados en el campo y el laboratorio; además del vacío que existe entre la investigación básica y las aplicaciones a gran escala en la agricultura (Lucy, Reed y Glick, 2004; Díaz-Zorita y Fernandez-Canigia, 2009).

Para desarrollar un biofertilizante es necesario establecer relaciones específicas con el hospedero, determinar las condiciones físico-químicas en las que se establece el inoculante, desarrollar formulaciones adecuadas y evaluar la rizocompetencia del inóculo ante poblaciones nativas bien adaptadas (Lucy, Reed y Glick, 2004).

Por ejemplo, la respuesta en la promoción del crecimiento es influenciada por un nivel óptimo de fertilización de N (Cong et al., 2009; Baba et al., 2010), la cual depende de las cultivariedades y la cepa inoculada (Gunarto, Adachi y Senboku, 1999). Por un lado, las cultivariedades que responden positivamente a la fertilización de N podrían ser afectadas positivamente por la inoculación con diazótrofos a bajos niveles de N; por el otro lado, las cultivariedades que responden débilmente a la fertilización de N podrían ser afectadas positivamente por la inoculación al 100% de los requerimientos de N (Sasaki et al., 2010).

En Colombia, se han aislado bacterias fijadoras de N en plantas forestales como el pino romerón, cedro rosado, encenillo y pagoda (Orozco, 2009). En cuanto a plantas de interés comercial se han realizado aislamientos y evaluaciones de promoción de crecimiento en algunas como la vainilla (López, Vega y Montoya, 2013), arroz (Valero 2003, Laray Álvarez. 2013, Vanegas y Uribe-Vélez, 2014), lechuga (López et al., 2014), pastos (Criollo et al, 2012; Caro et al 2014), ají (Vanegas, 2007), tomate (Pareja, 2012, Vanegas, 2004), entre otros. No obstante, son limitados los bioinsumos aplicados a gran escala en cultivos comerciales.

10

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

3. Reg uladores de Crecimiento Vegetal (PGRs, en inglés) Los microorganismos, mediante la emisión de reguladores de crecimiento, son capaces de estimular el crecimiento de la planta; consecuentemente, intensificar la producción de metabolitos de la planta y utilizarlos para su propio crecimiento (Gaudin, Vrain y Jouanin, 1994). Las hormonas vegetales son señales químicas que se sintetizan en una parte de la planta y se transportan a otro lugar (tejido diana) para regular cambios morfológicos y fisiológicos en la planta, como la estimulación e inhibición del crecimiento vegetal (Saharan y Nehra, 2011). Las cinco fitohormonas más importantes son: auxinas, giberelinas, citoquininas, etileno y ácido abscísico. Estas deben ser reconocidas y capturadas por las células para unirse a una proteína receptora, capaz de causar algún cambio metabólico que conduzca a amplificar la señal o del mensajero hormonal (Salisbury y Ross, 1994).

3.1 Auxinas, moléculas de promoción de crecimiento vegetal El papel de las auxinas en la planta es muy importante en la elongación de tallos y hojas, la formación de yemas florales, el desarrollo de frutos, la ramificación de raíces, la dominancia apical y la abscisión de hojas (Salisbury y Ross, 1994; Azcon y Talon, 2000). Estas sustancias se encuentran principalmente unidas de forma covalente o conjugadas con otras moléculas como glucosa o glicoproteínas, las cuales son liberados mediante incidencia de luz o por gravedad; es importante que sea liberado ya que en su estado conjugado son inactivas (Salisbury y Ross, 1994).

Las plantas sintetizan fitohormonas en respuesta a efectos exógenos durante ciertas fases del crecimiento y almacenan estas moléculas como conjugados para su posterior uso, para un adecuado desarrollo, ya que bajo condiciones ambientales no adecuadas se limita la síntesis de fitohormona (Azcon y Talon, 2000).

El ácido indolacético (AIA) es una de las auxinas más importantes en la promoción del crecimiento vegetal. Sin embargo, existen otros compuestos indólicos que ejercen algún efecto en la promoción del crecimiento como el ácido indol pirúvico, el ácido indol láctico, el ácido indol acetamida y el ácido indol acetaldehído (Rives, Acebo y Hernández, 2007). El AIA es sintetizado por plantas y microorganismos, y se estima que el 80% de los microorganismos de suelo son capaces de sintetizar y liberar auxinas como metabolitos secundarios para colonizar la planta (Vessey, 2003).

El AIA es sintetizado por al menos tres rutas dependientes del triptófano: el ácido indol-3-pirúvico, el indol-3-acetamida y la ruta de la triptamina (Spaepen, Vanderleyden y Remans, 2007). El triptófano juega un importante papel en la regulación de la biosíntesis del AIA por parte de los microorganismos del suelo. Los exudados radicales son fuente natural del triptófano para la microbiota rizosférica, la cual puede potenciar la biosíntesis de auxinas en la rizósfera (Contreras et al., 2010). Existen factores ambientales que modulan la biosíntesis de AIA como: el

11

pH ácido, el estrés osmótico, la limitación de carbono y otros factores genéticos como la ubicación de los genes implicados en la biosíntesis de esta auxina (plásmido o cromosómico) y el modo de expresión (Ahemad y Kibret, 2014).

El AIA está íntimamente relacionada con el crecimiento y desarrollo de la planta, puesto que afecta la división, la extensión y diferenciación celular, incrementa la longitud y el área radicular para acceder a más nutrientes (Vessey, 2003; Lara, Oviedo y Aleman, 2011). Además, puede emitir respuestas de defensa frente a patógenos, estimular la germinación de semillas; en las plántulas jóvenes, ayuda a adherirse al suelo rápidamente (Cubillos, Castellanos y Argüello, 2009); incrementar la concentración de clorofila a y b, luteína, violaxantina y lípidos (Gómez, Valero y Morales, 2012).

Los efectos de las auxinas en las plantas son dependientes de la concentración, es decir, de acuerdo con la concentración en la que esté la auxina puede incrementar o inhibir el crecimiento vegetal (Spaepen, Vanderleyden y Remans, 2007).

Por ejemplo, el AIA actúa benéficamente a bajas concentraciones (5 g/ml, Saharan y Nehra, 2011), mientras que la inhibición de crecimiento de la raíz se produce cuando los niveles de AIA son altos (72 g/ml; Cecil, 2004). Las concentraciones de AIA en las raíces son usualmente más bajas que en las demás partes de la planta; cuando la concentración de AIA alcanza niveles similares a las del tallo la raíz se inhibe (Galindo, 2008).

Algunas PGPR han promovido el crecimiento vegetal, principalmente, por la producción de AIA como Aeromonas veronii, Agrobacterium sp., Alcaligenes piechaudii, Azospirillum brasilense, Bradyrhizobium sp., Comamonas acidovorans, Enterobacter cloacae y Rhizobium leguminosarum en plantas como arroz, lechuga, trigo, caña de azúcar y rábano (Vessey 2003; Saharan y Nehra, 2011; Bhattacharyya y Jha 2012).

No solo las PGPR pueden sintetizar AIA, bacterias fitopatógenas producen altas concentraciones de AIA para debilitar el sistema radical de la planta haciéndola más vulnerable a la infección (Spaepen, Vanderleyden y Remans, 2007).

4. Fijación Biológ ica de Nitrógeno (FBN) La fijación biológica de N es el proceso mediante el cual las bacterias fijadoras de N (diazotróficas) reducen el N atmosférico a amonio, una forma que puede ser metabolizada por las plantas. Este proceso le provee a la planta un mayor acceso al N y, por ello, promueve su crecimiento (Çakmakçi, 2006; Gamalero y Glick, 2011). El mecanismo mediante el cual la bacteria rompe el triple enlace del N atmosférico está relacionado con la acción de un complejo enzimático denominado nitrogenasa (Gamalero y Glick, 2011). La presencia de la nitrogenasa se puede determinar por la amplificación del gen que codifica para la enzima nitrogenasa (nifH, Dixon y Kahn, 2004), cuantificando la actividad fijadora de N con isótopos de 15N, o por cromatografía de gases mediante el ensayo de reducción de acetileno (Malik, 1997; Zahran, 1999).

La actividad de la nitrogenasa se ve afectada por la temperatura, los nutrientes inorgánicos, el nivel de pH, la disponibilidad de fósforo en el suelo y la concentración de oxígeno (Sánchez et al., 2006). Por ejemplo, la B. macerans sólo en condi-

12

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

ciones anaeróbicas fija N porque no tiene un mecanismo de protección de su enzima nitrogenasa ante los efectos dañinos del O2. No obstante, se ha reportado que la Streptomyces thermoautotrophicus presenta una nitrogenasa inusual que no es afectada por la presencia de oxígeno (Ribbe, Gadkari y Meyer, 1997).

De acuerdo con la relación que tienen con las plantas, las PGPR se han dividido en dos grupos: las bacterias simbióticas (entre las que se encuentran las diazotróficas Rhizobium spp.) y las diazotróficas de vida libre (de las cuales las representantes más comunes son Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, y Klebsiella sp.) (Hayat, 2010). Las bacterias diazotróficas de vida libre han sido ampliamente reportadas en plantas como caña de azúcar, el arroz, el algodón y el maíz (Malik, 1997; López et al, 2008). Estas relaciones se dan por la dependencia de las diazotróficas no simbióticas de algunos recursos que les brindan este tipo de plantas, como fuentes de carbono, elementos como el molibdeno, o el vanadio en el suelo (Hayat, 2010).

La bacteria modelo en promoción de crecimiento es Azospirillum sp. Esta cepa puede causar un aumento de más de un 12% en los niveles de N en cultivos de trigo, algodón o caña de azúcar, a partir de una cuantificación con 15N (Hayat, 2010).

Aunque hay distintos géneros de bacterias reconocidos por su capacidad de fijar N, se sabe que el rendimiento de las PGPR, no sólo depende de los genes que codifican para el complejo enzimático de nitrogenasa (Dixon y Kahn, 2004), sino también de otros factores como (i) la disponibilidad de determinados metales; (ii) de si la relación con la planta es endófita o de vida libre, (iii) el tipo de cultivo; si es en invernadero o en un cultivo abierto, pues presentan variación en la disponibilidad de N atmosférico, entre otros (Sánchez et al, 2006).

5. Solubilización de Fósforo (P) El fósforo (P) es uno de los principales macronutrientes para el crecimiento vegetal (Ahemad y Kibret, 2014) ya que está involucrado en el desarrollo de raíces, tallo, flores, formación de semillas, madurez del cultivo y resistencia a enfermedades (Khan et al., 2009). Se estima que las plantas requieren entre 10 y 30 kg. de fósforo por hectárea (Paredes-Mendoza y Espinosa-Victoria, 2010; Richardson y Simpson, 2011). En la naturaleza el P se encuentra en estado orgánico e inorgánico y es tomado por las plantas en dos formas solubles, monobásico (H2PO4) en suelos ácidos y como iones dibásicos (H2PO4-) en suelos básicos (Paredes-Mendoza y Espinosa-Victoria, 2010; Ahemad y Kibret, 2014). Sin embargo, la concentración de fósforo disponible para las plantas es muy baja, debido a que el fósforo soluble reacciona con iones como el calcio (en suelos alcalinos), el hierro o el aluminio (en suelos ácidos) que provocan la precipitación y retención de fósforo en el suelo entre el 75 y el 90% (Adesemoye y Kloepper, 2009; Khan et al., 2009).

El fósforo inorgánico se encuentra, en la naturaleza, en formas no solubles para las plantas, tales como fosfato tricálcico, fosfato dicálcico, hidroxiapatita y roca fosfórica en apatitas como la fluorapatita, las cloroapatita y las hidroxiapatita (Khan et al., 2009). La solubilización del fósforo se da mediante la disminución de pH y la

13

producción de ácidos orgánicos como el ácido glucónico, el ácido 2-cetoglucónico, el ácido glicólico, oxálico, malónico y ácido succínico (Adesemoye y Kloepper, 2009). Ciertas bacterias pueden producir estos ácidos, entre las cuales están las Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Agrobacterium, Microccocus, Flavobacterium y Erwinia (Rodríguez y Fraga, 1999; Peña y Reyes, 2007; Khan et al., 2009). Es importante destacar que la solubilización y la mineralización de fosfato pueden coexistir en la misma cepa bacteriana (Ahemad y Kibret, 2014) El fósforo orgánico constituye una proporción significativa del fósforo del suelo (entre el 30-50%), mayor que la de fósforo inorgánico (Adesemoye y Kloepper, 2009) y está conformado principalmente por fitatos, ácidos nucleicos, y fosfolípidos. El aumento de la disponibilidad de este fósforo orgánico se denomina mineralización (Adesemoye y Kloepper, 2009) y se da principalmente por la actividad de tres grupos de enzimas: las fosfatasas ácidas, fitasas y fosfatasas alcalinas que se encargan de catalizar la hidrólisis de los ésteres fosfóricos (Ahemad y Kibret, 2014). Estas fosfatasas pueden ser exudadas por la planta o por microorganismos del suelo (Paredes-Mendoza y Espinosa-Victoria, 2010) como Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus y Pseudomonas putida (Adesemoye y Kloepper, 2009).

Ha existido polémica en la selección de bacterias solubilizadores de fósforo con capacidad para promover el crecimiento vegetal ya que los experimentos realizados in vitro no pueden ser repetidos bajo condiciones de campo (Bashan, Camnev y de Bashan, 2013). Es muy frecuente que la mayoría de trabajos solo reporten aislamientos de bacterias solubilizadoras de fósforo con potencial para el uso biotecnológico agrícola (Mehta y Nautiyal, 2001; Puente et al., 2004; Pérez et al., 2007; Yang et al., 2012). Sin embargo, no se han realizado estudios en suelos ricos en hierro y ácidos, y deficientes en fósforo, a pesar del hecho de que casi el 80% de los suelos tropicales en Latinoamérica comparten estas características (Pérez et al., 2007).

Un elemento controversial es el uso de una fuente de fósforo insoluble para el aislamiento de microorganismos solubilizadores de fósforo (Bashan, Camnev y de Bashan, 2013). La mayoría de trabajos usan el fosfato de tricalcio [Ca3(PO4)2].

Este medio fue propuesto por Pikovskaya (1948); posteriormente, fue modificado por Nautiyal (1999); pero, el medio NBRIP sigue conteniendo fosfato de tricalcio como fuente de fósforo. Este medio es útil y apropiado para el aislamiento de bacterias solubilizadoras de fosfatos. Sin embargo, el fosfato de tricalcio es un medio fácilmente soluble, comparado con otros fosfatos difíciles de solubilizar (Bashan, Camnev y de Bashan, 2013). Los microorganismos solubilizadores de fosfatos son una alternativa biotecnológica en la agricultura sostenible para satisfacer las demandas de fósforo en las plantas (Saharan y Nehra, 2011), aunque son escasos los reportes de PGRP que promuevan el crecimiento por un aumento en la toma de fósforo en plantas bajo condiciones de campo.

14

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

6. ACC deaminasa, la Enzima para Evitar el Estrés Vegetativo La actividad de la enzima desaminasa del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) o ACC desaminasa es la promoción de crecimiento vegetal de las rizobacterias (Esquivel et al., 2013). Esta es una enzima multimérica con una masa molecular entre 35-42 KDa, que disminuye los efectos ambientales a los que se puede ver sometida una planta, tales como: ambientes áridos, salinos, contaminados con metales, inundaciones, presencia de patógenos, entre otros (Tabla 1). Las plantas, para hacer frente a estos tensores ambientales, activan sus mecanismos de defensa natural tales como la resistencia sistémica inducida, la cual actúa mediante la emisión de compuestos volátiles orgánicos como el ácido jasmónico, el ácido salicílico y el etileno (Siddikee et al., 2011; Esquivel et al., 2013). La enzima ACC desaminasa contribuye en la disminución de la concentración de etileno en la planta e incrementa los niveles de amonio en la rizósfera (Esquivel et al., 2013).

El etileno es una molécula con una actividad biológica importante en los procesos fisiológicos de las plantas como la germinación de semillas, desarrollo y elongación de la raíz, de las hojas y los frutos (Contesto et al., 2008). El etileno se localiza en cualquier tejido vegetal, se libera y se difunde entre los espacios intracelulares y extracelulares gracias a su naturaleza gaseosa (Glick, 2005; Arshad, Shaharoona y Mahmood, 2008; Esquivel et al., 2013). La síntesis de etileno se ve afectada por diversos factores como la temperatura, la luz, la gravedad, la nutrición, la presencia y concentración de otras hormonas de la planta y el someter a la planta a estrés biológico (Glick, 2014).

A bajas concentraciones de etileno se estimula la germinación y se rompe la latencia de las semillas; pero, si se incrementa la concentración del etileno por el estrés ambiental, se puede detener la elongación de la raíz; por lo tanto, la reducción de la absorción de nutrientes, la detención del crecimiento de flores, frutos, hojas y tallo, la disminución de la concentración de clorofila, la mayor peroxidación lipídica y el cierre de estomas que causan la muerte de la planta o un bajo rendimiento (Shahzada et al., 2013). Además, el aumento de la concentración de etileno inhibe la colonización de micorrizas y la nodulación por parte de Rhizobium sp. debido al daño oxidativo que se presenta (Barnawal et al., 2012; Esquivel et al., 2013; Barnawal et al., 2014), todas estas consecuencias pueden ser evitadas mediante la reducción de los niveles de etileno, garantizando la supervivencia en un ambiente adverso (Glick, 2014).

El etileno se deriva del aminoácido metionina, el cual se convierte en S-adenosinmetionina (SAM) gracias a la acción de la enzima sintetasa de SAM; luego se convierte en ácido ACC por la actividad de la ACC sintasa; después actúa la enzima ACC oxidasa que transforma el ACC en etileno (Ma et al., 2003). Para controlar y mantener los niveles de etileno internos y externos de la planta, es fundamental la actividad de la enzima ACC desaminasa, la cual cataliza la degradación del ACC precursor del etileno en α-cetobutirato y amoníaco (Arshad et al., 2008; Contesto et al.,

15

2008). Este mecanismo reduce significativamente la cantidad de etileno producido por las plantas tras estar expuesta a un tipo de estrés (Ma et al., 2003; Glick, 2005).

Las rizobacterias capaces de producir la enzima ACC desaminasa se emplean frecuentemente como inoculantes de plantas cultivadas en ambientes adversos, con el objetivo de mejorar su crecimiento (Esquivel et al., 2013, Tabla 1). Estas bacterias reducen los efectos del etileno y el estrés ambiental al hidrolizar la ACC, que es la precursora del etileno (Siddikee et al., 2011; Barnawal et al., 2012), y al promover el crecimiento de la raíz (Shahzada et al., 2013) y estimular la formación de raíces secundarias (Glick, 2005) que aumentan las concentraciones de nutrientes para vivir en ambientes adversos (Ma et al., 2003). La promoción de crecimiento vegetal es estimulada, entonces, no solo por un decremento en el contenido de etileno sino también por la generación de amonio producido a partir del ACC por las rizobacterias que posean la enzima ACC deaminasa (Glick, 2005; Esquivel et al., 2013).

Tabla 1. Mitigación de diferentes tensores ambientales por bacterias productoras de ACC deaminasa.

Planta

Tipo de estrés

Bacterias utilizadas

% crecimiento frente al control

Capsicum annuum (pimiento rojo)

Estrés salino

Brevibacterium iodinum Bacillus licheniformis Zhiheng livela alba

44% 53% 57%

Pisum sativum (arveja)

Estrés hídrico

Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens

62% 40%

Pisum sativum (arveja)

Estrés salino

Arthrobacter protophormia

60%

Zea mays (maíz)

Fertilizantes y condición axénicas

Pseudomonas thivervalensis Serratia marcescens

75% 100%

Ocimum sanctum (albahaca morada)

Saturación de agua

Xylosoxidans achromobacter Serratia ureilytica Herbaspirillum seropedicae Ochrobactrum rhizosphaerae

Fuente: Glick, 2005 y Esquivel et al., 2013.

16

60%

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

7. Sideróforos El transporte de elementos como metales es vital en procesos de supervivencia de los organismos. La importancia del hierro (Fe+2) radica en su función como transportador de oxígeno y como elemento constitutivo de reacciones de transferencia de electrones. Adicionalmente, el hierro desempeña un rol importante en procesos de metabolismo celular, siendo cofactor de varias vías metabólicas, su estrecha relación con la síntesis de DNA, y en procesos de eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS por sus siglas en inglés) mediante la reacción de Fenton (Dertz y Raymond, 2004).

El hierro es un elemento de poca solubilidad en ambientes acuosos y existe la dificultad biológica de obtener la versión reducida de este, puesto que no se encuentra en el ambiente como ion Fe+3. Una estrategia para adquirir e incorporar el hierro es el uso de sideróforos (del griego “transportador de hierro”). Los sideróforos son compuestos de bajo peso molecular (500-1000 Da) producidos por bacterias, hongos y plantas para quelar el hierro del ambiente y tomarlo por el organismo (Neilands, 1995; Renshaw et al., 2002).

7.1 Tipos de sideróforos En general, los sideróforos se agrupan de acuerdo con las fracciones o motivos de la molécula que permiten una coordinación que une el oxígeno con el hierro (III); estas moléculas, generalmente, son: catecolatos, hidroxamatos o grupos αhidroxicarboxilato (Dertz y Raymond, 2004). i. Sideróforos de tipo Catecolatos Estos sideróforos generan un complejo férrico altamente estable, cargado negativamente; los catecoles generan Pkas altos (6 a 11 en catecoles con estructuras complejas, y cerca de 13 para el catecol en estado libre). Los principales catecolatos son la enteobactina (producida por bacterias entéricas y Streptomyces) y la vibriobactina (Vibrio cholerae). La enterobactina es un compuesto hexadentado generado principalmente por bacterias Gram negativas, presente también en Gram positivas como Streptomyces, relacionados con procesos de crecimiento bacteriano (Dertz y Raymond, 2004; Raines et al., 2015). ii. Sideróforos de tipo Hidroxamatos Los hidroxamatos son ampliamente sintetizados por bacterias y hongos; con Pkas cercanos a 8 o 9. Algunos de estos se han probado en actividades inmunosupresoras, quelantes de otros metales, incluso, metales radiactivos como plutonio, y como factor terapéutico de varias enfermedades (Dertz y Raymond, 2004; Raines et al., 2015).

17

iii. Sideróforos de tipo Carboxilatos Los carboxilatos poseen Pkas muy bajos ente 3,5 y 5. Estos sideróforos están restringidos a ambientes ácidos, lo que limita su espectro de acción. También los α-hidroxicarboxilatos, son comunes en bacterias marinas, en donde los complejos poseen naturaleza fotoactiva, permitiendo que la carga de luz medie la unión al ligando, liberando el hierro (II) y CO2 (Miethke y Marahiel, 2007; Raines et al., 2015). Otros tipos de sideróforos combinan estos tres tipos de motivos, en cadenas ramificadas, ya sea sola, unidas por enlaces alternos, de tipo lineal, cíclico o ambos.

El rango de acción depende del pH del ambiente, el tipo de agente quelante, y la disponibilidad de hierro (Varma y Chincholkar, 2007) Algunos sideróforos, como las marinobactinas, son de tipo antipáticos, donde la longitud entre las colas hidrofóbicas y el grupo hidrofílico varían. Esto permite evitar la difusión fácil del hierro en las bacterias dentro de la colonia. En Pseudomonas aeruginosa existen mecanismos moleculares relacionados con la escisión de estas colas y la formación de precursores de sideróforos, vital en procesos como regulación de quórum sensing o procesos de colonización (Miethke y Marahiel, 2007; Raines et al., 2015). Por ejemplo, solo ante la presencia de sideróforos tipo acil-desferrioxamina producidos por E. coli fue posible cultivar bacterias como Micrococcus luteus y Maribacter polysiphoniae, lo que muestra la importancia de los sideróforos en relaciones de comunicación bacteriana (D’Onofrio et al., 2010). iv. Biosíntesis de los sideróforos Los sideróforos pueden ser sintetizados principalmente por dos vías, dependientes y no dependientes de un complejo enzimático denominado sintetasas de péptidos no ribosomales (NRPS). Este complejo multienzimático es el encargado de sintetizar un amplio rango de sideróforos como aminos, carboxilatos, e hidroxilatos. Los catecoles, son sintetizados por este mecanismo dependiente de NRPS (Miethke y Marahiel, 2007; Raines et al., 2015).

Los complejos NRPS son encargados de generar sideróforos que están involucrados en varias enfermedades patógenas, como la enterobactina, presente en E. coli, Salmonella entérica, Klebsiella spp., y Shigella spp. Otros como yersiniabactina, vibriobactina y micobactina, producidas por Yersinia spp., Vibrio cholerae y Mycobacterium tuberculosis, respectivamente (Miethke y Marahiel, 2007). Los mecanismos independientes de NRPS son considerados responsables de la síntesis de hidroxamatos y carboxilatos. Generalmente, los sideróforos sintetizados en esta vía son vistos como factores de virulencia en varios microorganismos patógenos, como la aerobactina de bacterias entéricas, staphilobactina, o petrobactina (antracina) (Miethke y Marahiel, 2007).

18

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

7.2 Aplicaciones y utilidad de los sideróforos Son crecientes los estudios que comprometen los sideróforos con estrategias en el tratamiento de enfermedades humanas como la talasemia, anemias y afecciones relacionadas con la falta de hierro en el componente sanguíneo (Ferreras et al., 2005, Mossialos y Amoutzia, 2009). Estas enfermedades son tratadas mediante la fabricación sintética de compuestos con acción similar a sideróforos, o el implante de sideróforos, con el fin de remediar la obtención de hierro en el organismo (Raines et al., 2015), la generación de conjugados, compuestos antibióticos y moléculas que mimeticen la acción de los sideróforos (Miethke y Marahiel, 2007; Varma, y Chincholkar, 2007; Raines et al., 2015).

Se ha reportado que el Bacillus anthracis presenta una infección sistémica temprana, relacionada con la obtención de hierro y la producción de sideróforos como antrabactina y antracelina (Cendrowski, MacArthur y Hanna, 2004). En ensayos con mutantes para estos dos sideroforos, y sus respectivos cultivos en medios cargados de hierro, mostraron que existe una disminución e incluso la inhibición en el crecimiento bacteriano debido a la falta de sideróforos (en este caso antracelina), debido a que estos son cruciales en el crecimiento, colonización y virulencia en células de ratón (Cendrowski, MacArthur y Hanna, 2004).

Muchas plantas sufren de deficiencias de hierro, lo que perjudica su crecimiento y buen desarrollo, siendo este punto crucial en la producción alimenticia de muchas frutas, hortalizas y cereales. En gramíneas, la deficiencia de hierro genera clorosis y baja calidad del grano (Varma, y Chincholkar, 2007).

Yehuda y colaboradores (1996) reportaron la excelente calidad y rendimiento que tienen los sideróforos bacterianos en comparación con los fitosideróforos; por lo que asumen que debe haber una especie de consorcio, en este caso, de la Ferizoferrina de Rhizopus arrhizus, como un mecanismo indirecto en la obtención de hierro en la rizósfera. En consecuencia, se ha intentado la aplicación de microorganismos sideroforogénicos para el establecimiento de mejores tasas de crecimiento y obtención de hierro por parte de las plantas.

Por ejemplo, las Pseudomonas son capaces de promover el crecimiento, por este mecanismo, en plantas de maíz, maní y papa (Varma y Chincholkar, 2007).

Igualmente, hongos como Proteus y Penicillium promueven el crecimiento en plantas como maíz, pepino y frijol (Varma y Chincholkar, 2007). Por otra parte, las plantas son afectadas por fitopatógenos bacterianos y fúngicos, productores de sideróforos como Erwinia chrysanthemi y Verticullium dahlia respectivamente (Varma y Chincholkar, 2007). También, se ha reportado que plantas de Arabidopsis thaliana tratadas con el sideróforo deferrioxamina (DFO) activa la inmunidad vegetal relacionada a metales y esta inducción protege a la planta de una posible infección bacteriana (Aznar et al., 2014).

19

8. Quórum Sensing en PGPR Las bacterias han desarrollado mecanismos sofisticados para coordinar la expresión de genes en diferentes niveles poblacionales (Fuqua et al., 1994). Por muchos años, se creyó que las bacterias funcionaban de manera individual con la única finalidad de obtener nutrientes para asegurar su supervivencia y reproducción (Flores et al., 2011). Ahora se sabe que las bacterias se comunican para llevar a cabo procesos fundamentales, utilizando un lenguaje químico, basado en la percepción de moléculas difusibles que son sintetizadas por las poblaciones y las comunidades bacterianas, que regulan la transcripción de genes cuando la población alcanza una alta densidad (Fuqua et al., 1994; Greenberg, 2003; Zhu y Sun, 2008). Esta vía de regulación es denominada Quórum Sensing (QS) e involucra cambios a nivel morfológico y/o fisiológico en la población, lo que permite coordinar actividades grupales (Brango, 2011). De este modo, el QS asegura que un número suficiente de bacterias se organicen para actuar como un organismo multicelular (Ortiz, Campos y López, 2012). Así, las bacterias resultan ser organismos interactivos que poseen un avanzado y diverso repertorio de moléculas que utilizan en la comunicación entre diferentes o la misma especie, incluso con organismos como mamíferos y plantas (Mathesius et al., 2003).

Dentro de las PGPR más estudiadas con actividad QS se encuentran: Burkholderia cepacia, Pseudomonas chlororaphis, P. fluorescens, Rhizobium elti, R. leguminosarum, Sinorhizobium meliloti; patógenos de plantas como: Agrobacterium rhizogenes, A. tumefaciens, Erwinia carotovora, E. chrysanthemi, E. stewartii, Pseudomonas syringae; saprófitos como: Chromobacterium violaceum, Nitrosomonas europaea, Pseudomonas corrugata y P. putida (Sharma, Sahgal y Johri, 2003).

En el proceso de QS se han descrito diversas moléculas que actúan como autoinductores que coordinan procesos fisiológicos como: bioluminiscencia, formación de biopelículas, motilidad, transferencia de plásmidos conjugativos, inducción de esporulación, producción de exopolisacáridos, producción de factores de virulencia, pigmentación y producción de metabolitos secundarios (Dunny y Winans, 1999; Whitehead et al., 2001; Waters y Bassler, 2005; Keller y Surette, 2006; Johansson et al., 2008; Marquina y Santos, 2011).

Las moléculas de señalización se clasifican en dos categorías: (i) los aminoácidos y las feromonas de péptidos cortos, comúnmente utilizados por las bacterias Gram positivas (Kleerebezem et al., 1997; Lazazzera y Grossman, 1998), y (ii) los derivados de ácidos grasos tales como las acilo homoserinlactonas (AHLs), utilizados por las bacterias Gram negativas (Fuqua y Greenberg, 1998; Greenberg, 2000; Fuqua, Parsek y Greenberg, 2001; Whitehead et al., 2001). La síntesis de AHLs depende de sintasas que pertenecen, generalmente, a dos clases: los homólogos LuxI y los homólogos AINS (Fuqua y Greenberg, 2002). La percepción de la señal se basa en un sensor de proteína, homólogo de LuxR, que también es el regulador transcripcional de genes asociados a respuestas de QS (Fuqua y Greenberg, 1998).

Las funciones reguladas por las AHLs son cruciales en la interacción planta-bacterias (Boyer et al., 2008; Barreto, 2011). Se ha reportado que el efecto de las AHLs sobre plantas de Medicago trunculata provocó cambios en la expresión de proteínas

20

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

asociadas a mecanismos de defensa de la planta, respuesta al estrés, proteínas de degradación, síntesis de flavonoides, síntesis de fitohormonas, entre otras (Mathesius et al., 2003). De igual forma, la exposición de AHLs en plantas puede incrementar la transpiración y conductancia estomática (Joseph y Phillips, 2003) y la resistencia sistémica a algunos microorganismos patógenos (Schuhegger et al., 2006).

Una alta proporción de bacterias productoras de AHLs se han encontrado en la rizósfera (Newton y Fray, 2004; Boyer et al, 2008). La producción de AHLs puede influir sobre mecanismos de promoción de crecimiento vegetal como la producción de compuestos antifungales, competencia por hierro (Haas, Keel y Reimmann, 2002; Zhou et al., 2003), formación de biopelículas, la producción de enzimas hidrolíticas (Loh et al., 2002) y la producción de elicitores que inducen resistencia sistémica en plantas (Ryu, Lee y Lee, 2013). Sin embargo, es escasa la información del efecto de las AHLs en procesos como la solubilización de fosfato, la fijación de nitrógeno, producción de vitaminas e inhibición de la síntesis de etileno en plantas (Boyer et al., 2008). Se ha reportado que la actividad pectinasa, producción de sideróforos, síntesis de ácido indolacético no fue afectada por la interrupción de la producción de AHLs por Azospirillum lipoferum B510, lo mismo para Vibrio 6HC en la producción de AIA (Galindo, 2008). Según los autores estas conclusiones no pueden ser generalizadas para otras cepas de la misma especie bacteriana ya que son específicas para cada cepa, lo que sugiere la continuación de estudios que aporten en esta área de investigación.

Se ha demostrado que las AHLs pueden ser degradadas por otras bacterias o células de plantas y animales, siendo esta la ruta de acceso a innovadoras estrategias de biocontrol (Faure y Dessaux, 2007). La capacidad de degradación de estas moléculas señal se denomina Quórum Quenching (QQ) (Dong y Zhang, 2005; Rasmussen y Givskov, 2006). El QQ es una estrategia de antivirulencia ya que afecta la expresión de las funciones de virulencia y no afecta la viabilidad del patógeno (Faure y Dessaux, 2007). Por ejemplo, se ha reportado que el Bacillus con actividad lactonasa es capaz de degradar las moléculas AHLs (Dong et al., 2000). Similares resultados se han reportado para una cepa de Ralstonia sp. de una población con biopelícula compleja (Lin et al., 2003). Sin embargo, existe limitada información del uso de estos aislamientos con actividad QQ para el control en campo de cepas patógenas de importancia agrícola. Por ejemplo, Acinetobacter sp. con actividad degradadora de AHLs fue capaz de atenuar los síntomas de podredumbre blanda causadas por Pectobacterium carotovorum en ensayos con tubérculos de papa (Kang et al., 2004).

Se ha reportado que exudados de plantas que imitan moléculas señales como AHLs pueden regular las conductas de algunos aislamientos, mientras que inhiben tales conductas en las demás (Teplitski, Robinson y Bauer, 2000; Degrassi et al., 2007). La naturaleza química de estos compuestos es actualmente desconocida.

Los compuestos de señal mímica AHLs podrían llegar a ser importantes para determinar el resultado de las interacciones entre plantas superiores y una diversidad de bacterias patógenas, simbióticas y saprófitas (Teplitski, Robinson y Bauer, 2000).

21

9. Poli-inóculos La actividad de PGPR se ha incrementado mediante el desarrollo de co-inoculaciones y poli-inóculos o inoculantes mixtos a partir de la combinación de mecanismos de acción de diferentes PGPR como la fijación de nitrógeno, la solubilización de fósforo y/o reguladores de crecimiento (Holguin y Bashan, 1996; de Freitas, 2000; Alam et al., 2001; Nandakumar et al., 2001; Rojas et al., 2001; Nguyen et al, 2003; Raja et al., 2006; Cong y Dung, 2008; Govindarajan et al., 2008; Cong et al., 2009). Estas mezclas son una combinación de microorganismos que interactúan sinérgicamente para potencializar la promoción de crecimiento en plantas inoculadas (Bashan, Holguin, y de-Bashan, 2004). Diferentes ensayos de mezclas bacterianas han sido reportados y fueron recapitulados en la Tabla 2.

Los poli-inóculos son capaces de reaccionar flexiblemente a cambios ecológicos usando eficientemente los flujos de energía y sustratos disponibles, en comparación con los cultivos puros (Zlotnikov et al., 2001). Igualmente, los poli-inóculos pueden incrementar la concentración de azucares y aminoácidos exudados por la planta y, por ende, estimular la fijación de N y la producción de reguladores de crecimiento (Raja et al., 2006). Sin embargo, no todas las mezclas bacterianas promueven el crecimiento vegetal (Molla et al., 2001; Oliveira et al., 2002; Roesti et al., 2006; Felici et al., 2008); por lo que la selección de cepas constituye un paso crítico para el desarrollo de poli-inóculos bacterianos (Holguin y Bashan, 1996; Villicaña, 2007; Felici et al., 2008).

Govindarajan e investigadores (2007) compararon la actividad individual de diferentes diazótrofos y la mezcla de todas las cepas en cultivos arroz. Determinaron que, en términos globales, los tratamientos con mayores rendimientos fueron las mezclas bacterianas, seguido de la actividad individual de K. pneumoniae, A. lipoferum, G. diazotrophicus, B. vietnamiensis y H. seropedicae. Al modificar este consorcio agregando B. vietnamiensis MGK3 a cambio de K. pneumoniae, se observó que la biomasa radicular y aérea alcanzó un aumento de 83,0 y 38,4%, respectivamente, a los 60 días de la inoculación; lo que indica que este consorcio tiene un efecto temprano en la planta. También evaluaron la mezcla entre Klebsiella pneumoniae y G. diazotrophicus en cultivos de caña de azúcar a diferentes niveles de nitrógeno. Determinaron que K. pneumoniae, con una fertilización del 50% de nitrógeno, produjo un aumento en la biomasa del 1,96% con respecto al control negativo donde se utilizó un 100% de nitrógeno recomendado. La cepa G. diazotrophicus produjo un incremento en la biomasa de 0,8%; mientras que en consorcio, estas dos bacterias solo alcanzaron el 0,5%. Esto se debe a la competencia generada por entre las dos cepas por colonizar la planta; es por esto que el consorcio entre K. pneumoniae y G. diazotrophicus no fue efectivo, aunque la acción individual de las cepas fue eficaz.

22

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

Tabla 2. Efecto de mezclas bacterianas sobre la promoción de crecimiento en especies vegetales de interés comercial.

Cultivo vegetal

Consorcio bacteriano

Ensayos Mecanismo inoculación de acción

G. diazotrophicus LMG 7603 H. seropedicae A. lipoferum Invernadero y LMG 4348 campo B. vietnamiensis LMG10929 B. vietnamiensis MGK3

Fijación de N

Arroz G. diazotrophicus A. lipoferum H. seropedicae Invernadero y B. vietnamiensis campo Klebsiella pneumoniae (KPY17657)

Caña de azúcar

Lechuga (Lactuca sativa)

G. diazotrophicus Klebsiella Invernadero y pneumoniae campo (KPY17657)

Serratia sp.

Achromobacter sp.

F. oxysporum MSA 35

In vitro

Fijación de N

Fijación de N

AIA Solubilización de fosfatos

Efecto del consorcio sobre el crecimiento vegetal con respecto al control Característica

Control

Consorcio

Biomasa aérea*

33.6 cm**

38.4%

Biomasa radical*

0.74 g/ planta**

83.0%

Peso de 1000 granos

18.07 g

14.4%

Peso de 1000 granos

19.3 g

15.5%

Panículas por planta

6.34

63.9%

Rendimiento del grano

66.10 g/ maceta

12.4%

Granos por plata

482.56

62.6%

Biomasa en condiciones de 50% de N

3105 g/ planta (100% de N)

0.5%

Longitud de la raíz

9.0 mm

(95.6%)

Longitud de brotes

5.0 mm

(75.0%)

Peso fresco

9.0 mg

(85.8%)

Rizobium cepa 33 Rizobium cepa 45

32.3% Invernadero

AIA

Rizobium consorcio 33-45 * Resultados a los 60 días de inoculación. ** Promedio tomado de las mediciones de las seis especies del estudio.

Peso seco

37.1 mg/ plántula

-5.6% 18.4%

23

A modo de conclusión, las bacterias promotoras de crecimiento presentan diferentes mecanismos de acción, como la fijación de nitrógeno, la solubilización de nutrientes como el fósforo, la producción de reguladores como las auxinas, la producción de sideróforos y la producción de ACC deaminasas. No obstante, la aplicación de PGPR es una práctica muy limitada que necesita integrar mayor número de estudios de campo para transferir esta tecnología a diferentes cultivos de interés comercial. El aislamiento de estas bacterias es el primer caso para la comercialización de estos productos. Es necesario determinar las condiciones para que se dé la promoción de crecimiento, la fermentación en masa, la formulación del producto, la toxicidad del mismo y garantizar un control de calidad que permita extender la aplicación de las PGPR. Nuevas estrategias para aumentar la actividad de las PGPR se han planteado; como ejemplo está el uso de mecanismos de acción como las ACC deaminasas, el desarrollo de poli-inóculos y la comprensión de las interacciones planta-bacteria mediante sistemas de comunicación molecular como el QS.

Bibliog raf ía Adesemoye, A. O., y Kloepper, J. W. (2009). Plant–microbes interactions in enhanced fertilizer-use efficiency. Applied Microbiology and Biotechnology, 85(1), 1-12. Doi: 10.1007/s00253-009-2196-0.

Ahemad, M., y Kibret, M. (2014). Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: Current perspective. Journal of King Saud University-Science, 26(1), 1-20. Doi: 10.1016/j.jksus.2013.05.001.

Alam, M. S., Cui, Z. J., Yamagishi, T., y Ishii, R. (2001). Grain yield and related physiological characteristics of rice plants (Oryza sativa L.) inoculated with free-living Rrhizobacteria.

Plant Production Science, 4(2), 126-130. Doi: 10.162/pps.4.126.

Arshad, M., Shaharoona, B., y Mahmood, T. (2008). Inoculation with Pseudomonas spp. Containing ACC-deaminase partially eliminates the effects of drought stress on growth, yield, and ripening of pea (Pisum sativum L.). Pedosphere, 18, 611-620. Doi: 10.1016/ S1002-0160(08)60055-7.

Azcon-Bieto J., y M. Talon. (2000). Fundamentos de fisiología vegetal. Primera edición, McGraw-Hill, Madrid, España, 514.

Aznar, A., Chen, N. W., Rigault, M., Riache, N., Joseph, D., Desmaële, D. y Dellagi, A. (2014). Scavenging iron: a novel mechanism of plant immunity activation by microbial siderophores. Plant physiology, 164(4), 2167-2183. Doi: 10.1104/pp.113.233585.

Baba, M. H., Hussain, S. S., Kumar, A., y Misger, F. A., (2010). Influence of nitrogen levels and bio-fertilizers on uptake, use efficiency and build up of nitrogen under rice crop.

Research Journal of Agricultural Sciences, 1(4), 375-379.

Bach, A. T., y Díaz, M. (2008). Las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) en la agricultura. Revista Agricultura Orgánica, (3), 35-38.

Barea, J. M., Pozo, M. J., Azcon, R., y Azcon-Aguilar, C. (2005). Microbial co-operation in the rhizosphere. Journal of Experimental Botany, 56 (417), 1761-1778. Doi: 10.1093/ jxb/eri197.

24

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

Barnawal, D., Bharti, N., Maji, D., Chanotiya, C. S., y Kalra, A. (2012).

1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase-containing rhizobacteria protect Ocimum sanctum plants during waterlogging stress via reduced ethylene generation.

Plant Physiology and Biochemistry, 58, 227-235. Doi: 10.1016/j.plaphy.2012.07.008.

Barnawal, D., Bharti, N., Maji, D., Chanotiya, C. S., y Kalra, A. (2014). ACC deaminase-containing Arthrobacter protophormiae induces NaCl stress tolerance through reduced ACC oxidase activity and ethylene production resulting in improved nodulation and mycorrhization in Pisum sativum. Journal of Plant Physiology, 171(11), 884-894.

Barreto, A. C. (2011). Quorum Sensing: bacterial communication systems. Ciencia actual, 1(1), 46-55.

Bashan, Y. (1998). Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture.

Biotechnology Advances, 16 (4), 729-770.

Bashan, Y. y Holguin, G. (1998). Proposal for the division of plant growth-promoting rhizobacteria into two classification: biocontrol-PGPB (plant growth-promoting bacteria) and PGPB. Soil Biol. Biochem, 30 (8/9), 1225–1228.

Bashan, Y., Holguin, G., y De-Bashan, L. E. (2004). Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003).

