ANÁLISIS DE 34 MICOTOXINAS MEDIANTE AGILENT 6460C LC-MS/MS
Hunor Farkaš, Jog Raj*, Svetlana Ćujić, Zdenka Jakovčević y Marko Vasiljević PATENT CO, DOO., Vlade Ćetkovića 1A, 24 211, Mišićevo, Serbia *jog.raj@patent-co.com
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Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por especies fúngicas en alimentos y piensos. La mayoría están producidas por
Aspergillus, Fusarium y Penicillium sp. Normalmente, la mayoría de la gente piensa en las seis principales micotoxinas que contaminan los piensos: Aflatoxinas (AF) Deoxinivalenol (DON) Toxina T-2 Fumonisinas (FB) Ocratoxina Zearalenona (ZEN) Los principales efectos de estas toxinas sobre el rendimiento y la salud de los animales de producción son conocidos, y existen directrices reglamentarias sobre los niveles umbral de estas toxinas en los alimentos y piensos. Sin embargo, aunque las pruebas y los informes sobre la prevalencia de micotoxinas en los piensos han aumentado en los últimos años, muchas
Una categoría cada vez
micotoxinas siguen sin detectarse.
más preocupante son las micotoxinas emergentes.
Al igual que el DON, la toxina T-2 y la zearalenona, las micotoxinas emergentes también son producidas habitualmente por diversos mohos Fusarium. Además, como los mohos producen múltiples micotoxinas bajo los mismos factores de estrés ambiental, es probable que las micotoxinas emergentes sean cocontaminantes frecuentes en los piensos junto con las micotoxinas principales.
Este artículo describe un método de preparación y análisis de
Por tanto, es muy deseable disponer de un
muestras de múltiples micotoxinas
método de análisis de micotoxinas totales,
en el LC-MS/MS Agilent 6460c.
incluidas las micotoxinas emergentes.
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PROCEDIMIENTOS 1. Preparación de muestras La muestra de laboratorio debe molerse finamente y mezclarse a fondo utilizando un molino y un mezclador antes de extraer una porción de prueba para su análisis. Transfiera 5 g de muestra homogeneizada y finamente molida con una precisión de 0,1 g a un tubo cónico de 50 ml y proceda al paso de extracción.
5 g muestra
2. Procedimiento de adición de estándar a la muestra Si es necesario determinar la recuperación, realice lo siguiente por duplicado:
5 g muestra Transferiera 5 g de muestra homogeneizada y finamente molida a un tubo cónico de 50 ml. Transfiera 5 g de muestra homogeneizada y finamente molida a un tubo cónico de 50 ml y añada 200 µl de la solución de enriquecimiento multimicotoxina.
5 g muestra + 200 µl solución multimicotoxina
Proceda al paso de extracción.
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3. Extracción Añada 20 ml de mezcla de extracción y cierre el tubo. Agite la mezcla en un agitador orbital a 250 rpm durante 90 minutos a temperatura ambiente. Tras la extracción, centrifugue a 4200 x g durante 5min. Transfiera 450 μl de sobrenadante a un vial
20 ml solución de extracción
de vidrio y añada 750 μl de agua ultrapura
250 rpm 90 min
al sobrenadante.
450 µl sobrenadante
750 µl agua ultrapura
Agite en el vórtex y analice la muestra mediante LC-MS/MS. Agite bien en el vórtex. Filtre una alícuota de 1200 µL del extracto de muestra preparado a través de un filtro de jeringa de membrana en un vial de vidrio.
120 µl extracción de la muestra
Matrices: maíz, piensos compuestos, trigo, cebada, harina de soja, salvado de trigo, harina de girasol, ración mixta total (TMR).
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RESULTADOS La Tabla 1 muestra las micotoxinas analizadas junto con sus correspondientes Límites de Cuantificación (LOQ).
