Agua activada por plasma como alternativa a los desinfectantes químicos en el procesado de productos by Horticultura & Poscosecha

Agua activada por plasma como alternativa a los desinfectantes químicos en el procesado de productos vegetales Mercedes López, Paula Fernández-Gómez, Miguel Prieto, Avelino Álvarez-Ordóñez y Márcia Oliveira Departamento de Higiene y Tecnología de los Alimentos, Universidad de León

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2021

Agua activada por plasma como alternativa a los desinfectantes químicos en el procesado de productos vegetales

Mercedes López*, Paula Fernández-Gómez, Miguel Prieto, Avelino Álvarez-Ordóñez y Márcia Oliveira mmlopf@unileon.es Departamento de Higiene y Tecnología de los Alimentos, Universidad de León

Índice 1. Introducción .............................................................................................................................. 1 2. Composición química y propiedades físico-químicas del PAW ................................................. 2 3. Mecanismo de inactivación microbiana por PAW .................................................................... 3 4. Factores críticos en la generación de PAW ............................................................................... 5 4.1. Equipo ................................................................................................................................ 5 4.2. Energía aplicada ................................................................................................................. 6 4.3. Gas precursor ..................................................................................................................... 6 4.4. Tiempo de activación ......................................................................................................... 7 4.5. Características del agua...................................................................................................... 7 5. Condiciones de aplicación del PAW .......................................................................................... 8 5.1. Tiempo de tratamiento ...................................................................................................... 8 5.2. Tratamiento con o sin agitación ......................................................................................... 9 5.3. Temperatura de tratamiento ............................................................................................. 9 6. Descontaminación microbiana de productos vegetales ........................................................... 9 7. Conclusiones............................................................................................................................ 14

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1. Introducción Las frutas y hortalizas forman parte de una dieta equilibrada ya que no sólo contribuyen a prevenir trastornos ocasionados por la falta de micronutrientes, sino que también reducen el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares y distintos tipos de cáncer. Además de los aspectos beneficiosos sobre la salud, otros factores sociales y demográficos, como el cambio del estilo de vida de los consumidores y la incorporación de la mujer al mundo laboral están influyendo positivamente en la popularidad de los productos de IV Gama, habiéndose producido, en los últimos años, un rápido aumento de su producción y consumo. Aunque las frutas y hortalizas tenían, hasta hace relativamente poco tiempo, un interés limitado en relación a la seguridad alimentaria, se han documentado numerosos casos de enfermedades de origen alimentario de etiología diversa transmitidos por su consumo. Las fuentes de contaminación microbiana incluyen factores de precosecha, como el agua de riego, el abonado con estiércol, la transmisión por animales y el viento, así como factores poscosecha, tales como la manipulación intensa, o el contacto con superficies y utensilios de trabajo, agua de lavado y/o envases contaminados, siendo aún mayor el riesgo de contaminación que presentan los productos de IV Gama. Cuando las frutas y hortalizas son peladas, cortadas y/o ralladas, la liberación de fluidos celulares proporciona un medio nutritivo para el crecimiento microbiano, existiendo, además, un mayor riesgo de contaminación cruzada durante su manipulación y procesado. A pesar de los avances que se están llevando a cabo, principalmente en el sector de la IV Gama, para reducir los riesgos de contaminación microbiana, los productos hortofrutícolas se han visto involucrados en brotes de toxiinfecciones alimentarias. En este sentido, diversas frutas y hortalizas, incluyendo melones, tomates, papaya, fresas, mangos, pepino, espinacas y lechugas, han estado implicados en brotes de salmonelosis y colitis hemorrágicas causados por cepas de Escherichia coli productoras de verotoxinas, principalmente pertenecientes al serotipo O157:H7 (CDC, 2007, 2011 y 2018). Asimismo, diversos brotes de listeriosis han estado asociados con el consumo de lechuga, manzana y melones contaminados con Listeria monocytogenes (Buchanan et al., 2017; CDC, 2016; Zhu et al., 2017). Los métodos convencionales utilizados para la higienización de los productos vegetales, tanto enteros como de IV Gama, incluyen tratamientos físicos y químicos que se aplican al producto, equipos de procesado e, incluso, a las superficies de trabajo. No obstante, debe tenerse en cuenta que, en general, cualquier método de descontaminación microbiana presenta ventajas y limitaciones, en función de una serie de factores, como son las características de la superficie del producto o equipo, la fisiología de los microorganismos diana, el tiempo de exposición, la concentración del agente desinfectante a utilizar, el pH y la temperatura de lavado. En la actualidad, el cloro, en forma de hipoclorito sódico, es el desinfectante más ampliamente utilizado en la industria de frutas y hortalizas frescas. Se emplea a unas concentraciones de 50200 ppm con un tiempo de contacto de 1-2 minutos (Banach et al., 2015). Aunque es un método de bajo coste, fácil de preparar, aplicar y monitorizar, resulta poco efectivo, muy corrosivo, irritante para el manipulador y nocivo para el medio ambiente. Otros inconvenientes que presenta el cloro son su rápida degradación en contacto con materia orgánica y la formación de subproductos nocivos para la salud por su potencial mutagénico y cancerígeno (Gil et al., 2016), lo que ha conducido a que su uso esté prohibido en algunos países, como Alemania, Holanda, Dinamarca, Suiza y Bélgica. Por ello, se requieren otras alternativas que resulten más efectivas

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en la inactivación de los microorganismos, más seguras para el consumidor y más respetuosas con el medio ambiente. El agua activada por plasma atmosférico no térmico es una de las alternativas que está siendo investigada en la actualidad, considerándose, además, como muy prometedora. El plasma atmosférico no térmico se genera por excitación de gases tras la aplicación de suficiente energía, mediante descargas eléctricas a presión atmosférica y temperatura ambiente. Está constituido, además de por electrones e iones, por radicales libres, átomos y moléculas en estado o no de excitación y fotones ultravioleta, estando presentes especies reactivas de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS), tales como ozono, superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo y peroxilo, nitritos y nitratos, con una demostrada capacidad para inactivar microorganismos al provocar daños importantes en la membrana y pared celular, así como en el ADN y las proteínas (López et al., 2019). La aplicación de una descarga de plasma a un medio líquido, como el agua, conduce a la presencia de estas especies químicas reactivas en la propia agua, generándose así la denominada agua activada por plasma (PAW, Plasma-Activated Water). Son numerosos los estudios en los que se ha demostrado que el PAW resulta muy eficaz en la inactivación de microorganismos tanto alterantes como patógenos, incluyendo bacterias, mohos, levaduras e, incluso, esporos bacterianos y fúngicos, en diferentes productos vegetales (Ma et al., 2015; Chen et al., 2019; Choi et al., 2019; Khan y Kim, 2019; Liao et al., 2019; Zhao et al., 2019; MachadoMoreira et al., 2021).

