Transformación de Aflatoxina B1 y Zearalenona mediante una lacasa avanzada de alto potencial redox

Transformación de AFLATOXINA B1 Y ZEARALENONA mediante una lacasa avanzada de ALTO POTENCIAL REDOX

Jog Raj*1, Hunor Farkaš1, Miguel Alcalde2, Bernardo J. Gomez-Fernandez2, Jasna Bošnjak-Neumüller1 y Marko Vasiljević1 PATENT CO, DOO., Mišićevo, Serbia CSIC- Departamento de Biocatálisis - Instituto de Catálisis y Petroquímica, CSIC, Madrid, España *Autor correspondiente y presentador: jog.raj@patent-co.com 1

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The World Mycotoxins Forum (WMF) meets IUPAC, Belfast, Oct 14-16, 2019

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OBJETIVOS Las micotoxinas son el mayor desafío para los productores de alimentos para animales, siendo necesario el monitoreo y la remediación regular.

Las micotoxinas pueden ser remediadas mediante varios

MATERIALES & MÉTODOS

1. INCUBACIÓN

métodos, pero las enzimas y los

El Desoxinivalenol (DON), la Aflatoxina B1

microorganismos para desactivar

(AFB1) la Zearalenona (ZEN), la toxina

las micotoxinas se están

T-2, la Ocratoxina A (OTA) y la Fumonisina B1 (FB1) (2 ppm) se incubaron

popularizando actualmente.

con 500 µl de la enzima DooKu (Lacasa) a 37°C; con siringaldehído (10mM) como Entre las enzimas que intervienen en

mediador redox durante 1 hora.

la degradación de las micotoxinas, las lacasas fúngicas de alto potencial son biocatalizadores prometedores debido a sus bajos requerimientos y a su amplia gama de sustratos.

2. CUANTIFICACIÓN Tras la incubación, las muestras se centrifugaron y analizaron mediante un método de multi-micotoxinas por LC-MS/ MS para la cuanti icación de todas las micotoxinas (A latoxina B1, Ocratoxina A,

Recientemente hemos diseñado una

Zearalenona, Deoxinivalenol, FB1 y toxina

lacasa de alto potencial redox mediante

T-2).

ADN recombinante para mejorar su termoestabilidad y rango de afinidad por los sustratos.

En el presente estudio, hemos evaluado la transformación de micotoxinas usando la lacasa avanzada, la variante DooKu.

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RESULTADOS

Se examinaron diferentes variantes de Lacasas, estando la Lacasa 240 entre las mejores enzimas para la transformación de AFB1 y ZEN como se muestra en la Tabla 1.

El siringaldehído demostró ser mejor cofactor en comparación con TEMPO.

Tabla 1. Análisis de diferentes variantes de lacasas utilizando diferentes cofactores a un pH de 6,5.

Nombre de la variante de la enzima

240 (MA) Chu-B (MA) OB-1 (MA) KyLo (MA) 9C1 (MA) Vader (MA)

Cofactor

Transformación (%)

DON

AFB1

FB1

T-2

ZEN

OTA

TEMPO, 10mM

14,1

7 ,4

1,7

16,2

100,3

11,5

Siringaldehído, 10mM

7,9

73,7

0,2

2,0

100,5

3,5

TEMPO, 10mM

10,1

5,1

3,3

2,1

92,4

4,4

Siringaldehído, 10mM

6,3

9,8

4,1

0,9

24,6

2,5

TEMPO, 10mM

6,4

1,3

2,3

4,2

100,0

1,8

Siringaldehído, 10mM

4,0

15,2

1,1

3,3

65,4

8,0

TEMPO, 10mM

1,3

0,8

6,8

1,6

5,1

0,5

Siringaldehído, 10mM

8,8

12,9

2,9

3,0

17,3

1,2

TEMPO, 10mM

3,3

5,8

2,1

4,3

74,5

5,4

Siringaldehído, 10mM

4,6

14,5

11,3

8,0

20,4

8,6

TEMPO, 10mM

1,0

8,4

4,1

5,2

58,0

6,3

Siringaldehído, 10mM

6,8

3,7

6,6

3,6

3,1

0,1

Tabla 2. Efecto de diferente pH en la actividad de la Lacasa 240.

Transformación (%)

A240G (PM1 laccase variant)

pH

DON

AFB1

FB1

T-2

ZEN

OTA

3

-0,3

7,2

-5,3

2,0

44,2

-0,3

4

9,0

6,9

-5,8

2,8

88,7

2,5

5

6,7

7,4

-7,6

2,2

99,0

3,7

6,5

13,2

73,2

-3,8

-1,2

70,4

1,2

3

El efecto del pH fue estudiado realizando ensayos a pH 3.0, 4.0, 5.0 y 6.5.

La Lacasa 240 logró un 73% de transformación para AFB1 a pH 6.5 y un 99% de transformación de ZEN a pH 5.0 como se muestra en la Tabla 2.

Figura 1. Transformación de AFB1 y ZEN utilizando Lacasa 240 a lo largo del tiempo.

120 % Transformación

100 80 60

% Transformación de AFB1 a pH 6,5

40

% Transformación de ZEN a pH 5,0

20 0 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Tiempo en minutos

También se estudió el efecto del tiempo de incubación, como se muestra en la Figura 1.

La ZEN se transformó en 2 horas, mientras que la AFB1 se transformó en 3 horas.

Se están llevando a cabo ensayos relacionados con los metabolitos derivados de AFB1 y ZEN y los resultados se actualizarán pronto.

Esta enzima lacasa puede ser usada como solución de remediación de micotoxinas en los alimentos para animales.

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