Canadian Journal of Microbiology, 50 (8), 521-577. Doi: 10.1139/w04-035.

Bashan, Y., Kamnev, A. A., y de-Bashan, L. E. (2013). Tricalcium phosphate is inappropriate as a universal selection factor for isolating and testing phosphate-solubilizing bacteria that enhance plant growth: a proposal for an alternative procedure. Biology and Fertility of Soils, 49 (4), 465-479.

Bécquer, C. J., Salas, B., Archambault, D., Slaski, J., y Anyia, A. (2008). Selección de rizobios adaptados a ecosistemas ganaderos de Alberta, Canadá, inoculados en maíz (Zea mays, L.). Fase I: invernadero. Pastos y Forrajes, 31 (4). Recuperado de: http://www.redalyc. org/articulo.oa?id=269120945006.

Bhattacharjee, R. B., Singh, A. y Mukhopadhyay, S. N. (2008). Use of nitrogen-fixing bacteria as biofertiliser for non-legumes: prospects and challenges. Applied Microbiology and Biotechnology, 80, 199-209. Doi: 10.1007/s00253-008-1567-2 Bhattacharyya, P. N., y Jha, D. K. (2012). Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 28, 13271350. DOI: 10.1007/s11274-011-0979-9.

Boyer, M., Bally, R, Perrotto S, Chaintreuil C, Wisniewski-Dyé F. (2008). A quorum-quenching approach to identify quorum-sensing-regulated functions in Azospirillum lipoferum. Research in Microbiology, 159 (9/10), 699-708. DOI: 10.1016/j. resmic.2008.08.003.

Brango, J. F. (2011). Búsqueda de Compuestos Inhibidores de Quorum Sensing (IQS) a Partir de Extractos de Origen Natural (tesis de maestría). Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Bogotá, Colombia. Çakmakçi, R., Dönmez F., Aydin A., y Şahin, F. (2006). Growth promotion of plants by plant growth-promoting rhizobacteria under greenhouse and two different field soil conditions. Soil Biology and Biochemistry, 38 (6), 1482-1487. DOI: 10.1016/j. soilbio.2005.09.019.

Caro, D. M. C., Rubiano, M. F. G., Fandiño, B. A. R., y Buitrago, R. R. B. (2014).

Inoculación con Azospirillum spp y Enterobacter aglomerans en Pasto Guinea (Panicum

25

maximum Jacq.) en el Departamento de Cesar (Colombia). Revista Facultad Nacional de Agronomía Medellín, 67 (2), 7271-7280. DOI: 10.15446/rfnam.v67n2.44168 .

Cecil, F. (2004). Incidencia de Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal, como una posible estrategia adaptativa utilizada por la vegetación representativa del ecosistema de alta montaña “El Granizo”, municipio de la Calera, departamento de Cundinamarca (tesis de maestría). Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Bogotá. Colombia.

Cendrowski, S., MacArthur, W., y Hanna, P. (2004). Bacillus anthracis requires siderophore biosynthesis for growth in macrophages and mouse virulence. Molecular microbiology, 51(2), 407-417. DOI: 10.1046/j.1365-2958.2003.03861.x.

Choudhury, A., Kennedy, I.R. (2004). Prospects and potentials for systems of biological nitrogen fixation in sustainable rice production. Biology and Fertility of Soils, 39, 219-227.

DOI: 10.1007/s00374-003-0706-2.

Cong, P. T., Dung, T. D., Hien, T. M., Hien, N. T., Choudhury, A. T., Kecskés, M. L., y Kennedy, I. R. (2009). Inoculant plant growth-promoting microorganisms enhance utilisation of urea-N and grain yield of paddy rice in southern Vietnam. European Journal of Soil Biology, 45 (1), 52-61. DOI: 10.1016/j.ejsobi.2008.06.006.

Cong, P. T., y Dung, T. D. (2008). Interaction effects of BioGro with nitrogen and phosphorus on grain yield and nutrient uptake of rice in light-textured soils of southern Vietnam.

In Kennedy, I. R., choudhury, A. T., Kecskés, M. L., Rose, M. T. (Eds.). Efficient Nutrient Use in Rice Production in Vietnam Achieved Using Inoculant Biofertilisers, ACIAR Proceedings.

Hanoi, 24 - 28.

Contesto, C., Desbrosses, G., Lefoulon, C., Béna, G., Borel, F., Galland, M., Gamet, L., Varoquaux, F. y Touraine, B. (2008). Effects of rhizobacterial ACC deaminase activity on Arabidopsis indicate that ethylene mediates local root responses to plant growth-promoting rhizobacteria. Plant Science, 175 (1/2), 178-189. DOI: 10.1016/j.plantsci.2008.01.020.

Contreras, A. R., Dorantes, A. M. R., Villafán, S. M., Jiménez, S. P., Tovar, A. R., y Zúñiga, L. A. G. (2010). Evaluación de la promoción del crecimiento de Cynodon dactylon L. por rizobacterias productoras de fitohormonas aisladas de un suelo contaminado con hidrocarburos derivados del petróleo. Polibotánica, (29), 131-147.

Criollo, P. J., Obando, M., Sánchez, M., y Bonilla, R. (2012). Effect of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) associated to Pennisetum clandestinum in the altiplano Cundiboyacense. Corpoica Ciencia y Tecnología Agropecuaria, 13(2), 189-195.

Cubillos, J. R., Castellanos, D. E., y Argüello, H. (2009). Selección de microorganismos promotores de crecimiento vegetal (ácido indol acético) a partir de muestras de suelo rizosféerico, como primera etapa en el desarrollo de un biofertilizante. Revista Brasileira de Agroecología, 4 (2), 1720 - 1723.

De Freitas, J.R. (2000). Yield and N assimilation of winter wheat (Triticum aestivum L., var. Norstar) inoculated with rhizobacteria. Pedobiologia, 44 (2), 97-104. DOI: 10.1078/ S0031-4056(04)70031-1.

Degrassi, G., Devescovi, G., Solis, R., Steindler, L., y Venturi, V. (2007). Oryza sativa rice plants contain molecules that activate different quorum-sensing N-acyl homoserine lactone biosensors and are sensitive to the specific AiiA lactonase. FEMS Microbiology Letters, 269 (2), 213-220. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2006.00624.x.

Dertz, E. A., y Raymond, K. N. (2004). Siderophores and transferrins. ChemInform, 35 (49), 141-168.

26

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

Díaz-Zorita, M., y Fernández-Canigia, M. V. (2009). Field performance of a liquid formulation of Azospirillum brasilense on dryland wheat productivity. European Journal of Soil Biology, 45 (1), 3-11. DOI: 10.1016/j.ejsobi.2008.07.001.

Dixon, R., Kahn, D. (2004). Genetic regulation of biological nitrogen fixation. Nature Reviews Microbiology, (2), 621-631. DOI: 10.1038/nrmicro954.

Dong, Y. H., Xu, 1. L., Li, X. Z., y Zhang, L. H. (2000). AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone Quórum-Sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 97 (7), 3526-3531. DOI: 10.1073/pnas.97.7.352 6.

Dong, Y. H., y Zhang, L. H. (2005). Quórum Sensing and Quórum-quenching enzymes.

Journal of Microbiology, 43, , 101-109.

D’Onofrio, A., Crawford, J. M., Stewart, E. J., Witt, K., Gavrish, E., Epstein, S., Clardy, J. y Lewis, K. (2010). Siderophores from neighboring organisms promote the growth of uncultured bacteria. Chemistry and Biology, 17(3), 254-264. DOI: 10.1016/j. chembiol.2010.02.010.

Dunny, G. M., y Winans, S. C. (1999). Bacterial life: neither lonely nor boring. In: G. M. Dunny and S. C. Winans (ed.), Cell-cell signaling in bacteria. ASM Press, Washington, D.C, 1-5.

El-Tarabily K. A., y Sivasithamparam K. (2006). Non-streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters.

Soil Biology and Biochemistry, 38 (7), 1505-1520. DOI: 10.1016/j.soilbio.2005.12.017.

Esquivel- Cote, R., Gavilanes-Ruiz, M., Cruz- Ortega, R. y Huante, P. (2013).

Importancia agrobiotecnológica de la enzima ACC Desaminasa en Rizobacterias, una revisión. Revista Fitotecnica Mexicana, 36 (3), 251-258.

Fages J. (1994). Azospirillum inoculants and field experiments. In: Y. Okon (Ed.) Azospirillum/Plant Associations. (cap. 6, pp. , 6, 87-109), Florida, United States: CRC Press Inc. Faure, D. y Dessaux, Y. Denis F. y Yves D. (2007). Quórum Sensing as a target for developing control strategies for the plant pathogen Pectobacterium. European Journal of Plant Pathology, 119,: 353-365. DOI: 10.1007/s10658-007-9149-1.

Felici, C., Vettori, L., Giraldi, E., Forino, L. M. C., Toffanin, A., Tagliasacchi, A. M. y Nuti, M. (2008). Single and co-inoculation of Bacillus subtilis and Azospirillum brasilense on Lycopersicum esculentum: eEffects on plant growth and rhizosphere microbial community. Applied Soil Ecology, 40 (2), 260-270. DOI: 10.1016/j. apsoil.2008.05.002.

Ferreras, J. A., Ryu, J. S., Di Lello, F., Tan, D. S., y Quadri, L. E. (2005). Small-molecule inhibition of siderophore biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis and Yersinia pestis.

Nature chemical biology, 1(1), 29-32. DOI: 10.1038/nchembio706.

Flores Encarnacióna, M., Aguilar Gutiérrez, G. R., Cabrera-Maldonado, C., GuzmánFlores, J. E., y Flores-Encarnación, M. D. S. (2011). El impacto biológico de los autoinductores bacterianos. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología, 31(02), 104-111.

Fuentes Ramirez, L. E., y Caballero Mellado, J. (2006). Bacterial biofertilizers.

IEn: Siddiqui, Z. A. (Ed.), PGPR: Biocontrol and biofertilization. (cap. 5, pp. 143-172), Netherlands: Springer Netherlands, 143-172.

Fuqua, C., Parsek, M. R., y Greenberg, E. P. (2001). Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: Acyl-homoserine lactone Quórum Sensing. Annual Review of Genetics, 35, 439-468. DOI: 10.1146/annurev.genet.35.102401.090913

27

Fuqua, C., y Greenberg, E. P. (1998). Self perception in bacteria: Quórum Sensing with acylated homoserine lac- tones. Current Opinion in Microbiology, 1(1), 183-189. DOI: 10.1016/S1369-5274(98)80009-X Fuqua, C., y Greenberg, E. P. (2002). Listening in on bacteria: Acyl-homoserine lactone signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 3, 685-695. DOI: 10.1038/nrm907 Fuqua, W. C., Winans, S. C., y Greenberg, E. P. (1994). Quórum Sensing in bacteria: The LuxR/LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. Journal of Bacteriology, 176(2), 269-275.

Galindo, T. (2008). Dinámica de la producción de ácido indolacético de rizobacterias asociadas a las plantas de mangle Laguncularia racemosa, Avicennia germinans y Rhizophora mangle y su relación con moléculas señal tipo n-acil homoserin lactonas (tesis de maestría interfacultades). Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias e Instituto de Biotecnología, Bogotá.

Gamalero, E., and y Glick, B. R. (2011). Mechanisms used by plant growth-promoting bacteria. In: Maheshwari, D. K. (Ed.), Bacteria in Agrobiology: Plant Nutrient Management (cap. 2, pp.pp. 17-46). Heidelberg, Berlin: Springer Berlin Heidelberg.

Gaudin, V., Vrain, T., y Jouanin, L. (1994). Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry, 32 (1), 11-29.

Glick, B. R. (2005). Modulation of plant ethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase. FEMS Microbiology Letters, 251 (1), 1-7. DOI: 10.1016/j.femsle.2005.07.030 Glick, B. R. (2014). Bacteria with ACC deaminase can promote plant growth and help to feed the world. Microbiological Research, 169, 30-39.

Gómez, L. C., Valero, N., y Morales, E. (2012). Halotolerant alkalophilic and indolacetic acid producing bacteria associated with Arthrospira platensis (Cyanophyceae). Revista Colombiana de Biotecnología, 14 (2), 81-88.

Govindarajan, M., Balandreau, J., Kwon, S. W., Weon, H. Y. y Lakshminarasimhan, C. (2008). Effects of the Inoculation of Burkholderia vietnamensis and Related Endophytic Diazotrophic Bacteria on Grain Yield of Rice. Microbial Ecology, 55(1), 21–37. DOI: 10.1007/ s00248-007-9247-9.

Govindarajan, M., Kwon, S. W. y Weon, H. Y. (2007). Isolation, molecular characterization and growth-promoting activities of endophytic sugarcane diazotroph Klebsiella sp. GR9. World Journal of Microbiology and y Biotechnology, 23(7), 997-1006. DOI: 10.1007/s11274-006-9326-y.

Greenberg, E. P. (2000). Acyl-homoserine lactone Quórum Sensing in bacteria. Journal of Microbiology, 38, 117- 121.

Greenberg, E. P. (2003). Bacterial communication and group behavior. The Journal of Clinical Investigation, 112(9), 1288-1290. DOI: 10.1172/JCI200320099.

Gunarto, L., Adachi, K., y Senboku, T. (1999). Isolation and selection of indigenous Azospirillum spp. from a subtropical island, and effect of inoculation on growth of lowland rice under several levels of N application. Biology and Fertility of Soils, 28 (2), 129-135.

Haas, D., Keel, C., y Reimmann, C. (2002). Signal transduction in plant-beneficial rhizobacteria with biocontrol properties. Antonie Van Leeuwenhoek, 81(1), 385-395.

Hayat, R., Sadfar, A., Ummay, A., Rabia, K., y Iftikhar A. (2010). Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion : a review. Annals of Microbiology, 60 (4), 579-598.

28

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

Holguin, G., y Bashan, Y. (1996). Nitrogen-fixation by Azospirillum brasilense Cd is promoted when co-cultured with a mangrove rhizosphere bacterium (Staphylococcus sp.). Soil Biology and Biochemistry, 28 (12), 1651-1660.

Höoflich, G., Wiehe, W. y Küuhn, G. (1994). Plant-growth stimulation by inoculation with symbiotic and associative rhizosphere microorganisms. Experientia, 50(10), 897-905.

Jackson, L. E., Burger, M., y Cavagnaro, T. R. (2008). Roots, nitrogen transformations, and ecosystem services. Plant Biology, 59(1), 341-363. DOI: 10.1146/annurev. arplant.59.032607.092932.

Johansson, E., Crusz, S. A., Kolomiets, E., Buts, L., Kadam, R. U., Cacciarini, M., Bartels, K. M., Diggle, S. P., Cámara, M., Williams, P., Loris, R., Nativiti, C., Rosenau, F., Jaeger, K. E., Darbre, T. y Reymond, J. L. (2008). Inhibition and Dispersion of Pseudomonas aeruginosa Biofilms by Glycopeptide Dendrimers Targeting the FucoseSpecific Lectin LecB. Chemistry and Biology, 15(12), 1249-1257. DOI: 10.1016/j. chembiol.2008.10.009.

Joseph, C. M., y Phillips, D. A. (2003). Metabolites from soil bacteria affect plant water relations. Plant Physiology and Biochemistry, 41(2), 189-192. DOI: 10.1016/ S0981-9428(02)00021-9.

Kang, B. R., Lee, J. H., Ko, S. J., Lee, Y. H., Cha, J. S., Cho, B. H., y Kim, Y. C. (2004).

Degradation of acyl-homoserine lactone molecules by Acinetobacter sp. strain C1010.

Canadian Journal of Microbiology, 50(11), 935-941. DOI: 10.1139/w04-083.

Keller, L., y Surette, M. G. (2006). Communication in bacteria: an ecological and evolutionary perspective. Nature Reviews Microbiology, 4, 249-258. DOI: 10.1038/nrmicro1383.

Kennedy, I. R., Choudhury, A. T. M. A., y Kecskés, M. L. (2004). Non-symbiotic bacterial diazotrophs in crop-farming systems: can their potential for plant growth promotion be better exploited? Soil Biology and Biochemistry, 36, 1229-1244. DOI: 10.1016/j. soilbio.2004.04.006.

Khan, A. A., Jilani, G., Akhtar, M. S., Naqvi, S. S., y Rasheed, M. (2009). Phosphorus solubilizing bacteria: occurrence, mechanisms and their role in crop production. Journal of Agricultural and Biological Science, 1(1), 48-58.

Kleerebezem, M., Quadri, L. E., Kuipers, O. P., y De Vos, W. M. (1997). Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in Gram‐positive bacteria. Molecular Microbiology, 24(5), 895-904. DOI: 10.1046/j.1365-2958.1997.4251782.x Kloepper, J. W., y Schroth, M. N. (1978). Plant growth-promoting rhizobacteria on radishes. En In: Proceedings of the 4th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, vol. 2, (pp. 879-882), Angers, Francia.

Ladha, J. K., y Reddy, P. M. (2003). Nitrogen fixation in rice systems: state of knowledge and future prospects. Plant and soil, 252(1), 151-167.

Lara C., Oviedo L. y Aleman A. (2011). Strain native with potential in the acetic acid production indol to improve the agricultura. Biotecnologia en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, 9(1), 17-23.

Lara, C., and Alvarez, A. (2013). Impact of the inoculation of Azospirilum native on Oryiza sativa Ll. in the department of Córdoba-Colombia. Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, 11(2), 37-45.

29

Lazazzera, B. A., y Grossman, A. D. (1998). The ins and outs of peptide signaling. Trends in Microbiology, 6(7), 288-294. DOI: 10.1016/S0966-842x(98)01313-4.

Lin, Y. H., Xu, J. L., Hu, J., Wang, L. H., Ong, S. L., Leadbetter, J. R., y Zhang, L. H. (2003). Acyl-homoserine lactone acylase from Ralstonia strain XJ12B represents a novel and potent class of quorum-quenching enzymes. Molecular microbiology, 47(3), 849-860.

Loh, J., Pierson, E. A., Pierson III, L. S., Stacey, G., y Chatterjee, A. (2002). Quorum sensing in plant-associated bacteria. Current Opinion in Plant Biology, 5(4), 285-290. DOI: 10.1016/S1369-5266(02)00274-1.

López, C. L. Á., Vega, N. W. O., yand y Montoya, M. M. (2013). Identificación molecular de microorganismos asociados a la rizósfera de plantas de vainilla en Colombia. Acta Biológica Colombiana, 18(2), 293-305.

López, D. B. S., Hoyos, A. M. G., Perdomo, F. A. R., y Buitrago, R. R. B. (2014). Efecto de rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal solubilizadoras de fosfato en Lactuca sativa cultivar White Boston. Revista Colombiana de Biotecnología, 16(2), 122-128.

López, M., Viera, R. M., Martínez, Fabré, M. B., Bolívar, A., Alfonso, N., Alba, A., y Abreo, H. P. (2008). De un cultivar de maíz en dos suelos contrastantes venezolanos 1 bacterial biofertilizers effect on the growth of a maize cultivar in two venezuelans contrasting soils, Agronomía tropical, Vol. 58(4),. Pp 391-401.

López-Ceballos, F. D. (2011). Inoculación con bacterias promotoras de crecimiento en cuatro especies leñosas de selva baja caducifolia trabajo. (Ttrabajo de experiencia recepcional). Universidad Veracruzana, Facultad de Ciencias Agrícolas, Xalapa, EnriquezVeracruz, México., 30.

Lucy, M., Reed, E., y Glick, B. R. (2004). Applications of free living plant growth-promoting rhizobacteria. Antonie Van Leeuwenhoek, 86(1), 1-25.

Ma, W., Guinel, F. C., y Glick, B. R. (2003) Rhizobium leguminosarum biovar viciae 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase promotes nodulation of pea plants.

Applied and environmental microbiology, 69(8), 4396-4402.

Malik, K. A. (1997). Association of nitrogen-fixing, plant-growth-promoting rhizobacteria (PGPR) with kallar grass and rice. Plant and Soil, 194(1), 37-44.

Marquina, D., y Santos, A. (2011). Sistemas de quorum sensing en bacterias. Reduca (Biología), 3(5), 39-55.

Mathesius, U., Mulders, S., Gao, M., Teplitski, M., Caetano-Anollés, G., Rolfe, B. G., y Bauer, W. D. (2003). Extensive and specific responses of a eukaryote to bacterial quorum-sensing signals. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(3), 14441449. DOI: 10.1073/pnas.262672599 Mehta, S., y Nautiyal, C. S. (2001). An efficient method for qualitative screening of phosphate-solubilizing bacteria. Current Microbiology, 43(1), 51-56.

Miethke, M., y Marahiel, M. A. (2007). Siderophore-based iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(3), 413-451.

Molla, A. H., Shamsuddin, Z. H., Halimi, M. S., Morziah, M., y Puteh, A. B. (2001).

Potential for enhancement of root growth and nodulation of soybean co-inoculated with Azospirillum and Bradyrhizobium in laboratory systems. Soil Biology and Biochemistry, 33, 457-463.

Mossialos, D., y Amoutzias, G. D. (2009). Role of siderophores in cystic fibrosis pathogenesis: foes or friends? International Journal of Medical Microbiology, 299(2), 87-98.

30

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

Nandakumar, R., Babu, S., Viswanathan, R., Sheela, J., Raguchander, T., y Samiyappan, R. (2001). A new bio-formulation containing plant growth promoting rhizobacterial mixture for the management of sheath blight and enhanced grain yield in rice.

Biocontrol, 46(4), 493-510.

Nautiyal, C. S. (1999). An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEMS Microbiology Letters, 170, 265-270. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1999.tb13383.x.

Neilands, J. B. (1995). Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds. Journal of Biological Chemistry, 270(45), 26723-26726.

Newton J. A., y Fray R. G. (2004). Integration of environmental with quorum sensing.

Cellular Microbiology, 6, 213-224.

Nguyen, H.T., Deaker, R., Kennedy, I.R. y Roughley, R.J. (2003). The positive yield response of field-grown rice to inoculation with a multi-strain biofertiliser in the Hanoi area, Vietnam. Symbiosis, 35(3), 231-245.

Oliveira, A.L.M., Urquiaga, S., Döbereiner, J. y Baldani, J.I. (2002). The effect of inoculating endophytic N2-fixing bacteria on micropropagated sugarcane plants. Plant and Soil, 242(2), 205-215.

Orozco C., Martínez P. (2009). Evaluación de la inoculación con microorganismos fijadores de nitrógeno asimbióticos aislados de la rizósfera de Pinus patula en Colombia. Bosque (Valdivia). 30 (2), 70-77. DOI: 10.4067/S0717-92002009000200002.

Ortiz Castro, R., Campos García, J., y López Bucio, J. (2012). Comunicación planta-bacteria basada en ciclodipéptidos de origen microbiano con actividad auxínica. Ciencia Nicolaita, 56, 59-74.

Paredes-Mendoza, M., y Espinosa-Victoria, D. (2010). Ácidos orgánicos producidos por rizobacterias que solubilizan fosfato: una revisión crítica. Terra Latinoamericana, 28(1), 61-70.

Pareja, F. A. G. (2012). Bacterias fijadoras de nitrógeno en el comportamiento agronómico del tomate Lycopersicon esculentum var. Río Grande. Revista Cuadernos del Caribe, 7(1), 125-132.

Péerez, E., Sulbaran, M., Ball, M. M., y Yarzabal, L. A. (2007). Isolation and characterization of mineral phosphate-solubilizing bacteria naturally colonizing a limonitic crust in the south-eastern Venezuelan region. Soil Biology and Biochemistry, 39(11), 2905-2914.

DOI: 10.1016/j.soilbio.2007.06.017 Peña H. B. y Reyes I. (2007). Aislamiento y evaluación de bacterias fijadoras de nitrógeno y disolventes de fosfatos en la promoción del crecimiento de la lechuga (Lactuca sativa L.). Interciencia, 32(8), 560-565.

Pikovskaya R. I. (1948). Mobilization of phosphates in soil in relation with vital activity of some microbial species. Mikrobiologiya, 17, 362-370.

Puente, M. E., Bashan, Y., Li, C. Y., y Lebsky, V. K. (2004). Microbial populations and activities in the rhizoplane of rock-weathering desert plants. I. Root colonization and weathering of igneous rocks. Plant Biology, 6(5), 629-642.

Raines D. J., Sanderson T. J., Wilde E. J., y Duhme-Klair A. K., (2015). Siderophores.

En Reference Module in Chemistry:, Molecular Sciences and Chemical Engineering. Elsevier . DOI: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-409547-2.11040-6 Raja, P., Uma, S., Gopal, H. y Govindarajan, K. (2006). Impact of bio inoculants consortium on rice root exudates, biological nitrogen fixation and plant growth. Journal of Biological Sciences, 6, 815-823. DOI: 10.3923/jbs.2006.815.823.

31

Rasmussen, T. B., y Givskov, M. (2006). Quórum Sensing inhibitors: A bargain of effects. Microbiology, 152(4), 895- 904. DOI: 10.1099/mic.0.28601-0.

Rather, S. A., y Mukhtar, S. (2014). Environment and perception of sustainable agriculture development in India: the edge of bio-fertilizer. International Journal of Trade and Global Business Perspectives, 3, 1036-1041.

Renshaw, J. C., Robson, G. D., Trinci, A. P., Wiebe, M. G., Livens, F. R., Collison, D., y Taylor, R. J. (2002). Fungal siderophores: structures, functions and applications.

Mycological Research, 106(10), 1123-1142.

Ribbe, M., Gadkari, D., Meyer, O. (1997), N2 fixation by Streptomyces thermoautotrophicus involves a molybdenum-dinitrogenase and a manganese-superoxide oxidoreductase that couple N2 reduction to the oxidation of superoxide produced from O2 by a molybdenum-CO dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry. 272(42), 26627-26633.

Richardson A. E., Barea, J. M., McNeill, A. M. y Prigent-Combaret, C. (2009) Acquisition of phosphorus and nitrogen in the rhizosphere and plant growth promotion by microorganisms. Plant Soil, 321(1), 305–339. DOI: 10.1007/s11104-009-9895-2.

Richardson, A. E., y Simpson, R. J. (2011). Soil microorganisms mediating phosphorus availability update on microbial phosphorus. Plant Physiology, 156(3), 989-996. DOI: 10.1104/pp.11.175448.

Rives, N., Acebo, Y., y Hernández, A. (2007). Reseña bibliográfica Bacterias promotoras del crecimiento vegetal en el cultivo del arroz (Oryza sativa L.). Cultivos Tropicales, 28(2), 29-38.

RodrıguezRodríguez, H., y Fraga, R. (1999). Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnology Advances, 17(4-5), 319-339. DOI: 10.1016/ S0734-9750(99)00014-2.

Roesti, D., Gaur, R., Johri, B. N., Imfeld, G., Sharma, S., Kawaljeet, K., y Aragno, M. (2006). Plant growth stage, fertiliser management and bio-inoculation of arbuscular mycorrhizal fungi and plant growth promoting rhizobacteria affect the rhizobacterial community structure in rain-fed wheat fields. Soil Biology and Biochemistry, 38(5), 1111-1120. DOI: 10.1016/j.soilbio.2005.09.010 Rojas, A., Holguin, G., Glick, B. R., y Bashan, Y. (2001). Synergism between Phyllobacterium sp. (N2-fixer) and Bacillus licheniformis (P-solubilizer), both from a semiarid mangrove rhizosphere. FEMS Microbiology Ecology, 35, 181-187.

Ryu, C. M., Lee, C. H., y Lee, J. K. (2013). Modulation of Quorum Sensing in Acyl homoserine Lactone Producing or Degrading Tobacco Plants Leads to Alteration of Induced Systemic Resistance Elicited by the Rhizobacterium Serratia marcescens 90 166. The Plant Pathology Journal, 29(2), 182-192. DOI: 10.5423/PPJ.SI.11.2012.0173.

Saharan, B. S., y Nehra, V. (2011). Plant growth promoting rhizobacteria: a critical review. Life Sciences and Medicine Research, 21, 1-30.

Salisbury, F. B., y Ross, C. W. (1994). Fisiología Vegetal. México. Grupo Editorial Iberoamérica.

Sánchez J., Vanegas J., Sosa T., Melgarejo L.M., y Fuentes C. (2006). Diazótrofos de vida libre: Perspectivas de aplicación. (Pp.: 99-117). En: L. A. Castilla (Ed.) Biofertilización: alternativa viable para la nutrición vegetal. Vol.1. ed. Ibagué: L&L impresores. Sociedad Colombiana de la Ciencias del Suelo. 195p Sasaki, K., Ikeda, S., Eda, S., Mitsui, H., Hanzawa, E., Kisara, C., y Sato, T. (2010).

Impact of plant genotype and nitrogen level on rice growth response to inoculation with

32

RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL

Azospirillum sp. strain B510 under paddy field conditions. Soil Science and Plant Nutrition, 56(4), 636-644. DOI: 10.1111/j.1747-0765.2010.00499.x Schuhegger, R., Ihring, A., Gantner, S., Bahnweg, G., Knappe, C., Vogg, G., Hutzler, P., Schmid, M., Van Breusegem, F., Eberl, L., Hartmann, A. y Langebartels, C. (2006).

Induction of systemic resistance in tomato by N-acyl-homoserine lactone-producing rhizosphere bacteria. Plant Cell and Environment, 29, 909-918.

Shahzada S, Arif M , Riaz M, Iqbal Z y Ashraf M. (2013). PGPR with varied ACCdeaminase activity induced different growth and yield response in maize (Zea mays L.) under fertilized conditions. European Journal of Soil Biology, 57, 27-34. DOI: 10.1016/j. ejsobi.2013.04.002 Sharma, A., Sahgal, M., y Johri, B. N. (2003). Microbial communication in the rhizosphere: Operation of quorum sensing. Current Science, 85, 1164-1172.

Siddikee, M. A., Glick, B. R., Chauhan, P. S.,y Sa, T. (2011). Enhancement of growth and salt tolerance of red pepper seedlings (Capsicum annuum L.) by regulating stress ethylene synthesis with halotolerant bacteria containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase activity. Plant Physiology and Biochemistry, 49(2), 427-434. DOI: 10.1016/j.plaphy.2011.01.015.

Spaepen, S., Vanderleyden, J., y Remans, R. (2007). Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling. FEMS Microbiology Reviews, 31, 425-448. DOI: 10.111/j.1574-6976.2007.00072.x.

Teplitski, M., Robinson, J. B., y Bauer, W. D. (2000). Plants secrete substances that mimic bacterial N-acyl homoserine lactone signal activities and affect population density-dependent behaviors in associated bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions, 13(6), 637-648.

Valero, N. (2003). Potencial biofertilizante de bacterias diazotróficas y solubilizadoras de fosfatos asociadas al cultivo de arroz (Oryza sativa L.). (tesis de Maestría Interfacultades).

Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias e Instituto de Biotecnología, Bogotá, Colombia. Maestría interfacultades Microbiología, Universidad Nacional de Colombia.

Vanegas, J., (2004). Determinación de la actividad fijadora de nitrógeno de diazótrofos asociados a plántulas de Rhizophora mangle y Avicennia germinans en manglares del Caribe colombiano (trabajo de pregrado). Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, Colombia.

Vanegas, J., (2007). Mitigación del estrés salino en plántulas de Avicennia germinans y Capsicum annuum por bacterias promotoras de crecimiento vegetal (tesis de maestría).

Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, Colombia.

Vanegas, J., y Uribe-Vélez, D. (2014). Selection of mixed inoculants exhibiting growth-promoting activity in rice plants from undefined consortia obtained by continuous enrichment. Plant and soil, 375(1-2), 215-227.

Varma, A., y Chincholkar, S. B. (2007). Microbial siderophores (Vol. 12). Springer Science and Business Media.

Vessey, J.K. (2003). Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil, 255, 571-586.

Villicaña, C. (2007). Efecto de las acil homoserina lactonas en la fijación de nitrógeno y solubilización de fosfato inorgánico en bacterias aisladas de la rizósfera de los

33

mangles Avicennia germinans y Laguncularia racemosa. (Tesis de Maestría), Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, La Paz, México.

Waters, C. M., y Bassler, B. L. (2005). Quórum Sensing: Cell- to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 21, 319-346. DOI: 10.1146/ annurev.cellbio.21.012704.131001.

Whitehead, N. A., Barnard, A. M. L., Slater, H., Simpson, N. J., L., y Salmond, G. P. C. (2001). Quórum-Sensing in Gram- negative bacteria. FEMS Microbiology Review, 25, 365- 404.

Wu, S. C., Cao, Z. H., Li, Z. G., Cheung, K. C., y Wong, M. H. (2005). Effects of biofertilizer containing N-fixer, P and K solubilizers and AM fungi on maize growth: a greenhouse trial. Geoderma, 125 (1-2), 155-166. DOI: 10.1016/j.geoderma.2004.07.003.

Yang, P. X., Ma, L., Chen, M. H., Xi, J. Q., He, F., Duan, C. Q., Mo, M. H., Fang, D.H., Duan, Y. Q. y Yang, F. X. (2012). Phosphate solubilizing ability and phylogenetic diversity of bacteria from P-rich soils around Dianchi Lake drainage area of China. Pedosphere, 22(5), 707-716.

Yehuda, Z., Shenker, M., Romheld, V., Marschner, H., Hadar, Y., y Chen, Y. (1996).

The role of ligand exchange in the uptake of iron from microbial siderophores by gramineous plants. Plant Physiology, 112(3), 1273-1280.

Zahran, H. H. (1999). Rhizobium-legume symbiosis and nitrogen fixation under severe conditions and in an arid climate. Microbiology and molecular biology reviews, 63(4), 968-989.

Zhou, H., Yao, F., Roberts, D. P., y Lessie, T. G. (2003). AHL-deficient mutants of Burkholderia ambifaria BC-F have decreased antifungal activity. Current Microbiology, 47(3), 0174-0179. DOI: 10.1007/s00284-002-3926-z.

Zhu, H., y Sun, S. J. (2008). Inhibition of bacterial quorum sensing-regulated behaviors by Tremella fuciformis extract. Current Microbiology, 57(5), 418-422. DOI: 10.1007/ s00284-008-9215-8.

Zlotnikov, A. K., Shapovalova, Y. N., y Makarov, A. A. (2001). Association of Bacillus firmus E3 and Klebsiella terrigena E6 with increased ability for nitrogen fixation. Soil Biology and Biochemistry, 33(11), 1525-1530. DOI: 10.1016/S0038-0717(01)00070-0 Zúuñiga Dávila, D. (2010). Caracterización y selección de bacterias promotoras de crecimiento en el cultivo orgánico de maca (Lepidium meyenii Walpers) como herramienta biotecnológica para mejorar su calidad productiva. Perú biodiverso, 207.

34

2 aspectos gener ales en

micorremediaciรณn

35

Fung, Yih1 Sánchez, Jimena2 Torres, Johanna3 Boada, Luisa4 Rivera, Hugo5 Mejía, Jairo6 Gómez, Diego7 Ruiz, Elkin8 1 Microbióloga Industrial. MSc. Microbiología.

Docente de Cátedra, departamento de Biología.

Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia.

2 Bacterióloga. MSc Microbiología. Candidato PhD ciencias Agrarias. Docente Asociada, dedicación exclusiva, departamento de Biología. Facultad de Ciencias.

Universidad Nacional de Colombia.

3 Bacterióloga. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. Candidato MSc. Microbiología.

Universidad Nacional de Colombia.

4 Bióloga. Universidad Nacional de Colombia. Candidato MSc. Medio Ambiente y Desarrollo.

Universidad Nacional de Colombia.

5 Biólogo. MSc. Microbiología.

Universidad Nacional de Colombia.

6 Estudiante Ingeniería Agronómica.

Universidad Nacional de Colombia.

7 Estudiante Biología.

Universidad Nacional de Colombia.

8 Tecnólogo en química Industrial. Técnico de apoyo laboratorio Microbiología. Departamento de Biología.

Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

1. Introducción Los problemas asociados a la contaminación de ecosistemas, por parte de sustancias de origen industrial o al manejo inadecuado de prácticas y políticas ineficientes de disposición de residuos y tratamiento de las mismas, se ha convertido, en los últimos años, en una problemática ambiental, en donde la aplicación de métodos fundamentados en el uso de alternativas limpias han sido el objetivo principal para buscar la mitigación y/o restauración total o parcial del ambiente alterado (Quintero, 2011).

La “biorremediación” es un tratamiento tecnológico de descontaminación que usa sistemas biológicos para catalizar la destrucción o transformación de componentes peligrosos en el ambiente. El empleo de plantas para la eliminación de contaminantes del suelo y agua se denomina fitorremediación; mientras que el término biorremediación abarca el empleo de microorganismos o sus enzimas (Quintero, 2011). La aplicación de la biotecnología ha presentado un crecimiento durante las últimas dos décadas debido a su potencial comercial en diversos campos. Una de las mayores ventajas de la biotecnología es su capacidad de llevar a cabo reacciones con alta especificidad, ofrecer procesos tecnológicos de producción limpia, ahorro de energía y desarrollo de procesos biológicos alternativos a los tratamientos químicos. Por lo anterior, Banat y colaboradores (1996) resaltan los procesos biotecnológicos, por ser eficientes, amigables con el medio ambiente y atractivos económicamente.

El término micorremediación, generalmente, se refiere a la explotación de una capacidad única de los hongos para utilizar varios contaminantes orgánicos o para remover los metales pesados de sustratos contaminados, ampliando, mediante su aplicación, la revitalización de áreas degradadas y orgánicamente empobrecidas (Piškuret al., 2013). Los hongos están equipados con un sistema que les otorga la capacidad de crecer en una amplia gama de sustratos tanto naturales como sintéticos. Estos microorganismos producen y secretan altas concentraciones de diferentes enzimas extracelulares hacia su entorno periférico, degradando varios substratos a moléculas sencillas, las cuales pueden ser absorbidas y/o metabolizadas (Pakdaman, Mohammadi y Varma, 2013).

La micorremediación involucra las técnicas para remediar o restablecer matrices de suelo, agua o aire a un estado óptimo, libre de contaminantes o, al menos, reducir la concentración a niveles no tóxicos. Dentro del contexto de la aplicabilidad de los hongos en la biodegradación de xenobióticos, el estudio de enzimas involucradas en la degradación de plaguicidas y la investigación de complejos enzimáticos de los hongos de pudrición blanca constituyen un interesante campo de acción, con gran potencial biotecnológico. La habilidad de los hongos para degradar el polímero de lignina y otros compuestos aromáticos estructuralmente relacionados, como los complejos derivados de petróleo, componen un método eficaz para remover plaguicidas e hidrocarburos aromáticos policíclicos de ambientes alterados (Hammel,1996).

En los últimos años, la búsqueda exhaustiva de tecnologías limpias, a través del estudio e identificación de enzimas y su mecanismo de acción frente a compuestos contaminantes, contribuyen a la construcción del conocimiento, reconociendo la diversidad microbiana, la importancia ecológica y la aplicación biotecnológica.

37

2. Hongos en la Bioconversión de Residuos Industriales La transformación microbiana de los compuestos orgánicos va ligada a dos procesos principales, el crecimiento y el cometabolismo. La transformación de compuestos químicos naturales y sintéticos en fuentes de energía para su desarrollo, desencadenando las reacciones propias del catabolismo microbiano, siempre se fundamentan en el mismo principio básico: una degradación gradual de la molécula compleja para producir uno o más fragmentos sencillos para su posterior integración al metabolismo central (Fernández, 2012). La adaptabilidad de la población microbiana a las fuentes nutricionales disponibles serán las ventajas adaptativas que permitan el proceso de remediación, mediante reacciones bioquímicas y físicas que disminuirán directa o indirectamente las concentraciones de los contaminantes en el medio (Juwarkar, Singh y Mudhoo, 2010).

Las características principales de los organismos aplicados en biorremediación y del medio contaminado cumplen con los siguientes requisitos: (a) Los organismos sintetizarán las enzimas efectivas para la biorremediación y deberán ser capaces de vivir y demostrar su bioactividad bajo condiciones de contaminación; (b) Los organismos deberán tener acceso a los contaminantes apolares en ambientes acuosos o severamente fijados por adsorción a las superficies sólidas; (c) El sitio del substrato del contaminante debe ser accesible por el sitio activo de la enzima para su papel en la biorremediación; (d) el contaminante y el sistema enzimático deben permanecer en estrecho contacto en algún lugar dentro o fuera de la célula (Padaman, Mohammadi y Varma, 2013).

Los hongos son organismos únicos por sus características morfológicas, fisiológicas y genéticas; son ubicuos, capaces de colonizar todas las matrices (suelo, agua, aire) en ambientes naturales y juegan un papel importante dentro del contexto del equilibrio de los ecosistemas. Analizando las diferentes matrices, el aire es un vehículo importante para la dispersión de propágulos fúngicos (conidios y esporas), los cuales representan el principal componente de un bioaerosol. El medio acuático, tanto marino como de agua dulce, constantemente es colonizado por hongos; sin embargo, el principal hábitat de estos microorganismos es el suelo. Dentro de esta matriz compleja y heterogénea, los hongos se encuentran en una variedad de nichos ecológicos, desde la tundra ártica a las dunas de arena del desierto, en donde son fundamentales para el mantenimiento de los ecosistemas (Anastasi, Tigini y Varese, 2013). Los hongos y sus interacciones con otros organismos son indispensables para el funcionamiento estable de los ecosistemas y la biósfera. La actividad de los hongos es única e irremplazable en los ciclos biogeoquímicos de nutrientes; además, representan un reservorio genético con un enorme potencial para restaurar y conservar el equilibrio ambiental (Piškuret al., 2013).

La capacidad para catabolizar la celulosa y hemicelulosa es una característica común para diversos hongos y otros microorganismos. Sin embargo, al ser la lignina un heteropolímero muy recalcitrante, solamente es mineralizado (transformado hasta dióxido de carbono y agua) en forma limitada por algunas bacterias y ex-

38

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

tensivamente por un grupo de hongos. La mayoría de los hongos ligninolíticos pertenecen al grupo Basidiomycetes y son los microorganismos más eficientes en degradar totalmente la lignina. Estos organismos secretan varias enzimas extracelulares que son esenciales para la transformación inicial de la lignina y que, en conjunto, logran su mineralización (Dávila y Vázquez, 2006).

El crecimiento filamentoso de basidiomicetos que forman cordones miceliales es una ventaja significativa para la colonización del suelo, en el cual la distribución de los nutrientes no es homogénea. En el caso de los hongos de pudrición blanca que producen cambios en la lignina (polímero estéreo-irregular) mediante mecanismos oxidativos, el sistema enzimático ligninolítico es poco específico, ya que las peroxidasas y oxidasas actúan al azar sobre la molécula de lignina, generando radicales libres que son inestables y tienden a polimerizarse.

Las principales enzimas que actúan directa o indirectamente sobre la lignina son: lacasas, manganeso peroxidasas (MnP) y peroxidasas (LiP). Ciertos hongos de pudrición blanca producen las tres enzimas, algunos solo dos y pocos producen solo una (Díaz, 2009). Este mecanismo de radicales libres proporciona la base para el carácter inespecífico de la degradación de una variedad estructuralmente diversa de contaminantes, disminuyendo los tiempos de adaptabilidad fisiológica de estos microorganismos a la complejidad química que están degradando (Anastasi, Tigini y Varese, 2013).

2.1 Sistema enzimático extracelular 2.1.1 Lacasas Las lacasas (p-difenol:dioxigeno:oxido-reductasa) son enzimas fenol-oxidasas extracelulares llamadas también multicobre oxidasas (Mendoza, 2012). Se encuentran distribuidas de manera extensa en plantas, hongos y algunas bacterias; en el caso específico de los hongos, estas enzimas son producidas por el micelio durante el crecimiento vegetativo; además, son de vital importancia en los procesos propios del desarrollo de cuerpos fructíferos, pigmentación y diferenciación sexual, entre otros (Castanera, 2011; Lladó, 2012). Estas enzimas catalizan la oxidación de un amplio rango de compuestos fenólicos y aminas aromáticas utilizando como aceptor final de electrones el oxígeno molecular. Las lacasas se comportan de manera más estable en pH alcalino que en pH ácido (Díaz, 2009). El uso de mediadores en la catálisis con lacasas es una alternativa ambiental, siendo esta utilizada en procesos como el blanqueo de pulpa de papel, decoloración de tintes usadas en la industria textil o bien en la oxidación de hidrocarburos poliaromáticos PAH (Lodolo, Gonzalez, y Miertus 2001).

