Beatriz Caroline de Moraes by Héber Bensi

Instituto Federal De Educação, Ciência e Tecnologia do Estado De São Paulo – Campus São Roque

Beatriz Caroline de Moraes

Ativação indireta da expressão gênica regulada pela triiodotironina em linhagens celulares de adenocarcinoma mamário.

São Roque 2016

Instituto Federal De Educação, Ciência e Tecnologia do Estado De São Paulo – Campus São Roque

Beatriz Caroline de Moraes

Ativação indireta da expressão gênica regulada pela triiodotironina em linhagens celulares de adenocarcinoma mamário. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado no Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Estado de São Paulo - Campus São Roque - IFSP como requisito para obtenção do título de Licenciada em Ciências Biológicas sob orientação do Professor Doutor Sandro José Conde.

São Roque 2016

Nome: Beatriz Caroline de Moraes Título: Ativação indireta da expressão gênica regulada pela triiodotironina em linhagens celulares de adenocarcinoma mamário

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado no Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Estado de São Paulo - Campus São Roque - IFSP como requisito para obtenção do título de Licenciada em Ciências Biológicas sob orientação do Professor Doutor Sandro José Conde.

APROVADO EM: ___/___/_____

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Agradecimento Agradeço primeiramente a Deus que sempre me protegeu e me guiou por todos os caminhos para chegar até aqui. Aos meus pais que me ensinaram o caminho das pedras e que sempre confiaram e acreditaram em mim, sem eles sem nada disso seria possível. Aos irmãos, que mesmo me estressando me entendiam toda vez que falava que precisava terminar o TCC. E também ao meu namorado que sempre me deu forças para conseguir concluir esse trabalho. Ao meu orientador Prof. Dr. Sandro José Conde, por me aceitar como sua orientanda, desde a minha primeira iniciação científica, me ensinando tudo desde o princípio, por todo o conhecimento transmitido e por toda atenção nos momentos de dúvida no início da vida de laboratório e também naqueles momentos de estresse onde tudo parecia estar errado e você dizia que estava tudo bem. Aos meus professores, grandes mestres e doutores que estiveram comigo por toda minha graduação, tirando dúvidas e fazendo com que eu amadurecesse e me dando bases para ser uma boa profissional, seja por conselhos trocados nos intervalos ou por um simples exemplo de vida. Aos técnicos de Laboratório do IFSP São Roque, especialmente a Maira e a Cris que sempre estavam dispostas a ajudar no que fosse preciso, que me apoiaram em cada momento frustrante dentro do laboratório para realizar esse TCC, que foram inúmeros. Agradeço também pelos bate papos de final de tarde que ajudavam a aliviar a cabeça. Aos amigos que também acompanharam toda essa trajetória, claro em especial as “meninas” que sempre me apoiaram e ouviram as lamentações nos dias que tudo dava errado e as comemorações de quando algo dava certo. Agradeço imensamente a amizade de vocês e quero leva-las para a vida toda. Aqui nesse momento cabe um agradecimento especial a Gabi, pois sem você esse trabalho não estaria concluído, obrigada por estar lá quando mais precisei. Agradeço também a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo financiamento desse projeto, fator que foi essencial para seu desenvolvimento.

MORAES, B. C. Ativação indireta da expressão gênica regulada pela triiodotironina em linhagens celulares de adenocarcinoma mamário [Trabalho de Conclusão do Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas]. Instituto Federal de São Paulo. São Roque, 2016. RESUMO Sabe-se que o estrógeno (E2) e o status hormonal da paciente são importantes para a proliferação e tratamento do câncer de mama (CaM). Quanto ao hormônio tireoidiano (T3), apesar dos estudos epidemiológicos contraditórios em relação a sua influência no câncer de mama, estudos laboratoriais demonstram sua capacidade de aumentar a proliferação de células de CaM com receptor de E2 (ER) positivo. Embora o T3 exerça muitas ações pela regulação genômica clássica da transcrição gênica, ações não genômicas dos hormônios tireoidianos são descritas na membrana plasmática, no citoplasma e em organelas celulares. Recentemente foi demonstrado que os genes AREG, FBLN1, CLDN6, TGFA foram estimulados por E2 e T3 nas células MCF-7. Pretendeu-se elucidar melhor a via de ação dos hormônios tireoidianos na ativação gênica desses alvos em linhagens celulares de adenocarcinoma de mama, através da utilização de Ciclohexamida, uma droga que inibe a síntese proteica. Metodologia: Linhagens celulares de câncer de mama MCF-7 foram plaqueadas em intervalos de tempo de 10 minutos, 30 minutos, 1 hora e 48 horas com T3 (108M), T3 (10-8M) + Ciclohexamida (50 mM) e Ciclohexamida (50 mM). Os tratamentos empregados foram realizados em triplicata, com posterior quantificação da expressão gênica de THRA, gene responsável pela produção dos receptores tiroidianos (TR), onde foi verificado que nos tempos de 10 e 30 minutos e 1 hora, não houve nenhuma alteração nos níveis de expressão gênica. No tratamento de 48 horas, houve uma diferença entre o tratamento com CHX e o seu controle e entre o tratamento de T3 e o de T3+CHX, indicando que o tratamento com T3 não interfere na expressão gênica de THRA em linhagens celulares de câncer de mama MCF-7, já quando ocorre o bloqueio da síntese protéica, ocorre um aumento nos níveis de expressão gênica de THRA. Palavras-chave: Câncer de mama, linhagens celulares, Ciclohexamida, expressão gênica.

