THỰC HÀNH HÓA SINH TRAO ĐỔI CHẤT NGUYỄN NHƯ NGỌC - THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐH LÂM NGHIỆP

TS. NGUYỄN NHƯ NGỌC

ThùC HµNH

HãA SINH TRAO §æi chÊt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP - 2020

TS. NGUYỄN NHƢ NGỌC

THỰC HÀNH

HÓA SINH TRAO ĐỔI CHẤT

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP - 2020

MỤC LỤC MỤC LỤC ........................................................................................................................ i BẢNG CÁC KÝ HIỆU CẢNH BÁO HÓA CHẤT....................................................... iv LỜI NÓI ĐẦU................................................................................................................. 1 NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM ................................................................................. 2 GIỚI THIỆU MÔN HỌC ................................................................................................ 4 Bài 1. NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG THIẾT BỊ - CÁCH PHA CHẾ DUNG DỊCH CÓ NỒNG ĐỘ XÁC ĐỊNH VÀ DUNG DỊCH ĐỆM ................................................ 9 1.1. Mục tiêu ................................................................................................................ 9 1.2. Yêu cầu ................................................................................................................. 9 1.3. Nội dung thực hành............................................................................................... 9 1.3.1. Nguyên tắc, cách sử dụng thiết bị trong phòng thí nghiệm hóa sinh ............. 9 1.3.2. Cách pha chế dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm ................ 12 1.4. Kết quả thực hành ............................................................................................... 20 1.5. Đánh giá .kết quả, chấm điểm ............................................................................ 20 1.5.1. Đánh giá sinh viên trực tiếp ......................................................................... 20 1.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành ........................................................................ 20 Bài 2. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG PROTEIN VÀ AXÍT AMIN ............................................................................................................................ 22 2.1. Mục tiêu .............................................................................................................. 22 2.2. Yêu cầu ............................................................................................................... 22 2.3. Nội dung ............................................................................................................. 22 2.3.1. Tóm tắt lý thuyết ........................................................................................... 22 2.3.2. Nội dung thực hành ...................................................................................... 25 2.4. Kết quả thực hành ............................................................................................... 34 2.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm ............................................................................. 34 2.5.1. Đánh giá sinh viên trực tiếp ......................................................................... 34 2.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành ........................................................................ 35 Bài 3. PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ SẢN PHẨM TRAO ĐỔI AXÍT AMIN, PROTEIN ........................................................................................................ 36 3.1. Mục đích ............................................................................................................. 36 3.2. Yêu cầu ............................................................................................................... 36 3.3. Nội Dung thực hành ............................................................................................ 36 3.3.1. Phản ứng phát hiện urê ................................................................................ 36

i

3.3.2. Phát hiện axít amin, protein trong mồ hôi và nước tiểu ............................... 37 3.3.3. Phản ứng phát hiện creatin, creatinin .......................................................... 39 3.4. Kết quả thực hành ............................................................................................... 40 3.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm: ............................................................................ 40 3.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên ......................................................................... 40 3.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành ........................................................................ 41 Bài 4. TÍNH CHẤT CỦA AXÍT NUCLEIC ............................................................. 42 4.1. Mục đích ............................................................................................................. 42 4.2. Yêu cầu ............................................................................................................... 42 4.3. Nội dung .............................................................................................................. 42 4.3.1. Tóm tắt lý thuyết ........................................................................................... 42 4.3.2. Nội dung thực hành ...................................................................................... 43 4.4. Kết quả thực hành .............................................................................................. 45 4.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm: ............................................................................ 46 4.5.1. Đánh giá sinh viên trực tiếp ........................................................................ 46 4.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành ....................................................................... 46 Bài 5. ENZYM.............................................................................................................. 47 5.1. Mục đích ............................................................................................................. 47 5.2. Yêu cầu ............................................................................................................... 47 5.3. Nội dung .............................................................................................................. 47 5.3.1. Tóm tắt lý thuyết ........................................................................................... 47 5.3.2. Nội dung thực hành ...................................................................................... 48 5.4. Kết quả thực hành ............................................................................................... 53 5.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm: ............................................................................ 53 5.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên ......................................................................... 53 5.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành ....................................................................... 54 Bài 6. XACARIT .......................................................................................................... 55 6.1. Mục đích ............................................................................................................. 55 6.2. Yêu cầu ............................................................................................................... 55 6.3. Nội dung .............................................................................................................. 55 6.3.1. Tóm tắt lý thuyết ........................................................................................... 55 6.3.2. Nội dung thực hành ...................................................................................... 55 6.4. Kết quả thực hành ............................................................................................... 59 6.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm .............................................................................. 59 6.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên ......................................................................... 59 6.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành ........................................................................ 59

ii

Bài 7. LIPIT ................................................................................................................. 61 7.1. Mục đích ............................................................................................................. 61 7.2. Yêu cầu ............................................................................................................... 61 7.3. Nội dung ............................................................................................................. 61 7.3.1. Tóm tắt lý thuyết ........................................................................................... 61 7.3.2. Nội dung thực hành ...................................................................................... 63 7.4. Kết quả thực hành ............................................................................................... 67 7.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm ............................................................................. 67 7.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên ......................................................................... 67 7.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành ........................................................................ 67 Bài 8. VITAMIN .......................................................................................................... 68 8.1. Mục đích ............................................................................................................. 68 8.2. Yêu cầu ............................................................................................................... 68 8.3. Nội dung ............................................................................................................. 68 8.3.1. Tóm tắt lý thuyết ........................................................................................... 68 8.3.2. Nội dung thực hành ...................................................................................... 69 8.4. Kết quả thực hành ............................................................................................... 71 8.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm ............................................................................. 71 8.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên ......................................................................... 71 8.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành ........................................................................ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 72 PHỤ LỤC……………………………………………………………………………..73

iii

BẢNG CÁC KÝ HIỆU CẢNH BÁO HÓA CHẤT

iv

LỜI NÓI ĐẦU Hóa sinh trao đổi chất là môn học cơ sở quan trọng trong quá trình đào tạo kỹ sư ngành công nghệ sinh học và một số ngành có liên quan (Lâm sinh, Thú y...). Môn học này cung cấp những kiến thức về lý thuyết và thực tế của các cơ sở phân tử sự sống: Thành phần cấu tạo hóa học, quá trình chuyển hóa các chất trong tế bào cơ thể sống và trong tự nhiên, là tiền đề để tiếp thu kiến thức của các môn chuyên ngành Công nghệ sinh học và Lâm sinh.

Thực hành là một phần quan trọng không thể thiếu đối với các môn học thuộc khối ngành kỹ thuật, đặc biệt là với các ngành nghiên cứu thực nghiệm như Công nghệ sinh học. Phần thực hành sẽ giúp người học củng cố sâu hơn về kiến thức lý thuyết đã được học. Thực hành vừa là cầu nối, vừa là sự kiểm nghiệm và so sánh giữa lý thuyết và các ứng dụng trong thực tế. Ngoài ra, việc rèn lyện kỹ năng thực hành trong các môn học nói chung và môn học hóa sinh trao đổi chất nói riêng còn giúp sinh viên rèn luyện thành thạo các kỹ năng về bố trí, sắp xếp và tiến hành thí nghiệm, nâng cao trình độ và giúp người học tự tin trong nghiên cứu để tiếp cận với công việc chuyên ngành trong tương lai.

Mặt khác, ngành Công nghệ sinh học của Trường Đại học Lâm nghiệp là ngành mới, do đó kho giáo trình và bài giảng phù hợp để phục vụ cho sinh viên của trường còn chưa nhiều. Để đáp ứng với chủ trương Nhà trường đề ra: Các ngành học lấy kỹ năng thực hành làm mục tiêu chính để dạy cho sinh viên nhằm trang bị cho sinh viên có tay nghề vững vàng khi ra trường, thì việc biên soạn tài liệu hướng dẫn thực hành cho mỗi môn học là hết sức cần thiết.

Do đó, tác giả đã biên soạn bài giảng “Thực hành hóa sinh trao đổi chất”.

Trong quá trình biên soạn không tránh khỏi thiếu sót, rất mong mọi ý kiến đóng góp để giúp tài liệu ngày càng hoàn thiện hơn.

Tác giả

1

2

NỘI QUY PHÕNG THÍ NGHIỆM Mọi người đến làm việc tại phòng thí nghiệm hóa sinh trao đổi chất phải chấp hành nghiêm túc các nội quy sau: 1. Làm việc dưới sự hướng dẫn của người có trách nhiệm; 2. Sinh viên phải có mặt ở phòng thí nghiệm đúng giờ quy định. Sinh viên đến trễ quá 10 phút nếu không có lý do chính đáng sẽ không được vào làm thí nghiệm; 3. Sinh viên phải xem trước nội dung lý thuyết của bài thực hành trước khi vào thí nghiệm; 4. Khi bố trí sắp xếp thí nghiệm phải tuân theo sự bố trí của người hướng dẫn; 5. Khi làm việc phải mặc áo bảo hộ lao động (áo blu trắng), kính đeo mắt (nếu cần thiết); 6. Phải tuân thủ các thao tác về an toàn lao động và phòng chống cháy nổ khi sử dụng các thiết bị; 7. Các hóa chất, chất thải độc hại hoặc có mùi - sử dụng theo hướng dẫn và để đúng nơi quy định; 8. Không mang các dụng cụ, mẫu vật, hóa chất, thiết bị, tài liệu… ra khỏi nơi quy định khi chưa có sự đồng ý của người có trách nhiệm; 9. Khi có sự đổ, vỡ, cháy nổ phải lập tức báo cáo cho người có trách nhiệm để giải quyết khắc phục; 10. Khi kết thúc thí nghiệm, sinh viên phải báo cáo kết quả với giáo viên hướng dẫn và dọn dẹp đồ đạc, dụng cụ đã sử dụng của nhóm mình trước khi ra về; 11. Mỗi nhóm thực hành phải chịu trách nhiệm về: Trật tự, an toàn thí nghiệm, dụng cụ, hóa chất và kết quả thí nghiệm cho bài thực hành của mình; 12. Mỗi sinh viên phải làm một bản báo cáo thực hành về các nội dung đã được tiến hành thí nghiệm và nộp về bộ môn sau khi kết thúc thí nghiệm trong vòng 1 tuần.

3

4

GIỚI THIỆU MÔN HỌC 1. Các thông tin chung Tên: Thực hành Hóa sinh trao đổi chất.

Thời lƣợng: 15 Tiết (30 tiết thực tế). Địa điểm: Phòng 216 - Nhà A3.

Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Như Ngọc.

2. Mục tiêu môn học Nhằm giúp sinh viên ngành Công nghệ sinh học và các ngành liên quan nắm vững các kiến thức và kỹ năng thuộc lĩnh vực hóa sinh, cụ thể như sau: - Củng cố, hệ thống hóa kiến thức lý thuyết đã được học trên lớp môn học Hóa sinh đại cương và Hóa sinh trao đổi chất; - Hiểu rõ về nguyên lý, phương pháp và thực hiện chính xác các thí nghiệm hóa sinh trong phòng thí nghiệm, như: Tính chất định tính và định lượng các hợp chất (protein; axít amin; lipit; xacarit; vitamin...) và xác định các sản phẩm từ quá trình trao đổi từ các hợp chất đó...; - Sử dụng thành thạo một số máy móc, thiết bị liên quan trong phòng thí nghiệm; - Có thái độ chủ động, nghiêm túc, khoa học và tự tin khi làm việc trong phòng thí nghiệm; - Tăng cường kỹ năng nghiên cứu thực nghiệm và ứng dụng của sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học.

3. Yêu cầu 3.1. Kiến thức và kỹ năng Hiểu rõ về nguyên lý, phương pháp chứng minh tính chất vật lý, hóa học, đặc biệt là các phương pháp định tính và định lượng các hợp chất.

Sử dụng thành thạo được một số loại máy móc, thiết bị trong thực hành hóa sinh học: máy ly tâm, máy đo pH, cân điện tử, cân phân tích, pipet mant, bếp từ, bể ổn nhiệt...

Thành thạo, độc lập và khoa học trong cách bố trí, tiến hành, thu thập kết quả và phân tích, giải thích kết quả thí nghiệm.

5

3.2. Thái độ Chấp hành tốt nội quy, quy định của Nhà trường và nội quy của phòng thí nghiệm Hóa sinh thuộc Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp.

Thực hiện đầy đủ, nghiêm túc và đúng tất cả các nội dung thực hành để thu được kết quả chính xác.

3.3. Kết quả Sau mỗi bài thực hành, mỗi sinh viên phải thu thập số liệu và phân tích, giải thích về kết quả thực hành.

Khi kết thúc phần thực hành, mỗi sinh viên phải viết báo cáo kết quả thực hành của tất cả các nội dung.

4. Phƣơng pháp tiến hành Sinh viên trực tiếp thực hiện thí nghiệm tất cả các nội dung trong các bài thực hành dưới sự hướng dẫn của giáo viên tại phòng thí nghiệm hóa sinh.

5. Nội dung thực hành: 15 tiết (30 tiết thực tế) Tên bài

Số tiết

Bài 1. Nguyên tắc sử dụng thiết bị và cách pha chế dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm

2

1. Nguyên tắc, cách sử dụng thiết bị trong phòng thí nghiệm hóa sinh 2. Cách pha chế các dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm Bài 2. Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng protein, axít amin

1 1 5

1. Tính chất dung dịch keo protein

2

2. Phản ứng màu của axít amin và protein

1

3. Xác định nitơ amin bằng phương pháp chuẩn độ foocmol

1

4. Các phương pháp định lượng protein

1

Bài 3. Phƣơng pháp định tính, định lƣợng một số sản phẩm trao đổi axít amin, protein 1. Phản ứng phát hiện urê 2. Phát hiện axít amin trong mồ hôi và nước tiểu 3. Phát hiện protein trong nước tiểu 4. Phản ứng phát hiện creatin và creatinin

6

4 1 1 1 1

Tên bài

Số tiết

Bài 4. Axít nucleic

2

1. Chuẩn bị mẫu axít nucleic từ nấm men

1

2. Một số tính chất của axít nucleic và sản phẩm trao đổi axít nucleic

1

Bài 5. Enzym

6

1. Amylaza nước bọt

1

2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ amylaza

1

3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm và kích hoạt tới hoạt độ amylaza

1

4. Xác định hoạt độ alpha - amylaza theo phương pháp Wohlgemuth

1

5. Xác định hoạt độ amylaza bằng phương pháp DNS

1

6. Xác định hoạt độ lipaza

1 Bài 6. Xacarit

5

1. Các phản ứng định tính xacarit

2

2. Sự thủy phân tinh bột

1

3. Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich

1

4. Xác định pectin bằng phương pháp canxi pectat

1

Bài 7. Lipit

4

1. Các tính chất của lipit

2

2. Xác định các chỉ số của lipit

2

Bài 8. Vitamin

2

1. Vitamin A

1

2. Viatmin E

0,5

3. Vitamin C

0,5 Tổng

30

7

6. Phƣơng pháp đánh giá Kết quả thực hành của từng sinh viên phải được đánh giá, cho điểm căn cứ vào: - Ý thức tổ chức kỷ luật thực hiện các nội dung thực hành trong phòng thí nghiệm: 20%; - Kiểm tra kết quả cuối buổi thực hành: 40%; - Báo cáo thực hành: 40%.

8

Bài 1 NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG THIẾT BỊ - CÁCH PHA CHẾ DUNG DỊCH CÓ NỒNG ĐỘ XÁC ĐỊNH VÀ DUNG DỊCH ĐỆM 1.1. Mục tiêu Giúp sinh viên nắm và hiểu được nguyên lý hoạt động của các loại máy móc, thiết bị cần thiết dùng trong phòng thí nghiệm hóa sinh: cân điện tử, cân phân tích, máy chỉnh pH, pipet mant, bếp từ, bể ổn nhiệt...

Nắm được các phương pháp pha và sử dụng các loại dung dịch có nồng độ xác định, dung dịch đệm.

1.2. Yêu cầu Sau khi thực hiện bài thực hành này, sinh viên nắm rõ nguyên tắc và sử dụng thành thạo các loại máy móc, thiết bị cần thiết dùng trong thí nghiệm hóa sinh: cân điện tử, cân phân tích, máy chỉnh pH, pipet mant, bếp từ, bể ổn nhiệt, tủ hút...

