Unidad 2. Medios de cultivo

Cultivo de tejidos vegetales I Unidad 2. Medios de cultivo

Programa de la asignatura:

Cultivo de tejidos vegetales I

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Medios de cultivo

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Índice

Presentación de la unidad ......................................................................................................... 2 Propósitos de la unidad ............................................................................................................. 2 Competencia específica ............................................................................................................ 3 2.1. Reseña histórica del cuitivo de tejidos vegetales…..…………………………………...........3 2.1.1. Los primeros años…………...……………..……………………………………………….….4 2.1. 2. La era de desarrollos técnicos ................................................................................... …5 2.1.3. El pasado reciente y la era presente…...…………………………………………………....8 2.2. Medio de cultivo…………..…………..………………….………………….…………………..10 2.2.1. Ingredientes………………………………………………….………………………………...13 2.2.2. Preparación…………………………………………………………….………………………19 2.3. Reguladores de crecimiento vegetal……………………………………………………....….25 2.3.1. Auxinas…………………………………………………………………………………………26 2.3.2. Citocininas……………………………………………………………………………………...28 2.3.3. Giberelinas……………………………………………………………………………………..30 2.3.4. Ácido abscísico………………………………………………………………………………..31 2.3.5. Etileno…………………………………………………………………………………………..32 Actividades .............................................................................................................................. 32 Autorreflexiones....................................................................................................................... 32 Cierre de la unidad .................................................................................................................. 33 Para saber más ....................................................................................................................... 33 Fuentes de consulta………………………………………………………………………………….34 Anexo ...................................................................................................................................... 35

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Presentación de la unidad Después de una inmersión a conceptos variados, al descubrimiento de la anatomía de la planta y a los componentes de una célula, en esta unidad se busca descubrir cómo el Cultivo de tejidos vegetales fue construyéndose hasta el día de hoy.

Figura 1. Gottlieb Haberlandt en 1903.

(Laimer M. y Rücker W., 2003).

El primer cultivo de tejidos de plantas exitoso, fue desarrollado por Gottlieb Haberlandt, en el inicio del siglo XX; a partir de ese momento, el desarrollo del conocimiento en este campo implicó entre muchas otras cosas la elaboración de medios de cultivo y el descubrimiento de reguladores de crecimiento, puntos que también se abordarán en esta unidad.

Propósitos de la unidad

  

Analizar el contexto histórico del cultivo de tejidos vegetales.

Comparar los diferentes medios de cultivo empleados en cultivo in vitro.

Analizar las necesidades de reguladores de crecimiento en el establecimiento de un cultivo in vitro en relación a su destino final.

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Competencia específica

Clasificar los diferentes tipos de medios de cultivos y reguladores de crecimiento, para su empleo en el cultivo de tejidos vegetales con el fin de establecer un cultivo in vitro en laboratorio, considerando el destino final del cultivo.

2.1. Reseña histórica del cultivo de tejidos vegetales El cultivo de células y tejidos, también referido como cultivo in vitro, axénico o estéril, es una herramienta importante, ya sea en estudios básicos o en aplicaciones comerciales.

Quizás el paso más temprano hacia el cultivo de tejidos de plantas fue hecho por HenriLouis Duhumel du Monceau en 1756, quien, durante sus estudios pioneros sobre la cicatrización de plantas, observó la formación de callos (Gautheret, 1985).

Estudios extensivos por medio del microscopio, condujeron al desarrollo independiente y casi simultáneo a la teoría celular de Schleiden y Schwann (1839). Esta teoría sostiene que la célula es la unidad de estructura y función en un organismo, y por lo tanto es capaz de autonomía. Esta idea se puso a prueba por varios investigadores, pero el trabajo de Vöchting (1878) sobre la formación de callos y sobre los límites a la divisibilidad de segmentos de plantas fue quizás el más importante. Mostró que la parte superior de un segmento de tallo, siempre produce yemas o brotes y la parte inferior, callos o raíces, independientemente del tamaño, hasta alcanzar un segmento muy delgado. También demostró el desarrollo polar y reconoció que era una función de las células y su ubicación con relación a los extremos cortados.

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Las bases teóricas para el cultivo de tejidos de plantas fueron propuestas por Gottlieb Haberlandt en la Academia Alemana de Ciencias en 1902 sobre sus experimentos relativos al cultivo de células individuales. Él opinó lo siguiente: “[a] mi conocimiento, no se han hecho intentos organizados de manera sistemática al cultivo de células vegetativas aisladas de plantas superiores. Sin embargo, los resultados de tales experimentos de cultivos deben dar una idea interesante para las propiedades y potencialidades que posee la célula como un organismo elemental” (Haberlandt, 1902). Él experimentó sin éxito, con células aisladas de hojas y otras células funcionalmente diferenciadas, aun así, predijo que “se podría cultivar con éxito embriones artificiales a partir de células vegetativas”. Así estableció claramente el concepto de totipotencia e indicó además que “la técnica de cultivos de células vegetales aisladas en solución nutritiva permite la investigación de los problemas importantes a partir de un nuevo enfoque experimental”. Sobre la base de 1902 y su experimentación pionera antes y después, Haberlandt se reconoce justificadamente como el padre del cultivo de tejidos de plantas. Mayores detalles sobre los primeros eventos pioneros en el cultivo de tejidos vegetales se pueden observar con los trabajos de White (1963), Bhojwani y Razdan (1983) y Gautheret (1985).

2.1.1. Los primeros años Usando un enfoque diferente, Kotte (1922) (un estudiante de Haberlandt y Robins), logró cultivar ápices de raíces aisladas. Este enfoque del uso de explantes con células meristemáticas condujo al cultivo exitoso e indefinido de ápices de raíces de tomate por White (1934). Estudios posteriores permitieron para el cultivo de raíces un medio definido completo. Tales cultivos de raíces fueron usados inicialmente para estudios virales y más tarde como una herramienta importante para los estudios fisiológicos (Street, 1969). El éxito también se logró con el cultivo de yemas por Loo (1945) y Ball (1946).

El cultivo de embriones tuvo también su inicio a principios del siglo XX, cuando Hanning en 1904, cultivó satisfactoriamente embriones de crucíferas y Brown en 1906 embriones de cebada. Esto fue seguido por el exitoso rescate de embriones a partir de semillas no viables de una cruza entre Linum perenne X L. austriacum (Laibach, 1929). Tukey (1934) fue capaz de permitir el desarrollo de un embrión completo de algunas especies de maduración temprana de árboles frutales, proporcionando de este modo una de las primeras aplicaciones del cultivo in vitro.

Los primeros y verdaderos cultivos de tejidos vegetales se obtuvieron por Gautheret (1934, 1935) a partir del tejido del cambium de Hacer pseudoplatanus. También tuvo éxito con explantes similares de Ulmus campestre, Robina pseudoacacia y Salix caprea, usando el medio de la solución de Knop con agar solidificado, glucosa y clorhidrato de cisteína (cisteína-HCl). Posteriormente, la viabilidad de uso del ácido indol-acético y el Universidad Abierta y a Distancia de México

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suplemento de vitaminas del grupo B permitieron que los tejidos pudieran estar en crecimiento continuo e incluso lograr diferenciar raíces y brotes, esto fue reconocido en las demostraciones casi simultaneas de Gautheret y Nobécourt (1939) con tejidos de raíz de zanahorias y de White (1939) con tejido tumoral de un híbrido entre Nicotiana glauca X N. langsdorffii, el cual no requirió de la auxina. Todos los explantes iniciales utilizados por estos pioneros incluyeron el tejido meristemático. Estos resultados sientan las bases para el aumento dramático en el uso de los cultivos in vitro en las décadas posteriores.

