evaluación in vitro de doS biocidaS

Evaluación in vitro de dos biocidas comerciales sobre la tasa de extrusión de esporas EHP

Ambos biocidas analizados tuvieron un efecto inhibitorio sobre la tasa de extrusión de esporas

La microsporidioidia es un vasto phylum [rango taxonómico para organismos que comparten un plan corporal similar] compuesto por más de 1400 especies de eucariotas [organismos cuyas células tienen un núcleo encerrado dentro de una envoltura nuclear], parásitos unicelulares e intracelulares relacionados con los hongos. Son capaces de infectar una amplia variedad de huéspedes acuáticos y convertirse en un patógeno de alta relevancia en el medio acuático donde ha sido un problema emergente. En 2004, se notificó por primera vez una microsporiosa sin nombre en el hepatopancreas de camarón tigre negros (Penaeus monodon) afectados por un crecimiento lento en Tailandia.

Sin embargo, no fue hasta 2009 cuando este patógeno se caracterizó completamente e identificó como Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), y la enfermedad muy grave que causó en camarones como microsporidiosis hepatopancreática (HPM). Este patógeno se ha encontrado en camarones tigre negro, camarones de pata blanca (P. vannamei) y posiblemente camarones kuruma (Marsupenaeus japonicus), y ha sido reportado en algunos países con importantes industrias acuícolas de camarón, como China, Vietnam, Indonesia, Brunei, India, Malasia, la región de Australasia (sospechosa), Venezuela y México (posiblemente diferentes especies). La EHP se puede transmitir horizontalmente a través de la convivencia con muestras infectadas, canibalismo, agua contaminada, suelo o equipo. El ciclo de vida de la microsporoides se divide en tres etapas principales, incluyendo proliferativa (merogeny), producción de esporas (espoogenia) y la etapa infecciosa (esporas maduras). Las esporas son generalmente de forma ovoide, de tamaño pequeño de 1 a 4 m y que contienen un filamento polar de cuatro a cinco bobinas que pueden ser extruidas y utilizadas para perforar células huésped e inyectar materiales infecciosos. Se pueden encontrar en los túbulos epiteliales hepatopancreáticos. Durante muchos años, se ha infor-

Vista del microscopio de esporas DE EHP purificadas y no manchadas.

mado de que el principal signo de infección por EHP es el crecimiento retardado en los camarones afectados y sin signos externos visibles; sin embargo, estas infecciones pueden ser un factor de riesgo para que los patógenos oportunistas puedan iniciar infecciones secundarias.

A medida que la industria de cultivo de camarón se intensifica y aumenta su producción, las enfermedades siguen desempeñando un papel importante en su éxito. Un enfoque ampliamente utilizado para tratar enfermedades en granjas acuáticas es la aplicación de productos quíción o remediación para controlar los impactos de la enfermedad y el medio ambiente en el estanque. En el caso de la EHP, hubo confusión en los agentes causantes del EHP, que generalmente estaba relacionada con otras enfermedades como la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND), también conocida como Síndrome de Mortalidad Temprana (SME). A partir de los resultados anteriores de un modelo de desafío de coinfección, se hicieron varias conclusiones importantes sobre la destrucción escalada de los tejidos hepatopancreáticos y la susceptibilidad de los camarones a Vibriospp. causando AHPND/EMS y necrosis hepatopancreática séptica (SHPN). Además, otro estudio encontró una correlación entre la EHP y el síndrome de heces blancas (WFS), mientras que se estaban cuantificando

micos bajo estrategias de prevencantidades masivas de esporas de EHP en las heces de los camarones infectados por el S WFS. El diagnóstico de EHP puede realizarse mediante microscopía (montaje húmedo de tejido hepatopancreático), métodos moleculares (PCR) y análisis de tejidos (histología o hibridación in situ). El desarrollo de tensioactivos superficiales y el tratamiento farmacológico para la EHP es uno de los métodos adecuados para controlar la EHP. Todavía existe la oportunidad de un gran número de productos que pueden ser estudiados por su idoneidad para tratar y controlar las infecciones por EHP, como los biocidas [sustancias químicas utilizadas para destruir o controlar organismos nocivos]. En este artículo, se presentan los resultados y observaciones obtenidos mediante el estudio del efecto biocida de dos productos comerciales, Aqua-Protect y Antizol (fabricado por Virbac Vietnam). El

objetivo de este estudio fue determinar el potencial de estos dos agentes biocidas contra la extrusión de esporas EHP en condiciones de laboratorio mediante estudios in vitro.