Pha chế được một số dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm với độ chính xác cao.

1.3. Nội dung thực hành 1.3.1. Nguyên tắc, cách sử dụng thiết bị trong phòng thí nghiệm hóa sinh 1.3.1.1. Hệ thống cân a. Cân kỹ thuật Là thiết bị dùng để xác định (cân) chính xác một lượng hóa chất, mẫu vật chất nhất định có trọng lượng lớn hơn 1.000 mg.

Cách sử dụng: - Trước khi cân cần chỉnh cho cân về trạng thái cân bằng; - Mở khóa cân ở phía dưới bằng cách xoay núm khóa ngược chiều kim đồng hồ; - Bấm nút ON/OFF (màu đỏ) bên trái cân; - Đợi vài giây cho cân thật ổn định. Các thông số trên cân sẽ là:

OK

- Đặt giấy cân (gập viền xung quanh) lên vị trí đặt mẫu vật cần cân; - Đợi vài giây. Chữ số hiện lên là trọng lượng của giấy cân; - Ví dụ: Giấy cân nặng 0,3 g thì có các thông số: 9

OK

0,3 g;

0,00 g;

- Bấm nút ZERO (màu xanh) bên phải cân để cân tự trừ đi trọng lượng của giấy cân, màn hình cân lại hiện lên: OK 0,00 g; - Dùng thìa cân lấy hóa chất cho vào giấy cân đến trọng lượng cần cân; - Lấy giấy cân có hóa chất ra khỏi cân; - Bấm nút ON/OFF để tắt cân; - Khóa cân lại bằng cách xoay núm dưới theo chiều kim đồng hồ; - Vệ sinh cân: Lau sạch hóa chất rơi vãi trên đĩa cân và mặt cân… b. Cân phân tích Là thiết bị dùng để xác định (cân) chính xác một lượng hóa chất, mẫu vật có trọng lượng lớn hơn 1 mg.

Cách sử dụng Trước khi cân cần chỉnh cho cân ở trạng thái cân bằng. Sử dụng giấy hoặc đĩa cân chuyên dùng để cân mẫu, các thao tác phải nhẹ nhàng cẩn thận, tránh gây rơi hóa chất ra ngoài. Sau khi cân phải vệ sinh sạch sẽ cân. Khi sử dụng cân thực hiện các bước tương tự như với cân kỹ thuật.

1.3.1.2. Máy đo pH Là thiết bị dùng để xác định pH của dung dịch, trên cơ sở đó điều chỉnh pH của dung dịch.

Cách sử dụng: - Rửa cực đo pH với nước cất 2 lần, thấm khô nhẹ nhàng cực đo với giấy thấm mềm; - Mở nút đẩy Filler Port trên cực để cực sẵn sàng cho việc đo pH; - Nhúng phần đầu cực đo pH vào dung dịch môi trường sao cho phần cực đo pH ngập trong dung dịch nhiều hơn 3 cm tính từ đỉnh cực; - Nhấn nút ON/OFF để bật máy (màn hình của máy sẽ sáng lên); - Nhấn nút MEAS; - Khi màn hình hiện từ HOLD nhấp nháy thì máy bắt đầu đo. Từ HOLD trên màn hình nhấp nháy đến khi giá trị pH trên màn hình đạt đến độ pH thực của dung dịch; - Khi máy phát tín hiệu báo, từ HOLD thôi nhấp nháy và giá trị pH trên màn hình chỉ độ pH của dung dịch;

10

- Nếu giá trị pH của dịch chưa đạt đến hoặc vượt quá giá trị pH phù hợp với giá trị pH cần thì điều chỉnh bằng cách bổ sung thêm HCl (nếu pH dung dịch lớn hơn pH cần) hoặc NaOH (nếu pH dung dịch nhỏ hơn pH cần). Sau đó, nhấn nút MEAS để máy tiếp tục đo như trên; - Khi giá trị pH của dung dịch đạt tới giá trị cần đo, nhấn nút ESC để thoát khỏi chương trình đo; - Nhấn nút ON/OFF để tắt máy; - Vệ sinh nhẹ nhàng đầu cực bằng nước cất và giấy mềm.

1.3.1.3. Tủ hút Sử dụng tủ hút khi phải thao tác với những hóa chất độc hại, bay hơi, có mùi khó chịu như HCl đặc, aceton, HNO3 đặc... cần cân hoặc pha phải được thực hiện trong tủ hút để tránh sự lan toả trong không gian phòng thí nghiệm.

Cách sử dụng: - Kiểm tra hệ thống điện, bật công tắc quạt hút và đèn chiếu sáng; - Pha hoặc lấy hóa chất dễ bay hơi trong tủ; - Kết thúc: Đóng nắp các chai, lọ đựng hóa chất, để gọn vào nơi qui định; - Để 10 - 20 phút, sau đó tắt công tắc đèn, quạt hút.

1.3.1.4. Bể ổn nhiệt Là thiết bị được sử dụng để giữ nhiệt độ ổn định trong khoảng thời gian cần thiết.

Cách sử dụng: - Kiểm tra hệ thống điện vào bể; - Cho khoảng 2 - 4 lít nước sạch vào trong bể (tùy thể tích bể), thể tích nước thường chiếm ½ thể tích bể; - Đạy nắp bể; - Đặt giá trị nhiệt độ cần ổn định; - Bật nút START để bắt đầu nâng nhiệt độ; - Kiểm tra thông số nhiệt độ, khi đạt tới giá trị cần thiết thì đưa mẫu vào và bấm nút cài đặt thời gian; - Khi thời gian ổn nhiệt đủ theo yêu cầu, lấy mẫu ra khỏi bể; - Điều chỉnh giá trị nhiệt độ về nhiệt độ phòng; 11

- Tắt công tắc điện, đổ bỏ nước trong bể; - Vệ sinh trong và ngoài bể.

1.3.1.5. Bếp từ Là thiết bị sử dụng để cung cấp nhiệt cho các phản ứng cần nhiệt như: đun sôi, nhiệt phân cách thủy...

Cách sử dụng: - Kiểm tra trên mặt bếp: khô ráo, sạch; - Cắm phích điện; - Đặt nồi hoặc dụng cụ bằng inox; - Đặt chế độ nhiệt độ sôi; - Sau khi thí nghiệm xong: Tắt bếp, rút điện, cất nồi, vệ sinh trên mặt bếp và xung quanh bếp.

1.3.2. Cách pha chế dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm 1.3.2.1. Phần lý thuyết về nồng độ và dung dịch đệm a. Khái niệm dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. Nếu chất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. b. Định nghĩa nồng độ Nồng độ là một đại lượng biểu thị cho mức độ đậm đặc của một hệ có thể ở dạng rắn, lỏng hay khí.  Nồng độ phần trăm (C%) Có 3 cách biểu diễn nồng độ phần trăm như sau:  Cách 1: Nồng độ % (w/w): Biểu diễn số gam chất tan có trong 100 g dung dịch.

Ví dụ: Nồng độ H2SO4 20% nghĩa là trong 100 gam dung dịch H2SO4 20% có 20 gam H2SO4 tinh khiết.

Công thức tính:

12

%  Cách 2: Nồng độ % (w/v): Biểu diễn số gam chất tan có trong 100 ml dung dịch.

Công thức tính:

(%)  Cách 3: Nồng độ % (v/ v): Biểu diễn số mililit chất tan có trong 100 ml dung dịch.

Ví dụ: Cồn 50o có nghĩa là trong 100 ml dung dịch cồn 50o có 50 ml cồn tinh khiết.

Công thức tính:

Trong đó: - mct: Khối lượng chất tan (g); - mdd: Khối lượng dung dịch (g); - Vct: Thể tích chất tan (ml); - Vdd: Thể tích dung dịch (ml).  Nồng độ mol (CM) Biểu thị số phân tử gam chất tan có trong 1.000 mL dung dịch (hay 1 lít dung dịch).

Công thức tính: (Mol/l) Trong đó: - a là số gam chất tan (g);

13

- M là khối lượng của phân tử gam hay nguyên tử gam chất tan; - Vdd là thể tích dung dịch (ml); - 1.000 là thể tích dung dịch (ml).  Nồng độ đương lượng (CN hay N) Biểu thị số đương lượng gam chất tan có trong 1 lít dung dịch.

Công thức tính: (N)

Trong đó: - a là số gam chất tan (gam); - D là khối lượng của 1 đương lượng gam chất tan; - Vdd là thể tích dung dịch (ml); - 1.000 là thể tích dung dịch (ml).  Nồng độ chuẩn T Độ chuẩn T là một loại nồng độ biểu thị lượng chất tan có trong một đơn vị thể tích hay một đơn vị khối lượng. Đơn vị thể tích ở đây có thể 1 lít hay 1 m3, đơn vị đo khối lượng ở đây có thể là 1 kg hay 1.000 kg. Đơn vị đo hiện nay được sử dụng thông dụng nhất là ppm, ppb, g/kg, g/lít.  Nồng độ phần triệu ppm (part per million) Là nồng độ biểu thị số mg chất tan có trong 1.000 mL dung dịch nếu hệ ở dạng lỏng hay số mg chất tan có trong 1 kg chất, nếu hệ ở dạng rắn.

Công thức tính:

Ví dụ: Hàm lượng chì trong thịt là 20 ppm nghĩa là trong 1 kg thịt có 20 mg chì.  Nồng độ phần tỉ ppb (part per billion) Là nồng độ biểu thị số mg chất tan có trong 1.000.000 mL (1.000 lít) dung dịch 14

nếu hệ ở dạng lỏng hay số mg chất tan có trong 1.000 kg nếu hệ ở dạng rắn.  Đơn vị g/kg Là đơn vị biểu thị số g chất tan có trong 1 kg chất mà nó tồn tại.

Ví dụ: Hàm lượng NaCl trong cá là 30 g/kg nghĩa là trong 1 kg cá có 30 g NaCl.  Đơn vị g/lít Là đơn vị biểu thị số g chất tan có trong 1 lít chất mà nó tồn tại.

Ví dụ: Hàm lượng NaCl trong nước mắm là 30 g/lít nghĩa là trong 1 lít nước mắm có 30 g NaCl.  Biểu thức liên hệ giữa các loại nồng độ  Biểu thức liên hệ CM và CN:

CN = zCM Trong đó: - z: Số điện tích mà 1 phân tử gam chất trao đổi hoặc số e mà 1 phân tử gam chất trao đổi; - CM: Nồng độ mol/l; - CN: Nồng độ đương lượng.  Biểu thức liên hệ C%(w/w) và C%(w/v):

C1% = C2% x ddd Trong đó: - C1 %: Nồng độ phần trăm theo thể tích (w/v); - C2 %: Nồng độ phần trăm theo khối lượng (w/w); - ddd: Khối lượng riêng của dung dịch (g/ml).  Biểu thức liên hệ C%(w/w) và CM: Trong đó: - CM: Nồng độ mol của chất (mol/l);

15

- d: Khối lượng riêng của dung dịch (g/ml); - C%: Nồng độ phần trăm của dung dịch; - M: Khối lượng phân tử của chất (g).  Khi pha một thể tích dung dịch từ một dung dịch có nồng độ cao hơn: Biểu thức:

C1V1 = C2V2

Trong đó: - C1: Nồng độ mol ban đầu của dung dịch (mol/l); - C2: Nồng độ sau của dung dịch (mol/l); - V1: Thể tích ban đầu của dung dịch (lít); - V2: Thể tích sau của dung dịch (lít).

1.3.2.2. Một số bài toán pha hóa chất thường gặp a. Tính toán pha dung dịch có nồng độ C% từ hóa chất rắn Ví dụ 1: Pha 100 ml NaOH 30% từ NaOH rắn (độ tinh khiết p = 96%). Đây là pha dung dịch có nồng độ C% (w/v) từ hóa chất rắn có nồng độ C% (w/w).

C1% = C2% x ddd

(1)

Áp dụng công thức:

(2) Từ (1) và (2) có:

Tra bảng sổ tay hóa chất có được dNaOH(30%) = 1,3311 g/ml.

Do đó: mNaOH = 30 x 1,3311 x 100 = 30,933 (gam).

Do NaOH rắn có độ tinh khiết 96%, nên có khối lượng thực của NaOH cần cân để pha dung dịch là: 16

m’ct = (mct x 100) : 96 ≈ 41,597 (gam) b. Pha dung dịch có nồng độ C% từ hóa chất rắn ngậm nước Ví dụ: Pha 250 ml CuSO4 1% từ CuSO4.5H2O (p = 98%). Áp dụng công thức (1) và (2) có: mct = (C2% x ddd x Vdd) / 100 Do đó, lượng CuSO4 loãng (1%): mct = C2% x Vdd / 100 = 2,5 gam, nhưng do CuSO4 tinh khiết 98% nên có: m’ = mct x 100 / 98 ≈ 2,551 gam.

Trong 250 gam CuSO4.5H2O có 160 gam CuSO4, do đó: m’’ = m’ x 250/160 ≈ 3,986 gam. c. Pha dung dịch có nồng độ C% từ hóa chất lỏng Ví dụ: Pha 250 ml HCl 1% từ HCl 36%.

Tương tự như trên: mct = C% x Vdd / 100 = 2,5 gam → m’ = m x 100 / 36 ≈ 6,944 gam dHCl 36% = 1,18 g/ml → V = m / d ≈ 5,9 ml d. Pha dung dịch có nồng độ CN Ví dụ: Pha 250 ml NaOH 1N từ NaOH 96%. m = N x D x V = 1 x 40 x 250 / 1000 = 10 gam → m’ = m x 100 / 96 ≈ 10,42 gam e. Pha loãng dung dịch Ví dụ: Pha 250 ml NaOH 0,1N từ NaOH 1N. Áp dụng công thức: N1V1 = N2V2 có được: →V1 = N2 x V2 / N1 = 0,1 x 250 / 1 = 25 ml Vậy cần lấy 25 ml NaOH 1N để pha dung dịch NaOH 0,1N. 1.3.2.3. Thực hành pha dung dịch có nồng độ xác định a. Pha 100 g dung dịch NaOH 40%  Hóa chất - dụng cụ: NaOH rắn, nước cất sạch, cốc thủy tính 250 ml, đũa khuấy, cân kỹ thuật, bình định mức 100 ml.

17

 Tiến hành: - Xác định chính xác lượng NaOH cần để pha X = ....... (gam); - Lượng nước cần để pha: N = ..... ml; - Dùng cốc thủy tinh 250 ml có chứa 50 ml nước cất; - Cân .... g NaOH rắn, cho vào cốc thủy tinh từ từ từng ít một; - Dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ nhàng cho tan từ từ đến hết; - Dùng phễu thủy tinh và chuyển dịch sang bình định mức 100 ml; - Dùng 10 ml nước cất còn lại để chuẩn đến vạch mức. b. Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37%  Hóa chất - dụng cụ: HCl; nước cất, ống đong; bình định mức; tủ hút.  Tiến hành: - Phân tử lượng HCl: MHCl = 1 + 35,5 = 36,5; - Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = ........... g; - Như vậy: Số ml HCl 37% cần lấy để pha là V = X : 1,19 = ........ ml; - Vậy, đong V ml HCl 37% cho vào bình định mức 1.000 có sẵn 1 ít nước; - Định mức thành 1 lít; - (Tiến hành pha trong tủ hút).

1.3.2.4. Pha dung dịch đệm a. Khái niệm Dung dịch đệm là dung dịch tạo môi trường ổn định pH cho dung dịch, thường gồm một axít yếu và một bazơ yếu với tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch.

Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp axít - bazơ có hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau. b. Pha dung dịch đệm Citrat (pH = 3,0 - 6,0)  Hóa chất - dụng cụ: Axít Citric, natricitrat, bình định mức 100 ml, đũa thủy tinh, cốc thủy tinh 250 ml, cân kỹ thuật.