MORAES, B. C. Indirect activation of gene expression regulated by triiodothyronine in cell lines of breast adenocarcinoma. [Academic Coursework in Biological Sciences]. SĂŁo Paulo Federal Institute. SĂŁo Roque, 2016.

ABSTRACT It is known that estrogen (E2) and the hormonal status of the patient are important for the proliferation and treatment of breast cancer (CaM). As for the thyroid hormone (T3), despite the contradictory epidemiological studies regarding its influence on breast cancer, laboratory studies have demonstrated its ability to increase proliferation of cells with CaM of E2 receptor (ER) positive. Although T3 exert many actions by the classical genomic regulation of gene transcription, not genomic actions of thyroid hormones are described in the plasma membrane, the cytoplasm and cell organelles. Recently it was demonstrated that the gene AREG, FBLN1, CLDN6, TGFA were stimulated by E2 and T3 in MCF-7 cells. It is intended to elucidate better then the route of action of thyroid hormones in gene activation of these targets in cell lines of breast adenocarcinoma, through the use of cyclohexamide, a drug that inhibits protein synthesis. Methods: Cell lines MCF-7 breast cancer are plated in 10-minute intervals, 30 minutes, 1 hour and 48 hours with T3 (10-8M), T3 (10-8M) + cycloheximide (50 mM), cycloheximide (50 mM). The treatments were be performed in triplicate. They were accomplish the quantification of gene expression. It was verified that in the durations of 10 minutes, 30 and 1 hour, there was no change in gene expression. In the 48-hour treatment, CHX treatment differed from its control, while T3 is differed from T3 + CHX treatment, indicating that T3 treatment does not interfere with THRA gene expression in MCF-7 breast cancer cell line. When there is a blockage of protein synthesis, there was an increase in THRA gene expression.

Keywords: Breast cancer cell lines, cyclohexamide, gene expression

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Indução de HIF1A, GLUT1 e PFKP pelo T3..........................................................14 Figura 2. Fotomicrografia das células MCF-7 obtidas ao microscópio óptico 40% e 80% de confluência............................................................................................................................... 23

LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1: Níveis de expressão gênica de THRA no tempo de 10 minutos (1) com os tratamentos de T3, CHX, T3+CHX, respectivamente............................................................. 24 Gráfico 2: Níveis de expressão gênica de THRA no tempo de 30 minutos (2) com os tratamentos de T3, CHX, T3+CHX, respectivamente............................................................. 24 Gráfico 3: Níveis de expressão gênica de THRA no tempo de 1 hora (3) com os tratamentos de T3, CHX, T3+CHX, respectivamente................................................................................ 25 Gráfico 4: Níveis de expressão gênica de THRA no tempo de 48 horas com os tratamentos de T3, CHX, T3+CHX, respectivamente................................................................................ 25

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Esquema de tratamentos em modelo de dois fatores (2x2) para a análise dos blocos completos casualizados.......................................................................................................... 19 Tabela 2: Resumo das características das culturas primárias e das linhagens celulares....... 27

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A/A: Antimicótico/Antibiótico AREG: Gene amphiregulin CaM : Adenocarcinoma mamário CHX: inibidor de síntese proteica CLDN6: Gene Claudin DMSO: Dimetilsulfóxido E2: 17-beta-estradiol FBLN1: Gene Fibulin GLUT1: Transportador de glicose GPCR: Receptores acoplados a proteína G HIF1A: Hypoxia-inducible factor 1-alpha IP3: inositol trifosfato LY294002: Inibidor da via PI3K MAPK: Proteína quinase ativada por mitógeno MCF7: Linhagem celular de adenocarcinoma mamário MCT4: Transportadores de monocarboxilato MEK: “Mitogen-activated protein kinase” NcoR: Receptor co-repressor nuclear PCR: Reação da polimerase em cadeia PGR: Progesterone Receptor PI3K: Phosphatidylinositol-3-kinase PKA: Proteína quinase A PKC: Proteína quinase C PFKP: Phosphofructokinase Ras: Oncogene humano Raf :Oncogene retroviral RPMI: Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute medium RXR: retinoid X receptor SFB: Soro fetal bovino SMRT: silencing mediator thyroid-hormone receptors T3: 3,5,3’ triiodotironina T4: Tetraiodotironina

TER: Elementos responsivos ao horm么nio tireoidiano TGFA: Fator de crescimento transformante alfa TGFB1: Fator de crescimento transformante beta THRA: Receptor de horm么nio tireoidiano alfa THRB: Receptor de horm么nio tireoidiano beta TR: Receptores de horm么nio tireoidiano

SUMÁRIO 1.

INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 12

2. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 16 2.1 Materiais permanentes ................................................................................................. 16 2.2 Materiais de consumo .................................................................................................. 16 2.3 CULTURA DE CÉLULAS ........................................................................................... 17 2.3.1 Descrição e Descongelamento ................................................................................. 17 2.3.2 Manutenção e expansão das linhagens celulares ...................................................... 17 2.3.3 Tripsinização ......................................................................................................... 18 2.3.4 Plaqueamento ........................................................................................................ 18 2.3.5. Tratamentos ......................................................................................................... 19 2.3.6 Congelamento e medidas de controle ...................................................................... 19 2.4 EXTRAÇÃO DE RNA ................................................................................................. 20 2.4.1 Separação.............................................................................................................. 20 2.4.2 Precipitação .......................................................................................................... 20 2.4.3 Lavagem ............................................................................................................... 20 2.4.4 Redissolvendo ........................................................................................................ 21 2.5 TRANSCRIÇÃO REVERSA ....................................................................................... 21 2.6 REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIRA .............................................................. 21 3. RESULTADOS ................................................................................................................. 23 4. DISCUSSÃO..................................................................................................................... 26 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 30 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................ 31

1. INTRODUÇÃO Em

tumores

mamários

hormônios

tireóideos

são

necessários

para

desenvolvimento de alguns tumores de ratos E2-dependentes. A controvérsia sobre o papel desses hormônios, tanto na etiologia quanto no tratamento do câncer de mama é bastante grande. Kapdy & Wolfe, (1976) [1] e Mustacchi & Greenspan (1977) [2] encontraram uma associação entre ingestão de hormônios tireóideos e aumento do risco de câncer mamário. Por outro lado, Vorherr (1987) [3] descreve um aumento na sobrevida em pacientes hipertireóideas com câncer de mama e sugere que o hipertireoidismo parece proteger contra o desenvolvimento de câncer de mama por aumentar a globulina ligadora de hormônios esteróides e por diminuir a atividade estrogênica sobre o tecido mamário. Os hormônios da tireóide regulam o crescimento, o desenvolvimento, diferenciação e processos metabólicos, interagindo com e ativando os receptores hormonais da tireóide e vias associadas. [30]. Sabe-se que o T3 regula a expressão de genes nucleares pela ligação aos receptores de hormônio tireoidiano TRα e TRbeta. Os receptores de hormônio tireoidiano (TR) reconhecem específicos elementos responsivos tireoidianos (TRE) nos promotores de genes alvos e ativam ou reprimem a transcrição na presença do hormônio. Assim, as ações nucleares do T3 são sensíveis a inibidores da transcrição e tradução e tem uma latência de horas a dias. Embora o T3 exerça muitas ações pela regulação genômica clássica da transcrição gênica, um número de efeitos do T3 ocorre rapidamente e não são afetados por inibidores da transcrição e da síntese protéica [4-6]. Ações não genômicas dos hormônios tireoidianos são descritas na membrana plasmática, no citoplasma e em organelas celulares. In vitro, independente da síntese protéica, T4 induz IP3 e sinalização pelo cálcio aumentando os efeitos de interferon-δ via PKC e PKA [5]. Este modelo proposto por Davis e colaboradores para a ação não genômica mediada na superfície celular através do hormônio tireoidiano envolve tanto a cascata da MAPK como a PI3K. Neste modelo, num período de tempo entre 10-30min, T4 liga-se a GPCR da superfície celular ativando PKC, Ras, Raf1 e MEK resultando na fosforilação de tirosina, ativação e nuclear translocação de MAPK, que, por sua vez, fosforila um resíduo de serina no segundo dedo de zinco do TR. Esta fosforilação resulta na dissociação do TR de seus co-repressores SMRT e NcoR, diminuindo a atividade das proteases, aumentando a atividade transcricional e pode também regular heterodimerização com RXR.

Quanto ao câncer de mama, pouco se sabe sobre a maneira como o T3 modula o seu receptor no tecido tumoral. Foi demonstrada por Burke & McGuire (1978) [7] a presença de receptores para T3 no núcleo de uma linhagem de células derivadas de câncer de mama humano (MCF-7). Cerbon et al. (1981) [8] comprovaram a presença de receptores nucleares para T3 em câncer de mama, embora não tenha sido observada correlação alguma com a concentração de outros receptores hormonais (E2 e progesterona) ou estadiamento do tumor. Sabe-se que o status hormonal da paciente é importante para a proliferação e o tratamento do câncer de mama. Quanto ao T3, apesar dos estudos epidemiológicos serem ainda contraditórios em relação a sua influência no câncer de mama, estudos laboratoriais demonstram sua capacidade de aumentar a proliferação de células de CaM com ER positivo, induzindo a expressão de genes normalmente estimulados por E2 (PGR, TGFA e TGFB1) [9]. Trabalhos recentes, utilizando linhagens celulares, destacam uma alteração de expressão gênica após o tratamento com T3, dependente da via PI3K. Ainda sob uma ótica de iniciação não genômica, podemos distinguir duas classes de genes alvos da ação do T3 pela via PI3K, uma classe de genes induzidos diretamente pela ação dessa via e que não necessitam de síntese protéica “a priori” para sofrerem a ação do tratamento com o hormônio, denominado em alguns trabalhos como ação não-genômica direta do T3, e uma classe de genes cuja expressão altera-se na presença do hormônio, porém dependente da síntese de uma proteína específica previamente, denominada como ação não-genômica indireta do T3. Dentre os genes estimulados pelo tratamento com T3 podemos destacar alguns genes relacionados com o metabolismo energético como HIF1A, GLUT1, PFKP e MCT4. Todos possuem expressão alterada pela via não clássica (não-genômica) de ação do hormônio tireoidiano pela PI3K, pois qualquer expressão foi interrompida com o tratamento concomitante de LY294002, uma droga que inibe a ação da via metabólica PI3K. No entanto, somente o HIF1A teve sua expressão estimulada diretamente pelo T3 na via PI3K, pois a associação de um inibidor da síntese protéica como a ciclohexamida não interrompeu a ação do hormônio. Dessa forma, a ciclohexamida (CHX) mostra-se como um importante componente para distinguir ação direta ou indireta do hormônio tireoidiano (Figura 1).

