Foldning af cryptochrome - hvor svært kan det være? Af: Claus Nielsen Hvert år flyver mange trækfugle henover Danmark, men hvordan finder de egentlig vej? En del af svaret kræver overraskende nok en indsigt i kvantefysik – og netop derfor endte jeg, som ellers primært er interesseret i atomer, molekyler og det der er endnu mindre, med at studere trækfugle. Sådan da. Det viser sig nemlig at trækfugle har en særlig sans, som vi mennesker ikke besidder: de kan “fornemme’’ retningen og intensiteten af magnetfelter – de har så at sige et indbygget kompas. Man ved stadig ikke hvordan denne kompas-sans egentlig virker, men der er forsket meget i netop dette i løbet af de sidste to årtier, og man er kommet frem til, at et protein kaldet cryptochrome må være ansvarlig for kompas-sansen (det er dog ikke endeligt bevist endnu). Der findes forskellige typer af cryptochrome-proteiner, og vi mennesker har endda selv nogle, som bl.a. er med til at styre vores døgnrytme. De sidder i nethinden i øjnene, og kræver lys for at fungere – dette skyldes et mindre fotoreceptor-molekyle, FAD (Flavin-adenin-dinukleotid), som er bundet inde i cryptochrome. Når FAD absorberer lys, sker der nogle kemiske reaktioner mellem FAD og cryptochrome, som aktiverer proteinet. For den type cryptochrome, som menes at stå bag magnetoreception, altså trækfuglenes kompas-sans, består denne aktivering i dannelsen af et radikal-par (to uparrede elektroner), og netop dette radikal-par kan fungere som kompas. Hvordan denne såkaldte radikalpar-mekanisme fungerer, var emnet i mit bachelorprojekt, og jeg skrev en artikel om dette i Hjerneblod nr. 3: kort fortalt, så kan et radikal-par eksistere i to forskellige spin-tilstande, kaldet singlet og triplet, og hvis man antager at forskellige kemiske reaktioner kan ske alt efter hvilken tilstand radikal-parret befinder sig i, så kan forholdet mellem kemiske reaktions-produkter fra hhv. singlet- og triplet-tilstande sige noget om eksterne magnetfelter, idet sådanne magnetfelter kan ”blande” singlet- og triplet-tilstande. I praksis vil det altså sige, at sådan et radikal-par vil skifte mellem at være singlet og triplet, med en frekvens som kan påvirkes af Jordens magnetfelt – og det er netop til at beskrive alt dette, at man er nødt til at bruge kvantefysik.
Når FAD (t.v.) absorberer lys sker tre elektronoverførsler, som involverer tre tryptofan-aminosyrer. Dermed fås et radikal mellem FAD og en tryptofan (t.h.). Cryptochrome ses i baggrunden.
Cryptochrome opløst i vand. Den kendte del af strukturen er grå, og ét af vores bud på CCT-strukturen er vist i grøn. Udover cryptochrome og vand, indeholder simuleringerne også en del ioner, her vist som kugler.
Efter mit bachelorprojekt fik jeg kontakt til Ilia Solov’yov, der leder QuantBio-gruppen (Quantum Biology and Computational Physics) ved SDU, som jeg i dag er en del af. Han blev ansat mens jeg arbejdede på mit bachelor-projekt – endda med kontor lige overfor min daværende vejleder – og havde allerede arbejdet med magnetoreception i lang tid. På daværende tidspunkt havde han opslået en ph.d.-stilling, som ud fra beskrivelsen lød som det helt rigtige for mig, men desværre manglede jeg stadig at gennemføre det første år på kandidatuddannelsen, inden det kunne blive aktuelt. I stedet begyndte jeg på et lille projekt med Ilia. Idéen bag projektet var at teste en teori om, hvordan en type cryptochrome-proteiner fungerer – via computersimuleringer kan man nemlig se, hvordan proteiner opfører sig, og hvordan de fungerer. Eller rettere, det kan man, hvis man har en tilstrækkelig god model for det molekylære system man vil simulere. Og det var præcis hér, mit projekt startede: man kender en del af strukturen af dette cryptochrome, men de sidste ca. 220 aminosyrer (af 716 i alt), den såkaldte Cryptochrome C-Terminal (CCT), er ikke inkluderet. Det viste sig dog, at det ikke var helt så simpelt som det lød, lige at lave en model for den fulde struktur – der er tale om det efterhånden velkendte problem med proteinfoldning (se faktaboks). De manglende aminosyrer blev sat på den kendte struktur, og så var det ellers bare med at forsøge at folde strukturen. Dette blev gjort vha. såkaldte interactive molecular dynamics-simuleringer (iMD), og jeg fik lavet et bud på, hvordan de sidste aminosyrer skal foldes. Ø
Proteinfoldning
Et protein er i princippet bare en lang kæde af aminosyrer: hvis du forestiller dig en lang kæde med flere hundrede led – hvert led svarer til en aminosyre – så prøv at forestille dig hvor mange måder denne kæde kan foldes på (hvor mange forskellige ”konformationer” der findes). Der er ret mange muligheder! Men med aminosyrer er det endnu mere indviklet, bl.a. fordi hver aminosyre har en sidekæde (det er sidekæden der afgør hvilken aminosyre der er tale om). Hvis man ikke kender andet end rækkefølgen på aminosyrerne i kæden, er det derfor ekstremt svært at finde ud af, hvordan proteinet skal foldes – selv med al den computerkraft forskere har til rådighed i dag, er det oftest umuligt at beregne hvilken foldning, der er den rigtige. 63
4+4 ph.d.