18

 Tiến hành: - Cân 2,1 gam C6H8O7.H2O; - Hòa tan và định mức đến 100 ml (dung dịch a); - Cân 2,94 g C6H5O7Na3.2H2O; - Hòa tan và định mức đến 100 ml (dung dịch b); - Dung dịch đệm Citrat có giá trị pH khác nhau, phụ thuộc số ml dung dịch a và dung dịch b theo bảng sau: Dung dịch a (ml)

Dung dịch b (ml)

pH

4,65

0,35

3,0

4,0

1,0

3,4

3,5

1,5

3,8

2,8

2,2

4,4

1,8

3,2

5,2

1,6

3,4

5,4

0,95

4,05

6,0

- Trộn dung dịch a và b theo tỷ lệ ở bảng để thu được pH đệm là: 3,4; 3,8 và 5,4; - Kiểm tra pH của các dung dịch vừa pha bằng máy đo pH. c. Pha dung dịch đệm Glycin  Hóa chất - dụng cụ: Glycin, NaOH.  Dụng cụ: Nước cất, bình định mức; đũa thủy tinh; máy đo pH; cân kỹ thuật.  Tiến hành: - Cân 3,0 gam Glycin, hòa tan và định mức tới 200 ml (dung dịch a); - Cân 1,6 gam NaOH, hòa tan và định mức tới 200 ml (dung dịch b); - Dung dịch đệm Glycin có pH thay đổi khi pha 50 ml dung dịch a với X ml dung 19

dịch b, như bảng sau: Dung dịch b (ml)

pH

4,0

8,6

8,8

9,0

32

10,0

45,5

10,6

- Pha các dung dịch đệm Glycin có giá trị pH: 9,0; 10; - Kiểm tra pH của dịch đệm vừa pha bằng máy đo pH. 1.4. Kết quả thực hành Sinh viên ghi chép lại hiện tượng và giá trị xác định được trong quá trình của các thí nghiệm.

1.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm 1.5.1. Đánh giá sinh viên trực tiếp - Trả lời được các câu hỏi về nguyên tắc sử dụng các loại thiết bị đã được thực hành.

- Thao tác thành thạo đối với một số loại thiết bị được thực hành.

1.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành Sinh viên viết báo cáo kết quả thực hành và giải thích về kết quả thu được khi pha một số loại dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm.

Bảng 1.1. Pha dung dịch có nồng độ xác định TT

Thể tích dung dịch cần pha (ml)

Hóa chất gốc

1

100 ml NaOH 40%

NaOH rắn 96%

2

100 ml HCl 1M

HCl 37%

3

150 ml NaOH 0,5M NaOH 10M

4

100 ml CuSO4 5%

CuSO4.5H2O

20

Lƣợng hóa chất gốc cần (g/ml)

Lƣợng nƣớc (ml)

Ghi chú

Bảng 1.2. Pha dung dịch đệm có pH xác định

TT

Thể tích dung dịch đệm cần pha

Lƣợng chất 1 tƣơng ứng

1

200 ml đệm Citrat pH 6

Axít citric:...........g Natri citrat..........g

2

250 ml đệm Glycin pH 9

Glycin..................g NaOH.................g

3

150 ml đệm Phosphat NaH2PO4……….g pH 8

21

Lƣợng chất 2 tƣơng ứng

Na2HPO4............g

Lƣợng nƣớc (ml)

Ghi chú

Bài 2 CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG PROTEIN VÀ AXÍT AMIN 2.1. Mục tiêu Bài thực hành giúp sinh viên hiểu nguyên tắc của các phương pháp định tính và định lượng axít amin và protein.

Sinh viên độc lập tiến hành được một số nội dung thí nghiệm về định tính và định lượng protein và axít amin.

2.2. Yêu cầu Sau khi thực hiện xong bài thực hành, sinh viên phải: - Hiểu và nắm được các nguyên tắc của một số phương pháp định tính và định lượng axít amin và protein; - Thực hiện các thí nghiệm và định lượng chính xác một lượng axít amin và protein.

2.3. Nội dung 2.3.1. Tóm tắt lý thuyết Protein là các polymer, phân tử lượng lớn chủ yếu gồm L-α axít amin kết hợp với nhau bằng liên kết peptit tạo thành chuỗi polypeptit.

Axít amin là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl (-COOH) và ít nhất một nhóm amin (-NH2).

2.3.1.1. Tính chất vật lý của protein Khối lượng: Khối lượng phân tử (Mr) lớn từ (10.000 - 100.000 dalton), do đó protein không đi qua màng bán thấm.

Hình dạng: Protein có dạng cầu (hình hạt, hình bầu dục) hoặc dạng sợi. a. Tính chất dung dịch keo và kết tủa protein Khi hòa tan protein tạo dung dịch keo, các phân tử keo có kích thước lớn, không đi qua màng bán thấm. Sử dụng tính chất này, có thể tinh sạch protein khỏi các chất phân tử thấp bằng phương pháp thẩm tích.

22

Độ bền dung dịch keo phụ thuộc vào: sự tích điện, mức độ hidrat hóa, nhiệt độ…

Khi thay đổi các yếu tố này (làm trung hòa điện của phân tử protein, loại bỏ lớp vỏ nước…) thì các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau tạo thành những khối lớn, tách khỏi dung dịch, gọi là kết tủa protein.

Kết tủa thuận nghịch: Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại tạo thành dung dịch keo bền như trước.

Kết tủa không thuận nghịch (biến tính): Sau khi protein kết tủa, loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein không trở lại dung dịch keo bền như trước, protein thay đổi (tính tan, hoạt tính sinh học, phản ứng hóa học…) gọi là sự biến tính protein.  Ứng dụng tính chất kết tủa protein Các yếu tố gây kết tủa thuận nghịch protein được dùng để thu nhận chế phẩm protein. Thường dùng muối trung hòa: (NH4)2SO4, dung môi hữu cơ: axeton, etanol kết tủa ở nhiệt độ thấp, dưới 00C. Các yếu tố gây kết tủa không thuận nghịch protein (biến tính) được sử dụng để loại bỏ protein khỏi dung dịch, làm ngừng phản ứng enzym (như: Đun sôi dung dịch protein, sử dụng axít, bazơ, kiềm ở nồng độ cao: axít tricloaxetic, axít vonframic, axít picric, axít sunfoxalisilic… Ngoài ra, có thể dùng các kim loại nặng: Fe, Cu, Hg, Pb...). b. Tính chất hấp phụ ánh sáng tia tử ngoại của protein Dung dịch pr có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở hai vùng ánh sáng: - Vùng 1: Bước sóng ánh sáng: 180 - 220 nm, do hấp thụ của liên kết peptit; - Vùng 2: Bước sóng sánh sáng: 250 - 300 nm, do hấp thụ của các axít amin thơm.

Các phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại thường được dùng để định lượng protein đã tinh sạch.

2.3.1.2. Tính chất hóa học của protein, axít amin a. Tính chất lưỡng tính của protein và axít amin  Với axít amin Trong phân tử axít amin có nhóm -COOH nên có khả năng nhường (H +), mặt khác có nhóm amin- NH nên có khả năng nhận (H+) vì vậy axít amin có tính lưỡng tính.

2

Mức độ ion hóa của axít amin phụ thuộc vào pH của môi trường. Khi thay 23

đổi pH của một dung dịch axít amin, phân tử axít amin sẽ tích điện âm (-) hoặc dương (+).

Trong môi trường axít, axít amin ở dạng cation (tích điện dương), nếu tăng dần pH, axít amin lần lượt nhường proton để thay đổi điện tích và khi tăng đến giá trị pH nào đó, axít amin sẽ chuyển thành dạng anion (tích điện âm).

Tại giá trị pH nào đó axít amin sẽ trung hòa về điện. Giá trị pH đó được gọi là điểm đẳng điện của axít amin (isoelectric point) và được ký hiệu là pHi. Giá trị đẳng điện của axít amin phụ thuộc vào số lượng nhóm amin và carboxyl có trong phân tử axít amin.  Với protein Protein là chất điện li lưỡng tính vì trong phân tử có nhiều nhóm phân cực mạnh (bên gốc R) của axít amin... Trạng thái tích điện của các nhóm này phụ thuộc vào pH của môi trường. Ở một pH nào đó mà tổng điện tích (+) và điện tích (-) của protein bằng không. Phân tử protein không di chuyển trong điện trường gọi là pH (isoelectric i

điểm đẳng điện) của protein. Ở pH < pH , Pr là một cation, số điện tích dương lớn hơn số điện tích âm. i

Ở pH > pHi, Pr là một anion, số điện tích âm lớn hơn số điện tích dương. Ở pH = pHi, Pr có xu hướng kết tụ với nhau tạo kết tủa Pr. Bảng 2.1. Giá trị pH đẳng điện của một số protein

24

 Ứng dụng tính chất dung dịch keo và kết tủa protein: Trong môi trường có pH = pH , protein dễ dàng kết tụ lại với nhau do đó, lợi i

dụng tính chất này để xác định pH của protein cũng như để kết tủa protein. i

Mặt khác, do sự khác nhau về pH giữa các protein mà có thể điều chỉnh pH của i

môi trường để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. b. Phản ứng màu của axít amin, protein  Phản ứng Biurê Là phản ứng đặc trưng của liên kết peptid, sử dụng để phát hiện và định lượng protein. Tất cả các chất chứa từ 2 liên kết peptid trở lên đều cho phản ứng này.

Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptid trong protein phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu tím đỏ. Phức này có cực đại hấp thụ ở bước sóng 540 nm.  Phản ứng với Ninhydrin Tất cả các axít amin của protein đều phản ứng với ninhidrin tạo thành hợp chất màu xanh tím (riêng prolin tạo màu vàng). Để định lượng axít amin có thể dùng phương pháp so màu đo cường độ màu phản ứng hoặc dùng phương pháp đo thể tích khí CO2 hoặc NH3 được tạo thành.  Phản ứng của nhóm amin (phản ứng với formaldehyde) Formadehyde có thể phản ứng với nhóm amin của axít amin ở nhiệt độ thường và pH trung tính để tạo dẫn xuất dihydroxymethyl. Trong dẫn xuất này, nhóm amin bị khóa, người ta có thể dùng một bazơ để trung hòa gốc –COOH. Lượng kiềm tiêu tốn hết được cùng để xác định hàm lượng formol hay nitơ formol. Phản ứng này cũng được dùng để xác định hàm lượng formol trong dung dịch.

2.3.2. Nội dung thực hành 2.3.2.1. Tính chất dung dịch keo protein Dung dịch protein là keo ưa nước, chúng bền vững là nhờ màng nước bao quanh phân tử. Các yếu tố vật lý hay hóa học có khả năng tác dụng lên phá hủy màng nước xung quanh phân tử protein sẽ ảnh hưởng đến protein có thể làm chúng kết tủa.

Kết tủa có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Ứng dụng các phương pháp kết tủa thuận nghịch protein để tách protein và enzym ở dạng tinh khiết.

25

a. Kết tủa bằng muối trung tính  Nguyên tắc: Muối trung tính làm trung hòa điện và làm loại đi lớp vỏ nước của phân tử keo protein làm chúng kết tủa. Protein khác nhau kết tủa ở nồng độ muối khác nhau.  Hóa chất - dụng cụ: Lòng trắng trứng không pha loãng; (NH4)2SO4 bão hòa, NaCl bão hòa, tinh thể (NH4)2SO4, ống nghiệm, pipet, giấy lọc, cân kỹ thuật.  Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm 5 ml lòng trắng trứng; - Thêm vào 5 ml (NH4)2SO4 bão hòa, lắc đều; - Quan sát sự tạo thành kết tủa thứ nhất (1); - Để yên 5 phút, lọc thu dịch lọc sang ống nghiệm khác; - Cho vào dịch lọc 3 gam tinh thể (NH4)2SO4, lắc đều; - Quan sát sự tạo thành kết tủa, lọc thu kết tủa thứ hai (2); - Cho các kết tủa 1 và 2 vào 2 ống nghiệm khác; - Thêm vào mỗi ống 2 - 3 ml nước cất, lắc đều; - Quan sát sự hòa tan kết tủa. b. Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp  Nguyên tắc: Dung môi hữu cơ (ethanol; ete; axeton...) có tác dụng khử nước của phân tử keo protein, làm phá hủy màng nước, dẫn đến kết tủa protein. Quá trình kết tủa protein diễn ra nhanh, trong môi trường trung tính hoặc axít yếu với sự có mặt của các chất điện ly (NaCl).

Nếu thời gian tác dụng của dung môi hữu cơ ngắn, nhiệt độ thấp (≤ 4oC), protein kết tủa thuận nghịch. Ngược lại, thời gian tác dụng lâu dài, trong điều kiện nhiệt độ thường (20 - 30oC), protein biến tính hoàn thoàn, tạo thành kết tủa không thuận nghịch.  Hóa chất - dụng cụ: Lòng trắng trứng nguyên chất; NaCl (bột); cồn (axeton), ống nghiệm, đũa thủy tinh, giấy lọc.  Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm 1 ml lòng trắng và 0,2 gam bột NaCl, khuấy từ từ đến tan;

26

- Thêm vào 2 ml cồn 96 oC (hoặc axeton), lắc mạnh trong 3 phút thu được tủa protein; - Gạn bỏ dịch trong, thu tủa, thêm 2 ml nước cất vào làm giảm nồng độ dung môi trong dung dịch; - Hòa tan hoàn toàn kết tủa protein; - Quan sát và giải thích kết quả thí nghiệm. c. Kết tủa protein bằng muối kim loại nặng  Nguyên tắc: Những muối kim loại nặng (Cu2+; Fe3+; Pb2+...) tác dụng với protein tạo thành kết tủa không tan. Nếu dư muối, kết tủa lại tan do những phần tử keo hấp thụ ion kim loại nặng, trở nên tích điện. Ion có hóa trị càng cao, kết tủa càng dễ tan trở lại.  Hóa chất - dụng cụ: Dung dịch lòng trắng trứng 5%, FeCl3 5%, CuSO4 7%, [(CH3COO)2Pb] 5%, ống nghiệm, đũa thủy tinh.  Tiến hành: - Lấy 3 ống nghiệm sạch, khô; - Cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch lòng trắng trứng 5%; - Thêm vào ống 1: 1 giọt dung dịch FeCl3 5%. + Ống 2: 1 giọt chì axetat 5%; + Ống 3: 1 giọt CuSO4 7%.

- Quan sát kỹ, sau đó cho thêm vào lượng muối kim loại tương ứng vào từng ống và so sánh sự hòa tan kết tủa ở các ống.

2.3.2.2. Phản ứng màu của axít amin và protein a. Phản ứng Biurê  Hóa chất - dụng cụ: Lòng trắng trứng 5%, urê tinh thể, NaOH 10%, CuSO4 1%, ống nghiệm, đèn cồn, pipet.  Tiến hành: Phản ứng với urê: - Cho vào ống nghiệm khô thứ nhất 0,5 gam tinh thể urê; - Đun trên ngọn lửa yếu để urê nóng chảy, đến khi cứng lại thì ngừng đun; 27

- Để ống nguội, thêm vào 2 ml NaOH 10%, lắc cho tan; - Thêm vài giọt CuSO4 1%, quan sát màu.

Phản ứng với protein: - Cho vào ống nghiệm thứ hai 3 ml dung dịch lòng trắng trứng 5%; - Thêm vào 1 ml NaOH 10% và 1 - 2 giọt dung dịch CuSO4 1%, lắc kỹ; - Quan sát màu tạo thành; - So sánh phức màu của hai ống nghiệm 1 và 2 và giải thích kết quả. b. Phản ứng Xantoprotein của axít amin vòng  Nguyên tắc: Các axít amin vòng như phenylalanin, tirozin, triptophan khi tác dụng với HNO3 đặc tạo dẫn xuất nitro màu vàng. Khi thêm dung dịch kiềm vào sẽ tạo thành muối có màu da cam. Các axít amin không vòng, protein không chứa axít amin vòng không cho phản ứng này.  Hóa chất - dụng cụ: Lòng trắng trứng 5%, dung dịch gelatin 1%, HNO3 đặc, NH4OH đặc, ống nghiệm, tủ hút, bếp từ, nồi inox, pipet.  Tiến hành: - Lấy 2 ống nghiệm sạch, khô, đánh dấu; - Cho vào ống 1: 3 ml lòng trắng trứng 5%; - Cho vào ống 2: 3 ml gelatin 1%; - Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 ml HNO3 đặc; - Đun sôi cách thủy hỗn hợp phản ứng 1 phút; - Làm nguội, thêm từ từ vài giọt NH4OH đặc; - Quan sát sự chuyển màu trong 2 ống nghiệm và so sánh, giải thích kết quả. c. Phản ứng của axít amin chứa lưu huỳnh (phản ứng Folia)  Nguyên tắc: Các axít amin chứa lưu huỳnh như: xistein; xistin; metionin... dưới tác dụng của kiềm bị phân hủy tạo thành natri sunfua: RSH + 2 NaOH (PbS).