Figura 1: Indução de HIF1A, GLUT1 e PFKP pelo T3: Ativação de PI3K no citosol, através da ligação do hormônio tireoidiano ao TRBeta, aumenta diretamente a expressão de HIF1A. Este aumento pode ser prevenido pela adição do inibidor da PI3K (LY294002). Depois de traduzido, HIF1A liga-se a elementos de resposta a hipoxia (HRE) e induz a expressão de outros genes como PFKP ou GLUT1. Somente esses últimos possuem a influência do tratamento com T3 bloqueada pela adição de ciclohexamida (CHX), demonstrando uma ação indireta do hormônio tireoidiano para sua expressão [10].

A triiodotironina pode levar ao aumento da expressão gênica de seus receptores em células colocadas em cultura [11] e dados de expressão já observados na literatura foram confirmados nas culturas primárias indicando que o T3 está agindo normalmente através de sua via de sinalização. A expressão dos receptores de hormônios tireoidianos em carcinomas mamários também parece estar envolvida na caracterização dessa patologia, embora os estudos nesse sentido sejam escassos. Apenas um pequeno número de trabalhos descreve a presença de TR nesses tumores [7,12] e em linhagens celulares de câncer de mama [13, 14]. Em diferentes tipos de carcinoma, incluindo mama, já foi demonstrada a existência de alterações específicas na expressão de THRA e de THRB, sugerindo que a transcrição desregulada de genes alvo do hormônio tireoidiano pode estar relacionada à gênese dessa neoplasia. A expressão destes receptores confere importantes modificações em diferentes graus da diferenciação do câncer de mama [15]. García-Silva e Aranda, 2004 [13] relataram mudanças na expressão dos receptores de hormônios tireoidianos na proliferação e nos mecanismos de transformação tumoral, sugerindo que os TRs podem ter um potente papel supressor da ação do oncogene Ras. Em estudos prévios nosso grupo demonstrou que o T3 aumenta a expressão de seu receptor [16]. Considerando-se os dados de influência do hormônio tireoidiano em carcinoma mamário, somando-se trabalhos do nosso grupo que observaram uma maior freqüência de hipertireoidismo em pacientes menopausadas portadoras de câncer de mama, juntamente com

o fato de análogos dos hormônios tireoidianos exercerem ativação da via PI3K, torna-se relevante estudar se a variação da expressão de THRA, já observadas por nosso grupo [9], é controlada pela ação do hormônio triiodotironina em modelos com baixa deriva genética como linhagens celulares MCF7. Dessa forma, procura-se delimitar melhor a ação do hormônio e sua aplicabilidade durante a terapêutica do carcinoma mamário.

2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Materiais permanentes - Tanque de Nitrogênio Líquido; - Tubos Polietileno; - Banho Maria; - Frascos Plásticos de Cultura Celular; - Câmara de Fluxo Laminar; - Tubos Eppendorf; - Micropipetas Gilson; - Ponteiras; - Centrifuga; - Geladeira; - Freezer; - Tubos Falcon; - Estufa; - Placas de 24 poços; - Autoclave; - Vórtex; - Capela laboratorial. 2.2 Materiais de consumo - Células MCF- 7; - Meio de cultura - Roswell Park Memorial Institute medium - RPMI 1640 (Gibco, Cat. nº 31800-014); - Soro Fetal Bovino (Gibco, Cat. nº 10082-147); - Antibiótico/ Antimicótico (Gibco, Cat. nº 15240-062); - Tripsina (tripsina 0,2% e EDTA 0,02% - Gibco); - Etanol 70%; - Etanol 75%; - Trizol® reagente (Gibco); - Clorofórmio; - Álcool isopropílico (propanol); - DMSO (DMSO – Sigma ); - Nitrogênio Líquido.

2.3 CULTURA DE CÉLULAS 2.3.1 Descrição e Descongelamento As células MCF-7 utilizadas ao longo do projeto são mantidas em tubos polietileno, em concentrações de aproximadamente 1x106 células por ml, congeladas e mantidas em nitrogênio líquido. Cabe salientar que as linhagens inicialmente cultivadas foram gentilmente cedidas pela Profª Célia Regina Nogueira, do Laboratório de Biologia Molecular da FM/UNESP, das quais se extraiu clones utilizados nas demais culturas do projeto. O cultivo inicia-se com descongelamento das células. Para tanto, os tubos de polietileno, nas quais estão armazenadas as células, são retirados do nitrogênio líquido, colocados rapidamente em banho-maria sobre temperatura média de 37°C, temperatura ideal para descongelamento das células, sem causar danos a elas. Paralelamente, é realizada a esterilização da câmara de fluxo laminar e das pipetas com etanol 70% e radiação ultravioleta por 15 minutos, separação das ponteiras e tubos falcon autoclavados e aquecimento a 37°C dos componentes que compõem a cultura: RPMI, Soro Fetal Bovino (SFB) e Antibiótico/ Antimicótico(A/A). É necessário ter preparado na câmara de fluxo laminar o meio de descongelamento para receber essas células, pois o meio onde estão congeladas se torna tóxico quando descongelado. Esse meio deve conter soro fetal bovino (SFB) 20% e meio de cultura RPMI 1640 (Sigma Chemical Corporation, Saint Louis – EUA) 80%. Após serem transferidas para esse meio, as células são centrifugadas por 2 minutos a 2500 rpm. A centrifugação faz com que haja precipitação das células e então é possível observar um pellet no fundo tubo. Em seguida, o tubo é levado até o fluxo novamente e o sobrenadante é descartado. O pellet formado é ressuspendido em RPMI com auxílio da micropipeta e as células são transferidas para garrafa plástica pequena (40ml), onde recebem as quantidades complementares do meio de cultura, resultando em 4,5ml de RPMI, 0,5ml de SBF e 50μl de A/A por garrafa pequena. A garrafa com as células e meio cultura é fechada e conduzida até uma estufa uma taxa de 5%/95% de CO2/Ar a 37ºC, onde permanece durante seu crescimento.