2. Composición química y propiedades físico-químicas del PAW El PAW presenta una composición química y unas propiedades físico-químicas diferentes a las del agua. El tratamiento del agua con plasma, además de inducir la presencia de ROS y de RNS, crea un ambiente ácido y provoca cambios en el potencial de óxido-reducción y conductividad (Figura 1).

Figura 1. Interacción del plasma con el agua durante la generación de agua activada por plasma (PAW). Aumento de la conductividad eléctrica (CE) y del potencial de óxido-reducción (POR) y descenso de pH

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Las especies químicas reactivas neutras con una larga vida generadas en el plasma, como el ozono, el oxígeno atómico, el peróxido de hidrógeno y los óxidos de nitrógeno (NO2, N2O3, N2O5, N2O4), a diferencia de las especies cargadas con una vida corta, tendrían la capacidad no sólo de difundir a través de líquido sino también de interaccionar posteriormente entre sí o con el agua, dando lugar a la formación de nuevas especies reactivas. Por ejemplo, la coexistencia de ozono y peróxido de hidrógeno en agua da lugar a especies altamente reactivas, como radicales hidroperóxido e hidroxilo. El oxígeno atómico al reaccionar con el agua puede generar radicales hidroxilo y oxígeno singlete (Surowsky et al., 2014). Por otra parte, la interacción de óxido nítrico y superóxido produce peroxinitrito, compuesto muy reactivo que puede difundir fácilmente a través de las membranas celulares (Ercan et al., 2016). La presencia de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno, incluyendo radicales hidroxilo, oxígeno singlete, anión superóxido, peróxido de hidrógeno, ozono, así como óxido nítrico y sus derivados formados con agua, tales como nitratos, nitritos y peroxinitritos, ha sido detectada utilizando diversas técnicas analíticas (Tian et al., 2015; Zhang et al., 2016; Choi et al., 2019; Khan y Kim, 2019; Vaka et al., 2019; Xiang et al., 2020; Xu et al., 2020). Además, las especies reactivas presentes en el PAW modifican las propiedades físico-químicas del agua. En este sentido, se ha comprobado en repetidas ocasiones que el tratamiento de agua induce aumentos tanto en su conductividad eléctrica como en su potencial de óxido-reducción (Ma et al., 2015, 2016; Tian et al., 2015; Xu et al., 2016; Joshi et al., 2018; Choi et al., 2019; Wang et al., 2021). Así, por ejemplo, se ha observado un cambio del potencial de óxido-reducción del agua desde 270 mV a 450 y 550 mV, así como de la conductividad eléctrica, alcanzando valores de 350 y 450 µS/cm tras 10 y 20 minutos de tratamiento, respectivamente (Ma et al., 2015). Asimismo, son diversos los autores que han observado la rápida acidificación que exhibe el PAW durante su generación, debida a la disociación del agua que causa el tratamiento por plasma, así como a la formación de ácido nítrico y ácido nitroso si el nitrógeno está disponible, bien del aire ambiente o del propio gas de trabajo. Este descenso del pH ha sido descrito en diversos estudios (Ma et al., 2015, 2016; Joshi et al., 2018; Lin et al., 2019; Choi et al., 2019; Vaka et al., 2019; Wang et al., 2021) en los que se ha demostrado que el pH del agua tratada por plasma se reducía gradualmente con el tiempo de tratamiento hasta valores de pH próximos a 3,0.

3. Mecanismo de inactivación microbiana por PAW Aunque son numerosos los estudios en los que se ha demostrado que el PAW resulta una estrategia muy eficaz en la inactivación de una amplia variedad de microorganismos, aún no se ha conseguido esclarecer el mecanismo responsable de su efecto letal. No obstante, parece existir un acuerdo en que son las ROS y RNS presentes las principales responsables de la inactivación microbiana, considerándose los daños ejercidos en las envolturas celulares como la principal causa de la muerte celular, al representar la primera barrera de contacto con las especies químicas reactivas, que provocarían una pérdida de su funcionalidad y/o integridad derivada de un efecto oxidativo. Las especies reactivas podrían ejercer un potente efecto oxidativo sobre todos los componentes que constituyen las membranas celulares, aunque especialmente sobre los ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos (Laroussi y Leipold, 2004), ya que resultan muy susceptibles

