Manual de diagnóstico laboratorial porcino by Grupo Asís, S.L.

Manual de diagnóstico laboratorial porcino Joaquim Segalés (coordinador) Jorge Martínez (coordinador) Joaquim Castellà Laila Darwich Mariano Domingo Enric Mateu Marga Martín Marina Sibila

Manual de diagnóstico laboratorial porcino

En los últimos 20 años, la producción porcina se ha especializado considerablemente, con la creación de grandes explotaciones de producción intensiva. A este escenario se añaden unos ganaderos con un gran nivel de profesionalismo y formación, que demandan un servicio de calidad por parte de sus veterinarios y consultores. En paralelo, durante el mismo periodo, los problemas patológicos han evolucionado hacia enfermedades complejas, en los que patógenos conocidos se mezclan con otros nuevos e interactúan con el manejo, el ambiente y el sistema de producción. Además, los ganaderos y veterinarios no sólo se comprometen a producir alimentos sanos y nutritivos, sino también a hacerlo respetando el bienestar animal. Por lo tanto, es importante destacar que, una producción segura de productos porcinos que contribuya a la salud pública, se puede alcanzar principalmente en un escenario en el que las enfermedades porcinas estén ausentes o en el que su presencia sea mínima. Es cierto, sin embargo, que los sistemas de producción intensiva implican grandes densidades de animales en espacios limitados y la probabilidad de que contraigan enfermedades infecciosas es una amenaza permanente. Así mismo, enfermedades o procesos patológicos no infecciosos, tales como déficits nutricionales o intoxicaciones, también pueden afectar a una población de cerdos, así como problemas de manejo (suministro de agua, sistemas automáticos de alimentación, etc.). Ante un caso de una enfermedad compleja, tanto el ganadero como el veterinario deben estar preparados para enfrentarse a una etiología multifactorial, y alcanzar un diagnóstico correcto y temprano para asegurar un control adecuado de la patología. El proceso diagnóstico consiste en un plan relativamente complejo, que incluye varias etapas y termina con unas estrategias a medida de control y prevención para cada explotación.

La investigación clínica es el fundamento de este proceso. Un diagnóstico presuntivo se establece mediante la recogida de datos clínicos y epidemiológicos. La investigación clínica tiene dos fases. La primera es la etapa inductiva (descriptiva), y consiste en contestar a las preguntas “¿Quién tiene qué, dónde, cuándo, desde cuándo, cuántos y cómo?”. La segunda es la etapa deductiva, en la que se tienen que establecer hipótesis sobre las causas del problema. Sea cual sea la estrategia de control o prevención implementada, ésta debería ser la consecuencia lógica y natural de las investigaciones clínicas. En este contexto, es importante resaltar que “para cada error que se comete por no saber, se cometen diez errores por no observar” (Steve Henry, en la reunión anual de la Asociación Americana de Veterinarios de Porcino, 2003). Por lo tanto, la investigación clínica es clave, ya que la totalidad del esfuerzo diagnóstico posterior depende de su calidad. Las investigaciones clínicas quizá no sean suficientes para obtener un cuadro completo de lo que está ocurriendo en una explotación. Además, es posible que se necesite algo más para poder establecer las estrategias más eficientes y económicamente factibles para minimizar o eliminar el problema. En estos casos, se recomiendan más investigaciones diagnósticas y los análisis de laboratorio pueden confirmar o descartar el papel de ciertos agentes infecciosos o toxinas específicos. De hecho, los análisis de laboratorio se usan principalmente para: • Detectar patógenos o toxinas potencialmente implicados en la enfermedad o en una producción por debajo del nivel óptimo. • Evaluar la infección/estatus de exposición de los individuos o poblaciones de cerdos. • Estimar el porcentaje de granjas porcinas o cerdos con anticuerpos frente a un patógeno. • Monitorizar la respuesta serológica de una población a la vacunación.

Introducción

•

Monitorizar el progreso y el éxito de los programas de control o de erradicación de enfermedades.