2.3.2 Manutenção e expansão das linhagens celulares As garrafas com meio de cultura são mantidas na estufa, e a cada dois dias o meio de cultura é trocado para que os nutrientes que favorecem o crescimento celular não se esgotem.

Para as células MCF-7 é preparado um meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino, 0,1% de antibiótico-antimicótico e o restante de meio basal RPMI. Ao serem descongeladas as células são inicialmente cultivadas em uma garrafa pequena, transferidas para garrafa média e posteriormente para uma garrafa grande. A concentração de células por ml é determinado por uma estimativa, após contagem em hemocitômetro (câmara de Neubauer). Após a troca do meio de cultura, a garrafa retorna para estufa até uma nova troca do meio cultura. Quando as células atingem confluência superior a 75%, elas são tripsinizadas para passagem para uma nova garrafa, seguindo com crescimento da linhagem, ou podem ser congeladas novamente. É importante que a confluência total não seja atingida para evitar que o crescimento das células seja afetado por inibição de contato. 2.3.3 Tripsinização Quando as garrafas alcançam a confluência de 80%, as células são submetidas a tripsinização, na qual em ambiente esterilizado da câmara de fluxo laminar, o meio de cultura é retirado da garrafa e descartado. Lava-se a garrafa com 2ml de DPBS e em seguida colocase quantidade de tripsina suficiente para a área da garrafa diretamente na parede onde as células estão aderidas. Com a garrafa fechada, são realizados movimentos circulares com garrafa para que tripsina seja distribuída igualmente sobre as células, para que sua ação seja completa sobre as mesmas. A tripsina digere parte da membrana plasmática assim rompendo a fixação das células no fundo da garrafa. A ação da tripsina, por ser bem agressiva, deve durar poucos minutos até células desafixarem da garrafa, rapidamente as células devem ser transferidas para um tubo contendo meio superconcentrado de soro fetal com a intenção de inativar a ação da tripsina. O tubo então é centrifugado por 2 minutos a 2500 rpm. Retornando ao ambiente do fluxo laminar, o sobrenadante formado é descartado, o pellet de células formado é ressuspendido com 4ml de RPMI e colocado em nova garrafa onde recebe os componentes do novo meio de cultura nas concentrações adequadas. 2.3.4 Plaqueamento Nessa etapa as células são preparadas para o início dos tratamentos. Para o plaqueamento foram utilizadas placas de 24 poços, com uma área de crescimentos de 1,9 cm 2. Foi realizada a contagem das células em câmara de Neubauer, para que fossem divididas de

maneira a ficarem com um valor de 1x105 células em cada poço. No momento do plaqueamento o SFB usado durante todo o cultivo celular é substituído por SFB filtrado, que consiste num soro livre de hormônios e outras substâncias que possam interferir na ação dos hormônios e drogas durante o tratamento. Depois das células serem plaqueadas em todos os poços, a placa é levada para a estufa, onde permanecerá por dois dias, para que as células cresçam e atinjam a confluência, para então dar-se o início dos tratamentos. 2.3.5. Tratamentos Os tratamentos foram realizados com T3 (10-8M), T3 (10-8M) + CHX (50 mM), CHX (50 mM) em quatro intervalos de tempo: 10 minutos, 30 minutos, 1 hora e 48 horas e durante esse tempo as culturas são mantidas à 37o C em uma atmosfera umidificada com 95% O2/5% CO2. Em cada tubo falcon fica armazenado um tipo de tratamento, contendo 1,5 ml de SFB, 13,5 ml de RPMI e 150μl de antibiótico-antimicótico com quantidade adequada de seu respectivo agente, ficando distribuído em cada tubo conforme a Tabela 1. Todos os tubos são cobertos com papel alumínio devido á fotossensibilidade dos hormônios. Tabela 1. Esquema de tratamentos em modelo de dois fatores (3x2) para a análise dos blocos completos casualizados. Esse esquema foi empregado às células MCF-7.

Tratamentos Ausência de Droga

CHX (50mM)

Ausência de droga

Triiodotironina (10-8M)

Controle

T3 (10-8M)

15 μL de DMSO

7,5 μL de T3 + 7,5 μL de DMSO

CHX (50 mM)

T3 (10-8M) + CHX (50mM)

7,5 μL de CHX + 7,5 μL de DMSO

7,5 μL de T3 + 7,5 μL de CHX

A placa é retirada da estufa e levada para o fluxo laminar, retira-se o meio antigo das células e pipeta-se 1ml do meio de cultura com os tratamentos respectivos em cada poço. A placa é levada de volta à estufa e inicia-se a contagem dos tempos determinados. 2.3.6 Congelamento e medidas de controle Após a tripsinização é possível estocar parte das culturas celulares, acrescentando SFB 30% (Gibco) e dimetilsulfóxido (DMSO – Sigma) 10% em alíquotas de 2ml, contendo cerca de 106 células/ml, que serão transferidas para tubos de polietileno, colocados em estantes de isopor com gelo e congelados a –80oC por 24h e depois estocados em nitrogênio líquido.