2.1.2. La era de desarrollos técnicos Las décadas de 1940, 1950 y 1960 proveyeron de tiempos exitosos para el desarrollo de nuevas técnicas y para el mejoramiento de aquellas ya disponibles. La aplicación del agua de coco (frecuentemente referidas como leche de coco) por Van Overbeek et al. (1941) permitieron el cultivo de embriones jóvenes y otros tejidos recalcitrantes, incluyendo de monocotiledóneas. De igual forma el establecimiento de cultivos de callos de varias especies, incluyendo de dicotiledóneas leñosas y herbáceas, de gimnospermas tales como tejidos de “agalla de la corona” (tumor en plantas causado por Agrobacterium tumefasiens). También en este mismo periodo de tiempo, fue reconocido que las células en cultivo experimentan varios cambios, incluyendo pérdida de sensibilidad o habituación al aplicar auxinas (Gautheret, 1942, 1955), así como la variabilidad de meristemos formados de callos (Gautheret, 1955; Nobécourt, 1955). Sin embargo, fue durante este periodo, que la mayoría de las técnicas in vitro empleadas en la actualidad se desarrollan en gran medida.

Estudios por Skoog y sus asociados mostraron que la adición de adenina y altos niveles de fosfato permitieron que tejidos de médula (pith) no meristemática fueran cultivados produciendo brotes y raíces, pero solo en la presencia de tejido vascular (Skoog y Tsui, 1948). Estudios posteriores usando ácidos nucleícos permitieron descubrir la primera citocinina (cinetina) como el producto de degradación del DNA de esperma de arenque (Miller et al., 1955). La disponibilidad de cinetina, incrementó posteriormente el número de especies que pueden ser cultivadas indefinidamente, pero quizás lo más importante, es que permitió reconocer el balance exógeno de auxinas y citocininas en el medio influye el destino morfogenético de callos de tabaco (Skoog y Miller, 1957). Un alto nivel relativo de auxina/cinetina, favorecen el enraizamiento, a la inversa, conducen a la formación de brotes, y los niveles intermedios a la proliferación de callos. Este modelo morfogénico ha sido adecuado para operar en numerosas especies. Citocininas nativas fueron descubiertas subsecuentemente en varios tejidos, incluyendo en el agua de coco (Letham, 1974). Además se reportaron independientemente por Reinert, (1958, 1959) y Steward et al. (1958) la formación de yemas de brotes unipolares y raíces, la formación de embriones bipolares somáticos (zanahoria).

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El cultivo de células individuales (y pequeños agregados celulares) fue obtenido mediante agitación de cultivo de callos de Tagetes erecta y tabaco, colocados subsecuentemente sobre papel filtro, permaneciendo en él los callos bien establecidos, dando así origen al llamado cultivo madre (Muir et al. 1954, 1958). Posteriormente, las células individuales pueden ser crecidas en medio líquido, en los cuales los tejidos pueden ser crecidos.

Bergmann (1959) incorporó células individuales en una capa de 1 mm de medio sólido donde fueron formadas algunas colonias. Esta técnica es ampliamente usada para clonar células y en cultivo de protoplastos. El primer cultivo a gran escala de células de plantas fue reportado por Tulecke y Nickell (1959), quién hizo crecer células en suspensión de Ginkgo, Holly (Ilex), Lolium y rosas en simples garrafones de 20 litros.

Vasil y Hildebrandt (1965), utilizando agua de coco como un aditivo al medio fresco finalmente realizaron el sueño de Haberlandt de producir una planta completa (tabaco) a partir de una célula individual, demostrando así la totipotencia de las células de plantas.

Los primeros medios nutritivos usados para el crecimiento de tejidos de plantas in vitro fueron basados en la formulación de nutrientes para plantas completas. Las soluciones de Knop y la de Uspenski y Uspenskia fueron muy usadas proveyendo al menos 200 mg/l de las sales totales. Heller (1953), basado en estudios sobre zanahorias y en tejidos de enredadera de Virginia, incrementó la concentración de sales dos veces, y Nitsh y Nitsh (1956) incrementaron posteriormente la concentración de sales a 4 g/l, basados en sus trabajos con la alcachofa de Jerusalén. Sin embargo, estos cambios no proporcionaron el crecimiento óptimo para tejidos, siendo requeridos frecuentemente complementos, tales como el extracto de levadura, la proteína hidrolizada y el agua de coco. En diferentes aproximaciones basadas en el estudio de la ceniza de los callos de tabaco, Murashige y Skoog (1962) desarrollaron un nuevo medio. Las concentraciones de algunas sales fuero 25 veces más que las de la solución de Knop. En particular el nivel de NO3- y NH4+ fueron muy altos y el arreglo de micronutrientes se incrementó. Esta formulación permitió un incremento en el número de especies de plantas cultivadas, muchas de ellas empleando solo un medio definido consistiendo de macro y micro nutrientes, una fuente de carbono, nitrógeno reducido, vitaminas del grupo B y reguladores de crecimiento.

Ball en 1946, produjo con éxito plántulas por cultivo de extremos de brotes, pero la importancia de esta conclusión no fue reconocida sino hasta que Morel (1960), usando esta aproximación obtuvo orquídeas libres de virus, realizando una potencial propagación clonal. Este potencial fue rápidamente explotado, particularmente con ornamentales. Los primeros estudios de White (1934) mostraron que el cultivo de los extremos de raíz (cofia) era libre de virus. Posteriormente Limmaset y Cornuet (1949) observaron que la concentración de virus en los brotes era muy lentos. Esto fue confirmado cuando plantas libres de virus de Dhalia se obtuvieron a partir de plantas infectadas al cultivar extremos de brotes (Morel y Martin, 1952). La eliminación de virus fue posible ya que el tejido

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vascular, en el que el virus se encuentra, no se extiende a los ápices de brotes o raíces.

El método fue posteriormente refinado por Quack (1961) y es ahora usado rutinariamente.

Las técnicas para el cultivo in vitro de partes florales y semillas fueron desarrolladas durante este periodo. El primer intento de un cultivo de ovarios fue realizado por LaRue, C.D. (1942), quien obtuvo un crecimiento limitado de ovarios acompañados por enraizado de pedicelos en muchas especies. Comparados a estudios con embriones, el éxito del cultivo de óvulos fue muy limitado.

En la polinización y fertilización in vitro fueron pioneros Kanta, K. et al. (1962) usando Papaver somniferum. La propuesta involucró el cultivo de óvulos extirpados y granos de polen en el mismo medio, empleándose para producir híbridos inter-genéricos e interespecíficos. Años antes, Tuleke (1953) obtuvo colonias de células en cultivo a partir de granos de polen de Ginkgo, y Yamada et al. (1963) obtuvieron callos haploides a partir de anteras de Tradescantia reflexa. Sin embargo fue hasta los resultados de Guha y Maheshwari (1964, 1966) que las plantas aploides pudieron ser obtenidos de cultivos de anteras de Datura innoxia, abriendo una nueva era a la androgénesis. Plantas haploides de tabaco fueron obtenidas por Bourgin y Nitsh (1967), conformando de esa manera la totipotencia de los granos de polen.

Los protoplastos, o células de plantas sin sus paredes celulares, fueron aisladas primero de manera mecánica a partir de tejidos plasmolizados hace más de 100 años por Klercker en 1892, y la primera fusión fue lograda por Küster en 1909. Sin embargo, esta tecnología permaneció sin explotar hasta el uso de celulasa fungal por Cocking (1960), acomodándose a esta nueva era. En la década de 1970, la disponibilidad comercial de enzimas degradadoras de pared celular, permitieron su amplio uso y el desarrollo de la tecnología de protoplastos. La primera demostración de totipotencia de protoplastos fue realizada por Takebe et al. (1971), quien obtuvo plantas de tabaco a partir de protoplastos mesofílicos. Esto fue seguido por la generación de la primer planta hibrida inter-específica (Nicotiana glauca X Nicotiana langsdorffii) realizada por Carlson et al. (1972).

