Unidad 1. Generalidades by Jazina Ruiz Hernández

Programa de la asignatura:

Cultivo de tejidos vegetales I

Generalidades

Ciencias de la Salud Biológicas y Ambientales | Ingeniería en Biotecnología

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Índice

Presentación de la unidad ......................................................................................................... 2 Propósitos.................................................................................................................................. 2 Competencia específica ............................................................................................................ 3 1.1. Introducción……..………………………………………………………………........................3 1.2. Organización de plantas superiores……………. ………………………………………….….7 1.2.1. Organización de una planta ............................................................................................ 8 1.2.2. Organización celular…………………………..…………………………………………….....9 1.2.3. Necesidades metabólicas (Hall et al., 1982)……………..………………………………..34 Actividades .............................................................................................................................. 40 Autorreflexiones....................................................................................................................... 40 Cierre de la unidad .................................................................................................................. 40 Para saber más ....................................................................................................................... 41 Fuentes de consulta ................................................................................................................ 42

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Presentación de la unidad El “Cultivo de células y tejidos vegetales” o cultivo in vitro de plantas es una disciplina relevante que ha generado reportes de trabajos desde hace más de cien años, que como otras disciplinas no pierden su atracción e importancia. En la actualidad la industria de producción de flores de ornato y la fruticultura a gran escala emplean material vegetativo de calidad genética y fitosanitaria, a través de la propagación del cultivo in vitro. La necesidad de estas características en el material vegetativo, sin tomar en cuenta el valor económico en juego, hacen de esta disciplina una herramienta necesaria a largo plazo. Esta primera unidad de tres totales, establecerá los conceptos fundamentales relacionados con el cultivo de tejidos vegetales in vitro, además del conocimiento de las estructuras organizacionales de una planta, con el fin de poder identificarlas con el avance de la asignatura.

Propósitos de la unidad

 

Identificar los conceptos fundamentales del área de biotecnología vegetal. Identificar estructuras en la organización de plantas superiores (tipos de células, tejidos y órganos) y sus necesidades metabólicas.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Competencia específica

Relacionar los componentes asociados en la organización de plantas superiores, para vincularlos con las técnicas de biotecnología vegetal, tomando en cuenta las necesidades metabólicas vegetales.

1.1. Introducción La biotecnología es una ciencia amplia, y, aunque muchos creen que es reciente, es tan antigua como la fabricación del vino por egipcios desde hace más de 4,000 años.

Figura 1. Reina Nefertari ofreciendo vino (SciPh, 2013).

Su concepto ya ha sido discutido al inicio de tu formación, esto es, la aplicación de organismos, sistemas y procesos biológicos para obtener un bien o servicio desde una perspectiva multidisciplinaria. En esta ocasión se estudiará una de sus disciplinas derivadas: el cultivo de células y tejidos vegetales.

En esta unidad se discutirá la definición y desarrollo histórico del cultivo de tejidos vegetales, sin embargo, provisionalmente puede ser conceptualizado como el conjunto de técnicas en las que un explante (semilla, órgano, tejido o célula viva) se inocula asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones controladas (Rosas-Romero G., 2007). Un cultivo in vitro se establece Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

cuando se toman en cuenta y aplican algunos aspectos generales relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubación en forma exitosa. El cultivo de células y tejidos vegetales ha otorgado líneas celulares libres de virus, nuevos germoplasmas, sistemas de propagación clonal y la introducción de especies de plantas difíciles de propagar. Por otra parte, sin la capacidad de regenerar plantas, no pudieron ser posibles los avances en la biotecnología de plantas y la ingeniería genética (Murch S.J. y Saxena P.K., 2004). En este breve espacio, se han introducido diferentes conceptos, tal vez desconocidos, por lo que se tratará de elucidar cada uno de ellos.

Figura 2. Cultivo de tejidos vegetales (FreeDP, 2013).

El término in vitro, ampliamente usado en biotecnología de plantas indica que las plantas o partes de ella fueron cultivadas en un contenedor de vidrio, esto es, producido en el laboratorio por métodos experimentales (del latín in: dentro/en, vitro: vidrio) (RAE, 2013). Al respecto, Ovando (2013) ahonda en lo siguiente:

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

“En la actualidad se emplean materiales como el plástico, polipropileno etc. que son igual de eficientes para el cultivo artificial o in vitro. Los contenedores son cerrados que solo permiten el paso del aire. El término contrario es in situ (en el sitio), en el que se indica que las plantas se estudiaron en la naturaleza o en el campo. Es importante tener en cuenta en la nomenclatura que se ha de aplicar a las plantas micro-propagadas, es que una vez que las plantas han salido de la fase in vitro (aclimatación y crecimiento inicial en invernadero y vivero) se dice que han entrado a la etapa ex vitro, extra vitrium o post vitro, y se les llama vitro-plantas; no obstante cuando salen finalmente al campo están nuevamente en condiciones in situ”. (Ovando, 2013).

Figura 3. Protoplastos obtenidos de hojas de tabaco (SciPh, 2013).

Figura 4. Explante de teca (Tectona grandis) en Malasia (SciPh, 2013).

Un explante, como ya se mencionó, se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (partes de hojas, tallos, raíces, pétalos, entre otros), un órgano (semillas, anteras, ovarios, botones forales, hojas y raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien células individuales (como en el caso de los protoplastos). Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticas. La selección del explante es un aspecto clave para tener éxito en el cultivo de tejidos, ya que dependiendo de su ubicación en la planta, del tipo de tejido que contiene, de su edad cronológica y fisiológica, de su contenido endógeno de hormonas, entre otros, se comportará de una manera u otra (Ovando, 2013). Un explante se usa para iniciar un cultivo.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

El término totipotencia de su raíz totipotente, es un concepto en el que se basa el cultivo in vitro, se define según el Real diccionario de la lengua española como: “célula embrionaria con capacidad de generar un organismo completo”, mientras que el diccionario de biología Oxford (6ta edición en línea), define totipotente como: “1. Palabra que describe células vegetales diferenciadas que, aisladas, tienen la habilidad de desarrollar a una nueva planta si se provee de un medio de cultivo adecuado. 2. Palabra que describe células embrionarias en la etapa antes de su destino Figura 5. Germinación de irreversible, cuando tienen la capacidad de convertirse una semilla (SciPh, 2013). en cualquier célula diferenciada dada una estimulación apropiada”. Esto nos indica por lo tanto, que toda célula nucleada es potencialmente totipotente. Hoy en día los biólogos saben que bajo condiciones apropiadas, ya sea natural o artificial, no solo las células de plantas pueden dar origen a una nueva planta, sino que una célula somática aislada in vitro incluso puede producir un embrión, los cuales son generalmente referidos como embriones somáticos, embriones adventicios, embriones asexuales o embriones vegetativos. Los embriones somáticos o embrioides son morfológicamente similares, si no idénticos, a los embriones cigóticos y tienen todo el potencial para el crecimiento inherente en un embrión derivado de una unión sexual (Krikorian A.D., 2004).

Figura 6. Polen de campanilla (Campanula spp.)(SciPh, 2013).

Uno de los más importantes eventos biológicos en el ciclo de vida de un organismo es la fertilización, la cual involucra la fusión de dos gametos de sexo opuesto o cepas resultantes en la formación de un cigoto. A partir de esta célula-cigoto simple se origina un cuerpo multi-celular y multi-óganos de un organismo ya sea una planta floral o un cuerpo humano (Bhojwani y Razdan, 1992).

Un diploide, se refiere a una célula u organismo que posee el doble del número de cromosomas característicos de una especie. El tejido somático normalmente es diploide, en contraste con las células gaméticas (óvulos y polen), que son haploides (Hurtado y Merino, 1991). Un haploide contiene la mitad del número de cromosomas presentes en las células somáticas de las plantas. El tejido somático se refiere a la parte o proceso vegetativo no sexual. Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Figura 7. Propagación vegetativa de camelia (SciPh, 2013).

La propagación vegetativa se refiere entonces a la propagación asexual de plantas al cortar una parte de ellas, por ejemplo, un esqueje, el cual subsecuentemente desarrollará una planta completa. Un clon es una población de células derivadas a partir de una sola célula por división mitótica. Este término también es usado para denotar a una población derivada de un solo individuo a través de la propagación vegetativa (Bhojwani y Razdan,1992).

El término adventicios, se emplea como adjetivo y es usado para describir raíces, brotes u otros órganos desarrollados a partir de posiciones anormales, por ejemplo, brotes a partir de raíces, hojas o callos; raíces Figura 8. Raíces producidas en los nudos de los tallos de pastos, etc.

adventicias. (SciPh, 2013).

Finalmente, el germoplasma consiste en los recursos genéticos de un organismo. Si es el caso del trabajo con tejidos de plantas, el germoplasma puede ser protegido mediante una colección de semillas (también conocida como banco de germoplasma), o algún otro material en el que las plantas puedan ser propagadas.

Figura 9. Raíces adventicias en maíz (SciPh, 2013).

