Hình 2.16. Hạt nghiền và máy nghiền hạt

được tạo áp lực lên đến 20.000 psi (137,9 MPa). Vật liệu thoát khỏi áp lực DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL thông qua các van kim. Sự thay đổi áp lực gây ra sự gián đoạn của các tế bào. Loại này là một tiền thân của FRANCE ® Modern Laboratory Press (từ một phương pháp được phát triển bởi Tiến sĩ Pháp). Thiết bị này được nạp một lượng mẫu nhỏ nhưng có thể đạt được áp lực cao. Tuy nhiên, không có công nghệ đặc biệt liên quan đến việc thiết kế van kim. Một vấn đề khác liên quan đến kỹ thuật này là nhiệt độ tăng cao trong mẫu sau khi đi qua van. Duerre và Ribi5 đã giải nhiệt qua van và loại bỏ nhiệt từ sản phẩm nhưng vẫn còn phát hiện sự biến tính protein, khi hoạt động trong khoảng 25.000 đến 55.000 psi (172,4379,3 MPa). Wimpenny 6 thấy rằng thành tế bào cầu khuẩn Gram âm và vi trùng lao là dễ phá vỡ nhất, và cầu khuẩn Gram dương và tảo Chlorella là phá vỡ khó khăn nhất. 2.2.2.3. Sử dụng máy nghiền hạt Hình 2.16. Hạt nghiền và máy nghiền hạt Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme. Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi thủy tinh có kích thước 0,2 – 1 mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy tinh có độ ma sát cao hơn nên hiệu suất nghiền cao hơn. Phương pháp nghiền hạt sử dụng các máy tốc độ cao, huyền phù được bơm qua một buồng chứa các hạt và khuấy đĩa 3. Các đĩa chạy ở tốc độ 1.500-2.000 rpm, và gây ra sự phá vỡ tế bào bằng cách nghiền giữa các

157

hạt, va chạm giữa các hạt và sinh vật, nhờ lực cắt do gradient vận tốc gây DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ra bởi các hạt chuyển động. Hạt được nạp vào buồng chiếm 80 đến 85% của khối lượng tự do của khoang nghiền. Hạt thủy tinh có đường kính lớn hơn 0,5mm là tốt nhất cho nấm men, và hạt đường kính dưới 0,5 mm là tốt nhất để sử dụng cho phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, một số vấn đề cần chú ý khi sử dụng phương pháp này: - Nhiệt độ gia tăng cao - Sản phẩm dễ bị ô nhiễm bởi vật liệu hạt - Khó phá vỡ các tế bào như nấm men, bào tử, và vi tảo,… - Sử dụng được cho vi khuẩn, và mô thực vật và động vật. 2.2.3. Sử dụng nén đông kết Phương pháp nén đông kết thường được sử dụng để phá vỡ tế bào vi khuẩn và tế bào động vật có vú. Kỹ thuật này sử dùng phương pháp đóng băng tế bào trong một băng khô/ngâm trong ethanol hoặc trong tủ đá, sau đó để rã đông ở nhiệt độ phòng hoặc 370C. Phương pháp này khiến các tế bào trương lên và cuối cùng bị phá vỡ nhờ các tinh thể băng được hình thành trong quá trình đóng băng và sau đó co lại trong thời gian tan băng. Lặp lại nhiều chu kỳ để tăng hiệu quả và quá trình này có thể khá dài. Tuy nhiên, nén đông kết đã được chứng minh có hiệu quả trong thu hồi protein tái tổ hợp nằm trong tế bào chất của vi khuẩn và được đề xuất cho việc làm tan vón tế bào động vật có vú. 2.2.4. Sử dụng phương pháp lytic hoặc phương pháp phi cơ học Các phương pháp phi cơ học bao gồm phương pháp hóa học và phương pháp enzyme (còn gọi là phương pháp hóa học và phương pháp sinh học). 2.2.4.1. Phương pháp hóa học Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp này không đòi hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện.