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a estos agentes, especialmente a los radicales libres, sufriendo fenómenos de peroxidación lipídica, que podrían comprometer la viabilidad celular al modificar las propiedades de las membranas, disminuyendo su fluidez y alterando su permeabilidad e incluso su integridad (Xu et al., 2020). La peroxidación lipídica es una reacción en cadena que se inicia con el ataque de las especies reactivas del oxígeno (o cualquier especie reactiva) a un ácido graso insaturado, extrayendo un átomo de hidrógeno de un grupo metileno (-CH2), dando lugar a la formación de un radical lipídico (L*) que puede reaccionar rápidamente con una molécula de oxígeno para dar un radical peroxilo (LOO*). A su vez, estos radicales pueden extraer átomos de hidrógeno de otros lípidos y convertirse en hidroperóxidos (LOOH), que sufren fenómenos químicos degradativos que pueden ser catalizados por iones metálicos para dar compuestos de degradación muy tóxicos, como radicales alcoxilo (LO*), peroxilo e hidroxilo y aldehídos muy reactivos, incluyendo malondialdehído y 4-hidroxinonenal. De hecho, el malondialdehído es comúnmente utilizado como marcador biológico del estrés oxidativo, habiéndose comprobado un aumento del contenido de este compuesto durante la exposición de Saccharomyces cerevisiae a la acción del PAW (Xu et al., 2020). Es posible que estos compuestos reactivos intermediarios se comporten como mensajeros tóxicos secundarios de las especies reactivas presentes en el PAW, trasladando así su actividad a través de la membrana celular y amplificando sus daños letales en el interior celular (Joshi et al., 2011). Además, muchos de ellos presentan una mayor estabilidad que muchas especies reactivas producidas en el plasma y, en consecuencia, con una acción citotóxica mucho más prolongada, teniendo además la capacidad de difundirse desde su lugar de producción hacia moléculas más distantes de la membrana, como el ADN (Yost y Joshi, 2015), interaccionando con los nucleótidos e induciendo importantes modificaciones al formar aductos y enlaces cruzados (del Río et al., 2005), dificultando el crecimiento celular y la reparación del ADN (Alkawareek et al., 2014). Además, algunos de los aldehídos generados en el proceso de peroxidación, incluido el malondialdehído, son capaces de formar entrecruzamientos en las cadenas polipeptídicas de las proteínas, afectando a la actividad de las enzimas y proteínas asociadas a la membrana (Xu et al., 2020). La existencia de daños en las envolturas celulares de diversos microorganismos, incluyendo Staphylococcus aureus, S. Enteritidis, E. coli O157:H7, Pseudomonas deceptionensis, S. cerevisiae y esporas de Aspergillus flavus, ha sido evidenciada a partir de la información obtenida a través de diferentes técnicas analíticas, permitiendo comprobar que tras la exposición al PAW, éstos muestran diferentes alteraciones morfológicas, como disminución del tamaño, redondeamiento, aparición de superficies rugosas, presencia de crestas, con poros en sus membranas o con envolturas completamente rotas (Tian et al., 2015; Shen et al., 2016; Zhang et al., 2016; Xiang et al., 2018; Lin et al., 2019; Los et al., 2020; Liu et al., 2021). No obstante, parece que las envolturas celulares no son la única estructura diana, ya que se ha documentado un aumento del contenido de especies reactivas de oxígeno en el interior de los microorganismos durante su exposición al PAW (Tian et al., 2015; Xu et al., 2020; Liu et al., 2021). Estas especies químicas son capaces de interaccionar con todos los componentes intracelulares, especialmente con el ADN y las proteínas. Los daños originados en estas estructuras afectarían el metabolismo y las funciones fisiológicas microbianas, comprometiendo así la viabilidad celular (Zhang et al., 2016). De hecho, se ha demostrado que la exposición de S. aureus y S. cerevisiae al PAW originó una importante degradación de la estructura del ADN (Zhang et al., 2016; Xu et al., 2020).

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A pesar del valor ácido que presenta el PAW, varios autores han comprobado que la exposición de diversos microorganismos en agua acidificada hasta los valores de pH alcanzados en los PAWs utilizados en sus trabajos, apenas tenía efecto letal, tras un mismo tiempo de tratamiento (Chen et al., 2009; Ercan et al., 2013; Frías et al., 2020). Así, Frías et al. (2020) comprobaron que un tratamiento del agua desionizada con un plasma a base de aire durante 10 minutos reducía el pH hasta valores de 3,8 y conseguía una inactivación de 0,6 unidades logarítmicas de L. monocytogenes en tofu, comprobando, asimismo, que la inmersión de este producto inoculado con el patógeno en agua acidificada, con ácido clorhídrico, hasta pH 3,8 no mostraba ningún efecto bactericida. Por ello, se ha sugerido que la acidificación no es la causa principal de la inactivación conseguida en el tratamiento con PAW (Chen et al., 2009; Ercan et al., 2013; Frías et al., 2020). En consecuencia, se especula sobre la posibilidad de que los bajos valores de pH contribuyan a la estabilización de algunas de las especies reactivas presentes (Julák et al., 2012; Yost y Joshi, 2015) o a la formación de nuevos compuestos antimicrobianos (Naïtali et al., 2010), así como a un posible efecto sinérgico entre la acidez y estas especies en la inactivación microbiana, al resultar estos valores de pH más favorables para la penetración de las especies reactivas a través de las paredes celulares o bien a que la presencia de especies reactivas sensibilice a los microorganismos a los ambientes ácidos (Oehmigen et al., 2010).

4. Factores críticos en la generación de PAW 4.1. Equipo El PAW se puede obtener a partir de diversas fuentes de generación de plasma atmosférico no térmico que aplican diferentes tipos de descarga eléctrica (descarga de corona, descarga de arco, descarga de barrera dieléctrica (DBD), radiofrecuencia, microondas, chorro de plasma,...) para provocar la ionización del gas precursor, aunque las configuraciones basadas en chorro de plasma (Ma et al., 2015, 2016; Xu et al., 2016; Zhao et al., 2018; Chen et al., 2019; Kang et al., 2019; Lin et al., 2019; Muhammad et al., 2019; Qian et al., 2019; Frías et al., 2020; Liu et al., 2020; Xiang et al., 2019, 2020) y DBD (Vaka et al., 2019; Han et al., 2020; Wang et al., 2021) son las más ampliamente utilizadas en investigación alimentaria, debido a su facilidad de construcción y adopción. Además, la activación del agua puede realizarse por dos procedimientos diferentes: aplicando la descarga de plasma sobre la superficie del agua, que es el más ampliamente utilizado en los estudios de descontaminación de los alimentos (Ma et al., 2015, 2016; Guo et al., 2017; Joshi et al., 2018; Choi et al., 2019; Muhammad et al., 2019; Xiang et al., 2019, 2020), o bien llevando a cabo la descarga de plasma en el propio agua (Fröhling et al., 2018; Chen et al., 2019; Lin et al., 2019; Liu et al., 2020; Royintarat et al., 2020), que pueden dar lugar a PAWs con distintas características y, en consecuencia, con diferentes propiedades antimicrobianas (Tian et al., 2015). Estos autores encontraron, empleando la misma fuente de generación de plasma, que el PAW obtenido aplicando el plasma en el seno del agua presentaba, en comparación con el preparado suministrando el plasma superficialmente, valores de potencial de óxido-reducción y de conductividad más altos, así como una mayor efectividad en la inactivación de S. aureus (5,0 vs 1,2 ciclos logarítmicos), fenómeno que atribuyeron al mayor contenido intracelular de especies reactivas de oxígeno.