Con todo lo anterior se han revisado los conceptos generales necesarios para adentrarnos al cultivo de tejidos vegetales, a continuación se presentará todo lo necesario sobre la organización de las plantas.

1.2. Organización de plantas superiores Las cormofitas (plantas con tallo) más desarrolladas son las plantas superiores, estas muestran una diferenciación típica en raíces, tallos y hojas. El tallo soporta a las hojas y a las flores y contienen los elementos para el transporte de agua y nutrientes hacia las partes superiores de la planta así como para la translocación de productos fotosintéticos. A continuación se detallará su organización.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

1.2.1. Organización de una planta

Figura 10. Transporte de agua en plantas, imagen creada, artwork (SciPh, 2013).

Por ejemplo, se tiene una plántula, llamada aquí brote, que ha emergido de una semilla, la cual está anclada al suelo por el sistema radicular que es responsable de la toma de nutrientes minerales del suelo. Las hojas están atadas al brote y sus ramas dispuestas de tal manera que puedan capturar la luz necesaria para la fotosíntesis de forma óptima. Las hojas típicas son órganos delgados, donde las células están dispuestas en capas: epidermis superior, la capa mesófilo parenquimatosa y la epidermis inferior. Generalmente los brotes y las raíces tienen centros meristemáticos, los cuales permiten el crecimiento. Así las plantas son -en contraste con los sistemas animales- sistemas abiertos, comúnmente con crecimiento ilimitado. Una única característica de plantas, además de la existencia de centros meristemáticos primarios, es la capacidad de que casi cada simple célula viva – no importando su estado de diferenciación- puede desdiferenciarse para llegar a convertirse en una célula meristemática nuevamente. De esta forma, las células de plantas pueden ser consideradas como “totipotentes”. Este proceso es básico para todas las técnicas de cultivo de tejidos de plantas, desde la manipulación de células diferenciadas, las cuales pueden ser manipuladas para crecer posteriormente en su estado desdiferenciado o rediferenciarlas a todo tipo de células y órganos posibles de una planta superior hasta una planta completa nuevamente (Petersen y Alfermann 1993).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

1.2.2. Organización celular Usando un microscopio simple para examinar secciones de corcho, las células fueron primeramente descritas por Robert Hooke en 1665. Hooke usó el término “célula” para describir las pequeñas unidades amuralladas que se pueden observar en un tejido de vegetal; el significado biológico de este descubrimiento no fue apreciado sino hasta más tarde. La pared misma fue considerada como tejido de planta mientras Figura 11. Dibujo del corcho bajo el que la existencia e importancia del contenido de la célula no microscopio hecho fue realizada. En los siguientes 100 años, al mejorar los pot R. Hooke (SciPh, microscopios y las técnicas preparativas, fue posible 2013). examinar el contenido de las células. De allí nuestro estudio. En términos de estructura y función, la célula es la unidad fundamental de lo viviente. En términos simples la célula de plantas puede ser dividida en dos principales regiones: la pared celular y el protoplasto. Esta última consiste en el núcleo, el citoplasma, el cual contiene una variedad de organelos enlazados a la membrana y frecuentemente, una gran vacuola conteniendo un medio acuoso de sales y varias moléculas orgánicas actuando como un depósito para la actividad metabólica de la célula. Sin embargo, mientras la gran mayoría de las células de plantas conforman a esta imagen general, existe una variable consideración en tamaño, forma y estructura.

Figura 12. Tipos de células, imagen creada, artwork (SciPh, 2013).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

El tamaño de las células de plantas varía considerablemente. Las más pequeñas, tales como las células de las algas verdeazuladas, están en cerca de 0.5 µm de diámetro, mientras que las más grandes, tales como las algas verdes Valonia o Nitella pueden alcanzar varios centímetros de diámetro o largo respectivamente. Estas grandes células son atípicas teniendo varios núcleos embebidos en la periferia del citoplasma. La mayoría de las plantas superiores caen dentro de un intervalo entre 20-300 µm en longitud o diámetro (cabe recordar que 1 mm = 10-3 m y 1 µm = 10-6 m). El factor que parece ser importante en el control de tamaño celular, está relacionado directamente con el intercambio de nutrientes y metabolitos entre la célula y el medio ambiente y entre los diferentes organelos intracelulares.

Figura 13. Tetradecaidecaedro (Rehmeyer J., 2008).

En cuanto a la forma, ésta también tiene una relación con el metabolismo de la célula. La forma de algunas de ellas, tales como la amiba es variable pero muchos tipos de células de plantas tienen una forma típica y más o menos rígida, la cual está estrechamente relacionada con su función y con las tensiones que operan durante el desarrollo cuando aún son plásticas. Muchas plantas unicelulares y en cultivos de células aisladas crecen teniendo una forma redonda, pero en los tejidos tienen una forma frecuentemente poliédrica como resultado del contacto unas contra las otras. Una forma similar puede ser vista en grupos de burbujas de jabón presionadas.

En cálculos y observaciones sobre películas de jabón se ha demostrado que la máxima utilización de espacio cuando las esferas son comprimidas, se realiza en un tetracaidecaedro (catorce lados). Mediciones sobre células isodiamétricas en un número de diferentes tejidos de plantas, tales como ápices de raíces y centro de tallos, han mostrado una variación considerable en el número de caras por célula. Catorce caras por célula fueron en promedio las más destacadas. Sin embargo, está claro que a partir de un examen de los tejidos de plantas, existe una variación considerable en la forma ideal de la célula predicha por la compresión de esferas. Las razones son numerosas: la división celular no es sincronizada y puede variar en la proporción entre células durante la producción de un tejido, produciendo considerables diferencias en tamaño celular y falta de uniformidad en la presión ejercida sobre las células vecinas. Además, existe variación en la plasticidad de la superficie de una sola célula.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Anatomía de plantas (Trigiano y Gray, 2005) Las plantas como cualquier organismo completo, están constituidas de células, la unidad básica de la vida. Sin embargo, diferente a las células animales, muchas de las células de plantas están rodeadas por una pared más o menos rígida compuesta de una variedad de polímeros estructurales, los cuales incluyen pectina, celulosa, lignina y hemicelulosa. La pared celular es relativamente delgada, como muchas de las células del parénquima, o gruesa como en las células del colénquima y esclerénquima. De hecho la estructura de la célula de planta imparte en algún grado la función de la célula. Las células pueden tener solo una pared celular primaria, que puede ser más o menos definida con precisión como el material depositado en la pared mientras las células incrementan de tamaño y que tienen microfibrillas de celulosa establecidas al azar o en orientaciones menos paralelas. La pared primaria generalmente contiene celulosa, hemicelulosa y compuestos de pectina, referido como a lamela media. La lamela media actúa como “cemento” entre las células adyacentes. En contraste, las paredes secundarias que se encuentran en algunas células, se depositan sobre o se integran a la pared primaria y a la lamela media después que la pared primaria ha sido completada.

Tipos de célula Se considerarán los tipos de células básicas de plantas antes de examinar la distribución interna de células a tejidos y, en su momento a tejidos y órganos. Las células de plantas pueden ser clasificadas en los siguientes tipos: a) b) c) d)

Meristemáticas, Del parénquima o parenquimatosas, Del colénquima o colenquimatosas, y Del esclerénquima o esclerinquematosas.

Es de notar que muchas referencias consideran que las células meristemáticas pertenecen a las células del parénquima.

a) Células meristemáticas Las células meristemáticas son pequeñas y realizan la mitosis para incrementar la longitud (meristemo apical) o grosor (meristemo lateral) del órgano. El meristemo inicial se reproduce él mismo, así como de nuevas células, denominadas derivativas, las cuales incrementan el cuerpo de la planta. Estas células derivativas generalmente continúan Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

dividiéndose varias veces antes de que alguna diferenciación significante ocurra hacia algún otro tipo de célula. Las células iniciales y sus células derivativas constituyen el meristemo apical, el cual puede ser observado en el brote (Figura 14A) y en la cofia de la raíz (Figura 14B). El meristemo apical del tallo puede ser dividido posteriormente en la túnica y el cuerpo. La túnica (cubierta) es una de varias capas de células gruesas y divididas solo por división anticlinal para incrementar el área superficial del extremo y para rodear el cuerpo, el cual consiste de una cantidad de células que se dividen en diferentes planos para incrementar el volumen del meristemo. Este arreglo “doble” se encuentra ausente en las raíces. Figura 14. Meristemo de la raíz apical y nacimiento de una raíz lateral

(A) Sección aproximada a la media longitudinal de una raíz joven de maíz (Zea mays). El caliptrógeno, en este caso, se eleva por encima de las células de la cofia de la raíz. En otras raíces, incluyendo monocotiledóneas, la cofia de la raíz se deriva del meristemo apical. Las tres áreas meristemáticas son el protodermo (la cual se forma de la epidermis), el tejido fundamental (cortex), y el procambium (tejido vascular). Las flechas indican sustancias mucilaginosas de la pared.