Na2S + ROH + H2O

Thêm chì axetat vào Na2S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sunfua

28

Na2S + Pb(CH3COO)2

2 (CH3COO)Na + PbS

 Hóa chất - dụng cụ: Lòng trắng trứng 1%, NaOH 10%, chì axetat 1%, xistein 1%, ống nghiệm, pipet, bếp từ, nồi inox.  Tiến hành: - Lấy 3 ống nghiệm khô, sạch; - Cho vào ống 1: 2 ml nước cất; - Cho vào ống 2: 2 ml lòng trắng trứng 1%; - Cho vào ống 3: 2 ml xistein 1%; - Cho vào mỗi ống 2 ml NaOH 10%; - Đun sôi 3 phút; - Lắc đều, thêm vào vài giọt Pb(CH3COO)2 1% vào mỗi ống; - Quan sát sự tạo thành kết tủa và giải thích kết quả. d. Phản ứng với Ninhydrin  Nguyên tắc: Tất cả các α - axít amin của protein đều có phản ứng với ninhydrin. Ngoài ra, các protein, peptit, muối amon, amoniac... cũng tạo thành màu với thuốc thử ninhydrin. Do đó, nếu muốn xác định chính xác axít amin phải loại bỏ các chất này. Để xác định axít amin liên kết trong thành phần của peptit hay protein, phải thủy phân chúng để tạo thành các axít min tự do sau đó mới thực hiện phản ứng ninhydin. Phản ứng ninhydin có độ nhạy cao, nên được dùng để định tính và định lượng axít amin. Phản ứng này là cơ sở của phương pháp sắc ký axít amin.  Hóa chất - dụng cụ: Glixin 0,02%, albumin 1%, ninhydrin 0,1%, ống nghiệm, nồi đun cách thủy.  Tiến hành: - Lấy 2 ống nghiệm, đánh số 1 và 2. + Ống 1: 1 ml glixin 0,02%; + Ống 2: 1 ml albumin 1%.

- Thêm vào mỗi ống 5 giọt ninhydrin 0,1%; - Đun nóng cả hai ống nghiệm trong 1 phút; - Quan sát sự xuất hiện màu, giải thích kết quả.

29

2.3.2.3. Xác định nitơ amin (N-amin) bằng phương pháp chuẩn độ foocmol  Nguyên tắc: Các axít amin có thể phản ứng với focmol trung tính để tạo thành metyl - axít amin. Focmol đã bao vây nhóm amin mang tính kiềm nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl trong phân tử axít amin bằng kiềm. Dựa vào lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ sẽ tính được lượng nitơ của axít amin.  Hóa chất - dụng cụ: Dịch mẫu có chứa axít amin cần xác định, NaOH 0,1N, H2SO4 0,1N, phenolphtalein 0,5%, etanol, hỗn hợp focmol (Phụ lục 1), bình tam giác 100 ml, burêt, pipet, tủ hút.  Tiến hành: - Lấy 2 bình tam giác, đánh số bình 1 (đối chứng); bình 2 (thí nghiệm); - Cho vào bình 1: 10 ml nước cất vô đạm, bổ sung 5 ml dung dịch hỗn hợp focmol và 5 ml dung dịch NaOH 0,1N; - Dùng H 2 SO4 0,1N để điều chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt; - Thêm 2 giọt NaOH 0,1N, màu đỏ tươi xuất hiện, ứng với pH = 8,8; - Cho vào bình 2: 10 ml dịch mẫu (đã cân và ghi khối lượng dịch mẫu (gam)); - Thêm 5 ml hỗn hợp focmol và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi có màu đỏ tươi; - Chuẩn bằng H2SO4 0,1N đến khi màu của bình còn hồng nhạt; - Thêm vài giọt NaOH 0,1N đến màu đỏ tươi, tương đương màu của bình 1; - Thêm vào bình 1: 4 giọt NaOH 0,1N, xuất hiện màu đỏ tươi, pH = 9,1; - Thêm vào bình 2: Vài giọt NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu đỏ tươi giống bình 1, pH = 9,1; - Tính kết quả: Cộng toàn bộ lượng kiềm và axít đã cho vào mỗi bình trong quá trình thí nghiệm và kết quả tính theo công thức:

(mg %)

30

Trong đó: - V1: Tổng lượng kiềm dùng chuẩn bình 1; - v1 : Tổng lượng axít dùng chuẩn bình 1; - V2: Tổng lượng kiềm dùng chuẩn bình 1; - v2: Tổng lượng axít dùng chuẩn bình 2; - a: Lượng mẫu ứng với 10 ml dung dịch mẫu (gam); - 1,4: Hệ số chuyển thành nitơ, cứ 1 ml NaOH 0,1N dùng chuẩn độ ứng với 1,4 mg nitơ.

2.3.2.4. Các phương pháp định lượng protein a. Định lượng protein theo phương pháp Lowry  Nguyên tắc: Protein tác dụng với thuốc thử Folin tạo thành sản phẩm màu xanh. Đây là sản phẩm khử của photphomolipden - photphovolframat bởi phức chất đồng - protein và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Dùng máy so màu để xác định cường độ màu trong các mẫu và so sánh với dịch protein chuẩn.

Phương pháp Lowry sử dụng kết hợp phản ứng Biurê và phản ứng với thuốc thử Folin để tạo phức có màu đặc trưng. Phương pháp có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định được đến nồng độ vài chục µg protein, được sử dụng rộng rãi để xác định nhiều loại protein ở dạng tương đối tinh khiết.  Hóa chất - dụng cụ: - Dung dịch protein nghiên cứu (chứa 50 - 300 µg protein/ml); albumin chuẩn; - Dung dịch A: Na2CO3 2% hòa trong NaOH 0,1N; - Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5% pha trong dung dịch natri xitrat 1%; - Dung dịch C: Trộn 1 thể tích dung dịch B với 49 thể tích dung dịch A; - Dung dịch Folin (phụ lục 2), pha loãng 2 lần; - Máy so màu quang điện, ống nghiệm, pipet.  Tiến hành: - Hút vào ống nghiệm sạch, khô 0,5 ml dung dịch cần xác định; - Thêm vào 2,5 ml dung dịch C, lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 10 phút;

31

- Thêm chính xác 0,25 ml dung dịch Folin đã pha loãng, lắc đều, để 30 phút; - So màu trên máy ở bước sóng 750 nm; - Song song với mẫu thí nghiệm, làm ống đối chứng trong đó thay dung dịch protein bằng nước cất và tiến hành giống như ống thí nghiệm; - Lập đồ thị chuẩn protein: + Chuẩn bị các dung dịch protein chuẩn của albumin với các nồng độ pha loãng khác nhau chứa một lượng protein tương ứng là: 20, 50, 100, 150, 200, 300 và 400 µg/ml protein từ dịch gốc ban đầu có nồng độ 1 mg/ml; + Tiến hành làm phản ứng màu với các dịch chuẩn theo thứ tự; + Dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein; + Từ kết quả đọc được của các mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính ra hàm lượng protein có trong 1 ml dịch mẫu nghiên cứu, từ đó tính ra hàm lượng % protein trong nguyên liệu. b. Xác định điểm đẳng điện của protein  Nguyên tắc: Tại điểm pH nhất định, các phân tử protein có số điện tích âm bằng với điện tích âm, tổng số điện tích của phân tử bằng không. Protein biểu hiện tính chất của một chất lưỡng tính gọi là điểm đẳng điện của protein (pHi).

Tại pHi, các protein không di động trong điện trường, các phân tử protein dễ dàng kết tụ lại với nhau tạo thành kết tủa protein.

Phản ứng kết tủa protein ở điểm đẳng điện diễn ra nhanh chóng khi môi trường phản ứng được bổ sung thêm dung môi hữu cơ (cồn, axeton...). Điểm đẳng điện đặc trưng cho từng loại protein, ví dụ: Albumin trứng có pHi = 4,6; cazein có pHi = 4,7; gelatin có pHi = 4,9.  Hóa chất - dụng cụ: Albumin trứng, Na2HPO4 0,2 M, axít citric 0,1 M, cồn 96o, ống nghiệm, đũa thủy tinh.  Tiến hành: - Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống các dung dịch đệm theo bảng sau: 32

Bảng 2.2. Xác định điểm đẳng điện của albumin trứng Na2HPO4 STT (ml)

Axít citric 0,1 M (ml)

pH tƣơng ứng

Albumin trứng 1% (ml)

Cồn 96o (ml)

1

0,34

0,66

3,7

1

1

2

0,48

0,52

4,7

1

1

3

0,66

0,34

5,7

1

1

Kết quả

- Lắc đều để dung dịch đệm đảm bảo độ pH tương ứng. Sau đó cho vào mỗi ống 1 ml albumin trứng 1%, lắc nhẹ; - Thêm vào mỗi ống 1 ml cồn 96o, lắc đều, để yên 5 phút; - Quan sát, so sánh mức độ kết tủa trong 3 ống nghiệm, xác định điểm đẳng điện của albumin trứng. Giải thích kết quả. c. Định lượng protein theo phương pháp Biurê  Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+ tạo thành phức chất màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540 nm. Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ với số lượng liên kết peptit trong chuỗi polipeptit.

Phương pháp Biurê được sử dụng đối với các mẫu nghiên cứu có khối lượng protein tương đối lớn ( ≥ mg/ml). Việc cải tiến phương pháp Biurê làm tăng độ nhạy của phản ứng biurê lên hàng chục lần gọi là phương pháp microbiurê.  Hóa chất - dụng cụ: Albumin tiêu chuẩn 1%; dung dịch protein (trứng, sữa, đậu tương); thuốc thử biurê (phụ lục 3), ống nghiệm, đũa thủy tinh, máy đo quang.  Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch mẫu nghiên cứu và 4 ml thuốc thử biurê; - Lắc đều, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh. So màu ở bước sóng 540 nm, xác định được mật độ quang học E của dung dịch nghiên cứu; - Lập đồ thị chuẩn; - Lấy 6 ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 đến 6, cho các chất tham gia phản ứng vào từng ống nghiệm theo bảng 2.3.

33

Bảng 2.3. Xây dựng đồ thị đƣờng chuẩn albumin theo phƣơng pháp Biurê STT

Albumin 1% (ml)

H2O cất (ml)

Thuốc thử biurê (ml)

Lƣợng protein (mg)

1

0,0

1,0

4

0

2

0,2

0,8

4

2

3

0,4

0,6

4

4

4

0,6

0,4

4

6

5

0,8

0,2

4

8

6

1,0

0,0

4

10

E (OD540)

- Lắc đều, để yên các ống nghiệm trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. So màu dung dịch trong các ống ở bước sóng 540 nm bằng cuvet có độ dày 1 cm; - Ống đối chứng là ống 1; các ống thí nghiệm là 2; 3; 4; 5; 6. Mỗi ống so màu 3 lần, lấy trị số trung bình E, xây dựng đồ thị đường chuẩn với hệ số R2 đạt 98%; - Tính kết quả: Từ mật độ quang học E đo được trên máy so màu hoặc quang phổ, đối chiếu với đồ thị chuẩn, xác định được lượng protein có trong dung dịch nghiên cứu (mg/ml). Từ đó tính được hàm lượng protein có trong nguyên liệu.

2.4. Kết quả thực hành - Sinh viên xây dựng được đường chuẩn albumin chính xác với hệ số R2 ≥ 98%.

- Sinh viên xác định được hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm dựa trên đường chuẩn albumin đã xây dựng.

2.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm 2.5.1. Đánh giá sinh viên trực tiếp - Trả lời được các câu hỏi về tính chất dung dịch keo và kết tủa protein, một số phản ứng màu của protein để ứng dụng trong định tính, định lượng protein, axít amin.

- Các giá trị của đường chuẩn albumin chính xác với hệ số R2 cao.

- Xác định chính xác lượng protein có trong mẫu với sai số ≤ 5%.

34

2.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành Sinh viên trình bày hiện tượng quan sát được, đo giá trị hoặc xác định kết quả thí nghiệm và giải thích kết quả thu được.

Bảng 2.4. Hiện tƣợng, kết quả và giải thích kết quả TT

Tên thí nghiệm

1

Kết tủa protein bằng muối trung tính

2

Kết tủa protein bằng kim loại nặng

3

Phản ứng Biurê

4

Phản ứng Xantoprotein

5

Phản ứng Floria

6

Xác định lượng nitơ amin bằng chuẩn độ foocmol

7

Định lượng protein theo phương pháp Lowry

8

Định lượng protein theo phương pháp Biurê

Hiện tƣợng -Kết quả

35

Giải thích

Hình ảnh

Ghi chú

Bài 3 PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ SẢN PHẨM TRAO ĐỔI AXÍT AMIN, PROTEIN 3.1. Mục đích Trong các mô động vật, thực vật và vi sinh vật, quá trình trao đổi axít amin, protein thường xuyên diễn ra dưới tác dụng của phức hệ enzim nội bào. Quá trình trao đổi axít amin, protein có một số sản phẩm trao đổi đặc thù. Bài thực hành sẽ giúp sinh viên củng cố được lý thuyết của các quá trình trao đổi chất ở sinh vật. Nắm được một số phương pháp để xác định và tính toán lượng các sản phẩm của quá trình trao đổi chất.

3.2. Yêu cầu Sau khi thực hiện xong bài thực hành, sinh viên phải: - Nắm vững nguyên tắc của các phương pháp xác định sản phẩm trao đổi chất; - Biết cách tiến hành và xác định chính xác lượng sản phẩm trao đổi có trong mẫu.

3.3. Nội Dung thực hành 3.3.1. Phản ứng phát hiện urê  Nguyên tắc: Urê là một trong những sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi protein. Ở người bình thường, trong một ngày đêm có khoảng 6 đến 18 gam urê được thải ra ngoài cùng với nước tiểu. Số lượng urê chiếm khoảng 80 - 90% nitơ tổng số có trong nước tiểu.

Hàm lượng urê trong nước tiểu tỉ lệ thuận với hàm lượng protein trong khẩu phần ăn, cường độ phân giải protein trong cơ thể và trạng thái sinh lí của cơ thể. Để phát hiện urê, có thể dựa vào phản ứng biurê hoặc sản phẩm phân giải urê.  Hóa chất - dụng cụ: Nước tiểu cô đặc (cho vào bát sứ 5 ml nước tiểu, đặt trên nồi cách thủy cho bay hơi còn khoảng 2 ml nước tiểu), HCl, thuốc thử biurê, NaOH 10%, nồi đun cách thủy, bát, ống nghiệm, pipet.

36

 Tiến hành: Chuẩn bị 2 ống nghiệm khô, sạch, đánh số thứ tự 1 (ống thí nghiệm) và 2 (ống đối chứng); - Cho 2 ml nước tiểu cô đặc vào ống nghiệm 1 và 2 ml nước cất vào ống nghiệm 2; - Cho vào mỗi ống 5 giọt HCl đặc, để yên 5 phút; - So sánh sự tạo thành kết tủa ở ống 1 và 2; - Gạn bỏ phần nước trong, thu kết tủa ở ống 1 gồm tinh thể urê màu nâu; - Tiến hành phản ứng Biurê; - Đun nóng tủa thu được trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng chảy; - Để nguội, thêm vào 1 ml NaOH 10% và 3 giọt CuSO4 1%; - Lắc đều, quan sát và giải thích kết quả.