Configuración del estudio

Se obtuvieron dos lotes diferentes de camarones infectados por EHP de dos fuentes geográficamente diferentes: las provincias de Pathum Thani (lote 1) y Chanthaburi (lote 2) en Tailandia. Estos camarones fueron aclimatados a temperaturas que oscilaban entre 28 y 29 grados C con aireación constante en el laboratorio durante 2 días (Unidad de Servicio en Centex Shrimp, Universidad Mahidol, Bangkok) antes de que su hepatopancreas fuera recogido y utilizado para la purificación de esporas EHP de acuerdo con el método publicado de Aldama-Cano et al. (2018). La tasa de extrusión de esporas se midió y se notificó como 77,0 a 2,65 por ciento y 70,3 a 2,08 por ciento, respectivamente, para los lotes 1 y 2 de las esporas de EHP. La preparación de las soluciones de prueba de los dos biocidas comerciales fue la siguiente: Aqua-Protect y Antizol se diluyeron en agua destilada a soluciones iniciales de 1.000 ppm, que luego se diluyeron a 1, 5 y 10 ppm para Aqua-Protect, y 10, 20 y 40 ppm para que Antizol probara en el Lote 1 del EHP esspor. Para el lote 2 de las esporas de EHP, Aqua-Protect se diluyó a 1, 5, 10 y 20 ppm, y Antizol se diluyó a 10, 20, 40 y 80 ppm concentraciones de trabajo de la población de 1000 ppm (Tabla 1). Para ambos lotes, las diluciones se prepararon de 10 a 20 minutos antes de añadir las esporas activas purificadas, y el experimento se llevó a cabo a temperatura ambiente (25 grados-C).

en un portaobjetos de vidrio junto con 10 ml de 2 por ciento de Phloxin B y 10 l de celulosa de 0,2 por ciento, después de lo cual se incubaron durante 10 minutos. Cien esporas fueron contadas y puntuadas como esporas extruidas o no extruidas. Cada reacción se contó bajo un microscopio tres veces para calcular una tasa media de extrusión que, a su vez, se dividió por la tasa de extrusión del tratamiento de control correspondiente de cada lote para calcular la tasa de extrusión normalizada (Fig. 1). dieron a los tratamientos con los biocidas de una manera similar. Bajo un microscopio de luz (Leica, 100o de aumento), se puede observar un alto número de esporas extruidas en el tratamiento de control (Fig. 2A; donde se han extruido los tubos polares demostrando su etapa activa e infecciosa), mientras que se observó una reducción significativa en la extrusión del tubo polar en las esporas activas de EHP tratadas con 20 ppm de Aqua-Protect (Fig. 2B) y 80 ppm de Antizol (Fig. 2C). El análisis estadístico indicó una diferencia signifi-

Diagrama esquemático de experimentos de dos fórmulas de biocidas en esporas EHP.

Los datos se analizaron utilizando el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) – utilizando SPSS versión 22 (IBM). La prueba post-hoc de rango múltiple de Duncan se aplicó para múltiples comparaciones de diferencias significativas entre tratamientos (p < 0.05).

Extrusión de esporas EHP, Tabla 1.

Tabla 1. Concentraciones de trabajo preparadas de soluciones de ensayo.

En cuanto a los ensayos de extrusión de esporas, las pruebas de inhibición de esporas de EHP se llevaron a cabo en tubos de reacción de 100 l. Cada tubo se preparó añadiendo esporas de EHP purificadas a cada concentración de los productos diluidos para lograr la concentración final de esporas de 104 esporas/L. Las pruebas de control se realizaron en agua destilada estéril (SDW) en lugar de soluciones de prueba. Todas las reacciones se incubaron durante 120 minutos a temperatura ambiente (25 grados-C). Para calcular la tasa de extrusión, se depositaron 3 l de cada reacción

Resultados y discusión

Las pruebas de extrusión de esporas in vitro se llevaron a cabo con dos lotes de esporas de EHP recogidas de dos fuentes diferentes de camarones infectados por EHP. Las tasas de extrusión de los tratamientos de control fueron del 77,0 por ciento y del 70,3 por ciento de la primera y la segunda tanda de esporas, respectivamente (Tabla 1). Estos valores se utilizaron para normalizar la tasa de extrusión de las esporas tratadas en sus respectivos lotes experimentales. Se observó que ambos lotes de esporas activas de EHP respon-

cativa (p < 0.05) en las tasas de extrusión de esporas de EHP después de ser tratado con los biocidas (Tabla 2 y Fig. 3). 2: Vistas representativas de las esporas extruidas y no extruidas de EHP donde los tubos polares están marcados con flechas rojas. (A) Tasa de extrusión de las esporas activas de EHP en la muestra de control sin productos químicos añadidos; (B) Extrusión de esporas activas de EHP después de ser tratada con 20 ppm Aqua-Protect durante 120 minutos; y (C) Tasa de extrusión de las esporas activas de EHP tratadas con 80 ppm de Antizol durante 120 minutos. La barra de escala es de 20 m.