Når man er færdig med sin bachelor-uddannelse, har man mulighed for at tage en 2-årig kandidat-uddannelse og derefter en 3-årig ph.d.-uddannelse hvis man vil forsætte med at læse videre. Det er dog ikke den eneste mulighed: sidste år af kandidaten, som normalt går med at skrive speciale (med mindre man kun har et halvårigt speciale), kan man dog kombinere med en ph.d., således at man starter på sin ph.d. allerede efter 1. år af kandidaten – dermed tager ph.d.-uddannelsen 4 år, og dette er den såkaldte ”4+4-ordning”. Når man følger 4+4-ordningen skal man ikke skrive speciale, men man har i stedet en ”kvalificerende eksamen” efter 2. år på ph.d.-uddannelsen, som gør det ud for specialet, og giver kandidatgraden.
Hen imod slutningen af mit første år på kandidaten fik Ilia råd til at ansætte endnu en ph.d.-studerende, og denne gang fik jeg stillingen – man kan nemlig starte som ph.d.-studerende efter første år på kandidaten (den såkaldte 4+4-ordning, se faktaboks). Da jeg startede var jeg stadig i gang med cryptochrome-foldningsprojektet, men jeg startede også på en række andre projekter, og har i det hele taget ikke haft tid til at kede mig. Der var på det tidspunkt primært to problemer med foldningsprojektet: udover FAD indeholdt denne type cryptochrome også et ATP-molekyle, som desuden havde en magnesium-ion, Mg2+, koordineret (bundet). Dette ATP-Mg2+-kompleks sad mellem CCT-delen, som skulle foldes, og den del af proteinet som strukturen var kendt for. CCT-delen havde derfor rigtig mange muligheder for at binde til Mg2+ionen, men vi havde ingen idé om hvordan den ion skulle bindes. Det andet problem bestod i, at vores struktur ikke var stabil, dvs. systemet var ikke i ligevægt – ved længere simuleringer kunne der stadig forekomme konformationsændringer. For at få systemet i ligevægt, altså opnå en stabil struktur, vil det kræve en simulering på mindst nogle mikrosekunder, og til sammenligning får jeg typisk omkring 40 ns per dag fra en MD-simulering på Abacus-supercomputeren der står på SDU (se faktaboks om MD-simuleringer og Abacus). Cirka en måneds tid efter, at jeg startede som ph.d.-studerende, var min gruppe med til at arrangere en workshop i MD-simuleringer. Den blev afholdt af en gruppe fra USA, og vi endte med at diskutere cryptochrome-projektet med en af instruktorerne. Dette førte til et samarbejde, idet han havde arbejdet i flere år med koordinering af Mg2+ til GTP (stort set det samme som ATP-Mg2+-komplekset, idet fosfat-grupperne er koordineret til ionen). Desuden havde han mulighed for at lave en anden type simuleringer (coarse graining af vand-molekylerne), hvor vi skulle kunne nå op på at simulere omkring 150 ns per dag, og havde derudover også noget software, der kan foreslå foldninger af proteiner. Vha. dette lavede han tusindvis af nye strukturer for CCT-delen til os – så var det bare et spørgsmål om at finde de bedste! Det tog noget tid at finde de bedste strukturer, og de skulle alle bearbejdes en del før de kunne bruges. Derudover skulle den bedste Mg2+-koordinering bestemmes, og der var i det hele taget mange detaljer og komplikationer, der skulle tages højde for. Vi er nu endt med 3 strukturer, udover den første vi selv konstruerede, som ser lovende ud. Desværre har det for nyligt vist sig, at den hurtigere simuleringsform (med op til 150 ns per dag) alligevel ikke fungerer for lige netop vores system, så vi skal have fundet et alternativ, så vi kan få nogle stabile strukturer – i princippet kan det sagtens klares med almindelige MD-simuleringer på Abacus-supercomputeren, men det vil kræve rigtig mange ressourcer og dermed være rigtig dyrt. 64
Hjerneblod l
6/2016