(B) Raíz (secundaria) lateral joven de frijol (Phaseolus vulgaris) originada del periciclo. Nota que los desarrollos laterales de la raíz, empujan destruyendo el tejido cortical y epidérmico de la raíz primaria. La arquitectura de raíces laterales es similar a la de las raíces primarias (Trigiano y Gray, 2005).

El meristemo apical del brote puede ser dividido en una zona periférica, el cual se encuentra en hojas, yemas y flores (órganos laterales), y la zona del flanco, el cual produce los tejidos del tallo. Varias capas de células distales al meristemo apical y a la zona del flanco, el procambium (vascular), el meristemo fundamental (córtex) y protodermo (epidermis) del tallo, están diferenciadas y dan lugar al tejido primario del cuerpo de la planta.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

El crecimiento primario de la planta es provisto a partir de las actividades del meristemo apical, divisiones subsecuentes y diferenciación de las células derivativas en tejidos y órganos de la planta. Todos los tejidos originados a partir del meristemo primario son denominados tejidos primarios; ejemplo: xilema primario y epidermis. Varias monocotiledoneas y algunas dicotiledoneas completan su crecimiento y desarrollo vía solo crecimiento primario. El crecimiento secundario exhibido por muchas dicotiledóneas es logrado a través de meristemos laterales especializados. El cambium vascular (Figura 15A), localizado entre el floema primario y el xilema primario, produce células que diferencian a tejido vascular adicional, esto es, floema secundario y xilema, los cuales incrementan el contorno de tallos y raíces. Figura 15. Estructura de la raíz de dico y monocotiledóneas

(A) Sección transversal de un ranúnculo (Ranunculus spp), una raíz dicotiledónea. Nota la disposición de tejidos y la falta de una médula central (pith). (Trigiano y Gray, 2005).

(B) Mayor magnificación del área central de la Figura 7.1A. La estela incluye todos los tejidos vasculares (xilema y floema), el cambium vascular (distinguible solo por la posición relativa en raíces jóvenes), y el periciclo. No se incluye la endodermis. Nota los vasos del xilema en el centro y las paredes gruesas (franjas Casparianas) de las células endodérmicas. (Trigiano y Gray, 2005).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

(C) Sección transversal de un raíz de maíz (Zea mays), una monocotiledónea). Nota el corazón central de la médula (pith) y los notablemente grandes vasos del xilema. (Trigiano y Gray, 2005).

(D) Magnificación del área vascular de la sección transversal mostrada en la Figura 7.1C (Trigiano y Gray, 2005).

Figura 16. Brote meristemático apical y lateral (auxilar)

(A) Sección longitudinal de un tallo apical del frijol (Phaseolus vulgaris). El meristemo apical (AM) está rodeado por varios primordios de hojas jóvenes (LP) y más hojas desarrolladas (L). (Trigiano y Gray, 2005).

(B) Secciones longitudinales de un nodo de nébeda (Nepeta cataria). La yema auxiliar (Aux. bud) está localizada en el eje formado por el peciolo de la hoja (PET) y el tallo. Nota el tejido vascular (VT) extendiéndose del peciolo y conectando al tejido vascular del tallo (flecha). El AM da la forma y el VT se ha diferenciado (ver inserto). TR = tricoma (Trigiano y Gray, 2005).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Células del parénquima Son típicamente isodiamétricas (mismo largo que ancho), sin embargo, las células pueden variar en forma, algunas alargadas o incluso lobuladas. La pared celular primaria de este tipo de células es relativamente delgada y está compuesta principalmente de celulosa y hemicelulosa con una capa de sustancias pécticas, la lamela media, sobre el exterior de la pared celular primaria. Es de notar que algunas células del parénquima, especialmente en el tejido vascular, pueden desarrollar una pared secundaria o llegar a escarificarse con lignina. Las células del parénquima tienen núcleo y protoplasma funcionando (citoplasma). Estas células están consideradas generalmente como relativamente indiferenciadas (comparadas al esclerénquima) y capaces de reanudar actividades meristemáticas por diferenciación. Este tipo de célula y tejido está involucrado en el desarrollo de raíces adventicias y brotes, heridas curadas y otras actividades.

Células del colénquima Las células del colénquima tienen las siguientes características: generalmente son más alargadas que las células del parénquima y están especializadas para funcionar como soporte mecánico para la planta. Las células del colénquima son blandas, flexibles con paredes primarias gruesas irregulares compuestas principalmente de celulosa con algo de pectina, pero nunca lignina. Las células del colénquima son similares a las células del parénquima al tener núcleo y protoplasma vivo, son capaces de desdiferenciarse con actividades meristemáticas. Este tipo de células se encuentran generalmente en tallos jóvenes (Figura 5D) y en peciolos de hojas. Funcionan como tejido de soporte flexible.

Células del esclerénquima Las células del esclerénquima pueden ser largas y delgadas (fibras; Figura 5A) o de formas isodiamétricas a alongadas (esclereidas). Están involucradas en el soporte mecánico y en la conducción de agua. Este tipo de células está ampliamente distribuido en los cuatro principales órganos de plantas. Las células específicas incluyen fibras, elementos de conducción, traqueidas y esclereidas.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

El sello de las células del esclerénquima consiste en la deposición de una pared secundaria en el interior de la pared primaria. Procediendo del exterior al interior de la célula, las capas de pared que rodean estas células son la lamela media, la pared primaria y finalmente la pared secundaria. Por definición la pared secundaria se establece después de que el crecimiento de la célula cesa. La pared está compuesta principalmente de celulosa dispuesta en fibras paralelas y usualmente sin componentes pécticos. Si una célula llega a lignificarse, se inician deposiciones de lignina en la lamela media y avanza al interior. Aunque muchas células del parénquima están muertas (esto es, no cuentan con protoplasma) en la madurez funcional algunos tipos de células pueden retener protoplasmas vivos. No obstante, el protoplasma de estas células parece estar fisiológicamente inactivo. Las células del esclerénquima están altamente diferenciadas y son consideradas, en la mayoría de los casos, incapaces de desdiferenciarse y reanudar actividad meristemática.

¿Físicamente cómo son estas células? (Hall et al. 1982) Existen en algunos libros, esquemas que nos describen la forma física como se han descrito estas células, por ejemplo las células parenquimatosas, que son las más comunes y pueden formar cerca del 80% del total de células complementadas en muchos órganos de plantas superiores. Son generalmente grandes cuando maduran, relativamente indiferenciadas y consisten de una delgada pared, citoplasma periférico y vacuola central (Figura 17). Ellas están adaptadas para el almacenamiento de alimentos y contienen gran cantidad de granos de almidón o gotas de lípidos, o para la fotosíntesis conteniendo cloroplastos, como en las células en palizada de las hojas. Las células parenquimatosas son las que dominan en la mayoría de las raíces, brotes, hojas y frutas. Un segundo grupo principal pueden ser descritos como células conductoras y estructurales. De estas, las más importantes constituyen los tejidos del floema y xilema. El floema es la principal vía para el transporte de azúcares y otros fotosintatos desde las hojas a otras partes de la planta. Este consiste del parénquima, esclerénquima y elementos cribosos. El esclerénquima se conforma de células alargadas con paredes fuertemente impregnadas con lignina y sin citoplasma (ver Figura 17). Las células son frecuentemente conocidas como fibras y forman parte del sistema de soporte de la planta. Los tubos cribosos son las células conductoras y consisten de filas de células alargadas con paredes extremas perforadas conocidas como placas cribosas (ver Figura 17). El xilema forma el tejido conductor de agua de la planta y consiste de parénquima, esclerénquima, vasos y traqueidas. Los vasos se forman cuando las filas de Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

cĂŠlulas alargadas llegan a engrosar con lignina formando patrones de anillos, espirales o reticulados (ver Figura 17). Al madurar, el final de la pared y el citoplasma se descomponen, de manera que se producen largos tubos de cĂŠlulas muertas desarrollando traqueidas de manera similar a los vasos, excepto que el final de la pared no se descompone, aunque permanecen permeables.

Universidad Abierta y a Distancia de MĂŠxico

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Figura 17. Representación esquemática de algunos tipos de células de plantas

Representación esquemática de algunos tipos de células de plantas. No se encuentran a escala. (Hall et al. 1978).

El otro principal tipo de células constituye los tejidos protectores y reproductivos. Las células protectoras están generalmente caracterizadas por la impregnación de las paredes celulares con sustancias impermeables al agua tales como la cutina y suberina. Estas incluyen las células de la epidermis, las cuales forman la otra capa de tejido primario, y del peridermo, o corcho, producido en tejidos secundarios. Las células Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

reproductoras forman solo una parte del total del cuerpo de la planta y son producidas solo en un cierto tiempo del ciclo de vida.

Arreglo interno de células (Trigiano y Gray, 2005) Tomando en cuenta la información anterior, las células están organizadas en tejidos simples (un solo tipo de células) y tejidos complejos (más de un sólo tipo de células). Los tejidos a su vez, están organizados en cuatro órganos principales: raíces, tallos, hojas y flores.