Familia de micotoxinas
Aflatoxinas
Zearalenona + Metabolito
A-Tricotecenos
B-Tricotecenos
Fumonisinas + Metabolito
Ocratoxina
Micotoxinas emergentes
Toxinas de Penicillium Alcaloides ergóticos Toxina de Alternaria
Micotoxina
Abreviatura
LOQ (μg/kg)
Aflatoxina B1
AFB1
< 0,4
Aflatoxina B2
AFB2
< 0,4
Aflatoxina G1
AFG1
< 0,4
Aflatoxina G2
AFG2
< 0,4
α – Zearalenol
α -ZEL
< 10
β – Zearalenol
β -ZEL
< 10
Zearalanona
ZAN
< 10
Zearalenona
ZEN
<5
Diacetoxiscirpenol
DAS
<3
Toxina HT-2
HT-2
< 9,6 < 9,6
Toxina T-2
T-2
Neosolaniol
NEO
< 10
3-Acetil Deoxinivalenol
3-ADON
< 20
15- Acetil Deoxinivalenol
15-ADON
< 20
Deoxinivalenol
DON
< 20
Nivalenol
NIV
< 20
Deoxinivalenol -3-Glucosido
D3G
< 30
Fumonisina B1
FB1
< 25
Fumonisina B2
FB2
< 25
Fumonisina B3
FB3
< 25
Ácido Fusárico
FA
<3
Moniliformina
MON
<3
Fusarenon X
FX
< 40
Ocratoxina A
OTA
< 1,6
Beauvericina
BEA
<1
Enniatina A
ENN A
<1
Enniatina A1
ENN A1
<1
Enniatina B
ENNI B
<1
Enniatina B1
ENN B1
<1
Citrinina
CIT
< 50
Patulina
PAT
< 100
Ergosina
ES
<1
Ergocriptinina
ECR
<1
Alternariol
AOH
< 20
Tabla 1. Micotoxinas analizadas y sus LOQ.
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La Tabla 2 muestra la recuperación (%) de micotoxinas analizadas en maíz, trigo y cebada.
RECUPERACIÓN (%) Analito MAÍZ
TRIGO
CEBADA 90
1.
Moniliformina
82
91
2.
Nivalenol
85
89
88
3.
Deoxinivalenol
103
108
105
4.
Ácido Fusárico
102
96
109
5.
3-Acetil Deoxinivalenol
80
88
90
6.
15- Acetil Deoxinivalenol
83
92
91 99
7.
Aflatoxina G2
99
99
8.
Aflatoxina G1
98
98
92
9.
Aflatoxina B2
93
96
96
10.
Aflatoxina B1
96
93
104
11.
Diacetoxiscirpenol
96
101
103
12.
Toxina HT-2
92
93
99
13.
Fumonisina B1
103
96
94
14.
β – Zearalenol
101
96
89
15.
α – Zearalenol
87
104
99
16.
Toxina T-2
98
103
90
17.
Zearalanona
103
103
95
18.
Ocratoxina A
94
97
98
19.
Zearalenona
102
101
91
20.
Fumonisina B2
82
91
101
21.
Fumonisina B3
86
99
93
22.
Enniatina B
86
98
96
23.
Beauvericina
85
89
88
24.
Enniatina B1
81
89
82
25.
Enniatina A1
84
95
96 94
26.
Enniatina A
81
98
27.
Citrinina
84
88
81
28.
Patulina
72
75
71
29.
Fusarenon X
89
85
82
30.
Neosolaniol
94
90
85
31.
Ergosina
103
99
98
32.
Ergocriptinina
96
92
94
33.
Alternariol
79
84
81
34.
Deoxinivalenol -3-Glucosido
83
82
80
Tabla 2. Porcentaje de micotoxinas recuperadas en muestras de maíz, trigo y cebada.
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CONCLUSIONES El análisis de 34 micotoxinas utilizando la columna CORTECS C18 en el LC-MS/MS Agilent 6460c presentó una recuperación del 71-109% para varias micotoxinas. Esto demuestra que se trata de un método robusto para el análisis de 34 micotoxinas.
La detección de micotoxinas en muestras de alimentos y piensos es una cuestión de gran importancia debido a su toxicidad inherente. Estos contaminantes inevitables no pueden eliminarse y, por tanto, la aplicación de programas de control eficaces y de normativas legales estrictas puede contribuir significativamente a la reducción y arrastre de estas micotoxinas en la cadena alimentaria.
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