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4.2. Energía aplicada El nivel de voltaje y potencia utilizada para ionizar los gases a presión atmosférica, al determinar la energía aplicada y, en consecuencia, las especies generadas y su cantidad, tienen un gran efecto en las propiedades antimicrobianas del PAW. Se ha demostrado que un incremento de la potencia mejora la eficacia letal de un tratamiento con PAW. Un aumento de este parámetro, de 16 a 36 W (Vaka et al., 2019) y de 50 a 60 W (Lin et al., 2019) en la obtención de PAW permitió reducir, tras 2 minutos de exposición, la población bacteriana naturalmente presente en hojas de espinacas y la de S. Enteritidis inoculada superficialmente en huevos en 0,4 y 1,2 unidades logarítmicas adicionales, respectivamente. En estos trabajos se observó que al incrementar la potencia de la descarga el pH del PAW resultante descendía, mientras que la concentración de especies químicas reactivas de larga vida producidas y, en concreto, el contenido de peróxido de hidrógeno, nitratos y nitritos, aumentaba, correlacionándose directamente con el nivel de inactivación bacteriano logrado. Asimismo, se ha comprobado que, manteniendo la potencia constante, un aumento del voltaje de la descarga utilizada para la activación del agua, de 6 a 8 kV (Chen et al., 2019; Liu et al., 2020), mejora las propiedades antimicrobianas del PAW en la descontaminación de manzana y pera cortadas, probablemente, al aumentar los niveles de las especies químicas reactivas generadas en el plasma y, por tanto, en el PAW. Por ejemplo, cuando el voltaje utilizado pasaba de 6 a 8 kV el efecto letal conseguido sobre las bacterias aerobias totales, mohos y levaduras presentes en pera cortada se incrementó hasta en 0,43 unidades logarítmicas tras un tratamiento de 5 minutos y almacenamiento posterior a 4 °C durante 12 días (Chen et al., 2019). Sin embargo, un mayor aumento de este parámetro de procesado (hasta 10 kV) en la activación del agua se tradujo en una pérdida en la actividad antimicrobiana del PAW (Chen et al., 2019; Liu et al., 2020). De hecho, las tasas de inactivación conseguidas para los grupos microbianos ensayados fueron prácticamente similares a las obtenidas con la potencia más baja estudiada (6 kV). Esta pérdida de efectividad del PAW al emplear altos voltajes en la descarga eléctrica podría deberse a que en estas condiciones se generasen una menor cantidad de especies químicas reactivas y/o que algunas de ellas sufriesen una mayor degradación (Chen et al., 2019; Liu et al., 2020). 4.3. Gas precursor Otra variable a tener en cuenta en la efectividad antimicrobiana del PAW en la descontaminación de los alimentos es el tipo de gas utilizado para generar el plasma. Se han empleado diversos gases, incluyendo nitrógeno (Zhou et al., 2019), oxígeno (Zhou et al., 2019), gases nobles, como argón (Royintarat et al., 2020) y helio (Zhou et al., 2019), mezclas de diferentes gases (Ma et al., 2015; Xu et al., 2016), siendo, por razones económicas y logísticas, el aire (Ma et al., 2016; Joshi et al., 2018; Chen et al., 2019; Vaka et al., 2019; Xiang et al., 2019; Zhao et al., 2019; Liu et al., 2020) el más ampliamente utilizado. Aunque a partir de los estudios existentes se pone de manifiesto que todos ellos resultan efectivos en la obtención de PAW con propiedades antimicrobianas, no se conoce cuál de ellos proporciona una mayor capacidad descontaminante. Tan sólo existe un estudio en la bibliografía en el que se ha comparado el efecto ejercido por la composición del gas utilizado (nitrógeno, helio, oxígeno y aire) en la preparación del PAW sobre su posterior eficacia en la inactivación de los microorganismos presentes en los alimentos (Zhou et al., 2019). Estos autores comprobaron que, en las mismas