2.1.2 Manganeso Peroxidasa (MnP) Las manganeso peroxidasas son proteínas caracterizadas por tener dentro de su estructura un grupo hemo y son capaces de catalizar la oxidación del Mn2+, a dos electrones de H2O2 (Moreno y Ospina, 2008). En la anterior reacción se ge-

39

nera un intermediario denominado compuesto I, el cual es capaz de oxidar Mn2+ u oxidar compuestos de carácter fenólico a compuestos radicales denominados compuestos II, el cual requiere de Mn2+ como agente reductor, produciéndose así la oxidación de Mn2+ a Mn3+. El Mn3+, raptado en este caso por un ácido de tipo orgánico, es un compuesto capaz de oxidar una gran variedad de substratos fenólicos. Estudios de diferentes autores sugieren que las manganeso-peroxidasas, en combinación con las lacasas o con las lignina-peroxidasas, podrían ser el conjunto de enzimas oxidativas necesario para la degradación de compuestos complejos como la lignina (Moreno y Ospina, 2008; Díaz, 2009; Mendoza, 2012; Lladó, 2012).

2.1.3 Versátil Peroxidasa (V P) Conocida también como MnP versátil, esta enzima es una de las más recientes en descubrirse para el género Pleurotus, siendo también una hemoperoxidasa como MnP. Su característica principal se basa en que combina las propiedades descritas para la enzima MnP y de la enzima Lignina peroxidasa (LiP). Se considera como un tercer tipo de enzima ligninolítica debido a su capacidad de llevar a cabo reacciones de oxidación del Mn2+ a Mn3+ y catalizar reacciones sobre sustratos aromáticos en ausencia de MnP (Dávila y Vázquez, 2006).

2.2 Sistema enzimático intracelular 2.2.1 Monoxígenasa citocromo P-450 Dentro de los procesos de degradación de compuestos, no solo se puede atribuir dicha degradación al complejo enzimático extracelular, dado que, de acuerdo con la literatura revisada, se evidencia que compuestos tales como el fenantreno, Benzo(alfa) pireno y el DDT son degradados por el complejo monoxígenasa citocromo P-450 presente en todos los hongos (Dávila y Vázquez, 2006). El citocromo P-450 monooxigenasas (P-450s) puede ser entendido como una superfamilia de biocatalizadores que introducen un átomo de oxígeno en un amplio rango de moléculas para producir un epóxido (Quintero, 2011).

En los suelos, los nutrientes están presentes en diversas formas; el entorno es heterogéneo y los tipos de suelos difieren enormemente en sus propiedades físico-químicas, materia orgánica, contenido de nutrientes inorgánicos, textura y cantidad de biomasa microbiana. Aunque la presencia de compuestos inhibitorios parece ser el problema principal en suelos contaminados y/o potencialmente tóxicos, varias especies de hongos son tolerantes a altas concentraciones de metales pesados e hidrocarburos aromáticos policíclicos, pentaclofenol y otros contaminantes orgánicos (Baldrian, 2008); por lo cual, es necesario tomar medidas para su tratamiento y remoción de manera apropiada, con el objetivo de minimizar el impacto ambiental.

40

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

3. Micoremediación de Suelos Contaminados por Compuestos con Residualidad y Recalcitrantes La contaminación del suelo consiste en una degradación química que provoca la pérdida parcial o total de la productividad del suelo, como consecuencia de la acumulación de sustancias tóxicas en concentraciones que superan el poder de amortiguación natural del suelo y que modifican negativamente sus propiedades. Generalmente, estas acumulaciones son el resultado de actividades humanas exógenas, aunque también se pueden producir de forma endógena natural (Rosales, 2008).

Uno de los principales efectos de la contaminación en suelo es la disminución significativa de la diversidad biológica de la población microbiana nativa, desde el punto de vista genético y funcional. La contaminación ambiental afecta negativamente muchos niveles de la organización del ecosistema, lo que podría afectar la eficiencia del uso de recursos disponibles, haciendo que el sistema sea más sensible a las tensiones posteriores, o conducir al desarrollo de tolerancia y/o resistencia (Anastasi, Tigini y Varese, 2013).

En el proceso de biorremediación se ajustan las condiciones del suelo, incluyendo la humedad, oxígeno, concentración de nutrientes y pH. La formulación y el método de la adición de los nutrientes son influyentes en el éxito o fracaso del proceso. Las pruebas de biodegradabilidad en el laboratorio son importantes para determinar las condiciones físicas y nutricionales, con el objetivo de maximizar el efecto de biorremediación y reducir al mínimo la cantidad de nutrientes residuales en el proceso in situ (Hara y Uchiyama, 2013).

Existen estudios que se han enfocado principalmente en la remoción de metales pesados y diferentes tipos de tintes, usando varias especies fúngicas (células muertas o viables), con o sin pretratamiento químico o físico. Los estudios con metales pesados y tintes han generado un gran interés en el uso potencial de la biomasa fúngica como biosorbente. La mayoría de observaciones de acumulación de plaguicidas dentro de las células son registradas con hidrocarburos clorados como DDT, dieldrin, aldrin y heptacloro. Se ha encontrado que no solo las células bacterianas, sino también las células autoclavadas, muestran una toma similar de plaguicidas (Arunachalam y Lakshmanan, 1988).

Las altas concentraciones de metales pesados (HM, por sus siglas en inglés) en el suelo tienen efectos perjudiciales sobre los ecosistemas; a su vez, son un riesgo para la salud humana, ya que pueden entrar en la cadena alimentaria mediante productos agrícolas o agua potable contaminada. La fitorremediación es una tecnología sostenible y económica que se fundamenta en la eliminación de los contaminantes del medio ambiente de las plantas; sin embargo, la fitorremediación es un proceso lento, por lo cual, al incorporar, por ejemplo, hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) se puede mejorar la eficiencia y estabilización del

41

proceso, convirtiéndolo en un sistema atractivo. Durante la interacción simbiótica, la red hifal se extiende dentro del sistema de la raíz y, por lo tanto, las plantas en simbiosis con HFMA tienen el potencial para absorber metales pesados en un amplio volumen de suelo (Göhre y Paszokowski, 2006).

El resultado de la colonización micorrízica en la limpieza de suelos contaminados depende de la combinación de plantas, hongos y metales pesados; así mismo, está influenciado por las condiciones del suelo. Los metales pesados absorbidos por las hifas de los hongos pueden ser transportados a la planta; en algunos casos, las plantas micorrizadas pueden mostrar mayor absorción para el transporte de metales pesados (fitoextracción), mientras que en otros casos, los hongos HFMA contribuyen a la inmovilización dentro del suelo (fitoestabilización) (Göhre y Paszokowski, 2006).

De otro lado, la decoloración se ha convertido en un área de gran interés científico, dado que existe la necesidad de buscar tecnologías alternativas efectivas para retirar tintes en grandes volúmenes de efluentes. Es así como la decoloración mediante la aplicación de hongos ligninolíticos y sus enzimas oxidativas extracelulares han sido estudiadas (Mazmanci, 2010). El proceso de decoloración de una mezcla de colorantes fue reportado con el hongo de la podredumbre blanca Ganoderma lucidum, el cual incluye una variable de combinación mediante el uso del hongo Bjerkandera sp. La potencial acción en la decoloración de tintes de textiles recalcitrantes por Ganoderma lucidum se evidenció por la presencia de lacasas durante la fermentación en estado sólido (solid-state fermentation - SSF) sobre salvado de trigo, un sustrato lignocelulósico natural (Erkur, Erkurt y Unyayar, 2010).

Se ha reportado que la degradabilidad de hidrocarburos simples y combustibles derivados del petróleo disminuye de acuerdo con el incremento del peso molecular y del grado de ramificación, de tal forma que compuestos de hidrocarburos aromáticos de uno o dos anillos se degradan fácilmente, en comparación con los compuestos de mayor peso molecular. La estrategia para degradar hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH’s) consiste en desestabilizar el anillo aromático mediante la introducción de dos grupo hidroxilos. Así, el compuesto es susceptible al ataque enzimático, para rendir formas asimilables del carbono (Rosales, 2008). La oxidación enzimática, seguida de la adición de microorganismos endógenos, puede ser una estrategia de remediación efectiva debido a que la biodegradación de los PAH’s y sus metabolitos incrementa con su estado de oxidación.

Adicionalmente, las quinonas son significativamente menos mutagénicas que sus correspondientes PAH’s. Esto indica que una transformación enzimática de los PAH’s es suficiente para reducir su impacto ambiental (Dávila y Vázquez, 2006).

La persistencia de fluoreno y de sus metabolitos tanto en el suelo como en los ecosistemas acuáticos plantea una preocupación para la salud humana. En un estudio de biodegradación, realizado por Akdogan y Pazarlioglu (2011), se evaluaron los hongos de pudrición blanca P. ostreatus, Trametes versicolor, Trametes trogii y Ganoderma carnasum, calculando las tasas de degradación y eficiencia de remoción de fluoreno a diferentes concentraciones. P. ostreatus demostró tener la capacidad degradativa más alta y eficiente, degradando el compuesto por encima

42

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

del 90%. Por lo anterior, es posible afirmar que, si bien es cierto que las diferentes estrategias de biorremediación presentan limitaciones que deben considerarse en la aplicación de estos procesos, vale la pena resaltar el gran potencial que se abre frente a la micorremediación, ya que, a través de diversos grupos ecofisiológicos de hongos, se puede resolver una gran variedad de problemas que impactan de manera negativa la sostenibilidad de los ecosistemas.

La determinación de las comunidades académicas y científicas inmersas en el estudio y exploración de la micorremediación señala el papel directo que tienen los hongos para usar diferentes sustratos orgánicos recalcitrantes por vías catabólicas y complejos enzimáticos, además de involucrar las interacciones con otras poblaciones de organismos del medio ambiente del suelo.

4. Potencial de Biorremediación de los Hongos de la Pudrición Blanca Dentro de los procesos en los que la biotecnología puede tener un gran potencial, se destaca la degradación de residuos lignocelulósicos para su bioconversión a biomasa y enzimas de interés en el procesamiento de pulpa, papel, desarrollo de biosensores y degradación de compuestos contaminantes, entre otros (Kuhad, Singh y Eriksson, 1997). Los basidiomicetos responsables de la pudrición blanca de la madera son especies con características potenciales para ser utilizados en diferentes procesos biotecnológicos, incluidos los de biorremediación (Déley, 2010).

Este tipo de hongos poseen la capacidad de degradar, principalmente, la lignina hasta su mineralización (Mendieta et al., 2013).

Dentro de los grupos de hongos degradadores de madera más importantes están los Ascomycetes y Basidiomycetes. Dependiendo de cómo degraden uno o más componentes de la madera viva o muerta, estos se clasifican en hongos de pudrición suave, parda y blanca. Entre los hongos de pudrición suave se destacan: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Trichoderma viride y Chaetomium cellulolyticum, entre otros (Kuhad, Singh y Eriksson, 1997). Los hongos de pudrición suave degradan carbohidratos de la madera pero modifican muy poco la lignina.

Su característica principal es la formación de cadenas biónicas y cavidades cilíndricas dentro de la pared secundaria de las células vegetales. En general, los hongos de pudrición suave degradan más rápido maderas duras que maderas blandas (Duarte, 2004).

Entre la amplia diversidad microbiana, solo un pequeño número de microorganismos son responsables de la biodegradación de la lignina, de los cuales, los hongos de la podredumbre blanca constituyen el grupo más importante, gracias a la producción de enzimas ligninolíticas extracelulares, lignino peroxidasa (LiP) y manganeso peroxidasa (MnP) de gran capacidad oxidante (Hammel, 1996). En la degradación enzimática de la lignina interviene una serie de reacciones inespecíficas que originan la formación de radicales libres en el biopolímero y dan como

43

resultado la desestabilización de los enlaces y, finalmente, la ruptura de la macromolécula (Barr y Aust, 1994).

A partir de la década de los años 80, se ha incrementado el interés acerca de la posibilidad de usar hongos de la pudrición blanca en biorremediación. Estos hongos pertenecen a la clase Basidiomicetes y son conocidos por degradar la lignina de la madera. Uno de los primeros trabajos sobre el tema reporta la degradación de una amplia variedad de contaminantes ambientales (Bumpus et al., 1985). Las principales ventajas de estos hongos son (i) la tolerancia a concentraciones considerablemente altas de contaminantes y (ii) su capacidad para crecer a bajos valores de pH. Igualmente, gracias a la extensión de sus hifas en el suelo, pueden alcanzar contaminantes que no son biodisponibles ni biodegradables para otros organismos; y, puesto que requieren de sustratos lignocelulósicos para su crecimiento, es posible adicionar residuos de muy bajo costo (viruta de madera, carozo de maíz o paja de trigo) en los sitios contaminados, para promover su crecimiento e incrementar la degradación de los contaminantes (Quintero, 2011).

4.1 Mecanismos de biodeg radación de hongos de la pudrición blanca Se reportan tres mecanismos enzimáticos principales, responsables de la pudrición blanca de la madera para degradar contaminantes ambientales, dos de tipo oxidativo y uno reductivo así: (i) Sistema de degradación de la lignina, la cual realiza ataques oxidativos a moléculas orgánicas por medio de radicales libres generados por las enzimas ligninolíticas tipo peroxidasas; (ii) Fase I del metabolismo, mecanismo oxidativo en el que intervienen las enzimas citocromo P-450 monooxigenasas y (iii) Fase II del metabolismo, en donde el conjunto de enzimas catalizan reacciones de conjugación, reduciendo los contaminantes. Estos mecanismos degradan o modifican los contaminantes sin ser empleados como substratos para su crecimiento, es decir, la degradación se hace por cometabolismo (Quintero, 2011). i. Enzimas lig ninolíticas El metabolismo ligninolítico, generalmente denominado “sistema de degradación de lignina” (SDL), es inducido por deficiencia o limitación de nutrientes, principalmente nitrógeno y carbono. Varios de los metabolitos producidos por la degradación fúngica de contaminantes orgánicos, que incluyen fenoles, epóxidos, dihidrodioles y quinonas, son producidos por reacciones similares a las conocidas farmacológicamente como fase I del metabolismo (Sutherland, 1992). En esta fase, los procesos de biotransformación involucran las enzimas citocromo P-450 monooxigenasas y el epóxido hidrolasa. En la fase II del metabolismo, los contaminantes orgánicos son conjugados con sulfato, ácido glucorónido, glutatión, u otras moléculas (Cerniglia, Freeman y Mitchum, 1982).

44

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

ii. Fase I del metabolismo Las enzimas más importantes de la fase I son las citocromo P-450 monooxigenasas (P-450s) (Quintero, 2011). En la figura 1, se evidencia el ciclo catalítico. La enzima citocromo P-450 reductasa y su cofactor NADPH intervienen en el transporte de electrones. Algunos epóxidos son inestables y, a menudo, sufren reacciones de reordenamiento a fenoles o una hidratación enzimática vía otra enzima de la fase I, la epóxido hidrolasa, generando trans-dihidrodioles (Jerina, 1983).

Figura 1. Ciclo catalítico de las enzimas citocromo P-450 monooxigenasas.

Fuente: Jerina, 1983, p. 2.

Las citocromo P-450 monooxigenasas (P-450s) es un nombre colectivo dado para todas las hemo-proteinas que forman un complejo Fe (II)-CO con un espectro de absorción cercano a los 450 nm. Se sabe que estas enzimas oxidan más de 200.000 sustancias químicas exógenas y endógenas diferentes (Lewis, 2001; Urlacher y Eiben, 2006). Son altamente específicas en procariotes e inespecíficas en eucariotes (Sariaslani, 1991). A diferencia de las peroxidasas, las reacciones globales de los dos sistemas enzimáticos son: Peroxidasas: H2O2 + 2R + 2H+ ( 2H2O + 2R+ Citocromo P-450 monooxigenasas: RH + O2 + 2H+ + 2e- ( ROH + H20 En algunos trabajos recientes, relacionados con la secuenciación parcial del genoma del hongo de la pudrición blanca Phanerochaete chrysosporium, se ha descrito

45

la existencia de, al menos, 97 genes para las enzimas P-450s (Ichinose, Wariishi y Tanaka, 2002). Con esto, se refuta la teoría que afirma que los hongos poseían una pobre diversidad genética para enzimas P-450s y, por el contrario, ha conducido a que se incremente el interés en su identificación y caracterización. En los últimos años, se ha identificado la presencia de enzimas de la fase I P-450s en algunos hongos de pudrición blanca, tales como Phanerochaete chrysosporium, Bjerkanderaadusta y Coriolusversicolor (Kullman y Matsumura, 1997; Eilers et al., 1999; Ichinose, Wariishi y Tanaka, 2002; Harshavardhan et al., 2005), enzimas P-450s y epóxido hidrolasa en Pleurotus ostreatus (Bezalel, Hadar y Cerniglia, 1997).

Cuando los tratamientos de biorremediación se llevan a cabo con los hongos de la pudrición blanca de la madera, en condiciones no ligninolíticas, muchos investigadores han involucrado las enzimas P-450s en la degradación de diferentes compuestos xenobióticos. Como ejemplos de ello se tienen: 2,4,6-TNT (Eilers et al., 1999), atrazina, benzo(a)pireno (Masaphy, Henis y Levanon, 1996; Masaphy et al., 1996), lindano (Mougin et al., 1996), endosulfan (Kullman y Matsumura, 1996), fenantreno (Bezalel, Hadar y Cerniglia . 1997), difenil éter (Hiratsuka, Wariishi y Tanaka, 2001). iii. Fase II del metabolismo La fase I del metabolismo puede actuar como intermediaria para que se lleven a cabo las reacciones de la fase II de carácter reductivo, las cuales son conocidas típicamente como vías de conjugación. Estas vías son mediadas por la glutatióntransferasa, sulfotransferasa, glucosyl-transferasa, entre otras; enzimas que adicionan glutatión, sulfato o residuos de azúcar a los xenobióticos, haciéndolos más hidrosolubles y menos tóxicos (Casillas et al., 1996). Posteriormente, estos conjugados pueden ser reducidos por las enzimas conjugado reductasas, generando compuestos más degradables (Reddy y Gold, 1999; Reddy y Gold, 2001).

Al igual que las enzimas de la fase I, en los últimos años se han identificado, aislado y purificado las enzimas pertenecientes a la fase II: Glutathion S-transferasa y glutatión conjugado reductasa de Phanerochaete chrysosporium, involucradas en la dehalogenación reductiva del 2,4,6-triclorofenol, tetracloro-1, 4-hydroquinona (Dowd, Buckley y Sheehan, 1997; Reddy, Gelpke y Gold,1998; Reddy y Gold, 1999; Reddy y Gold, 2001), glutatión, sulfato y glucoronosyl transferasas de Pleurotus ostreatus (Bezalel, Hadar y Cerniglia, 1997).

Los mecanismos descritos muestran que los hongos de la pudrición blanca de la madera presentan gran diversidad genética para la degradación de contaminantes ambientales; no obstante, desde el punto de vista práctico, el mecanismo ligninolítico es el más eficiente por acción extracelular, altamente inespecífico y fácilmente inducible. De otro lado, la presencia de mecanismos intracelulares de degradación de contaminantes vía reductiva y oxidativa, les permite la aplicación de estos hongos en procesos de biorremediación de ambientes contaminados (Quintero, 2011).

46

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

5. Micorremediación de Plag uicidas Algunos autores afirman (Khan, 1980; Subhani et al., 2000) que, independientemente del método de aplicación de los plaguicidas, grandes cantidades de estos llegan al suelo y, en ocasiones, se genera acumulación de residuos que, a su vez, pueden estar presentes en otros compartimentos de la naturaleza. El cambio en el uso del suelo y, particularmente, las prácticas de uso intensivo pueden afectar las propiedades químicas y biológicas de este. La aplicación de altas dosis de fertilizantes y de abonos puede incrementar el ingreso de nutrientes y carbono, generar acidificación del suelo, así como cambios en la composición del carbono orgánico disuelto. Esto afecta las comunidades del suelo, favoreciendo la presencia de microorganismos que son más competitivos al tolerar altas concentraciones de sustrato y al estar adaptados para permanecer en menores valores de pH del suelo (Tian et al., 2012). El continuo uso agrícola de aguas residuales puede conducir a la acumulación de metales pesados y compuestos orgánicos e inorgánicos en los suelos; estos se concentran en los biosólidos, ocasionando riesgos potenciales si estos provienen de aguas residuales no tratadas. Adicionalmente, su tasa de acumulación en el suelo varía ampliamente y depende principalmente de la fuente del agua de riego, siendo las aguas residuales industriales las que producen la mayor contaminación (Abaidoo et al., 2010).

La biodegradación de plaguicidas en el suelo está relacionada con diversas reacciones enzimáticas efectuadas por comunidades microbianas allí presentes, de tal forma que las transformaciones bioquímicas de los plaguicidas modifican su estructura y propiedades toxicológicas, las cuales pueden conducir con la conversión total del contaminante en productos finales inorgánicos inocuos (Hussain et al., 2009).

Se ha reportado que la biodegradación se entiende como el rompimiento in vitro o in vivo de una sustancia catalizada por enzimas, la cual se puede caracterizar (según el propósito de la evaluación del riesgo) como: (i) primaria, alteración de la estructura química de una sustancia, resultando en la pérdida de una propiedad específica de esta; (ii) ambientalmente aceptable, se da la biodegradación hasta remoción de las propiedades indeseables del compuesto y, por lo general, corresponde a la biodegradación primaria, aunque depende de las circunstancias bajo las que se liberan los productos en el ambiente; (iii) final, rompimiento completo del compuesto hasta que se oxida completamente o se reduce a moléculas simples. Cabe anotar que, en algunos casos, los productos de la biodegradación pueden ser más dañinos que la sustancia degradada en sí (Duffus, Nordberg y Templeton, 2007).

Se ha afirmado que, aun cuando la capacidad biosorbente y el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio difiere de una a otra combinación de microorganismo-contaminante orgánico, la biomasa tiene mayor capacidad de biosorción para tintas, que para compuestos fenólicos y plaguicidas, con evidencias de que el pH del medio de biosorción es el parámetro que más influye en la capacidad biosorbente. En cuanto a compuestos fenólicos y plaguicidas, el valor de pH para mayor biosorción varía entre valores de pH acídicos, aunque el efecto del pH sobre la

47

capacidad biosorbente no siempre es reportado. En general, la cantidad de compuestos orgánicos absorbida por la cantidad de biomasa se incrementa con la creciente concentración inicial del sorbato y disminuye con la creciente concentración de biomasa (Aksu, 2005).

La investigación que involucra biomasa fúngica y compuestos orgánicos se ha enfocado principalmente en estudios de biodegradabilidad. Algunos estudios se han enfocado en la capacidad de biosorción de biomasa fúngica muerta. Los reportes más antiguos sobre este efecto en compuestos tóxicos orgánicos con biomasa fúngica han indicado que las mejores remociones se obtuvieron con biomasa muerta en vez de biomasa viva (Rao y Viraraghavan, 2002), como se puede visualizar en la tabla 1.

Tabla 0. Remoción de compuestos orgánicos usando biosorbentes fúngicos.

Compuesto investigado

Tipo de biomasa estudiada

Referencia

Lindano y dieldrin

Levadura de hornear (Saccharomyces cerevisiae), células vivas y muertas

[Voerman y Tammes, 1969]

Clordano y heptacloro

Aspergillus niger (células vivas)

[Iyengar y Prabhakar, 1973]

Metoxicloro

Flavobacterium harrisonii, Bacillus subtilis, Aspergillus sp., Chlorella pyrenoidosa (células vivas y muertas)

[Paris y Lewis, 1976]

Toxafeno

F. harrisonii, B. subtilis, Aspergillus sp., C. pyrenoidosa (células vivas y muertas)

[Paris, Lewis y Barnett, 1977]

1,1,2-Tricloroetano (TCE) y 1,1,2,2-tetracloroetano (TTCE)

Células muertas de Rhizopus arrhizus, Penicillium chrysogenum, lodos de aguas residuales municipales (mezcla de bacterias), Aspergillus terreus, A. niger, Pseudomonas fluorescens (bacteria)

[Tsezos y Seto, 1986]

Lindano, diazinon, pentaclorofenol, 2-clorobifenil,malatión

Biomasa viva y muerta de R. arrhizus y lodos activados

[Tsezos y Bell, 1989]

p,p´-DDT

Cladosporium cepa AJR318,501

[Juhasz et al., 2002]

Compuestos fenólicos

Funalia trogii (células vivas)

[Yesilda, Fiskin y Yesilda, 1995]

Lindano

R. arrhizus (células muertas)

[Young y Banks, 1998]

Compuestos fenólicos

Phanerochaete chrysosporium, A. niger, A. terreus, Geotrichum candidum (biomasa viva)

[Garcia et al., 2000]

Fuente: Rao y Viraraghavan, 2002, p. 166.

48

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

Por un lado, en estudios (Tsezos y Bell, 1989; Bell y Tsezos, 1987) sobre la adsorción y desorción de lindano, diazinon, pentaclorofenol y 2-clorobifenilo por células vivas y muertas del hongo Rhizopus arrhizus y lodos activados, se encontró que no se pudo hacer una generalización concerniente a la magnitud relativa de la toma biosorbida entre la biomasa viva y muerta. Para moléculas que no son fácilmente biodegradables, la toma por biomasa viva parece ser menor que por biomasa muerta, por ejemplo, el mecanismo de remoción dominante parece ser la adsorción física, la toma es rápida y el proceso parece ser completamente reversible.

Para moléculas más fácilmente degradables o que se adsorben fuertemente, se sugiere que ocurre lo contrario. La toma de células vivas y muertas se correlaciona similarmente con el coeficiente de partición octanol/agua de los contaminantes orgánicos adsorbidos físicamente. La desorción de los contaminantes orgánicos no siempre es completa. Una parte de la toma biosorbida observada puede atribuirse a las paredes celulares de la biomasa microbiana y a otros componentes celulares.

De otro lado, algunos investigadores (Young y Banks, 1998 citado por Aksu, 2005) han usado suspensión celular no viable (tratada por calor) del hongo Rhizoctonia oryzae, para la remoción de concentraciones bajas de lindano de soluciones acuosas en un sistema discontinuo. Los resultados indicaron que el mecanismo de adsorción fue por enlace físico de la molécula de lindano, cargada negativamente, con la pared celular fúngica, también cargada negativamente, en donde los iones de hidrógeno actúan como los ligandos puente.

Así mismo, se ha investigado sobre las características de biosorción del herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) en micelio fúngico liofilizado de Emericella nidulans, y Aspergillusnidulans, aislado a partir de paja de trigo compostada. Se observó una adsorción menor de 2,4-D (2.1 mg g-1 a una concentración inicial de 221 mg l-1 2,4-D), debido a las cargas negativas como resultado de la disociación del grupo carboxílico y de los efectos de repulsión electrostática a pH 6.0 (Benoit, Barriuso y Calvet, 1998 citado por Aksu, 2005).

Se ha reportado (Lièvremont, Seigle y Benoit, 1998 citado por Aksu, 2005) la remoción del fungicida pentacloronitrobenceno (PCNB), a partir de una solución acuosa por micelio fúngico muerto de Mucor racemosus, R. arrhizus y Sporothrix cyanescens; además, se comparó con la sorción de paredes celulares aisladas de estas tres cepas. Se indicó que la biosorción involucró la toma del compuesto por las paredes celulares y por otros componentes celulares. El tamaño de las células, la morfología y la composición química, así como el número de centros de adsorción activa y su distribución, pueden jugar un papel importante en determinar la capacidad de toma. La sorción del adsorbato también depende de su tamaño molecular y reactividad, así como de movilidad en la fase líquida.

En un estudio sobre la remoción de pentacloronitrobenceno (PCNB), a partir de soluciones acuosas por micelios fúngicos, en donde se comparó la adsorción del fungicida por la biomasa muerta de M. racemosus, R. arrhizus y S. cyanescens, con la sorción en paredes células aisladas de las tres cepas. La sorción del PCNB, por medio de las paredes celulares solas, fue menor y estadísticamente diferente de la sorción por micelios sometidos a autoclave, corroborando que la biosorción invo-

49

lucra la toma de los compuestos por las paredes celulares y por otros componentes celulares (Lièvremont, Seigle y Benoit, 1998).

A su vez, se investigó la biosorción de fenol y clorofenoles por pellets miceliales de Phanerochaete chrysosporium a partir de solución acuosa, encontrando que el orden de capacidad de sorción fue de menor a mayor, así: fenol, 2-clorofenol, 4-clorofenol y 2,4-diclorofenol; concordando con el orden de la solubilidad en agua y los coeficientes de partición octanol-agua.

Los resultados sugieren que la simple adsorción superficial puede no ser la responsable de la adsorción de compuestos fenólicos, lo que implica que se involucra, en gran medida, un particionamiento en los mecanismos de biosorción y que la hidrofobicidad puede gobernar la sorción de compuestos fenólicos por la biomasa miceliar fúngica (Wu y Yu, 2006).

Adicionalmente, se ha investigado la biosorción de 2,4-diclorofenol (2,4-DCP) desde una solución acuosa por biomasa inmovilizada (autoclavada) de P. chrysosporium en una columna de lecho fijo de flujo continuo, encontrando que la tasa del flujo, la concentración del afluente de 2,4-DCP y la profundidad del lecho fueron parámetros cruciales para la operación del lecho fijo. La matriz del hongo inmovilizado puede ser reutilizada en una operación continua para la remoción del 2,4-DCP de soluciones acuosas, usando agua destilada como solución de agotamiento (Wu y Yu, 2008).

Se ha reportado que el hongo Aspergillus niger es efectivo para tratar aguas residuales de textiles al remover el color, ya que adsorbe casi todos los tintes textiles en un efluente de la planta, sin producir ninguna enzima biodegradadora en el proceso; la tasa de decoloración es afectada por factores como el pH, tamaño del inóculo y concentración de glucosa, mientras que la presencia de algunas sales y nutrientes, no tienen mucho efecto en la remoción del color. La adsorción de la molécula de tinte en la superficie celular parece ser un proceso rápido que, por lo general, no toma más de 20 horas (Assadi y Jahangiri, 2001). También, se encontró que la biomasa de Aspergillus niger pretratada con ácido sulfúrico resultó efectiva en la remoción del fenol presente en solución acuosa a concentración de 1000 µg L-1.

Bajo condiciones discontinuas se consiguió el equilibrio a las 24 horas. La máxima remoción del fenol se obtuvo a un pH inicial de 5.1 (Rao y Viraraghavan, 2002).

Así mismo, el potencial del hongo Aspergillus niger y el alga Spirogyra sp. como biosorbente para la remoción del tinte reactivo Synazol de efluentes textiles multicomponentes ha sido evaluada, mostrando que su biomasa posee alta eficiencia de biosorción y estabilidad, permitiéndole ser usada nuevamente; y, en donde, para la biomasa autoclavada de estos se obtuvo una máxima remoción del tinte de 88% y 85%, respectivamente, a 30°C y pH 3, durante 18 horas de contacto (Mahmoud, 2008).

Por su parte, el compost fúngico gastado (SMC, sigla en inglés) es un subproducto de la producción comercial de hongos que se obtiene en grandes cantidades.

Algunos estudios indican que la utilización de SMC esterilizado, como medio de adsorción para la remoción de una mezcla de plaguicidas (carbaril, carbofuran y aldicarb), con un rango de concentración de 0-30 mg/L, es capaz de adsorber exitosamente los plaguicidas carbamatos a partir de soluciones acuosas. Las pruebas

50

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

de adsorción multi-plaguicida desplegaron las características de un comportamiento competitivo. La habilidad competitiva de estos tres plaguicidas en la adsorción multi-componente presentó un orden de mayor a menor, así: carbaril > carbofuran > aldicarb, dato consistente con la adsorbilidad de los plaguicidas (Kuo y Regan, 1999).

Se ha reportado que el Aspergillus nidulans se caracteriza por una rápida acumulación inicial de fenarimol (fungicida derivado de pirimidina), con subsiguiente excreción gradual. Mientras que la toma del compuesto parece ser resultado de un rápido y pasivo influjo, el eflujo es activo, señalando que el eflujo es inducible por fungicidas inhibidores de la biosíntesis de esteroles (Waard y Van, 1981).

Se ha reportado la actividad de Cladosporiumcepa AJR318, para sorberdiclorodifeniltricloroetano (DDT), diclorodifenildicloroetano (DDD) y diclorodifenildicloroetileno (DDE) del medio líquido, cuando el plaguicida se suministra en exceso de su solubilidad acuosa. Así mismo, esta cepa puede transformar el DDT durante periodos extendidos de incubación (12 días). La limitación para biosorber los organoclorados está relacionada con la baja solubilidad en el medio usado. El etanol y el 1-propanol (25%) incrementaron la solubilidad y biosorción del DDT; sin embargo, al incrementar la fracción volumétrica de los cosolventes (del 25% al 50%), el incremento en solubilidad del DDT no resulta en una mayor biosorción del DDT (Juhasz et al., 2002).

Por lo anterior, se puede pensar que la micobiorremediación de diferentes componentes residuales de los plaguicidas permite la profundización en la aplicación de estos microorganismos y sus enzimas, como alternativas ambientales efectivas, tomando fuerza en las investigaciones científicas en este campo.

6. Biorremediación de Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos por Hongos Lig nocelulósicos Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) están ampliamente distribuidos en el ambiente y se encuentran asociados con las actividades humanas, ya que se forman durante la combustión incompleta de materiales orgánicos, tales como carbón, petróleo, gasolina, leña y basura; también se encuentran en el petróleo crudo, en el alquitrán, creosota y asfalto, junto con algunos de sus derivados nitrados (Xu y Obbard, 2004). Debido a que estos compuestos son persistentes y se acumulan en plantas, peces e invertebrados terrestres y acuáticos, representan una amenaza tanto para la salud humana como para la de los ecosistemas donde se encuentran, dado que pueden ser absorbidos por inhalación, contacto dérmico o, con menor frecuencia, por ingestión directa, en tanto que las plantas pueden absorberlos a través de las raíces en suelos contaminados (Blanco et al., 2006).

Se considera que los PAHs son compuestos químicos orgánicos, constituidos por dos o más anillos aromáticos o bencénicos fusionados, muy estables y conformados por átomos de H y C (Jacques et al., 2008), con arreglos lineales, angulares y agrupados (Juhasz y Naidu, 2000). Estos se clasifican en moléculas de alto peso

51

molecular (HMW, sigla en inglés) y de bajo peso molecular (LMW, sigla en inglés) (Guo et al., 2010); señalando que los de alto peso molecular tienen de cuatro a cinco anillos aromáticos fusionados (Masaphy et al., 1999).

6.1 Generalidades de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PA Hs) De acuerdo con las evidencias históricas, el petróleo se formó a lo largo de millones de años gracias a la descomposición de especies vegetales y organismos marinos junto con la presión del subsuelo y las altas temperaturas. Los crudos de petróleo son mezclas complejas que contienen compuestos de hidrocarburos, cuyo aspecto y composición varían según los yacimientos y la composición, consistencia y color de los crudos de petróleo, el cual varía dependiendo de las proporciones de sus elementos, reportándose los siguientes porcentajes: hidrógeno (11% a 16%), carbono (83% a 87%) y azufre (4% +/-). Según las diferencias en composición, los crudos se clasifican en parafinados, naftenos, aromáticos o mixtos (Kraus, 2012).

Otra de las clasificaciones para los hidrocarburos y sus derivados según Ortuño (2010) es la siguiente: i. Hidrocarburos saturados Son también llamados alcanos, parafinas, hidrocarburos cíclicos saturados o cicloalcanos. Presentan una ciclación total o parcial de su esqueleto carbonado; el número de átomos presentes es variable, representan el 50 % del conjunto de los componentes del petróleo. La forma general de los cicloalcanos corresponde a CnH2n. En los cicloalcanos de 4 y 5 cadenas se encuentran los hidrocarburos que han conservado la estructura del material vivo original, siendo óptimos para ser usados como marcadores bioquímicos. ii. Hidrocarburos no saturados (alq uenos, naftenoaromáticos y aromáticos) Son hidrocarburos cíclicos poliinsaturados, presentes en los crudos de petróleo y en sus derivados en grandes cantidades. Su fórmula obedece a uno o varios ciclos con tres enlaces dobles conjugados. Los compuestos como el benceno, tolueno y los xilenos son los elementos representativos de esta familia de hidrocarburos por su alta demanda como materia prima. iii. Resinas y asfaltenos Son compuestos complejos, de peso molecular alto. Dentro de sus enlaces poseen elementos como el hidrogeno, oxígeno y azufre. Estos son los hidrocarburos más pesados dentro de la composición total de un crudo.

52

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

Puesto que los PAHs tienen propiedades tóxicas, carcinógenas, teratogénicas y mutagénicas, su característica recalcitrante es tema central de varias investigaciones ambientales a nivel mundial (Ambrosoli et al., 2005; Arun y Eyini, 2011; Chang, Lee y Chao, 2007; Chávez et al., 2003; Eggen y Majcherczyk, 1998; González et al., 2011). Diferentes estudios han establecido que métodos como la volatilización, fotólisis, oxidación química y adsorción son reacciones físicas y químicas costosas pero efectivas (Janbandhu y Fulekar, 2011). No obstante, la principal vía para su eliminación es la transformación y degradación microbiana, ya sea por vías aerobias (generando H2O o CO2) o por vías anaerobias (produciendo CH4) (Ambrosoli et al., 2005; Arun y Eyini, 2011; Haritash y Kaushik, 2009).

Por lo anterior, como herramienta para disminuir la existencia de PAHs en un ecosistema y, aprovechando la presencia de organismos capaces de crecer en ambientes contaminados, la biorremediación emplea a menudo microorganismos, plantas o sus productos para degradar, detoxificar o secuestrar químicos tóxicos presentes en aguas y suelos naturales (Arun y Eyini, 2011; Chang, Lee y Chao, 2007). Dentro de los microorganismos responsables de la degradación (mineralización) de PAHs se han reportado algas (Haritash y Kaushik, 2009), bacterias (Acuña et al., 2010; Ambrosoli et al., 2005; Arun y Eyini, 2011; Benavides et al., 2006; Chávez et al., 2003), y hongos lignolíticos y no lignolíticos (Arun y Eyini, 2011, Bettin et al., 2011; Chávez et al., 2003; Juhasz y Naidu, 2000), siendo estos últimos los empleados en micorremediación, por la similitud de la estructura química entre los PAHs y los sustratos naturales de crecimiento (Baldrian, 2008).

Dentro de los Basiodiomicetes lignolíticos se encuentran los hongos de pudrición blanca, descritos anteriormente en el punto 4. del presente capítulo, los cuales son los encargados de degradar la madera a través de la producción de oxidasas especiales o fenoloxidasas (Bettin et al., 2011; Córdova et al., 2011), es decir, enzimas extracelulares que degradan desde un primer paso inespecíficamente los polímeros de la lignina (Arun y Eyini, 2011), la celulosa y la hemicelulosa (Córdova et al., 2011).

Los hongos de la pudrición blanca de la madera o lingnolíticos más estudiados pertenecen al género Pleurotus, los cuales, además de su valor nutricional y propiedades terapéuticas, proyectan gran potencial en las aplicaciones ambientales y biotecnológicas (Bettin et al., 2011). Adicionalmente, para otros géneros como Phanerochaete, Bjerkandera, Trametes (Eggen y Majcherczyk, 1998) y hongos microscópicos del género Trichocladium, Fusarium, Verticillium y Acremonium (Haritash y Kaushik, 2009), Penicillium, Cunnighamella y Aspergillus, se ha reportado degradación de PAHs en diferentes ecosistemas, evidenciando reacciones de cometabolismo en cultivo líquido para los últimos tres géneros (Chávez et al., 2003).

Con respecto a los hongos del género Pleurotus, varias especies han sido reportadas como responsables de la degradación de PAHs y bifenilos clorados en fermentación en estado sólido (SSF) y líquido. Estas especies expresan el sistema lignolítico durante la fase de crecimiento y su concentración de enzimas lignolíticas no está inhibida por altas concentraciones de nitrógeno (Rodríguez et al., 2004).

Tanto en SSF como en líquida, los géneros Pleurotus sp. han secretado versatil-peroxidasa (VP), lacasa y aril-alcohol oxidasa (AAO), siendo la primera un tipo nuevo

53

de peroxidasa que oxida compuestos aromáticos fenólicos y no fenólicos o bien como Mn2+ a Mn3+, el cual actúa como agente oxidante difusible; identificándose por primera vez en Pleurotus eryngii (Rodríguez et al., 2004).

Cabe anotar que México ha sido uno de los países de América que más ha trabajado en la evaluación de los hongos del género Pleurotus en la degradación de compuestos tipo crudo, destacando los experimentos realizados por Déley (2010), en donde, utilizando muestras inoculadas con el hongo sobre sustrato contaminado con hidrocarburos totales de petróleo (TPH), se evidenció una disminución entre 94,5% - 97,5% de TPH, reportando eficiencias en degradación de 96% - 98% en dos meses.

En contraste con estos resultados, en el año 2012 RELBAA (Revista Latinoamericana de biotecnología Ambiental y Algal de México) presentó resultados de trabajos en laboratorio, en los cuáles la degradación de crudo total (TPH) por Pleurotus ostreatus y otros hongos alcanzaron porcentajes alrededor del 50%. Los resultados de degradación no solo se limitan a TPH; también se muestra evidencia de degradación de compuestos específicos con hidrocarburos saturados, con una tasa de degradación del 82% en periodos de 90 días y degradación de compuestos aromáticos con tasas del 100%. Varios autores sugieren que la capacidad del P. ostreatus de actuar como biodegradador de hidrocarburos es proporcionada por la actividad lacasa, sobre todo al inicio del proceso de degradación.

Por su parte, Rodríguez y colaboradores (2004) evaluaron la transformación y degradación de 2,4-diclorofenol (2,4-DCP) y benzopireno(BaP) en cultivos líquidos y en fermentación en estado sólido (SSF) y líquido, respectivamente, empleando inicialmente cometabolismo con una fuente alternativa de carbono; para lo cual, evaluaron cuatro especies de hongos: Pleurotus eryngii, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius y Pleurotus sajorcaju. Adicionalmente, evaluaron el efecto de mediadores tales como 2,2’-azino-bis (ácido 3-metil benzotiazol-6-sulfhidrico) (ABTS) y 1-hidroxibenzotriazol (HBT) que pudieran aumentar la mineralización de 2,4-DCP y BaP mediante la enzima lacasa de Pleurotus eryngii, como también la mineralización de estos hidrocarburos por la VP y adición de Mn2+.

En términos generales, encontraron que hay una biodegradación diferencial de los hidrocarburos por parte de los cuatro hongos, en donde Pleurotus eryngii tuvo la mayor tasa de degradación. Finalmente, se evidenció que el Mn2+ se comportó más como un inhibidor competitivo que como un mediador oxidativo. De esta manera se pudo demostrar la aplicación satisfactoria de varios hongos del género Pleurotus en procesos de biorremediación. Sin embargo, es importante identificar las sustancias que no necesariamente se comportan como mediadores y sí pueden representar una competencia para la enzima VP. Los aportes obtenidos con el género Pleurotus en la degradación de compuestos complejos muestra que la eficiencia de este método de biorremediación son prometedores.

Igualmente, se debe considerar que existen dos procesos que incrementan la actividad de los microorganismos en la biorremediación: la bioestimulación y la bioaumentación. La primera involucra la adición de nutrientes y/o un aceptor final de electrones para incrementar la actividad escasa de las poblaciones microbianas locales; y la segunda hace referencia a la adición de cepas microbianas externas, las cuales tienen la capacidad de degradar moléculas tóxicas blanco (Li., y Chen., 2009).