Braun (1941) mostró que en el girasol Agrobacterium tumefaciens puede inducir tumores, no solo en sitios inoculados pero también a puntos distantes. Estos tumores secundarios se encontraron libres de la bacteria y estas células pueden ser cultivadas sin auxinas (Braun y White, 1943). Otros experimentos mostraron que tejidos de “agalla de la corona”, libres de bacterias, contenían un principio activo inductor de tumores (PIT), el cual fue probablemente una macromolécula (Braum 1950). La naturaleza del PIT, fue elaborada en la década de 1970 (Zaenen et al. 1974), pero el trabajo de Braum sirvió de base para las transformaciones basada en Agrobacterium. Hay que señalar que el hallazgo de Ledoux (1965) en donde células de plantas podían tomar e integrar DNA, permaneció en polémica por un tiempo mayor a esa década.

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2.1.3. El pasado reciente y la era presente Basándonos en la disponibilidad de las diferentes técnicas in vitro discutidas en los párrafos anteriores, no es de sorprender, que lo que se inició en la década de 1960, originó un incremento en las aplicaciones a los varios problemas en biología básica, agricultura, horticultura y forestería a través de las décadas de 1970 y 1980. Estas aplicaciones pueden ser divididas convenientemente en cinco grandes áreas: a) comportamiento celular, b) modificación y mejoramiento de plantas, c) plantas libres de virus y almacenamiento de germoplasma, d) propagación clonal y e) formación de productos.

Durante la década de 1990 la expansión continúa en las aplicaciones de las tecnologías in vitro se observan en un incremento en el número de especies de plantas. Las técnicas del cultivo de tejidos de plantas han sido empleadas en todo tipo de plantas, incluyendo cereales y pastos (Vasil y Vasil, 1994), legumbres (Davey et al. 1994), cultivos de vegetales (Reynolds, 1994), papa (Jones, 1994) y otras raíces y cultivos de tubérculos (Krikorian, 1994), semillas de aceite (Palmer y Keller, 1994), frutas de zonas templadas (Zimmerman y Swartz, 1994) y tropicales (Grosser, 1994), cultivo de plantaciones frutales (Krikorian, 1994), árboles forestales (Harry y Thorpe, 1994), y por supuesto plantas ornamentales (Debergh, 1994). Como se ha podido ver hasta ahora, la aplicación de la tecnología de células in vitro va más allá de la micropropagación y abarca a todos los métodos in vitro que son relevantes o posibles para la especie y el problema(s) del que se trate. Sin embargo, sólo se ha logrado un éxito limitado en la explotación de la variación somaclonal o en la regeneración de plántulas útiles a partir de células mutantes; de igual manera, la promesa inicial de la tecnología de protoplastos permanece en gran medida sin cumplirse. Se está avanzando en la extensión de la tecnología de criopreservación para el almacenamiento de germoplasma (Kartha y Engelmann, 1994). Progresos también se están realizando en la tecnología de semillas artificiales (Redenbaugh, 1993).

El cultivo de células ha permanecido como una herramienta importante en el estudio de biología de plantas, por ejemplo, sobre cambios cromosómicos en cultivos celulares (Kaeppler y Phlilips, 1993) y del ciclo celular (Komamine et al. 1993; Trehin et al. 1998).

Los cultivos celulares han permanecido como herramientas extremadamente importantes en el estudio del metabolismo primario.; por ejemplo, el uso de células en suspensión para desarrollar sistemas de transcripción in vitro (Suguira, 1997) o la regulación del metabolismo de carbohidratos en transgénicos (Stitt y Sonnewald, 1995). El desarrollo de técnicas de cultivo de células de plantas medicinales, ha permitido la identificación de más de 80 enzimas de la biosíntesis de alcaloides (Kutchan, 1998). Información similar surge de la utilización de cultivos celulares para estudios moleculares y bioquímicos en otras áreas del metabolismo secundario, generando así actividad de investigación sobre

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ingeniería metabólica sobre la producción de metabolitos secundarios (Verpoorte et al.

1998).

Los cultivos de células permanecen como herramienta importante en estudios de morfogénesis. Estudios moleculares, fisiológicos y bioquímicos han permitido mejores entendimientos sobre la citodiferenciación (Fukuda, 1997), organogénesis (Thorpe, 1993; Thompson & Thorpe, 1997), y embriogénesis somática (Nomura & Komamine, 1995; Dudits et al., 1995).

Avances en la biología molecular permitieron en ingeniería genética, inserciones precisas de genes a partir de diversos sistemas biológicos.

La ola inicial de investigación en biotecnología de plantas ha sido conducida principalmente por industrias de semillas y agroquímicos y ha sido concentrada en “rasgos agronómicos” de relevancia directa a estas industrias, notamente al control de insectos, malezas y enfermedades de plantas (Fraley, 1992). Al presente, más de 100 especies de plantas han sido manejadas genéticamente incluyendo casi todos los principales cultivos de monocotiledóneas y de un número en incremento de algunas plantas leñosas. La investigación común está dirigida a los sistemas de transferencia de genes para todos los cultivos de importancia económica. La siguiente ola en biotecnología agrícola está relacionada con los progresos con aplicaciones biotecnológicas de interés al procesamiento de alimentos, especialmente de industrias químicas y farmacéuticas.

El énfasis común e importancia de la biotecnología de plantas puede ser extraída de las conclusiones de Congresos Internacionales de Cultivo de células y tejidos de plantas, por ejemplo, el ocurrido en Israel en junio de 1998 “Biotecnología de plantas y biología in vitro en el siglo XXI” o el ocurrido en Estados Unidos en junio de 2002 con el tema “Biotecnología de plantas y más allá”.

Ambos congresos fueron desarrollados a través de un programa científico que se centró en los acontecimientos más importantes, tanto en desarrollos básicos como en los aplicados, en las áreas de cultivo de tejidos vegetales y de biología molecular y su impacto en la mejora de las plantas y la biotecnología. En ellos se muestra claramente al cultivo de tejidos de hoy y hacia dónde se dirige (esto es, el cultivo de tejidos vegetales como un socio igual con la biología molecular), como una herramienta de la biología básica de las plantas y en diversas áreas de aplicación. De hecho los avances en la biotecnología aplicada de plantas están totalmente en juego y es, sin duda el estímulo al

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progreso científico fundamental, que sigue siendo la mejor esperanza para lograr una agricultura sostenible y estable medioambientalmente. Los avances realizados en los últimos 100 años con la tecnología in vitro ha ido mucho más allá de lo que Haberlandt y los otros pioneros hubiera imaginado.

2.2. Medio de cultivo (Beyl CA, 2005) La selección del medio de cultivo de tejidos vegetales, depende de la especie a ser cultivada. Algunas especies son sensibles a la salinidad o con diferentes requerimientos de reguladores de crecimiento de plantas (RCP). La edad de la planta también tiene efecto. Por ejemplo, tejidos juveniles habitualmente regeneran raíces más rápidamente que un tejido adulto. Es importante también el tipo órganos a cultivar; por ejemplo, las raíces requieren tiamina. Cada efecto de cultivo tiene sus requisitos, tales como auxinas para la inducción de raíces adventicias, y la variación de la relación citocinina: auxina para la iniciación y desarrollo de brotes adventicios.

El desarrollo de las formulaciones de los medios de cultivo fue el resultado de pruebas sistemáticas y de experimentación. La tabla 1 provee una comparación de la composición de los más comúnmente empleados medios de cultivo de tejidos con respecto a sus componentes en miligramos por litro y unidades molares (para lectura de fórmulas químicas, diríjase al anexo de esta unidad). El medio Murashige y Skoog (MS) (1962) es el medio de cultivo de tejidos base más adecuado y más comúnmente empleado para regeneración de plantas a partir de tejidos y callos. Este medio fue desarrollado para desarrollar plantas de tabaco y está basado principalmente sobre los análisis de minerales obtenidos de tejidos de la planta de tabaco. Este medio es “alto en sales”, debido al contenido de sales de K y N. El medio Linsmaier y Skoog (1965) es básicamente el medio de Murashige y Skoog (MS) (1962) con respecto a sus porciones inorgánicas, en donde solo el inositol y la tiamina HCl (tiamina clorhidrato) quedan entre los componentes orgánicos. Para contrarrestar la sensibilidad a las sales de algunas especies leñosas, Lloyd y McCow (1980) desarrollando el medio para plantas leñosas (WPM).