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condiciones de activación del agua, el PAW obtenido a partir de un plasma de aire resultaba el más efectivo en la descontaminación de germinados de semillas de “mung bean” (Vigna radiata), llegando a alcanzar una inactivación microbiana de 5,17 unidades logarítmicas frente a los 4,29, 2,80 y 2,04 ciclos logarítmicos conseguidos con los PAWs generados con plasmas de oxígeno, helio y nitrógeno, respectivamente, atribuyendo este fenómeno al hecho de que el PAW-aire mostraba los valores de potencial de oxidación-reducción más altos (650 mV) y de pH más bajos (3,5), así como un contenido de ROS y RNS más alto (hasta 4,26 mM). 4.4. Tiempo de activación Otro factor que determina marcadamente la efectividad del PAW como agente de descontaminación microbiana de los alimentos es el tiempo de exposición del agua a la acción del plasma. En líneas generales, se ha comprobado en repetidas ocasiones que tiempos de tratamiento más prolongados conducen a cambios más intensos en las propiedades físicoquímicas del PAW, incluyendo valores de pH más ácidos, y a un aumento en la concentración de especies químicas reactivas presentes (Ma et al., 2015; Choi et al., 2019; Khan y Kim, 2019; Lin et al., 2019; Vaka et al., 2019; Wang et al., 2021), así como a la consecución de mayores tasas de inactivación para diferentes microorganismos alterantes y patógenos en diversos alimentos de origen vegetal, como fresas, uvas, repollo, chufas y hojas de espinacas (Ma et al., 2015; Guo et al., 2017; Choi et al., 2019; Khan y Kim, 2019; Muhammad et al., 2019; Vaka et al., 2019). Por ejemplo, se ha observado que la exposición de fresas durante 15 minutos a un PAW previamente activado durante 10 minutos permitía reducir la población de S. aureus en 1,5 unidades logarítmicas, mientras que si el tiempo de tratamiento del agua con plasma se prolongaba a 20 minutos se conseguía un mayor efecto letal, 2,2 ciclos logarítmicos (Ma et al., 2015). Un aumento del tiempo de activación del agua desionizada de 3 a 7 minutos resultaba en un PAW con mejores propiedades bactericidas frente a Klebsiella pneumoniae en chufas, incrementando las tasas de inactivación observadas en 2,26 unidades logarítmicas (Muhammad et al., 2019). Resultados similares han sido descritos en la descontaminación de productos de origen animal (Kang et al., 2019; Lin et al., 2019; Wang et al., 2021). 4.5. Características del agua Se han utilizado diferentes tipos de agua para la preparación de PAW, incluyendo agua de la red de suministro (Fröhling et al., 2018; Lin et al., 2019), agua obtenida por ósmosis inversa (Lin et al., 2019) y, muy especialmente, agua destilada (Ma et al., 2015, 2016; Guo et al., 2017; Joshi et al., 2018; Chen et al., 2019; Choi et al., 2019; Liu et al., 2020; Xiang et al., 2020) y agua desionizada (Zhao et al., 2018; Muhammad et al., 2019; Frías et al., 2020; Royintarat et al., 2020), resultando, en todos los casos, efectivas en la descontaminación superficial de los alimentos. Sin embargo, su efectividad en la inactivación microbiana se ve afectada por la dureza del agua utilizada, así como por las condiciones de almacenamiento del PAW. En un estudio reciente se ha podido comprobar que las propiedades físico-químicas del PAW están estrechamente relacionadas con la dureza del agua utilizada (Lin et al., 2019). Estos autores observaron que el PAW preparado con agua dura mostraba valores bajos de potencial de óxidoreducción y altos de pH, concluyendo que estas características podrían reducir su capacidad para inactivar microorganismos. Por otra parte, en la mayoría de los trabajos en los que se ha estudiado el potencial del PAW como estrategia descontaminante de los alimentos, este agente se ha aplicado inmediatamente

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tras su generación. Aunque en alguna ocasión se ha señalado que las propiedades antimicrobianas adquiridas por el PAW persisten durante un tiempo prolongado, hasta de 4 semanas (Julák et al., 2012), parece que la efectividad del PAW en la inactivación de microorganismos se va reduciendo progresivamente tras su preparación, en una magnitud que depende tanto del tiempo como de la temperatura de almacenamiento. En este sentido, Lin et al. (2019) comprobaron que, tras la aplicación de idénticos tratamientos, las tasas de inactivación conseguidas frente a S. Enteritidis inoculada superficialmente en huevos con el PAW recién preparado (3,8 unidades logarítmicas) fueron superiores a las obtenidas tras su almacenamiento durante 24 horas a 4 °C (2,1 unidades logarítmicas). Además, estos autores pusieron de manifiesto que el almacenamiento del PAW en estas condiciones iba acompañado de un importante descenso del valor del potencial de óxido-reducción y una ligera acidificación, por lo que la pérdida de la efectividad antibacteriana observada puede estar relacionada con la degradación de las especies químicas reactivas generadas en el PAW con el transcurso del tiempo. Además del tiempo transcurrido tras la preparación del PAW, también se ha puesto de manifiesto que la temperatura de almacenamiento utilizada influye en su posterior efectividad antimicrobiana. Así, Shen et al. (2016) investigaron, hasta 30 días, los efectos ejercidos por la temperatura de almacenamiento (25, 4, -20 y -80 °C) tanto sobre las características fisicoquímicas del PAW como sobre su capacidad en la inactivación de S. aureus. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que el almacenamiento ocasionó una pérdida de su actividad antibacteriana, cuya magnitud aumentaba con la temperatura utilizada. Así, la aplicación de un tratamiento de 20 minutos con PAW recién obtenida permitía reducir la población de este patógeno en 5 unidades logarítmicas, mientras que el empleo de PAW almacenado durante 30 días a -80, -20, 4 y 25 °C ocasionó aproximadamente 3,5, 1,0, 1,0 y 0,75 ciclos logarítmicos de inactivación, respectivamente. Además, las concentraciones de H2O2 y NO2- presentes en la solución sólo disminuyeron significativamente a las temperaturas más altas de almacenamiento (-20, 4 y 25 °C). Sobre la base de estos resultados los autores propusieron -80 °C como temperatura de almacenamiento del PAW.

5. Condiciones de aplicación del PAW 5.1. Tiempo de tratamiento El tiempo de exposición de los alimentos al PAW ejerce, asimismo, una gran influencia sobre el grado de inactivación alcanzado. De forma similar al tiempo de activación del agua, se ha demostrado en numerosas ocasiones que, a medida que se prolonga el tiempo de exposición de los microrganismos a la acción del PAW aumenta también la efectividad de esta estrategia en la descontaminación de los alimentos, tanto de origen animal como de origen vegetal, crudos y procesados (Ma et al., 2015, 2016; Kang et al., 2019; Lin et al., 2019; Frías et al., 2020; Royintarat et al., 2020; Wang et al., 2021), al favorecer que las especies reactivas presentes en la solución interaccionen con los microorganismos. Un incremento del tiempo de inmersión de 5 a 15 minutos (Ma et al., 2015) aumentó las tasas de inactivación observadas para S. aureus en fresas de 1,7 a 2,3 unidades logarítmicas.