Cuadro 2. Tasa normalizada de extrusión de esporas de EHP después de dos horas de tratamiento. Los datos se presentan como medias - desviaciones estándar de las tasas de extrusión de esporas (porcentaje, %) que se normalizaron frente a la tasa de extrusión de su respectivo tratamiento de control. N/D – No hecho. Diferentes superíndices son significativamente diferentes entre sí en la misma columna (p < 0.05). Las letras mayúsculas y minúsculas representan datos de cada lote de esporas EHP probadas.

3: Tasa normalizada de extrusión de esporas después de 120 minutos de incubación con cada compuesto a diferentes concentraciones. Las tasas de extrusión de cada experimento se normalizaron con respecto a la tasa de extrusión de su respectivo experimento de control. Diferentes letras indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05), letras A, B, C y D minúsculas y mayúsculas indican diferencias en los tratamientos Aqua-Protect, mientras que las letras X e Y en minúsculas y mayúsculas indican diferencias en los tratamientos Antizol. Los datos de las pruebas mues- sis de 10 ppm, mientras que tran que los biocidas fueron Aqua-Protect fue más eficaz eficaces contra ambos lotes que Antizol a la dosis de 20 de esporas de EHP mediante ppm (Tabla 2 y Fig. 3). Se enla inhibición de la extrusión contró que el efecto inhibitorio del tubo polar de esporas de Aqua-Protect dependía de después de 120 minutos de la dosis, ya que un aumento de incubación (Tabla 2 y Fig. 3). la concentración de 1 ppm a 20 ppm condujo a una dismiPara Antizol, las tasas máximas nución de la tasa de extrusión. de inhibición oscilaron entre 92.6 por ciento (Lote 1, 40 Sin embargo, la tasa de extruppm) a 96.7 por ciento (Lote sión en respuesta a la aplica2, 80 ppm), mientras que pa- ción de Antizol no disminura Aqua-protect las tasas de yó significativamente ya que inhibición fueron de 63.2 por la dosis aumentó de 10 ppm.ciento (Lote 1, 10 ppm) a 95.2 por ciento (Lote 2, 20 ppm). Conclusión Los resultados del estudio preComparando los dos produc- sentado, mostraron que los biotos, Antizol fue más eficaz que cidas Aqua-Protect y Antizol teAqua-Protect a la misma do- nían un efecto inhibitorio en la tasa de extrusión de las esporas de EHP cuando se trataba in vitro en condiciones de laboratorio. Si bien ambos biocidas parecen inhibir la extrusión bajo un estricto entorno de laboratorio, es necesario tener en cuenta varios factores a la hora de optimizar los procedimientos para su uso en el campo, como los niveles de toxicidad para los animales (se dispone de datos), métodos/ estrategias de aplicación, concentraciones de trabajo óptimas, área o volumen de agua a tratar y otras consideraciones. También sería necesario determinar si un enfoque profiláctico o preventivo es más adecuado que un enfoque correctivo, ya que se ha recomendado que la mayoría de los productos químicos evaluados para combatir posiblemente las infecciones por EHP se utilicen entre cultivos como medida preventiva de bioseguridad. Una vez que se determina el mejor enfoque, el uso de desinfectantes como los biocidas para controlar las infecciones por EHP podría convertirse en una práctica común tanto para los productores de camarón afectados como para los no afectados. Autores KHANITTHA SANG-NGAM Virbac, División de Acuicultura, Francia DIVA J. ALDAMA-CANO, PH.D. Centro de Excelencia en Biología Molecular y Biotecnología del Camarón (CENTEX Shrimp) Universidad Mahidol, Tailandia ORNCHUMA ITSATHITPHAISARN, PH.D. Centro de Excelencia en Biología Molecular y Biotecnología del Camarón (CENTEX Shrimp) Universidad Mahidol, Tailandia PHILIPPE MAHL Virbac, División de Acuicultura, Francia PHUONG DO Virbac, División de Acuicultura, Francia HOANG PHAN, PH.D. Autor correspondiente Virbac, División de Acuicultura, Francia hoang.phan@virbac.vn

Artículo publicado en el sitio: Copyright © 2016–2020 Global Aquaculture Alliance, agosto 2020.