54

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

En este orden de ideas, los residuos de los hongos (SMC) de la industria de los champiñones comestibles (Agaricus sp. y Pleurotus sp.) son reservorio de varias enzimas como: proteasas, celulasas, hemicelulasas, lignina peroxidasa, manganeso peroxidasas, y lacasas. Este SMC se ha evaluado para bioaumentar el efecto de degradación de PAHs a través de diferentes consorcios microbianos (Chiu, Gao, Chan, Ho. 2009).

No obstante, las técnicas de biorremediación se pueden optimizar al bioaumentar los procesos sinérgicos entre microorganismos y residuos de los sustratos de crecimiento (SMC) de los hongos de pudrición blanca. Al respecto, Law et al.

(2003) evaluaron in vitro, en un sistema de agua, el efecto del sustrato de crecimiento de los hongos en la remoción de pentaclorofenol (PCP). Si bien no es un PAH, presenta la estructura bencénica recalcitrante, evidenciando la bioabsorción, degradación y remoción de compuestos contaminantes.

En los estudios de bioestimulación y bioaumentación, se han evaluado como bioestimulantes el compost y alimentos para conejo, y como bioaumentador al hongo de pudrición blanca Trametes versicolor en un experimento ex situ para medir la biorremediación de suelos contaminados por PAHs. Lo anterior demostró que no necesariamente el hongo de pudrición blanca es el único responsable de la degradación de PAHs, ni tampoco un aditamento específico como co-sustrato. A pesar de que los resultados evidenciaron que la actividad enzimática es directamente proporcional a la temperatura, existe la posibilidad de volatilización y mineralización de PAHs sin garantizar una biorremediación. Finalmente, en este estudio, se evidenció la degradación de PAHs, pero principalmente por los microorganismos locales del co-sustrato, evidenciando la actividad co-metabolica del hongo y los microrganismos presentes en el medio (Sayara et al., 2011).

Dentro de la micorremediación cabe destacar la acción de hongos microscópicos, como los hongos filamentosos y levaduras: Rhodotorula glutinis, Rhodotorula minuta, Fusarium solani, Cylindrocarpon didymium y Penicillium variabile. Según Romero et al. (2002), evaluaciones del pireno permitieron reportar que el uso de glucosa como recurso alternativo de carbono genera un cometabolismo del hidrocarburo, aumentando los porcentajes de consumo. De esta manera se confirma la hipótesis en la cual el condicionamiento de la fuente de carbono como PAH pireno incentiva la activación enzimática de estos hongos.

En términos generales, a manera de conclusión, los autores del presente capítulo podemos afirmar que cuando se habla de la huella generada por el petróleo sobre la biosfera, se piensa en los impactos directos sobre los ecosistemas; si bien es un problema, inicialmente, biofísico, se debe considerar como un problema de tipo ambiental, entendiendo la problemática como el conjunto de factores bióticos, económicos y sociales. La contaminación de ecosistemas da inicio a una secuencia de impactos indirectos no solo en los sistemas bióticos cercanos al foco de contaminación, sino también sobre los habitantes que puedan depender de estos nichos. Ante esta situación, la biorremediación ha surgido como una alternativa sustentable debido a su carácter de proceso limpio, económico y efectivo.

Los retos de la biorremediación como una técnica sencilla, aliada a los procesos de recuperación del ambiente de forma natural sin afectar al medio, busca como objetivo

55

la identificación de consorcios de organismos degradadores, lo que permite un estudio profundo sobre su metabolismo y la repercusión en la cadena degradadora de estos compuestos. En el ámbito social, se puede hablar de una reducción de suelos y aguas contaminadas, mejorando las condiciones para su uso agrícola e industrial.

De acuerdo con lo anterior, en el momento de aplicar técnicas de biorremediación es importante contemplar las diferentes variables que permitan optimizar los procesos de mineralización, identificando las reacciones sinérgicas que promuevan la reintegración de los elementos a los ciclos biogeoquímicos de la naturaleza.

Bibliog raf ía Abaidoo, R. C., Keraita, B., Dissanayake, P., y Maxwell, A. (2010). Soil and Crop Contamination Through Wastewater Irrigation and Options for Risk Reduction in Developing Countries. Soil Biology and Agriculture in the Tropics, 21, 275-297. DOI: 10.1007/978-3-642-05076-3_13 Acuña, A., Pucci, G., Morales, M. J., Pucci O. (2010). Biodegradación de petróleo y sus derivados por la comunidad bacteriana en un suelo de la Patagonia Argentina. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología, 30(1), 29-36.

Akdogan, H. y Pazarlioglu, N. (2011). Fluorene biodegradation by P. ostreatus – Part I: Biodegradation by free cells. Process Biochemistry, 46(4), 834–839. DOI: 10.1016/j. procbio.2010.12.011.

Aksu, Z. (2005). Application of biosorption for the removal of organic pollutants: a review. Process Biochemistry, 40(3-4), 997-1026. DOI: 10.1016/j.procbio.2004.04.008.

Ambrosoli, R., Petruzzelli, L., Minati J. L., Marsan, F. A. (2005). Anaerobic PAH degradation in soil by a mixed bacterial consortium under denitrifying conditions. Chemosphere, 60(9), 1231–1236. DOI: 10.1016/j.chemosphere.2005.02.030.

Anastasi, A., Tigini, V., y Varese, G. C. (2013). The Bioremediation Potential of Different Ecophysiological Groups of Fungi. En: Goltapeh, E. M., Danesh, Y. R. y Varma, A. (Eds.).

Fungi as Bioremediators (cap. 2, pp. 29-49), Soil Biology 32, Heidelberg, Berlin: SpringerVerlag Berlin Heidelberg.

Arun, A., y Eyini, M. (2011). Comparative studies on lignin and polycyclic aromatic hydrocarbons degradation by basidiomycetes fungi. Bioresource Technology, 102(17), 80638070. DOI: 10.1016/j.biortech.2011.05.077.

Arunachalam, K., y Lakshmanan, M. (1988). Microbial uptake and accumulation of (14C carbofuran) 1,3-dihydro-2,2-dimethyl-7 benzofuranylmethyl carbamate in twenty fungal strains isolated by miniecosystem studies. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 41(1), 127-134.

Assadi, M. M., y Jahangiri, M. R. (2001). Textile wastewater treatment by Aspergillus niger. Desalination, 141(1), 1-6. DOI:10.1016/S0011-9164(01)00383-6.

Baldrian, P. (2008). Wood-inhabiting ligninolytic basidiomycetes in soils: Ecology and constraints for applicability in bioremediation. Fungal Ecology, 1(1), 4-12. DOI: 10.1016/j. funeco.2008.02.001.

56

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

Banat, I. M., Nigam, P., Singh, D., Marchant, R. (1996). Microbial Decolorization of Textile Dyecontaining Effluents: A Review. Bioresource Technology, 58(3) 217-227. DOI: 10.1016/S0960-8524(96)00113-7.

Barr. D. P., y Aust, S. D. (1994). Mechanisms white-rot fungi use to degrade pollutants.

Environmental Science and Technology, 28(2), 78A-87A. En: Demain, A. L., Davies, J. E., y Baltz, R. H. (Eds.). Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (pp. 666-681).

Segunda edición, Washington D.C., Estados Unidos: SM Press.

Bell, J. P., y Tsezos, M. (1987). Removal of hazardous organic pollutants by biomass adsorption. Journal WPCF, 59(4), 191-198.

Benavides-López, J., Quintero, G., Guevara-Vizcaíno, A. L., Jaimes, D. C., Gutiérrez, S.M., y Miranda-García, J. (2006). Bioremediación de suelos contaminados con hidrocarburos derivados del petróleo. NOVA, 4(5), 1-116.

Benoit, P., Barriuso, E., y Calvet, R. (1998). Biosorption characterization of herbicides, 2,4-D and atrazine, and two chlorophenols on fungal mycelium. Chemosphere, 37(7), 1271-1282. DOI: 10.1016/S0045-6535(98)00125-8.

Bettin, F., Osório da Rosa, L., Montanari, Q., Calloni R., Aparecida-Gaio T., Malvessi E., Moura da Silveira M., Pinheiro-Dillon A. J. (2011). Growth kinetics, production, and characterization of extracellular laccases from Pleurotus sajor-caju PS-2001. Process Biochemistry, 46(3), 758–764. DOI: 10.1016/j.procbio.2010.12.0022.

Bezalel, L., Hadar, Y., y Cerniglia, C. E. (1997). Enzymatic mechanisms involved in phenanthrene degradation by the white rot fungus Pleurotus ostreatus. Applied and Environmental Microbiology, 63(7), 2495-2501.

Blanco, P., Galeano, D., Quiroga, I., y Herrera, L. (2006). Degradación de Hidrocarburos Aromáticos por Basidiomycetes (Phanerochaete Chrysosporium) (revisión). Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Microbiología Industrial, Bogotá, Colombia.

Bumpus, J. A., Tien, M., Wright, D., y Aust, S. D. (1985). Oxidation of persistent environmental pollutants by a white rot fungus. Science, 228(4706), 1434-1436. DOI: 10.1126/science.3925550.

Casillas, R. P., Crow, S. A., Heinze, T. M., Deck, J., y Cerniglia, C.E. (1996). Initial oxidative and subsequent conjugative metabolites produced during the metabolism of phenanthrene by fungi. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 16(4), 205-215.

Castanera, R. (2011). Estudio de la variación en los niveles de transcripción de genes de enzimas degradadoras de lignina en cultivos sólidos y sumergidos de Pleurotus ostreatus (tesis de maestría). Universidad de Navarra, Pamplona, España. Recuperado de: http:// academica-e.unavarra.es/bitstream/handle/2454/5004/ESTUDIO%20DE%20LA%20 VARIACI%C3%93N%20EN%20LOS%20NIVELES%20DE%20TRANSCRIPCI%C3%93N%20 DE%20G.pdf?sequence=1.

Cerniglia, C. E., Freeman, J. P., y Mitchum, R. K. (1982). Glucuronide and sulfate conjugation in the fungal metabolism of aromatic hydrocarbons. Applied and Environmental Microbiology, 43(5), 1070-1075.

Chang, Y. T., Lee, J. F., Chao, H. P. (2007). Variability of communities and physiological characteristics between free-living bacteria and attached bacteria during the PAH biodegradation in a soil/water system. European Journal of Soil Biology, 43(5-6), 283-296. DOI: 10.1016/j.ejsobi.2007.02.012.

57

Chávez-Gómez B., Quintero R., Esparza-García F., Mesta-Howard A. M., ZavalaDíaz de la Serna, F. J., Hernández-Rodríguez, C. H., Gillén, T., Poggi-Varaldo, H. M., Barrera-Cortés, J., Rodríguez-Vázquez, R. Cáceres R. (2003). Removal of phenanthrene from soil by co-cultures of bacteria and fungi pregrown on sugarcane bagasse pith.

Bioresource Technology, 89(2), 177–183. DOI: 10.1016/S0960-8524(03)00037-3.

Chiu, S.W., Gao, T., Chan, C. S., Ho, C. K. (2009). Removal of spilled petroleum in industrial soils by spent compost of mushroom Pleurotus pulmonarius. Chemosphere, 75(6), 837-842. DOI: 10.1016/j.chemosphere.2008.12.044 Córdova-Juárez, R. A., Gordillo-Dorry, L. L., Bello-Mendoza, R., y Sánchez, J. E. (2011). Use of spent substrate after Pleurotus pulmonarius cultivation for the treatment of chlorothalonil containing wastewater. Journal of Environmental Management, 92(3), 948952. DOI: 10.1016/j.jenvman.2010.10.047.

Dávila, G., y Vázquez-Duhalt, R. (2006). Enzimas ligninolíticas fúngicas para fines ambientales. Mensaje Bioquímico, XXX. Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Medicina, Instituto de Biotecnología.

Déley, Z. A. R. (2010). Biorremedación de suelos contaminados con hidrocarburos derivados del petróleo del campamento Sacha 161 utilizando el hongo Pleurotus ostreatus (tesis de grado). Escuela Superior Politécnica de Chimborazo. Ecuador.

Díaz-Godínez, R. (2009). Efecto del pH inicial de desarrollo de pleurotus ostreatus en fermentación sumergida sobre su actividad de lacasas (tesis de maestría). Instituto Politécnico Nacional, Tepetitla de Lardizábal Tlaxcala, México.

Dowd, A. C., Buckley, C. M., y Sheehan, D. (1997). Glutathione S-transferases from the white-rot fungus, Phanerochaete chrysosporium. Biochemical Journal, 324(1), 243-248.

Duarte-Puentes, A. M. (2004). Evaluación de la producción de enzimas lignolíticas por hongos de pudrición blanca en fermentación semisólida, utilizando desechos agroindustriales como sustrato (tesis de maestría). Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia.

Duffus, J. H., Nordberg, M., y Templeton, D. M. (2007). IUPAC Glossary of terms used in toxicology,2nd edition - IUPAC recommendations 2007. Pure and Applied Chemistry, 79(7), 1153-1344. Recuperado de: http://sis.nlm.nih.gov/enviro/iupacglossary/frontmatter.html Eggen, T., y Majcherczyk, A. (1998). Removal of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in contaminated soil by white rot fungus Pleurotus ostreatus. International Biodeterioration & Biodegradation, 41(2), 111-117. DOI: 10.1016/S0964-8305(98)00002-X. Eilers, A., Rüngeling, E., Stündl, U. M., y Gottschalk, G. (1999). Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by the white-rot fungus Bjerkandera adusta DSM 3375 depends on cytochrome P-450. Applied Microbiology and Biotechnology, 53(1), 75-80.

Erkurt, E. A., Erkurt, H. A., y Unyayar, A. (2010). Decolorization of azo dyes by white rot fungi. Biodegradation Azo Dyes. En: Barcelo, D. y Kostiano, A. G. The Handbook of Environmental Chemistry 9 (pp. 157-167). Heidelberg, Berlin: Springer-Verlag Berlin Heidelberg Fernández, S. (2012). Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos pesados y caracterización de comunidades microbianas implicadas (tesis de doctorado).

Universidad de Barcelona, España.

58

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

García-García, I., Jiménez-Peña, P. R., Bonilla-Venceslada, J. L., Martín-Martín, A., Martin-Santos, M. A. y Ramos-Gómez, E. (2000). Removal of phenol from olive mill wastewater using Phanerochaete chrysosporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Geotrichum candidum. Process Biochemistry, 35(8), 751-758. DOI: 10.1016/ S0032-9592(99)00135-1.

Göhre, V., y Paszokowski, U. (2006). Contribution of the arbuscular mycorrhizal symbiosis to heavy metal phytoremediation. Planta, 223(6), 1115-1122. DOI: 10.1007/ s00425-006-0225-0.

González, N., Simarro, R., Molina, M. C., Bautista, L. F., Delgado, L., y Villa, J. A. (2011). Effect of surfactants on PAH biodegradation by a bacterial consortium and on the dynamics of the bacterial community during the process. Bioresource Technology, 102(20), 9438-9446. DOI: 10.1016/j.biortech.2011.07.066.

Guo, C., Dang, Z., Wong, Y., y Tam N. F. (2010). Biodegradation ability and dioxgenase genes of PAH-degrading Sphingomonas and Mycobacterium strains isolated from mangrove sediments. International Biodeterioration & Biodegradation, 64(6), 419-426. DOI: 10.1016/j.ibiod.2010.04.008.

Hammel, K. E. (1996). Extracellular free radical biochemistry of ligninolitic fungi. New Journal of Chemistry, 20(2), 195-198.

Hara, E., y Uchiyama, H. (2013). Degradation of Petroleum Pollutant Materials by Fungi. En: Goltapeh, E. M., Danesh, Y. R. y Varma, A. (Eds.). Fungi as Bioremediators (cap.

5, pp. 117-133), Soil Biology 32, Heidelberg, Berlin: Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

Haritash, A. K., y Kaushik, C. P. (2009). Biodegradation aspects of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs): A review. Journal of Hazardous Materials, 169(1-3), 1-15. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2009.03.137.

Harshavardhan, D., Ranajit, C., y Jaqjit, S. Y. (2005). Genome-wide structural and evolutionary analysis of the P450 monooxygenase genes (P450ome) in the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium: evidence for gene duplications and extensive gene clustering. BMC Genomics, 6, 1-24.

Hiratsuka, N., Wariishi, H., y Tanaka, H. (2001). Degradation of diphenyl ether herbicides by the lignin-degrading basidiomycete Coriolus versicolor. Applied Microbiology and Biotechnology, 57(4), 563-571. DOI: 10.1007/s002530100789.

Hussain, S., Siddique, T., Arshad, M., y Saleem, M. (2009). Bioremediation and phytoremediation of pesticides: Recent advances. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 39(10), 843-907. DOI: 10.1080/10643380801910090.

Ichinose, H., Wariishi, H., y Tanaka, H. (2002). Identification and characterization of novel cytochrome P450 genes from the white-rot basidiomycete, Coriolus versicolor. Applied Microbiology and Biotechnology, 58(1), 97-105. DOI: 10.1007/s00253-001-0868-5.

Iyengar, L., y Prabhakararao, A. V. S. (1973). Metabolism of chlorodane and heptachlor

by Aspergillus niger. Journal of General and Applied Microbiology, 19(4), 321-324. DOI: 10.2323/jgam.19.321.

Jacques, R. J. S., Okeke, B. C., Bento, F. M., Teixeira, A. S., Peralba, M. C. R., y Camargo, F. A. O. (2008). Microbial consortium bioaugmentation of a polycyclic aromatic hydrocarbons contaminated soil. Bioresource Technology, 99(7), 2637-2643. DOI: 10.1016/j.biortech.2007.04.0477.

59

Janbandhu, A., y Fulekar, M. H. (2011). Biodegradation of Phenanthrene using adapted microbial consortium isolated from petrochemical contaminated environment. Journal of Hazard Materials, 187(1-3), 333-340. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2011.01.034.

Jerina, D. M. (1983). Metabolism of aromatic hydrocarbons by the cytochrome P-450 system and epoxide hydrolase. Drug Metabolism and Disposition, 11, 1-4.

Juhasz, A. L., Smith, E., Smith, J. y Naidu, R. (2002). Biosorption of organochlorine pesticides using fungal biomass. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 29(4), 163-169.

Juhasz, A. L., y Naidu, R. (2000). Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of PAHs. International Biodeterioration & Biodegradation, 45(1-2), 57-88. DOI: 10.1016/S0964-8305(00)00052-4.

Juwarkar, A. A., Singh, S. K., y Mudhoo, A. (2010). A comprehensive overview of elements in bioremedition. Reviews in Environmental Science and Biotechnology, 9(3), 215-288.

Khan, S. U. (1980). Pesticides in the soil environment. En: Fundamental aspects of pollutions control and environmental science, Wakeman, R. (Ed.), Amsterdam, Oxford, New York: Elsevier Scientific Publishing Company.

Kraus, R. (2012). Petróleo: Pospección y perforación. En: Stellman, J. Enciclopedia de salud y seguridad en el trabajo (p.75). Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales. Madrid, España.

Kuhad, R. C., Singh, A., y Eriksson, K. E. L. (1997). Microorganisms and enzymes involved in the degradation of plant fiber cell walls. En Eriksson K, Babel W, Blanch H., Cooney Ch., Enfors O., Fiechter A., Klibanov A., Mattiasson B., Primrose S. Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany. Pp. 45-125 Kullman, S. W., y Matsumura, F. (1996). Metabolic pathways utilized by Phanerochaete chrysosporium for degradation of the cyclodiene pesticide endosulfan. Applied and Environmental Microbiology, 62(2), 593-600.

Kullman, S. W., y Matsumura, F. (1997). Identification of a novel cytochrome P-450 gene from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology, 63(7), 2741-2746.

Kuo, W. S., y Regan, R. W. (1999). Removal of pesticides from rinsate by adsorption using agricultural residuals as medium. Journal of Environmental Science and Health, Part B: Pesticides, food contaminants, and agricultural wastes, 34(3), 431-447. DOI: 10.1080/03601239909373207.

Law, W. M., Lau, W. N., Lo K. L., Wai L. M., y Chiu, S. W. (2003). Removal of biocide pentachlorophenol in water system by the spent mushroom compost of Pleurotus pulmonarius. Chemosphere, 52(9), 1531-1537. DOI: 10.1016/S0045-6535(03)00492-2.

Lewis, D. F. (2001). COMPACT: a structural approach to the modelling of cytochromes P450 and their interactions with xenobiotics. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 76(3), 237-244. DOI: 10.1002/jctb.363.

Li, J. L., y Chen, B. H. (2009). Surfactant-mediated Biodegradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Materials, 2(1), 76-94. DOI: 10.3390/ma20100766.

Lièvremont, D., Seigle-Murandi, F., y Benoit-Guyos, J. L. (1998). Removal of PCNB from aqueous solution by a fungal adsorption process. Water Research, 32(12), 36013606. DOI: 10.1016/S0043-1354(98)00132-8.

60

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIÓN

Lládo, S. (2012). Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos pesados y caracterización de poblaciones microbianas implicadas (tesis de doctorado). Universidad de Barcelona, España.

Lodolo, A., Gonzalez-Valencia, E., y Miertus, S. (2001). Overview of remediation technologies for persistent toxic substances. Arh Hig Rada Toksikol, 52, 253-280.

Mahmoud, A. K. (2008). Biosorption of reactive dye from textile wastewater by non-viable biomass of Aspergillus niger and Spirogyra sp. Bioresource Technology, 99(14), 66316634. DOI: 10.1016/j.biortech.2007.12.010.

Masaphy, S., Lamb, D. C., Kelly, S. L. (1999). Purification and Characterization of a Benzo[a]pyrene Hydroxylase from Pleurotus pulmonarius. Biochemical and Biophysical Research Communications, 266(2), 326–329.

Masaphy, S., Levanon, D., Henis, Y. (1996a). Manganese-enhanced biotransformation of atrazine by the white rot fungus Pleurotus pulmonarius and its correlation with oxidation activity. Applied and Environmental Microbiology, 62(10), 3587-3593.

Masaphy, S., Levanon, D., Henis, Y., Venkateswarlu, K., y Kelly, S. L. (1996b).

Evidence for cytochrome P-450 and P-450-mediated benzo(a)pyrene hydroxylation in the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. FEMS Microbiology Letters, 135(1), 51-55.

DOI: 10.1111/j.1574-6968.1996.tb07965.x.

Mazmanci, M. A. (2010). Decolorization of Azo Dyes by Immobilized Fungi.

Biodegradation Azo Dyes. En: Barcelo, D. y Kostiano, A. G. The Handbook of Environmental Chemistry 9 (pp. 169-181). Heidelberg, Berlin: Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

Mendieta, E. H., Sánchez, D. G., Martínez, V. L., Tejacal, I. A., Rodríguez, M. A., Torres, O. G. V., Fernández, E. M., Lara, M. H., y Miranda, A. S. (2013). Identificación del agente causal de la pudrición blanca en Morelos, México. XV (104).

Mendoza, G. (2012). Estudio de enzimas ligninolíticas producidas por pleurotus ostreatus y lentinula edodes usando diferentes inductores (tesis de maestría). Universidad Autónoma de Madrid, España.

Moreno, N., y Ospina, X. A. (2008). Evaluación de inductores y co-sustratos para la remoción de negro reactivo 5 empleando Pleurotus ostreatus, inmovilizado en fique (tesis de pregrado). Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.

Mougin, C., Pericaud, C., Malosse, C., Laugero, C., y Asther, M. (1996).

Biotransformation of the insecticide lindane by the white rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Pest Management Science, 47(1), 51-59. DOI: 10.1002/ (SICI)1096-9063(199605)47:1<51::AID-PS391>3.0.CO;2-V. Ortuño, S. (2010). El mundo del petróleo: origen, usos y escenarios. México: Fondo de Cultura Económica (FCE).

Pakdaman, B., Goltapeh, E. M., Danesh, Y. R. y Varma, A. (2013). An Introduction to Bioremediation. En: Goltapeh, E. M., Danesh, Y. R. y Varma, A. (Eds.). Fungi as Bioremediators (cap. 1, pp. 3-27), Soil Biology 32, Heidelberg, Berlin: Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

Paris, D. F., Lewis, D. L., y Barnett, J. T. (1977). Bioconcentration of toxaphene by microorganisms. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 17(5), 564-572.

Paris, D. F., y Lewis, D. L. (1976). Accumulation of methoxychlor by microorganisms isolated from aqueous systems. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 15(1), 24-31.

Piškur, B., Humar, M., Ulčnik, A., Jurc, D., y Pohleven, F. (2013) Fungal wood decay processes as a basis for bioremediation. En: Goltapeh, E. M., Danesh, Y. R. y Varma, A. (Eds.).

61

Fungi as Bioremediators (cap. 3, pp. 51-74), Soil Biology 32, Heidelberg, Berlin: SpringerVerlag Berlin Heidelberg.

Quintero, D. J. C. (2011). Revisión: Degradación de plaguicidas mediante hongos de la pudrición blanca de la madera. Revista Facultad Nacional de Agronomía – Medellín, 64(1), 5867-5882.

Rao, J. R., y Viraraghavan, T. (2002). Biosorption of phenol from an aqueous solution by Aspergillus niger biomass. Bioresource Technology, 85(2),165-171. DOI: 10.1016/ S0960-8524(02)00079-2 Reddy, G. V. B., Gelpke, M. D. S., y Gold, M. H. (1998). Degradation of 2,4,6-trichlorophenol by Phanerochaete chrysosporium: Involvement of reductive dechlorination.

Journal of Bacteriology, 180(19), 5159-5164.

Reddy, G. V. B., y Gold, M. H. (1999). A two-component tetrachlorohydroquinone reductive dehalogenase system from the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Biochemical and Biophysical Research Communications, 257(3), 901-905.

Reddy, G. V. B., y Gold, M. H. (2001). Purification and characterization of glutathione conjugate reductase: a component of the tetrachlorohydroquinone reductive dehalogenase system from Phanerochaete chrysosporium. Archives of Biochemistry and Biophysics, 391(2), 271-277.

Rodríguez, E., Nuero O., Guillén, F., Martínez, A. T., Martínez, y M. J. (2004).

Degradation of phenolic and non-phenolic aromatic pollutants by four Pleurotus species: the role of laccase and versatile peroxidase. Soil Biology & Biochemistry, 36(6), 909-916.

DOI: 10.1016/j.soilbio.2004.02.005.

Romero, M. C., Salvioli, M. L., Cazau, M. C., y Arambarri, A. M. (2002). Pyrene degradation by yeasts and filamentous fungi. Environmental Pollution, 117(1), 159-163.

Rosales, L. (2008). Biorremediación de suelos contaminados con aceite usado de automóvil con el hongo de la pudrición blanca Pleorotus ostrestus (Setas) en Durango (tesis de maestría). Instituto Politécnico Nacional y Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Durango, México.

Sariaslani, F. S. (1991). Microbial cytochromes P-450 and xenobiotic metabolism.

Advances in Applied Microbiology, 36, 133-178. DOI: 10.1016/S0065-2164(08)70453-2.

Sayara, T., Borràs, E., Caminal, G., Sarrà, M., y Sánchez, A. (2011). Bioremediation of PAHs-contaminated soil through composting: Influence of bioaugmentation and biostimulation on contaminant biodegradation. International Biodeterioration & Biodegradation, 65(6), 859-865. DOI: 10.1016/j.ibiod.2011.05.006.

Subhani, A., El-ghamry, A. M., Changyong, H., y Jianming, X. (2000). Effects of pesticide (herbicides) on soil microbial biomass - A review. Pakistan Journal of Biological Sciences, 3(5), 705-709.

Sutherland, J. B. (1992). Detoxification of polycyclic aromatic hydrocarbons by fungi. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 9(1), 53-61. DOI: 10.1007/BF01576368.

Tian, J., Fan, M., Guo, J. Marschner, P., Li, X., y Kuzykov, Y. (2012). Effects of land use intensity on dissolved organic carbon properties and microbial community structure.

European Journal of Soil Biology, 52(0), 67-72. DOI: 10.1016/j.ejsobi.2012.07.002.

Tsezos, M., y Bell, J. P. (1989). Comparison of the biosorption and desorption of hazardous organic pollutants by live and dead biomass. Water Research, 23(5), 561-568.

62

ASPECTOS GENERALES EN MICORREMEDIACIĂ&#x201C;N

Tsezos, M., y Seto, W. (1928). The adsorption of chloroethanes on microbial biomass.

Water Research, 20(7), 851-858.

Urlacher, V. B., y Eiben, S. (2006). Cytochrome P450 monooxygenases: perspectives for synthetic application. Trends in Biotechnology, 24(7), 324-330. DOI: 10.1016/j. tibtech.2006.05.002.

Urlacher, V.B. and S. Eiben. (2006). Cytochrome P450 monooxygenases: perspectives for Waard, M. A., y Van Nistelrooy, J. G. M. (1981). Induction of Fenarimol-efflux activity in aspergillus nidulans by fungicides inhibiting sterol biosynthesis. Journal of General Microbiology, 126(2), 483-489. DOI: 10.1099/00221287-126-2-483.

Wu, J., y Yu, H. Q. (2006). Biosorption of 2,4-dichlorophenol from aqueous solution by Phanerochaete chrysosporium biomass: Isotherms, kinetics and thermodynamics. Journal of Hazardous Materials, 137(1), 498-508. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2006.02.026.

Wu, J., y Yu, H. Q. (2008). Biosorption of 2,4-dichlorophenol from aqueous solutions by immobilized Phanerochaete chrysosporium biomass in a fixed-bed column. Chemical Engineering Journal, 138(1-3), 128-135.

Xu, R., y Obbard, P. (2004). Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in oil- contaminated beach sediments treated whit nutrient amendments. Journal of Environmental Quality, 33(3), 861-867. DOI: 10.2134/jeq2004.0861.

Yesilda, O., Fiskin, K., y Yesilda, E. (1995). The use of white rot fungus Funalia trogii (malatya) for the decolonization and phenol removal from olive mill wastewater.

Environmental Technology, 16(1), 95-100.

Young, E., y Banks, C. J. (1998). The removal of lindane from aqueous solution using a fungal biosorbent: the influence of pH, temperature, biomass concentration and culture age. Environmental Technology, 19(6), 619-625. DOI: 10.1080/09593331908616718.

63

64

3 HA LÓFILOS Y TERMÓFILOS,

ECOLOGÍA

Y A PLICACIONES

65

Leal, María1 Pérez, Cristian2 Méndez, Yael3

1 Bióloga. Universidad Nacional de Colombia.

Coordinadora Grupo de Astrobiología Universidad Nacional de Colombia-UNASB. 2 Biólogo. Universidad Nacional de Colombia.

3 Microbióloga. Universidad de los Andes.

HALÓFILOS Y TERMÓFILOS, ECOLOGÍA Y APLICACIONES

1. Introducción Cuando se hace referencia a un ambiente extremo, su significado es realmente sesgado; esto, considerando que la definición del mismo se basa en un concepto meramente antropocéntrico, debido a que se toman como valores ambientales de referencia los óptimos para el ser humano; y todos aquellos valores en temperatura, presión, salinidad, disponibilidad de agua y demás factores ambientales que se encuentren alejados de dichos óptimos son los que permitirán considerar un ambiente como extremo (Canganella y Wiegel, 2011). Como es de suponer, existen organismos adaptados que, adicionalmente, necesitan dichas condiciones extremas, es sobre algunos de estos que se abordará el presente capítulo.

A partir de los estudios realizados por Brock y colaboradores, en los años setenta, donde se demostró la existencia de organismos capaces de vivir en ambientes con elevadas temperaturas en distintos lugares del Parque Nacional de Yellowstone (Amilis, et. al, 2004), se desarrolló un creciente interés por el estudio de este tipo de organismos conocidos como extremófilos; y es, a partir de 1974, cuando Macelroy (citado en Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006) introdujo el término.

Los extremófilos reúnen un gran grupo de organismos pertenecientes a los tres dominios de la vida: Archaea, bacteria y Eukarya, los cuales tienen la capacidad de vivir en ambientes en los que la gran mayoría de seres vivos no podrían sobrevivir; además de requerir, entre otras condiciones para su óptimo desarrollo, temperaturas muy elevadas (55-121 °C) o muy bajas (-2 – 20 °C), valores de pH altos (ambientes ácidos con pH menor a 4) o muy bajos (ambientes alcalinos con pH mayor a 8), alta salinidad (con NaCl de 2-5 M) y altas presiones. Y de acuerdo con uno o varios de estos factores ambientales se les designa un nombre a los organismos que viven en dicho ambiente (Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006). Por lo anterior, a continuación se presenta una breve revisión en torno a los organismos halófilos y termófilos.

2. Organismos Halófilos El caso específico de los halófilos considera un grupo de organismo cuyas funciones metabólicas y reproductivas son más eficientes en ambientes con altas concentraciones salinas (Castro, et. al, 2011). La existencia de organismos halófilos fue observada, por primera vez, hace más de un siglo, cuando durante la conservación del pescado por salazón se observaron organismos creciendo en los pescados, los cuales, posteriormente, produjeron la llamada enfermedad roja del bacalao (Amilis, et. al, 2004).

El estudio de los organismos halófilos inicia con la investigación básica desde la obtención de aislamientos, hasta su caracterización y descripción; ello permitió avances como (i) la distinción entre organismos halófilos y halotolerantes, entendiendo que los primeros cumplen funciones metabólicas y reproductivas de forma más eficaz a altas concentraciones de sal, lo cual no se evidencia en los halotolerantes (Gonzales y Peña, 2002), y (ii) la clasificación de estos organismos según la concentración de sal que requieren (Ver tabla 1.).

67

Tabla 1. Clasificación de los Halófilos según requerimientos de NaCl. Tipo de Organismo

Concentración NaCl requerida

Halófilos Extremos

20% - 30%

Halófilos Moderados

5% - 20%

Halófilos Débiles

2% - 5%

Halotolerantes

Toleran tanto la salinidad en diferentes concentraciones como las condiciones sin alta concentración de salinidad (inferior al 2%)

Fuente: Basado en González y Peña, 2002, p. 139.

Siguiendo el interés por el estudio de los organismos halófilos, se explora su bioquímica, genética y regulación metabólica (Averhoff y Müller, 2010). Ello dio paso a la identificación de estrategias adaptativas, las cuales le otorgan a los organismos la capacidad de balancear su presión osmótica para mantener la actividad de agua (Aw) necesaria en las células. Estas estrategias van en dos sentidos: i. Estrateg ia <<Salt-in>> Las células mantienen altas concentraciones intracelulares de sal, osmóticamente equivalentes a la concentración externa de sal; ello requiere que algunos sistemas internos deban adaptarse a las altas concentraciones de la misma. Esta estrategia se encuentra en dos grupos: la Archaea del orden Halobacteriales y las bacterias halófilas del orden Haloanaerobiales. Ya que no hay solutos osmoprotectores, se observan adaptaciones como la existencia de un exceso de aminoácidos con carácter ácido y pocos aminoácidos hidrofóbicos. ii. Estrateg ia <<compatible-solute>> Aquí, la presión osmótica del medio es balanceada mediante la presencia de solutos compatibles y no requiere adaptaciones especiales de los sistemas intracelulares. Estos solutos básicamente permiten, a altas concentraciones, el funcionamiento de las enzimas de manera eficiente; dentro de estos se han encontrado sustancias como el glicerol, el arabinitol, azúcares y sus derivados, aminoácidos y derivados de aminas como la glicina betaína (Gonzales y Peña, 2002). A pesar del auge en el estudio de organismos halófilos y de conocer que estos podrían pertenecer a los tres dominios de la vida, el estudio de los mismos se ve limitado a procariotas y solo hasta el año 2000 se conocen los primeros informes acerca de hongos activos en salinas solares (Gunde, Ramos, y Plemenitas, 2009)

68

HALÓFILOS Y TERMÓFILOS, ECOLOGÍA Y APLICACIONES

2.1 Ecolog ía Los microorganismos halófilos han sido aislados en diferentes puntos geográficos del planeta, y se ha encontrado que estos no son comunes en ambientes extremadamente salinos, aunque algunos de ellos se encuentran en zonas calientes, donde predominan lagos y suelos salinos; incluso, se han aislado microorganismos halófilos de alimentos con una elevada concentración de sal, como las salmueras, la salsa de soya y el pescado. (Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006).

La forma cristalina de la sal (NaCl) fue considerada hostil para la mayoría de formas de vida; por lo que fue utilizada en la conservación de alimentos por siglos. Las charcas o lagos salinos, los cuales proveen un amplio rango de salinidad, han sido lugares ideales para el estudio de los microorganismos halófilos. Particularmente, las charcas adquieren un color rojizo debido a la alta densidad poblacional de Halobacteriaceae, de células del género Dunaleilla, ricas en ß-caroteno y especies de baterías rojas del género Salinibacter, en lugares donde las charcas han alcanzado el punto de saturación salina y ocurre cristalización (Gunde, Ramos, y Plemenitas, 2009). Estos cuerpos de agua, donde las concentraciones de NaCl llegan al punto de saturación, son dominados por la familia de arqueas halofílicas rojas Halobacteriaceae. Algunas de las cepas aisladas de las charcas salinas son Haloferaxmediterranei, Haloferaxgibbonsii, Haloferaxdenitrificans, Halogeometricumborinquense, Halococcussaccharolyticus, Haloterrigenathermotolerans, Halorubrumsaccharovorum, Halorubrumcoriense, Haloarcula hispánica y Haloarculajaponica. (Oren, 2002).

Aunque los ambientes extremos fueron considerados, por un tiempo, exclusivos de organismos procariotas, y, por ende, únicamente estudiados por bacteriólogos, en el 2000 fue reportado el primer hongo habitante de una laguna salina Fuente especificada no válida. Posterior a esto, muchos microorganismos, unos nuevos y otros ya conocidos únicamente como contaminantes de alimentos, fueron aislados de diversos ambientes hipersalinos. A raíz de ello, se han desarrollado muchas investigaciones, algunas de las cuales han descubierto una composición de especies consistente y estable de micobiota en ambientes hipersalinos a nivel global, tal y como se puede observar en la tabla 2 (Castillo y Barragan, 2011).

Las variables más importantes en el crecimiento de estos microorganismos son dos nutrientes principales (nitrógeno y fosforo), el oxígeno disuelto, la actividad del agua (Aw) y el pH. Después del aislamiento de los hongos de las aguas hipersalinas ubicadas entre Eslovenia y Croacia en el año 2000, los estudios se han ampliado a distintas ubicaciones de aguas hipersalinas alrededor del mundo, incluyendo las salmueras a lo largo de la costa del mar Rojo en Israel (Eilat), a través de la costa del Mediterráneo en España (Santa Pola y río Delta) y Francia (Camarga), a lo largo de la costa atlántica de Namibia (Costa esqueleto), y en las costas de República Dominicana (Monte Cristo), Puerto Rico (Fraternidad) y Portugal (Samouco) (Gunde, Ramos, y Plemenitas, 2009).

Por un lado, algunos de los hongos aislados de ambientes hipersalinos presentan un comportamiento diferente al de la mayoría de halófilos procariotas; por

69

otro lado, algunos hongos halófilos no requieren sal para su viabilidad y pueden crecer en un amplio rango de concentraciones de sal, desde soluciones de NaCl saturadas hasta en el agua fresca (Gunde, Ramos, y Plemenitas, 2009).

Tabla 2. Algunos géneros de microorganismos halófilos reportados Dominio

Género

Referencia

Arquea

Halobacteriumsp.

Methanohalobiumsp.

Methanohalophihissp

[Oren, 1999] [ZhilinayZavarin, 1987] [Paterek y Smith, 1988]

Bacteria

Acetohalobiumsp.

Halorhodospirasp.

Actinopolysporasp.

Salinibactersp.

Halanaerobiumsp.

Halothermothrixsp.

Halocellasp.

Halobacteroidessp.

Haloanaerobactersp.

Salibacillussp.

Halobacillussp.

Marinococcussp.

Salinococcussp.

Tetragenococcussp.

Halomonassp.

Chromohalobactersp.

Salipigersp.

Pallemniasp.

[Zhulina y Zavaria, 1990] [Imhoff y Stiling, 1996] [Skerman et al., 1980] [Anton et al., 2002] [Rainey et al., 1995] [Rainey et al., 1995] [Rainey et al., 1995] [Rainey et al., 1995] [Rainey et al., 1995] [Mota et al., 1997] [Mota et al., 1997] [Mota et al., 1997] [Mota et al., 1997] [Mota et al.,1997] [Vreeland et al., 1980] [Ventosa et al., 1989] [Martinez-Canovas et al., 2004] [Martinez-Checa et al., 2005]

Fuente: Castillo y Barragan, 2011, p. 47.

Una de las especies procariotas más estudiadas es la arquea Halobacteriumhalobium, habitante del Gran Lago Salado de Utah en Estados Unidos de Norte américa. Esta arquea ha desarrollado una proteína membranal conocida como bacteriodopsina, la cual le proporciona resistencia a altas concentraciones de sal y a la escasez de oxígeno. Esta proteína le da un color purpura a la membrana, lo que la hace capaz de reaccionar a la luz, permitiéndole la síntesis de ATP, la importación de iones potasio y exportación de sodio (Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006).

El modelo eucariota más estudiado en la halotolerancia es Saccharomycescerevisiae, a pesar de ser susceptible a condiciones hipersalinas; también, han sido propuestos organismos como Debaryomyces hansenii, Hortaea werneckii y Wallemiaichthyophaga como los modelos más adecuados para el estudio de la halotolerancia en eucariotas.

Estos organismos crecen en concentraciones de NaCl de 3.0M, 5.0M y 5.2M, respectivamente; a diferencia de la concentración de 1.2M, en la cual es capaz de crecer las células de S. cerevisiae (Gunde, Ramos, y Plemenitas, 2009).

70

HALÓFILOS Y TERMÓFILOS, ECOLOGÍA Y APLICACIONES

2.2 Adaptaciones Los organismos, para sobrevivir a ambientes hipersalinos, mantienen un Aw menor a su entorno (Gunde, Ramos, y Plemenitas, 2009). La principal adaptación desarrollada por los microorganismos halófilos para tolerar el estrés osmótico se da en la acumulación citoplasmática de solutos para compensar la presión osmótica generada por el medio. De forma general, existen dos estrategias de acumulación de compuestos intracelulares, los cuales pueden ser tanto inorgánicos como orgánicos.

El primer mecanismo, mencionado previamente de forma breve, es el conocido como <<salt-in>>. Este consiste en la acumulación de iones, principalmente K+ y Cl-. El aumento de la concentración de KCl conlleva a la adaptación de los componentes celulares a las condiciones de alta salinidad. El segundo mecanismo es el conocido como <<Salt-out>>. Este está presente tanto en bacterias halófilas como no halófilas y arqueas metanógenas moderadas. Su estrategia se basa en la acumulación de solutos compatibles (compuestos orgánicos de bajo peso molecular), los cuales mantienen el balance osmótico de la célula sin alterar con su metabolismo. Los principales solutos conocidos son: aminoácidos, azúcares, glicina betaina, ectoína e hidroxiectoína. Este sistema permite la adaptación a los cambios en la presión osmótica dada por el medio. Estos solutos compatibles pueden ser sintetizados o bien, transportados desde el medio extracelular para su acumulación (Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006). Una de las arqueas conocidas que concentran KCl en su citoplasma es Halobacteriumsalinarum, para evitar la deshidratación. Esta arquea utiliza la proteína púrpura bacteriodopsina en su membrana.

Su crecimiento óptimo se da en concentraciones de NaCl de 3.5 a 4.3 M (Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006).

Otra propiedad importante, en la adaptación a condiciones de extrema salinidad, está dada en los cambios en la membrana plasmática en función a diferentes situaciones de estrés. La composición lipídica de la membrana afecta la retención de glicerol, uno de los solutos compatibles utilizado en la estrategia de <<salt-out>>.