3.3.2. Phát hiện axít amin, protein trong mồ hôi và nước tiểu  Nguyên tắc: Quá trình chuyển hóa protein tạo nên các axít amin. Các axít amin tham gia chủ yếu vào quá trình kiến tạo các cơ quan, mô, hoặc phân giải đến cùng để cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động sống của cơ thể. Ngoài ra, tùy thuộc vào trạng thái sinh lí, bệnh lí của cơ thể, một số axít amin có thể bị thải ra ngoài cùng với mồ hôi và nước tiểu. Sử dụng phản ứng ninhidrin để phát hiện axít amin.

3.3.2.1. Phát hiện axít amin trong mồ hôi  Hóa chất - dụng cụ: Mồ hôi, ninhidrin 0,1%, ống nghiệm, giấy lọc, panh kẹp, đèn cồn, tủ ấm, đĩa peptri.  Tiến hành: - Cắt một mảnh giấy lọc có kích thước 3x3 cm. Ấn mạnh các ngón tay trên giấy, để thấm mồ hôi; - Dùng kẹp giấy lấy mẩu giấy nhúng vào dung dịch ninhidrin 0,1%; - Đặt giấy trên đĩa petri cho bay hơi dung dịch ninhidrin; - Hơ nhẹ giấy trên ngọn lửa đèn cồn hoặc để trong tủ ấm 60oC trong 5 phút; - Lấy giấy ra và quan sát sự xuất hiện các vạch màu; - Đối chứng làm tương tự thay mồ hôi bằng nước cất; - Giải thích kết quả thí nghiệm.

37

3.3.2.2. Phát hiện axít amin trong nước tiểu  Hóa chất - dụng cụ: Nước tiểu, ninhidrin 0,1%, ống nghiệm, giấy lọc, panh kẹp, đèn cồn, tủ ấm, đĩa peptri.  Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm 1 ml nước tiểu và 5 giọt ninhidrin 0,1%; - Đun nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, quan sát sự xuất hiện màu trong ống nghiệm; - Quan sát và giải thích kết quả thí nghiệm.

3.3.2.3. Phát hiện protein trong nước tiểu  Nguyên tắc: Nước tiểu của người bình thường hầu như không có protein hoặc protein chỉ ở dạng vết. Khi cơ thể ở trạng thái bị bệnh lí hoặc sinh lí đặc biệt, lượng protein thải ra ngoài cùng với nước tiểu tăng từ vài gam đến hàng chục gam (25 g) trong 1 ngày đêm. Đặc biệt khi cơ thể bị bệnh thận hoặc huyết áp cao, trong nước tiểu xuất hiện albumin và globulin huyết thanh. Sử dụng các tác nhân gây kết tủa protein như nhiệt độ cao, axít vô cơ, axít hữu cơ để phát hiện protein trong nước tiểu.  Hóa chất - dụng cụ: Nước tiểu, CH3COOH 10%; HNO3 đặc, axít sulfosalisilic 20%, ống nghiệm, giấy lọc, panh kẹp, đèn cồn, tủ ấm, đĩa peptri.  Tiến hành: - Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml nước tiểu; - Đun sôi ống 1 trên ngọn lửa đèn cồn; - Khi xuất hiện vẩn hoặc kết tủa, tiếp tục cho 3 - 5 giọt CH3COOH 10%; - Đun sôi, để nguội; - Cho từ từ vào thành ống nghiệm thứ 2: 1 ml HNO3 đặc; - Cho vào ống nghiệm thứ 3: 5 giọt axít sunfosalisilic 20%; - Quan sát sự xuất hiện hoặc không xuất hiện các thể vẩn hay tủa trong từng ống nghiệm; - Thực hiện tương tự với ống đối chứng chứa mẫu là nước tiểu chứa albumin; - Giải thích kết quả thu được.

38

3.3.3. Phản ứng phát hiện creatin, creatinin Creatin và creatinin là sản phẩm của quá trình trao đổi protein. Trong cơ, creatin tồn tại dưới dạng creatin - photphat, là nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu cho hoạt động co rút của cơ. Ngoài ra, creatin còn tồn tại trong nước tiểu chủ yếu dưới dạng anhidrit gọi là creatinin.

3.3.3.1. Phát hiện creatin trong cơ  Nguyên tắc: Phản ứng chuyển hóa giữa các dạng creatin diễn ra như sau: Trong môi trường kiềm, creatin chuyển thành creatinin.

Sau đó, creatinin tác dụng với axít picric trong môi trường kiềm để tạo phức màu đỏ cam.

 Hóa chất - dụng cụ: Cơ (gà, lợn, cá...); axít sunfosalisilic 20%, HCl 10%, NaOH 10%, axít picric bão hòa (12 g/l), ống nghiệm, cối chày sứ, đũa thủy tinh, giấy lọc, nồi cách thủy, bếp điện, phễu.

39

 Tiến hành: - Tách và cân 2 gam cơ, cho vào cối sứ nghiền nhỏ. Thêm vào 2 ml nước cất, tiếp tục nghiền thành chất đồng thể, chuyển sang ống nghiệm. Cho thêm vào ống nghiệm một thể tích axít sulfosalisilic 20% (tỉ lệ 1:1), khuấy đều, để yên vài phút, kết tủa protein được lắng xuống, lọc tủa được nước chiết cơ; - Lấy 2 ml dịch lọc cho sang ống nghiệm khác, cho vào đó 2 ml HCl 10% đun trên nồi cách thủy sôi trong 1 giờ, để nguội. Cho thêm vào ống 2 ml axít picric bão hòa và 2 ml NaOH 10%, dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu, giải thích kết quả; - Ống đối chứng tiến hành tương tự, thay mẫu dịch chiết cơ bằng nước cất.

3.3.3.2. Phát hiện creatinin trong nước tiểu  Nguyên tắc: Creatinin là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi nitơ có trong nước tiểu. Ở người, trong một ngày đêm tiết khoảng từ 0,8 đến 1,0 gam creatinin trong nước tiểu.

Hàm lượng creatinin trong nước tiểu dao động, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của cơ thể, chế độ thức ăn. Khi ăn nhiều thịt hoặc chức năng cơ, thận bị thương tổn, cơ thể ở trạng thái bệnh lí như sốt, nhiễm trùng nặng, tiểu đường... lượng creatinin trong nước tiểu tăng lên.  Hóa chất - dụng cụ: NaOH 10%; axít picric bão hòa (12 g/l), ống nghiệm.  Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm 2 ml nước tiểu, 6 giọt NaOH 10% và 4 giọt axít picric bão hòa, lắc đều; - Quan sát sự tạo thành màu trong ống nghiệm. Giải thích kết quả.

3.4. Kết quả thực hành - Sinh viên ghi chép lại hiện tượng và giá trị xác định được trong quá trình của các thí nghiệm.

- Sinh viên mô tả hiện tượng của kết quả từng thí nghiệm 3.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm 3.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên Sinh viên trả lời được các câu hỏi về nguyên tắc xác định một số sản phẩm của quá trình trao đổi chất.

40

3.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành Sinh viên trình bày hiện tượng quan sát được, đo giá trị hoặc xác định kết quả thí nghiệm và giải thích kết quả thu được.

Bảng 3.1. Kết quả, hiện tƣợng và giải thích TT

Tên thí nghiệm

1

Phát hiện urê trong nước tiểu

2

Phát hiện axít amin trong mồ hôi

3

Phát hiện axít amin trong nước tiểu

4

Phát hiện protein trong nước tiểu

5

Phát hiện creatin trong cơ

6

Phát hiện creatinin trong nước tiểu

Hiện tƣợng - Kết quả

41

Giải thích

Hình ảnh

Ghi chú

Bài 4 TÍNH CHẤT CỦA AXÍT NUCLEIC 4.1. Mục đích Giúp sinh viên hiểu được và nghiên cứu xác định được thành phần và một số tính chất của axít nucleic.

4.2. Yêu cầu Sau khi thực hiện xong bài thực hành, sinh viên cần đáp ứng những yêu cầu sau: - Trả lời được ý nghĩa của axít nucleic; - Xác định được thành phần của axít nucleic; - Giải thích được một số tính chất của axít nucleic.

4.3. Nội dung 4.3.1. Tóm tắt lý thuyết Axít nucleic có tính axít là do trong thành phần có chứa axít phosphoric, (H+ có khả năng phân ly). Do đó, các axít nucleic là các đa anion - mang nhiều điện tích âm, điều này làm cho chúng có khả năng tương tác với các đa cation, đặc biệt là với các protein kiềm (là các chất mang điện dương). Chúng cũng liên kết với các hợp chất phân tử có tính chất kiềm, chẳng hạn như xanh methylen. Trong môi trường tự nhiên, DNA chủ yếu liên kết với các protein kiềm - histone, trong khi RNA chủ yếu liên kết với các protein trung tính.

Các phức hợp của axít nucleic với protein được gọi là nucleoprotein. Trong điều kiện phòng thí nghiệm của sinh viên, các nucleoprotein nhân tạo có thể thu được bằng cách trộn một dung dịch axít nucleic với huyết thanh. Nucleoprotein phân tách thành các thành phần riêng rẽ trong các dung dịch muối cô đặc. Trong môi trường kiềm, các axít nucleic tạo thành muối, hòa tan trong nước và chúng có thể kết tủa với ethanol.

Thành phần đường của axít nucleic gồm: ribose và deoxyribose có thể được phát hiện trực tiếp trong dung dịch của các axít này hoặc muối của chúng mà không cần thủy phân trước.

Ribose (trong RNA) khi được làm nóng bằng dung dịch HCl đậm đặc tạo thành furfural. Furfural tác dụng với orcin khi có mặt của ion Fe3+ tạo thành một phức hợp 42

màu xanh lá cây ổn định.

Deoxyribose (trong DNA) khi nung nóng với axít sulfuric đậm đặc được chuyển thành hydroxylevulinyl aldehyde. Hợp chất này tạo thành một phức hợp màu xanh trong phản ứng với diphenylamine.

Các bazơ purine chỉ có thể được phát hiện trong các sản phẩm thủy phân của axít nucleic.

Mẫu axít nucleic, dùng để phát hiện purin, thường được thủy phân trong axít sulfuric ở 100°C. Khi axít nucleic được thủy phân tạo thành adenine và guanine. Các bazơ purine kết tủa dễ dàng với các ion đồng hoặc bạc. Trong cùng điều kiện, pyrimidin ổn định và không phân hủy.

Sản phẩm cuối cùng của các biến đổi bazơ purine trong cơ thể người là axít uric hòa tan kém. Muối natri của axít này (natri urat) hòa tan tốt hơn, trong khi urê amoni, bạc và đồng ít hòa tan trong nước. Tính khử của axít uric làm cho nó trở thành một chất chống oxy hóa sinh học quan trọng.

Axít uric bị oxy hóa bởi tác dụng của axít nitric (V) thành alloxan và urê. Sự ngưng tụ của hai phân tử alloxan với amoniac gây ra sự hình thành axít murêxidic.

Muối của nó được gọi là murêxidate. Khi phản ứng với ion NH4+ hình thành phức murêxit màu tím, và khi phản ứng với ion Na+, sẽ hình thành một murêxidat natri màu xanh.

4.3.2. Nội dung thực hành 4.3.2.1. Chuẩn bị mẫu axít nucleic từ nấm men  Hóa chất - dụng cụ: Nấm men bánh mì, NaCl 25%, phenol đỏ, NaOH 10%, NaOH 2%, ethanol 70%, NaOH 1M, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet, ống eppendorf, cối chày sứ.  Tiến hành: - Hòa tan 25 gam nấm men bánh mì trong 30 ml NaCl. Nghiền kỹ trong cối chày sứ; - Thêm 30 giọt dung dịch phenol đỏ trong cồn; - Bổ sung NaOH 10% đến khi làm trung hòa hỗn hợp (2 giọt phenolphtalein 1% làm chỉ thị); 43

- Bổ sung NaOH 2% thêm vào hỗn hợp từ từ đến khi xuất hiện màu đỏ cam; - Để dung dịch hỗn hợp vào nồi đun sôi cách thủy trong 30 phút, lắc đều, axít nucleic sẽ được tiết ra dung dịch. Sau khi làm lạnh, ly tâm hoặc lọc thu lấy phần dịch nổi, loại phần cặn; - Phần dịch lỏng chứa axít nucleic được bổ sung ethanol với thể tích gấp 3 lần trong 15 phút. Sau đó, axít nucleic được kết tủa, thu lấy kết tủa và hòa tan lại trong 15 ml NaOH 1 M; - Kết quả thu được dung dịch axít nucleic - natri nucleate sử dụng cho những nghiên cứu sau.

4.3.2.2. Tính chất của axít nucleic và sản phẩm trao đổi axít nucleic a. Tính chất hòa tan của axít nucleic  Hóa chất - dụng cụ: HCl 2M, NaOH 2M, dung dịch natri nucleate, ethanol 96%, ống nghiệm, pipet.  Tiến hành: Tác dụng của axít và kiềm: - Chuẩn bị ống nghiệm chứa 1 ml dung dịch natri nucleate; - Bổ sung vài giọt axít HCl 2M, lắc đều; - Quan sát sự tạo thành kết tủa và màu của dung dịch; - Bổ sung thêm vào ống nghiệm vài giọt NaOH 2M, lắc đều; - Quan sát sự hòa tan kết tủa và giải thích hiện tượng.

Tác dụng của dung môi: - Chuẩn bị ống nghiệm chứa 2 ml dung dịch natri nucleate; - Bổ sung thêm 2 ml ethanol; - Quan sát sự tạo thành kết tủa và giải thích hiện tượng. b. Phản ứng với dung dịch protein  Hóa chất - dụng cụ: Dung dịch nucleate natri, dung dịch axít acetic (1:20), NaCl bão hòa, ống nghiệm, pipet.

44

 Tiến hành: - Chuẩn bị ống nghiệm thứ 1: Chứa 1 ml dung dịch nucleate natri; - Chuẩn bị ống nghiệm thứ 2: Chứa 1 ml nước cất; - Bổ sung vào cả hai ống nghiệm 2 - 3 giọt axít acetic (1:20); - Quan sát sự tạo thành kết tủa và so sánh hiện tượng giữa hai ống nghiệm; - Bổ sung thêm vào cả hai ống 2 ml NaCl bão hòa; - Quan sát sự hòa tan kết tủa, so sánh và giải thích hiện tượng xảy ra ở hai ống nghiệm 1 và 2. c. Tính chất của axít uric  Hóa chất, dụng cụ: Dung dịch đinatri urate, axít nitric, dung dịch NH4OH, dung dịch NaOH, ống nghiệm, máy hút chân không, pipet.  Tiến hành: - Chuẩn bị 2 ống nghiệm, mỗi ống chứa 1 ml dung dịch đinatri urate; - Bổ sung vào cả 2 ống vài giọt axít nitric; - Cả 2 ống được đặt vào máy hút chân không đến khi khô; - Quan sát sự tạo thành kết tủa màu đỏ của dạng axít murêxydic ở cả 2 ống nghiệm; - Ống thứ 1: Bổ sung thêm vài giọt dung dịch NH4OH, quan sát sự tạo thành kết tủa màu tím của amonium murêxide; - Ống thứ 2: Bổ sung thêm vài giọt NaOH, quan sát sự tạo thành kết tủa màu xanh của sodium murêxidate; - Quan sát, so sánh và giải thích hiện tượng xảy ra trong 2 ống nghiệm.

4.4. Kết quả thực hành - Sinh viên ghi chép lại hiện tượng và giá trị xác định được trong quá trình của các thí nghiệm.

- Sinh viên mô tả hiện tượng và giải thích.

45

4.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm 4.5.1. Đánh giá sinh viên trực tiếp Sinh viên trả lời được các câu hỏi về nguyên tắc xác định tính chất của một số sản phẩm axít nucleic và của quá trình trao đổi chất từ axít nucleic.

4.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành Sinh viên trình bày hiện tượng quan sát được, đo giá trị hoặc xác định kết quả thí nghiệm và giải thích kết quả thu được.

46

Bài 5 ENZYM 5.1. Mục đích Giúp sinh viên nắm được nguyên lý và cách tiến hành một số phương pháp xác định hoạt độ và đánh giá độ hoạt động của enzym.

5.2. Yêu cầu Sau khi thực hiện xong bài thực hành, sinh viên phải: - Nắm vững các khái niệm về hoạt độ enzym; - Biết cách xác định hoạt độ của một enzym; - Xác định được hoạt độ của enzym.