El medio de Gamborg (B5) (Gamborg et al., 1968) fue diseñado para el cultivo de callos de soya, y contiene menos cantidades de nitratos y particularmente sales de amonio que el medio MS. Sin embargo el medio B5 fue originalmente desarrollado con el propósito de obtener callos o par el uso en cultivos en suspensión, es adecuado para trabajar como medio basal en la regeneración de plantas completas. Sheck y Hildebrandt (1972) desarrollaron el medio SH para el cultivo de callos de mono y dicotiledóneas. El medio de White (White, 1963), fue diseñado para el cultivo de raíces de tomate, este tiene una baja concentración de sales en relación al medio MS. El medio de Nitsch (Nitsch y Nitsch,

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1969) fue desarrollado para el cultivo de anteras, contiene una concentración intermedia de sales entre el medio MS y el de White.

Muchas compañías venden mezclas preparadas y empaquetadas de las recetas más conocidas. Estas son fáciles de hacer ya que solamente es necesario disolver el contenido del paquete, mezclar en un volumen específico de agua. Estas pueden ser adquiridas como sales, vitaminas, o como mezcla entera con o sin reguladores de crecimiento, agar y sacarosa. Esto es muy conveniente, ya que es menos propenso a incluir errores individuales, y se evitan tener almacenadas soluciones innecesarias. Sin embargo, estos son más caros que si se elaboran los medios por sí mismos.

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Medios de cultivo Tabla 1.Composición de cinco medios de cultivo de tejidos más comunes en concentraciones de miligramos por litro y concentraciones molares (Beyl CA, 2005)

Compuesto

MS

Gamborg B5

WP

Nitsch and Nitsch

Schenk and Hildebrandt

White

300 (2.6) 151 (1.0) 400 (1.6) 2500 (24.8) -

288 (1.2) 737 (3.0) 65 (0.9) 80 (0.8) 16.5 (0.12) 200 (1.4)

5 (80) 0.1 (0.4) 0.2 (0.08) 20.1 (54) 15.4 (54) 10.0 (59) 0.1 (0.4) 0.1 (0.4) 1 (3)

1.5 (25) 0.01 (0.04) 2.5 (6.2) 5.04 (30) 0.001 (0.001) 2.67 (9)

1000 (5500) 5.0 (40.6) 0.5 (2.4) 5.0 (14.8) -

3.0 (40) 0.5 (4.1) 0.1 (0.45) 0.1 (0.3) -

Macronutrientes en mg/l (mM) NH4NO3 NH4H2PO4 (NH4)2SO4 CaCl2∙2H2O Ca(NO3)2∙4H2O MgSO4∙7H2O KCl KNO3 K2SO4 KH2PO4 NaH2PO4 Na2SO4

1650 (20.6) 332.2 (2.3) 370 (1.5) 1900 (18.8) 170 (1.3) -

134 (1.0) 150 (1.0) 250 (1.0) 2500 (24.8) 130.5 (0.9) -

400 (5.0) 96 (0.7) 556 (2.4) 370 (1.5) 990 170 (1.3) -

H3BO3 CoCl2∙6H2O CuSO4∙5H2O Na2EDTA Fe2(SO4)3 FeSO4∙7H2O MnSO4∙H2O KI MoO3 Na2MoO4∙2H2O ZnSO4∙7H2O

6.2 (100) 0.025 (0.1) 0.025 (0.1) 37.3 (100) 27.8 (100) 16.9 (100) 0.83 (5) 0.25 (1) 8.6 (30)

3.0 (49) 0.025 (0.1) 0.025 (0.1) 37.3 (100) 27.8 (100) 10.0 (59) 0.75 (5) 0.25 (1) 2.0 (7.0)

6.2 (100) 0.25 (1) 37.3 (100) 27.8 (100) 22.3 (132) 0.25 (1) 8.6 (30)

Mio-inositol Glicina Ác. nicotínico Pirodoxina HCl Tiamina HCl Biotina

100 (550) 2.0 (26.6) 0.5 (4.1) 0.5 (2.4) 0.1 (0.3) -

100 (550) 1.0 (8.2) 0.1 (0.45) 10.0 (30) -

100 (550) 2.0 (26.6) 0.5 (4.1) 0.5 (2.4) 1.0 (3.0) -

166 (1.1) 185 (0.75) 950 (9.4) 68 (0.5) -

Micronutrientes en mg/l (mM) 10 (162) 0.025 (0.1) 37.3 (100) 27.8 (100) 18.9 (112) 0.25 (1) 10 (35)

Orgánicos en mg/l (µM) 100 (550) 2.0 (26.6) 5.0 (40.6) 0.5 (2.4) 0.5 (1.5) 0.2 (0.05)

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2.2.1. Ingredientes (Beyl CA, 2005) El crecimiento y desarrollo de explantes in vitro es el producto de la genética, del medio ambiente que lo rodea y componentes del medio de cultivo de tejidos.

El medio de cultivo de tejidos consiste de 95% de agua, macro y micro-nutrientes, RCP, vitaminas, azúcar (ya que las plantas no son fotosintéticamente competentes), y en algunas ocasiones varios materiales orgánicos simples o complejos. Considerándolo todo, cerca de veinte diferentes componentes son generalmente necesarios.

Agua Agua de alta calidad es un ingrediente requerido del medio de cultivo de tejidos de plantas. De manera ordinaria, el agua de la llave contiene cationes, aniones, partículas de varios tipos, microorganismos, y gases que la hacen no útil para su uso en el medio de cultivo de tejidos. Existen varios métodos para tratar el agua, incluyendo filtración a través de carbón activado para remover compuestos orgánicos y cloro, des-ionizar o desmineralizar haciendo pasar agua a través de resinas de intercambio iónico para remover impurezas ionizadas disueltas, y la destilación, la cual elimina muchos iones e impurezas particuladas, químicos volátiles y no volátiles, materia orgánica y microoganismos. El proceso de ósmosis inversa, remueve el 99% de impurezas ionizadas disueltas, este proceso hace uso de membranas semipermeables a través del cual una porción de agua es forzada a atravesar bajo presión; el resto del agua conteniendo impurezas es eliminado. El método universalmente más fiable para la purificación de agua para el cultivo de tejidos es un tratamiento de desionización seguida por una o dos veces la destilación en vidrio, aunque la simple desionización algunas veces es usada satisfactoriamente. En algunos casos, los nuevos equipos de purificación por ósmosis inversa (Milli-RO™, Millipore™, RO pure™, Barnstead™, Bion™, Pierce™), combinado con cartuchos de intercambio iónico, adsorción, y equipos por filtrado con membrana, han reemplazado la tradicional destilación de agua en vidrio.

Elementos inorgánicos minerales Así como el crecimiento de plantas in vivo requiere muchos elementos diferentes, ya sea del suelo o de fertilizantes el crecimiento de tejidos de plantas in vitro requiere una combinación de macro y micronutrientes (ver Tabla 2). La selección de las micro o macro sales y sus concentraciones es dependiente de la especie. El medio MS es muy popular ya que muchas plantas reaccionan a él favorablemente; si no es así, será debido al alto contenido de sales.