En la Hortaea werneckii, expuesta a una amplia gama de concentraciones de NaCl, se presenta una baja proporción de esterol-fosfolípidos, lo que genera una mayor fluidez de la membrana. Esta característica también es observada en Debaryomyces hansenii, el cual presenta una proporción esterol-fosfolípidos similar a la de H. werneckii; lo que le permite a estos hongos una mayor retención del glicerol en su citoplasma (Gunde, Ramos, y Plemenitas, 2009). El glicerol, el cual ha sido encontrado en un gran número de hongos, se ha evidenciado que también facilita el crecimiento de algas del género Dunaliella a altas concentraciones de NaCl. Otro de los solutos compatibles es el glucosilglicerol, el cual es conocido como el principal osmolito estabilizador en cianobacterias; este es sintetizado bajo concentraciones medias de sal, pero también se ha identificado como un soluto osmótico en las bacterias heterotróficas como Pseudomonas mendocina (Gonzales y Peña, 2002).

Se han observado estrategias en donde los microorganismos censan el medio para detectar los cambios en la concentración de iones Na+. La vía de señalización del glicerol de alta osmolaridad (HOG por sus siglas en inglés), conocida como la principal vía de señalización para censar dichos cambios, ha sido identificada en

71

S. cerevisiae y H. werneckii (Gunde, Ramos, y Plemenitas, 2009). El análisis de expresión de genes ha identificado genes como Sko1/Acr1p, Hot1p, y, probablemente, Msn2p y Msn4p, así como Smp1p, en la transcripción dependiente de HOG (Gonzales y Peña, 2002).

La diversificación microbiana, proveniente de las múltiples adaptaciones a los diversos ambientes extremos han dado origen a los diversos mecanismos de mantenimiento de la integridad celular, puede ser originada por la mutación de genes, la pérdida diferencial de genes, la recombinación intramolecular y la transferencia horizontal de genes, la cual permite el intercambio del material genético entre especies. Esta última es reconocida como el motor más importante en la evolución y adaptación de las bacterias, lo cual ha sido concluido a partir de los resultados de los análisis comparativos de los genomas de arqueas y bacterias, donde del 20% a más del 40% del total de genes han sido transferidos horizontalmente. Esta transferencia horizontal, facilitada por los mecanismos de conjugación, transducción y transformación, han dado como resultado una fuerza de gran importancia en la adaptación de las bacterias extremófilas (Averhoff y Müller, 2010).

2.3 Aplicaciones biotecnológ icas Para los biotecnólogos los microorganismos halófilos han resultado de gran interés, debido a que estos además de tener una aplicación a nivel industrial en la producción de enzimas, biopolímeros o solutos compatibles; sus propiedades fisiológicas facilitan su explotación comercial (Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006).

2.3.1 Producción de enzimas Las conocidas como extremoenzimas, obtenidas de los microorganismos extremófilos, han sido objeto de explotación por parte de la biotecnología. Su estabilidad ofrece oportunidades en procesos de biocatálisis y de biotransformación. El potencial de aplicación industrial de enzimas hidrolíticas extracelulares producidas por microorganismos halófilos, tales como: amilasas, proteasas, lipasas, nucleasas y esterasas, han sido de amplio interés en el desarrollo de productos como detergentes, productos dietéticos, procesamiento del cuero, papel y alimentos cárnicos, así como en la industria farmacéutica en la síntesis de productos enantioméricos, y la biodegradación de productos tóxicos (Castillo y Barragan, 2011). Algunas aplicaciones biotecnológicas se visualizan en la tabla 3.

2.3.2 Producción de biopolímeros.

Exopolisacáridos, biosurfactantes, liposomas, lectinas y bioplásticos son algunos de los biopolímeros sintetizados a partir de microorganismos halófilos. Los exopolisacáridos o EPS son utilizados en la industria farmacéutica, cosmética, médica, alimentaria y en procesos de biodegradación; estos son producidos extracelularmente por bacterias halófilas, los cuales, en la naturaleza, le brindan la capacidad, a estas bacterias, de formar biofilms para la adhesión a superfices y en la captación de metales pesados.

72

HALÓFILOS Y TERMÓFILOS, ECOLOGÍA Y APLICACIONES

Tabla 3. Aplicación biotecnológica de algunas enzimas y otras moléculas obtenidas de microorganismos halófilos.

MICROORGANISMOS HALÓFILOS

Fuente

Aplicación

Proteasas

Síntesis peptidica

Deshidrogenasas

Biocatálisis en medio orgánico

Nucleasas, amilasas

Agentes saborizantes

B-caroteno, ácido a linoléico, extractos celulares (Spirulinasp y Dunaliella sp)

Alimentos naturales, complementos alimenticios, colorantes para alimentos y alimento para ganado

Bacteriorodopsina

Interruptores ópticos y generadores fotónicos de corriente en dispositivos bioelectrónicos

Polihidroxialcanoatos

Plásticos de uso en medicina

Polímeros reológicos

Recuperación de petróleo

Lípidos

Liposomas para liberación de fármacos y cosméticos

Solutos compatibles

Protectores de proteínas y células en una variedad de aplicaciones industriales como congelación y calentamiento

Glicerol

Productos farmacéuticos

Membranas

Surfactantes para productos farmacéuticos

Microorganismos

Salsas fermentadas y modificadores de sabor y textura en alimentos Transformación y degradación de desechos

Fuente: Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006, p. 66.

En la biorremediación son utilizados los biosurfactantes, ya que estos disminuyen la tensión superficial del agua, aumentando su solubilidad y promueven la degradación (Castillo y Barragan, 2011). Además de ello, los biopolímeros surfactantes y emulsionantes aumentan la eficacia en los procesos de extracción de crudo del subsuelo, mediante el aumento de la viscosidad del agua que se le aplica a las bolsas utilizadas en este proceso (Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006).

73

2.3.3 Biotecnolog ía alimentaria Los procesos de fermentación pueden ser llevados a cabo en condiciones de alta salinidad. Los microorganismos halófilos ofrecen la capacidad de fermentar alimentos en presencia de sal, además de la producción de compuestos que dan características de sabor, consistencia y aroma a los productos, y pueden actuar como biocontroladores de microorganismos no deseados (Castillo y Barragan, 2011).

En la elaboración de la salsa de soya participan determinadas especies del género Tetragenooccus, donde estas actuan como un indicador de la fermentación, en donde la concentración de NaCl en la salsa de soya es de aproximadamente 3M (Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006).

2.3.4 Biorremediación Los microorganismos halófilos constituyen una importante alternativa en el tratamiento de residuos tóxicos industriales, tales como las aguas residuales hipersalinas derivadas de procesos como la producción de plaguicidas, productos farmacéuticos y herbicidas, en donde los tratamientos microbiológicos convencionales son ineficaces (Ramírez, Serrano, y Sandoval, 2006).

Uno de los prinipales problemas de la agricultura sostenible es la acumulación de sodio y el incremento de la salinidad de los suelos. Se han propuesto soluciones a esta dificultad mediante el uso de un bioreactor en suelos sodicos y salinos, en donde se ha comprobado la capacidad in-vitro de algunas bacterias de capturar sodio. Igualmente, se han desarrollado procesos donde ecosistemas contaminados con productos derivados del petroleo en presencia de sal pueden ser tratatos biológicamente. A su vez, existen reportes de la capacidad de microorganismos halófilos de degradar productos tóxicos como colorantes, textiles y compuestos orgánicos halogenados como el tricloroetileno (Castillo y Barragan, 2011).

3. Organismos Termófilos El término termófilo hace referencia a los organismos que necesitan un ambiente extremo limitado por las altas temperaturas; particularmente, aquellos organismos que necesitan un óptimo de crecimiento superior a los 45°C. Sin embargo, al igual que en los organismos halófilos, al interior de la clasificación de termófilos, es posible encontrar otras subcategorias: termófilos moderados, extremos, hipertermólifos y organismos termotolerantes. Para entender estos rangos es necesario hacer referencia a los organismos mesófilos, todos aquellos organismos que tienen optimos de crecimiento entre los 7°C y los 42°C. Las clasificaciones de los organismos termófilos se pueden observar en la tabla 4.

74

HALÓFILOS Y TERMÓFILOS, ECOLOGÍA Y APLICACIONES

Tabla 4. Clasificación de organismos termófilos.

Categoría

Temperatura Óptima

Ejemplos

40-60°C

Tepidibacter, Clostridium, Exiguobacterium, Caminibacter, Lebetimonas, Hydrogenimonas, Nautilia, Desulfonauticus, Sulfurivirga, Caminicella, Vulcanibacillus, Marinotoga, Caldithrix, Sulfobacillus, Acidimicrobium

60-85 °C

Methanocaldococcus, Thermococcus, Palaeococcus, Methanotorris, Aeropyrum, Thermovibrio, Methanothermococcus, Thermosipho, Caloranaerobacter, Thermodesulfobacterium, Thermodesulfatator, Deferribacter, Thermosipho,Desulfurobacterium, Persephonella, Kosmotoga, Rhodothermus,

>85°C

Geogemma, Archaeoglobus, Methanopyrus, Pyrococcus, Sulfolobus, Thermoproteus, Methanothermus, Acidianus, Ignisphaera, Ignicoccus, Geoglobus

Termófilo Moderado

Termófilo Extremo

Hipertermófilo Fuente: Brock, 1978, p.155.

Entre los organismos termófilos más representativos figuran Pyrobaculum islandicum, Thermus aquaticus y Pyrolobus fumarii. Este último fue bastante concocido debido a que cuenta con el mayor óptimo de crecimiento, el cual se registraba en 113°C (Cavicchioli y Thomas, 2000). No obstante, en el año 2005 se descubrió el organismo que, hasta la fecha, es el que registra una mayor temperatura óptima de crecimiento: Pyrobaculum aerophilum, identificado molecularmente con un 95,3% de similaridad. Este organismo registra un óptimo de crecimiento de 121°C (Kashefi y Lovley, 2003).

El estudio de los organismos termófilos inició en el parque nacional de Yellostone (Estados Unidos), lugar caracterizado por lagunas termales con coloraciones particulares, asociadas a productos de la fotosíntesis, realizada por microorganismos propios del manantial. Allí se descubrió la Thermus aquaticus, en la cual se encontró un ADN de polimerasa termoestable, lo que permitió la amplificación de ADN. Logrando el uso extendido de la reacción en cadena de la polimerasa o comunmente conocida como PCR (por sus siglas en Inglés), este tipo de organismos son de alto interes tanto a nivel biológico como en aplicaciones biotecnológicas e inductriales (Saiki, et. al, 1988).

75

3.1 Ecolog ía Los ambientes naturales para la aparición de microorganismos termófilos se distribuyen en todo el mundo y corresponden a hábitats de alta temperatura, en comparación con aquellos de origen antropogénico; adicionalmente, pueden ser terrestres o marinos. Entre los hábitats naturales más destacados para este tipo de organismos están las zonas volcánicas y las fuentes hidrotermales submarinas; la mayoría de los termofilos conocidos se han recuperado de estas regiones. En relación con las zonas volcánicas, estas se asocian a áreas tectónicamente activas, donde se producen grandes movimientos de la corteza terrestre; en estas, materiales magmáticos son empujados cerca de la superficie y sirven como fuente de calor para el agua subterranea que se filtra y, así, posteriormente, generar las conocidas fumarolas, fuentes termales y geiseres (Brock, 1978).

Una fumarola corresponde a una abertura en la corteza de la Tierra, a menudo en las zonas volcánicas, donde se emite vapor de agua y gases como dióxido de carbono, dióxido de azufre, ácido clorhídrico y sulfuro de hidrógeno. Existe un tipo específico de fumarola, llamado solfatara, que hace referencia a las fumarolas emisoras de gases sulfurosos. Estas se encuentran dentro de campos de solfataras, los cuales constan de suelos, ollas de barro y aguas superficiales (manantiales ricos en azufre), calentados por las expulsiónes volcánicas de las cámaras de magma situadas por debajo de ellos. Este tipo de ambientes pueden tener temperaturas de hasta 100 °C. La composición química de los campos solfatáricos es muy variable y depende de la geología circundante; estos pueden ser ligeramente ácidos a ligeramente alcalino (pH 8.5) o extremadamente ácido, con valores de pH inferiores a 1,0. Esta condición de acidez se produce debido a la producción de ácido sulfúrico (H2SO4) a través de la oxidación biológica de H2S y S. Tales ambientes calientes y ricos en azufre se encuentran en todo el mundo, entre ellos Italia, Islandia, Nueva Zelanda, y el Parque Nacional de Yellowstone, en Wyoming (EE.UU.). Muchos de ellos son ricos en minerales de hierro.

En estos campos se ha recuperado gran variedad de organismos, entre estos, especies de Pyrobaculum, Sulfolobus, Methanothermus, Thermoproteus, Thermoanaerobacter, y Thermo (Völkl, y otros, 1993). La mayor parte del conocimiento sobre los estudios de diversidad en solfataras se basa en estudios por técnicas de cultivo, basandose únicamente en técnicas de análisis de ADN, independientes de cultivo. Se han llegado a describir 65 filotipos diferentes de crenarchaeotes (Kvist, Mengewein, Manzei, Ahring, y Westermann, 2005).

Los sistemas geotérmicos están presentes en zonas no relacionas directamente con fenómenos volcanicos. El agua resultante en una fuente de aguas termales puede ser calentada bien por el calor geotérmico (el calor del interior de la Tierra) o por el contacto con el magma (roca fundida). En zonas no volcánicas, el agua se filtra a través de la corteza terrestre, entrando en contacto con las rocas que se calientan como producto del gradiente geotérmico; mientras que en áreas volcánicas, al ser zonas tectónicamente activas, el gradiente de alta temperatura, junto al magma, logra que el agua se caliente lo suficiente para que la presión obligue al agua a subir a la superficie a través de los poros y fisuras de la tierra, generando una fuente termal (Brock, 1978). La interacción química con las rocas del yacimien-

76

HALÓFILOS Y TERMÓFILOS, ECOLOGÍA Y APLICACIONES

to forma minerales durante la trayectoria de ascenso, lo cual afecta la composición del agua caliente, que puede ser altamente ácida o alcalina. Su temperatura oscila entre los 100 °C y la temperatura ambiente en sus costas.

Las aguas termales están presentes en muchos países alrededor del mundo. Los países que son reconocidos por sus aguas termales incluyen Islandia, Nueva Zelanda, Chile y Japón; sin embargo, se presentan en otros países de cómo Colombia, que cuenta con numerosos manantiales termales; tan solo en Cundinamarca se encuentran más de 20, registrandose fuentes con temperaturas cercanas a los 80 °C (Alfaro, 2005).

Un tipo especial de hábitat con alta temperatura son los geiseres, donde se expulsa agua y vapor a través de un orificio de ventilación; cuando el agua se mezcla con barro, se le denomina una olla de barro. Contrario a lo que sucede con las solfataras y las fuentes termales los geiseres son un fenómeno extraño, presentandose en unos pocos lugares del planeta como el Valle de los Géiseres ubicadas en la península de Kamchatka (Rusia), El Tatio (Chile) y Haukadalur (Islandia). Tanto en este tipo de ambientes, como en general ambientes extremos, se han encontrado microorganismos filogeneticamente desconocidos (al realizar estudios por medio de análisis de ADN). Entre los microorganismos que se han podido identificar se resaltan los pertenecientes a los géneros Calderobacterium, Thermodesulfovibrio y Thermodesulfobacterium (Derekova, Sjoholm, Mandeva, y Kambourova, 2007)

3.2 Adaptaciones En estos ambientes se presentan múltiples adaptaciones; pero, de manera general, se puede decir que debido a la alta temperatura la fluidez de las membranas aumenta, y para mantener la fluidez óptima de la membrana celular se debe ajustar la composición de la misma, incluyendo la cantidad y tipo (por ejemplo, saturado- insaturado) de los lípidos. La temperatura también afecta la estructura y función de las proteínas; existen diferentes métodos en los que las proteinas han evolucionado para hacer frente a las altas temperaturas (Jaenicke, 1996), incluyendo el aumento de contenido de pares de iones, formando oligómeros de orden superior y la disminución de la flexibilidad a temperatura ambiente. La disminución de la longitud de los bucles de superficie es otro mecanismo conocido, en particular, los bucles que conectan elementos de estructura secundaria optimizan las interacciones electrostáticas e hidrófobas, y el intercambio de aminoácidos para aumentar la hidrofobicidad.

Respecto al ADN en altas temperaturas (superiores a 70°C) está sujeto normalmente a desnaturalización y modificación química; sin embargo, el ADN de los hipertermófilos (como los pertenecientes al género Pyrococcus) es más estable in vivo que el de un mesófilo (como la Escherichia coli). Esto se debe a la presencia de sales monovalentes y divalentes que mejoran la estabilidad de los ácidos nucleicos, puesto que estas sales reciben las cargas negativas de los grupos fosfato, y porque KCl y MgCl2 protegen el ADN de despurinación e hidrólisis (Marguet y Forterre, 1998). El par Guanina-Citosina de ácidos nucleicos es más termoestable que Adenina-Timina o Adenina-Uracilo debido al puente de hidrógeno adicional. No obstante, en los procariotas termófilos no se encuentra una gran proporcion de G-C (Galtier y Lobry, 1997).

77

3.3 Aplicaciones biotecnológ icas El estudio de microorganismos extremófilos ha contribuido de manera significativa en el nivel biotecnológico. Se han creado centros de investigación especializados en estudiar el desarrollo de la vida microbiana en ambientes extremos y sus aplicaciones. Algunos de los centros más reconocidos son el US NationalScienceFoundation y European Union Biotechnology (Rothschild y Mancinelli, 2001).

El potencial biotecnológico de los microorganismos termófilos puede ser aprovechado en procesos industriales que requieren altas temperaturas, donde normalmente se utilizan microorganismos mesófilos. La ventaja que tienen los microorganismos termófilos sobre los microorganismos mesófilos es que sus enzimas, extremo-enzimas, son mucho más estables y pueden resistir procesos fisicoquímicos, que funcionan con temperaturas elevadas, sin que se vean afectadas sus propiedades. Es así como, al clonar y expresar este tipo de enzimas en mesófilos, puede contribuir en la optimización de los procesos que requieren este tipo de microorganismos y altas temperaturas. Esta tecnología se ha aplicado en diferentes procesos tales como biorefinación, bioconversión, producción de biocombustibles, biorremediación y en la industria de alimentos (Singh, 2013).

Entre las extremo-enzimas que han sido purificadas se encuentran hidrolasas, oxido-reductasas, proteínas redox, deshidrogenasas, esterasas, glucosa isomerasas, alcohol deshidrogenasa, DNA polimerasas y nitralasas (Suárez, Alazard, Ramírez, Monroy, y Fernández, 2002). En la tabla 5, se relacionan algunos microorganismos termófilos con la extremo-enzima asociada y su aplicación biotecnológica.

Tabla 5. Asociaciones Microorganismo termófilo, extremo-enzima y aplicación biotecnológica.

Microorganismo Termófilo

Extremo-enzima

Aplicación Biotecnológica

Desulfurococcusmucosus

Amilasa (α-amilasa)

Licuefacción y sacarificación

Thermotoga marítima MSB8

Amilasa (Pululanasa Tipo 1)

Licuefacción y sacarificación

Thermoascusauranticus

Celulasas (Xilanasas)

Producción de combustible (alcohol)

Thermococcusceler

Proteasas (Serín proteasa)

Desnaturalización por detergentes, industria de alimentos.

Thermusaquaticus

ADN Polimerasa (Taqpol I)

PCR

Pyrococcusfuriosus

Celulasas(Exoglucanasa)

Producción de alcohol

Sulfolobussolfataricus

Celulasas (ß-Glucosidasa)

Detergentes, colores brillantes a los textiles

Fuente: Basado en Suárez, Alazard, Ramírez, Monroy, y Fernández, 2002, pp. 12-17.

78

HALÓFILOS Y TERMÓFILOS, ECOLOGÍA Y APLICACIONES

La industria de alimentos también se ha beneficiado de las extremo-enzimas para la optimización de sus procesos. Las extremo-enzimas pectinasa, renina y lipasa, aisladas de hongos termófilos, se han utilizado en el proceso de clarificación del vino, la coagulación de la leche y la degradación de grasas, respectivamente. De igual forma, extremo-enzimas aisladas de bacterias, como es el caso de las proteasas, hidrolizan las proteínas a péptidos, haciendo que la textura de la carne sea más suave. (Suárez, Alazard, Ramírez, Monroy, y Fernández, 2002) Las aplicaciones biotecnológicas de los termófilos también se extienden al campo de la biorremediación, donde sus propiedades ayudan a eliminar residuos tóxicos que se encuentran en el ambiente. El Thermoanaerobacterthermohidrosulfuricus ha sido reconocido por tener la capacidad de convertir desechos agrícolas, solventes y aguas residuales (Suárez, Alazard, Ramírez, Monroy, y Fernández, 2002). Existen estudios que demuestran que hay adsorción de metales pesados por parte de bacterias termófilas, como es el caso de Anoxybacillusflavithermus. Este hecho plantea una alternativa para la recuperación de ambientes contaminados con este tipo de elementos; además, garantiza la recolección de los metales pesados que pueden ser utilizados en otros procesos (Burnett, Handley, Peak, y Daughney, 2007).

Bibliog raf ía Alfaro, C. (2005). Geochemistry of Hot Spring at Cundinamarca Department, Colombia.

Proceedings World Geothermal Congress, (pp. 1-8). Antalya, Turkey.

Amilis, R., Gómez, F., González, E., Aguilera, A., Rodríguez, N., y Fernández Remolar, D. (2004). Extremofilia Astrobiológica: El caso del río Tinto. Boletin SEA (12), 19-26.

Averhoff, B., y Müller, V. (2010). Exploring research frontiers in microbiology: recent advances in halophilic and thermophilic extremophiles. Research in microbiology , 161, 506-514.

Brock, T. (1978). Thermophilic microorganisms and life at high temperatures. New York, Estados Unidos: Springer.

Burnett, P., Handley, K., Peak, D., y Daughney, C. (2007). Divalent metal adsorption by the thermophile Anoxybacillus flavithermus in single and multi-metal systems Divalent metal adsorption by the thermophile Anoxybacillus flavithermus in single and multi-metal systems. Chemical Geology, 244, 493-506.

Canganella, F., y Wiegel, J. (2011). Extremophiles: from abyssal to terrestrial ecosystems and possibly beyond. Naturwissenschaften, 98, 253-279.

Castillo, L., y Barragan, B. (2011). Aplicaciones biotecnológicas de los microorganismos halófilos. Revista sistemas ambientales, 4(2), 45-54.

Castro, L., Flores, A., Rodríguez, A., Aguilar, M., Aguilar, C., y Rodríguez, R. (2011).

Aislamiento y Caracterización de Microorganismos Halófilos de suelos salinos de cuatro ciénagas Coahuila, México. Acta Química Mexicana , 3 (5), 33-43.

Cavicchioli, R., y Thomas, T. (2000). Extremophiles. In J. Lederberg, Encyclopedia of microbiology (2 ed., Vol. 2, pp. 317-337). Londres, Inglaterra: Academic Press.

Derekova, A., Sjoholm, C., Mandeva, R., y Kambourova, M. (2007). Anoxybacillus gonensis sp. nov., a moderately thermophilic, xylose-utilizing, endospore-forming bacterium.

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology , 1315-1320.

79

Galtier, N., y Lobry, J. (1997). Relationships between genomic G+C content, secondary structures and optimal growth temperature in prokaryotes. Journal of Molecular Evolution , 44, 632.

Gonzales, J., y Peña, A. (2002). Estrategias de adaptación de microorganismos halófilos y Debaryomyces hansenii (Levadura halófila). Revista Latinoamericana de microbiología , 44 (3-4), 137-156.

Gunde, N., Ramos, J., y Plemenitas, A. (2009). Halotolerant and halophilic fungi.

British Mycological Society, 113, 1231-1241.

Jaenicke, R. (1996). Stability and folding of ultrastable proteins: eye lens crystallins and enzymes from thermophiles. FASEB Journal , 10, 84-92.

Kashefi, K., y Lovley, D. (2003). Extending the upper temperature limit for life. Science, 301 (5635), 934.

Kvist, T., Mengewein, A., Manzei, S., Ahring, B., y Westermann, P. (2005). Diversity of thermophilic and non-thermophilic Crenarcheota at 80°C. FEMS Microbilogy Letters, 244, 61-68.

Marguet, E., y Forterre, P. (1998). Protection of DNA by salts against thermodegradation at temperatures typical for hyperthermophiles. Extremophiles, 2, 115-122.

Oren, A. (2002). Molecular Ecology of extremely halophilic archaea and bacteria. FEMS microbiology ecology , 39, 1-7.

Ramírez, N., Serrano, J., y Sandoval, H. (2006). Microorganismos extremófilos.

Actinomicetos halófilos en México. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, 37 (3), 56-71.

Rothschild, y Mancinelli. (2001). Life in extreme environments. Nature, 409, 1092-1101.

Saiki, R., Gelfand, D., Stoffel, S., Scharf, S., Higuchi, R., Horn, G., et al. (1988). Primerdirected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239 (4839), 487-491.

Singh, O. (2013). Extremophiles: sustainable resources and biotechnological implications.

New Jersey: Wiley-Blackwell.

Suárez, C., Alazard, D., Ramírez, F., Monroy, O., y Fernández, L. (2002). Las enzimas termoestables y sus aplicaciones industriales. BioTecnología, 7 (1), 7-23.

Völkl, P., Huber, R., Drobner, E., Rachel R, Burggraf, S., Trincone, A., et al. (1993).

Pyrobaculum aerophilum sp.nov., a novel nitrate-reducing hyperthermophilic archaeum.

Applied and Environmental Microbiology, 59, 2918-2926.

80

4 biodeterioro Y perspectivas de in vestigaciรณn

81

Villalba, Luz1 Sánchez, Jimena2 Patiño, María3 Villalba, Carlos4 Delgadillo, Nathalia5 Montaño, Sandra4 Rodríguez, Jenny5 Espítia, Nelcy5 Campos, Sandra4 Ruíz, Elkin6

1 Bacterióloga MSc. Microbiología Ambiental.

Laboratorio de Análisis y Control.

Biblioteca Nacional de Colombia y Empresa Haerentia.

2 Bacterióloga. MSc Microbiología.

Candidato PhD ciencias Agrarias. Docente Asociada, dedicación exclusiva, departamento de Biología.

Facultad de Ciencias.Universidad Nacional de Colombia.

3 Microbióloga Industrial. Candidato Maestría en Museología y Gestión del Patrimonio, Universidad Nacional de Colombia, Laboratorio de Análisis y Control.

Empresa Haerentia.

4 Biólogo (a). Universidad Nacional de Colombia.

5 Estudiante Biología, Universidad Nacional de Colombia.

6 Tecnólogo en química industrial, Técnico de apoyo laboratorio Microbiología. Departamento de Biología, Universidad Nacional de Colombia.

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

1. Introducción La herencia cultural constituye una expresión de las civilizaciones (Ortega-Calvo et al., 1993), la cual puede referirse a dos tipos de manifestaciones reconocidas como patrimonio cultural. Por un lado, las creaciones artísticas y bienes de naturaleza arqueológica, que presentan valores con un reconocimiento unánime, y, por otro lado, los bienes de naturaleza etnológica que conforman aquellas manifestaciones iletradas, también llamadas artes populares, y a los cuales se les reserva el título de patrimonio etnológico o etnográfico (García, 1998).

Aquellos bienes muebles e inmuebles que forman parte del acervo heredado como patrimonio cultural se encuentran compuestos por diversos materiales y pueden sufrir, en gran medida, deterioro por diferentes factores físicos, químicos y biológicos (biodeterioro) (Warscheid y& Braams, 2000). Esta heterogeneidad de procesos involucrados determina que la conservación de estos objetos, bien sea mediante la prevención del deterioro o la conservación posterior luego de algún daño, requiera interdisciplinariedad en la formulación y desarrollo de herramientas de prevención y mitigación en dicho patrimonio cultural. En relación con esta interdisciplinariedad, se hace importante la interacción entre las ciencias, tales como biología y la química, y las ciencias humanas como la historia y la conservación. No obstante, es claro que, en algunos casos, se hace necesario dejar claridad acerca de qué es el biodeterioro. (Szczepanowska y Cavaliere, 2012).

El biodeterioro se define como la alteración indeseable y los cambios en las propiedades de los materiales, debido a la actividad vital de los microorganismos (Hueck, 1965; Piñar y Sterflinger, 2009) por medio de enzimas y ácidos (Vaillant y Valentin, 1996; Caneva, Nugari y Salvadori , 2000; Videla, Guiamet y Gómez , 2003), y los cuales están determinados por los siguientes factores: composición química del material en sí; exposición ambiental del objeto; forma y frecuencia de la limpieza de las superficies del objeto (Piñar y Sterflinger, 2013). Por ello, actualmente, se reconoce la acción de microorganismos (bacterias, hongos filamentosos, levaduras), líquenes y plagas de insectos, como causantes frecuentes del biodeterioro de patrimonio cultural (Sterflinger y Piñar, 2013).

2. Ecolog ía Microbiana del Biodeterioro en Patrimonio Inmueble y Bienes Muebles en Espacio Público 2.2 Materialidad Un gran porcentaje del patrimonio cultural tangible en el mundo está construido por rocas, que sufren un proceso de transformación natural hacia arenas y suelos, como un proceso de reciclaje esencial. Muchos tipos de roca han sido utilizados por los

83

artistas, difiriendo en dureza, alcalinidad, y porosidad, por lo que influyen, así, en la susceptibilidad al biodeterioro (Sheerer, Ortega y Gaylarde, 2009). Con respecto a los monumentos, pueden distinguirse los tipos de roca que se muestran en la tabla 4.1.

Tabla 1. Principales características de las rocas más utilizadas en monumentos.

(Tomado y modificado de Warscheid y Braams, 2000) Tipo de Roca

Características Petrofísicas

Rocas densas: Areniscas silíceas, granito, basalto, pizarra, piedra caliza, rocas metamórficas (cuarcita, mármol)

Tamaño granular: <0.1mm Porosidad: <14% Superficie interior (BET): 3.5m^2/g Tamaño del poro: < 3 µ m

Rocas porosas: Arcilla cementada o silícea, algunas areniscas, rocas artificiales (ladrillo, hormigón)

Tamaño granular: > 0.5mm Porosidad: < 18% Superficie interior (BET): 3 m^2/g Tamaño del poro: 3 - 8 µ m

Areniscas de grano medio, rocas calcáreas

Tamaño granular: 0.1 - 0.5 mm Porosidad: 14 - 18% Superficie interior (BET): 5 - 7 m^2/g Tamaño del poro: > 8 µ m

Rocas densas: Areniscas silíceas, granito, basalto, pizarra, piedra caliza, rocas metamórficas (cuarcita, mármol)

Tamaño granular: <0.1mm Porosidad: <14% Superficie interior (BET): 3.5m^2/g Tamaño del poro: < 3 µ m

Rocas porosas: Arcilla cementada o silícea, algunas areniscas, rocas artificiales (ladrillo, hormigón)

Tamaño granular: > 0.5mm Porosidad: < 18% Superficie interior (BET): 3 m^2/g Tamaño del poro: 3 - 8 µ m

Areniscas de grano medio, rocas calcáreas

Tamaño granular: 0.1 - 0.5 mm Porosidad: 14 - 18% Superficie interior (BET): 5 - 7 m^2/g Tamaño del poro: > 8 µ m

Fuente: Tomado y modificado de Warscheid y Braams, 2000, p.346.

En los bienes inmuebles, el cemento, arena, tierra arcillosa, entre otros son los materiales comúnmente utilizados para construcciones de vivienda (Rojas et al., 2000). En ingeniería civil, el concreto es el material más empleado para diferentes construcciones como puentes, tuberías de alcantarillado, edificios, y está hecho a base de cemento (Guillon, 2004 citado en Wiktor et al., 2009). Los materiales a base de cemento se caracterizan por ser porosos y pueden contener adyuvantes orgánicos, lo cual les confiere una bioreceptividad primaria determinada.

84

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

A nivel mundial, en la construcción, se utilizan cinco tipos principales de roca, las cuales difieren, de modo importante, por sus características y propiedades. Entre ellas, se encuentran las rocas calizas, pizarra, mármol y el granito. En realción con las calizas, éstas están compuestas, principalmente, por carbonato de calcio; se distinguen por su estabilidad en aguas neutras y ligeramente alcalinas, y por disolverse rápidamente bajo condiciones ácidas, aspecto que puede facilitar la acción de los contaminantes atmosféricos sobre ellas (Sikiotis y Kirkitsos, 1995 citado en Valdés et al., 2007).

Dentro de las rocas calizas, se encuentra la piedra caliza coralina, empleada como material arquitectónico y estructural, debido a sus propiedades mecánicas, su estabilidad al medio ambiente y su fácil obtención. Este material también es afectado por microorganismos deteriorantes, especialmente, a la humedad (Valdés et al., 2007) que, junto con los contaminantes urbanos e industriales bajo deposición húmeda, influyen de manera negativa sobre la roca caliza (Johnson et al., 1996).

Mientras que el granito, la pizarra y el mármol son materiales generalmente más duraderos y presentan poca porosidad, la arenisca y la caliza tienen menor durabilidad ya que poseen una gran porosidad; esta permite una mayor conectividad de poros, lo que facilita el proceso de transporte de agua por capilaridad (Leygraf y Graedel, 2000). En la tabla 4.2, se relaciona el tipo de roca empleada en construcción y algunas de sus características.

Tabla 2. Principales características de las rocas más utilizadas en construcción.

Nombre

Composición

Tipo

Porosidad

Permeabilidad K (cm2 )

Granito

Cuarzo, feldespato, aluminosilicatos

Ígnea

0,1 - 4,0

10-9-10-6

Pizarra

SiO2 con silicatos

Metamórfica

0,1 - 5,0

10-11-10-8

Arenisca

Granos de cuarzo (SiO2 ) y feldespato (KAlSi3O8− NaAl2 Si2O8)

Sedimentaria

1,0 - 30,0

10-3-10

Caliza

CaCO3

Sedimentaria

0,3 - 30,0

10-9-10-2

Mármol

CaCO3

Metamórfica

0,4 - 5,0

10-6-10-3

Fuente: Tomado y modificado de Leygraf y Graedel, 2000, Citado en Valdés et al., 2007, p. 25.

2.2 Agentes biológ icos La diversidad metabólica de los microorganismos les confiere la capacidad de causar el deterioro de una amplia variedad de materiales (Flores, Morrillo y Crespo., 1997 citado en Rojas et al., 2000). Esto, junto con la interacción de mecanismos físico-químicos, es considerado como un aspecto central para entender el deterio-

85

ro a largo plazo (Saiz, 1997). Los agentes físico-químicos y biológicos actúan en co-asociación, teniendo desde relaciones sinérgicas, hasta antagónicas para deteriorar los materiales (Warscheid y Braams, 2000).

Edificaciones, pinturas murales y monumentos en espacio público pueden ser afectados por microorganismos, principalmente líquenes, bacterias y hongos (Roelleker et al., 1996; Arino, Gómez y Saíz, 1997; Saíz, 1997 citado en Rojas et al., 2000); aunque cianobacterias y algas también pueden crecer en estas estructuras (Wiktor et al., 2009). La bioreceptividad de las rocas utilizadas en este tipo de elementos, se ve influenciada por la naturaleza química de las mismas (su origen geológico) y se define como la totalidad de las propiedades de los materiales que contribuyen a la colonización y desarrollo de la fauna y/o flora (Guillitte, 1995). Los procesos de biodeterioro están fuertemente influenciados por la disponibilidad de agua, y determinados por características propias de los materiales como la porosidad y la permeabilidad (Hopton, 1988 citado en Warscheid y Braams, 2000).

Las cianobacterias y los hongos constituyen la mayor parte de la biomasa de los microorganismos que causan biodeterioro, los cuales pueden generar la degradación de materiales por medio de la producción de ácidos, metabolitos alcalinos y surfactantes, así como por la penetración física de sus células en el sustrato (Gaylarde y Morton, 1999). Las cianobacterias, por su parte, son particularmente resistentes a la desecación y a altos niveles de luz UV, gracias a la presencia de pigmentos (Garcia, Sherry y Castenholz, 1992; Chazal y Smith, 1994), lo cual les confiere una ventaja sobre otros microorganismos en las superficies expuestas. Los géneros más detectados sobre superficies de construcciones, han sido Chlorella, Klebsormidium y Trentepohlia (Crispima, Gaylarde y Gaylarde., 2004). Algunas cianobacterias endolíticas colonizan fisuras en rocas calcáreas y, como consecuencia de la toma de agua y la precipitación de carbonatos y oxalatos, las células ejercen una presión en la roca, que tiene como resultado la expansión de la fisura, permitiendo la entrada de polen, material particulado y pequeños animales (Crispima y Gaylarde, 2003).

Los hongos son los mayores agentes de deterioro en construcciones de roca (May et al., 1993). Leo y Urzí (2003) identificaron dos grupos principales de hongos biodeteriorantes (especies de Hyphomycetes y Coelomycetes), entre los cuales se incluyen aquellos que no producen melanina, como especies de los géneros Fusarium, Penicillium, Aspergillus, y aquellos que producen melanina, como especies de los géneros Alternaria, Ulocladium y Cladosporium. En general, la producción de melanina y un crecimiento meristemático, le permite, a este grupo de hongos, sobrevivir en condiciones ambientales de estrés tales como baja humedad y alta irradiación solar (de Hoog, 1993).

En los procesos de biodeterioro también intervienen bacterias quimiolitotróficas, autotróficas y heterotróficas (Videla et al., 2003). Debido a sus requerimientos nutricionales y ambientales básicos se desarrollan fácilmente sobre superficies que contengan una alta cantidad de humedad (Kumar y Kumar, 1999).

Entre las bacterias que atacan edificios construidos con piedra, pueden mencionarse tiobacterias, silicobacterias y las bacterias nitrificantes. Estas últimas transforman los nitratos en nitritos, los sulfatos en sulfuros, producen ácido ní-

86

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

trico, ácido nitroso y sales de amonio, que intervienen en la degradación del asbesto (Wasserbauer, Zadak y Novotny, 1988 citado en Videla et al., 2003). Se ha sugerido que estas pueden atacar la roca a través de procesos químicos y físicos relacionados con el metabolismo bacteriano y con los biofilms que pueden formar (Warscheid, Oetling y Kumbrein, 1991). Varios autores han reportado diferentes géneros de bacterias implicadas en el biodeterioro de diferentes materiales empleados para la construcción de edificios y fachadas, dentro de las cuales se encuentran principalmente Pseudomonas sp, Bacillus sp, Nitrobacter sp, Staphylococcus sp, Nitrosomonas sp, Nitrosococcus sp y Micrococcus sp (Warscheid, Oetling y Kumbrein, 1991; Cepero et al., 1992; citados en Kumar y Kumar,1999).

Ahora bien, los microorganismos pueden formar biofilms, los cuales pueden estar constituidos por bacterias, hongos, protozoarios, entre otros. En general, los requerimientos para su formación son bastante simples: presencia de una superficie, humedad, nutrientes y microorganismos. Estos interactúan, conformando agregados que pueden ser más resistentes a altas concentraciones de biocidas, que cuando están en suspensión (Villalba y Malagon, 2011, LeChevallier et al., 1988), lo cual dificulta el tratamiento anti-fouling.

Finalmente, las plantas superiores también pueden causar biodeterioro, desarrollándose sobre los edificios y monumentos, donde sus raíces, al penetrar en los poros, forman fisuras y microfisuras que provocan tensiones, rupturas y desprendimientos (Malaga et al., 2003). Los musgos también actúan degradando las superficies, especialmente de roca, debido a la acidez de sus rizomas, lo que les permite extraer cationes minerales de la superficie (Caneva, Nugariy Salvadori, 1988 citado en Kumar y Kumar, 1999). Los líquenes actúan penetrando los poros, fisuras y grietas de la superficie, por medio del talo. Esto ocasiona el desprendimiento ocasional de fragmentos minerales adherentes (Kumar y Kumar, 1999), y, por ende, el deterioro de la estructura.

2.3 Indicadores de biodeterioro A los indicadores de biodeterioro en rocas y otros materiales utilizados se les conoce como pátinas, y se definen con un tono característico que adquieren ciertos elementos. Específicamente en las rocas, se pueden apreciar diferentes tipos de pátinas, de acuerdo con la manifestación física observada en los elementos (Warscheid y Braams, 2000), así: i. Pátina tipo I Alteración cromática, revestimiento o coloración debido a la formación de biofilm.

Se aprecia en rocas densas. El biofilm se distribuye de manera superficial y en las fisuras naturales al material. Estas superficies están típicamente dominadas por organismos foto-tróficos y algunos hongos. Se pueden observar variaciones en la coloración por pigmentos biogénicos, o por procesos de oxidación de algunos minerales como hierro o manganeso. Pueden darse procesos de corrosión biológica debida a la excreción microbiana de ácidos orgánicos.

87

ii. Pátina tipo II Desintegración granular, pulverización o erosión. Se presenta corrosión de superficie. Este tipo de pátina se observa en rocas porosas. La contaminación microbiana en estos casos puede extenderse hasta 5 cm de profundidad, y está principalmente dominada por bacterias. Se forma un biofilm debido a dicha porosidad, la cual que favorece e incrementa la toma de agua por capilaridad. En este caso, el biodeterioro se debe a la excreción de ácidos orgánicos e inorgánicos. iii. Pátina tipo III Formación de “corteza”, astillado, exfoliación. Es típico de rocas de tamaño de grano medio y rocas calcáreas. La biota microbiana puede establecerse hasta con 1cm de profundidad de manera estable. Con estos biofilms establecidos, puede darse el sellado de la porosidad en los sitios de establecimiento, en los cuales se empieza a dar un enriquecimiento de contaminantes ambientales con la subsecuente formación de “corteza”. Los cambios de color presentados pueden deberse tanto a la oxidación de minerales (hierro, manganeso), como a procesos de corrosión determinados por la excreción de ácidos orgánicos e inorgánicos.

2.4 Métodos de control para biodeterioro de monumentos y bienes inmuebles La intervención, con el ánimo de controlar los efectos del biodeterioro, debe ser cuidadosamente evaluada, y su aproximación debe ser polifacética y multidisciplinaria (Sheerer, Ortega y Gaylarde, 2009). En general, es mucho más valiosa la prevención que la remediación (Allsop, Seal y Gaylarde, 2004); además, es importante tener en la cuenta que el biodeterioro de un sustrato dependerá de la disponibilidad de agua y nutrientes, y que, al remover una comunidad microbiana de un nicho determinado, puede darse un evento de sucesión que implique mayores complicaciones en el tratamiento (May, 1993).

Sin embargo, existen mecanismos físicos y químicos que han sido ampliamente utilizados en el tratamiento de los microorganismos causantes del biodeterioro tales como: 2.4.1 Tratamientos f ísicos Remoción o erradicación mecánica de los agentes de deterioro (Sheerer, Ortega y Gaylarde, 2009); control estricto de las variables ambientales involucradas en la promoción de los microorganismos; uso de rayos gama, UV y microondas como agentes esterilizantes (Allsop, Seal y Gaylarde, 2004); con reporte de autores como Tretiach y colaboradores (2012), quienes lograron la eliminación de líquenes mediante aplicación de temperatura (20°C a 55°C) por periodos de hasta 6 horas, obteniendo resultados favorables.

88

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

2.4.2 Tratamientos Químicos Tradicionalmente, para el tratamiento del biodeterioro se han utilizado elementos biocidas, bactericidas, fungicidas, fungistáticos, compuestos anti-fouling y materiales de protección (Allsop, Seal y Gaylarde, 2004), aunque es importante tener en la cuenta que los tratamientos con estos compuestos pueden tener efectos negativos sobre los elementos sobre los cuales se aplican (Webster et al, 1992), como sería el caso de los agentes oxidantes sobre las inclusiones de hierro en los sustratos (rocas) (Allsop, Seal y Gaylarde, 2004); a su vez, es necesario hacer la evaluación de suceptibilidad microbiana de dichos compuestos, ya que pueden implicar más que un método de control, un aporte extra de fuente de carbono que puede ser metabolizada (Warscheid y Braams, 2000). Por eso, se ha propuesto que los tratamientos con biocidas solo deben aplicarse cuando los factores que han favorecido inicialmente el biodeterioro no pueden ser controlados (Warscheid y Braams, 2000).