5.3. Nội dung 5.3.1. Tóm tắt lý thuyết Enzym là protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học, chúng thúc đẩy một phản ứng xảy ra mà không có mặt trong sản phẩm cuối cùng.

Enzym bị biến tính hay phân tách thành những tiểu đơn vị thì hoạt tính xúc tác thường mất đi, tương tự protein, enzym bị phân cắt thành những axít amin.  Cơ chế tác dụng của enzym Nhìn chung ta có thể hình dung cơ chế tác dụng của enzym lên cơ chất tạo sản phẩm bằng phương trình tổng quát như sau: E+S

E-S

P+E

Giai đoạn 1: E kết hợp với S để tạo thành phức E-S. Giai đoạn này xảy ra rất nhanh.

Giai đoạn 2: Sau khi tạo phức, cơ chất có những biến đổi nhất định về mật độ điện tử, cấu hình làm cơ chất trở nên hoạt động hơn, phản ứng được dễ dàng để tạo thành sản phẩm P.  Ứng dụng của enzym trong y học: - Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, urê, cholesterol…; - Xác định hoạt tính xúc tác của enzym trong mẫu sinh vật;

47

- Xác định nồng độ cơ chất với sự hỗ trợ của thuốc thử enzym đánh dấu; - Dùng enzym để định lượng các chất, phục vụ công việc xét nghiệm chẩn đoán bệnh, ví dụ: kiểm tra glucose nước tiểu, urêaza để định lượng urê…; - Dùng enzym làm thuốc ví dụ: Proteaza làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm…; - Amylaza được sử dụng phối hợp với coenzym A, cytocrom C, ATP, carboxylaza để chế thuốc điều trị tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzym thủy phân để chữa bệnh thiếu enzym tiêu hóa...

5.3.2. Nội dung thực hành 5.3.2.1. Amylaza nước bọt  Nguyên tắc: Amylaza nước bọt người thuộc loại alpha - amylazaxít amin, xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột thành các dextrin khác nhau. Các dextrin này khác nhau về khối lượng phân tử, khả năng cho phản ứng màu với iốt và khả năng khử dung dịch fehling.  Hóa chất - dụng cụ: Dung dịch tinh bột 1%, thuốc thử liugon (phụ lục 4), thuốc thử fehling (phụ lục 5), nồi cách thủy ổn nhiệt (400C), bản sứ thử pH, phễu thủy tinh, bình nón (V - 100 ml), ống đong, ống nghiệm.  Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch nước bọt: Súc miệng sạch, lấy 50 ml nước cất để súc miệng nhẹ vài lần khoảng 3 - 5 phút. Lọc dịch nước bọt qua bông và dịch bọt dùng để thí nghiệm; - Thủy phân tinh bột: Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 5 ml dung dịch tinh bột; - Thêm 5 ml dung dịch nước bọt vào ống thứ 1 và 5 ml nước cất vào ống thứ 2, lắc đều cả hai ống; - Để vào mỗi ống một chiếc đũa thủy tinh, đặt cả 2 ống vào nồi cách thủy 40oC; - Sau 1, 2, 4, 6, 8 phút dùng đũa thủy tinh lấy từ mỗi ống nghiệm 1 giọt hỗn hợp phản ứng nhỏ vào các miếng trên bản sứ, thêm vào mỗi giếng 2 giọt thuốc thử liugôn; - Quan sát màu ta thấy ở dẫy thí nghiệm (chứa nước bọt) có sự biến đổi màu các 48

giọt trên bản sứ, tùy theo thời gian phản ứng: Từ màu xanh tím đến đỏ nâu, đỏ và cuối cùng là màu vàng. Ở dãy kiểm tra, tất cả các giọt đều có màu xanh tím; - Giải thích kết quả thu được; - Thử khả năng khử hỗn hợp fehling: Thêm vào ống 1 và 2 mỗi ống 2 ml hỗn hợp fehling, đun sôi, ở ống có amylaza xuất hiện kết tủa đỏ nâu của Cu2O. 5.3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ amylaza nước bọt  Nguyên tắc: Đa số enzym tách từ cơ thể động vật máu nóng hoạt động mạnh nhất ở 37 - 400C. Ngoài giới hạn nhiệt độ này, hoạt động enzym thường bị giảm, ở nhiệt độ > 700C hầu hết enzym bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác.  Hóa chất - dụng cụ: Dung dịch nước bọt không pha loãng, dung dịch tinh bột 1%, thuốc thử liugon hoặc dung dịch iốt 0,3% trong KI 3%, bản sứ, nồi cách thủy 1000C, tủ ấm 370C, phích đá, ống nghiệm, pipet, giá ống nghiệm, kẹp ống nghiệm.  Tiến hành: - Chuẩn bị 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch tinh bột 1%; - Đặt ống 1 vào nồi cách thủy đang sôi, ống 2 vào tủ ấm 370 C, ống 3 vào nước đá; - Giữ các ống 15 phút để dung dịch trong ống đạt đến nhiệt độ tương ứng; - Cho vào mỗi ống 0,5 ml dung dịch enzym cũng đã đạt nhiệt độ như trên; - Đặt các ống nghiệm vào các nhiêt độ cũ trong thời gian 1, 2, 4, 6, 8 và 12 phút; - Lấy từ mỗi ống 1 giọt, nhỏ vào các giọt thuốc thử liugon đã chuẩn bị sẵn trên bản sứ; - Quan sát màu tạo thành, nhận xét sự sai khác giữa các mẫu và giải thích.

5.3.2.3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm và kích hoạt đến hoạt độ của amylaza  Nguyên tắc: Hoạt độ thủy phân tinh bột của alpha - amylaza nước bọt được kích thích bởi NaCl và bị kìm hãm bởi CuSO4. Để nghiên cứu tác dụng của các chất này, người ta cho enzym thủy phân tinh bột trong điều kiện có và không có các chất đó. Đánh giá hoạt độ của enzym dựa theo mầu của hỗn hợp phản ưng với iốt.  Hóa chất - dụng cụ: Dung dịch nước bọt không pha loãng, dung dịch tinh bột 0,5%, NaCl 1%, CuSO4 1%, thuốc thử liugon, ống nghiệm, pipet...

49

 Tiến hành: - Chuẩn bị 3 ống nghiệm: + Ống 1: 1 ml nước cất; + Ống 2: 0,8 ml nước cất + 0,2 ml NaCl 1%; + Ống 3: 0,8 ml nước cất + 0,2 ml CuSO4 1%.

- Lắc đều, cho vào mỗi ống 1 ml nước bọt và 1 ml dung dịch tinh bột 0,5%, lắc đều; - Sau vài phút thêm vào mỗi ống vài giọt liugon, quan sát sự khác nhau giữa các ống, giải thích kết quả.

5.3.2.4. Xác định hoạt độ alpha - amylaza theo phương pháp Wohlgemuth  Nguyên tắc: Dùng dung dịch amylaza có độ pha loãng khác nhau tác dụng với một lượng tinh bột như nhau. Tìm nồng độ enzym nhỏ nhất có thể phân giải hoàn toàn lượng tinh bột đó qua biểu diễn hoạt độ bằng đơn vị Wohlgemuth. Một đơn vị Wohlgemuth là lượng enzym có thể phân giải 1 mg tinh bột thành các sản phẩm không màu với i ốt trong 30 phút ở 370C, khi có anion Cl-.  Hóa chất, dụng cụ: Nước bọt không pha loãng, dung dịch tinh bột 0,1% trong đệm photphat pH = 6,8; NaCl 0,9%, dung dịch iốt 0,02, tủ ấm, nồi cách thủy ổn nhiệt 370C, giá và kẹp ống nghiệm.  Tiến hành: - Chuẩn bị 10 ống nghiệm sạch, khô, đánh số từ 1 đến 10; - Cho vào mỗi ống 1 ml NaCl 0,9%. Thêm 1 ml dung dịch enzym vào ống 1, lắc đều; - Lấy ra 1 ml cho vào ống 2, lắc đều; - Lấy ra 1 ml cho vào ống 3, lắc đều...; - Tiếp tục làm như vậy đến ống thứ 10, lấy 1 ml từ ống 10 bỏ đi; - Sau đó cho vào mỗi ống dung dịch tinh bột 0,1%, lắc đều; - Giữ ở 370C trong 30 phút, sau đó làm nguội ống nghiệm; - Cho vào mỗi ống 2 giọt dung dịch iốt 0,02N; - Ghi ống có độ pha loãng lớn nhất vẫn có khả năng phân giải tinh bột (ống màu vàng và ống sau có màu nâu đỏ hay tím);

50

- Tính kết quả: Trong mỗi ống nghiệm có chứa 2 ml tinh bột 0,1% (tương ứng 2 mg), giả sử sau khi thêm iốt, từ ống 1 đến ống 5 dung dịch màu vàng, ống 6 màu nâu đỏ thì hoạt độ enzym amylaza trong 1ml nước bọt thí nghiệm là: 25 x 2 = 32 x 2 = 64 (đơn vị) Trong đó: - 25 = 32: Độ pha loãng ở ống 5; - 2: Số ml dung dịch tinh bột thí ban đầu (2 ml).

5.3.2.5. Xác định hoạt độ amylaza bằng phương pháp DNS  Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với hỗn hợp thuốc thử axít dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Khi so màu tiến hành ở bước song 540 nm và dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.

Xác định hoạt độ amylase: - Enzym amylaza khi cho phản ứng với cơ chất tinh bột sẽ phân cắt tinh bột thành các phân tử nhỏ hơn và một lượng đường khử nhất định; - Xác định hàm lượng đường khử có trong mẫu sau phản ứng enzym so với đối chứng để tính hoạt độ enzym.  Hóa chất - dụng cụ: Glucose, hỗn hợp DNS (phụ lục 6), NaOH, tinh bột 0,2%, NaCl 0,1%, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, máy đo quang, pipet.  Tiến hành:  Xây dựng đường chuẩn nồng độ glucose (mg/ml) - Pha dung dịch glucose đã biết nồng độ từ 0,1 đến 1,0 mg/ml.

- Tiến hành phản ứng của dãy chuẩn nồng độ glucose với DNS. - Đọc kết quả trên máy so màu OD540nm thu được bảng số liệu về mối liên hệ giữa nồng độ glucose và giá trị OD540nm.

- Sử dụng phần mềm Excel để dựng đồ thị đường chuẩn dựa trên giá trị OD540nm thu được với hệ số R2 ≥ 0,98.  Phản ứng enzym - cơ chất 51

- Tiến hành phản ứng enzym với cơ chất là tinh bột 0,2%.

- Ống nghiệm 1: 1 ml dịch enzym + 1 ml NaCl 0,1% + 1 ml cơ chất (TN).

- Ống nghiệm 2: 1 ml dịch enzym + 1 ml NaCl 0,1% đun sôi 2 phút, làm nguội rồi cho 1 ml cơ chất.

- Đặt cả 2 ống nghiệm vào tủ 370C trong vòng 30 phút.  Phản ứng với DNS - Lấy 2 ống nghiệm sau phản ứng ra, thực hiện phản ứng với DNS. - 2 ml dịch sau phản ứng + 1 ml DNS, đun sôi 5 phút.

- Làm nguội.  So màu bằng máy đo quang - Đo OD540nm của mẫu thí nghiệm so với đối chứng.

- Kết quả: Từ đồ thị đường chuẩn nồng độ glucose theo OD540nm tra được nồng độ đường khử có trong mẫu thí nghiệm so với đối chứng.

- Tính được hoạt độ enzym amylaza trong dịch nuôi cấy vi khuẩn.  Hoạt độ enzym: HĐE = (C2 – C1) x n / 0.18 (U/ml) Trong đó: - HĐE: Là hoạt độ enzym (là lượng enzym cần thiết để giải phóng ra 1 µmol cơ đường khử (glucose) ở 370C trong 1 ml dịch lên men trong 30 phút, (U/ml); - C2: Nồng độ đường khử trong mẫu phân tích (mg/ml); - C1: Nồng độ đường khử trong mẫu đối chứng (mg/ml); - n: Hệ số pha loãng (nếu có); - 0,18: Khối lượng của 1 µmol glucose (mg).

5.3.2.6. Xác định hoạt độ của lipaza  Nguyên tắc: Có thể xác định được hoạt độ lipaza theo hàm lượng axít béo được giải phóng ra từ lipit dưới tác dụng của lipaza.

52

 Hóa chất - dụng cụ: KOH 0,1N; etanol 96%, phenolphtalein 1%, chế phẩm lipaza tụy tạng, bình nón 100 ml, burêt, tủ ấm 37 - 400C.  Tiến hành: - Chuẩn bị chế phẩm tụy tạng: Cân 1 gam tụy tạng động vật cho vào cối sứ, thêm 5 ml hỗn hợp nước - glycerin (3:1), nghiền kỹ 3 - 5 phút, sau đó thêm 5 ml hỗn hợp nước - glycerin nghiền tiếp 1 - 2 phút. Lọc vắt hỗn hợp qua 2 lớp vải màn, sau đó lọc lại qua giấy lọc, thu dung dịch lipaza; - Lấy 2 bình nón 100 ml, cho vào mỗi bình 10 ml sữa tươi; - Bình 1 (bình kiểm tra): Đun đến sôi, sau đó cho 2 ml lipaza vào đun sôi 5 phút, để nguội; - Bình 2 (bình thí nghiệm): Để nguyên, thêm vào 2 ml lipaza, lắc đều; - Để 2 bình vào tủ ấm 37 - 400C sau 1 giờ; - Lấy 2 bình ra, thêm vào mỗi bình 8 ml etanol tuyệt đối hoặc 96%, vài giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng KOH 0,1N; - Hoạt độ lipaza biểu thị bằng số ml KOH đã dùng để chuẩn độ axít béo tạo thành từ sự thủy phân lipit có trong 1 ml sữa, tính theo công thức: X = (A - B) x k x 100 (U/ml) Trong đó: - A: Số ml KOH 0,1 dùng chuẩn bình 2; - B: Số ml KOH 0,1 dùng chuẩn bình 1; - k: Hệ số điều chỉnh dung dịch KOH. 5.4. Kết quả thực hành Sinh viên ghi chép lại hiện tượng và giá trị xác định được trong quá trình của các thí nghiệm.

5.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm 5.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên Sinh viên trả lời được các câu hỏi về nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzym.

Biết cách xác định và tính toán hoạt độ của enzym.

53

5.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành Sinh viên trình bày hiện tượng quan sát được, đo giá trị hoặc xác định kết quả thí nghiệm và giải thích kết quả thu được.

Bảng 5.1. Hiện tƣợng/kết quả và giải thích TT

Tên thí nghiệm

1

Amylase nước bọt

2

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ amylase nước bọt

3

Ảnh hưởng của chất kìm hãm và kích hoạt tới hoạt độ amylase nước bọt

4

Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Wohlegmuth

5

Xác định hoạt độ amylase bằng DNS

6

Xác định hoạt độ lipase

Hiện tƣợng Kết quả

54

Giải thích

Hình ảnh

Ghi chú

Bài 6 XACARIT 6.1. Mục đích Bài thực hành giúp sinh viên hiểu và nắm được tính chất, vai trò của xacarit, các phản ứng định lượng xacarit, xác định xacarit.

6.2. Yêu cầu Sau khi thực hiện xong bài thực hành, sinh viên phải: - Nắm vững kiến thức về xacarit, các tính chất và đặc điểm của xacarit - Nắm vững các nguyên tắc của các phản ứng định lượng xacarit - Tiến hành được các thí nghiệm xác định và định lượng xacarit 6.3. Nội dung 6.3.1. Tóm tắt lý thuyết Xacarit là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố: C, H, O có công thức cấu tạo chung Cm(H O)n, thường m = n. Xacarit là thành phần quan trọng trong mọi 2

sinh vật.  Monoxacarit (đường đơn): Là đơn vị cấu tạo của glucid không bị thủy phân thành những chất đơn giản hơn, là chất có chứa nhiều nhóm rượu và một nhóm khử oxy (aldehyd hay ceton).  Oligoxacarit: Gồm 2 - 10 mono nối nhau bằng các liên kết glycosid. Tùy theo số monoxacarit mà gọi tên khác nhau. Đơn giản và quan trọng nhất là các dixacarit (saccarose, lactose, maltose), trixacarit (maltosetriose, rafinose), oligoxacarit trong glycoprotein có thể chứa tới 14 monoxacarit.  Polyxacarit: Là những glucid khi thủy phân cho ra nhiều đơn vị monoxacarit.