Raíces La raíz sirve como órgano primario de plantas para absorber agua y minerales, así como para anclar la planta al suelo y puede también funcionar como órgano de almacenamiento y en la reproducción vegetativa (asexual). Las plantas dicotiledóneas tienen una raíz principal, sin embargo como muchas monocotiledóneas, la raíz principal es efímera y es remplazada por un sistema radicular fibroso consistiendo de muchas raíces adventicias. La anatomía de la raíz es extremadamente variable, pero muchos modelos generales pueden ser desarrollados ya sea para mono como para dicotiledóneas. El meristemo apical de muchas raíces (Figura 14A) aparece menos evidente que el meristemo de brotes (Figura 5B), los cuales están concertados en una túnica y cuerpo. En muchas plantas el meristemo apical de raíz da lugar a células ya sea de la punta de la raíz (cofia) como al del meristemo primario; sin embargo en algunos pastos, un grupo de células, el caliptrógeno (caliptra), produce células de la cofia (Figura 14A). En muchos casos una zona inactiva está localizada en el meristemo apical. Esta región muestra baja actividad mitótica, pero la división típica se reanuda lejos de esta zona. La más evidente diferenciación de células se encuentra en el tejido vascular –el floema primario se diferencia primero, seguido por el xilema primario. Las células continúan madurando en elongación y tamaño (agrandar). Los pelos de la raíz, extensiones de células epidérmicas que incrementan el área superficial para absorber agua y minerales, son típicamente el primer signo detrás de la zona de actividad mitótica y marca la maduración de los primeros elementos del xilema.

Las raíces laterales o secundarias incrementan grandemente el área de absorción del sistema radicular y generalmente éstas inician en el periciclo, esto es, una o varias capas de células en el tejido vascular o estela, a alguna distancia detrás del sistema apical (Figura 14B). Varias células del periciclo adyacente se dividen para formar un primordio de raíz, y divisiones continuas obligan al desarrollo radicular desgarrando la endodermis, Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

córtex y la epidermis de la raíz primaria. El tejido vascular dentro de la raíz lateral está conectado a elementos similares en la raíz primaria o parental por diferenciación de células del periciclo. La gran mayoría de las mismas células y tejidos están presentes en monocotiledóneas y dicotiledóneas, sin embargo la disposición de estos tejidos es algo diferente. Un resumen de diferencias primarias entre las dos divisiones de angiospermas se presenta en la Tabla 1. La más evidente diferencia entre dico y monocotiledóneas en la anatomía de raíz es la disposición del tejido vascular primario. Muchas raíces de monocotiledóneas no tienen tejido de médula central por lo tanto el corazón de la raíz está ocupada por grandes vasos – metaxilema - (Figura 15A y B). Adicionalmente el xilema primario está dispuesto en arcos o brazos, con el floema primario localizado entre los brazos. El cambium vascular está localizado entre el xilema primario y el floema en raíces de dicoledoneas. En contraste muchas raíces primarias de monocotiledóneas tienen una médula en el centro de la raíz primaria rodeada por muchos brazos de tejido vascular (Figura 15C y D).

Tabla 1. Resumen guía de características morfológicas y anatómicas de mono y dicotiledóneas Órgano Raíz

Monocotiledóneas Habitualmente fibrosas. Presencia de médula. Sin cambium y corcho vascular o crecimiento secundario.

Dicotiledóneas Generalmente una raíz principal. Sin presencia de médula. Cambium y corcho vascular y crecimiento secundario presente. Xilema primario habitualmente distribuido en “arcos”.

Tallo

Sin presencia de médula, pero con haces vasculares embebidos en el tejido fundamental similar a la médula. Generalmente falta el cambium y corcho vascular, sin crecimiento secundario, sin embargo puede haber engrosamiento del meristemo primario.

Presencia de médula. Típicamente presente el cambium y corcho vascular, crecimiento secundario evidente, manifestado como anillos de tejido vascular.

Hoja

Habitualmente en forma de lámina con venaciones paralelas. El mesófilo de hojas generalmente indiferenciadas en capas distintas.

Varias formas con venaciones nítidas. El mesófilo de las hojas puede ser diferenciado en esponjoso y en capas del parénquima en palizada.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Flor y semilla

Las partes de flores generalmente en tres o en múltiplos de tres. Embrión con un cotiledón.

Las partes de flores generalmente en cuatro o cinco o en múltiplos de cuatro o cinco. Embrión con dos cotiledones.

Debe de tomarse en cuenta que existen excepciones a estas generalizaciones (Trigiano y Gray, 2005). Figura 18. Anatomía de tallos mono y dicotiledóneos

(A) Sección transversal de un tallo de frijol (Phaseolus vulgaris). Nota la prominente médula central (Pith) y la capa de fibras del floema (PF). El xilema (SX) y floema secundario (SP), los cuales se originan a partir del cambium vascular interfascicular (IFC) y del cambium fascicular (FC), son también comunes en tallos de dicotiledóneas (recuadro). PP = flema primario; PX = xilema primario (Trigiano y Gray, 2005).

(B) Sección longitudinal de un tallo de frijol ilustrando la disposición de tejidos en el tallo. Las flechas indican vasos del xilema con patrones helicoidales de pared secundaria. E = epidermis (Trigiano y Gray, 2005).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

(C) Sección transversal de un tallo viejo de maíz (Zea mays). Nota los haces vasculares difundidos a través del tallo y embebidos en el tejido fundamental (Fund. Tiss.). Los haces vasculares contienen solo tejidos de xilema (X) floema primario (P) (ausente el cambium vascular) con una prominente laguna (L) o espacio libre (inserto). Las flechas indican células de esclerénquima de la cubierta (Trigiano y Gray, 2005).

(D) Sección transversal del tallo de nébeda (Nepeta cataria) y una sección longitudinal de una raíz adventicia. La raíz, la cual es originada cerca del floema primario y tejido vascular (flechas), se ha diferenciado y conectado al tejido vascular (Vass. tiss.) en el tallo. Coll = tejido del coléquima (Trigiano y Gray, 2005).

Tallo El meristemo de un brote o ápice (Figura 16A) está organizado en dos partes, la túnica o manto y el corpus o células centrales. Así como en el meristemo apical radicular, los meristemos primarios, el tejido fundamental, el procambium y el protodermo se encuentran en el extremo del brote. Sin embargo el extremo del brote es más complejo que el ápice de la raíz, como en hojas diferenciadas, yemas laterales (Figura 16B) y flores a partir de la zona periférica. El tallo de plantas está dividido en nodos (con hojas presentes) e internodos (con hojas ausentes). Las hojas están definidas por la presencia de una yema auxiliar (Figura 16B e insertos) disimulada entre el tallo principal y el peciolo de la hoja. La anatomía de las yemas auxiliares es equivalente al extremo de la yema inicial. La yema tiene la misma estructura que la del meristemo apical y sirve para iniciar una rama o un crecimiento lateral y/o flores en las condiciones ambientales adecuadas. La disposición de tejidos en tallos es variable y muy diferente que las encontradas en raíces. Así como en la anatomía de raíces, los tallos dico y monocotiledóneos son generalmente diferentes unos de otros. Estas diferencias se resumen en la Tabla 1. Las dicotiledóneas tienen generalmente haces vasculares primarios (fasciculares) dispuestos en un anillo alrededor de la médula central (Figura 18A y B). El xilema primario está localizado en dirección a la médula central, mientras que el floema primario está en dirección y contiguo al cortex. El fascicular puede tener una cofia de evidentes fibras del floema (Figura 18A). Una porción del cambium vascular (cambium intrafascicular) está Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

localizado entre el xilema primario y floema, con otra porción entre los haces vasculares (cambio interfascicular). Las actividades del cambium vascular producen tejidos vasculares secundarios, los cuales en su debido momento rodean a la médula con un anillo continuo de tejido vascular. El tejido vascular secundario eventualmente presiona y borra el tejido primario, especialmente en plantas perennes y leñosas. Es este anillo continuo de tejido vascular que la médula se diferencia fácilmente del cortex en dicotiledóneas. Las dicotiledóneas tienen otro meristemo lateral o secundario – felógeno o corcho del cambium. Este cambium o meristemo está formado en el cortex y es el responsable de la formación de células corticales adicionales (felodermo) y del reemplazamiento de la epidermis (peridermo). En el tallo de las monocotiledóneas los haces vasculares están dispersos a través del tejido fundamental, y da como resultado una médula y cortex no distinguible (Figura 18C). Los haces vasculares típicos están rodeados por una cubierta de células del esclerénquima, los cuales ayudan a soportar el tallo (Figura 18C recuadro). Adicionalmente muchos tallos de monocotiledóneas, tales como el maíz tienen en abundancia pequeños haces vasculares localizados justo por debajo de la epidermis, impartiendo rigidez al tallo y ayudando a la planta a resistir presiones medioambientales. Las monocotiledóneas no cuentan con cambium vascular y por lo tanto no tienen crecimiento secundario. Una importante característica de los tallos, especialmente en la producción de brotes en cultivo de tejidos o esquejes, es la habilidad de producir raíces adventicias (Figura 18D). Estas raíces tienen el origen en células del parénquima difundiéndose cerca del tejido vascular (floema). Ellos crecen de una manera similar a la de las raíces laterales. Figura 19. Anatomía de la hoja

(A) Sección transversal de una hoja de dicotiledónea (Ligustrum spp.) Se muestra

(B) Sección transversal de una hoja de maíz (Zea mays), una monocotiledónea. Nota que

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

una gran vena central, con xilema (X) hacia el haz (superficie adaxial) y floema (P) orientada hacia el envés (superficie abaxial). El mesófilo está diferenciado en capas en palizada (PL) y esponjoso (S), con estomas y células guarda (flechas) sobre la superficie (ver inserto) (Trigiano y Gray, 2005).

la epidermis contiene células buliformes especializadas y que el tejido mesófilo no está diferenciado en capas. Las estomas y las células guarda están asociadas con grandes cavidades subestomatas (Trigiano y Gray, 2005).