Planes de NMFS para primeras zonas federales de acuicultura marina.

Ocean Era, con sede en Hawái, busca construir la primera operación de corral de peces del Golfo de México en aguas federales. Foto de la Era del Océano.

Insoportado por un reciente revés en la corte federal de apelaciones, el Servicio Nacional de Pesca Marina está avanzando en la planificación de "áreas de oportunidades de acuicultura" en aguas federales del sur de California y en el Golfo de México. Todavía en las primeras etapas, el proceso de planificación evaluará el potencial en esas regiones y trazará lo que los planificadores del NMFS prevén como grupos de tres a cinco operaciones de piscicultura. Las áreas de la costa del golfo y del Pacífico fueron seleccionadas "sobre la base de los datos de análisis espacial ya disponibles y el interés actual de la industria en el desarrollo de operaciones de acuicultura sostenibles en la región", según funcionarios de la agencia. "Nombrar estas áreas es un gran paso adelante", dijo Chris Oliver, administrador del NMFS, al anunciar el paso hacia la implementación de la orden ejecutiva de mayo de la administración Trump sobre la promoción del desarrollo de la industria de mariscos de Estados Unidos. "La creación de áreas de oportunidades de acuicultura fomentará la industria acuícola de los Estados Unidos como un complemento necesario para nuestras pesquerías de captura silvestre. Este tipo de trabajo proactivo crea oportunidades para los agricultores acuícolas y mantiene nuestro compromiso con la administración ambiental". El plan de largo alcance exige 10 áreas de desarrollo alrededor de las costas que apoyarían peces de aleta, mariscos, algas marinas y combinaciones de esas mariculturas. Los funcionarios del NMFS dicen que "utilizarán el análisis científico y la participación pública para resaltar espacios que sean ambiental, social y económicamente apropiados para la acuicultura comercial". "Las ubicaciones exactas se identificarán en función de la ciencia mejor disponible, incluidos los análisis de ubicación basados en datos utilizando cientos de capas de datos de las condiciones y usos de los océanos", dijo Nicole LeBoeuf, administradora adjunta en funciones del Servicio Nacional Oceánico. "La aportación de las partes interesadas también es esencial para garantizar que las áreas de oportunidades de acuicultura se encuentran en los mejores luga-

res para la acuicultura y para evitar conflictos con otras industrias o daños ambientales". "Junto con el análisis espacial avanzado, la aportación pública es vital para este proceso", dijo Danielle Blacklock, directora de la oficina de acuicultura en el NMFS. "En los próximos meses y años planeamos llevar a cabo actividades de divulgación, solicitudes de información y sesiones de escucha para permitir que nuestros grupos de partes interesadas compartan sus ideas sobre la creación de estas áreas de oportunidad". El anuncio se produjo un poco más de dos semanas después de que un tribunal federal de apelaciones en Luisiana confirmara una sentencia de la corte inferior de que NMFS carece de autoridad del Congreso para permitir y regular la acuicultura en aguas federales. Los jueces rechazaron la posición de NMFS de que tiene jurisdicción bajo la Ley de Conservación y Gestión Pesquera MagnusonStevens, fallando a favor de los grupos ambientales y pesqueros que impugnaron los planes para un proyecto piloto de pluma de aleta frente a la costa oeste de Florida que podría haber crecido para producir hasta 64 millones de dólares de pescado al año. NMFS no puede entrar en el negocio de per-

mitir y regular la piscicultura en alta mar sin conseguir primero que el Congreso le conceda ese poder, dictaminó una mayoría en el panel del Tribunal de Apelaciones del Quinto Circuito de tres jueces. "La ley no dice ni sugiere que la agencia pueda regular la acuicultura", escribió el juez Stuart Kyle Duncan en la opinión mayoritaria emitida el 3 de agosto. "El organismo interpreta este silencio como una invitación, pero nuestro precedente dice lo contrario: el Congreso no delega la autoridad simplemente por no retenerlo". La propuesta de Ocean Era, con sede en Hawái, para los estanques de peces a 45 millas al oeste de Sarasota, Florida, tiene el apoyo del Departamento de Agricultura del estado de Florida, con una industria de acuicultura de almejas y ostras ya establecida en aguas estatales, la agencia estatal ha pedido a NMFS que incluya a Florida en su área de planificación de la acuicultura marina en el Golfo de México.

Autor: Kirk Moore | National Fisherman, Agosto 2020.