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5.2. Tratamiento con o sin agitación Otro factor importante que ejerce una gran influencia en la efectividad antimicrobiana del PAW es la agitación. En este sentido, en un trabajo reciente (Wang et al., 2021) se ha demostrado que tras la realización del tratamiento sin agitación los niveles de inactivación obtenidos para S. aureus eran de 1,75 unidades logarítmicas/gramo, que resultaron significativamente más bajos a los encontrados cuando el mismo tratamiento se llevaba a cabo en condiciones de agitación, 2,19 unidades logarítmicas/gramo. La aplicación de agitación, al igual que ocurre con otros métodos de descontaminación, podría suponer una fuerza mecánica que favorecería la separación de los microorganismos de la superficie de los alimentos y, de esta forma, acelerar su muerte. 5.3. Temperatura de tratamiento Aunque la mayor parte de los estudios en los que se ha evaluado la efectividad de esta estrategia de descontaminación se han realizado tratando los alimentos con PAW a temperatura ambiente, recientemente se ha demostrado que su eficacia en la inactivación microbiana puede potenciarse aumentando la temperatura exposición, incluso a temperaturas que resultan subletales para los microorganismos (Liao et al., 2019). Estos autores observaron que el tratamiento de arroz con PAW durante 1 minuto lograba reducir la población de esporos de Bacillus cereus en 0,72 unidades logarítmicas, mientras que, si la temperatura de tratamiento se elevaba a 40 o 55 °C, se lograban incrementar las tasas de inactivación para el patógeno esporulado en 0,82 y 1,40 ciclos logarítmicos, respectivamente).

6. Descontaminación microbiana de productos vegetales Se ha comprobado en repetidas ocasiones que el PAW resulta una estrategia muy eficaz en la descontaminación superficial de diversos productos de origen vegetal, incluyendo frutas y hortalizas, incluso cortadas, semillas y germinados (Tabla 1).

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Tabla 1. Resumen de los resultados obtenidos sobre la efectividad del PAW en la inactivación de microorganismos en distintos alimentos de origen vegetal e impacto de los tratamientos sobre diversos atributos de calidad Alimentos

Condiciones de generación del PAW

Composición química y propiedades físicoquímicas del PAW

Microorganismo-máxima reducción logarítmica

Repercusión sobre la calidad

Referencia

pH: 3 POR: 550 mV CE: 450 µS/cm

Staphylococcus aureus ~ 2,5 log Tras 15 minutos de exposición

No cambios en pH, color y firmeza

Ma et al. (2015)

Población bacteriana ~ 1,1 log Población de mohos ~ 1,1 log Tras 30 seg de exposición y 8 días de almacenamiento a 3 ºC

Aumento en la firmeza, color rojo y sólidos solubles totales: Retraso de la alteración

Ma et al. (2016)

Saccharomyces cerevisiae ~ 0,4 log Tras 30 minutos de exposición

No cambios en el color y contenido total de antocianinas

Guo et al. (2017)

Saccharomyces cerevisiae ~ 0,4 log Tras 30 minutos de exposición

No cambios significativos en los sólidos solubles totales, azúcares reductores, pH, acidez titulable, firmeza, color, polifenoles totales, vitamina C y propiedades antioxidantes

Xiang et al. (2020)

No evaluado

Joshi et al. (2018)

No cambios en el contenido en ácido ascórbico

Chen et al. (2019)

Frutas y hortalizas Fresas

Arándanos

Uvas

Plasma jet, 18 kV, 10 kHz, 98% Ar+2% O2 (5 L/min), 2 cm distancia, ADE, 20 min Plasma jet, 20 kHz, aire (260 L/h), 3 cm distancia, ADE, 25 min Plasma jet, 8,2 kV, aire (1,2 L/min), 1,5 mm distancia, ADE, 60 min

Plasma jet, 5 kV, 40 kHz, 750 W, aire (30 L/min), ADE, 90 seg

Lima

Pera cortada

Plasma jet, 295 V, 22,5 kHz, aire, 8,1 cm distancia, ADE, 5 min

Microplasma jet array, 8 kV, 9 kHz, aire (1 slm), AD, 10 min

pH: 3,53 POR: 511 mV CE: 125 µS/cm pH: 4,18 POR: 442 pH: 3,10 POR: 546 mV H2O2: 41,72 µmol/L NO2-: 1199,45 µmol/L NO3-: 1077,71 µmol/L pH: 3,1 POR: 534,52 mV CE: 324,19 µS/cm

Enterobacter aerogenes ~ 3,2 log Tras 3 minutos de exposición Bacterias ~ 0,7 log Mohos ~ 0,8 log Levaduras ~ 1,0 log Tras 5 minutos de exposición y 12 días de almacenamiento a 4 ºC

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Manzana cortada

Kiwi cortado

Tomates

Calabaza

Repollo

Hojas de espinacas

Bacterias aerobias ~ 1,1 log Mohos ~ 0,6 log Levaduras ~ 1,0 log Coliformes ~ 0,9 log Tras 5 minutos de exposición y 12 días de almacenamiento a 4 ºC

Microplasma jet array, 8 kV, 7 kHz, aire (1 slm), AD, 10 min

Reducción del pardeamiento superficial, sin afectar la firmeza y acidez titulable. No modificaciones en el contenido en polifenoles totales y ácido ascórbico

Liu et al. (2020)

La firmeza y los valores del parámetro b* del color se mantuvieron bien

Zhao et al. (2019)

Microplasma jet array, 10 kV, 8 kHz, aire (1 slm), ADI, 30 min

pH: 2,8 H2O2: 0,05 mmol/L

Plasma jet, 295 V, 22,5 kHz, aire, 8,1 cm distancia, ADE, 5 min

pH: 3,1 POR: 534,52 mV CE: 324,19 µS/cm

Enterobacter aerogenes ~ 4,7 log Tras 3 minutos de exposición

No evaluado

Joshi et al. (2018)

Plasma jet, 295 V, 22,5 kHz, aire, 8.1 cm distancia, ADE, 5 min

pH: 3,1 POR: 534,52 mV CE: 324,19 µS/cm

Enterobacter aerogenes ~ 1,0 log Tras 3 minutos de exposición

No evaluado

Joshi et al. (2018)