Diversas medidas foram adotadas para evitar a contaminação das células durante sua manipulação como utilização de luvas, lavar bem as mãos e punhos com água e etanol 70%, não interromper a passagem de ar da câmara de fluxo laminar, autoclavar materiais que entram em contato com as células que devem ser esterilizados ao entrar no fluxo laminar, não utilizar ponteiras que encostassem em superfícies dos materiais utilizados ao se manipular as células, utilizar uma ponteira para cada componente do meio de cultura e lacrar as tampas dos de seus frascos com parafilme. 2.4 EXTRAÇÃO DE RNA 2.4.1 Separação Dado o tempo do estudo, a placa é retirada da estufa e levada ao fluxo, onde o meio com o tratamento é retirado e coloca-se 1ml de Trizol®, depois as amostras são transferidas para um tubo eppendorf de 2ml identificados com cada tratamento, para dar-se início a extração de RNA. Depois da aplicação do Trizol® as amostras ficam em repouso de 3 a 5 minutos, para que haja uma dissociação dos complexos de nucleoproteínas. Adiciona-se 0,2ml de Clorofórmio por 1ml de Trizol®, os tubos são agitados por 15 segundos no vortex e são incubados a 15 – 30ºC durante 2 minutos. Centrifugam-se as amostras durante 15 minutos a 12000rpm a uma temperatura de 2 – 8ºC. Terminada essa etapa a amostra apresentará três fases: a inferior rosa (proteínas e restos celulares), a intermediária branca (DNA) e a fase superior aquosa, onde se encontra o RNA total. 2.4.2 Precipitação Transfere-se a fase aquosa para um novo tubo eppendorf de 1,5 ml também identificado e coloca-se 0,5ml de álcool isopropílico para cada 1ml de Trizol®. Incubam-se as amostras a 15-30ºC durante 10 minutos e então são levadas para centrifugação a 12000rpm por 10 minutos a 2-8ºC. Nessa etapa forma-se um pellet no fundo do tubo, o qual é precipitado de RNA. 2.4.3 Lavagem Após o descarte do sobrenadante, lava-se o pellet formado de RNA com 1ml de etanol 75% por 1ml de Trizol®. As amostras são agitadas no vortex por 15 segundos para serem homogeneizados e centrifugadas durante 5 minutos a 7500rpm a 2-8ºC.

2.4.4 Redissolvendo No final do procedimento, retira-se o sobrenadante por inversão do tubo e os tubos são deixados com a boca para baixo apoiados sobre papel autoclavado dentro do fluxo laminar durante cerca de 10-15 minutos, para secagem das amostras. O pellet de RNA é redissolvido com 30µL de água ultrapura tratada com dietilpirocarbonato (DEPC), passando-se a solução várias vezes pela ponteira de uma micropipeta. As amostras são incubadas durante 10 minutos a 55-60°C e depois armazenadas em freezer -80ºC. 2.5 TRANSCRIÇÃO REVERSA Obteve-se o cDNA utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription. Usam-se todos os componentes do Kit: 10x RT Buffer (2µlL), 25x dNTP Mix (100mM) (0.8µlL), 10x RT Random Primers(2µlL), MultiScribeTM Reverse Transcriptase (1µlL), Nuclease-free H2O (4.2µlL). As quantidades dos componentes para cada reação de cDNA foram realizadas seguindo o protocolo do kit High-Capacity cDNA. Depois do preparo do “mix” de componentes e da diluição do RNA seguindo o protocolo, usa-se o termociclador para dar início as reações em três etapas sendo a primeira a 25ºC por 10 minutos, a segunda a 37ºC por 120 minutos e a terceira a 85ºC por 5 minutos, conforme orientação do fabricante. Após o término da reação, as placas são armazenadas em freezer -80ºC, até serem levadas para a UNESP – Botucatu para realização do PCR. 2.6 REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIRA Para se realizar o PCR em tempo real, usa-se uma outra placa de 96 poços onde são adicionados os seguintes componentes, que estarão no gelo até que se descongelem: Master Mix 10 µL, Primer 1 µL, H20 5 µL e mais 4 µL da amostra de cDNA. Após a pipetagem dos componentes e da amostra numa placa, coloca-se essa placa no aparelho de PCR em tempo real e pelo computador o aparelho é programado para que não se perca o desenho da placa (onde se localiza as amostras, em cada poço). Dentre as etapas da reação destacam-se: aquecimento da amostra a 94oC para que a fita de DNA se desnature (se separe); o próximo passo é resfriar as amostras à 54oC para que os primers comecem a se anelar ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores da enzima polimerase; após esse passo aquece-se novamente as amostras à 72oC (temperatura ideal para o funcionamento da DNA polimerase), para a duplicação da fita. A DNA

polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla. Retira-se as amostras do programa e, ao final do experimento, obtém-se os gráficos de expressão gênica. Esses gráficos são gerados pela emissão de fluorescência que as sondas Taq-Man liberam ao serem clivadas durante a síntese da nova fita, na ação exonuclease da DNA-polimerase. O aparelho utilizado foi o “StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems”, da Life Technologies. Esse aparelho é ideal para trabalhar com sondas TaqMan na detecção de fluorescência na faixa de 300 a 600 nm. Durante a reação de PCR Real-time, a emissão de fluorescência começa a ser detectada pelo aparelho a partir de uma intensidade mínima, que se inicia, normalmente, a partir do décimo ciclo da reação, dependendo da quantidade inicial de moléculas presente na amostra biológica. Dessa forma, a fluorescência traduzida pelo aparelho na forma gráfica é proporcional à quantidade de moléculas expressas inicialmente. Tomando por base um gene que possua expressão estável durante qualquer fator empregado no experimento (controle interno da reação) é possível realizar a expressão relativa do gene alvo nas diferentes intervenções. Nesse trabalho foi utilizado, como controle interno da reação, o gene GAPDH devido à sua estabilidade para amostras de carcinoma mamário e o gene THRA como alvo.

3. RESULTADOS Nesse período foi realizada a cultura das células MCF- 7 que estavam armazenadas em nitrogênio. As células foram cultivadas com o objetivo de obter uma garrafa de cultura (175cm2) com confluência de 80% para realização dos tratamentos (Figura 2). Foram feitos registros fotográficos do decorrer das culturas. Também foi feito o primeiro tratamento da triplicata e a extração de RNA da mesma.

Figura 2 – Cultura de células MCF-7. À esquerda células com confluência de 40%(A) e a direita com 80%(B) de confluência.

Os tratamentos foram realizados em triplicata e depois realizadas as extrações de RNA. Com a análise dos dados da expressão gênica foram obtidos os seguintes gráficos. Nos gráficos 1, 2 e 3 são apresentados os resultados de expressão gênica de THRA em células MCF-7, tratadas com T3 e CHX nos tempos de 10 minutos, 30 minutos e 1 hora. Os tratamentos não apresentaram diferenças estatísticas entre eles.

Gráfico 1: Níveis de expressão gênica de THRA no tempo de 10 minutos (1), com os tratamentos de T3, CHX, T3+CHX, respectivamente.

Gráfico 2: Níveis de expressão gênica de THRA no tempo de 30 minutos (2), com os tratamentos de T3, CHX, T3+CHX, respectivamente.

Gráfico 3: Níveis de expressão gênica de THRA no tempo de 1 hora (3) com os tratamentos de T3, CHX, T3+CHX, respectivamente.

No gráfico 4 são apresentados os resultados de expressão gênica de THRA em células MCF-7, tratadas com T3 e CHX no tempo de 48 horas. Os resultados demonstram que existe uma diferença estatística entre o tratamento com CHX e o seu controle e entre o tratamento de T3 e o de T3+CHX, indicando que o tratamento com T3 não interfere na expressão gênica de THRA em linhagens celulares de câncer de mama MCF-7, já quando ocorre o bloqueio da síntese protéica, ocorre um aumento nos níveis de expressão gênica de THRA.

Gráfico 4: Níveis de expressão gênica de THRA no tempo de 48 horas com os tratamentos de T3, CHX, T3+CHX, respectivamente.

4. DISCUSSÃO Foi realizado um levantamento bibliográfico comparando o uso de linhagens de células imortalizadas e culturas primárias em artigos indexados na plataforma PubMed, o qual tem como objetivo ser publicado como uma parte desse trabalho. Segundo Pan et al. [20], experimentos na área da biologia usam mais frequentemente linhagens celulares imortalizadas, devido às suas vantagens sobre as culturas primárias, quanto a facilidade de cultivo em laboratório e tratamento, elas representam uma fonte quase ilimitada de células com genótipos e fenótipos similares [21]. O advento de diversas técnicas contemporâneas de estudo e combate ao câncer, o uso de linhagens celulares mostra-se com grande relevância científica, favorecendo inúmeros estudos, correlacionando os resultados obtidos à gradação e ao prognóstico das neoplasias. Muito frequentes no campo da ciência básica, inúmeras pesquisas demonstram as vantagens e desvantagens no uso de culturas primárias ou linhagens celulares e a interferência que a escolha de cada método pode provocar nos resultados do experimento. A aceitação de uma técnica ou outra varia entre as linhas de pesquisa, dependendo do objetivo de cada uma delas. As culturas primárias também apresentam diversas vantagens, sendo a principal delas a proximidade das características genotípicas das células com o tecido do qual foram isoladas [22]. Isso deve-se ao fato de como a técnica é realizada, onde as células são retiradas diretamente do tecido que será estudado e depois cultivadas no meio in vitro, preservando a maioria das características iniciais. No entanto, existe a possibilidade de que as células isoladas a partir de um tecido possam se comportar de forma diferente na cultura in vitro, em comparação com sua função metabólica quando elas fazem parte de um tecido no organismo, devido às interações célulacélula que existem no tecido original e que são perdidas no modelo in vitro. Allinen et al.[23] demonstram que as duas técnicas de pesquisa apresentam resultados semelhantes, quando comparados a expressão gênica e produção enzimáticas em tumores de mama. No trabalho de Osborne et al. [24] é evidenciado que existem algumas discrepâncias dentro das próprias linhagens celulares imortalizadas, como por exemplo em linhagens de MCF-7 obtidas de diversos laboratórios, foram observadas variações na taxa de crescimento celular, alterações nos receptores hormonais, e no cariótipo, apesar de as células serem morfologicamente idênticas.