I april gik turen til London, hvor konferencen RIN16 (Royal Institute of Navigation), om hvordan dyr navigerer, blev afholdt. Magnetoreception udgjorde mindst en tredjedel af programmet, men ikke kun i forbindelse med fugle – der er nemlig også mange andre dyr, som benytter Jordens magnetfelt til at navigere efter, f.eks. havskildpadder. Udover magnetoreception var der også forskere der arbejdede med alt fra ørkenmyrer til sæler, giftfrøer i junglen, en sjov fisk med en speciel elektrisk sans, en der havde testet biers syn, og meget, meget andet. Der var dog en overvægt at biologer, og sammen med vores samarbejdspartnere fra Oxford var vi næsten de eneste teoretikere på konferencen – og de eneste der beskæftigede os med MD-simuleringer. Vi havde til gengæld et oplæg om netop MD-simuleringer, og jeg havde taget en poster med omkring cryptochrome-projektet (se næste side). Det var en rigtig spændende oplevelse, hvor jeg lærte utroligt meget, og mødte en masse spændende mennesker – de eneste minus var frokosten, som primært bestod af kedeligt hvidt toastbrød. Men det var jo trods alt i England. Cirka to måneder efter konferencen i England gik turen til Middelfart. Her var jeg med til Årsmødet 2016 i Dansk Fysisk Selskab, hvor jeg skulle holde et kort oplæg omkring kvantebiologi. Det blev med fokus på mit eget forskningsområde – magnetoreception – og var i det hele taget særligt spændende idet det var første gang, at jeg skulle ud og holde et oplæg for andre fysikere. Jeg benyttede lejligheden til at tage min cryptochrome-poster med, og jeg tror faktisk at jeg fik den fremvist til væsentlig flere personer på en enkel aften i Middelfart, end i løbet af de tre dage i London, så jeg må nok konstatere at fysikere var en bedre målgruppe end biologer – i hvert lige i forhold til dette projekt. I slutningen af august fik vi besøg af vores samarbejdspartner fra USA, og fik diskuteret projektet igennem – han har kørt en lang række simuleringer, og jeg mangler nu ”bare” at få analyseret data fra alle disse: men det ser efterhånden ud til, at vi snart har nogle stabile strukturer med en fornuftig koordinering af Mg2+-ionen. Efter at have arbejdet på projektet i over et år, er målet altså endelig indenfor rækkevidde, og jeg regner med at vi snart kan gå i gang med at skrive en videnskabelig artikel om projektet. Ø
Der er mange forskellige aminosyrer fra CCT-delen af cryptochrome, der kan binde til Mg2+-ionen, der er bundet af fosfat-grupperne i ATP, og selv vandmolekyler kan endda være vigtige her! Vi ved kun, at nogle argininer fra CCT-delen skal binde til ATP - her ses en enkelt af dem.
65
MD-simuleringer og Abacus:
Proteiner er en særlig vigtig klasse af biologiske molekyler, som kan have mange forskellige funktioner i levende organismer – og en metode til at undersøge hvordan de fungerer, er Molecular Dynamics-simuleringer. En MD-simulering er en klassisk approksimation, hvor man beregner kræfterne på alle partikler i systemet og løser Newtons 2. lov – dermed kan man beregne hvordan partiklerne vil bevæge sig. I mine simuleringer indgår alle de tusindvis af atomer i cryptochrome-proteinet, og endnu flere atomer fra vandmolekyler (jeg har ca. 90000 atomer i mine simuleringer). Det kræver derfor rigtig meget computerkraft at lave sådan en simulering, og vi bruger derfor supercomputeren Abacus – dermed har vi mulighed for at bruge f.eks. 20 hurtige computere (nodes) på én gang til at køre en simulering, og alligevel kan det tage flere dage at køre en simulering! o
Claus Nielsen er 25 år gammel og har i løbet af sin tid på universitetet studeret både fysik, matematik og kemi. I dag er han i gang med en ph.d. i fysik hos QuantBio-gruppen ledet af Ilia Solov’yov. For mere info, se: www.quantbiolab.com
Baggrunden benyttet i denne artikel forestiller en vandboks fra en af Claus’ simuleringer.
68
Hjerneblod l
6/2016