El camino para llegar a un resultado de laboratorio potencialmente útil con fines diagnósticos y de control/prevención no está exento de dificultades. En primer lugar, el veterinario debe elegir los animales y las muestras que se enviarán para los análisis de laboratorio de forma adecuada. Algunas muestras clínicas como las de sangre, suero o saliva, los hisopos nasales o los lavados bronco-alveolares se pueden tomar de animales vivos, mientras que otros se tienen que tomar durante la necropsia de los cerdos que son representativos del problema patológico. Algunas consideraciones clínicas importantes tales como la duración estimada de la enfermedad, el historial de tratamiento, la disponibilidad de animales que padecen el problema y el mejor momento para los análisis serán cruciales para asegurar los resultados más fiables del laboratorio. El capítulo 2 de esta guía revisa los aspectos más importantes asociados con la toma de muestras. En segundo lugar, una toma de muestras eficaz y su posterior envío al laboratorio también son etapas obligatorias para aumentar la probabilidad de un diagnóstico correcto. Es un excelente ejemplo de cómo el veterinario contribuye a la fiabilidad de los test de laboratorio, proporcionando la muestra correcta en las

mejores condiciones. El envío de muestras se tratará en el capítulo 3. En tercer lugar, el veterinario debe conocer los test de laboratorio existentes y sus interpretaciones correspondientes. No todos los laboratorios de diagnóstico pueden realizar todo tipo de test, por lo que es muy importante tomar decisiones acertadas en lo que respecta a la forma de abordar el programa de análisis. El veterinario debe decidir qué agentes/toxinas se deben analizar (confirmar/descartar) -por medio de su diagnóstico presuntivo- así como con qué laboratorio trabajar, teniendo en cuenta la disponibilidad de test para cada agente en el laboratorio elegido, su coste y el tiempo necesario para obtener los resultados. En todo caso, los veterinarios deberían consultar al laboratorio antes de la toma y del envío de muestras. El capítulo 4 de esta guía resume los conocimientos existentes sobre los test básicos de laboratorio, su utilidad y su interpretación general. Finalmente, los capítulos 5 a 10 ofrecen una visión general y práctica del diagnóstico diferencial de las enfermedades en porcino. Este libro no pretende sustituir los libros de texto generales sobre las enfermedades porcinas o los análisis de laboratorio. El objetivo final de la presente guía es resumir e integrar de forma completa las distintas etapas necesarias para alcanzar un diagnóstico final de las enfermedades porcinas que requieren una intervención por parte del laboratorio.

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ToMa de MuesTras duranTe la necropsia Existen varios protocolos disponibles para lle var a cabo una necropsia en cerdos. El vete rinario puede elegir cualquiera de estos pro tocolos, pero se recomienda seguir un único procedimiento para realizar necropsias de forma ordenada, sistemática y completa. Este capítulo revisa los métodos y tipos de muestras que se pueden utilizar durante la necropsia. Una necropsia realizada correctamente puede dar información de mucho valor sobre una enfermedad. La patología macroscópica sola puede proporcionar un diagnóstico en algunos casos, pero muchas veces se requie ren análisis adicionales para obtener un diag nóstico definitivo. La variedad de técnicas uti lizadas está aumentando, pero los métodos tradicionales siguen siendo la primera línea de investigación. La tabla 1 ofrece una lista de muestras potenciales que se pueden tomar en una necropsia.

selección de animales La mejor forma de asegurar un diagnóstico correcto es mediante unas muestras frescas y bien conservadas. Por lo tanto, se aconse ja realizar las necropsias en animales recién sacrificados y para ello se pueden seleccionar 34 cerdos en la población de animales afec tados. Cuando sea posible, se seleccionarán los animales en fase aguda de la enfermedad (las primeras 2448 horas), que representen un patrón de signos clínicos similar al de otros miembros del grupo. Con el fin de evitar cual quier interferencia con posteriores análisis de laboratorio, es conveniente evitar seleccionar animales que ya han sido tratados (al menos de forma parenteral). Existen varios protocolos aprobados para realizar una eutanasia ética en cerdos; se reco miendan los barbitúricos por vía intravenosa ya que permiten la preservación de los órganos.

Toma de muestras de sangre Las muestras de sangre se deben tomar in vivo (figs. 1 y 2) o justo después de la euta nasia, cuando el corazón todavía late. Si han transcurrido varias horas tras la muerte, se pueden tomar coágulos de sangre del corazón y utilizarlos para análisis microbiológicos, viro lógicos, PCR y serológicos. Se han descrito varias técnicas in vivo que utilizan varias localizaciones de punción: la vena cava anterior (en animales jóvenes, des de el nacimiento hasta los dos meses de vida aproximadamente), la vena yugular (cerdos de engorde y en fase de finalización), y las venas de la cola y de las orejas (adultos). Las mues tras de sangre para análisis hematológicos y bioquímicos se deben recoger en tubos con EDTA de sodio o heparina de litio. La sangre recogida en tubos con anticoagulante también es adecuada para la mayoría de los test seroló gicos y bioquímicos (fig. 3).