(C) Brotes adventicios y raíces formadas directamente de un segmento de hoja madre cultivada en medio conteniendo citocininas (Trigiano y Gray, 2005).

(D)Sección transversal de un segmento de hoja y segmentos longitudinales de varios brotes adventicios mostrados en la Figura 7.6C. Nota la falta de un callo intermediario y de conexiones vasculares (pares de flechas) entre los brotes adventicios y el mesófilo de hoja. E = epidermis; AM = meristemo apical. (Trigiano y Gray, 2005).

Hojas Las hojas son los órganos fotosintetizadores de angiospermas. Muchas hojas son relativamente delgadas y planas (con una gran área superficial comparada con el volumen) y están adaptadas para captar luz y facilita el intercambio de gas y agua con la atmósfera. Hay por supuesto, muchas excepciones. Las hojas pueden exhibir amplias y frecuentes modificaciones inusuales, dependiendo del medio ambiente, a la par de las asociaciones genéticas y a la evolución. Las hojas se encuentran en nodos del tallo y en varias disposiciones: opuestas (dos hojas en el nodo), alternas (una hoja en el nodo). Algunas plantas tienen hojas que son difíciles de reconocerlas como tales, sin embargo otras son muy obvias. De manera general, las hojas tienen tres partes –cuchilla o lámina, peciolos y estipulas – aunque no es inusual para muchas hojas la falta de peciolos (hoja sésil) y/o estipulas. La lámina puede ser simple y de varias formas, o compuestas, con hojas divididas en hojas pequeñas (hojuelas). Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Todas las hojas tienen una yema auxiliar asociada con ellas, la cual está localizada en el eje formado por el peciolo y el tallo. Las hojas compuestas no tienen yemas en la base en los puntos de ramificación o donde las hojuelas se unen al eje común. Muchas hojas de dicotiledóneas muestran patrones de venación con venas principales y secundarias (Figura 19A), mientras que las hojas de las monocotiledóneas generalmente tienen venaciones paralelas dispuestas con varias venas de mayor o menor tamaño (Figura 19B). Existen muchas excepciones a esta regla general. Anatómicamente, el tejido vascular en el nodo puede exhibir lagunas foliares, o tejido parenquimatoso en el cilindro vascular del tallo donde trazas foliares se doblan hacia el peciolo de la hoja. Las hojas generalmente no muestran crecimiento secundario y por lo tanto solo cuentan con tejidos primarios. El tejido de la hoja puede contener los tres tipos básicos de células. La epidermis de hoja tiene muchas características especiales, incluyendo una cutícula para prevenir la pérdida de pared, varios tricomas (pelos), células de guarda (en estomas) y células auxiliares para regular el intercambio de agua y gas, y otras células con funciones especializadas (Figura 19A y B). El mesófilo en las hojas de muchas dicotiledóneas se diferencia en una o más capas en palizada hacia la superficie adaxial (superior o haz) de la hoja, y el mesófilo esponjoso hacia la superficie abaxial (inferior o envés) de la hoja. Las células en palizada son alargadas y dispuestas de forma “apretada” y ortogonales a la superficie de la hoja. Las células del tejido mesófilo esponjoso son isodiamétricas a ligeramente alargadas y están distribuidas “holgadamente” con grandes espacios intracelulares (Figura 19A). El mesófilo de las hojas monocotiledóneas por lo general no se diferencia en capas y solo tiene parénquima esponjoso (Figura 19B). Existe tejido vascular como haces que atraviesa el mesófilo de la hoja. El tejido del xilema está generalmente hacia la parte superior de la hoja y el floema hacia la parte inferior de la hoja. En muchas plantas, especialmente los pastos y algunas otras monocotiledóneas, el tejido vascular puede estar rodeado por una envoltura de células del esclerénquima (Figura 19B).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Figura 20. Anatomía de la flor

(A) Sección transversal de una flor de una especie de Geranium spp (Stork’s-bill). Progresando del exterior al interior, sépalos (SEP), pétalos (PET), y filamentos (FIL; pedúnculos de la antera) y ovario (OVY). Ocupando el centro de la flor es el ovario (OVY), el cual está compuesto de cinco carpelos (CAR) en los cuales se encuntran dos óvulos (OVL). Nota: En esta sección, solo un óvulo puede ser visto en cada lóculo (espacio) (Trigiano y Gray, 2005).

(B) Sección longitudinal de la flor de Stork’s-bill vista en la Figura 7.7A. En esta vista dos carpelos (CAR) y lóculos (LOC) del ovario (OVY) son visibles, pera cada uno contiene sólo dos óvulos (OVL), de los cuales solo uno madurará. Nota los tricomas (pelos) sobre el estilo (STY). Los sépalos (SEP), pétalos (PET), y filamentos (FIL) están insertados bajo los ovarios sobre el receptáculo (REC) (Trigiano y Gray, 2005).

(C) Sección transversal de una flor de azucena (Lilium spp.). En esta vista, se muestran seis estambres (STA) conteniendo polen (POL). El tejido vascular (VAS) en el filamento y cuatro lóbulos de cada antera son evidentes. Para la flor de azucena, sépalos y pétalos son nombrados colectivamente como tépalos (TEP). OVY = ovario (Trigiano y Gray, 2005).

(D) Mayor magnificación de una antera de azucena. La pared de la antera está compuesta de epidermis (EPI), el endotecio (END), y el tapeto (TAP), el cual es este caso ha degenerado y está solo representado por remanentes de células. Están presentes muchos granos de polen –algunos en estados binucleados (flechas) (Trigiano y Gray, 2005).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Flores Las flores son órganos únicos de las angiospermas. Existe una diversidad increíble en morfología, desde las muy singulares y evidentes hasta las simples y casi imperceptibles. Ellas pueden encontrase solas, o pueden estar distribuidas en diferentes tipos de inflorescencias (múltiples flores en un eje común). Las flores contienen el sistema reproductor sexual de plantas. Ambos sexos, el femenino y el masculino pueden estar contenidos en la misma flor (monoicas) o en dos flores separadas o plantas (dioicas) diferentes para cada sexo (flores pistiladas o estaminadas). La meiosis y la alteración de generaciones se llevan a cabo en el óvulo (femenino) y en las anteras (masculino). Los gametofitos masculinos y femeninos están muy reducidos, consistiendo en pocas células. En aras de la simplicidad, se considerarán solo flores perfectas, en la que todas las partes de las flores, incluyendo tanto las estructuras masculinas y femeninas, están presentes. Las cuatro unidades básicas en una flor son los sépalos, pétalos, estambres y pistilos (Figura 20A, B y C). Las partes florales están dispuestas como espirales en el receptáculo (Figura 20D). Observando desde el exterior hacia el interior en la base del receptáculo, los sépalos –generalmente verdes, estructuras semejantes a las hojas – forman la primera espiral; estas forman el término colectivo “cáliz”. La siguiente capa está compuesta por los pétalos, los cuales pueden ser verdes, pero generalmente son blancos o coloreados. Los pétalos son generalmente más grandes que los sépalos y su término colectivo es “corola”. Los pétalos y sépalos juntos forman el “perianto”. En algunos casos cuando los sépalos y pétalos son similares o casi indistinguibles, son llamados “tépalos” (Figura 20C). Los estambres comprenden la porción masculina de la flor, constituyen el siguiente grupo de estructuras encontradas en la flor. Un estambre consiste de un filamento o pedúnculo (Figura 20A y B), los cuales terminan en una antera, el cual contiene el polen (Figura 20C y D). El pistilo, o la estructura femenina, la cual contiene una forma parecida a una frasco, ocupa el centro de la flor y consiste de una base henchida, el ovario, y un pedúnculo de diámetro menor (estilo) que termina en un tejido algo henchido, el estigma (Figura 20B). Las dicotiledóneas generalmente tienen sépalos, pétalos y estambres en espiral de cuatro o cinco o en múltiplos de cuatro o cinco (Figura 20A), sin embargo las monocotiledóneas habitualmente tienen estas estructuras en grupos de tres o múltiplos de tres (Figura 20C). Los pistilos pueden estar compuestos de un simple carpelo (estructura análoga a la hoja enrollada a lo largo de un eje y portando óvulos sobre la superficie interna) o de muchos carpelos (Figura 20A). Uno o más óvulos pueden estar unidos a una superficie común o placenta en cada carpelo (Figura 20B). Células madre de microsporas en la antera y una célula madre megaspora en cada óvulo sufre meiosis (división de reducción) seguida por mitosis para formar el gametofito masculino y femenino respectivamente. Al madurar, el gametofito masculino consiste de tres células o núcleos, sin embargo el gametofito femenino habitualmente tiene ocho células o núcleos. Los gametofitos son frecuentemente empleados en cultivo de tejidos en espera de obtener plantas haploides. Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