Tùy vào bản chất các thành phần tạo ra khi thủy phân mà có các tên gọi khác nhau.

6.3.2. Nội dung thực hành 6.3.2.1. Các phản ứng định tính xacarit a. Phản ứng Tromer  Nguyên tắc: 55

Các dạng đường (mono, đi, oligo và polixacarit) có thể định lượng được bằng nhiều phương pháp hóa học khác nhau: Dùng phản ứng màu, dùng phản ứng khử của đường hay sau khi thủy phân bằng enzym hoặc axít đối với oligo và poli xacarit. Các phương pháp thông dụng hơn cả sử dụng phản ứng khử của đường. Trong đó, phản ứng khử Cu2+ là phổ biến nhất.

Dưới tác dụng của các mono và 1 số đi xacarit trong môi trường kiềm, Cu2+ bị khử thành Cu+, đồng thời nhóm chức aldehyt hoặc xeton của đường bị oxi hóa thành các muối tương ứng.  Hóa chất - dụng cụ: Glucose 5%; NaOH 10%; CuSO4 5%, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet.  Tiến hành: - Chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch, khô; - Cho 2 ml dung dịch glucose 5% vào ống 1 (ống thí nghiệm); - Cho 2 ml nước cất vào ống 2 (ống đối chứng); - Cho vào cả hai ống, mỗi ống 2 ml dung dịch NaOH 10%; - Thêm vào hai ống từng giọt CuSO 4 5% vào đến khi xuất hiện kết tủa xanh của Cu(OH) 2 ; - Đun đến sôi, quan sát hiện tượng ở hai ống, so sánh và giải thích. b. Phản ứng với thuốc thử fehling  Nguyên tắc: Phản ứng với thuốc thử fehling là phản ứng Tromer cải tiến: Cu2+ ở dạng kết hợp với muối kali natri tactrat sẽ bị các mono - và đi xacarit có tính khử khử thành Cu+ theo cách tương tự như phản ứng Tromer.  Hóa chất - dụng cụ: Glucose 1%, mantozo 1%, sacarozo 1%, hỗn hợp thuốc thử fehling, NaOH, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet.  Tiến hành: - Lấy 3 ống nghiệm sạch khô; - Cho 1 ml dung dịch glucose 1% vào ống 1, 1 ml maltose 1% vào ống 2 và cho 1 ml sacarose 1% vào ống 3; - Cho vào mỗi ống thêm 1 ml hỗn hợp thuốc thử fehling (fehling A + fehling B (tỉ lệ 1:1), pha ngay trước khi dùng), lắc đều; 56

- Đun cả 3 ống đến khi bắt đầu sôi, quan sát và so sánh kết quả trong các ống, giải thích kết quả thí nghiệm. c. Phản ứng với đồng axetat (phản ứng Barfed)  Nguyên tắc: Phản ứng này khác với các phản ứng trên ở chỗ không tiến hành trong môi trường kiềm mà trong môi trường gần trung tính, trong điều kiện này các đixacarit không bị oxi hóa nên đây là phản ứng để phân biệt đisacarit và monoxacarit có tính khử.  Hóa chất - dụng cụ: Glucose 5%; mantozo 5%; thuốc thử đồng axetat, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet.  Tiến hành: - Lấy 2 ống nghiệm sạch khô, cho 1 ml dung dịch glucose 5% vào ống 1, 1 ml dung dịch mantoz 5% vào ống 2; - Thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử đồng axetat (phụ lục 7); - Để 2 ống vào nồi cách thủy đang sôi trong 10 phút; - Quan sát, so sánh và giải thích các kết quả nhận được; - Viết phương trình phản ứng. d. Phản ứng khử Xanh metylen  Nguyên tắc: Dưới tác dụng của glucose, xanh metylen bị khử thành chất không màu.  Hóa chất - dụng cụ: Xanh metylen 1%, NaOH 5%, Glucose 1%, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet, phích đá.  Tiến hành: - Lấy 2 ống nghiệm sạch, khô; - Ống 1: Cho 2 ml nước, thêm 1 giọt xanh metylen 1% và 4 giọt NaOH 5%, đun sôi - quan sát; - Ống 2: Cho 2 ml glucose 1%, thêm 1 giọt xanh metylen và 4 giọt NaOH 5%, đun sôi và quan sát hiện tượng; - Làm lạnh cả 2 ống trong vài phút, quan sát, so sánh và giải thích.

57

6.3.2.2. Sự thủy phân tinh bột  Nguyên tắc: Dưới tác dụng của axít hoặc amylaza, tinh bột bị thủy phân tạo thành các sản phẩm trung gian gọi là dextrin, maltoz và cuối cùng là glucose. Có thể phân biệt các loại dextrin dựa vào sự khác nhau về khối lượng phân tử, khả năng khử và phản ứng màu với iốt. Amyloz dextrin và maltoz dextrin không có phản ứng màu với iốt. Vì vậy, có thể dựa vào phản ứng màu với iốt hoặc khả năng khử của sản phẩm được tạo thành để phán đoán mức độ thủy phân của tinh bột.  Hóa chất - dụng cụ: Dung dịch tinh bột 1%, HCl đặc, dung dịch iốt 0,001N, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet, bình nón, NaOH 5%.  Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm hoặc bình nón (50 ml): 15 ml dung dịch hồ tinh bột, 3 ml dung dịch HCl đặc; - Đặt vào nồi cách thủy đang sôi đồng thời chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm; - Cứ 10 phút cho vào mỗi cặp ống (1 ống của dãy 1 và 1 ống của dãy 2) vài giọt dung dịch tinh bột đang thủy phân; - Sau đó thêm vào 1 ml dung dịch iốt 0,001N vào mỗi ống của dãy 1. Quan sát màu của dung dịch; - Dãy ống 2 được trung hòa bằng NaOH 5% (chỉ thị phenolphtalein) và thực hiện tiếp phản ứng Tromer (6.3.2.1 a); - So sánh sự khác nhau của hiện tượng giữa các ống của hai dãy.

6.3.2.3. Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich  Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm các đường khử có thể khử dễ dàng đồng II oxit thành đồng I oxit dưới dạng kết tủa đỏ gạch. Dựa vào lượng CuSO4 dư không tham gia phản ứng sẽ tính được lượng đường khử có trong mẫu.  Hóa chất - dụng cụ: Mẫu đường cần xác định; thuốc thử fehling; H2SO4 25% và KI 30%, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet, tủ hút, burêt, bình nón...  Tiến hành: - Cho 1 ml dung dịch chứa đường và 2 ml nước cất vào bình nón thể tích 50 ml; - Cho thêm 2 ml dung dịch hỗn hợp fehling, đun sôi 2 phút; 58

- Sau khi đun dung dịch vẫn phải còn màu xanh đặc trưng và ở đáy ống phải có kết tủa Cu2O màu đỏ; - Nếu dung dịch mất màu hoàn toàn nghĩa là lượng fehling không đủ để oxi hóa hết lượng đường trong mẫu thì phải làm lại với dung dịch đường có nồng độ nhỏ hơn; - Ngược lại, nếu không có xuất hiện kết tủa đỏ gạch thì tăng lượng đường, giảm nước cất để đảm bảo tổng thể tích là 5 ml; - Làm nguội, cho thêm vào dung dịch hỗn hợp 1 ml H2SO4 25%; 1 ml KI 30%; - Thêm vào vài giọt hồ tinh bột (chỉ thị), lắc đều, giữ trong 20 phút; - Chuẩn độ lượng I2 tạo thành bằng Na2S2O3 0,1N; - Song song làm thí nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất.

Kết quả:

X = (a - b) x 3,3

(mg/ml)

Trong đó: - X: mg đường khử trong 1 ml dung dịch mẫu; - a: Số ml Na2S2O3 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra (mẫu đối chứng); - b: Số ml Na2S2O3 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm; - 3,3: Hệ số chuyển thành đường.

6.4. Kết quả thực hành - Sinh viên ghi chép lại hiện tượng và giá trị xác định được trong quá trình của các thí nghiệm.

- Sinh viên làm thí nghiệm ra kết quả và hiện tượng đúng, giải thích hợp lý và tính đúng lượng đường khử có trong mẫu.

6.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm 6.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên - Sinh viên trả lời được các câu hỏi về tính chất khử của xacarit.

- Trả lời câu hỏi về cấu trúc của tinh bột và tính chất bắt màu với iốt.

6.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành Sinh viên trình bày hiện tượng quan sát được, đo giá trị hoặc xác định kết quả thí nghiệm và giải thích kết quả thu được.

59

Bảng 6.1. Hiện tƣợng/kết quả và giải thích TT

Tên thí nghiệm

1

Phản ứng Tromer

2

Phản ứng với thuốc thử fehling

3

Phản ứng với đồng acetat

4

Phản ứng khử xanh metylen

5

Sự thủy phân tinh bột

6

Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich

7

Xác định pectin bằng phương pháp Canxi pectat

Hiện tƣợng - Kết quả

60

Giải thích

Hình ảnh

Ghi chú

Bài 7 LIPIT 7.1. Mục đích Bài thực hành giúp sinh viên hiểu và nắm được các tính chất vật lý, hóa học và ý nghĩa của các chỉ số lipit (chỉ số axít, chỉ số xà phòng, chỉ số iốt, peroxyt...) và các phản ứng xác định chỉ số lipit.

7.2. Yêu cầu Sau khi thực hiện xong bài thực hành, sinh viên phải: - Nắm vững kiến thức về lipit, các tính chất vật lý, hóa học và các khái niệm chỉ số và ý nghĩa của các chỉ số; - Nắm vững các nguyên tắc của các phản ứng chứng minh tính chất và xác định chỉ số lipit; - Tiến hành được các thí nghiệm xác định chỉ số lipit (chỉ số axít, chỉ số xà phòng, chỉ số iốt...).

7.3. Nội dung Để xác định tính chất hay đánh giá chất lượng của chất béo, thường dựa vào các chỉ số khác nhau: chỉ số axít, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số iốt, peroxyt...

7.3.1. Tóm tắt lý thuyết Lipit là ester của rượu và axít béo, tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước.

Lipit rất phổ biến ở động vật cũng như ở thực vật và tồn tại dưới 2 dạng mỡ nguyên sinh chất (dạng liên kết) và dạng dự trữ (dạng tự do).

- Mỡ nguyên sinh chất: Thành phần của màng tế bào cũng như các bào quan khác ví dụ: ty thể, lạp thể... dạng này không bị biến đổi ngay cả khi con người bị bệnh béo phì hoặc bị đói.

- Dạng dự trữ (dạng tự do) có tác dụng cung cấp năng lượng cho cơ thể, bảo vệ các nội quan, là dung môi cần thiết cho một số chất khác.

7.3.1.1. Tính chất vật lý của lipit a. Điểm tan chảy Điểm tan chảy phụ thuộc vào số C của axít béo, axít béo có chuỗi C dài thì 61

điểm tan chảy cao và ngược lại. Nhưng axít béo có C lẻ có điểm tan chảy thấp hơn axít béo có số C nhỏ hơn nó 1 đơn vị. Ngoài ra, độ tan chảy còn phụ thuộc vào số nối đôi trong phân tử axít béo, axít béo chứa nhiều nối đôi thì điểm tan chảy càng thấp. b. Độ sôi Axít béo có chuỗi C dài thì độ sôi càng cao, thường áp dụng tính chất này để tách các axít béo ra khỏi nhau. c. Tính hòa tan - Trong nước: Axít béo có chuỗi C ngắn (4; 6; 8) dễ tan, C khó tan, C không 10

12

tan. Nếu axít béo ở dạng muối thì dễ hòa tan hơn.

- Trong dung môi hữu không phân cực như benzen, ether, ether dầu hỏa axít béo dễ tan.

- Trong dung môi hữu cơ phân cực như aceton, axít béo khó hòa tan hay hòa tan rất ít.

7.3.1.2. Tính chất hóa học a. Sự hydrogen hóa Axít béo chưa no có thể kết hợp với H để tạo thành axít béo no: 2

Người ta dùng phản ứng này để chế tạo thực phẩm như margarin. b. Sự halogen hóa Axít béo không no kết hợp với các nguyên tố thuộc họ halogen (F, Cl, Br, I) để tạo thành axít béo no.

Có thể dùng phản ứng này để xác định số nối đôi trong phân tử axít béo. Phản ứng dễ dàng hay khó xảy ra tuỳ thuộc vào vị trí nối đôi đối với nhóm carboxyl, nối đôi càng gần nhóm carboxyl phản ứng càng khó xảy ra.

62

7.3.1.3. Các chỉ số của lipit a. Chỉ số axít Số mg KOH dùng để trung hòa tất cả axít béo tự do có trong 1 g chất béo. b. Chỉ số xà phòng hóa Số mg KOH cần thiết để trung hòa 1 g chất béo. Chỉ số xà phòng càng lớn thì độ dài mạch càng ngắn, nên được dùng để xác định độ dài của mạch C. c. Chỉ số iod Là số gam iod cần thiết để tác dụng lên 100 gam chất béo. Chỉ số iod càng lớn thì số nối đôi càng nhiều. d. Chỉ số este Số mg KOH cần thiết để trung hòa lượng axít béo liên kết với glycerin có trong 1 g chất béo. e. Chỉ số peroxyt Là lượng iốt được tạo ra bởi peroxyt có trong 100 g chất béo.

7.3.2. Nội dung thực hành 7.3.2.1. Các tính chất của lipit a. Tính tan  Nguyên tắc: Dưới tác dụng của các dung môi hữu cơ khác nhau, độ hòa tan của mỡ là khác nhau.  Hóa chất - dụng cụ: dầu lạc, etanol, ete etylic, cloroform, benzen, ống nghiệm, pipet.  Tiến hành: - Chuẩn bị 5 ống nghiệm sạch, khô; - Cho vào ống nghiệm 1: 2 ml nước cất, ống 2, 3, 4, 5 mỗi ống tương ứng 2 ml dung dịch ete, etanol, cloroform, benzen; - Thêm từng giọt dầu lạc vào mỗi ống, lắc đều; - Quan sát sự sai khác về độ hòa tan của dầu lạc trong các dung môi khác nhau.

-

63

b. Sự tạo thành nhũ tương  Nguyên tắc: Mỡ không hòa tan trong nước, vì vậy sau khi lắc mạnh mỡ với nước rồi để yên hỗn hợp một lúc, mỡ lại tạo thành một lớp nổi trên bề mặt, tuy nhiên, nếu có mặt của chất tạo nhũ tương (axít mật, xà phòng...) sẽ tạo nhũ tương mỡ trắng đục.  Hóa chất - dụng cụ: Dầu lạc, dung dịch xà phòng 2% hoặc mật động vật, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet.  Tiến hành: - Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống mỗi ống 4 ml nước cất; - Cho vào mỗi ống thêm vài giọt dầu lạc; - Cho vào 1 trong 2 ống 0,5 ml dung dịch xà phòng 2% hoặc dung dịch mật, lắc mạnh cả 2 ống; - Quan sát hiện tượng và giải thích kết quả. c. Phản ứng xà phòng hóa  Nguyên tắc: Dưới tác dụng của kiềm, mỡ bị thủy phân thành xà phòng và glyxerin.  Hóa chất - dụng cụ: dầu lạc, dung dịch KOH 0,5M trong etanol 50%, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet, bình nón...  Tiến hành: - Cho 0,5 ml dầu lạc vào bình nón dung tích 50 ml, sau đó cho thêm 10 ml dung dịch KOH trong etanol 50%, khuấy nhẹ; - Đun cách thủy khoảng 1 giờ, nếu chưa cạn, lấy ra đun sôi đến khi cạn khô; - Lấy sản phẩm ra, để nguội; - Thêm 20 - 30 ml nước cất vào, lắc đều; - Quan sát và giải thích sự tạo thành xà phòng (bọt) trong bình; - Viết phương trình phản ứng.