18 kV, 14,3 kHz, ADE, 120 min

pH: 2,4 POR: 798,33 mV CE: 2022,0 µS/cm H2O2: nd NO2-: 88,66 ppm NO3-: 394,28 ppm

Mínimas modificaciones en contenido en humedad y azúcares reductores, dureza y color

Choi et al. (2019)

Población bacteriana ~ 1,0 log Tras 2 minutos de exposición y 8 días de almacenamiento a 4 ºC

No cambios significativos en el color

Vaka et al. (2019)

Escherichia coli O157:H7 ~ 0,7 log Tras 30 minutos de exposición

Sin efectos adversos en el color, actividad antioxidante y contenido en clorofila, sólidos solubles y fenoles totales

Liu et al. (2021)

Descarga de barrera de superficie, 11 kV, 12 kHz, 36 W, aire, 44,8 mm distancia, AD, 20 min Plasma jet, 750 W, 5 kV, 40 kHz, aire (30 L/min), 5 mm distancia, ADE, 60 seg

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pH: 2,4 H2O2: nd NO2-: 320 mg/L NO3-: 7 mg/L

Staphylococcus aureus ~ 1,7 log Tras 8 días de almacenamiento a 4 ºC de las muestras pulverizadas superficialmente

Bacterias aerobias mesófilas ~ 2,0 log Bacterias ácido-lácticas ~ 2,2 log Mohos y levaduras ~ 1,8 log Coliformes ~ 0,9 log Listeria monocytogenes ~ 1,5 log Staphylococcus aureus ~ 1,3 log Tras 10 minutos de exposición

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Hojas de lechuga Iceberg

Hojas de lechuga Romana

Chufas

Glow plasma, O2 o aire, 10 min

Glow plasma, O2 or aire, 10 min

NO radical: 5×10−5 M OH radical: ~ 90×10−4 M O3: 0,5 ppm H2O2: 1,8×10−6 M NO radical: 5×10−5 M OH radical: ~ 90×10−4 M O3: 0,5 ppm H2O2: 1,8×10−6 M

Plasma jet, 650 W, aire (39 L/min), 5 cm distancia, ADIE, 10 min

pH: 2,71 POR: 575,67 mV H2O2: 0,0172 ng/L NO2-: 54,83 mg/L NO3-: 116,54 mg/L

Salmonella Typhimurium ~ 3,0 log Tras 3 minutos de exposición

Sin cambios importantes en el contenido en flavonoides (kaempferol y quercetina) y color

Khan y Kim (2019)

Salmonella Typhimurium ~ 2,6 log Tras 3 minutos de exposición

Sin cambios importantes en el contenido en flavonoides (kaempferol y quercetina) y color

Khan y Kim (2019)

Bacterias totales ~ 3,2 log Klebsiella pneumoniae ~ 3,5 log Tras 15 minutos de exposición

No cambios en el contenido de polifenoles y flavonoides y características sensoriales (color, apariencia y aroma)

Muhammad et al. (2019)

Semillas Alfalfa

“Mung bean”

Plasma jet, 10 kV, 20 kHz, aire (11 L/min), ADE, 10 min

pH: 2,93

Escherichia coli O104 ~ 1,7 log Tras 180 minutos de exposición

No evaluado

MachadoMoreira et al. (2021)

Plasma jet, 10 kV, 20 kHz, aire (11 L/min), ADE, 10 min

pH: 2,93

Salmonella Montevideo ~ 1,6 log Tras 180 minutos de exposición

No evaluado

MachadoMoreira et al. (2021)

Plasma jet, 750 W, 5 kV, 40 kHz, aire (30 L/min), 5 mm distancia, ADE, 30 seg

pH: 3,35 POR: 550,67 mV CE: 307,00 µS/cm H2O2: 20,17 µmol/L NO2-: 669,89 µmol/L NO3-: 644,33 µmol/L

No modificaciones significativas en las características sensoriales y contenido en polifenoles totales y flavonoides

Xiang et al. (2019)

Germinados

“Mung bean”

Bacterias aerobias totales ~ 2,3 log Mohos y levaduras ~ 2,8 log Tras 30 minutos de exposición

ADE, agua destilada estéril; AD, agua destilada; ADIE, agua desionizada estéril; ADI, agua desionizada. slm, litros estándar por minuto; nd, no detectado POR, potencial de óxido-reducción; CE, conductividad eléctrica