La polinización ocurre cuando el polen (contenido en el gametofito masculino) es transportado por el viento, por insectos o algún otro vector al estigma. Si el polen es compatible con el tejido femenino y el estigma es receptivo, el grano de polen podrá germinar por un tubo germinal y crecer hacia abajo a través del estilo hacia el gametofito femenino en el óvulo. El tubo del polen contiene dos núcleos espermáticos, de los cuales uno se fusiona con los núcleos polares para formar el núcleo del endospermo primario, mientras que el otro se une al óvulo para formar el cigoto. El núcleo del endospermo primario se divide y produce el endospermo, y el cigoto se divide, produciendo el suspensor y el embrión. El embrión se desarrolla en una estructura bipolar, poseyendo meristemos de brote y raíz exhibiendo simetría bilateral. El embrión cigótico dicotiledóneo tiene dos cotiledones (Figura 21A) y el embrión monocotiledóneo tiene un cotiledón (escutelo, Figura 21B). Los tegumentos (cubierta de las semillas) cubren el óvulo endurecido y el óvulo es ahora una semilla (Figura 21A). El endospermo puede estar completamente absorbido por el embrión o puede permanecer fuera del embrión. Embriones cigóticos inmaduros o partes de embriones (hipocotilos y cotiledones) son usados frecuentemente en experimentos en el cual el objetivo es la embriogénesis somática. Los embriones son fuentes excelentes de células relativamente indiferenciadas, totipotentes que son capaces de producir embriones somáticos y regenerar una planta completa. En muchos casos, los tejidos de embriones están expuestos a altas concentraciones de auxinas sintéticas para producir embriones somáticos (Figura 21C).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Figura 21. Embriones cigóticos y somáticos

(A) Sección longitudinal media aproximada de una semilla inmadura de la dicotiledónea, Cercis canadensis (redbud). Nota los bien desarrollados pares de cotiledones (CT), brotes meristemáticos (SM), e hipocotilo (H); el meristemo radicular (RM) no es notorio. E = endospermo, I = integumento, y PC = tejido provascular (Trigiano y Gray, 2005).

(B) Sección longitudinal media aproximada de una semilla de monocotiledónea (Dactylis glomerata). Desarrollo del meristemo del brote (SM) y radicular (RM), el cotiledón simple (S = escutelo) y la primera hoja (CO = coleoptilo) (Trigiano y Gray, 2005).

(D) Sección de un cotiledón (CT) y embrión somático (flechas) mostradas en la Figura 7C. Nota el bien desarrollado suspensor en

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

conteniendo 2,4-D. AR = raíz adventicia (Trigiano y Gray, 2005).

algunos de los embriones somáticos (Trigiano y Gray, 2005).

Tipos de células en plantas superiores y en cultivo de células y tejidos vegetales (Petersen y Alfermann, 1993) Se ha observado en términos generales, los diferentes tipos de células en una planta. Ahora se abreviará mediante este siguiente párrafo, qué tipo de células podemos encontrar en el cultivo de células y tejidos vegetales. La células meristemáticas, de las cuales se retiene su capacidad de división y esencialmente su estado indiferenciado, son pequeñas, aproximadamente isodiamétricas y contienen solo diminutas vacuolas. Sus paredes celulares son comparativamente delgadas y tienen un bajo nivel de ligninificación, es por ello que son deseables para la aislación de protoplastos. Las células meristemáticas muestran una alta actividad metabólica y una alta tasa de división celular. Por tener un bajo grado de desdiferenciación, las células meristemáticas son adecuadas para la iniciación de un cultivo de células y tejidos vegetales. Las células meristemáticas y las capas celulares en todo tipo de tejidos de plantas, por ejemplo, las capas del cambium de los haces vasculares, pueden ser proliferadas como células organizadas a células desorganizadas, base a todo tipo de cultivos de células, tejidos y órganos de plantas. Las capas de células epidérmicas parten de los límites de la planta y el medio ambiente. Estas células tienen paredes celulares rígidas e incrustadas con capas de cutina, suberina o ceras en su exterior, formando así una barrera real contra la pérdida de agua o la penetración de químicos o microorganismos. En el cultivo de tejidos vegetales este tipo de células no se emplean de forma común. Sin embargo es posible observarlos en el cultivo de órganos (cultivo de raíces o brotes) o en la regeneración de células de plantas epidérmica in vitro, pero no pueden servir a su propósito adecuadamente, debido al bajo grado de lignificación e insuficiente capa de cera. Sin embargo, cada planta puede ser aclimatada a las condiciones normales medioambientales.

Las células vasculares, esto es, las células alargadas del floema y xilema, tienen la función de translocar el agua, nutrientes inorgánicos y productos del metabolismo en plantas intactas. Las paredes celulares de estas células están altamente ligninificadas. Las células vasculares están presentes en las plantas regeneradas o en cultivo de órganos. Sin embargo, las células muy alargadas con paredes celulares reforzadas pueden ser vistas también Universidad Abierta y a Distancia de México

Figura 22. Microfotografía de una hoja de té. (SciPh, 2013).

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

en cultivo de callos o en cultivos por suspensión celular. Este proceso de diferenciación es considerado ser influenciado por el balance fitohormonal y la fase en el ciclo de crecimiento. Las células del mesófilo, que forman el principal tejido fotosintético en hojas organizadas, por consecuencia contienen gran cantidad de cloroplastos. Células equivalentes a células mesofílicas fotosintetizadoras pueden ser encontradas en cultivo de callos y en cultivos en suspensión en cultivos mixotrópicos y fotoautotrófos. También pueden ser encontrados en cultivos de brotes organizados tanto como en cultivos in vitro de plantas. El tipo de célula y la diferenciación estructural en el cultivo de células, tejidos y órganos de plantas, es principalmente determinado por las condiciones del cultivo, por ejemplo, el balance fitohormonal. El origen de un tejido de planta (explante) usado para el establecimiento de un cultivo in vitro es de menos importancia especialmente después de largos periodos de incubación.

Ultraestructura (Petersen y Alfermann, 1993) Las células de plantas superiores (ver Figura 9) son típicamente eucarioticas. Ellas tienen un núcleo el cual alberga el DNA organizado en cromosomas unidos a histonas y otras proteínas nucleares y uno o más nucléolos. El núcleo está rodeado por una membrana nuclear con poros los cuales median el contacto con el citoplasma. En el citoplasma existen organelos membranosos tales como retículo endoplasmático (ER), el aparato de Golgi, microcuerpos y vesículas. La mitocondria, rodeada por una doble unidad membranal contiene DNA mitocondrial, son organelos genéticamente semi-autonomos. Sus membranas internas contienen la cadena de transporte respiratorio. Los ribosomas como la maquinaria de síntesis de proteínas se encuentran en el citoplasma tanto como en la mitocondria y plástidos. Las células de plantas contienen microtúbulos y microfilamentos. La célula está rodeada por una unidad de membrana, el plasmalema. También son importantes la rígida pared celular, los plástidos y una gran vacuola central. La pared celular es secretada por el protoplasto sobre la parte exterior de la membrana plasmática, consistiendo en lamela media, la cual enlaza la célula adyacente manteniendo juntas las paredes primarias y secundarias.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Químicamente, la pared celular está formada a partir de pectinas, hemicelulosa y celulosa junto con proteínas. La pared celular rígida impone problemas sobre ciertas técnicas de cultivo de tejidos tales como la aislación de células solas, en la fusión de células y en la manipulación genética de células de plantas. Por lo tanto, la pared celular y la lamella media son frecuentemente removidas por tratamiento con celulasas y pectinasas originando los protoplastos. Estos protoplastos son capaces de regenerar su pared celular después de la remoción de enzimas hidrolíticas.

Figura 23. Bicapa lipídica en membrana celular., imagen creada, artwork (SciPh, 2013).