Conde et al. [25] demonstra em sua pesquisa que o modelo de cultura primária apresenta-se como a melhor alternativa para estudos que busquem individualizar o tratamento do paciente, quando não existem linhagens celulares para pesquisa da doença. Apesar disso as linhagens celulares, apresentam mais vantagens para estudos de vias bioquímicas que respondam a tratamentos in vitro. Dentre os 11 artigos analisados que envolviam prática laboratorial, cinco deles optaram pela utilização da linhagem celular de adenocarcinoma mamário MCF-7. Quanto à cultura primária, existe uma diversidade de tecidos utilizados nas pesquisas, devido ao fato de ser uma técnica mais individualizada, que depende do objetivo do artigo e do tipo de carcinoma apresentado pela paciente.

Tabela 2: Resumo das características das culturas primárias e das linhagens celulares.

Tendo em vista o direcionamento da literatura científica de que as linhagens de células imortalizadas são a melhor opção quando se procura avaliar respostas bioquímicas a um determinado estímulo (MASTERS, 2000; CONDE et al., 2011; BURDALL et al., 2003), nessa pesquisa foi realizada a cultura de células MCF-7, célula de adenocarcinoma mamário, que foram tratadas com triiodotironina (T3) e estradiol (E2), para verificar modo de ação (direta ou indireta) desses

hormônios, especificamente verificando se suas ações mais

imediatas (via não-genômica) estão relacionadas com a síntese proteica a priori. Foi utilizada a droga Ciclohexamida (CHX), que é um inibidor de síntese proteica, que atua rapidamente

nas células, mostrando se a síntese é ou não necessária para a expressão do gene, para elucidar melhor a ação dos hormônios nas linhagens [26]. Ao fazer as análises dos tratamentos e dos seus efeitos ao longo dos quatro tempos estudados, verificamos que a amostra controle não teve nenhum resultado significativo na expressão do gene THRA, demonstrando que os veículos dos diluentes (NaOH ou DMSO) não interferiram na expressão do gene. O T3 se liga a receptores específicos (TRs), que pertencem à super família de receptores nucleares. Estes receptores funcionam como fatores de transcrição dependentes de ligantes, ligando-se a sequências conhecidas como elementos responsivos ao hormônio da tiróide (TRE), que são normalmente localizadas nas regiões promotoras de genes-alvo. Os TRs são codificados pelo genes TRα e TRβ, localizados nos cromossomos humanos 17 e 3, respectivamente. Por splicing alternativo, cada gene gera, pelo menos, duas isoformas de TRs, o TRa1, TRa2, TRb1 e TRb2. [27] A presença do gene THRA pode causar uma redução de até 5 anos na sobrevida de pacientes portadores de câncer de mama. Heublein et al. (2015), demonstrou que o THRA, exerce uma ação promotora no desenvolvimento dos tumores de mama, pois estimula a migração celular, aumentando as chances de metástases. [28]. Os tratamentos de 10 minutos, 30 minutos e 1 hora não apresentaram diferença estatística significante, indicando que para o gene THRA, o T3 não possui ações nãogenômicas, que são aquelas caracterizadas pelo o tempo de desencadeamento do efeito biológico, que geralmente se verifica de segundos, minutos ou até 1 hora após o início dos tratamentos. [29] O tratamento de 48 horas evidenciou diferenças estatísticas entre o tratamento com CHX e o seu controle, apresentando um aumento no nível de expressão de THRA, indicando que o THRA sofre regulação de alguma proteína que mantém o seu nível de expressão baixo e, quando bloqueada, o seu nível aumenta, indicando que na ausência dessa proteína os efeitos tumorigênicos de THRA são aumentados após 48 horas, podendo influenciar no aumento da migração dessas células para outros tecidos. É notado que a partir de 48 horas de tratamento há um aumento estatístico na expressão de THRA, sendo isso observado quando utilizado o CHX, mostrando que a síntese protéica prévia é necessária para que os níveis de mRNA do gene sejam mantidos constantes. Entre o tratamento de T3 e o de T3+CHX, dentro das 48 horas, foi analisada outra diferença estatística significante, onde há um aumento da expressão gênica quando comparado ao tratamento apenas com T3, porém esse aumento analisado no tratamento

T3+CHX, não apresentou diferença quando comparado ao tratamento apenas com CHX, indicando que a presença de T3 não interfere na expressão gênica de THRA em linhagens celulares de câncer de mama MCF-7, após 48 horas de tratamento.

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS Os resultados de expressão gênica de THRA em células MCF-7, tratadas com T3 e CHX nos tempos de 10 minutos, 30 minutos e 1 hora não apresentaram diferenças estatísticas entre eles, evidenciando o T3 não exerce ações não-genômicas no gene THRA. No tempo de 48 horas foi demonstrado uma diferença estatística entre o tratamento com CHX e o seu controle e entre o tratamento de T3 e o de T3+CHX, indicando que o tratamento com T3 não interfere na expressão gênica de THRA em linhagens celulares de câncer de mama MCF-7, já quando ocorre o bloqueio da síntese protéica, ocorre um aumento nos níveis de expressão gênica de THRA, elevando o potencial de migração dessas células.

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