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Los macronutrientes son requeridos en cantidades milimolares (mM) en la mayoría de los medios basales de plantas. El nitrógeno (N) es generalmente suministrado en forma de iones de amonio (NH4+) y nitrato (NO3-); sin embargo es usado también en algunas ocasiones en forma de fuentes orgánicas complejas, tales como la urea, aminoácidos tales como la glutamina, o caseína hidrolizada, la cual es una mezcla compleja de aminoácidos y amonio. Aun así muchas plantas prefieren NO3- a NH4+, y pueden diferenciarse en el balance correcto de los dos iones para un óptimo crecimiento y desarrollo in vitro para las especies seleccionadas.

Tabla 2. Soluciones (100X) de macro y micro nutrientes del medio Murashige y Skoog (MS) (Beyl CA, 2005) Stock (100X) Nitrato

Componente NH4NO3 KNO3 MgSO4∙7H2O MnSO4∙H2O ZnSO4∙7H2O CuSO4∙5H2O CaCl2∙2H2O KI CoCl2∙6H2O KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4 FeSO4∙7H2O NaEDTA

Sulfato

Haluros

PBMo

NaFeEDTAc

Cantidad 165.0 g 190.0 g 37.0 g 1.7 g 0.86 g 250 mga 44.0 g 83.0 mg 250 mga 17.0 g 620.0 mg 25.0 mg 2.78 g 3.74 g

Para notas a, b y c, leer el texto.

Además, el suministro de nitrógeno, potasio, magnesio, calcio, fósforo y azufre en el medio de cultivo como diferentes compuestos, referenciados como macro-sales. MgSO4 provee de ya sea magnesio y azufre; NH4H2PO4, KH2PO4 o NaH2PO4 proveen de fósforo; CaCl2∙2H2O o Ca(NO3)2∙4H2O provee de calcio; y KCl, KNO3 o KH2PO4 provee de potasio.

El cloro es provisto por el KCl y/o CaCl2∙2H2O. Las micro-sales típicas incluyen boro (H3BO3), cobalto (CoCl2∙6H2O), hierro (un complejo de FeSO4∙7H2O y Na2EDTA, o raramente, Fe2[SO4]3), manganeso (MnSO4∙H2O), molibdeno (NaMoO3), cobre (CuSO4∙5H2O) y zinc (ZnSO4∙7H2O). Las micro-sales son necesarias en concentraciones más bajas (micromolar [µM]) que los macro-nutrientes.

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Algunos medios contienen muy pocas cantidades de yodo (KI), pero cantidades suficientes de muchos de los elementos traza, ya que éstos pasan inadvertidos como contaminantes inorgánicos en muchos químicos de grado reactivo (ver Tabla 2).

Con respecto a la tabla 2, su objetivo es preparar una solución concentrada o “stock”, por lo que el número de gramos o miligramos indicados en la columna de cantidad debe ser adicionado a 1000 ml de agua des-ionizada para preparar 1 litro de la solución “stock” necesaria.

Posteriormente, para cada litro de medio a elaborar, deben ser usados 10 ml de cada solución “stock”.

Para preparar una solución “stock” 100X para alguno de los medios listados en la Tabla 1, multiplicar la cantidad del químico listado en la tabla por 100 y disolver en un litro de agua desionizada-destilada.

Con respecto a la nota “a” para CuSO4∙5H2O, considerar lo siguiente: ya que esta cantidad (250 mg) es muy pequeña para pesarla convenientemente, disolver 25 mg de CuSO4∙5H2O en 100 ml de agua desionizada-destilada, para después adicionar 10 ml de esta solución a la solución “stock” de sulfatos. “b” para CoCl2∙6H2O, proceder de manera similar, ya que esta cantidad es muy pequeña para pesarla convenientemente, disolver 25 mg de CoCl2∙6H2O en 100 ml de agua desionizada-destilada, después adicionar 10 ml de esta solución a la solución “stock” de haluros. “c” Mezclar el FeSO4∙7H2O y el NaEDTA juntos y calentar ligeramente hasta que la solución se torne naranja. Almacenar en frascos ámbar o protegerla de la luz.

Compuestos orgánicos El azúcar es una muy importante parte de cualquier medio de cultivo, y su suministro es esencial para el crecimiento in vitro y desarrollo del cultivo. Muchos cultivos de plantas por varias razones están inhabilitados para fotosintetizar de manera efectiva, incluyendo una organización celular y desarrollo de tejidos insuficientes, falta de clorofila, intercambio limitado de gases y CO2 en el recipiente del cultivo de tejidos, y pobres condiciones medioambientales, tales como baja luz. Una concentración de 20-60 g/l de sacarosa (disacárido formado por glucosa y fructosa) es el más frecuentemente usada fuente de carbono o energía, ya que este azúcar es también sintetizada y transportada naturalmente

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por la planta. Pueden ser usados otros tipo de mono – disacáridos o azúcares alcohol tales como glucosa, fructosa, sorbitol y maltosa. La concentración de azúcar elegida depende del tipo y edad del explante en el cultivo. Por ejemplo, embriones muy jóvenes requieren una alta concentración relativa de azúcar (>3%). Para yemas de mora in vitro, la fructosa es mejor que la sacarosa, glucosa, maltosa, rafinosa o lactosa (Coffin et al.

1976). Para manzanos, el sorbitol y la sacarosa soportan igual de bien, la iniciación de callos y crecimiento, pero el sorbitol es mejor para el durazno después de cuatro subcultivos (Oka y Ohyama, 1982). El azúcar (sacarosa) comprado ordinariamente en el mercado es generalmente adecuado, pero que su origen sea solamente de caña de azúcar, ya que el proveniente de maíz es principalmente fructosa. La caña de azúcar es purificada y, de acuerdo a los análisis de los productores de azúcar, éste consiste de 99.94% sacarosa, 0.02% de agua y 0.04% de otros materiales (elementos inorgánicos tales como rafinosa, fructosa y glucosa). Las sales de nutrientes contribuyen aproximadamente entre el 20-50% del potencial osmótico del medio de cultivo, quedando responsable la sacarosa del resto. La contribución de la sacarosa al potencial osmótico se incrementa cuando este es hidrolizado a glucosa y fructosa durante el autoclaveado. Esto debe de ser tomado en consideración cuando se desarrollan procedimientos sensibles tales como el cultivo y aislación de protoplastos.

Las vitaminas son sustancias orgánicas que forman parte de enzimas o cofactores para funciones metabólicas esenciales. De las vitaminas, sólo la tiamina (vitamina B1 a 0.1-5.0 mg/l) es esencial en un cultivo, ya que está involucrada en el metabolismo de carbohidratos y en la biosíntesis de algunos aminoácidos. Es usual adicionar al medio de cultivo de tejidos tiamina HCl. El ácido nicotínico, también conocido como niacina, vitamina B3, o vitamina PP, forma parte de una coenzima respiratoria y es usada en concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/l. El medio MS contiene tiamina-HCl, así como otras dos vitaminas, el ácido nicotínico y la piridoxina (vitamina B6) en la forma HCl. La piridoxina es una coenzima importante en muchas reacciones metabólicas y es usada en medios en concentraciones de 0.1-1.0 mg/l. La biotina (vitamina H) es adicionada comúnmente a medios de cultivo de tejidos a 0.01-1.0 mg/l. Otras vitaminas que son comúnmente usadas son el ácido fólico (vitamina M; 0.1-0.5 mg/l), riboflavina (vitamina B2; 0.1-10 mg/l), ácido aspártico (vitamina C; 1-1000 mg/l), ácido pantotenico (vitamina B5; 0.5-2.5 mg/l), tocoferol (vitamina E; 1-50 mg/l) y ácido p-aminobenzoíco (0.5-1.0 mg/l).

El inositol es algunas veces caracterizado como uno de las vitaminas del complejo B, pero es realmente un azúcar alcohol involucrado en la síntesis de fosfolípidos, pectinas de pared celular y sistemas de membranas en citoplasma celular. Esta es adicionada a medios de cultivo de tejidos a concentraciones de 0.1-1.0 g/l y ha sido demostrado necesario para algunas mono, dicotiledóneas y gimnospermas.