Figura 24. Esquema de una célula meristemática de planta

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

N, núcleo con cromatina y dos nucléolos; ER, retículo endoplásmatico con y sin ribosomas; D, dictiosomas (componentes del aparato de Golgi); V, vacuolas; M, mitocondria; P, plástidos (aquí: protoplástidos); m, microcuerpos; L, cuerpos lipídicos (oleosomas). La célula está rodeada por la membrana plasmática (plasmalema) y la primera pared celular. Las flechas externas sobre la célula indican plasmodesmatas. Las flechas dentro de la célula apuntan a microtubulos. (Figura tomada de Petersen y Alfermann,1993).

La vacuola está rodeada por una simple unidad membranal, el tonoplasto. Las células meristemáticas contienen una cantidad de pequeñas vacuolas, sin embargo las células diferenciadas tienen una gran vacuola central, la cual puede ocupar más del 90% del volumen celular. En la vacuola, agua, iones, enzimas, productos de almacenaje y otros compuestos, los cuales han sido aislados de metabolismo del citoplasma son acumulados. El agua almacenada en la vacuola en cooperación con la rígida pared celular Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

mantiene la turgencia de la célula, lo cual es necesario para mantener a la planta vertical. Los plástidos son organelos típicos de la planta. Ellos están rodeados por dos unidades de membrana y contienen DNA. Los plástidos fotosintéticos (cloroplastos) han desarrollado sistemas intermembranales transportando pigmentos fotosintéticos, clorofilas y carotenoides y la proteína compleja responsable para el transporte electrón fotosintético. La acumulación de productos de asimilación puede tomar lugar en forma de granos de almidón en los plástidos. Cuando las células de plantas se mantienen fuera de la luz, el cloroplasto degenera a pequeños protoplástidos decolorados sin capacidad fotosintética. Este es el caso en un gran número de células de plantas o cultivo de tejidos que se mantienen en cultivos heterotróficos. En el cultivo de tejidos todos los cloroplastos activos pueden solo ser encontrados en cultivo de células activas fotosintéticamente en luz.

1.2.3. Necesidades metabólicas (Hall et al., 1982) Regresando nuevamente a conceptos, encontramos que la palabra “metabolismo” hace referencia al “conjunto de reacciones químicas que efectúan constantemente las células de los seres vivos con el fin de sintetizar sustancias complejas a partir de otras más simples, o degradar aquellas para obtener estas” (RAE, 2013). Como necesidades metabólicas, están las sustancias simples y complejas que el concepto menciona y son los sujetos a nuestro estudio en esta sección. Como se sabe ahora, con el desarrollo de las técnicas de microscopía, se construyó el conocimiento de la estructura de la célula y en forma paralela, los químicos orgánicos fueron aislando y caracterizando regularmente los componentes químicos de las células vivas.

Se conoce así, que la gran diversidad de las cosas vivientes, pueden ser consideradas en términos de varias combinaciones de pequeñas cantidades de elementos, y que las moléculas biológicas aisladas fueron entidades inanimadas las cuales muestran complejidades considerables en estructura y Figura 25. Modelo molecular del ATP, el propiedades pero faltando, en sí mismas, las ATP es un acarreador de energía metabólica en las características de la vida. Este es el objetivo de los bioquímicos y biólogos celulares: el entender cómo las células (SciPh, 2013). moléculas interactúan y están organizadas para producir, mantener y perpetuar la vida.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Todas las células vivas están compuestas de macromoléculas similares, las cuales están compuestas del mismo tipo de moléculas pequeñas bloque constructoras. La gran diversidad en macromoléculas encontradas en sistemas vivos, surgen de la variada combinación de un siempre pequeño número de elementos. Por ejemplo, las células bacterianas contienen cerca de 3000 diferentes tipos de moléculas proteicas. Estas a la vez están formadas de varias combinaciones de únicamente veinte diferentes aminoácidos, los bloques constructores, mientras que los aminoácidos están compuestos de cuatro elementos. Estos veinte aminoácidos, los cuales combinándose forman proteínas son las mismas en todas las células, entre ellas las de las plantas, animales o microorganismos. El principal constituyente de las células vivas es el agua, la cual contribuye con cerca del 80-95% del peso fresco total de la mayoría de los organismos. De la materia seca, cerca del 90% esta comúnmente compuesta de cuatro clases principales de macromoléculas, el resto consiste de moléculas libres bloque constructoras, otros intermediarios metabólicos e iones inorgánicos. Las cuatro clases principales de macromoléculas son las proteínas, los ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos, todos ellos están basados en el elemento carbono (C) y contienen hidrógeno (H) y oxígeno (O) y muchos contienen nitrógeno (N). Estos cuatro elementos forman más del 90% de los átomos de muchos organismos (ver Tabla 2) (Nota, el carbono, cuando se encuentra solo, se considera carbón inorgánico). Tabla 2. Composición inorgánica del maíz y del hombre (%) Obtenida de Hall J.L. et al. (1982) Elemento O C H N Si K Ca P Mg S Cl Al Fe Mn Na

Zea mays 44.43 43.57 6.24 1.46 1.17 0.92 0.23 0.20 0.18 0.17 0.14 0.11 0.08 0.04 -

Homo sapiens 14.62 55.99 7.46 9.33 0.0005 1.09 4.67 3.11 0.16 0.78 0.47 0.012 0.47

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Zn Rb

0.010 0.005

Varios otros elementos tales como fosforo (P), azufre (S), potasio (K), magnesio (Mg) y cloro (Cl) son conocidos por ser esenciales para la vida, sin embargo solo veintidós de los 100 diferentes elementos encontrados sobre la tierra son esenciales cuando todos los organismos vivos son considerados. La importancia de algunos elementos se restringe y su función no es siempre entendida. Por ejemplo, el cobalto (Co) es requerido por algunos organismos pero este requerimiento no ha sido confirmado ampliamente para plantas superiores, sin embargo parece ser esencial para las bacterias fijadoras de nitrógeno que forman nódulos en raíces de las plantas leguminosas. ¿Cuál es la razón de la importancia de estos cuatro elementos principales: C, H, O y N? Se cree que es debido a que son los elementos más pequeños de la tabla periódica que pueden formar enlaces covalentes fuertes y estables por el intercambio de un par de electrones: esta formación del enlace es el primer paso en la formación de macromoléculas. Dado que la estabilidad de simples o múltiples enlaces incrementa con un decremento del tamaño atómico, el C, O y N son capaces de interactuar para formar dobles enlaces más estables mientras que el carbono también puede formar enlaces triples con N y con otros átomos de carbono. En su conjunto, los cuatro principales elementos de células vivas poseen un considerable intervalo de posibilidades, en lo que respecta a la formación de enlaces.

Bases para la nutrición de plantas (Jones J.B. 1998; Epstein, E., 2000) Retomemos nuevamente el concepto de esencialidad. Arnon y Stout, de la Universidad de California en 1939, publicaron los criterios para indicar la esencialidad de nutrientes, criterios que aun hoy en día son empleados:   

La omisión del elemento en cuestión puede resultar en un crecimiento anormal, fallo en completar el ciclo de vida o muerte prematura de la planta. El elemento debe ser específico y no reemplazable por algún otro. El elemento debe ejercer su efecto directamente sobre el crecimiento o sobre el metabolismo.

 Los elementos esenciales en plantas fueron establecidos por científicos en los alrededores de 1890, estos son: C, H, O, N, P, S, K, calcio (Ca), Mg y hierro (Fe), ya que Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

su ausencia o baja disponibilidad resultan en ya sea que la planta muera o que un crecimiento muy pobre ocurra, acompañado con síntomas visuales. Entre los años de 1922 y 1954, elementos adicionales fueron determinados como esenciales: manganeso (Mn), cobre (Cu), zinc (Zn), molibdeno (Mo), boro (B) y Cl. Los requerimientos de concentración en las plantas para un crecimiento y desarrollo normal varía ampliamente (1 a 1 millón –intervalo relativo-) entre los 13 de los elementos esenciales tales como se presenta en la Tabla 3. Por lo tanto, no es una sorpresa que muchos de los elementos esenciales no se hallan identificado hasta que la purificación de reactivos químicos se haya realizado, y que las técnicas y análisis químicos hayan roto las límites de detección por debajo del nivel de los miligramos. La forma química disponible y su función en plantas de los elementos esenciales son resumidas en la Tabla 4. El Cl y el Niquel (Ni), son los últimos elementos esenciales añadidos a la lista actual de 17. El Cl fue identificado en 1954 y el Ni sugerido en 1983 y confirmado en 1984 y 1987 (Epstein, E., 2000). Aunque ya han pasado casi 26 años desde que el último de los elementos esenciales fue identificado (Ni), hay fisiólogos vegetales que participan activamente en la determinación de qué elemento adicional puede ser añadido a la lista actual. Es el caso de estudios para el establecimiento del Co, del sodio (Na) y del silicio (Si) (Epstein, E., 2000). Tabla 3. Concentraciones promedio de algunos nutrientes minerales en plantas (peso seco) y que son suficientes para un adecuado crecimiento (Jones J.B. 1998)

Elemento Símbolo µmol/g ps mg/kg (ppm) Molibdeno Mo 0.001 0.1 Cobre Cu 0.10 6 Zinc Zn 0.30 20 Manganeso Mn 1.00 50 Hierro Fe 2.00 100 Boro B 2.00 20 Cloro Cl 3.00 100 Azufre S 30 Fósforo P 60 Magnesio Mg 80 Calcio Ca 125 Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Potasio Nitrógeno

K N

250 1000

Tabla 4. Algunos elementos esenciales, su forma química disponible y funciones en plantas (Jones J.B. 1998)

Elemento esencial C, H, O, N, S

P, B

Forma química disponible Iones en solución (HCO3, NO3-, NH4+, SO42-), o gases en la atmósfera (O2, N2, SO2) Iones en solución (PO43-, BO33-)

K, Mg, Ca, Cl

Iones en solución (K+, Mg2+, Ca2+, Cl-)

Cu, Fe, Mn, Mo, Zn

Iones o quelatos en suspensión (Cu2+, Fe2+, Mn2+, MoO-, Zn2+)

Funciones en la planta Constituyentes principales de sustancias orgánicas Reacciones de transferencia de energía y movimiento de carbohidratos Funciones no específicas o componentes específicos de compuestos orgánicos o para mantener el balance iónico. Transporte electrónico y catálisis de enzimas.