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De hecho, la potencialidad del PAW para mejorar la calidad microbiológica de los alimentos se puso de manifiesto por primera vez en el tratamiento de fresas (Ma et al., 2015), una fruta en la que por su compleja estructura superficial resulta difícil su descontaminación. Los resultados obtenidos mostraron que la inmersión de las fresas durante 15 minutos en PAW, previamente activada durante 20 minutos por plasma, permitió reducir la población de S. aureus en 2,5 unidades logarítmicas/gramo, un efecto bactericida comparable al que se consigue aplicando soluciones de hipoclorito sódico (Issa-Zacharia et al., 2010), no observándose, además, cambios ni en el color ni en la firmeza de las fresas tratadas. Posteriormente, este mismo grupo de investigación comprobó que, al final del periodo de almacenamiento a refrigeración (3 °C, 8 días), la población de bacterias y mohos presentes en arándanos lavados con PAW era 1,1 ciclos logarítmicos/gramo inferior en comparación con los controles (Ma et al., 2016). Asimismo, los autores encontraron que los productos tratados presentaban una mayor firmeza y un color rojo más intenso. También se ha demostrado que la utilización de PAW en el lavado de uvas lograba inactivar la población de S. cerevisiae presente en el producto en 0,4 unidades logarítmicas, sin afectar sus propiedades organolépticas y funcionales ni el valor nutritivo (Guo et al., 2017; Xiang et al., 2020). Por su parte, Joshi et al. (2018) evaluaron la eficacia del PAW (generado y aplicado en las mismas condiciones) en la inactivación de Enterobacter aerogenes en tomate, lima y calabaza, comprobando que el mayor efecto letal se conseguía en tomate (4,7 unidades logarítmicas) y el menor en calabaza (1,0 unidad logarítmica), diferencias que fueron atribuidas a la diferente rugosidad superficial de estos productos. La rugosidad de estos alimentos era, en efecto, mayor para la calabaza (101,50 ± 10,95 µm), seguida de la lima (18,76 ± 3,00 µm), y el valor más bajo lo presentaba el tomate (5,17 ± 0,53 µm). Además de la rugosidad de la superficie, otras características de la misma, como su hidrofobicidad, la presencia de irregularidades o la adsorción de especies reactivas podrían afectar a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos, lo que debería considerarse también a la hora de diseñar tratamientos de PAW eficaces. Asimismo, se ha comprobado el potencial que ofrece el PAW para mejorar la calidad microbiológica de frutas frescas cortadas, como peras (Chen et al., 2019), kiwis (Zhao et al., 2019) y manzanas (Liu et al., 2020), sin afectar sus atributos de calidad. Chen et al. (2019) concluyeron que el lavado de pera cortada con PAW permitía reducir los recuentos de bacterias, mohos y levaduras, entre 0,7 y 1,0 unidades logarítmicas, al cabo de 12 días de almacenamiento a 4 °C, sin ejercer un efecto adverso en el contenido en vitamina C. Al aplicar un tratamiento idéntico, Liu et al. (2020) obtuvieron tasas similares de inactivación (entre 0,6 y 1,1 unidades logarítmicas) para las poblaciones de bacterias aerobias, mohos, levaduras y coliformes presentes en manzana cortada. Zhao et al. (2019) encontraron que la pulverización superficial de PAW también resulta eficaz para inactivar la población de S. aureus en kiwi cortado, logrando alcanzar 1,7 reducciones logarítmicas tras su almacenamiento a 4 °C durante 8 días. Recientemente, se ha puesto de manifiesto, asimismo, la capacidad del PAW para la inactivación de microorganismos alterantes y patógenos, incluyendo S. Typhimurium, E. coli O157:H7, S. aureus y L. monocytogenes en repollo (Choi et al., 2019) y hojas de espinacas (Vaka et al., 2019; Liu et al., 2021) y de lechuga (Khan y Kim, 2019). Por ejemplo, se ha observado que la inmersión de hojas de lechuga Iceberg y Romana durante 3 minutos en un PAW, activado por plasma durante 10 minutos, reducía la población de S. Typhimurium en 3,0 y 2,6 unidades logarítmicas, sin comprometer su color y contenido en flavonoides (Khan y Kim, 2019). Choi et al. (2019) han

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descrito que el tratamiento de repollo con PAW durante 10 minutos permitía reducir los recuentos de bacterias aerobias mesófilas, bacterias ácido-lácticas, coliformes y mohos y levaduras en 2,0, 2,2, 0,9 y 1,8 ciclos logarítmicos, respectivamente, así como la población S. aureus en 1,3 unidades logarítmicas y la de L. monocytogenes en 1,5 ciclos, ejerciendo mínimas modificaciones tanto en el contenido en azúcares reductores como en la dureza y color característicos del producto. Por último, los resultados obtenidos en estos últimos años por diversos autores (Sivachandiran y Khacef, 2017; Zhang et al., 2017; Xiang et al., 2019; Zhou et al., 2019; Machado-Moreira et al., 2021) evidencian el gran potencial que presenta el PAW en la producción de germinados. Machado-Moreira et al. (2021) han descrito que un tratamiento de 3 horas lograba inactivar la población de E. coli O104 y la de S. Montevideo en semillas de alfalfa y “mung bean" (Vigna radiata) hasta en 1,7 unidades logarítmicas. También se ha observado en varias ocasiones que la irrigación de las semillas con PAW durante el proceso de obtención de germinados estimula tanto su germinación como su crecimiento posterior, acortando así el proceso productivo. Por ejemplo, Zhou et al. (2019) encontraron que la utilización del PAW como agua de irrigación era capaz de acortar a la mitad el tiempo necesario para la germinación de semillas “mung bean”, de 72 horas a 36 horas, e incrementar, en un 6%, el porcentaje final de germinación. Por su parte, Zhang et al. (2017) observaron que cuando la germinación de las semillas de lentejas se llevaba a cabo en PAW se obtenían tanto brotes con un tallo más desarrollado como mayores porcentajes de semillas germinadas (80% vs 30% conseguido al utilizar agua de la red de suministro). Además, también se ha puesto de manifiesto la capacidad del PAW para reducir la carga microbiana de los propios germinados. Así, Xiang et al. (2019) comprobaron que la inmersión de germinados de “mung bean” durante 30 minutos en un agua previamente activada durante un tiempo tan corto como 30 segundos lograba tasas de inactivación de 3,2 y 3,5 unidades logarítmicas para la población de bacterias totales y K. pneumoniae, respectivamente, sin afectar las características sensoriales y el contenido en polifenoles y flavonoides del producto. Todos estos efectos ejercidos por el PAW en la producción de germinados (incremento de la tasa de germinación de semillas, acortamiento del tiempo requerido para la germinación, estimulación del crecimiento de los brotes, reducción de la carga microbiana de las semillas y los germinados) hace que esta estrategia presente un potencial muy prometedor en este sector industrial.

7. Conclusiones Aunque en la actualidad el PAW es considerado como una estrategia sumamente prometedora para mejorar la calidad microbiológica de los productos vegetales, su implementación industrial como una alternativa segura y eficaz a los agentes químicos actualmente utilizados requiere disponer no sólo de datos precisos acerca del grado, características y biovariabilidad de la resistencia de los microorganismos frente a este agente letal, sino también determinar aquellos factores que condicionan su efectividad antimicrobiana. Además, el conocimiento de los mecanismos involucrados en la inactivación microbiana y la identificación de las especies

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químicas responsables del efecto letal permitirán desarrollar regímenes de tratamiento más eficientes.

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Agua activada por plasma como alternativa a los desinfectantes químicos en el procesado de productos vegetales

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