Existen diversos compuestos químicos, tradicionalmente utilizados y con un efecto diferencial sobre los microorganismos: agentes oxidantes, aldehídos, alcoholes, fenoles, entre otros; los cuales pueden generar oxidación y, por tanto, lisis de la pared celular; afectar el transporte activo de membrana y su integridad; actuar como denaturantes de proteínas, o actuar como inhibidores de procesos vitales de las células, como síntesis de proteínas, síntesis de ácidos nucléicos y, en consecuencia, la división celular, la síntesis de membrana e incluso la inhibición de la fotosíntesis, afectando la cadena de transporte de electrones (Allsop, Seal y Gaylarde, 2004). Por lo tanto, es importante recalcar que los tratamientos de conservación deben ser planeados (Warscheid y Braams, 2000) y producto de investigaciones sobre los aspectos microbiológicos que implica el biodeterioro.

En este campo de investigación, en Colombia, recientes estudios se han enfocado en la identificación de la diversidad microbiana involucrada en el deterioro de monumentos en espacio público y estructuras en piedra y otros materiales de construcción, como parte del proceso de diagnóstico y valoración para su conservación. Por una parte, Villalba y Malagón (2011), en su estudio sobre el biodeterioro de la fuente de Lavapatas en el Parque Arqueológico de San Agustín (Huila), describieron diversos géneros de líquenes, musgos, plantas hepáticas, plántulas, algas, hongos y bacterias involucrados en la formación de biofilms, con el consecuente deterioro estético, físico y químico de las estructuras pétreas.

Por otra parte, en el estudio de la colonización microbiológica de los monumentos en el espacio público de la ciudad de Bogotá (Colombia), fueron aislados, a partir de los indicadores en esculturas y pedestales, algas y cianobacterias, donde predomina el género Desmococcus, microorganismos heterótrofos que incluyen bacterias como Bacillus sp., y hongos filamentosos como Epicoccum sp., Aureobasidium sp. y Fusarium sp. (Villalba, 2012).

El más reciente estudio efectuado en las ruinas Arqueológicas de Pore-Casanare, Colombia (datos no mostrados), pone de manifiesto la importancia de realizar evaluación interdisciplinaria para la conservación del material, con participación de arquitectos restauradores, químicos, microbiólogos y restauradores; con estudios

89

técnicos a nivel de caracterización de organismos deteriorantes, selección de biocidas y de producto consolidante e intervenciones en primeros auxilios para la salvaguarda del bien cultural (Vargas et al., 2014).

3. Ecolog ía Microbiana del Microbiodeterioro en Acervos Documentales y Bibliog ráficos 3.1 Aspectos generales Como materia prima para la elaboración del papel se han utilizado diversos materiales entre los que se pueden citar la seda, el lino y el algodón, con alto grado de pureza, el yute, el sisal, el cañamo, el aspartato y, por último, la madera, utilizada actualmente (Vaillan & Valentin, 1996; Panshin et.al., 1959 en Villalba, 2003).

El papel es un material fibroso cuya estructura depende de los componentes utilizados y la técnica de elaboración. Está constituido principalmente por fibras de celulosa tridimensionales, formadas por monómeros de glucosa unidos por enlaces glucosídicos de tipo ß-1,4. Algunos de los aditivos de origen orgánico, como almidón, gelatina o la caseína, con el tiempo, tienden a oxidarse y convertirse en fuente potencial de nutrientes para los agentes biológicos (Allsopp, Seal y Gaylarde, 2004). Especialmente las proteínas, polisacáridos y ácidos grasos pueden ser tomados como fuentes de carbono y nitrógeno mediante complejos enzimáticos como las celulasas, amilasas, proteasas, lipasas y hemicelulasas (Villalba, 2003).

Como todos los materiales, el papel es sensible al envejecimiento natural, causado por procesos físico-químicos como oxidación, hidrólisis, reacciones fotoquímicas y deformación de las fibras. No obstante, la mayor degradación del papel puede ser atribuida al proceso conocido como biodeterioro (Manente et al., 2012).

Las propiedades físico-químicas del papel influyen, a su vez, en su bioreceptividad (susceptibilidad a la colonización y degradación por los microorganismos).

Entre estas propiedades se encuentra la higroscopicidad del papel que favorece el crecimiento de microorganismos al proveer la humedad necesaria para su desarrollo (Manente et al., 2012); del mismo modo, los componentes adicionales de origen animal o vegetal, como adhesivos, pigmentos y encolantes, también pueden ser fuentes nutricionales para diversos organismos heterótrofos (Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012).

Desde finales del siglo XX, los esfuerzos en manufactura y restauración del papel se han dirigido, en parte, hacia el uso de materiales sintéticos como adhesivos a base de éteres de celulosa y emulsiones de acetato de polivinilo (las llamadas gomas blancas que varían en composición y propiedades). Lo anterior ha ofrecido mayor perdurabilidad a los documentos y mayor resistencia al ataque microbiano (Andrews et al., 1992).

90

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

3.2 Agentes biológ icos: ecolog ía microbiana del biodeterioro El biodeterioro, como se mencionó previamente, se puede definir como un cambio indeseado en las propiedades físicas y químicas de un material, comprometiendo su apariencia estética y su integridad física. Este proceso es ocasionado por la acción de organismos biológicos, puesto que el biodeterioro involucra principalmente microorganismos, Peters (2000) propuso el nuevo concepto de microbiodeterioro, en donde se hace énfasis en el agente causal del daño.

Los microorganismos son uno de los principales factores de deterioro del papel, especialmente los hongos y bacterias, bajo ciertas condiciones ambientales (Manente et al., 2012); estos pueden estar presentes en el aire interior o exterior, y sus propágulos son transportados por corrientes de aire y visitantes de las colecciones. La colonización de objetos o la estructura del edificio que contiene los documentos también es una importante fuente de contaminación microbiana en el ambiente (Guiamet et al., 2011).

La contaminación fúngica ha sido una preocupación constante en archivos y bibliotecas que custodian documentos y obras gráficas en papel (Michaelsen et al., 2013); sin embargo, también se ha sugerido que la contaminación microbiana puede ocurrir en el proceso de elaboración del papel o la preparación del libro, o provenir de los microorganismos ambientales (Michaelsen et al., 2006).

En la colonización y degradación del papel, interactúan diferentes poblaciones microbianas, incluyendo bacterias, hongos y actinomicetes que utilizan el papel como fuente nutricional, haciendo uso de sus complejos sistemas enzimáticos (celulasas, amilasas, proteasas) y ayudados por las condiciones micro y macroclimáticas del ambiente (Villalba, Mikan y Sánchez, 2004). Dentro de algunos estudios sobre biodeterioro en archivos y bibliotecas en Colombia, se puede mencionar lo reportado por Giraldo e investigadores (2009), quienes evaluaron, en cuatro secciones de la biblioteca de la Universidad del Valle (Colombia), la presencia de hongos (409 unidades formadoras de colonias –UFC–, correspondiente a un 10.3% en libros y un 89.7% en el ambiente), con hallazgos predominantes de los géneros Cladosporium (59.72%), Fusarium (9,31%), Curvularia (6,62%), Aspergillus (6,37%) y Chaetomium (5,64%). Adicionalmente, Toloza y Lizarazo (2011) han reportado microorganismos presentes en el ambiente del archivo central de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, logrando el aislamiento de 14 géneros que incluyen: Rhodotorula sp., bacterias (principalmente formas cocoides), y con predominio de los hongos Mucor sp. (36,6%) y Penicillium sp. (27,5%); destacando que algunos síntomas respiratorios que presentaban los trabajadores, no estuvieron correlacionados directamente con la presencia de esporas fúngicas en el ambiente.

Los principales grupos microbianos descritos como responsables del deterioro del papel son hongos y bacterias con actividad celulolítica (Manente et al., 2012). Las bacterias aparecen como agentes deteriorantes del papel, pero ya que los hongos filamentosos requieren menos humedad para desarrollarse, estos últimos prevalecen en ambientes como archivos, bibliotecas y museos, en donde, generalmente, las condiciones de humedad son controladas (Sequeira, Cabrita y

91

Macedo, 2012). Muchas de las bacterias presentes en estos materiales pueden crecer usando pocas concentraciones de nutrientes, causan daño químico y estético, y, al mismo tiempo, facilitan el desarrollo de otros microorganismos (Koestler et al., 1988 citado en Guiamet et al., 2011). Entre las bacterias celulolíticas que participan en el proceso de degradación del papel se han reportado géneros como Bacillus, Pseudomonas, Cellulomonas y Cellvibrio; Myxobacterias de los géneros Cytophaga y Sporocytophaga, géneros de actinomycetes como Streptomyces y Nocardia (Gallo, 1992; Altibrandi, 2002; Pasquariello et al., 2005 en Manente et al., 2012).

Por otro lado, los hongos filamentosos han sido reconocidos como los mayores responsables del proceso de biodeterioro en papel, gracias a su gran tolerancia a variaciones en las condiciones ambientales: sus propágulos pueden germinar en condiciones de baja humedad relativa (%HR) y pueden desarrollarse en sustratos con menor cantidad de agua que las bacterias. Algunos de los géneros celulolíticos reportados han sido Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Cladosporium, Stachybotrys, Trichoderma, Ulocladium, Chaetomium, Mucor y Rhizopus (Gallo, 1985; Gallo, 1992; Nyuksha, 1994; Zyska, 1997; Florian y Manning, 2000; Montemartini, Ferroni, Salvo, 2003; Pasquariello et al., 2005 citado en Manente et al., 2012; Lugauskas et al., 2003; Das et al., 1997). En el estudio realizado por Villalba y colaboradores, (2010), morfotipos de hongos considerados como Mycelia sterilia y los pertenecientes a los géneros Cladosporium, Trichoderma y Paecilomyces, también mostraron actividad celulolítica.

Respecto a la actividad proteolítica, se destacan los géneros Bacillus, Micrococcus, Penicillium y Actinopolyspora (Villalba, Mikan y Sánchez, 2004). Los resultados en el estudio de Villalba y colaboradores (2010) mostraron que el 85,7% de los morfotipos aislados de papel presentaron actividad celulolítica, mientras que el 42,86% fueron amilolíticos y el 47,62% proteolíticos. La alta incidencia de morfotipos celulolíticos está justificada en el tipo de sustrato de donde fueron aislados (Montemartini, Ferroni y Salvo, 2003), considerando que el componente principal del papel son las fibras celulósicas. Las actividades amilolíticas y proteolíticas aparecen como actividades complementarias que permiten la degradación de otros componentes minoritarios de los soportes documentales (Villalba et al., 2010).

Muchas especies de hongos, aisladas a partir de indicadores de biodeterioro en papel, hacen parte de la micobiota presente en el aire; muchas de estas especies han sido reportadas como agentes causales de foxing en documentos (Arai, 2000 citado en Montemartini, 2003). Hay una cantidad considerable de bacterias y levaduras frecuentemente no mencionadas en la literatura, como microorganismos asociados a foxing; pero, en sí están relacionados con otras modificaciones en el papel (Montemartini, 2003).

Se considera que el daño del material documental es el resultado de una sucesión ecológica de microorganismos que, en conjunto, potencializan el deterioro de la documentación; proceso evidenciado con la evaluación de actividades hidrolíticas de poblaciones microbianas recuperadas de material con biodeterioro, el cual deja ver claramente los hongos como colonizadores primarios, gracias a sus complejos sistemas enzimáticos, seguidos de las bacterias y levaduras como colonizadores secundarios (Villalba, Mikan y Sánchez, 2004 citado en Villalba et al., 2010).

92

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

Adicionalmente, Villalba e investigadores (2010) reportan morfotipos de levaduras pertenecientes al género Rhodotorula aisladas de papel, que no presentaban ninguna actividad hidrolítica. Debido a que no existen reportes en donde se presente el género Rhodotorula y, en general, las levaduras como destacadas degradadoras de polímeros, los autores consideran que su mecanismo de obtención de fuentes nutricionales y crecimiento en el papel incluye la utilización de monómeros liberados por la acción enzimática de otros microorganismos como los hongos filamentosos, como parte de una serie de relaciones ecológicas (Villalba et al., 2010).

La colonización de especies fúngicas se basa, principalmente, en estructuras de resistencia y dispersión como ascosporas y conidios; la estructura natural de las ascosporas como progenitoras le permite al hongo sobrevivir a condiciones drásticas, siendo estas más difíciles de inactivar, en comparación con las hifas vegetativas. Por otra parte, el desarrollo fúngico en el papel está regulado por las condiciones de temperatura y humedad del sitio de almacenamiento: condiciones ambientales específicas como escasa ventilación, falta de limpieza y la ausencia de un sistema para el control de humedad, que ocasionan incrementos de temperatura y humedad relativa, factores que favorecen la acumulación de esporas ambientales y la colonización de hongos en algunos de los materiales de lectura (Castrillón et al., 2009).

En los últimos años, se han desarrollado técnicas moleculares para el estudio de la diversidad microbiana y las complejas interacciones de las comunidades involucradas en el biodeterioro del papel (González y Saiz, 2005 citado en Michaelsen et al., 2006). Métodos basados en el análisis del DNA representan un gran potencial para descifrar la diversidad fúngica en papel (Michaelsen et al., 2006).

Algunos investigadores (Rogerio y Sáiz, 2011) afirman que se pueden emplear diversas técnicas para estudio del biodeterioro en bienes culturales, tales como: microbiología clásica, biología molecular (extracción de ADN, reacción en cadena de la polimerasa –PCR–, electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización –DGGE–, secuenciación y análisis bioinformático, pirosecuenciación), microscopía, análisis digital de imágenes, cromatografía, entre otras.

En particular, las técnicas de biología molecular han sido empleadas en la actualidad para el análisis y control del biodeterioro de poblaciones microbianas que contaminan diferentes tipos de soportes (Vaillant, 2013). Según González y Saiz (2005) citados por Vaillant (2013), dichas técnicas han contribuido en: la identificación microbiana a nivel de especie y subespecie en diferentes condiciones ambientales o en las cuales no se logra obtener aislamientos mediante métodos microbiológicos clásicos; en el uso de micro muestras de material, con evidencias de biodeterioro; en la introducción de genes nuevos o mutados en especies de organismos biológicos relacionados con el deterioro de los materiales históricos; en la investigación de los mecanismos de interacción organismo-soporte y resistencia de agentes biológicos a biocidas; en el uso de especies genéticamente manipuladas para evaluar la eficacia de tratamientos de erradicación de organismos biológicos; en la investigación de la expresión génica y el análisis funcional a partir de una sola célula.

93

3.3 Indicadores de biodeterioro Los hongos filamentosos, al establecerse en el papel, generan patrones de crecimiento o manifestaciones visuales propias en el soporte documental, conocidas como indicadores de biodeterioro (Montemartini et al., 2003 citado en Villalba et al., 2010).

Los documentos que presentan biodeterioro, por lo general, exhiben muchas alteraciones, siendo las más frecuentes las pigmentaciones y los daños mecánicos (Florian y Manning, 2000; Gallo, 1985).

Existen diferentes maneras en las que los microorganismos pueden alterar la estructura y función de los sustratos; específicamente, los hongos causan alteraciones cromáticas con diferentes tonalidades y texturas, debido al desarrollo del micelio y la producción de pigmentos. En el proceso de biodeterioro del papel, los microorganismos degradan los componentes a base de carbono como la celulosa y producen ácidos orgánicos como el ácido oxálico, fumárico, succínico y acético, los cuales acidifican el sustrato, causando el debilitamiento de las fibras de celulosa; por lo tanto, adicional a las alteraciones cromáticas, también causan un daño químico visible en las propiedades físicas del material (Borrego et al., 2010).

Otros autores reportan que el crecimiento microbiano, ya sea por hongos o bacterias, aparece como un cambio en la coloración del papel, con la formación de manchas de diferentes colores (púrpura, amarillo, café, negro, rojo y verde), diferentes formas y tamaños, causadas por la presencia de micelio pigmentado o esporas fúngicas con producción de exopigmentos (Manente et al., 2012). Generalmente, estos indicadores aparecen como manchas puntiformes y circulares; no obstante, los últimos estudios han mostrado que no es posible limitar la aparición de estas manchas exclusivamente a la presencia de microorganismos, su aparición está influenciada por circunstancias como el tipo de papel y sus características químicas (Manente et al., 2012).

Entre estos procesos de coloración del papel, uno de los más descritos es el fenómeno denominado “foxing” (Manente et al., 2012), el cual se refiere a pequeñas manchas de diferentes intensidades, las cuales pueden variar en color, desde un rojo oxidado hasta un beige o el glow, el cual emite fluorescencia bajo exposición a luz ultravioleta (Montemartini et al., 2003). Estas manifestaciones en los soportes, producto de la actividad de microorganismos, se visualizan como manchas irregulares con tonalidades de amarillo a café que se distribuyen en diferentes lugares del documento (Villalba et al., 2010).

Reportes explican el fenómeno de foxing, causado por hongos, como la reacción entre la glucosa y los oligosacáridos, producto de la degradación de la celulosa, con los aminoácidos que sintetiza el hongo para su crecimiento y el ácido aminobutírico, producto del metabolismo, en una reacción de Maillard que genera sustancias melanoides causantes de la pigmentación café en el papel (Arai, 2000 citado en Villalba et al., 2010). Otros autores afirman que este fenómeno corresponde a grupos de conidios que han sido depositados sobre la superficie del papel y germinado in situ. La posible causa de foxing, en este caso, es la contaminación por auto oxidación de los lípidos del conidio (Cruz, 2012).

Recientes estudios sobre las coloraciones causadas por los hongos en papel afectado por humedad y ataque biológico sostienen una relación entre las caracte-

94

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

rísticas del indicador y el tipo de microorganismo involucrado (Sato, Aoki y Kigawa 2014; Villalba et al., 2010).

Indicadores de color rojizo fueron relacionados con aislamientos del género Penicillium (Sato, Aoki y Kigawa., 2014), mientras que Villalba e investigadores (2010) reportan indicadores asociados a este mismo género, como manchas irregulares pequeñas de color marrón de gran distribución en los bordes del documento. En este estudio, cada género aislado generaba manifestaciones características en el papel, las cuales variaban en cuanto a forma, color y tamaño de las manchas producidas, lo que puede estar relacionado con la capacidad de esporulación y colonización del papel de cada hongo (Villalba et al., 2010).

Indicadores con tonalidad amarilla han sido relacionados con la presencia de Penicillium chrysogenum, Geomyces sp., Penicillium solitum, Aspergillus versicolor y Penicillium citreonigrum (Sato, Aoki y Kigawa, 2014); resultados que coinciden con lo expuesto por Villalba y colaboradores (2010), quienes reportan una asociación entre indicadores de tonalidad amarilla y el género Aspergillus.

Indicadores de color negro fueron asociados a hongos del género Stachybotrys (Sato, Aoki y Kigawa, 2014).

Según Florian (2002), la mayoría de los productos metabólicos microbianos depositados en el papel continúan su efecto deletéreo; incluso, aunque el hongo se encuentre inactivo, productos de excreción, como la glicerina, pueden incrementar el contenido de humedad en el indicador, favoreciendo la activación de conidios en una subsecuente contaminación. Algunos lípidos también pueden sufrir oxidación, formación de radicales libres y peróxidos que contribuyen a la formación de coloraciones marrón en el sustrato. La formación de pigmentos coloreados por procesos metabólicos también genera un efecto en la posibilidad de lectura del objeto (Florian, 2002; Abdel-Kareem, 2010 citado en Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012).

3.4 Métodos de control del biodeterioro en papel Los hongos se han convertido en un dominante y creciente problema en archivos y bibliotecas, por lo que encontrar métodos de prevención y tratamiento de los documentos afectados se ha convertido en un reto para restauradores y científicos.

En términos generales, cabe anotar que, según Vaillant (2013), para el control del biodeterioro, se debe tener en la cuenta la evaluación individual de los múltiples factores relacionados con cada caso en particular, para poder plantear alternativas específicas de solución. En este sentido, se han establecido medidas para la conservación preventiva en archivos y bibliotecas para libros, documentos de archivo, dibujos, grabados, planos, carteles, sigiligrafía (sellos de diferente tipología, siendo los más comunes los sellos de placa sobre cera u oblea, y los sellos pendientes de cera o metal), fotografía, soportes mecánicos (discos y cilindros), soportes magnéticos y digitales; las cuales están, principalmente, orientadas al mantenimiento de condiciones adecuadas y estables de temperatura y humedad relativa, según características de cada tipo de soporte, de tal forma que se impida el establecimiento de deterioro y/o biodeterioro (Hidalgo, 2010).

95

Con el fin de reducir los eventos de biodeterioro por acción de hongos, las instituciones dedicadas al almacenamiento y mantenimiento de este material cuentan con protocolos que integran el control de las condiciones ambientales y la aplicación de métodos físicos, químicos y biológicos, con el fin de garantizar su conservación y adecuada restauración. La mayoría de estos métodos han sido adaptados de otros campos, como la industria de alimentos o farmacéutica (Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012), y pueden ir desde limitar el acceso al agua, vital para la actividad de los microorganismos, hasta la aplicación de productos químicos con actividad antimicrobiana. Limitar el acceso al agua, disminuyendo la actividad acuosa (Aw) del sustrato, se considera la manera más simple e inofensiva de detener el crecimiento fúngico; sin embargo, puede ser un proceso lento y el tiempo es un factor importante en el crecimiento de los microorganismos.

Usualmente, los métodos físicos de control no tienen acción a largo plazo y su acción microbicida es inmediata, mientras que la mayoría de los métodos químicos dejan residuos que prolongan el efecto antimicrobiano durante un periodo limitado de tiempo. Algunos de estos compuestos son aplicados en el proceso de manufactura del papel para prevenir el desarrollo microbiano; no obstante, la mayoría de ellos son aplicados luego de detectar documentos con deterioro biológico avanzado (Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012).

Entre los factores que afectan la actividad antimicrobiana de los compuestos químicos se encuentran: el tiempo de contacto, la concentración, temperatura, pH, presencia de materia orgánica y el tipo de microorganismo (Russell, 2003 citado en Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012).

3.4.1 Métodos f ísicos 3.4.1.1 Freeze-drying (liof ilización) Es un método en el que el agua es congelada y luego removida del material por sublimación; ello permite que el agua sea removida sin los efectos de las fuerzas de evaporación del agua que pueden causar cambios dimensionales. Este proceso puede inactivar los propágulos, células bacterianas y detener el crecimiento micelial (Sussman, 1966; Mazur, 1968; Florian, 2002 citado en Michaelsen et al., 2013). Sin embargo, la congelación también incrementa la porosidad de los materiales orgánicos, haciéndolos más higroscópicos; adicionalmente, si el contenido de humedad del material descongelado permanece alto, los conidios secos restantes pueden ser reactivados. A pesar de que no puede ser considerado el tratamiento más efectivo, es uno de los métodos más conocidos para la estabilización de objetos afectados por el agua en archivos, bibliotecas y museos (Michaelsen et al., 2013).

3.4.1.2 Radiación Las radiaciones gamma y ultravioleta son reconocidas por su efecto microbicida al causar la desnaturalización y escisión de ácidos nucléicos. No obstante, se han descrito efectos indeseados al ser aplicados en papel, ya que la radiación resulta

96

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

en una acumulativa depolimerización de las moléculas de celulosa constitutivas del papel (Michaelsen et al., 2013).

3.4.2 Métodos q uímicos La mayoría de los compuestos microbicidas utilizados para el control del biodeterioro son caracterizados de acuerdo con su mecanismo de acción. Entre los compuestos que actúan sobre la membrana del microorganismo, con efectos letales se encuentran: alcoholes, fenoles, ácidos, biguanidinas, amonios cuaternarios y azoles (Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012).

El óxido de etileno ha sido uno de los tratamientos ampliamente utilizados en el pasado. Dicho compuesto no requiere energía de activación, se usa a temperatura ambiente, y expresa la alta reactividad y difusividad requerida para la inactivación de microorganismos, ocasionada por anormalidades metabólicas, debido a la alquilación de ácidos nucleicos y proteínas; no obstante, este mecanismo hace del óxido de etileno un potencial agente carcinogénico, motivo por el cual, la conservación del papel, por medio de este método, se encuentra vedada en muchos países.

Adicionalmente, estudios han señalado al tratamiento con óxido de etileno como estimulante de ataques microbianos después de su aplicación (Michaelsen, 2013).

Los alcoholes son uno de los compuestos más utilizados en el control del biodeterioro en papel, su eficacia incrementa con la longitud de la cadena y su mecanismo de acción se basa en la coagulación y desnaturalización de las proteínas en la célula microbiana (Bacílková, 2006). La mayor eficacia se alcanza en concentraciones entre el 50% y 90% (v/v), dependiendo del tipo de alcohol. Los alcoholes son efectivos contra formas vegetativas de bacterias y hongos, pero su efecto contra microorganismos esporulados no está bien descrito aún; por lo tanto, son considerados agentes desinfectantes y no esterilizantes (Bacílková, 2006 citado en Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012).

El grupo de los azoles actúa sobre la membrana de los microorganismos, específicamente con acción sobre hongos filamentosos. En las últimas décadas, han sido ampliamente estudiados como compuestos antimicóticos para humanos y, por su uso veterinario, estos compuestos actúan inhibiendo la biosíntesis del ergosterol, lo que conduce a alteraciones en la membrana y, en consecuencia, afecta el crecimiento fúngico (Lamb et al., 2000; Paulus, 2004 citado en Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012).

Los amonios cuaternarios son microbicidas de acción sobre membrana y alteran la permeabilidad de la pared celular, permitiendo que el componente activo penetre la membrana, conduciendo al daño y muerte celular (Paulus, 2004). Son considerados compuestos esporistáticos al inhibir la germinación de las esporas (Paulus, 2004 citado en Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012).

En un estudio realizado por Mateus et al. (2004), donde se evaluó la acción inhibitoria y reducción de la carga microbiana en hongos de los géneros Cladosporium y Penicillum, sobre soportes a base de papel, mediante la aspersión de los desinfectantes Timsen®, New ger®, así como de etanol al 70%, se eligió como óptimo al primer desinfectante debido a su acción efectiva y mínima aparición de cambios

97

en la estructura del papel y la información contenida. La aplicación con alcohol presenta inconvenientes debido a su capacidad de solubilizar tintas, especialmente las de bolígrafo.

Un tratamiento efectivo para la remoción o reducción de la cantidad de ascosporas y conidios fúngicos es la aplicación de cloruro de dimetil-benzil-amonio.

Soluciones de dicho compuesto se han empleado con éxito para la limpieza de la atmósfera contaminada por hongos (Calvo, 1997). Los resultados de estudios indican que una solución de [tiabendazol (tiazolil-4) -2 benzimidazol], aplicado en un 10% por nebulización térmica, a una tasa de 5 mL/m3, permite obtener el efectivo saneamiento de la atmósfera, al mismo tiempo que actúa sobre las esporas depositadas sobre las superficies (Rakotonirainy et al., 2005).

Muchos de estos tratamientos químicos tradicionales pueden ser potencialmente tóxicos y representar algún tipo de riesgo para la salud del personal en contacto con los documentos. En la actualidad, la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos de baja toxicidad ha cobrado gran importancia; en este contexto, el uso de productos naturales surge como alternativa para el control de los microorganismos deteriorantes, teniendo en la cuenta que los extractos provenientes de plantas han sido utilizados con la finalidad de inhibir el crecimiento de los microorganismos, resolver los problemas de resistencia microbiana y reducir los efectos colaterales de algunos antimicrobianos sintéticos (Vera et al., 2007).

De esta manera, una opción que resulta útil para el control del biodeterioro del patrimonio cultural y la conservación del medio ambiente es el uso de plantas con actividad biocida, lo cual ha sido reportado, por ejemplo, por Arenas e investigadores (2007), quienes evaluaron la actividad biocida de extractos vegetales (Cichorium intybus L., Arctium lappa L., Centaureacyanus L., Plantago major L., Medicago sativa L., Allium sativum L., Pinus caribaea Mor., Eucalyptuscitriodora Hook., Piper auritum Kunth.) obtenidas en Buenos Aires (Argentina) y en la Habana (Cuba), sobre microorganismos comúnmente relacionados con biodeterioro. Se observó que los extractos acuosos no mostraron actividad antibacteriana, en contraste con los resultados positivos de extractos etanólicos de Cichorium intybus, Arctium lappa y Centaurea cyanus, que tuvieron moderada actividad contra Pseudomonas sp.; y con los de Allium sativum, Pinus caribaea, Eucalyptus citriodora y Piper auritum, que tuvieron actividad moderada de control para bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Los aceites esenciales de plantas han sido reconocidos por sus propiedades antibacterianas y antifúngicas, así como su aplicación en la conservación de bienes de interés cultural (Rakotonirayni y Lavedrine, 2005). Estos están constituidos por compuestos terpenoides que, debido a su hidrofobicidad, se acumulan en la bicapa lipídica de la membrana celular, conduciendo a alteraciones en su estructura y función (Sequeira, Cabrita y Macedo, 2012). Se ha reportado alta actividad fungistática y fungicida para el linalool probado en cepas de hongos filamentosos, aislados de ambientes de archivos y bibliotecas (Rakotonirainy y Lavédrine, 2005).

Así mismo, en Colombia, entes rectores en la temática de conservación de patrimonio documental y bilbiográfico, como el Archivo General de la Nación y la Biblioteca Nacional de Colombia, han realizado estudios interinstitucionales para encontrar

98

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

plantas nativas con acción microbicida, para ser utilizadas en el control del biodeterioro y control de biocontaminación para depósitos o reservas documentales. Se han explorado plantas como el Arrayán, Canelón, Artemisa, Tomillo, Piper y Ajo, entre otras, con una eficiente acción inhibitoria in vitro para la esporulación de hongos y reducción en su tasa de crecimiento; “como ha sido mencionado por la Dra. Sandra Angulo, quien es coordinadora del centro de conservación de la Biblioteca Nacional de Colombia” (S. Angulo, comunicación personal, agosto de 2014).

3. Perspectivas de investigación 3.1 Estado de la investigación en biodeterioro Nuestro entendimiento sobre la interacción entre los microorganismos y los diferentes materiales que son objeto de biodeterioro ha avanzado en los últimos 40 años gracias a las metodologías propuestas por los científicos para el estudio detallado de este fenómeno. El biodeterioro es un proceso complejo en el que intervienen agentes físicos, químicos, antrópicos y biológicos, razón por la cual debe abordarse desde un punto de vista interdisciplinario. Actualmente, existen herramientas y metodologías disponibles para estudiar este fenómeno, pasando por la microbiología clásica hasta la biología molecular, la bioquímica y la nanotecnología. A continuación, se presentan algunas de estas metodologías aplicables en el campo de la conservación de bienes culturales.

Debido a la existencia de agentes microbianos no cultivables por técnicas de microbiología tradicional, en recientes investigaciones se han empleado técnicas de biología molecular para el estudio de la diversidad de microorganismos presentes en los materiales; se trata de estudios basados en la extracción de su material genético y el estudio del RNA ribosomal (16S rRNA) (Wan y Lewin, 2006; Jroundi et al., 2010; Ettenauer et al., 2010), haciendo posible la identificación taxonómica, incluso de organismos no cultivables en el laboratorio. Entre otras técnicas moleculares, se destaca el uso de PCR en tiempo real, para determinar el número de células viables de una muestra, haciendo posible un mejor análisis de los agentes causantes de biodeterioro (Wang & Lewin, 2006). Así mismo, la construcción de librerías de clones, con fragmentos extraídos y amplificados de DNA, los análisis por DGGE (electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante) (Schabereiter et al., 2001) y el uso de marcadores moleculares para análisis de secuencias genómicas, son herramientas ampliamente utilizadas en estudios de diversidad microbiana (Suihko et al., 2007). El uso de estas técnicas moleculares ha ampliado el rango de organismos detectados y su rol en el biodeterioro de documentos, pinturas, monumentos históricos en piedra, y otros materiales.

En los últimos años, la microbiología ambiental aplicada a la conservación del patrimonio cultural ha centrado su atención en el estudio de la forma como se desarrollan e interactúan diferentes comunidades microbianas en los soportes; específicamente, el estudio de las biocapas o biofilms ha sido ampliamente abordado, puntualmente, en construcciones en piedra (Villalba y Malagón 2011, Miller et al.,

99

2008) debido a la importancia de entender sus dinámicas a la hora de plantear metodologías de control del biodeterioro. En este campo, son utilizadas tecnologías como la Microscopía Electrónica de Barrido (MEB), la Difracción de Rayos X (DRX) y la Espectrometría de Dispersión de Energía de Rayos X (EDS) para dilucidar la estructura de los biofilms, la forma como los microorganismos se desarrollan en el sustrato y determinar la composición de cristales y otras sustancias relacionadas con el biodeterioro (Villalba y Malagón, 2011; Guiamet et al., 2013).

Otro aspecto importante en la investigación sobre los procesos de biodeterioro, es el estudio del metabolismo microbiano a través de la bioquímica y el análisis de los metabolitos producidos por los organismos que actúan directa o indirectamente en el deterioro del material, por medio de técnicas como la Espectroscopía FTIR y Micro Raman (Edwards, Farwell y Seaward, 1991; Franquelo et al., 2009; Herrera y Videla, 2009). La evaluación incluye observar la producción de sustancias como ácidos orgánicos, pigmentos y otros metabolitos implicados en el biodeterioro (Warscheid y Braams, 2000; Manente et al., 2012).

Del mismo modo, los trabajos sobre caracterización enzimática han cobrado gran importancia en el campo. Diversos estudios se han enfocado en la exploración del potencial enzimático de los microorganismos aislados de diferentes materiales, como es el caso de los microorganismos celulolíticos, amilolíticos y proteolíticos aislados de soporte papel (Rojas et al., 2009). Los avances en este campo han contribuido al desarrollo biotecnológico mediante la prospección de microorganismos y sus enzimas con potencial industrial, como es el caso del estudio realizado en el Archivo Histórico de Bogotá, en donde, a partir del cepario institucional de microorganismos aislados del ambiente y de documentos con biodeterioro, se realizó la búsqueda y selección de una proteasa que pudiese ser usada en la eliminación “limpia” de encolantes sobre soportes documentales con valor de patrimonio histórico de forma eficiente y económica.

De 74 morfotipos viables evaluados sobre placas selectivas, 32 morfotipos presentaron formación de halos de hidrólisis evidentes sobre placas diferenciales, 10 morfotipos fueron seleccionados, representativos de los géneros Penicillium, Stachybotrys, Chaetomium y Eladia. De ellos, se evaluó el perfil isoenzimático de 8 morfotipos provenientes de muestreos documentales directos y de 2 morfotipos proteolíticos promisorios, provenientes de un trabajo previo (Cruz et al., 2012).

Finalmente, el reto para las futuras investigaciones en materia de biodeterioro y conservación de bienes culturales, se basa en la optimización de los métodos de estudio, utilizando herramientas y técnicas no invasivas, y aprovechando el potencial tecnológico disponible en otros campos de estudio, en busca de un trabajo multidisciplinario.

100

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

Bibliog raf ía Abdel-Kareem, O. (2010). Fungal deterioration of historical textiles and approaches for their control in Egypt. E-Preservation Science, 7, 40-47.

Allsopp, D., Seal, K. J., y Gaylarde, C. C. (2004). Introduction to Biodeterioration.

Segunda edición. Cambridge: Cambridge University Press.

Altibrandi, M. G., (2002). Il deterioramento di natura biologica. En: Chimica e biología applicate alla conservazione degli archivi. Pubblicazione degli Archivi di Stato, Roma, Saggi, 74, 367-379.

Andrews, T., Andrews, W., y Baker, C. (1992). An investigation into the removal of enzymes from paper following conservation treatment. Journal of the American Institute for Conservation, 31(3), 313-323.

Arai, H. (2000). Foxing caused by fungi: twenty-five years of study. International Biodeterioration & Biodegradation, 46, 181-188.

Arenas, P., Gómez de Saravia, S., Guiamet, P., de la Paz, J., y Borrego, S. (2007).

68-Plantas con actividad biocida de aplicación en el control del biodeterioro que afecta al patrimonio cultural. Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 6(6), 323-324.

Arino, X., Gómez, A., y Saíz, C. (1997). Lichens on ancient mortars. International Biodeterioration and Biodegradation, 40(2-4), 217-224. DOI: 10.1016/ S0964-8305(97)00036-X. Bacílková, B. (2006). Study on the effect of butanol vapours and other alcohols on fungi. Restaurator, 27(3), 186-199.

Borrego, S., Guiamet, P, Gómez de Saravia, S., y Bastinini, P. (2010). The quality of air at archives and the biodeterioration of photographs. International Biodeterioration & Biodegradation, 64(2), 139-145. DOI: 10.1016/j.ibiod.2009.12.005.

Calvo, A. M. (1997). Conservación y restauración: Materiales, técnicas y procedimientos: de la A a la Z. Barcelona: Ediciones Serbal.

Caneva, G., Nugari M., y Salvadori, O. (2000). La biología de la restauración. Junta de Andalucía, Consejería de Cultura, IAPH: Editorial Nerea.

Cepero, A., Martínez, P., Castro, J., Sánchez, A., y Machado, J. (1992). The biodeterioration of cultural property in the republic of Cuba: A Review of some experiences.

Proceedings of the 2nd International Conference on Biodeterioration of Cultural Property.

Held at Pacifico Yokohama (479-487), Tokyo: International Communications Specialists.

Chazal, N. M., y Smith, G. D. (1994). Characterization of a brown Nostoc species from Java that is resistant to high light intensity and UV. Microbiology, 140 (11), 3183-3189.

DOI: 10.1099/13500872-140-11-3183.

Crispim, C., Gaylarde, C., y Gaylarde, P. (2004). Biofilms on church walls in Porto Alegre, RS, Brazil, with special attention to cyanobacteria. International Biodeterioration & Biodegradation, 54, 121 – 124.

Crispima, C. A., Gaylarde, C.C. (2004). Cyanobacteria and Biodeterioration of Cultural Heritage: A Review. Microbial Ecology, 49(1), 1-9.

Cruz-Ramírez, C., Villalba-Corredor, L. S., Mikán-Venegas, J. F., y Ospina-Sánchez, S. A. (2012). Búsqueda y selección de una proteasa fúngica con potencial aplicación en la

101

restauración de documentos históricos en el Archivo de Bogotá. Revista Colombiana de Biotecnología, 14(1), 108-120.

Das, M. K. L., Prasad, J. S., Ahmad, S. K. (1997). Endoglucanase production by paper degrading my coflora. Letters in Applied Microbiology, 25(5), 313-315. DOI: 10.1046/j.1472-765X.1997.00217.x.

De Hoog, G. S. (1993). Evolution of black yeasts: possible adaptation to human host.

Antonie van Leeuwenhoek, 63(2), 105-109.

De Leo, F., y Urzì, C. (2003). Fungal colonization on treated and untreated stone surfaces. En: Saiz-Jimenez, C. (Ed.). Molecular Biology and Cultural Heritage (pp.213-218). The Netherlands: Swets & Zeitlinger BV, Lisse.

Edwards, H. G. M., Farwell D. W., y Seaward M. R. D. (1991). Raman spectra of oxalates in lichen encrustations in Renaissance frescoes. Spectrochemical Acta, 47(11), 15311539. DOI: 10.1016/0584-8539(91)80247-G. Ettenauer, J., Sterflinger, K., Piñar, G. (2010). Cultivation and molecular monitoring of halophilic microorganisms inhabiting an extreme environment presented by a salt-attacked monument. International Journal of Astrobiology, 9(01), 59-72. DOI: 10.1017/ S1473550409990383.

Flores, M., Morrillo, M., y Crespo, M. (1997). Deterioration of raw materials and cosmetic products by preservative resistant microorganisms. International Biodeterioration and Biodegradation, 40(2-4), 157-160. DOI: 10.1016/S0964-8305(97)00037-1.

Florian, M. L. E. (2002). Fungal Facts - Solving Fungal Problems in Heritage Collections.

Great Britain: Archetype Publications.

Florian, M. L. E., y Manning, L. (2000). SEM analysis of irregular fungal fox spots in an 1854 book: population dynamics and species identification. International Biodeterioration & Biodegradation, 46(3), 205-220. DOI: 10.1016/S0964-8305(00)00062-7 Franquelo, M. L., Duran, A., Herrera, L. K., Jiménez de Haro, M.C., Pérez-Rodríguez, J. L. (2009). Comparison between micro-Raman and micro-FTIR spectroscopy techniques for the characterization of pigments from Southern Spain Cultural Heritage. Journal of Molecular Structure, 924-926, 404–412. DOI: 10.1016/j.molstruc.2008.11.041.

Gallo, F. (1985). Biological factors in deterioration of paper. Roma, Italia: ICCROM. Gallo, F. (1992). Il biodeterioramento di libri e documenti. En: Centro di Studi per la Conservazione della Carta. Roma, Italia: ICCROM. García, F., Sherry, N. D., Castenholz, R. W. (1992). Evidence for an ultraviolet sunscreen role of the extracellular pigment scytonemin in the terrestrial cyanobacterium Chlorogloeopsis sp. Photochemistry and Photobiology, 56(1), 17-23. DOI: 10.1111/j.17511097.1992.tb09596.x.

García, J. L., (1998). De la cultura como patrimonio al patrimonio cultural. Política y sociedad, 27, 9 - 20.

Gaylarde, C. C., y Morton, L. H. G. (1999). Deteriogenic biofilms on buildings and their control: A review. Biofouling, 14(1), 59–74. DOI: 10.1080/08927019909378397.

Giraldo-Castrillón, M., Torres-Gonzáles, C., y Díaz-Ortíz, J. (2009). Aislamiento de hongos celulolíticos causantes del biodeterioro de la biblioteca Central de la Universidad del Valle (Cali- Colombia). Revista Mexicana de Micología, 29, 9-14.

102

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

González, J. M., y Saiz-Jiménez, C. (2005). Application of molecular nucleic acid-based techniques for the study of microbial communities in monuments and artworks.

International Microbiology, 8(3), 189-194.

Guiamet, P., Borrego, S., Lavin, P., Perdomo, I., y Gómez de Saravia, S. (2011).

Biofouling and biodeterioration in materials stored at the Historical Archive of the Museum of La Plata, Argentine and at the National Archive of the Republic of Cuba. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 85(2), 229-234. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2011.02.031.

Guiamet, P., Crespo, M., Lavin, P., Ponce, B., Gaylarde, C., y Gómez de Saravia, S. (2013). Biodeterioration of funeral sculptures in La Recoleta Cemetery, Buenos Aires, Argentina: Pre- and post-intervention studies. Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 101C, 337-342. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2012.06.025.

Guillitte, O., (1995). Bioreceptivity: a new concept for building ecology studies. The Science of the Total Environment, 167, 215–220.

Guillon, E. (2004). Durabilité desmaté riaux cimentaires: modelisation de l’influence des équilibres physico-chimiques sur la microstructure et les proprié tés mécaniques ré siduelles (tesis de doctorado). Ecole Normale Supérieure de Cachan, Cachan, France.

Herrera, L., y Videla, H. (2009). Surface analysis and materials characterization for the study of biodeterioration and weathering effects on cultural property. International Biodeterioration & Biodegradation, 63(7), 813-822. DOI: 10.1016/j.ibiod.2009.05.002.

Hidalgo, M. (2010). Conservación preventiva y Plan de Gestión de Desastres en archivos y bibliotecas. Ministerio de Cultura. Secretaria General Técnica. Subdirección General de Publicaciones, Información y Documentación. Madrid, España: Gráficas/85 S.A. Hopton, J.W., (1988). Physical conditions and microbial growth: some implications for biodeterioration. En: Houghton, D. R., Smith, R. N., Eggins, H. O. W. (Eds.), Biodeterioration 7, (pp. 511-516). London and New York: Elsevier Applied Science.

Hueck, H. (1965). The biodeterioration of materials as part of hylobiology. Mater.Org. 1(1), 5-34.