Histopatología Las muestras de tejido para histopatología, IHQ e HIS se deben fijar en formol tamponado al 10% y conservar a temperatura ambiente. La proporción volumen de formol:tejido debe ser al menos 1:10. Los recipientes que contengan las muestras se deben etiquetar claramente con la identificación del animal. Todas las muestras del mismo animal se pueden incluir en el mismo recipiente. Se deben utilizar tan tos frascos como cerdos necropsiados haya. Las muestras de tejido deben ser de 0,5 cm de grosor; si no, la falta de penetración del formol podría favorecer la autolisis (fig. 4). El cerebro y el globo ocular son una excepción, y se fijan intactos. En cuanto al intestino, se recomien da tomar varias porciones, y las muestras se deben abrir longitudinalmente antes de fijarlas en formol. Las muestras se deben tomar de los bordes de las lesiones o, como alternativa, incluir áreas afectadas y no afectadas del mismo órgano.

Toma de muestras

Figura 1. Toma de sangre in vivo de la vena cava craneal.

Figura 2. Toma de sangre in vivo

de la vena yugular.

Figura 3. Tubos para

toma de sangre para análisis hematológicos y bioquímicos con anticoagulante (EDTArosa, heparinaverde). Los tubos sin anticoagulante (rojo) se utilizan para obtener suero con el fin de realizar test serológicos y bioquímicos.

Figura 4. Toma de muestras de tejido para estudio histopatológico. Las muestras no deberían exceder 0,5 cm de grosor para facilitar su fijación; el intestino se debe abrir longitudinalmente.

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Técnicas de microbiología/ virología y moleculares Las muestras de sangre, orina, saliva, leche, líquido cefalorraquídeo o de tejidos se deben tomar de la forma más aséptica posible para su cultivo, análisis virológico o test de PCR (figs. 5 y 6). Para las muestras de tejido, se recomienda enviar una porción grande del órgano, ya que permite que el laboratorio tome muestras asépticas. Este es el caso de los pulmones, hígado, corazón, riñones o bazo. En otros casos, cuando se observa necrosis o exudados, se pueden tomar muestras de las lesiones con hisopos. En casos de meningitis,

se pueden recoger muestras de las meninges o del tercer ventrículo mediante hisopos (fig. 7); se recomienda también el envío del encéfalo entero. Para los intestinos delgado y grueso, se deben enviar al laboratorio porciones sin abrir y con los extremos anudados (fig. 8). Cada muestra se debe conservar indivi dualmente en bolsas/recipientes para evitar la contaminación (fig. 9). A la hora de con siderar las posibles causas de una enferme dad, es conveniente consultar a bacteriólogos o virólogos sobre las condiciones adecuadas para conservar o enviar las muestras: medios, temperaturas, etc. (capítulo 3).

Figura 5. Toma de muestra estéril de orina en tubos sin anticoagulante.

Figura 6. Toma de muestra estéril de líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna de la articulación atlanto occipital. El fluido es, en condiciones normales, transparente, y se debe evitar su contaminación con sangre.

Toma de muestras

Figura 7. En caso

de sospecha de meningitis, se pueden tomar muestras del tercer ventrículo con hisopos para estudios microbiológicos.

Figura 8. Se deben enviar porciones del intestino sin abrir y con los extremos anudados para un análisis microbiológico en caso de diarrea o presencia de lesiones entéricas.

Figura 9. Las

muestras para estudios microbiológicos se deben empaquetar e identificar de forma separada.

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Toxicología

parasitología

Dado que existe una amplia variedad de com puestos tóxicos, las muestras para análisis toxicológico deben incluir tejidos (hígado, riñones y encéfalo), sangre, suero, conteni do gástrico u orina de los animales muertos. En otros casos, se puede también analizar el pienso o el agua para encontrar toxinas. Los tejidos, suero, orina, contenidos estomacales, pienso o agua se pueden refrigerar o conge lar, a excepción de la sangre que no se debe congelar. Es importante recordar que no existe una sola prueba toxicológica que pueda detectar todos los agentes tóxicos conocidos. Por eso, la elección de las sustancias tóxicas que se buscarán en el análisis químico se basará en el historial y los hallazgos clínicos y ambienta les de cada caso, que con un poco de suerte proporcionarán al clínico una lista de posibles enfermedades a descartar.