158

Tuy nhiên, vì trong quá trình thực hiện, người ta sử dụng các hóa chất nên DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp. Một trong những chất sử dụng nhiều là acetone. Các phương pháp hóa học để phân giải tế bào: l Xử lý kiềm Xử lý bằng kiềm được sử dụng thành công trong tách chiết ở quy mô nhỏ và lớn protein từ vi khuẩn. Ví dụ, enzyme trị liệu, L-asparaginase, được giải phóng khỏi Erwinia chrysanthemi bằng cách ủ tế bào ở pH 11,0 – 12,5 trong 20 phút. Thành công của phương pháp này nhờ vào khả năng ổn định của sản phẩm mong muốn. Giá trị pH cao có thể làm bất hoạt protease. l Chất tẩy rửa Các chất tẩy, hoặc ion ví dụ như sodium lauryl sulphate hay còn gọi là sodium dodecyl sulfate, sodium cholate (anion) và cetyl trimethyl ammonium bromide (cation) hoặc không phải ion như Trixton X-100 hoặc X-450, hoặc Tween, được dùng để phân giải tế bào, thường có phối hợp với lysozyme. Các chất tẩy ion có hoạt tính mạnh hơn các chất tẩy không phải ion, và có thể dẫn đến sự biến tính của nhiều protein. Sự hiện diện của các chất tẩy cũng có thể ảnh hưởng đến các bước tinh sạch tiếp theo, đặc biệt kết tủa muối. 2.2.4.2. Phương pháp enzyme (phương pháp sinh học) Có hai phương pháp hiện được sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào. Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một enzyme có khả năng phân giải cho một số thành phần cấu thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có trong tế bào và là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài mà trùng với mức hoạt động của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân tế bào, làm chết tế bào. Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào các loại nấm men. Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm men ở nhiệt độ 48 – 520C, trong thời gian 6 – 24h. Phương pháp này

159

có nhiều nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng bị phá hủy. Phương pháp này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công nghiệp. Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụng enzyme từ ngoài tế bào. Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành quá trình thủy phân các chất nhất định trong tế bào. Người ta thường sử dụng hệ enzyme xellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào thực vật. Phương pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễ dàng trong mọi điều kiện (phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, sản xuất công nghiệp). Ngoài ra người ta còn sử dụng lysozyme trong các loại tế bào khác. Lysozyme là một enzyme được sản xuất thương mại từ lòng trắng trứng gà, thủy phân các liên kết β-1,4-glycosidic trong mucopeptide12 của thành tế bào vi khuẩn. Các vi khuẩn Gram dương phụ thuộc vào mucopeptide của thành tế bào để trở nên rắn chắc dễ bị tổn thương nhất, nhưng sự đứt gãy cuối cùng của thành tế bào phụ thuộc vào hiệu quả thẩm thấu của đệm dịch huyền phù một khi thành tế bào bị cắt gãy. Khi phân giải của vi khuẩn Gram âm, ít khi người ta sử dụng một mình lysozyme, mà thường bổ sung thêm EDTA để tạo chelate với các ion kim loại sẽ dễ dàng làm tan tế bào (lysis). Mặc dù quá trình thao tác đơn giản và nhẹ nhàng, nhưng kỹ thuật này không được sử dụng cho việc tách chiết ở quy mô lớn các enzyme của vi khuẩn, có lẽ do giá thành tương đối cao của lysoyme và khả năng đưa vào các tác nhân gây nhiễm bẩn. Chỉ có trường hợp người ta dùng lysozyme ở quy mô lớn là để giải phóng aryl acylamidase Pseudomonas fluorescens. 2.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH HỖN HỢP CHẤT 2.3.1. Phương pháp trích ly hai pha lỏng Phương pháp trích ly hai pha lỏng là quá trình rút chất hòa tan trong chất lỏng bằng một chất lỏng khác. Chất lỏng đó được gọi là dung môi trích ly. Dung môi trích ly phải thỏa mãn các điều kiện sau: - Dung môi có tính hòa tan chọn lọc (hòa tan chất cần tách mà không hòa tan hoặc ít hòa tan các chất khác).

160