Johnson, J. B., Montgomery, M., Thompson, G., Wood, G. C., Sage, P. W., y Cooke, M. J. (1996). The influence of combustion-derived pollutants on limestone derioration: 2.

The wet deposition of pollutant species. Corrosion Science, 38(2), 267-278.

Jroundi, F., Fernández-Vivas, A., Rodríguez-Navarro, C., Bedmar, E. J., y GonzálezMuñoz, M. T. (2010). Bioconservation of deteriorated monumental calcarenite stone and identification of bacteria with carbonatogenic activity. Microbial ecology, 60(1), 39-54. DOI: 10.1007/s00248-010-9665-y.

Koestler, R J, E.D. Santoro, J. Druzik, F. Preusser, L. Koepp, M. Derrick. (1988). Status Report: Ongoing Kumar, R., Kumar. A. V. (1999). Biodeterioration of stone in tropical environments, an overview. United States of America. Library of Congress Cataloging-in-Publication Data.

Lamb, D. C., Kelly, D. E., Baldwin, B. C., y Kelly, S. L., (2000). Differential inhibition of human CYP3A4 and Candida albicans CYP51 with azole antifungal agents. ChemicoBiological Interactions, 125(3), 165-175. DOI: 10.1016/S0009-2797(99)00169-6.

LeChevallier, M. W., Cawthon, C. D., y Lee, R. G. (1988). Inactivation of bacterial biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 54(10), 2492-2499.

Leygraf, C., y Graedel, T. (2000). Atmospheric corrosion. Electrochemical Society Series, New York: Wiley Interscience.

103

Lugauskas, A., Levinskaite, L., Peciulyte, D. (2003). Micromycetes as deterioration agents of polymeric materials. International Biodeterioration & Biodegradation, 52(4), 233-242.

Malaga, K., Panas I., Lindqvist, J. E., y Lindqvist, O. (2003). Efflorescence on thin sections of calcareous stones. Journal of Cultural Heritage, 4(4), 313-318. DOI: 10.1016/j. culher.2003.09.002 Manente, S., Micheluz, A., Ganzerla, R., Ravagnan, G., y Gambaro, A. (2012).

Chemical and biological characterization of paper: A case study using a proposed methodological approach. International Biodeterioration & Biodegradation, 74, 99-108. DOI: 10.1016/j.ibiod.2012.03.008.

Mateus, J., Peña, D., Peña, G., Rojas, Á., Rojas, J., Zambrano, S., Martínez, M. M., Flórez C., y Santander, M. (2004). Seguimiento y control de biodeterioro microbiológico en documentos de interés histórico en el Archivo General de la Nación. Universitas Scientiarum, 9(1), 37-46.

May, E., Lewis, F.J., Pereira, S., Tayler, S., Seaward, M.R.D., Allsopp, D., (1993).

Microbial deterioration of building stone: a review. Biodeterioration Abstracts, 7, 109–123.

Mazur, P., (1968). Survival of fungi after freezing and desiccation. En: Ainsworth, G. C., y Sussman, A. S. (Eds.). The Fungi: An advanced treatise, Vol III, The fungal population (pp.

325-394), London and New York: Academic Press.

Michaelsen, A., Pinzarib, F., Ripka, K., Lubitza, W., y Piñar, G. (2006). Application of molecular techniques for identification of fungal communities colonising paper material. International Biodeterioration & Biodegradation, 58(3-4), 133–141. DOI: 10.1016/j. ibiod.2006.06.019.

Michaelsen, A., Pinzari, F., Barbabietola, N., y Piñar, G. (2013). Monitoring the effects of different conservation treatments on paper-infecting fungi. International Biodeterioration & Biodegradation, 84, 333-341. DOI: 10.1016/j.ibiod.2012.08.0005.

Miller, A., Laiz, L., González, J., Dionisio, A., Macedo, M-F., Saiz-Jimenez, C. (2008). Reproducing stone monument photosynthetic-based colonization under laboratory conditions. Science of total environment, 405(1-3), 278-285. DOI: 10.1016/j. scitotenv.2008.06.066.

Montemartini. A, Ferroni. A., Salvo,V. S. (2003). Isolation of fungal species from test samples and maps damaged by foxing, and correlation between these species and the environment. International Biodeterioration & Biodegradation, 51(3), 167-173. DOI: 10.1016/S0964-8305(02)00137-3.

Nyuksha, P. Y., (1994). The biodeterioration of paper and books. En: Garg, K. L., Garg, N., y Mukerji, K. G. (Eds.). Recent Advances in Biodeterioration and Biodegradation, vol. 1.

Calcutta, India: Naya prokash.

Ortega, J., Sánchez, P., Hernández, M., y Saiz, C., (1993). Isolation and characterization of epilithic chlorophytes and cyanobacteria from two Spanish cathedrals (Salamanca and Toledo). Nova Hedwigia, 57(1-2), 293-253.

Panshin, A. J., Harrar, E. S., Barker, J. W., y Proctor, P. B. (1959). Pulpa y papel. En: Productos Forestales. Origen, beneficio y aprovechamiento (pp. 160-175). Salvat Editores.

Pasquariello, G., Valenti, P., Maggi, O., y Persiani, A. M., (2005). Carta eI processi di biodeterioramento in relazione ai materiali dei beni culturali. Da Biologia vegetale per i Beni Culturali. Biodeterioramento e Conservazione, vol. 1., Florencia, Italia: Nardini Editore.

104

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

Paulus, W. (Ed.). (2004). Directory of microbicides for the protection of materials, A handbook. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers.

Peters, D. (2000). An alternative to foxing? oxidative degradation as a cause of cellulosic discolouration. Papier Restaurierung, 1, 801-806.

Piñar, G., y Sterflinger, K. (2009). Microbes and building materials. En Cornejo, D. N., y Haro, J. L. (Eds). Building materials: properties, performance and applications (pp. 163188). New York: Nova Science Publishers.

Rakotonirainy, M. S., y Lavédrine, B. (2005). Screening for antifungal activity of essential oils and related compounds to control the biocontamination in libraries and archives storage areas. International Biodeterioration and Biodegradation, 55(2), 141-147. DOI: 10.1016/j.ibiod.2004.10.002.

Roelleker, S., Muyzer, G., Wawer, C., Wanner, G., Lubitz, W. (1996). Identification of bacteria in a biodegraded wall painting by denaturing gradient gel electrophoresis of PCRamplified gene fragments coding for 16s Rrna. Applied and Environmental Microbiology, 62(6), 2059-2065.

Rogerio, M., y Sáiz-Jiménez, C. (2011). Microbiología y Patrimonio Cultural. En: Rogerio, M., Sáiz-Jiménez, C. (Ed.). Ciencia y tecnología para la conservación del patrimonio cultural. TechnoHeritage (pp. 87-90). Sevilla, España: Edita Instituto de Recurso naturales y agrobiología de Sevilla. Recuperado de: http://www.cienciayculturaescrita.es/esp/images/ stories/descargas/Technoheritage-2011.pdf.

Rojas, J. A., Cruz, C., Mikan, J. F., Villalba, L. S., Cepero de García, M. C., y Restrepo, S. (2009). Isoenzyme characterization of proteases, amylases and partial purification of proteases from filamentous fungi causing biodeterioration of industrial paper. International Biodeterioration & Biodegradation, 63(2), 169-175.

Rojas, N. M., Rojas, T., Guerra, A. G., y Herrera. R. (2000). Aislamiento y caracterización de la microbiota responsable del biodeterioro de tejas de cemento para tejados de vivienda en zonas tropicales de Latinoamérica. Nova Acta Científica Compostelana (Bioloxía), 11, 191-196.

Russell, A., (2003). Similarities and differences in the responses of microorganisms tobiocides. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 52(5), 750-763. DOI: 10.1093/jac/ dkg422.

Saíz-Jiménez, C. (1997). Biodeterioration and biodegratadion: The role of microoorganisms in the removal of pollutants deposited on historical buildings.

International Biodeterioration and Biodegradation, 40(2-4), 225-232. DOI: 10.1016/ S0964-8305(97)00035-8.

Sato, Y., Aoki, M., Kigawa, R. (2014). Microbial deterioration of tsunami-affected paper-based objects: A case study. International Biodeterioration & Biodegradation, 88,142-149.

Schabereiter-Gurtner, C., Piñar, G., Lubitz, W., y Rölleke, S. (2001). An advanced molecular strategy to identify bacterial communities on art objects. Journal of Microbiological Methods, 45(2), 77-87. DOI: 10.1016/S0167-7012(01)00227-5.

Sequeira, S., Cabrita, E. J., y Macedo, M. F. (2012). Antifungals on paper conservation: An overview. International Biodeterioration & Biodegradation, 74, 67-86. DOI: 10.1016/j. ibiod.2012.07.011.

105

Sheerer, S., Ortega-Morales, O., Gaylarde C. (2009). Microbial Deterioration of Stone Monumens – An Updated Overview. Advances in Applied Microbiology, vol. 66 (pp. 97139). London and New York: Elsevier Applied Science.

Sikiotis, D., Kirkitsos, P. (1995). The adverse effects of nitrates on stone monuments. The Science of the total Environment, 171(1-3), 173-182. DOI: 10.1016/0048-9697(95)04718-8.

Sterflinger, K., y Piñar, G. (2013). Microbial deterioration of cultural heritage and works of art - tilting at windmills? Applied and Environmental Microbiology, 97(22) 96379646. DOI: 10.1007/s00253-013-5283-1.

Studies of the susceptibility of stone consolidants to microbiologically induced deterioration. En: Houghton, D. R., Smith, R. N., Eggins, H. O. W. (Eds.), Biodeterioration 7, (pp. –441-448). London and New York: Elsevier Applied Science.

Suihko, M-L., Alakomi, H-L., Gorbushina, A., Fortune, I., Marquardt, J., y Saarela, M. (2007). Characterization of aerobic bacterial and fungal microbiota on surfaces of historic Scottish monuments. Systematic and Applied Microbiology, 30(6), 494-508. DOI: 10.1016/j.syapm.2007.05.001.

Sussman, A.S., (1966). Longevity and survivability of fungi. En: Ainsworth, G. C., y Sussman, A. S. (Eds.). The Fungi: An advanced treatise, Vol III, The fungal population (pp.

477-486), London and New York: Academic Press.

Szczepanowska, H., y Cavaliere, A. (2012). Conserving our cultural heritage: The role of fungi in biodeterioration. En: Johanning, E., Morey, P., y Auger, P. (Eds.). Bioaerosols Fungi, Bacteria, Mycotoxins in Indoor and Outdoor Enviroments and Human Health (pp.

293 - 309). Albany: Fungal Research Group.

Toloza-Moreno, D., Lizarazo-Forero, L. M. (2011). Aeromicrobiología del Archivo Central de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (Tunja-Boyacá). Acta Biológica Colombiana, 16(1), 185-194.

Tretiach, M., Bertuzzi, S., y Candotto, F. (2012). Heat Shock Treatments: A New Safe Approach against Lichen Growth on Outdoor Stone Surfaces. Enviromental Science & Technology, 46(12), 6851-6859. DOI: 10.1021/es3006755.

Vaillant, M. (2013). Biodeterioro del patrimonio histórico documental. Alternativas para su erradicación y control. Río de Janeiro, Brasil: Museo de Astronomía y Ciencias Afines.

Fundación Casa de Rui Barbosa. Recuperdo de: http://www.mast.br/pdf/livro_millagros_ espanhol.pdf.

Vaillant, M., y Valentin, N. (1996). Principios básicos de la conservación documental y causas de su deterioro. 1ª edición. Madrid, España: Editorial Ministerio de la Educación y Cultura.

Valdés, C., Corvo, F., González, E., Pérez, J., Portilla, C., Cuesta, O. (2007).

Mecanismos de deterioro de la piedra caliza coralina estructural del Convento y Basílica Menor de San Francisco de Asís y ensayo de productos para su conservación. Revista CENIC Ciencias Químicas, 38(3), 381-388.

Vargas, N., Villalba, L. S., Rodriguez, D.A., Páez, F.E., Anzola, E. (2014). Informe técnico. Contrato de Consultoría No. 2506/14. Estudios técnicos y proyecto de intervención para la consolidación de las ruinas del templo y la cárcel del Municipio de Pore-Casanare.

Colombia: Ministerio de Cultura-Colombia.

Vera, J., Pastrana, P., Fernandez, K., y Viña, A. (2007). Actividad antimicrobiana in vitro de volátiles y no volátiles de Lippia alba y extractos orgánicos y acuoso de justicia

106

BIODETERIORO Y PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN

pectoraliscultivadas en diferentes pisos térmicos del departamento del Tolima. Scientia et Technica, XIII(33), 345-348.

Videla, A., Guiamet, P., y Gómez De Saravia, S. (2003). Biodeterioro de materiales estructurales de sitios arqueológicos de la civilización maya. Revista Museo La Plata, Publicación Técnica y Didáctica, 44, 1-11.

Villalba, L. S. (2003). Actividades hidroliticas de Poblaciones Microbianas recuperadas del patrimonio documental (tesis de maestría). Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias e Instituto de Biotecnología, Bogotá.

Villalba, L. S. (2012). Informe técnico. Contrato de Cosultoría No. 191. Biodeterioro de 35 monumentos en espacio público. Instituto Distrital de Patrimonio Cultural. Colombia.

Villalba, L. S., Mikan, J. F., y Sánchez, J. (2004). Actividades hidrolíticas y caracterización isoenzimática de poblaciones microbianas aisladas del patrimonio documental del Archivo General de Colombia. NOVA, 2(2), 50-58.

Villalba, L. S., y Malagón, A. (2011). Biodeterioro de la fuente de Lavapatas, parque arqueológico de San Agustín-Huila. Colombia. Ge-conservación. 2, 65-80.

Villalba, L. S; Patiño, M. C., Manrique, A., Rodríguez, M. X., y Gutiérrez Chaves, A. (2010). Estudio del Microbiodeterioro del Fondo Documental Anselmo Pineda de la Biblioteca Nacional de Colombia. Conservamos, 5(5), 3-31.

Wang, S., y Lewin, R. D. (2006). Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR. Journal of Microbiological Methods 64, 1-8.

Warscheid, T., Oetling, M., y Kumbrein, W. E. (1991). Physico-chemical aspects of biodeterioration processes on rocks with special regard to organic pollutants. International Biodeterioration, 28, 37-48.

Warscheid, T., y Braams, J. (2000). Biodeterioration of stone: a review. International & Biodegradation, 46, 343 - 368.

Wasserbauer, R., Zadak, Z., y Novotny, J. (1988). Nitrifying bacteria on the asbestos-cement roofs of stable buildings. International Biodeterioration & Biodegradation, 24, 153-165.

Webster, R. G. M., Andrew, C. A., Baxter, S., MacDonald, J., Rocha, M., Thomson, B. W., Tonge, K. H., Urquhart, D. C. M., y Young, M. E. (1992). Stonecleaning in Scotland - Research Report to Historic Scotland and Scottish Enterprise by Masonry Conservation Research Group, Aberdeen, Escocia: Gilcomston Litho.

Wiktor, V., De Leob, F., Ursì, C., Guyonnet, R., Grosseau, Ph., y Garcia, E. (2009).

Accelerated laboratory test to study fungal biodeterioration of cementitious matrix.

International Biodeterioration & Biodegradation, 63, 1061-1065.

Zyska, B., (1997). Fungi isolated from library materials: a review of the literature. International Biodeterioration and Biodegradation, 40(1), 43-51. DOI: 10.1016/ S0964-8305(97)00061-9.

107

108

5 hongos

formadores DE

micorrizas arbusculares ecolog ía y aplicación con un enfoq ue en g ramíneas

109

Rivera, Hugo1 Rendón, Yennyfer2 Mancipe, Carolina2 Fung, Yih3 Sánchez, Jimena4 Leal, María5 Casas, María6

1 Biólogo. MSc Microbiología.

Universidad Nacional de Colombia.

2 Ingeniera Agrónoma. Universidad Nacional de Colombia.

3 Microbióloga Industrial. MSc. Docente de Cátedra, departamento de Biología.

Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia.

4 Bacterióloga. MSc Microbiología.

Candidato PhD ciencias Agrarias. Docente Asociada, dedicación exclusiva, departamento de Biología.

Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia.

5 Bióloga. Universidad Nacional de Colombia.

Coordinadora Grupo de Astrobiología Universidad Nacional de Colombia-UNASB. 6 Estudiante Biología. Universidad Nacional de Colombia.

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

1. Introducción Las gramíneas son plantas herbáceas muy abundantes en el mundo; representan entre el 25% y el 40% de la biomasa total; están presentes, principalmente, en ecosistemas como sabana, estepas y praderas. Estas plantas son importantes para la biodiversidad por su número de especies y su papel ecológico, porque evitan la erosión de suelos y tienen un gran potencial a nivel económico (Giraldo Cañas, 2013). Son fundamentales para el mantenimiento del ser humano que las ha usado como base de su alimentación y su desarrollo cultural; especies como el trigo (Triticum aestivum L.), el arroz (Oryza sativa L.) la caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) y el maíz dan cuenta de la dependencia vital que hay entre la especie humana y esta familia de plantas (Pinto, 2002).

Los usos de estas se extienden más allá de la alimentación directa a otras áreas como la construcción, el forraje para ganadería, la conservación del suelo, la producción de medicamentos, elaboración de fragancias y artesanías, los arreglos florales y la jardinería, por mencionar algunos (Giraldo Cañas, 2013).

Cerca de 600 géneros y 10000 especies pertenecen a la familia Graminae; de estas, en Colombia, se han identificado 907 especies, distribuidas así: 77 endémicas, 89 naturalizadas, 52 cultivadas e introducidas, y el resto nativas o espontáneas. Debido a su gran cantidad de especies, las gramíneas han sido reconocidas como una de las principales y destacadas especies en la flora mundial (Giraldo Cañas, 2013). Se encuentran presentes en todas las latitudes, desde el Ecuador hasta los Círculos Polares; además, se ha encontrado que es una de las pocas familias con dos mecanismos fotosintéticos C3 y C4, que producen diferentes respuestas al calentamiento global, gracias a sus diferencias fisiológicas, bioquímicas y de respuesta a la luz. La explotación de las gramíneas se puede mejorar ahora que se reconoce la simbiosis entre esta familia y los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA), tema del cual se ocupará el siguiente estudio (Rendón et al., 2013).

Los HFMA forman parte de la mayoría de los ecosistemas terrestres y se ha reportado que su diversidad influye de forma determinante en el desarrollo y mantenimiento de las comunidades vegetales con las que se encuentran asociadas (Van der Heijden et al., 1998; Caballar, 2009). Aunque el número total de hongos del suelo involucrados en esta simbiosis es desconocido, estos han beneficiado muchas especies importantes en la agricultura, como el maíz, incrementando su adaptación a ambientes diferentes, con efectos positivos sobre la productividad del sistema agrícola (Serralde y Ramírez, 2004).

Por los beneficios propios de esta asociación simbiótica mutualista (hongo-planta), en los últimos años, se han realizado investigaciones para determinar el efecto del aislamiento de los HFMA sobre los sistemas de producción agrícola, con el fin de lograr sistemas de producción sostenibles y competitivos (Serralde y Ramírez, 2004). Así mismo, la aplicación de HFMA en zonas degradadas se convierte en una estrategia sustentable, razonablemente productiva y ambientalmente amigable (Mustafa, Othman, Abidin y Ganesan, 2010).

El término micorriza está compuesto por dos vocablos de origen griego: ‘mycos’ (hongo) y ‘rhyza’ (raíz), el cual fue usado por Frank en 1885 (Lambers y Teste, 2013)

111

para describir la relación simbiótica entre hongos y raíces. Los HFMA forman asociaciones con más del 80% de las plantas establecidas en el planeta, y son capaces de colonizar un rango amplio de especies vegetales, incluyendo mono y dicotiledóneas (Smith y Read, 2008).

Las micorrizas pueden ser de tipo arbutoide, ectomicorriza, ericoide, orquidioide o arbuscular, la más frecuente, están incluidas en el phylum Glomeromycota.

Señalando que las arbusculares son las más frecuentes y se caracterizan por generar estructuras ramificadas al interior de las células radicales, promoviendo el intercambio bidireccional de nutrientes y agua (Carlile et al., 2000; Smith y Read, 2008); por ello, los HFMA constituyen un recurso microbiológico básico para la producción agrícola en agroecosistemas sostenibles (Duicela et al., 2003).

Aunque se acepta la hipótesis de que la colonización vegetal del planeta tierra se dio gracias a la simbiosis entre las micorrizas y las raíces de las plantas, alrededor del 18% de las plantas vasculares no establecen asociaciones micorrízicas (Brundrett, 1990 citado en Lambers, y Teste, 2013). Esto pudo ser porque los costos energéticos de la asociación superaban los beneficios y, por tanto, las plantas lograron adaptarse a condiciones ambientales adversas. De acuerdo con esa hipótesis, Lambers y Teste (2013) agrupan estas plantas en dos conjuntos: (i) aquellas de tipo Brassicaceae, que se desarrollaron en ambientes con alta disponibilidad de fósforo y un nivel de competencia baja, y (ii) las del tipo Protaceae, adaptadas a concentraciones mínimas de fosforo, que incluyen especies de las familias Cyperaceae, Haemodoraceae, Protaceae y Restionaceae.

Adicionalmente, el establecimiento de la simbiosis micorrízica implica un mutuo reconocimiento y, en ciertos casos, especificidad (HFMA-planta), tanto morfológica como fisiológica (Nadal, y Paszkowski, 2013). De esta manera, las micorrizas juegan un papel importante en la mayoría de las plantas cultivadas y en las condiciones fisicoquímicas del suelo, ya que cumplen funciones importantes en la captura de macro y micronutrientes como: fósforo, nitrógeno, trazas de elementos inmóviles como Zn, Cu y Fe; modificando las propiedades físicas del suelo; generando resistencia ante la acción de fitopatógenos; además de promover la supervivencia de las plantas en ambientes de estrés, como sequía, salinidad y contaminación con metales pesados (Bedinia et al., 2009).

Con base en lo anterior y en un contexto práctico, el uso de fertilizantes químicos para mejorar la fertilidad del suelo no es viable en muchas regiones, debido a las irregularidades en las lluvias y la baja rentabilidad agrícola; en consecuencia, la biofertilización representa una alternativa más viable de aporte de nutrientes al suelo y planta (Smith, y Read, 2008; Sousa et al., 2012). De ahí que, en los últimos años, se haya despertado el interés sobre las interacciones entre las plantas y los HFMA (Pérez y Vertel, 2010), puesto que esta simbiosis juega un papel clave en el ciclaje de nutrientes (Azcón y Barea, 1996).

112

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

2. Simbiosis entre Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares y las Plantas La interacción micorriza ha existido por 460 millones de años, tiempo en el cual los HFMA han desarrollado una dependencia con su hospedero vegetal para completar su ciclo de vida, por lo cual, se les ha denominado biótrofos obligados (Smith, y Read, 2008). Sin embargo, Giovannetti y colaboradores (2010) han sugerido que el establecimiento de estrategias de supervivencia le ha permitido a los HFMA modificar su naturaleza de biótrofos obligados. Ejemplo de ello, está la capacidad de detener el crecimiento micelial, al tiempo que los HFMA reasignan recursos hacia las esporas madre, permitiéndole mantener su capacidad de colonización en ausencia de raíces hospederas (Nadal, y Paszkowski, 2013). No obstante, cuando existe una relación dependiente, los HFMA poseen un componente molecular que les permite establecer una comunicación bioquímica con las plantas, detectando las raíces destinadas para elaborar la interacción. Por tanto, estas estrategias pueden contribuir a la supervivencia de individuos y poblaciones de HFMA, durante las fases de asimbiósis y presimbiósis, estableciendo interacciones con una diversidad funcional inter e intraespecífica, con una respuesta de crecimiento vegetal diferente con las plantas; ello implica una formación de estructuras características para el intercambio bidireccional de nutrientes entre los simbiontes: apresorios y arbúsculos (Munkvold et al., 2004).

2.1 Germinación de esporas: fase asimbiótica A nivel rizosférico, los compuestos de origen vegetal, en concentraciones bajas, inducen la germinación tanto en propágulos de hongos fitopatógenos como en micorrizas. Carlile, Watkinson y Gooday (2000) señalan que estos estimulantes incluyen hidrocarburos, ácidos grasos, aldehídos y alcoholes provenientes de exudados radicales y elementos minerales que promueven la interrupción de la dormancia, en especial los flavonoides, una sustancia fenólica vegetal reconocida por gran parte de los microorganismos y que ejerce un efecto positivo sobre el crecimiento de las hifas (Garg, y Chandel, 2010).

Adicionalmente, otras condiciones que determinan la germinación son: temperatura, humedad y pH, los cuales influyen, de manera particular, en cada aislamiento de HFMA (Porter et al., 1987). Giovannetti y colaboradores (2010) han propuesto que esto se debe a que la germinación es un proceso en el que se desarrollan estructuras según el género, por ejemplo, en Glomus sp. se genera un rebrote en forma de globo abultado, a partir de una hifa; mientras que en los géneros Gigaspora, Acaulospora y Scutelospora, el tubo germinativo se genera directamente de las paredes celulares de la espora.

Desde una perspectiva reduccionista, los genes involucrados en el desarrollo de este proceso son homólogos a los involucrados en la transducción de proteínas, metabolismo primario y procesos de transporte (Garg, y Chandel, 2010). Por

113

ejemplo, el gen GmGIN1 codifica, para una familia de importantes proteínas para el crecimiento polar, formación de septos y cambios morfológicos de las hifas (Giovannetti et al., 2010).

2.2 Reconocimiento bioq uímico: Presimbiosis De acuerdo con Garg y Chandel (2010) la presimbiosis es una etapa de reconocimiento y atracción entre ambos simbiontes, mediada por señales químicas que controlan la formación, crecimiento y expansión de las hifas, así como, la identificación de raíces hospedantes. En ese sentido, el proceso de colonización por esporas (HFMA) comienza con su germinación, al desarrollarse un tubo germinativo, el cual hará contacto físico con la superficie radical; señalando que factores físicos, químicos y biológicos en el suelo determinan tal proceso. Por parte del HFMA, la colonización se puede dar por estructuras vegetativas o reproductivas, las cuales se generalizan como propágulos y son: esporas, fragmentos de raíz colonizada o hifas (Collados, 2006).

Por el lado de la planta, la simbiosis está controlada con la detección de factores de micorrización (Myc); estos son componentes de los HFMA que estimulan la expresión de genes, provocando cambios estructurales en la raíz del hospedero. Este mecanismo de regulación se ve corroborado; puesto que, en plantas, Carlile y colaboradores (2000) reportan que el gen GUS (promotor ENOD11: ß-glucosidasa) se encuentra involucrado en los mecanismos relacionados con la endosimbiosis (en la fase presimbiótica) de hongos y bacterias; esto sugiere que las plantas tienen un componente bioquímico común para la detección de ambos microorganismos.

En ese sentido, en cuanto a los HFMA, existe un factor específico para la ramificación de sus hifas, una estrigolactona (5 desoxy-estrigol) que se origina de la vía biosintética de los carotenoides (Akiyama et al., 2005 citado en Garg y Chandel 2010). Adicionalmente, se ha detectado que los genes HMA MtENOD11 y GmFOX2 están involucrados en la división de las hifas y codifican proteínas relacionadas con el catabolismo de ácidos grasos de cadena larga; ello ocurre en la medida en la que la hifa se aproxima a la raíz. Simultáneamente, la planta libera ácidos grasos 2-hidroxi que producen la ramificación, aunque de baja intensidad, sobre la hifa principal (Corradi et al., 2004).

El mayor grado de ramificación de las hifas HFMA está mediada por estrigolactonas vegetales, liberados por la proteína transportadora PDR1, situada en células hipodérmicas no suberificadas, las cuales se producen cuando las hifas se encuentran muy próximas a la raíz (Nadal, y Paszkowski, 2013). Cuando las esporas germinan, secretan tetrámeros y pentámeros de quitina, que aumentan con la percepción de estrigolactonas; también secretan lipo-quito-oligosacáridos sulfatados y no sulfatados, los cuales contribuyen a la formación de raíces laterales (Corradi et al., 2004). A pesar de que no se comprende con exactitud la relevancia de los compuestos de quitina y de los lipo-quito-oligosacáridos para la colonización, la evidencia experimental indica que, en este proceso, se involucra un mayor número de factores fúngicos, con sus correspondientes receptores vegetales aún por describir (Lambers, y Teste, 2013).

114

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

2.3 Establecimiento de la simbiosis La formación del apresorio es uno de los signos morfológicos del reconocimiento planta-HFMA y es resultado del reconocimiento exitoso durante la presimbiosis; el apresorio es una estructura achatada en la parte más distal de la hifa, que se adhiere a la superficie de la rizodermis (Daft et al., 1987). Simultáneamente, las células vegetales preparan el ambiente intracelular para el ingreso de las hifas, en un proceso coordinado entre ambos simbiontes (Doubková et al., 2013).

Con la penetración de la hifa a través del córtex, se da paso a la formación de arbúsculos, con lo cual, se establece una mayor superficie de contacto para el intercambio de nutrientes; estos presentan dos tipos morfológicamente diferentes: Paris y Arum; el primero se caracteriza por formar enrollamientos intracelulares con reducido contacto intercelular, mientras que el segundo tiene una profusa ramificación intracelular ligada a hifas intercelulares (Corradi et al., 2004).

Su crecimiento transforma el interior de la célula; sin embargo, se desconoce qué proceso activa la formación del arbúsculo. Al respecto, es probable que esté determinada por un gradiente de carbohidratos entre el tejido vascular y las capas exteriores de la célula (Blee y Anderson, 1998, citados por Garg, y Chandel, 2010). Algunos genes que contribuyen al desarrollo de los arbúsculos son LjCASTOR, LjSYM15, LjSYm6, LjPOLLUX, LjNup133 y LjSYM24, los cuales codifican proteínas involucradas directa o indirectamente en una red de transducción de señales, requeridas para desarrollar estructuras de alojamiento para los hongos simbióticos en la célula vegetal.

Una vez los HFMA han desarrollado sus estructuras al interior de la planta, la transferencia de nutrientes sucede entre el lumen de la célula hospedera y la membrana hifal más externa (micorriza tipo Paris) o arbuscular (micorriza tipo Arum). El intercambio de nutrientes está regulado por transportadores proteínicos, integrados en la membrana de los HFMA, tales como la H+-ATPasa tipo fosfatasa y ß-tubulina (Corradi et al., 2004), transportadores de Pi (OsPT1-13) (Chena et al., 2013), serina carboxypeptidasa (MtSCP1), regulación de la colonización en la raíz por MtCell y regulación de células que contienen arbúsculos maduros con un quitinasa clase III (Garg, y Chandel, 2010). En relación con los transportadores de Pi, Chena et al. (2013), encontraron que en plantas de arroz micorrizadas con G. intraradices, la síntesis del transportador OsPT11 incrementó y, como resultado, la concentración de fósforo fue mayor en los tejidos de la planta.

En relación con las plantas vasculares que no establecen asociaciones micorrízicas, se ha detectado, en las de tipo Brassicaceae establecidas en suelos moderadamente fértiles, una liberación de aleloquímicos con efectos negativos sobre el crecimiento de plantas micorrizadas que, además, poseen mecanismos de resistencia que impiden el ingreso de las hifas a sus raíces (Veiga et al., 2013 citado en Lambers, y Teste, 2013). Por otro lado, en suelos poco fértiles, donde crecen plantas del tipo Proteaceae, hay liberación de exudados que pueden facilitar la disponibilidad de otros nutrientes requeridos por plantas micorrizadas, a cambio de capturar fósforo. Esta es una estrategia en la que la acción carboxilasa de las plantas no micorrízica, libera los micronutrientes quelantes para obtener una concentración mínima de fósforo (Muler et al. 2013 citado en Lambers, y Teste, 2013).

115

2.4 Condiciones del suelo Los HFMA son microorganismos clave en el sistema suelo-planta, puesto que influyen en la fertilidad del suelo, la nutrición vegetal e, incluso, contribuyen a la agregación y la estabilidad de la estructura del suelo, por la acción combinada de las hifas extraradicales y la glomalina, una proteína insoluble e hidrofóbica que se expresa en las hifas de los HFMA (Bedinia et al., 2009).

En el suelo, el pH es una característica importante en el proceso de germinación, puesto que sus valores pueden atribuirse a las particularidades edáficas de cada ambiente; cada aislamiento representa un ecotipo adaptado a dichas características del suelo; por lo tanto, es posible que una misma especie se encuentre en lugares, geográfica y ecológicamente, diferentes (Porter et al., 1987). Srimathi, Kumutha, Arthee y Pandiyarajan (2014) realizaron un análisis de diversidad de los HFMA sobre suelos salino-sódicos, cuyo pH se encontraba en un rango de 8.7 a 9.5, y se identificó la presencia de los géneros Acaulospora, Glomus, Scutellospora, Sclerocystis y Gigaspora en ambientes rizosféricos de maíz, cebolla, guayaba, arroz, neem y bamboo. Sin embargo, no solo las condiciones fisicoquímicas del suelo influyen en la distribución de las especies de HFMA; también existe un planteamiento biogeográfico, donde, de acuerdo con las características propias de las especies de HFMA, se pueden adaptar a un lugar determinado. Por ejemplo, en ecosistemas naturales, la temporada estacional cálida o fría influye en la esporulación de las especies de HFMA, causando que determinada especie sea fisiológicamente activa en una temporada estacional y no en la otra (Barrer, 2009).

Así mismo, cuando el ambiente edáfico presenta condiciones adversas, tales como la baja relación Ca:Mg; falta de nutrientes esenciales como nitrógeno, potasio y fósforo, o una alta concentración de metales pesados, caso de los suelos serpentina, los HFMA son una opción útil para mejorar el desarrollo de las plantas locales; tal y como lo propusieron Doubková, Vlasáková y Sudová (2013), al someter la planta serpentina Knautia arvensis a cuatro niveles de estrés hídrico, en asociación con tres inóculos de HFMA locales, observando que el crecimiento y la toma de fósforo incrementó, en la medida en que la planta tenía mayor estrés hídrico.

Sumado a ello, el manejo que se hace del suelo también genera un gran impacto en la diversidad de los HFMA; esto fue comprobado por Stockinger et al. (2014), quienes estudiaron la diversidad de la comunidad HFMA, basándose en estudios moleculares sobre la subunidad del gen ARN polimerasa II. Ellos encontraron mayor pérdida de diversidad en las comunidades de HFMA cuando las parcelas fueron labradas a 25 cm con volteo de suelo, en contraste con aquellas que no fueron labradas o no hubo volteo del suelo.

Además de la pérdida de diversidad, el efecto sobre las condiciones físicas del suelo puede acarrear problemas, como el deterioro de la estructura, ya que los HFMA tienen la capacidad de producir glomalina y formar redes de micelio extensas y densas, que agregan las partículas del suelo. Por su parte, Bedinia et al. (2009) usaron plantas de Medicago sativa inoculados con Glomus mosseae y Glomus intraradices, y comprobaron que la concentración de la glomalina está correlacionada positivamente con la aparición de los HFMA; esto, puesto que las

116

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

plantas micorrizadas produjeron un aumento en la concentración de glomalina, con respecto a los valores iniciales, así como en las plantas sin inóculo, encontrando que la estabilidad de los macroagregados (1-2 mm de diámetro) fue significativamente mayor en comparación con los suelos sin micorrizas.

2.5. Repercusión del uso de plag uicidas Los plaguicidas son usados para el control de plagas y, en términos económicos, buscan mejorar la productividad de los cultivos. No obstante, la aplicación incorrecta de estos constituyen un peligro potencial para el crecimiento, la nodulación y la acumulación de nitrógeno; inclusive, pueden llegar a ser tóxicos para los HFMA, usando los niveles recomendados de los fungicidas sistémicos (Abd-Alla, Omar, y Karanxhab, 2000).

En el estudio de Schweiger y Jakobsen (1998), se evaluó el efecto de los fungicidas sistémicos Carbendazim, Fenpropimorf, Propiconazol y del insecticida Dimetoato, en lo referente a la tasa de absorción de fósforo de plantas micorrizadas. Los resultados indicaron que carbendazim tuvo el efecto más negativo, en concentraciones de 0.006 mg g-1 y se produjo una fuerte disminución en la absorción de P; pero a 0.1 mg g-1 hubo una inhibición completa de tal proceso. El propiconazol alteró la captación de fósforo solo cuando se utilizó 1 mg g-1, y el Fenpropimorph y el Dimetoato no tuvieron efectos negativos sobre la captación de P. Con ello, se evidenció que los HFMA responden de forma diferentes al tipo de plaguicida implementado, con valores máximos y mínimos que determinan translocación de P. Por un lado, Vijayalakshmi y Rao (1993) consideraron que el tiempo de aplicación, también, es un criterio importante para evaluar el efecto de tres fungicidas (Carbendazim, Captan y Blitox), con formulaciones comerciales sobre el desarrollo de HFMA en Sesamum indicum, al aplicar de 50 a 500 ppm en diferentes tiempos. El Carbendazim y el Blitox inhibieron la micorrización, cuando se aplicaron 50 ppm en el suelo, 30 días después de la siembra de semillas. En contraste, la aplicación de Blitox y Captan, justo antes de la siembra, tendió a mejorar la micorrización. Lo anterior indica que la colonización de HFMA está supeditada al tiempo de aplicación del fungicida.

Por otro lado, Abd-Alla y colaboradores (2000) evidenciaron el efecto de plaguicidas como Afugan, Brominal, Gramoxone, Selecron y Sumi sobre el crecimiento y la colonización de las raíces por HFMA en caupí (Vigna sinensis L.), fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) y Lupin (Lupinus albus L.). Los plaguicidas inhibieron significativamente la colonización de HFMA y el número de esporas en todas las leguminosas; sin embargo, en capuí, la formación de esporas se estimuló al ser tratadas con estos plaguicidas 60 días después de la siembra. A nivel nutricional, la acumulación de N, P y K en las plantas tratadas con plaguicidas fue menor que en las plantas control. Como se mencionó, existe un efecto en la función de la micorriza, puesto que la esporulación, colonización y translocación de nutrientes son afectados drásticamente por los plaguicidas.

117

2.6 Concentración de fósforo El mayor beneficio de las micorrizas para la planta es incrementar la translocación de fósforo, elemento inmóvil en el suelo (Srimathi et al., 2014). De acuerdo con Garg y Chandel (2010) la captura de fosfato inorgánico (Pi) puede estar dominada por completo por la micorriza y, dependiendo de las condiciones, el micelio extrarradical puede crecer más allá de la zona de deficiencia de fósforo, buscando reservas de fosfato soluble, las cuales pueden ser capturadas por las células (Smith, y Read, 2008).

Los efectos del fósforo en el suelo pueden deberse a otros factores como: tipo de suelo, pH y niveles de nitrógeno. Las respuestas de los HFMA al pH del suelo son variables, encontrándose respuestas positivas de algunos HFMA en pH ácidos y de otros en pH alcalino; así como respuestas positivas, negativas o neutras (Guzman-Plazola et al., 1988) al proceso de encalamiento. El efecto del pH puede estar relacionado con la disponibilidad de Pi, lo cual puede afectar la función del HFMA; aunque se considera que los HFMA pueden tolerar condiciones adversas de pH por modificación de la micorrizósfera durante el proceso de captura de nutrientes. En general, se considera que los HFMA se adaptan al pH del suelo de su origen y, por ello, se puede convertir en un factor limitante para el establecimiento de HFMA (Sylvia et al., 1993).

La ruta metabólica propuesta por Nouri, Breuillin, Feller y Reinhardt (2014) para la adquisición simbiótica de Pi comienza con la asimilación de fosforo inorgánico desde el suelo por parte de las hifas, gracias a la alta afinidad de sus transportadores. Posteriormente, el fosforo es polimerizado en forma de polifosfatos al interior de las hifas y, a su vez, en la raíz, antes de ser transportado a la interfase periarbuscular (apoplasto). Después de ello, el fosfato es despolimerizado en fosforo inorgánico y translocado a la planta a través de los arbúsculos, usando sus transportadores de fosfato, transcripcionalmente inducidos durante el desarrollo de la simbiosis (Smith, y Read, 2008).

En el modelo Setaria italica con Funneliformis mosseae (syn. Glomus mosseae), Ceasar et al. (2014) estudiaron los transportadores involucrados en la toma de diferentes niveles de fosfato inorgánico (Pi). La investigación evidenció que es tomado por la familia de transportadores de fosfato (SiPHT1; 1-1; 12) en S. italica, y los análisis RT y qPCR indicaron que la mayoría de estos transportadores mostraron patrones de expresión específicos, con respecto al tejido; por ejemplo: el SiPHT1, 2 se expresa en todos los tejidos y en todos las condiciones de crecimiento; mientras que el SiPHT1, 4 fue inducido en las raíces, 15 días después de sembrada en un medio hidropónico con baja concentración de Pi; la expresión de SiPHT1, 8 y SiPHT1, 9 en las raíces fue inducida selectivamente por la colonización con F. mosseae. En especies Solanaceae, se han logrado identificar transportadores de Pi como el StPT3, el cual se expresa en células corticales colonizadas por HFMA. Este ha sido identificado como un transportador de alta afinidad, lo cual indica que existe un sistema de captura de Pi específico para HFMA en el sistema vascular de las plantas (Nadal, y Paszkowski, 2013).

118

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

En relación al suministro de fósforo, una concentración elevada ejerce una fuerte inhibición en el desarrollo de HFMA y afecta otras vías nutricionales. Nouri et al.

(2014) evaluaron la interacción entre Petunia hybrida y Rhizophagus irregularis, encontrando que la baja disponibilidad de nitrógeno disminuyó el efecto supresor de alta disponibilidad de fósforo para el desarrollo de la micorriza arbuscular; lo que sugiere que las plantas promueven la simbiosis cuando están limitadas por uno de estos dos macronutrientes; por ello, la simbiosis entre los HFMA y las plantas mejoran la adquisición de fósforo y nitrógeno bajo condiciones limitantes.

Adicionalmente, existe evidencia de que no solo la función de la vía micorrízica se ve inactivada al usar fertilización de fósforo alta, sino también la colonización de HFMA en la planta. Esto sucedió en maíz (cv. Pioneer 3949), cuando creció en niveles altos de fertilización fosfórica, usando Glomus versiforme (Braunberger, Miller y Peterson, 1991).

2.7 Consideraciones generales del inóculo de HFM A Uno de los estados en los que usualmente se encuentran las esporas de HFMA, como inoculo, es la dormancia. Este fenómeno ha sido estudiado desde finales de la década de 1950 (Giovannetti et al., 2010). La definición de Tommerup (1983), considera una espora dormante como aquella que presenta un problema en la germinación cuando no se encuentra expuesta a condiciones físicas y químicas favorables, o cuando el espacio del contenido citoplasmático se encuentra reducido por una acumulación de gránulos lipídicos. Esta capacidad puede considerarse como una estrategia de supervivencia en ambientes poco favorables, sin embargo, aún se desconocen las bases moleculares que pueden explicar este fenómeno (Carlile et al., 2000).

Con relación a la dormancia de las esporas, varios autores han evaluado la capacidad germinativa de estas, luego de someterlas a condiciones particulares de almacenamiento; por ejemplo, Daft, Spencer y Thomas (1987) examinaron la viabilidad de varios propágulos de HFMA en Medicago sativa, después de mantenerlas bajo condiciones de almacenamiento. Con esporas de Glomus clarum, la germinación después de 12 semanas a 35 °C y humedad relativa (H.R.) de 45% fue efectiva; pero, no al 14 y 75% de H.R. ni cuando sobrepasaron las 6 semanas. Aunque se encuentren con una humedad del 45%, esto demuestra la influencia que tienen las condiciones ambientales sobre la longevidad y viabilidad de los inóculos HFMA, entre los cuales hay esporas, raíces colonizadas y, micelio. Igualmente, es importante resaltar que la calidad del inóculo puede ser evaluado por la capacidad de las esporas para germinar, por el crecimiento de las hifas o por la colonización y reproducción de propágulos en presencia de plantas (Tommerup, 1987).