Es común la clasificación de elementos esenciales como: macro y microelementos. Macroelementos: Ca, C, H, Mg, N, O, P, K y S Microlementos: Cl, Cu, Fe, Mn, Mo, B, Ni y Zn

¿Y en cultivo de tejidos vegetales? (Petersen y Alfermann, 1993) En cuanto a los procesos metabólicos primarios, los cultivos de células de plantas muestran esencialmente las mismas propiedades que naturalmente las células vegetales Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

organizadas. Estos procesos metabólicos no se ven influenciados por el proceso mismo de cultivo. Una diferencia substancial el cultivo de células en suspensión, es el hecho de que están sumergidas en un líquido que contiene todos los nutrientes necesarios, los cuales pueden entrar a las células contra un gradiente de concentración solo por transporte activo, y este proceso por lo tanto requiere energía. Los carbohidratos, generalmente azúcares del medio de cultivo son metabolizados ya sea vía glicolisis, el ciclo del ácido tricarboxílico y la ruta pentosas fosfatos a fin de producir energía e intermediarios metabólicos, o son usados para la síntesis de polisacáridos tales como los componentes de la pared celular de la planta o almidón. Estos procesos metabólicos han demostrado ser activos en varios cultivos de células e incluso son capaces de fijar CO2. Estos procesos se vuelven más importantes en cultivos de células heterotróficas. En cultivos con adición de fuentes de carbohidratos, las células que contienen clorofila pueden aportar una cantidad considerable de su materia seca acumulada por la fijación fotosintética de CO2. Varios cultivos de tejidos han sido reportados en crecimiento fotoautotrófico. Por lo general estos cultivos requieren elevados niveles de CO2 pero sin ninguna fuente de carbono orgánico añadido de forma exógena. Los cultivos celulares pueden ser adicionados con diferentes fuentes de nitrógeno: nitrato, amonio y aminoácidos como los más comunes. Cuando diferentes compuestos nitrogenados son adicionados simultáneamente, primeramente los aminoácidos son consumidos, seguido por el amonio y nitratos. Por lo tanto la fuente de nitrógeno más fácilmente reducida es la consumida primero. En el cultivo de tejidos vegetales han sido reportadas activas la enzima nitrato y nitrito reductasa. La incorporación de amonio a través de compuestos orgánicos es similar que en plantas enteras, por lo tanto las enzimas glutámico deshidrogenasa, glutamato sintasa y glutamina sintasa se encuentran activas en cultivo de tejidos. La más común fuente de azufre en cultivo de tejidos vegetales es el sulfato, detrás de los aminoácidos cisteína y cistina. Dado que este es el estado de oxidación requerido para su posterior metabolización, las células sólo acoplan el sulfato con ATP por la ATP sulfurilasa dando lugar a el adenosin-5-fosfosulfato (APS) y pirofosfato. Las fitohormonas son suministradas exógenamente a la mayoría de los cultivos de tejidos vegetales lo que dirige a ciertos estados metabólicos y de estados de diferenciación de los cultivos de tejidos. En la planta misma no todas las células sintetizan fitohormonas, sin embargo la información genética para la síntesis de hormonas está presente en todas las células. El crecimiento y el desarrollo están regulados por los gradientes de fitohormonas a través de los órganos de plantas. Por lo tanto, el cultivo de células principalmente Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

requiere de fitohomonas exógenas, es conocido por sintetizar sus propias fitohormonas y por lo tanto son llamadas “adaptadas”. El metabolismo secundario de plantas muestra mucho más variación en plantas organizadas que en cultivo de órganos de plantas o en cultivos indiferenciados, ya que a menudo está asociado a cierto grado de diferenciación.

Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar. Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BCTV1 _U1_A1_XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BCTV1 _U1_ATR _XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

Cierre de la unidad Se han estudiado diversos conceptos necesarios para comprender el cultivo de tejidos vegetales, desde el necesario para nombrar a la parte vegetal separada de la planta e iniciar un cultivo de tejidos (explante) hasta el adjetivo adventicio relacionado con raíces y

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

órganos por ejemplo. Recordando, se pueden identificar ahora, dónde encontrar un tejido meristemático y cuáles son sus características. La organización de las plantas superiores, la organización celular y sus necesidades metabólicas estudiadas, harán comprender posteriormente, la relación que existe con los protocolos en biotecnología vegetal. La siguiente unidad llamada “Medios de cultivo”, permitirá conocer los principales medios de cultivo empleados y sus principales componentes, con el fin de ingresar a los protocolos de cultivo in vitro.

Para saber más

Atlas histológico interactivo. Universidad de Jaen, España. Departamento de Biología experimental. http://www.ujaen.es/investiga/atlas/ CIMMYT (2013). Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo. Centro de Recursos Fitogenéticos Wellhausen-Anderson. http://www.cimmyt.org/es/banco-degermoplasma Diccionario de biología (6 ed.) 2012, sólo en inglés (existe una versión de prueba por 20 días). http://www.oxfordreference.com/view/10.1093/acref/9780199204625.001.0001/acref9780199204625

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

Molecular Expressions Website information. Página en inglés de la universidad de Florida con acceso a diversos enlaces para observar varias fotogalerías. http://micro.magnet.fsu.edu/cells/plantcell.html UNIIQUIN (2013). Glosario de términos químicos y biológicos del Instituto de química de la UNAM. http://uniiquim.iquimica.unam.mx/GlosarioB/

Fuentes de consulta

1. Bhojwani S. S. y Razdan M.K. (1992). Plant Tissue Culture: theory and practice. USA: Elsevier. ISBN 0-444-42526-8 (Vol 5). 2. Epstein E. 2000. “The discovery of the essential elements”. En: Shain-Dow K y Shang-Fa Y. (Eds). Discoveries in plant biology (volume III). Singapore: World Scientific Publishing Co. ISBN: 981-02-3882-7 3. Free D. P. (2013). Free digital potos. http://www.freedigitalphotos.net/ 4. Hall J.L., Flowers T.J. y Roberts R.M. (1982). Plant cell structure and metabolism. New York: Logman. ISBN 0-582-44408X 5. Hurtado M.D.V. y Merino M.M.E. 1991. Cultivo de tejidos vegetales. México: Trillas. ISBN 968-24-2159-4.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Cultivo de tejidos vegetales I Generalidades

6. Krikorian A.D. (2004). Totipotency and proof of the concept: an historic perspective. En Murch S.J. y Saxena P.K. (Eds.). Journey a single cell to a plant.USA: Science Publisher, Inc. ISBN 1-57808-352-4. 7. Murch S.J. y Saxena P.K. (2004). Journey a single cell to a plant.USA: Science Publisher, Inc. ISBN 1-57808-352-4. 8. Ovando, I. (2013). Manual de cultivo de tejidos vegetales para ingenieros biotecnólogos. Cap. I. Documento electrónico de la Facultad de ciencias exactas y Naturales y agrimensura, de Corrientes (UNNE), Argentina. http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Manual%20c%20in%20v.pdf 9. Petersen M. y Alfermann A.W. (1993). Plant cell cultures. En: H.J. Rehm y G. Reed (Eds.) Biotechnology, Vol. 1: 577-614. 10. RAE (2013). Diccionario de la lengua española. Real academia española 2010. http://lema.rae.es/drae 11. Rehmeyer, J. 2008. A building of bubbles. http://www.cms.org.cn/cms/news/2008/20080731.htm 12. Rosas, G. (2007). Establecimiento del cultivo in vitro de Castilleja tenuiflora Benth. Tesis de maestría en desarrollo de productos bióticos. CEPROBI-IPN. 13. SciPh (2013). Science photo library. London, UK. http://www.sciencephoto.com/ 14. Trigiano R. N. y Gray D.J. (2005). Plant development and biotechnology. USA: CRC Press. ISBN 0-8493-1614-6.

Universidad Abierta y a Distancia de México