Además, otros aminoácidos son algunas veces usados en medios de cultivo de tejidos.

Estas incluyen L-glutamina, asparagina, serina y prolina, que son usadas como fuentes de

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nitrógeno orgánico reducido, especialmente para inducir y mantener la embriogénesis somática. La glicina, un aminoácido simple, es un aditivo común, ya que es esencial en la síntesis de purinas y constituye una parte del anillo de porfirinas en la estructura de la clorofila.

Compuestos orgánicos complejos son un grupo de suplementos indefinidos tales como caseína hidrolizada, leche de coco (el líquido del endospermo del coco, i.e. agua de coco), jugo de naranja, jugo de tomate, jugo de uva, jugo de piña, savia de abedul, puré de plátano y así por el estilo. Estos compuestos son usados frecuentemente cuando no existe ninguna otra combinación de componentes conocidos definidos para producir el crecimiento y desarrollo deseado. Sin embargo, la composición de estos suplementos es básicamente desconocida y pueden variar de un lote a otro, causando respuestas variables. Por ejemplo, el agua de coco (usada en una dilución de 50-150 ml/l), es una fuente natural de zeatina (RCP) y su concentración no solo difiere entre cocos jóvenes y maduros, sino también entre cocos de la misma edad.

Algunos compuestos de complejos orgánicos son usados como fuentes de nitrógeno orgánico, tales como el hidrolizado de caseína, una mezcla de cerca de 20 diferentes aminoácidos y amonio (0.1-1.0 g/l), peptona (0.25-3.0 g/l), triptona (0.25-2.0 g/l), y extracto de malta (0.5-1.0 g/l). El extracto de levadura (0.25-2.0 g/l) es usado ya que contienen altas concentraciones y alta calidad de vitaminas del grupo B. Las poliaminas, particularmente putrescina y espermidina, son algunas veces benéficas para la embriogénesis somática. Las poliaminas son también cofactores para la formación de raíces adventicias. La putrescina es capaz de sincronizar el proceso de embriogénesis de la zanahoria.

El carbón activado es útil para la absorción de los pigmentos cafés y negros y de compuestos fenólicos oxidados. Este es incorporado al medio en concentraciones de 0.23.0% (p/v). Es útil para absorber otros compuestos orgánicos, incluyendo RCP, tales como auxinas y citocininas, y otros materiales tales como vitaminas, y quelatos de hierro y zinc (Nissen y Sutter, 1990). Los efectos de RCP son minimizados al adicionar carbón activado cuando se transfieren explantes a medios sin RCP. Otras características del uso de carbón activado es que cambia el medioambiente luminoso al oscurecer el medio, de tal forma que auxilie en la formación y crecimiento de raíces. Puede también promover embriogénesis somática y mejorar el crecimiento y organogénesis de especies maderables.

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Reguladores de crecimiento de plantas (RCP) Los RCP ejercen efectos importantes a bajas concentraciones (0.001-10µM). Ellos regulan la iniciación y desarrollo de brotes y raíces sobre explantes y embriones en medios de cultivo semisólidos o líquidos.

La tabla 3 provee una comparación de la composición de los más comúnmente empleados medios de cultivo de tejidos con respecto a sus componentes en miligramos por litro y unidades molares.

Ellos estimulan también la división y expansión celular. Aunque algunas veces un explante es autotrófico y puede producir sus propios RCP, generalmente, los RCP deben ser suministrados en el medio de cultivo para el crecimiento y desarrollo del cultivo.

Los más importantes tipos de RCP usados en el cultivo de tejidos son las auxinas y las citocininas. El efecto relativo de las relaciones entre auxinas y citocininas sobre la morfogénesis de cultivo de tejidos fue demostrado por Skoog y Miller en 1957 y sirve de base para las manipulaciones del cultivo de tejidos de plantas en la actualidad.

Más adelante estudiaremos de manera más profunda este tema.

Agar y sistemas de soporte alternativo El agar es usado para solidificar el cultivo de tejidos (gel). Este capacita al explante a ser colocado en contacto preciso con el medio (sobre la superficie o embebido en él), pero permanece aireado. El agar es un polisacárido de alto peso molecular que puede enlazar el agua y es obtenida de algas marinas. El agar es adicionado al medio en intervalos de concentraciones de 0.5 a 1.0% (p/v). Altas concentraciones de agar resultan en un medio duro. Si una concentración baja de agar es empleada (0.4%) o si el pH es bajo, el medio estará tan suave y no gelificará apropiadamente. La consistencia del agar puede también influir en el crecimiento. Si es muy duro, el crecimiento de la planta será reducido. Si es muy suave, pueden resultar plantas hiperhídricas (Singha, 1982). Para gelificar apropiadamente, un medio con 0.6% de agar debe tener un pH por encima de 4.8.

Algunas veces el carbón activado en el medio interfiere con la gelificación. En cultivos de tejidos típicos el agar se fusiona a 65ºC y se gelifica a 45ºC aproximadamente.

El agar también contiene contaminantes orgánicos e inorgánicos, la cantidad de ellos varía entre las distintas marcas comerciales. Contaminantes comunes son: ácidos orgánicos, compuestos fenólicos, ácidos grasos de cadena larga. Un análisis del fabricante, muestra que los agares Difco® Bacto® contienen (cantidades en ppm): 0.0-0.5 cadmio; 0.0-0.1 cromo; 0.5-1.5 cobre; 1.5-5.0 hierro; 0.0-0.5 plomo; 210.0-430.0 magnesio; 0.1-0.5 manganeso y 5.0-10.0 zinc. Generalmente se realizan ensayos en los cultivos de tejidos vegetales de plantas para determinar el tipo de agar que se debe emplear. Una calidad pobre del agar puede interferir o inhibir el crecimiento de cultivos.

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La agarosa es frecuentemente usada cuando se cultivan protoplastos o células individuales. La agarosa es un extracto purificado el agar que deja atrás grupos de agaropectina y sulfatos.

Gomas tales como Gelrite™ y Phytagel™ son alternativas de agentes gelificantes. Están hechas de polisacáridos producidos por una bacteria. En lugar de ser traslúcidas (como el agar) son claras, por lo que es mucho más fácil de detectar la contaminación.

Soportes mecánicos tales como puentes de papel filtro o plataformas de polietileno, no dependen de un agente gelificante. Pueden ser usados con medios líquidos que circulen mejor, manteniendo al explante en la superficie para que siga siendo oxigenado.

2.2.2. Preparación El primer paso para elaborar un medio de cultivo es el de aprovisionarse de todos los materiales y equipos necesarios para tal fin, por ejemplo: Balanza, potenciómetro, autoclave, campana de flujo laminar, refrigerador, destilador, des-ionizador, parrilla de agitación y de calentamiento, vaso de precipitados de 1 l, matraz volumétrico de 1 l, parrilla, barra magnética, balanza, pipetas, varias soluciones “stock” (soluciones madre, ver tabla 2), frascos para almacenar soluciones y medios preparados, etc.

Aunque esperamos que ya se maneje adecuadamente las formas de medir concentración, se incluyen algunos ejemplos para clarificar cualquier duda.

Unidades de concentración Aunque es posible obtener la concentración de sustancias por otras vías, el siguiente listado provee algunos métodos para indicar la concentración encontrada en la literatura de cultivo de tejidos vegetales. 



Porcentaje basado sobre el volumen (v/v). Usado para diluir el agua de coco, jugo de tomate y de naranja. Por ejemplo, si deseamos 100 ml de agua de coco al 5%, requerimos tomar 5 ml de agua de coco y diluirlo con agua hasta alcanzar 100 ml.

Porcentaje basado en peso (p/v). Frecuentemente usado para expresar concentraciones de agar o azúcar. Por ejemplo, para preparar una solución al 1% de agar, es necesario disolver 10 g de agar en un litro de medio nutritivo.