Se pueden enviar las heces para análisis de flotación fecal en caso de sospecha de parásitos intestinales (fig. 10). Se deben tomar porciones de músculo de la lengua, diafragma y músculos intercostales y masetero en caso de sospecha de parasitosis muscular (triquinosis o cisterco sis). Los raspados cutáneos/de oreja se pueden utilizar para confirmar casos de sarna (fig. 11). En algunos casos, se han desarrollado técnicas moleculares y/o serológicas para enfermedades parasitarias específicas.

perfiles genéticos Se han desarrollado varios estudios moleculares de ácido nucleico para el examen genético de diferentes enfermedades porcinas (por ejemplo, el síndrome de estrés porcino). En general, la sangre es la muestra de elección, pero el clínico debería contactar previamente con el laboratorio para test genéticos específicos.

Figura 10.

Las muestras de heces se pueden tomar in vivo directamente del recto, con la mano utilizando un guante desechable, o del colón o el recto durante la necropsia.

Figura 11. Se debe realizar un raspado cutáneo profundo para identificar ácaros en las citologías.

Toma de muestras

Tabla 1. Tipos de muestras que se recomienda tomar durante la necropsia.

estas recomendaciones se pueden ampliar para un tejido o sistema en particular dependiendo de las lesiones encontradas. Histopatología

Microbiología/ virología/PCR

Respiratorio

Pulmón (x2, lóbulo medio y segmento apical), cornetes nasales

Tejido, hisopo

Digestivo

Hígado, estómago, intestino delgado (x3: duodeno, yeyuno e íleo), intestino grueso (x2, ciego y colon)

Tejido, hisopo, saliva

Linfohematopoyético

Nódulos linfáticos (x3: inguinal, mesentérico y mediastínico), tonsila, bazo, médula ósea

Tejido, hisopo tonsilar

Riñón, vejiga urinaria

Tejido, hisopo, orina

Orina

Tejido

Sistema/ Aparato

Urinario Cardiovascular

Toxicología

Otros

Hígado, contenido gástrico, heces

Heces (parasitología) Sangre/suero (hematología, bioquímica, perfiles genéticos)

Corazón

Nervioso

Encéfalo, médula espinal, ganglio trigémino

Tejido, hisopo (meninge o tercer ventrículo), LCR

Musculoesquelético

Músculos esqueléticos (psoas, diafragma, del hombro, muslos), huesos, articulaciones

Hisopo, tejido

Tegumentario

Piel (x2)

Tejido, hisopo

Pelo

Reproductivo

Ovarios, útero, testículos, glándulas mamarias

Tejido, hisopo, leche

Leche

Feto

Órganos parenquimatosos Placenta

Tejido, hisopo (contenido gástrico)

Raspado (parasitología)

MuesTreo de la población aniMal Los veterinarios a menudo quieren tener datos sobre enfermedades específicas que puedan afectar a los cerdos en una granja o en una región o país determinado. Se deben consi derar dos preguntas principales:

1. ¿Está la enfermedad presente en la población? 2. ¿Cuál es la proporción (prevalencia) de animales infectados?

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La toma de muestras se puede basar en el censo de animales (población total), pero la selección de una submuestra adecuada de animales es más sencilla y permite ahorrar tiempo y dinero.

Cuando el objetivo es saber si una infección está o no presente, los datos se pueden tomar de los animales del grupo con más posibili dades de ser infectados. Se trata de un método de muestreo intencionado o de conveniencia, para el cual es más sencillo seleccionar los ani males, pero que puede no ser representativo de la población total. Para contestar a la segunda pregunta, en lo que a la prevalencia de la infección respecta, las muestras deben ser representativas de la pobla ción y se deben seleccionar de forma aleatoria. El proceso de muestreo supone definir la población de interés (la población en riesgo), la población de estudio (las explotaciones de cerdos de las cuáles se obtendrán los datos de Figura 12. diagrama de flujo del proceso de muestreo en una población animal.