No obstante, al considerar un panorama práctico para la producción de inóculos de HFMA, esto sucede de las siguientes formas según Gianinazzi y Vosátka (2004): a.

Parcelas de semilleros con suelo, en donde las plantas inoculadas son cultivadas en campo abierto o camas de semilleros. Ventajas: sencillo, adaptado

119

para uso local, bajos costos; desventajas: aplicación limitada, fácilmente contaminable, mal adaptado para el desarrollo de actividad industrial. b.

Contenedores (macetas) con diferentes sustratos. Ventajas: baja entrada de tecnología, contaminaciones no deseadas muy fácilmente eliminables, costos razonables; desventajas: no axénico, limitado en su desarrollo industrial. c.

Sistemas aeropónicos, donde raíces vegetales inoculadas son continuamente nebulizadas (misted) con solución nutritiva en cajas de cultivo. Ventajas: control más fácil de contaminantes, inoculo sin carrier, adaptado para microplantas; desventajas: conformación tecnológica relativamente complicada. d.

In vitro en raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes. Ventajas: cultivos axénicos, permite el desarrollo industrial; desventajas: alta inversión tecnológica, altos costos, no todos los HFMA son exitosamente cultivables en este sistema y, no se ha evaluado la aplicabilidad del inóculo producido in vitro, en particular su habilidad competitiva hacia otros microbios en suelo de campo.

2.8 Control de calidad de inóculos micorrícicos Independientemente del modo de producción de inóculo HFMA y del procedimiento de formulación adoptado por las compañías, el producto desarrollado debe satisfacer los requerimientos esperados del usuario final (ej. reducir entradas de fertilizantes fosforados, incrementar la tolerancia vegetal a contaminantes, mejorar la floración, favorecer la restauración ecológica del terreno, entre otros).

En este contexto, debe satisfacerse los siguientes criterios por las compañías: (i) las plantas a inocular deben ser capaces de formar micorrizas, (ii) el inóculo HFMA debe estar libre de agentes que puedan afectar, negativamente, el normal crecimiento y desarrollo vegetal y, (iii) la vida útil del inóculo debe ser suficiente para satisfacer los mercados de usuarios finales. La introducción de tales criterios por los productores de inóculos puede contribuir a la definición de condiciones para el registro de productos a niveles nacionales e internacionales. Finalmente, en la descripción del producto, puede considerarse la inclusión de las siguientes recomendaciones implícitas en su producción para estándares de calidad: propiedades físicas y químicas del inóculo HFMA; densidad del propágulo HFMA (relación de esporas, hifas y/o raíces colonizadas por unidad de masa de suelo); efectividad garantizada; ausencia de contaminantes microbianos; almacenamiento y uso; ausencia de elementos transgénicos.

2.9 Aspectos ecológ icos Tanto los hongos como las plantas tienen distribución universal; de esta manera se presentan ecotipos adaptados a condiciones diversas y extremas. Las plantas y las micorrizas tienen un origen común, de ahí que los HFMA estén ampliamente distribuidos en condiciones naturales. Se encuentran en todos los continentes, excepto en la Antártida; se dan en todos los suelos, incluyendo los de minas abandonadas, suelos agrícolas, suelos de pantanos y en hábitats acuáticos (Pérez y Vertel, 2010).

120

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

La distribución de los HFMA es amplia, puesto que se encuentran en todos los ecosistemas terrestres desde hace más de 400 millones de años. Tal alcance terrestre puede ser muy heterogéneo en un mismo sitio, en cuanto a diversidad, abundancia y composición, lo que es un determinante para que las plantas obtengan un efecto diferente en la respuesta de crecimiento vegetal vía micorrícica (Collados, 2006; Smith, y Read, 2008; Barrer, 2009). A nivel de ecosistemas se les considera a los HFMA como los de mayor distribución mundial, tanto por el gran número de los posibles hospederos, como por su distribución geográfica, puesto que han sido reportados desde la Amazonía, donde son predominantes, hasta el Ártico (Escobar et al., 1998, Collados, 2006).

La relación HFMA-planta no es considerada específica, debido a que cualquier especie de HFMA puede colonizar o formar simbiosis con cualquier planta (exceptuando los grupos de plantas no micorrízicos). No obstante, bajo ciertas condiciones edafoclimáticas, algunos hongos pueden beneficiar mejor o en mayor grado un determinado hospedero (Barrer, 2009).

Las asociaciones micorrícicas son caracterizadas por una simbiosis mutualista entre raíz y hongo, el cual le proporciona a la planta hospedera mejor desarrollo y crecimiento, al aumentar la absorción de nutrientes, principalmente de fósforo, mayor resistencia a estrés hídrico, producción y acumulación de sustancias de crecimiento y de sustancias bioactivas (Samarão et al., 2011), aumento en la resistencia a enfermedades, resistencia a la sequía, tolerancia a metales pesados y mejorar la estructura del suelo (Mustafa et al., 2010; Cardona et al., 2008).

La resistencia a estrés hídrico se da gracias a la presencia de acuaporinas (canales de transporte de agua); en ellas, se ha descubierto el gen GintAQP1 en el micelio externo de Glomus intraradices, mostrando incrementos en la expresión, en partes del micelio, sometidas a estrés, en comparación con partes no sometidas, lo que sugiere que la comunicación entre micelio está sujeta a condiciones externas (Mustafa et al., 2010).

Los HFMA promueven el crecimiento de las plantas por el suplimiento de fosforo, capturado y translocado a partir de la solución del suelo por las hifas externas y, a cambio, el hongo obtiene el carbono de la actividad fotosintética de la planta (aprox.

20% del total de carbono fijado es usado para la interacción micorriza (Gavito et al., 2002)). Los nutrientes intercambiados entre el hongo y la planta dependen de las condiciones ambientales (Mustafa et al., 2010; Cardona et al., 2008).

El proceso de formación del HFMA tiene lugar en una sucesión de interacciones entre el hongo y la planta en la que se va a producir una integración morfológica y funcional; además, como resultado, la planta acepta la colonización por parte del hongo sin demostrar una reacción de defensa persistente (Collados, 2006). Es así como el hongo coloniza las raíces y, posteriormente, desarrolla una red de hifas externas que se extienden y ramifican en el suelo, funcionando como sistema radical complementario, aumentando la adquisición de nutrientes y agua para las plantas (Collados, 2006).

Los HFMA se caracterizan por presentar un crecimiento intra e intercelular en la corteza de la raíz y por formar dos tipos de estructuras, especialmente, en el interior celular, arbúsculos y vesículas. Los arbúsculos son hifas que se dividen dicotó-

121

micamente, son invaginados por la membrana plasmática de las células corticales y presentan periodos de vida cortos; mientras que las vesículas son estructuras de almacenamiento del hongo, a manera de lípidos que se forman en la parte terminal de las hifas (Smith, y Read, 2008; Barrer, 2009).

Las plantas y los hongos han coevolucionado, manifestándose en el alto grado del mutualismo y dependencia entre los simbiontes; de ahí que la mayoría de las plantas son micotróficas, es decir, necesitan estar micorrizadas para adquirir nutrientes del suelo. Por su parte, el hongo es un simbionte obligado y solo completa su ciclo de vida cuando se ha formado la micorriza con la planta (Collados, 2006).

3. Establecimiento de los HFM A en el Cultivo: Experiencias con Variedades Comerciales y Locales de Gramíneas 3.1 Caracterización y ecofisiolog ía de HFM A En Colombia, existen estudios que han caracterizado el estado de la simbiosis micorrízica en diferentes ecosistemas, considerando las gramíneas. Ejemplo de ello fue el realizado sobre el aislamiento, identificación y determinación del porcentaje de colonización de HFMA, asociados a la rizósfera del pasto Dichanthium Aristatum Benth, de fincas ganaderas del municipio de Tolú-Colombia. Allí se reportó la presencia de 25 morfotipos de HFMA, de los cuales, el 92% de las morfoespecies encontradas correspondieron al género Glomus, el 4% al género Gigaspora y el 4% restante al género Paraglomus (Pérez Rojas y Montes, 2011). En otro trabajo con HFMA, asociados a la especie de pasto colosoana de fincas ganaderas del municipio de Corozal-Colombia, se identificaron 31 morfotipos de HFMA. Así, del total aislado, un 96.9% correspondió a morfotipos con características similares a especie dentro del género Glomus y 3.1% a Gigaspora (Pérez et al., 2010). Estas dos evidencias sugieren que existen factores bióticos y abióticos que afectan la composición de las comunidades de HFMA, siendo la estructura de la comunidad de plantas un determinante más a considerar.

Por lo anterior, una de las causas que afectan las comunidades HFMA son los compuestos que permiten el reconocimiento planta-hongo, y estimulan la germinación de esporas, el crecimiento y la ramificación de las hifas, incluyendo: flavonoides (Vierheilig y Piché, 2002), estrigolactonas (Akiyama et al., 2005 citado en Garg, y Chandel 2010) y auxinas (Podila, 2002), los cuales son exudados por las raíces de las plantas (Gianinazzi, 2004; Akiyama et al., 2005 citado en Garg, y Chandel 2010), y que pueden de alguna manera determinar la preferencia planta-hongo.

Sin embargo, hay estudios que van más allá de una caracterización de la interacción micorrízica y emplean una visión más ecofisiológica al considerar a las gramíneas. Entre los factores abióticos, las condiciones del suelo han mostrado ejercer un control en las comunidades de HFMA, siendo los cambios permanentes

122

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

en el ambiente edáfico el reflejo de la dinámica existente. Se estudian parámetros como: la humedad, la temperatura y la disponibilidad de nutrientes, como condiciones naturales, y el efecto de las prácticas culturales para mejorar la productividad de cultivos como causas del proceso de degradación y contaminación con sustancias químicas tóxicas para plantas y microorganismos en suelos (Cuenca, 2007) Estudios han mostrado que el déficit de humedad (-1,5 a -2,0 MPa) no afecta ni la colonización ni la toma de Pi (fósforo inorgánico) por HFMA (Ming y Hui, 1999), aunque algunos estudios encontraron reducción en producción de esporas de Acaulospora y Glomus en maíz y sorgo (Simpson y Daft, 1990). Plantas de trigo micorrizadas mostraron, bajo diversas condiciones de estrés hídrico, incremento en área foliar, biomasa radical y total y producción de grano (Ellis et al., 1985).

En condiciones de campo, las plantas micorrizadas sometidas a estrés hídrico mostraron mejores respuestas a irrigación pos-estrés en la producción y la biomasa, que plantas no micorrizadas. De esta forma, los mecanismos asociados con el incremento de la tolerancia ante estrés hídrico de plantas micorrizadas, están relacionados con el incremento en toma de agua por las hifas (Karaki and Raddad 1997); la alteración de los niveles hormonales que producen cambios en conductancia estomatal (Drüge y Schönbeck, 1992); el incremento en la turgencia por reducción del potencial osmótico foliar (Davies et al., 1983); el mejoramiento nutricional del hospedero (Johnson y Hummel, 1985), y el mejoramiento de la recuperación de la planta después del estrés, manteniendo un continuo raíz-suelo (Sweatt y Davies, 1984).

Adicionalmente, los efectos del exceso de agua de los suelos sobre HFMA no han sido evaluados ampliamente, aunque se ha encontrado una asociación micorrícica en plantas acuáticas y de zonas inundadas (Dhillion, y Ampornpan, 1992), con excepción de aquellas pertenecientes a las familias Cyperaceae y Juncaceae.

Algunas especies de plantas de zonas húmedas no presentan micorrización en épocas húmedas, pero pueden ser colonizadas en épocas secas (Rickerl et al., 1994). Sin embargo, estudios comparativos han mostrado mayores tasas de colonización en suelos húmedos que en suelos muy secos o inundados (Miller, 2000), aunque el número de esporas no se reduce bajo condiciones de inundaciones largas, indicando que el efecto de la inundación puede afectar más al hospedero que al HFMA (Miller y Sharitz, 2000).

Por otro lado, existen otros aspectos evaluados en la interacción micorrízica. Es así como la compactación en los suelos reduce su fertilidad, como también, la distribución de las raíces de las plantas y de las hifas de HFMA en la rizósfera (Barrea, et al 2005). Además de lo anterior, otro factor físico que afecta el funcionamiento de HFMA, es la intensidad del pastoreo producidos por animales herbívoros. Al respecto, tres especies de pastos sometidas a defoliaciones, responden diferentemente con relación a los cambios en la dinámica de micorrización; en Digitaria sp. y Lolium sp. la colonización disminuyó, sin afectar la cantidad de hifas. De otra parte Themeda sp., quien es susceptible al pastoreo, no mantuvo cantidades de hifas en el suelo después de la defoliación (Barrea, et al 2005).

123

Pérez y Vertel (2010), evaluaron la relación entre el proceso de esporulación y colonización de HFMA asociados al pasto angletón, en función de factores físico-químico y de salinidad de los suelos de fincas ganaderas del municipio de TolúColombia. Determinaron que la abundancia de esporas de HFMA en los suelos está directamente relacionada con la concentración de los elementos intercambiables Mg, Na y de los valores de densidad aparente (Da) e, inversamente relacionada con los valores de Cu y Mn. Por su parte, la colonización de HFMA estuvo directamente relacionada con los elementos intercambiables K, Na, Zn y del porcentaje de hidrogeno en los suelos e, inversamente relacionada con los elementos de Ca y Mg intercambiable.

Por su parte, Pérez y Vertel (2010), al relacionar parámetros físico-químicos en las fincas ganaderas del municipio de Corozal, con relación al porcentaje de colonización de HFMA asociados a raíces del pasto colosoana, mediante el análisis de componentes principales, se observó que aquellas fincas que presentan valores altos de Magnesio (20.5 meq/100g), Calcio (32.2 meq/100g), Potasio (1.3 meq/100g) registraron los menores porcentajes de colonización. Mientras que en otras fincas presentaron altos porcentajes de colonización con contenidos moderados de Fosforo (18.94 ppm), Nitrógeno (0.03%), valores muy bajos de Sodio (1.7 meq/100g) y pH medianamente alcalino (7.8).

3.2 Dinámica y eficiencia de HFMA en pasturas tropicales Estudios realizados del beneficio de HFMA sobre la producción de materia seca y la composición química en especies forrajeras, resaltan la eficiencia de estos hongos en función de la especificidad, el porcentaje de colonización, época del año (lluviosa o seca), tipo de suelo, fertilización y la dependencia (Jehne, 1991). En Brachiaria decumbens se encontró que el porcentaje de infección y el número de esporas de los géneros Gigaspora y Glomus son afectados por la estación, siendo mayores en la época lluviosa en países como Brasil. Resultados equivalentes fueron reportados por Safir (1984) en los Llanos Orientales de Colombia en varias especies forrajeras; se evidenció que altos niveles de fósforo tienden a disminuir la colonización y los bajos la estimulan (Miranda, 1981). Esto muestra que los HFMA tienen un espectro amplio de respuestas fisiológicas (eventualmente o no, reflejadas en la promoción del crecimiento vegetal), que dependen -como se ha mencionado-, tanto de un componente biótico, como abiótico (Smith, y Read, 2008), lo cual, también es un fenómeno que afecta a las gramíneas.

A su vez, se ha comparado la eficiencia de la interacción entre gramíneas y plantas con otros sistemas simbióticos como las leguminosas. En ese sentido, se evaluó la frecuencia e intensidad de colonización de HFMA en gramíneas y leguminosas herbáceas y arbustivas en dos suelos del Brasil. De las 43 gramíneas estudiadas, Brachiaria ruziziensis, B. brizantha y Digitaria decumbens presentaron mayores porcentajes de colonización (Almeida et al., 1985). La evaluación de la eficiencia de especies de HFMA asociadas a las pasturas: Andropogon gayanus, Brachiaria sp., Panicum maximum, presentes en un suelo oxisol, mostró que las especies de Glomus manihotis y Entrophospora colombiana son las más efectivas (translocando)

124

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

en diferentes concentraciones con los elementos minerales de nitrógeno (N), fosforo (P) y potasio (K); en bajos niveles de P casi todas las especies de pastos dependieron altamente de HFMA. A niveles altos de P en los mismos suelos, especies de leguminosas forrajeras fueron más dependientes que las gramíneas (Howeler et al., 1987).

Otros experimentos realizados sobre la dependencia de micorrizas en 24 especies de pastos forrajeros tropicales, reportaron que Brachiaria decumbens y B. brizantha son las especies más dependientes, mientras que Panicum maximum es la menos. Todo esto indica que las gramíneas tropicales son igual o más dependientes de HFMA que las especies de leguminosas cuando crecen en suelos de baja fertilidad.

Finalmente, con relación a la eficiencia de la interacción (captura y translocación de nutrientes), los HFMA incrementan la tolerancia de las plantas al pastoreo por animales herbívoros, incrementando el suministro de nutrientes a las plantas huésped, las cuales estimulan el rebrote continuo de las pasturas, después de las defoliaciones hechas. Sin embargo, la diversidad de especies de HFMA decrece con el pastoreo moderado y alto, a través de los años (Ahn-Heum et al., 2001). Los resultados obtenidos por Ahn-Heum y cols. (2001) sugieren que la defoliación por el pastoreo de animales herbívoros altera fuertemente el desarrollo de las reservas de las plantas para estimular, en la misma magnitud, el desarrollo de la simbiosis.

Los cambios en la composición de las especies de HFMA y el decrecimiento en la diversidad con el pastoreo continuo, indican que la desfoliación provoca la alteración del microambiente del suelo y, como consecuencia, una disminución en la diversidad. Sin embargo, esto a la vez conduce a que ciertas especies de HFMA puedan adaptarse a las condiciones del pastoreo.

Con lo anterior, no solo los HFMA muestran su utilidad en un contexto de biofertilización de las gramíneas, sino también, en un contexto de sistemas forrajeros, donde diferentemente se afecta posivitamente unas especies de otras, lo cual, evidencia argumentos sobre su relevancia en un proceso productivo que pueda depender de este tipo de plantas.

3.4 Estudios usuales de HFM A en g ramíneas Si bien es cierto que en el contexto de la investigación científica todo está en función de una pregunta de investigación, son muchas las preguntas que se pueden hacer con relación a los HFMA y, en ese sentido, para las gramíneas no ha sido la excepción. Para ejemplificar, se han desarrollado estudios tipo caracterización de la interacción micorrízica, los cuales han usado, simultáneamente, tanto herramientas moleculares como morfológicas para determinar la composición y, con ello, el estado de la diversidad de una comunidad de HFMA con una planta determinada.

Puntualmente, Serralde y Ramírez (2004) caracterizaron las comunidades de HFMA en Zea mays (maíz) en suelos ácidos bajo diferentes tratamientos agronómicos en los Llanos Orientales de Colombia. En este, se observaron niveles relativamente altos de esporas locales en el suelo y las comunidades presentaron una diversidad media-alta (según géneros), de acuerdo con el índice de Shannon-Wiener, al compararla con otros sistemas de producción agrícola reportados en la literatura.

125

El comportamiento de esta población fue estable en el tiempo y, no se vio afectado ni por las aplicaciones de materia orgánica ni por los hospederos evaluados (ICA- Sikuani V-110 y la variedad regional Clavito). El género micorrízico predominante con mayor abundancia relativa dentro de la población fue Glomus, el cual, a su vez, muestra una mayor diversidad (12 morfotipos), seguido por Acaulospora (6 morfotipos), Gigaspora (4 morfotipos) y Entrophospora y Scutellospora (con un solo morfotipo cada uno).

Ahora bien, como ellos emplearon diferentes tratamientos agronómicos, establecieron que las condiciones edáficas determinaron la composición de las poblaciones de HFMA, dentro de las cuales, el pH del suelo y los contenidos de materia orgánica pueden ser empleados como indicadores del comportamiento de esos hongos. No obstante, las aplicaciones de materia orgánica (caupí y gallinaza) no tuvieron un efecto determinante sobre las poblaciones posiblemente, debido a las altas tasas de mineralización bajo las condiciones del experimento. Hasta este punto, además de la caracterización tanto morfológica como molecular de los HFMA, los autores determinaron correlaciones entre las variables ambientales y el desarrollo de la interacción; lo cual es útil para explicar por qué, sí o no, hay mayor preponderancia de un género con relación a otros. Finalmente, se evidenció que el contenido de materia orgánica bajo las condiciones evaluadas resulta ser altamente determinante para el establecimiento de poblaciones HFMA; así mismo, mostró una correlación positiva con las abundancias relativas de Acaulospora, Entrophospora y Scutellospora y, por lo tanto, con el índice de diversidad de Shannon–Wienner; también, se presentó una relación negativa con el género Glomus.

Igualmente, existen trabajos que han evaluado la fisiología de la interacción, con aislamientos de HFMA, previamente seleccionados por sus efectos positivos en el crecimiento de las plantas. En esa lógica, Prieto et al. (2011) desarrollaron un trabajo evaluando el efecto de cinco tratamientos de HFMA T1: Glomus spp., T2: Scutellospora spp., T3: Glomus spp.+ Scutellospora spp., T4: Acaulospora spp. + Gigaspora spp., T5: agua destilada estéril en sistemas agroforestales tradicionales con Theobroma cacao L. (cacao) tipo nacional (SAF-C) en el Trópico húmedo ecuatoriano, sobre pasto Brachiaria decumbens.

Se analizaron las variables: (i) número de esporas de HFMA por 100 g de suelo húmedo (gsh-1), (ii) porcentaje de colonización micorrícica visual y categoría de pelos radicales, (iii) altura de plantas, (iv) peso húmedo y seco del sistema foliar y radical, (v) largo total de raíz, y (vi) densidad radical, a 78 y 103 días después de las inoculaciones. Si bien hubo medición de variables a los 78 días, el tiempo de decisión para asumir efectos por los tratamientos fue de 103 días. Al cabo de ese tiempo, las plantas inoculadas con Glomus spp. y Glomus spp. + Scutellospora spp. presentaron la mayor altura, con 132.5 y 127.7 cm respectivamente. Estos tratamientos mostraron un comportamiento parecido al de las plantas inoculadas con Acaulospora spp. + Gigaspora spp.; no obstante, los tratamientos con Scutellospora spp. y control (H2O destilada estéril) fueron los que menor altura alcanzaron.

Los resultados hacen sospechar que los HFMA y, en especial, las especies del género Glomus estimulan las plantas para incrementar su sistema radicular y densidad radicular. Esto se debe a que las especies del género Glomus se reproducen

126

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

con mayor rapidez que especies de otros géneros como Scutellospora, Acaulospora o Gigaspora; también desarrollan mayor cantidad de hifas, lo que, a su vez, incrementa la capacidad de infección (Irrazabal et al., 2004). Mediante trabajos de esta índole se pueden establecer aspectos de la fisiología de la interacción HFMA, particularmente con la promoción de crecimiento vegetal. Sin embargo, hay tópicos que se complementan con ello, evaluando el costo beneficio de la interacción, estableciendo una razón entre masa de tallo y hojas con masa de la raíz (Smith, y Read, 2008).

4. Actividad de los HFM A en la Captura de Nutrientes Dentro de los grupos de microorganismos presentes en la rizósfera, existen tres grupos funcionales benéficos, cruciales para el funcionamiento de los ecosistemas terrestres: las bacterias fijadoras de nitrógeno, las rizobacterias promotoras de crecimiento y los hongos formadores de micorrizas arbusculares (Carballar, 2009).

La gran variedad de interacciones entre estos microorganismos resulta en el desarrollo de un ambiente dinámico conocido como rizósfera. La liberación de exudados, por parte de las raíces, proporciona fuentes de carbono para la microbiota heterótrofa, ya sea como crecimiento de sustratos, materiales estructurales o señales para la asociación entre las raíces y los microorganismos. En ese sentido, la rizosfera está diferenciada por tres zonas: la rizosfera (suelo), el rizoplano y la raíz.

La rizosfera es la zona de suelo influenciada por las raíces: a través de la liberación de sustratos que afectan la actividad microbiana. el rizoplano es la superficie de las raíces incluyendo las partículas adheridas a esta y la raíz, la cual hace parte del sistema, dado que algunos microorganismos endófitos son capaces de colonizar los tejidos de la misma (Barea et al., 2005).

Los HFMA como endófitos (en una parte de su ciclo de vida), promueven beneficios hacia sus hospederos, relacionados con la captura de fosfatos y otros nutrientes, como: Ca, Cu, S, Zn y Fe. El caso del P, Zn y Cu, al ser elementos inmóviles, son importantes, ya que su disponibilidad para la planta es limitada (Barea et al., 2005; Nogales, 2006), tienen un efecto positivo en un aspecto hídrico, especialmente, en plantas sometidas a este estrés. Adicionalmente, los HFMA también proveen protección frente a patógenos naturales al generar los siguientes mecanismos: el incremento en el vigor de la planta, compensación de daños, competencia directa con los microorganismos por espacio en la raíz, producción de cambios en el sistema radical y activación de mecanismos de protección de la planta de forma indirecta (Karaki y Raddad, 1997; Nogales, 2006, Mustafa et al., 2010).

Además, los HFMA pueden ser usados en biorremediación de suelos contaminados (Barea et al., 2005).

Se ha evidenciado la importancia que tiene la colonización de los HFMA en las raíces de las plantas, por el mejoramiento de las condiciones físico-químicas del suelo y la estimulación del crecimiento e incremento de la calidad nutricional de

127

las especies vegetales, convirtiéndolas en organismos más tolerantes a condiciones adversas abióticas como bióticas (Pérez y Vertel, 2010).

Durante la colonización y distribución del hongo en las raíces, se generan modificaciones fisiológicas en la planta como: el incremento de la actividad nuclear y de la masa citoplasmática; generación de nuevos organelos; entre ellos, las vacuolas de las células corticales, aumento en la diferenciación de los tejidos vasculares, tasa fotosintética, síntesis de proteínas, clorofila, sustancias de crecimiento y metabolitos secundarios; activación de los sistemas enzimáticos, y favorecimiento de la absorción y translocación de nutrientes y agua (Carballar, 2009).

La interacción de varios microorganismos del suelo como la regulación por moléculas o señales especificas, son la clave en los procesos de ciclaje bioquímico de nutrientes para mantener la salud y la calidad del suelo. En ese sentido, muchas rizobacterias y rizohongos son capaces de solubilizar fosfatos poco solubles, generalmente por la liberación de quelantes de ácidos orgánicos. Pero la capacidad de las bacterias promotoras de crecimiento para suministrar fosforo puede ser limitada principalmente por los componentes relacionados con esta solubilización que se degradan rápidamente o por el fosfato que se vuelve a fijar antes de alcanzar la superficie de la raíz. Sin embargo, si se presenta micelio de HFMA se da una interacción sinérgica microbiana que mejora la adquisición de fosforo por parte la planta (Barea et al., 2005).

Por otro lado, las poblaciones microbianas en la rizosfera intervienen en el establecimiento de los HFMA. “Micorrizas helper bacterias MHB”, bacterias conocidas por estimular el crecimiento de los hongos micorrícicos y/o mejorar la formación de micorrizas. Estos estimulan la exudación radicular, mejorando el crecimiento del micelio o facilitando la penetración de las raíces por el hongo. Los microorganismos rizosféricos también afectan etapas presimbióticas como la germinación de las esporas y el crecimiento del micelio (Barea et al., 2005).

El principal beneficio para la planta es el crecimiento, principalmente por el aumento en la captura y translocación de P. Si este elemento se encuentra en una baja disponibilidad en los suelos tropicales y no es limitante en el suelo, la simbiosis puede llegar a ser reducida o hasta inhibida si se encuentran altos niveles en el suelo (Barrer, 2009).

Por lo anterior, existen evidencias experimentales sobre la captura y translocación de nutrientes vía micorrízica. En un experimento realizado por Karaki y Raddad (1997), se evaluó el efecto de los HFMA y el estrés por sequía en el crecimiento y absorción de nutrientes en dos genotipos diferentes de trigo, con diferencias en la resistencia a sequías, sembrando semillas en macetas. Se utilizaron tratamientos con riego, bajo estrés, dos genotipos e inoculado y sin inocular. Se encontró un crecimiento mayor en plantas inoculadas, probablemente, por la captura de P por parte de la micorriza. De igual forma, los contenidos de fósforo en la planta fueron mayores con respecto a las no micorrizadas, posiblemente por la mejora en la fotosíntesis relacionada con la toma de P. Así mismo, los efectos en la sequía se redujeron en plantas inoculadas. Evidenciando que la inoculación con HFMA aumenta la captura y translocación de nutrientes.

128

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

Bibliog raf ía Abd-Alla, M., Omar, Sh., y Karanxhab, S. (2000). The impact of pesticides on arbuscular mycorrhizal and nitrogen-fixing symbioses in legumes. Applied Soil Ecology. 3,191-200.

Ahn-heum, E., Gail, W., Hartnett, D. (2001). Effect of ungulate grazer on arbuscular mycorrhizal simbioses and fungal community structure in tall grass prairie. Mycologia, 93(2), 233-242.

Almeida, R. T., De Freire, V. F., y Vascocelos, I. (1985). Infección de micorrizas vesículo arbuscular en gramíneas y leguminosas herbáceas y arbustivas en dos suelos del Estado de Ceara. Ciencias Agronómicas, 16(1), p. 69-73.

Azcón, C., y J. Barea. (1996). Arbuscular mycorrhizas and biological control of soil-borne plant pathogens – an overview of the mechanisms involved. Mycorrhiza, 6(6), 457-464.

Barea, J. M., Pozo, M. J., Azcón, R., y Azcón, C. (2005). Microbial co-operation in the rhizosphere. Journal of Experimental Botany, 56(417), 1761-1778.

Barrer, S. E. (2009). El uso de hongos micorrizicos arbusculares como una alternativa para la agricultura. Facultad de Ciencias Agropecuarias, 7(1), 123-132.

Bedinia, S., Pellegrinoa, E., Aviob, L., Pellegrinic, S., Bazzoffic, P., Argesed, E., y Giovannettia, M. (2009). Changes in soil aggregation and glomalin-related soil protein content as affected by the arbuscular mycorrhizal fungal species Glomus mosseae and Glomus intraradices. Soil Biology and Biochemistry, 41, 1491-1496. DOI: 10.1016/j. soilbio.2009.04.005.

Braunberger, P., Miller, M., y Peterson, R. (1991). Effect of phosphorus nutrition on morphological characteristics of vesicular arbuscular mycorrhizal colonization of maize.

New Phytologist, 109(1),107-113. DOI: 10.1111/j.1469-8137.1991.tb01013.x.

Caballar, S. (2009). Variación temporal de la diversidad de hongos de micorriza arbuscular y el potencial micorrízico en especies silvestres de Agave en Oxaca (tesis de maestría).

Instituto Politécnico Nacional. Centro interdisciplicario de investigación para el desarrollo integral regional unidad Oaxaca. Santa Cruz Xoxocotlán, Oaxaca, México.

Cardona, G., C. Peña y A. Arcos. (2008). Ocurrencia de hongos formadores de micorriza arbuscular asociados a ají (Capsicum sp.) en la Amazonia colombiana. Agronomía Colombiana, 26(3), 459-470.

Carlile, M., Watkinson, S., y Gooday, G. (2000). Spores Dormancy and Dispersal. En: The Fungi (cap.4, pp.185-243). Segunda edición, San Diego, California: Academic Press.

Ceasar, S., Hodge, A., Baker, A., y Baldwin, S. (2014). Phosphate concentration and arbuscular mycorrhizal colonisation influence the growth, yield and expression of twelve PHT1 family phosphate transporters in foxtail millet (setaria italica). Plos One, 9(9), e108459. DOI:10.1371/journal.pone.0108459.

Chena, X., Wub, F., Lic, H., Chana, W., Wud, C., Wue, S., y Wongf, M. (2013).

Phosphate transporters expression in rice (Oryza sativa L.) associated with arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) colonization under different levels of arsenate stress. Environmental and Experimental Botany, 87, 92-99.

Collados, C. (2006). Impacto de inoculantes basados en Azospirillum modificado genéticamente sobre la diversidad y actividad de los hongos de la micorriza arbuscular en rizosfera de trigo y maíz (tesis de doctorado). Universidad de Granada, Facultad de Ciencias, Granada, España.

129

Corradi, N., Kuhn, G., y Sanders, I. (2004). Monophyly of ß-tubulin and H+-ATPase gene variants in Glomus intraradices: consequences for molecular evolutionary studies of AM fungal genes. Fungal Genetics and Biology, 2, 262-273.

Cuenca, G., (2007). Las micorrizas arbusculares como alternativa para una agricultura sostenible en áreas tropicales. Interciencia, 32(1), 23-29.

Daft, M., Spencer, D., y Thomas, G. (1987). Infectivity of vesicular arbuscular mycorrhizal inocula after storage under various environmental conditions. Transactions of the British Mycological Society. 1, 21-27.

Davis, E. A., Young, J. L., y Linderman, R. G. (1983). Soil lime level pH and VAmycorrhiza effects on growth responses of sweet gum seedlings. Soil Science Society of America Journal, 47, 251-256.

Dhillion, S. S., y Ampornpan, L. (1992). The influence of inorganic nutrient fertilization on the growth, nutrient composition and vesiculararbuscular mycorrhizal colonization of pretransplant rice (Oryza sativa L) plants. Biology and Fertility of Soils, 3, 85-91.

Doubková, P., Vlasáková, E., y Sudová, R. (2013). Arbuscular mycorrhizal symbiosis alleviates drought stress imposed on Knautia arvensis plants in serpentine soil. Plant and Soil, 370(1), 149-161. DOI: 10.1007/si11104-013-1610-7.

Drüge, U., y Schönbeck, F. (1992). Effect of vesicular-arbuscular mycorrhizal infection on transpiration, photosynthesis and growth of flax-Linum usitatissimum L. in relation to cytokinin levels, Journal of Plant Physiology, 141, 40-48.

Duicela, L., Corral, R., Reyes, J., y Farfán, D. (2003). Identificación de micorrizas asociadas a la rizósfera de café arábigo y propagación artesanal. Proyecto desarrollo de tecnologías para la producción de café arábigo orgánico. COFENAC y PROMSA. Recuperado de: http://cofenac.org/documentos/Micorrizas-en-Cafetales.pdf Ellis J., Larsen, H., y Boosalis, M. (1985). Drought resistance of wheat plants inoculated with vesicular-arbuscular mycorrhizae. Plant and Soil, 86(3), 369-378.

Escobar, C., Zuluaga, J., Colorado, G., y Paez, D. (1998). Micorriza vesicula arbuscular (MVA) recurso microbiológico para desarrollar una agricultura sostenible. Primera edición.

Corpoica, Colombia: Editorial produmedios.

Garg, N., y Chandel, S. (2010). Arbuscular mycorrhizal networks: process and functions.

A review. Agronomy for Sustainable Development, 30, 581-599.

Gavito M., Bruhn D., y Jakobsen I. (2002). Phosphorus uptake by arbuscular mycorrhizal hyphae does not increase when the host plant grows under atmospheric CO2 enrichment. New Phytologist , 154, 751–760 Gianinazzi, S., y Vosátka, M. (2004). Inoculum of arbuscular mycorrhizal fungi for production systems: science meets business. Canadian Journal of Botan, 82, 1264-1271.

Giovannetti, M., Avio, L., y Sbrana, C. (2010). Fungal spore germination and pre-symbiotic mycelial growth-physiological and genetic aspects. En: Koltai, H, y Kapulnik, Y. (Eds.).

Arbuscular Mycorrhizas: Physiology and Function (cap. 1, pp. 3-32), Netherlands: Springer Netherlands.

Giraldo Cañas, D. A. (2013). Las gramíneas en Colombia: riqueza, distribución, endemismo, invasión, migración, usos y taxonomías populares. Biblioteca José Jerónimo Triana, No. 26. Facultad de Ciencias. Instituto de Ciencias Naturales Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia.

130

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

Howeler, R. H.; Sieverding, E. Safir, S. (1987). Aspectos prácticos de la tecnología de las micorrizas en algunos cultivos y pasturas tropicales. Plant and Soil, 100(1), 249-283.

Irrazabal, G., Velazquez, S., y Cabello, M. (2004). Efectividad y diversidad de hongos micorrízicos arbusculares de la rizósfera de los talares de Magdalena, Provincia de Buenos Aires, Argentina. Boletín Micológico, 19, 49-57.

Jehne, W. (1991). Endomicorrizas y productividad de pastos tropicales: Potencial para el mejoramiento y su racionalización práctica, citado por Estrada Pineda, J., y Zuluaica Londoño, C. (2011). Evaluación productividad de la micorriza glomus manihotis en el pasto axonoplus scoparius (tesis de grado). Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, Medellín, Colombia.

Johnson, C. R., y Hummel, R. L. (1985). Influence of mycorrhizae and drought stress on growth of Poncirus x Citrus seedlings. Horticultural Science, 20, 754-755.

Karaki, G., y Raddad, A. (1997). Effects of arbuscular mycorrhizal fungi and drought stress on growth and nutrient uptake of two wheat genotypes differing in drought resistance. Mycorrhiza, 7(2), 83-88.

Lambers, H., y Teste, F. (2013). Interactions between arbuscular mycorrhizal and non-mycorrhizal plants: do non-mycorrhizal species at both extremes of nutrient availability play the same game? Plant, Cell and Environment, 36(11), 1911-1915.

Miller, P. (2000). Arbuscular mycorrhizal colonization of semi-aquatic grasses along a wide hydrologic gradient. New Phytologist, 145, 145-155.

Miller, P., y Sharitz, R. R. (2000). Manipulation of flooding and arbuscular mycorrhizal formation influences growth and nutrition of two semi-aquatic species. Functional Ecology, 14(6), 738-748. DOI: 10.1046/j.1365-2435.2000.00481.x.

Ming, T., y Hui, C. (1999). Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on alkaline phosphorus activities on Hippophae rhamnoides droughtresistance under water stress conditions. Trees, 14(3), 113-115.

Miranda, J. C. (1981). Presencia de endomicorrizas nativas en suelo de cenado del distrito federal, e influencia en la absorción de fósforo por Brachiaria decumbens. Revista Brasilera de Ciencias do Suelo, 5(2), 100-105.

Munkvold, L., Kjøller, R., Vestberg, M., Rosendahl, S., Jakobsen, I. (2004). High functional diversity within species of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist, 164(2), 357-364. DOI: 10.1111/j.1469-8137.2004.01169.x Mustafa, A., R. Othman, M. Abidin y V. Ganesan. (2010). Growth response of sweet corn (Zea mays) to Glomus mosseae inoculation over different plant ages. Asian Journal of plant Sciences. DOI: 10.3923/ajps.2010.337.343.

Nadal, M., y Paszkowski, U. (2013). Polyphony in the rhizosphere: presymbiotic communication in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Current Opinion in Plant Biology. 16(4), 473-479. DOI: 10.1016/j.pbi.2013.06.005.

Nogales, A. (2006). Estudio de la interacción entre el hongo formador de micorrizas arbusculares Glomus intraradices Schenck y Smith y el hongo patógeno Armillaria mellea (Vahl:fr) P. Kuhn en vid (tesis de doctorado). Universidad de Barcelona, Barcelona, España.

Nouri, E., Breuillin-Sessoms, F., Feller, U., y Reinhardt, D. (2014). Phosphorus and Nitrogen Regulate Arbuscular Mycorrhizal Symbiosis in Petunia hybrida. Plos One. 10(4): e0127472. DOI: 10.1371/journal.pone.0090841

131

Pérez, A., y M. Vertel. (2010). Evaluación de la colonización de micorrizas arbusculares en pasto Bothríochloa pertusa (L) A. Camus. Rev. MVZ Córdoba, 15(3), 2165-2174.

Pérez, C., S. Rojas, and V. Montes. (2011). Hongos formadores de micorrizas arbusculares: una alternativa biológica para la sostenibilidad de los agroecosistemas de praderas en el caribe colombiano. Revista Colombiana Ciencia Animal, 3(2), 366-385.

Pinto, P. (2002). Las gramíneas en Colombia. Revista Académica Colombiana de Ciencias. 26(98), 59-68.

Porter, W., Robson, A., y Abbott, L. (1987). Factors controlling the distribution on vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in relation to soil pH. Journal of Applied Ecology, 24(2), 663-672. DOI: 10.2307/2403901.

Prieto, O., et al., (2011) Inoculación de Brachiaria decumbens con hongos formadores de micorriza arbuscular nativos del trópico húmedo ecuatoriano. Ciencia y Tecnología, 4(2), 9-18.

Rendón, Y., Mancipe, C.; Andrade, V.; Bello, G.; Sánchez, J.; Campos, S.; Rivera, H. (2013). Caracterización de hongos formadores de micorrizas arbusculares en maíz (Var. ICA-508) de Cajicá (Colombia). Revista Suelos Ecuatoriales, 43(1), 29-34.

Rickerl, D. H., Sancho, F. O., y Ananth, S. (1994). Vesicular arbuscular endomycorrhizal colonization of wetland plants. Journal of Environmental Quality, 23, 913-916. doi:10.2134/jeq1994.00472425002300050010x.

Safir, G. R. (1984). Respuesta de plantas forrajeras tropicales a las aplicaciones de roca fosfórica y micorrizas en un suelo oxisol no esterilizado. En: Ricaldi, V. y Escalera, S. La roca fosfórica (pp. 309-327). Cochubamba, Bolivia.

Schweiger, P., y Jakobsen, I. (1998). Dose–response relationships between four pesticides and phosphorus uptake by hyphae of arbuscular mycorrhizas. Soil Biology and Biochemestry, 30,1415-1422.

Serralde, A., y Ramírez, M. (2004). Análisis de poblaciones de micorrizas en maíz (Zea mays) cultivado en suelos ácidos bajo diferentes tratamientos agronómicos. Revista Corpoica, 5(1), 31-40.

Simpson, D., y Daft, M. J. (1990). Interactions between water stress and different mycorrhizal inocula on plant growth and mycorrhizal development in maize and sorghum. Plant and Soil, 121, 179-186.

Smith, S., y Read, D. (2008). Mycorrhizal Symbiosis. Tercera edición. San Diego, California: Academic Press.

Sousa, C., Menezes, R., Sampaio, E., Oehl, F., Maia, L., Garrido, M., y Lima, F. (2012).

Ocurrence of arbuscular mycorrhizal fungi after organic fertilization in maize, cowpea and cotton intercropping systems. Acta Scientiarum, Agronomy. 34(2), 149-156.

Srimathi, L., Kumutha, K., Arthee, R., y Pandiyarajan, P. (2014). Identification of Arbuscular mycorrhizal multiplicity in the saline-sodic soils. International Journal of Agricultural and Biological Engineering, 7, 56-67.

Stockinger, H., Peyret-Guzzon, M., Koegel, S., Bouffaud, M., y Redecker, D. (2014).

The Largest Subunit of RNA Polymerase II as a New Marker Gene to Study Assemblages of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in the Field. Plos One, 9(10), e107783.

Sweatt MR. and Davies FT Jr. (1984) Mycorrhizae, water relations, growth, and nutrient uptake of geranium grown under moderately high phosphorus regimes. Journal of the American Society for Horticultural Science, 109, 210-213.

132

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES

Tommerup, I. (1987). Long-term preservation by L-drying and storage of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi. Transactions of the British Mycological Society, 4, 585-591.

Van der Heijden, M., Klironomos, J., Ursic, M., Moutoglis, P., Streitwolf-Engel, R., Boller, T., Wiemken, A., y Sanders, I. (1998). Mycorrhizal fungal diversity determines plant biodiversity, ecosystem variability and productivity. Nature, 396(5), 69-72.

Vijayalakshmi, M., y Rao, A. (1993). Influence of Fungicides on Vesicular-Arbuscular Mycorrhizae in Sesamum indicum L. Zentralblatt fĂźr Mikrobiologie, 148, 483-486.

133

Se terminรณ de imprimir en las instalaciones de GRACOM Grรกficas Comerciales, ubicada en la Ciudad de Bogotรก, Coombia, en la carrera 69K Nยบ 70 - 76, el mes de enero de 2016.

El tiraje es de 300 ejemplares.

Las fuentes usadas son Avenir Next Condensed y Nilland.