7.3.2.2. Xác định các chỉ số của lipit a. Xác định chỉ số axít của lipit  Nguyên tắc: 64

Chỉ số axít của mỡ là số mg KOH cần thiết để trung hòa lượng axít béo tự do có trong 1 gam mỡ.  Hóa chất - dụng cụ: dầu lạc, etanol 96%, KOH 0,1N, phenolphtalenin, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet, bình nón, burêt.  Tiến hành: - Cân 1 gam dầu lạc vào bình nón (50 ml); - Thêm vào 10 ml etanol 96% để hòa tan axít béo tự do; - Nếu dầu khó tan thì lắc kỹ và đun cách thủy, vừa đun vừa lắc; - Sau khi mỡ đã tan, thêm vài giọt phenolphtalein 0,1% vào bình; - Chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1N đến khi có màu hồng nhạt; - Chỉ số axít tính theo công thức: X = A x f x 5,6 Trong đó: - A: Số ml dung dịch KOH đã dùng chuẩn độ; - f: Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch KOH. b. Xác định chỉ số xà phòng hóa  Nguyên tắc: Chỉ số xà phòng hóa là số miligam KOH cần thiết để trung hòa các axít béo tự do và axít béo liên kết chứa trong 1 gam mỡ.  Hóa chất - dụng cụ: dầu lạc, dung dịch KOH 0,5M trong etanol 50%, HCl 0,5N, dung dịch phenolphtalein 0,1%, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet, bình nón, burêt...  Tiến hành: - Lấy 2 bình nón dung tích 50 ml, cho 0,5 gam dầu lạc vào bình 1, cho 0,5 gam nước cất vào bình 2; - Thêm vào mỗi bình 15 ml dung dịch KOH 0,5M pha trong etanol 50%; - Đun cách thủy khoảng 1 giờ đến khi dung dịch trở nên trong suốt; - Lấy sản phẩm ra, để nguội; - Thêm vào bình vài giọt phenolphtalein 1%, lắc đều; 65

- Chuẩn độ bằng HCl 0,5N; - Lượng KOH đã dùng để trung hòa tất cả axít béo trong dầu lạc là chỉ số xà phòng hóa X. X = (A - B) x 28/a Trong đó: - A: Lượng HCl 0,5N dùng chuẩn độ bình kiểm tra (ml); - B: Lượng HCl 0,5N dùng chuẩn độ bình thí nghiệm (ml); - a: Khối lượng dầu lạc (gam). c. Xác định chỉ số iốt  Nguyên tắc: Chỉ số iốt là số gam iốt liên kết được với 100 gam mỡ, chỉ số iốt biểu thị mức độ no của axít béo trong mỡ.  Hóa chất - dụng cụ: etanol 96%, dung dịch iốt 0,1N, dung dịch tinh bột 0,1%, dung dịch Na2S2O3 0,1N; dầu lạc hoặc dầu vừng, ống nghiệm, nồi đun cách thủy, pipet, bình nón.  Tiến hành: - Lấy 2 bình nón dung tích 50 ml, cho vào bình 1: 0,2 gam dầu lạc, cho vào bình 2: 0,2 ml nước cất; - Thêm vào mỗi bình 5 ml etanol hoặc cloroform; - Thêm chính xác 5 ml dung dịch iốt 0,1N; - Đậy kín nắp bình, để trong tối khoảng 15 phút; - Lấy sản phẩm ra, để nguội; - Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N cho đến khi có màu vàng nhạt; - Thêm vào vài giọt (1 ml) tinh bột 1%, chuẩn độ tiếp đến khi mất màu xanh; - Chỉ số iốt tính theo công thức: C = (A - B) x f x 0,01296 x 100/a Trong đó: - A: Số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ bình kiểm tra (ml); - B: Số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ bình thí nghiệm (ml); 66

- f: Hệ số hiệu chỉnh dung dịch Na2S2O3 0,1N; - 0,001269: Số gam iốt tương ứng 1ml Na2S2O3 0,1N (gam); - a: Lượng dầu đã lấy để xác định (gam).

Giải thích kết quả, viết phương trình phản ứng.

7.4. Kết quả thực hành - Sinh viên ghi chép lại hiện tượng và giá trị xác định được trong quá trình của các thí nghiệm.

- Sinh viên xác định đúng các chỉ số của dầu lạc.

7.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm 7.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên - Sinh viên trả lời được các câu hỏi về tính chất vật lý và hóa học của lipit.

- Trả lời câu hỏi về nguyên tắc xác định các chỉ số của lipit.

7.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành Sinh viên trình bày hiện tượng quan sát được, đo giá trị hoặc xác định kết quả thí nghiệm và giải thích kết quả thu được.

Bảng 7.1. Hiện tƣợng/kết quả và giải thích TT

Tên thí nghiệm

1

Tính tan của lipit

2

Sự tạo thành nhũ tương

3

Phản ứng xà phòng hóa

4

Xác định chỉ số axít

5

Xác định chỉ số xà phòng hóa

6

Xác định chỉ số iốt

Hiện tƣợngKết quả

67

Giải thích

Hình ảnh

Ghi chú

Bài 8 VITAMIN 8.1. Mục đích Bài thực hành giúp sinh viên hiểu và nắm được ý nghĩa, vai trò, tính chất của các vitamin.

8.2. Yêu cầu Sau khi thực hiện xong bài thực hành, sinh viên phải: - Nắm vững kiến thức về vitamin, các tính chất của vitamin; - Nắm vững các nguyên tắc của các phản ứng định tính vitamin; - Tiến hành được các thí nghiệm định tính vitamin...

8.3. Nội dung 8.3.1. Tóm tắt lý thuyết Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có các tính chất lý, hóa học rất khác nhau.

Tác dụng của chúng trên các cơ thể sinh vật cũng rất khác nhau nhưng đều rất cần thiết cho sự sống của sinh vật, nhất là đối với người và động vật. Khi thiếu một loại vitamin nào đó sẽ dẫn đến những rối loạn về hoạt động sinh lý bình thường của cơ thể.

Vitamin được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và vi sinh vật. Ở người và động vật cũng có thể tổng hợp được một số vitamin nhưng rất ít nên không thỏa mãn nhu cầu của cơ thể mà phải tiếp nhận thêm ở ngoài vào bằng con đường thức ăn.

Có nhiều loại vitamin khác nhau. Tên vitamin được gọi theo nhiều cách như gọi theo chữ cái, gọi theo danh pháp hóa học, gọi theo chức năng. Ví dụ vitamin B còn có tên hóa học là Thiamin, đồng thời theo chức năng của nó còn có tên antinevrit.

1

Có nhiều kiểu phân loại vitamin, nhưng kiểu phân loại được sử dụng phổ biến nhất là dựa vào khả năng hòa tan của vitamin vào các dung môi. Người ta chia vitamin ra 2 nhóm: vitamin tan trong nước và vitamin tan trong mỡ.

Vitamin tan trong nước chủ yếu tham gia vào các quá trình liên quan tới sự giải phóng năng lượng như quá trình oxi hóa khử, quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ...

68

Vitamin tan trong mỡ tham gia vào các phản ứng tạo nên các chất có chức năng cấu trúc các mô, các cơ quan.

8.3.2. Nội dung thực hành 8.3.2.1. Vitamin A  Nguyên tắc: Trong môi trường axít, vitamin A phản ứng với FeSO4 tạo thành hợp chất màu xanh, để thời gian sau chuyển dần sang màu hồng đỏ. Chất tiền vitamin A cũng cho phản ứng này nhưng sản phẩm có màu xanh lục.  Hóa chất - dụng cụ: dầu cá (chứa vitamin A và D); axít axetic đặc bão hòa bằng FeSO4; H2SO4 đặc, ống nghiệm, pipet, tủ hút.  Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm vài giọt dầu cá, thêm vài giọt axít axetic đặc có chứa FeSO4 bão hòa và 1 - 2 giọt H2SO4 đặc; - Tiến hành thí nghiệm đối chứng để so sánh tương tự, thay dầu cá bằng nước cất; - Quan sát sự tạo thành và thay đổi màu; - Vitamin A còn tác dụng với H2SO4 tạo thành sản phẩm màu xanh tím không bền, sau thời gian ngắn sẽ chuyển thành màu hồng đỏ.

8.3.2.2. Vitamin E a. Phản ứng với axít HNO3  Nguyên tắc: Vitamin E phản ứng với HNO3 đặc tạo o-tôcopheril-qionon màu đỏ hoặc vàng đỏ.  Hóa chất - dụng cụ: vitamin E 0,15% trong etanol tuyệt đối, HNO3 đặc, ống nghiệm, pipet, tủ hút...  Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm 2 giọt dung dịch vitamin E; - Thêm từ từ 8 - 10 giọt HNO3 đặc, lắc đều nhẹ ống nghiệm; - Để yên 2 phút và quan sát sự đổi màu.

69

b. Vitamin E khử sắt  Nguyên tăc: Vitamin E có khả năng khử FeCl3 thành FeCl2, sau đó ion Fe2+ phản ứng với ophenantrolin tạo thành ion Fe(C12H8N2)32+ dung dịch sẽ chuyển màu đỏ.  Hóa chất - dụng cụ: vitamin E 0,15% trong etanol tuyệt đối, FeCl3 0,2% trong etanol, o-phenantrolin 0,5%, ống nghiệm, pipet, tủ hút...  Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch vitamin E; - Thêm 1 ml o-phenantrolin và 1 - 2 giọt FeCl3, lắc đều nhẹ ống nghiệm; - Để yên 2 phút và quan sát sự tạo màu.

8.3.2.3. Vitamin C  Nguyên tắc: Vitamin C có thể khử dung dịch iốt, dựa vào lượng iốt bị khử bởi vitamin có trong mẫu, suy ra hàm lượng vitamin C.  Hóa chất - dụng cụ: lá cây thì là; HCl 5%; dung dịch I2 0,01N, dung dịch tinh bột 1%, cối chày sứ, bình định mức, bình nón, burêt...  Tiến hành: - Cân 5 gam thì là tươi, nghiền nhỏ trong cối sứ với 5 ml HCl 5% cho đến khi thành dạng đồng thể; - Dùng nước cất chuyển toàn bộ dịch trên vào ống đong hoặc bình định mức, dẫn nước cất đến vạch 50 ml, khuấy đều, lọc; - Cho 20 ml dung dịch lọc vào bình nón; - Chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bột làm chỉ thị màu; - Chuẩn độ đến khi bắt đầu xuất hiện màu xanh thì dừng lại; - Hàm lượng vitamin C trong mẫu tính theo công thức: X(%) = (V x V1 x 0,00088 x 100) / V2 x a Trong đó: - V: Số ml dung dịch iốt 0,01N dùng chuẩn độ (ml); - V1: Thể tích tổng số dung dịch mẫu (50 ml); 70

- V2: Thể tích mẫu lấy để xác định (20 ml); - a: Số gam nguyên liệu dùng chiết vitamin C (5 gam); - 0,00088: Số gam vitamin C tương ứng với 1 ml dung dịch iốt 0,01N. 8.4. Kết quả thực hành Sinh viên ghi chép lại hiện tượng và giá trị xác định được trong quá trình của các thí nghiệm.

Xác định đượng lượng vitamin C có trong mẫu.

8.5. Đánh giá kết quả, chấm điểm 8.5.1. Đánh giá trực tiếp sinh viên Sinh viên trả lời được các câu hỏi về tính chất vai trò của các vitamin.

8.5.2. Đánh giá báo cáo thực hành Sinh viên trình bày hiện tượng quan sát được, đo giá trị hoặc xác định kết quả thí nghiệm và giải thích kết quả thu được.

Bảng 8.1. Hiện tƣợng, kết quả và giải thích TT

Tên thí nghiệm

1

Vitamin A

2

Vitamin E

3

Vitamin C

Hiện tƣợng -

Giải thích

Kết quả

71

Hình ảnh

Ghi chú

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Trần Thị Ân (chủ biên) (1979). Hóa sinh đại cương (tập I, II). NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2000). Hóa sinh học. NXB Giáo dục, Hà Nội.

3. Nguyễn Bá Lộc (1997). Hóa sinh. NXB Giáo dục, Hà Nội.

Tài liệu dịch 1. Musil J. G., Kurz K., Novakava O. (1982). Sinh hóa học hiện đại theo sơ đồ. NXB Y học, Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh 1. Lehninger A. L. (2004). Principle of Biochemistry. 4th Edition. W. H. Freeman.

2. Prof. Edward Bańkowski MD, DSc (2013). Biochemistry Workbook.

72

PHỤ LỤC 1. Pha hỗn hợp focmol Chuẩn bị hỗn hợp focmol: Trộn 10 ml focmol với 2 ml dung dịch phenolphtalein 0,5% pha trong etanol, dùng NaOH 0,1N để trung hòa đến khi có màu hồng nhạt (chỉ chuẩn bị trước khi dùng).

2. Dung dịch thuốc thử folin - ciocalteru Cân chính xác 100 gam natritungstat (NaWO4.2H2O); 25 gam natrimolipdat (Na2MoO4) rồi hòa tan hết trong 100 ml nước cất. Lắc đều sau đó bổ sung thêm 100 ml HCl (d = 1,17) và 50 ml H3PO4 (85%). Trộn đều dung dịch và đun sôi trong 10 giờ với ống sinh hàn hồi lưu. Để nguội và bổ sung thêm 100 gam lithisunfat (Li2SO4.H2O), 50 ml nước cất và vài giọt brom. Đun sôi lại trong 15 phút có lắp ống sinh hàn hồi lưu để loại hết brom thừa. Để nguội dung dịch và thêm nước cất đến 1.000 ml sau đó bảo quản trong chai thủy tinh tối màu.

3. Thuốc thử biurê Cân 1,50 gam đồng sunfat trong (CuSO4.5H2O) và 6,0 gam kali tartrat natri (KNaC4H4O6.4H2O), với 500 ml nước, hòa tan trong 300 ml dung dịch khuấy 10% dung dịch NaOH, pha loãng với nước đến 1 lít, được lưu trữ trong một chai nhựa (tráng bên trong với parafin hoặc chai). Thuốc thử này có thể bảo quản lâu dài. Nếu chai lưu trữ có kết tủa màu đen xuất hiện, cần phải được hoàn nguyên.

4. Thuốc thử liugon Cân chính xác 0,5 gam KI và 1 gam I 2 rồi hòa tan trong 5 ml nước cất. Lắc cho tan hết. Thêm nước cất cho đến đủ 100 ml và bảo quản trong chai thủy tinh tối màu.

5. Thuốc thử fehling - Thuốc thử fehling A: Cân 40 gam CuSO4 và hòa tan trong 1.000 ml nước cất. Lắc kỹ cho tan hết, nếu không tan hết thì có thể thêm 1 ml H2SO4 và lắc kỹ đến tan hoàn toàn.

- Thuốc thử fehling B: Cân 200 gam kali natritartarat trong 400 - 500 ml nước cất. Hòa tan 150 gam NaOH trong 200 - 300 ml nước cất. Sau đó trộn hai dung dịch với nhau và thêm nước cất đến đủ 1.000 ml. Ngay trước khi dùng lấy dung dịch fehling A trộn với dung dịch fehling B (tỉ lệ 1:1 (v/v)).

73

6. Hỗn hợp thuốc thử DNS (Dinitro Salisilic) Thuốc thử acid ditrosalisylic (DNS): Cân 1 g DNS pha trong 20 ml NaOH 2N, thêm vào 50 ml nước cất và 30 g muối sodium potasium tartrate, đun cách thủy cho tan rồi định mức tới 100 ml. Dung dịch glucose mẫu (500 ppm): Cân 0,5 g D-glucose pha trong nước cất thành 1 lít. Dung dịch glucose mẫu (50 ppm): Hút 10 ml dung dịch chuẩn glucose 500 ppm cho vào bình định mức, thêm nước cất, định mức đúng 100 ml, lắc đều.

7. Thuốc thử đồng acetat Chuẩn bị thuốc thử đồng axetat: Hòa tan 13,3 gam đồng axetat trong 200 ml nước cất nóng, lọc, thêm vào dung dịch lọc 1,9 ml axít axetic băng.

74