Población de interés

Censo de cerdos en la región

Población de estudio

Cerdos en las granjas seleccionadas

Muestra

Cerdos muestreados

los animales) y la muestra (cerdos que se van a estudiar) (fig. 12). El objetivo de este proceso es seleccionar una muestra de animales cuyos datos puedan ser representativos de la población, con una preci sión aceptable, y por esa razón se deben tener en consideración dos preguntas más: 1. ¿Qué individuos se deben incluir en el muestreo? 2. ¿De cuántos cerdos se deben tomar muestras?

Métodos de muestreo El muestreo probabilístico se puede aplicar al individuo (cerdo) o al grupo (explotación) como unidades de muestreo. Los métodos más fre cuentemente utilizados (tabla 2) en epidemio logía porcina son los siguientes: • Muestreo aleatorio simple: cada individuo de la población de estudio tiene las mismas probabilidades de ser elegido. Puede ser difícil de aplicar en la práctica y no es muy eficiente. • Muestreo aleatorio sistemático: consiste en seleccionar el primer cerdo de forma aleatoria y se toman muestras del resto de los animales a intervalos regulares. Se trata de un método muy práctico para obtener muestras representativas de una población. • Muestreo aleatorio estratificado: se clasifi ca la población en grupos según un factor determinado, como puede ser la edad o la raza. Es un método eficaz para reducir la varianza cuando es posible que un grupo de animales esté menos representado que otro en la misma población. • Muestreo por conglomerado: en este caso, la unidad de muestreo es un grupo de animales que incluye individuos que son heterogéneos, mientras que cada conglo merado es similar a los otros. El muestreo se divide por áreas geográficas o por periodos de tiempo.

Toma de muestras

Tabla 2. Métodos de muestreo adecuados para cada tipo y características de la población de cerdos.

Características de la población

Tipo de población

Método de muestreo adecuado

Homogéneo

Cerdos de engorde / matadero

Muestreo aleatorio simple/ aleatorio sistemático

Diferentes estratos (edad, raza, número de animales) pero homogéneo en cada estrato

Explotaciones de ciclo cerrado, estratificadas por edad Explotaciones estratificadas por número de cerdas

Muestreo estratificado

Regiones similares (país) con granjas heterogéneas en cada una de ellas

Grupos de granjas en las regiones seleccionadas

Muestreo por conglomerado

Tamaño de la muestra El número de cerdos de los cuales se tomarán muestras depende del objetivo del muestreo. A. Tomar muestras para determinar la prevalencia de una infección o de una enfermedad en la población. Los factores a tener en cuenta son: • La frecuencia esperada de la infección (p); es decir, una hipótesis sobre la proporción de animales infectados (ejemplo: p = 20%). • La exactitud o nivel de precisión requerido (B); significa la distancia de la estimación de la muestra que es aceptable (ejemplo: B = +/- 5%). • El nivel de confianza deseado; habitualmente 90-95-99% para que la distribución de la población sea normal. Los errores estándar correspondientes (z) son 1,65-1,96-2,58 (ejemplo: 95% y z = 1,96). • Número de animales en una población (N). Así, la fórmula para calcular el tamaño de la muestra (n) para determinar la prevalencia es:

z 2p (1 – p) B

1,96 * 0,20 (0,80) 0,052

= 246

Para pequeñas poblaciones, el tamaño de muestra calculado (n) puede ser demasiado alto, y el número total de animales (N) se tiene que tener en cuenta para ajustar el tamaño de muestra (n’): 1 n'

1 n

N = 500 cerdos 1

1 246

1 500

n' = 165

Estos cálculos se pueden realizar mediante programas informáticos de epidemiología tales como Winepi (http://www.winepi.net) o FreeCalc (http://www.ausvet.com.au/content. php?page=software#freecalc), o usando tablas. Un ejemplo de cálculo de tamaño de muestra para un nivel de confianza del 95% y valores diferentes de exactitud y prevalencia esperada se puede encontrar en la tabla 3. B. Tomar muestras para detectar la presencia de una enfermedad, independientemente de la proporción de animales infectados. Este cálculo es útil en investigaciones en casos de brote, control de enfermedad o programas de erradicación. El objetivo es calcular el tamaño de muestra necesario para saber si la enfermedad está presente o no en la población (N), teniendo en cuenta el nivel de confianza deseado