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







Solución molar. Para ello es necesario recordar que un mol (M) corresponde al mismo número de gramos como peso molecular corresponda (número de Avogadro), por lo tanto una solución 1M representa el peso molecular de la sustancia en un litro de solución, y 0.01 M representa 0.01 veces el peso molecular contenido en un litro de solución. Por lo que una solución milimolar (mM) representa 0.001 veces el peso molecular contenido en un litro. Las sustancias tales como los RCP están activas a concentraciones de micromoles (µM). La concentración molar es usada exactamente para comparar la reactividad relativa entre diferentes compuestos. Por ejemplo, a la concentración 1 µM de AIA (ácido indol acético) puede contener el mismo número de moléculas que 1 µM de cinetina, aunque realizando las conversiones correspondientes, esto puede ser también dichas en unidades basadas al peso (mg/ml). La tabla 3, ilustra la conversión entre concentraciones molares y las dadas en mg/l.

Miligramos por litro (mg/l). Aunque no es posible comparar sustancias con exactitud molecular, esta es una forma simple para realizar cálculos y usarlo en pesos directos. Cada medición directa es usada comúnmente en los macronutrientes y en RCP. Un miligramo por litro significa el colocar 1 mg de la sustancia deseada en un volumen final de 1 litro de solución. Recuerde que 1 mg = 0.001 g (10-3 g).

Microgramos por litro (µg/l). Este es usado con micronutrientes y también en algunas ocasiones con RCP. Significa 1 µg de una sustancia y se lleva a un volumen de 1 L de solución. 1 microgramo = 0.001 o 10-3 mg = 0.000001 o 10-6 g.

Partes por millón (ppm). Algunos componentes de medios son expresados en ppm, 1 ppm es igual a 1 mg/l.

Las instrucciones para preparar medios de cultivo, se describen en la Tabla 4. Estas instrucciones describen la preparación del medio MS, pero puede ser efectivo para preparar cualquier otro medio: sólo seguir los mismos pasos y sustituir los componentes de las soluciones madre de macro y micronutrientes del medio deseado. Omitir el agar si lo que se desea es producir medio líquido para un cultivo en suspensión. Los RCP pueden ser personalizados para el medio deseado, cuando sea necesario el inicializar a callos, brotes, raíces o para algún otro propósito.

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Cultivo de tejidos vegetales I Medios de cultivo Tabla 3. Reguladores de crecimiento de plantas (RCP) (Beyl CA, 2005)

Regulador de Crecimiento de Plantas Ác. abscísico Benciladedina Dihidrozeatina Ác. giberélico Ác. indolacético Ac. Indolbutírico Sal de potasio de AIB Cinetina Ác. naftalenacético Picloram Zeatina 2-isopentenil adenina Ác. 2-4 diclorofenoxiacético

Abreviatura

P.M.

ABA BA 2hZ GA3 AIA AIB K-IBA Cin ANA Pic Zea 2-iP 2,4-D

264.3 225.2 220.3 346.4 175.2 203.2 241.3 215.2 186.2 241.5 219.2 203.3 221.04

mg/l equivalentes para concentraciones µM 0.1 1.0 10.0 100.0 0.0264 0.264 2.64 26.4 0.0225 0.225 2.25 22.5 0.0220 0.220 2.20 22.0 0.0346 0.346 3.46 34.6 0.0175 0.175 1.75 17.5 0.0203 0.203 2.03 20.3 0.0241 0.241 2.41 24.1 0.0215 0.215 2.15 21.5 0.0186 0.186 1.86 18.6 0.0241 0.242 2.42 24.2 0.0219 0.219 2.19 21.9 0.0203 0.203 2.03 20.3 0.0221 0.221 2.21 22.1

µM equivalentes para concentraciones en mg/l 0.1 0.5 1.0 10.0 0.38 1.89 3.78 37.8 0.44 2.22 4.44 44.4 0.45 2.27 4.53 45.3 0.29 1.44 2.89 28.9 0.57 2.85 5.71 57.1 0.49 2.46 4.90 49.0 0.41 2.07 4.14 41.4 0.46 2.32 4.65 46.7 0.54 2.69 5.37 53.7 0.41 2.07 4.14 41.4 0.46 2.28 4.56 45.6 0.49 2.46 4.92 49.2 0.45 2.26 4.52 45.2

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Tabla 4. Preparación paso a paso de un medio de cultivo (Beyl CA, 2005)

Paso

1

2

Instrucciones y comentarios Para preparar un litro de medio de cultivo, colocar la mitad del volumen de agua desionizadadestilada en un vaso de precipitados y colocar una barra magnética en él. Colocar el vaso sobre la parrilla de agitación y encenderla para promover el mezclado de los diferentes componentes.

Adicionar 10 ml de la solución “stock” correspondiente (ver Tabla 2): nitratos, sulfatos, haluros, PBMo y NaFeEDTA.

3

Adicionar el volumen apropiado del “stock” de vitaminas. En este momento, adicionar las cantidades apropiadas de inositol (generalmente 100 mg) y sacarosa (entre 20 y 30 g/l).

4

Adicionar el volumen necesario del “stock” de RCP planeado.

5

Ajustar el pH usando 0.1-1.0 N de NaOH o HCl dependiendo si deseamos bajarlo o subirlo. Para la mayoría de los medios, el pH debe de encontrarse entre 5.4 y 5.8. Finalmente ajuste el volumen final (1 litro) con agua desionizadadestilada.

Para usar el medio líquido, se puede distribuir el medio en frascos apropiados de acuerdo a un plan determinado y llevarlo a la autoclave para esterilización.

6 Si el plan es usar medio sólido, pesar la cantidad necesario de agar o agente gelificante al medio líquido.

Colocar el medio de cultivo de tejidos sobre la placa de Universidad Abierta y a Distancia de México

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calentamiento y agitar o usar el horno de microondas. Verificar previamente el nivel de calentamiento del horno de microondas.

Distribuir en los frascos apropiados, colocar en autoclave para esterilización. Esterilizar por 15 min a 121ºC. Si son grandes cantidades de frascos, el tiempo de esterilización deberá prolongarse.

Si el plan es el de distribuir el medio después de la esterilización (tales como en cajas de petri estériles), cerrar los frascos con tapones de algodón cubriéndolo posteriormente con una hoja de aluminio. Una vez el medio esté tibio para que la mano lo tolere (cerca de 60ºC), puede proceder a transferir el medio dentro de una campana de flujo laminar a las cajas de petri.

El ajuste del pH es un paso esencial. El cultivo de células de plantas prefiere un pH ligeramente ácido, generalmente entre 5.3 y 5.8. Cuando el pH es menor a 4.5 o mayor a 7.0, el crecimiento y desarrollo in vitro es inhibido. Esto es debido probablemente a muchos factores, incluyendo RCP, tales como el AIA y el ácido giberélico, que llegar a ser menos estables; se precipitan los fosfatos y las sales iónicas; la vitamina B1 y el ácido pantoténico son menos estables; se reduce la toma de iones de amonio; se cambia la consistencia del agar (el agar se licua a pH bajo).

Figura 2. Autoclave horizontal (SciPh, 2013).

El ajuste del pH es el último paso antes de adicionar y disolver el agar para después distribuirlo en frascos de cultivo y “autoclavearlo” o esterilizar. Si el pH no se encuentra en los intervalos establecidos, éste debe ser ajustado usando NaOH para elevar el pH o HCl para bajarlo (0.1-1.0N). Mientras que el KOH puede ser usado, cuando existe un indeseable incremento de iones de sodio. El pH en un medio de cultivo generalmente decae de 0.3 a 0.5 unidades después del autoclaveado y después cambia a través del periodo de cultivo, debido a la oxidación y a la toma diferencial y secreción de sustancias del crecimiento de tejidos.

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Finalmente, es importante señalar que las fotografías son solamente un apoyo para imaginar el proceso, por lo que los colores mostrados aquí, son solo para resaltar la imagen, esto es entonces, que las soluciones “stock” son incoloras y al final el medio de cultivo permanece incoloro. El uso en nuestro caso de una autoclave horizontal, como la mostrada en el paso 6, implica ordenar los frascos conteniendo el medio de cultivo impidiendo que estos queden inclinados o que puedan derramarse.

Elaboración de soluciones “stock” de sales minerales Las sales minerales pueden ser preparadas como soluciones madre o soluciones “stock” de 10 a 100 veces (10X a 100X) la concentración especificada en el medio. Las sales minerales son frecuentemente agrupadas en dos soluciones stock, una para macroelementos y una para micro-elementos, pero al menos que éstos se mantengan relativamente diluidos (10X), la precipitación puede ocurrir. Con la finalidad de producir soluciones más concentradas, el método preferido es el de agrupar los componentes por los iones que ellos contienen, tales como nitratos, sulfatos, haluros, fósforo (P), boro (B), molibdeno (Mo) y hierro (Fe) haciéndolos en “stocks” de 100X. La tabla 2 lista las soluciones “stock” para el medio MS para una concentración final de 100X, lo cual significa que 10 ml de cada solución “stock” será usada para elaborar un litro de medio de cultivo. Algunas soluciones “stock” requieren pasos extras para obtener los componentes de la solución (por ejemplo, el “stock” de NaFeEDTA), o que requieran una dilución serial para obtener la cantidad de componentes traza de la solución “stock” (sulfatos o haluros).

Algunas veces la cantidad de componentes particulares necesarios para el medio de cultivo de tejidos es tan pequeña que hace difícil el pesar la cantidad incluso para el “stock” 100X. Por lo que estas cantidades tan pequeñas no pueden ser pesadas exactamente, la técnica de diluciones seriales es usada. El siguiente ejemplo ilustra cómo una dilución serial puede ser empleada para obtener la cantidad correcta de un componente (en este caso CuSO4∙5H2O) del medio de cultivo para su apropiada solución “stock”.

De acuerdo a las notas de la tabla 2, la solución “stock” pide 2.5 mg de CuSO4∙5H2O como parte del “stock” de sulfatos del medio MS. Se elabora una solución “stock” intermedia colocando 25 mg de CuSO4∙5H2O en 100 ml de agua desionizada-destilada.

Después de agitar vigorosamente, usar 10 ml de la solución, el cual contendrá la cantidad deseada de 2.5 mg, y colocarla en la solución “stock” de sulfatos. Este procedimiento requiere solo de una dilución serial pero algún componente puede ser sujeto a una o más diluciones para obtener la cantidad deseada. Una vez que la solución “stock” se ha realizado, es necesario etiquetar adecuadamente el frasco que lo contiene, con el fin de evitar errores y prevenir el mantener inadvertidamente de la solución “stock” en reserva por mucho tiempo, un ejemplo de etiquetado se muestra a continuación.

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Solución “stock” NITRATOS (100X)

Tipo de solución “stock” Tipo de medio

Murashige y Skoog (1962) Instrucciones Use 10 ml/l de medio Fecha de elaboración 14/09/2013 Jorge Méndez

Nombre de quién lo elaboró

2.3. Reguladores de crecimiento vegetal (Gaba, VP, 2005) El proceso de crecimiento y desarrollo de plantas, tales como la germinación, elongación del tallo, crecimiento y desarrollo de hojas, el florecimiento y crecimiento y maduración de frutos, son controlados por los reguladores de crecimiento de plantas (RCP) llamados comúnmente pero de manera incorrecta “hormonas de plantas”.

El estudio de la función de RCP puede ser complejo, ya que varios RCP trabajan de manera típica en concierto con algunos otros y sus concentraciones en la planta cambian con el tiempo, estación del año y etapa de desarrollo. Algunos RCP son sintetizados localmente por las células para su propio consumo, mientras que otras son sintetizadas en un órgano y transportado a otras partes de la planta para una acción específica, por lo que en este caso su actividad puede ser muy similar a una “hormona” para la planta y son referidos como RCP endógenos. En esta sección solo se describirán los RCPs naturales y sintéticos identificados y comúnmente suministrados a plantas intactas y a cultivo de tejidos, esto es RCP exógenos.

La concentración de RCP exógenos en los tejidos es determinada por la tasa relativa de síntesis y la tasa de degradación (consumo) o conjugación. Los RCP exógenos son aplicados a plantas en el campo para obtener respuestas agrícolas importantes, tales como la defoliación del algodón o el crecimiento o el madurado de frutas tales como uvas y duraznos. En el cultivo de tejidos vegetales, pequeños explantes son transferidos al medio de cultivo. Frecuentemente cada explante es muy pequeño como para tener el RCP necesario para una respuesta al desarrollo o al crecimiento. Sin embargo, suministrando el medio con RCP exógenos es posible estimular la respuesta deseada del tejido de planta, incluyendo el efecto de los RCP endógenos presentes en el explante.

Diferentes RCP análogos tienen diferentes efectos, dependiendo de la estructura química, tejido de planta y genotipo. Algunas veces es necesario mezclar diferentes RCP del Universidad Abierta y a Distancia de México

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mismo o diferente tipo para obtener el resultado deseado, o para obtener tratamientos secuenciales con diferentes RCP. Aunque el papel de los RCP en el cultivo de tejidos vegetales es crítico, los RCP interactúan dentro de importantes determinantes biológicos. El factor más importante en el cultivo de tejidos vegetales, es el genotipo; en otras palabras, la habilidad genética del material vegetal para producir la respuesta deseada. Por ejemplo, algunas especies o cultivos regeneran brotes, o producen embriones somáticos, con una relativa pequeña estimulación, mientras que otros no. De forma adicional, el estado fisiológico del material vegetal podrá determinar la respuesta biológica. Por lo tanto, ciertas partes de plantas (explantes) tendrán una mejor respuesta que otros en el mismo lapso de tiempo.

Existen cinco principales grupos de RCP endógenas: auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abcísico y etileno. Muchos de éstos grupos tienen múltiples roles en el crecimiento y desarrollo de plantas, y son muy usadas para la manipulación de plantas en el cultivo de tejidos. Todos ellos pueden ser divididos en tres grupos, mismos que a continuación se revisarán.

2.3.1. Auxinas El primer RCP aislado fue la auxina endógena (natural), ácido indol-3-acético (AIA) (Fig. 3A). El AIA es rápidamente degradado ya sea en el medio de cultivo o en la planta, sin embargo existen análogos químicos más estables con los que pueden ser sustituidos.

Son llamados auxinas, debido a su actividad biológica similar al AIA. Auxinas sintéticas tales como el 2,4-D (Fig. 3B), el ácido 3-indol butírico (AIB) (Fig. 3C) y al ácido 1naftalenacético (ANA) (Fig. 3D) son los más frecuentemente usados. Es interesante notar en las auxinas las similitudes de las estructuras químicas.

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Figura 3. Estructuras químicas de algunos RCP tipo auxinas. (A) Ác. Indol-3-acético (AIA); (B) ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D); (C) ácido 3-indol-butirico (AIB); (D) ácido 1-naftalenacético (ANA) (Gaba, VP, 2005).

Las auxinas tienen diversos papeles en el cultivo de tejidos, de acuerdo a su estructura química, su concentración y al tejido de la planta a ser afectado. Las auxinas causan la producción de callos y raíces tanto como el crecimiento en extensión de tallos. Las auxinas generalmente estimulan la elongación celular, la división celular en el tejido del cambium, y junto con la citocininas (próxima sección), estimulan la diferenciación del floema y del xilema. Además, a altas concentraciones de una auxina exógena puede ser inducido la embriogénesis somática. La función esencial de auxinas y citocininas es la reprogramación de células somáticas que habían estado previamente en un estado de diferenciación. La reprogramación causa desdiferenciación y los rediferencía a una nueva vía de desarrollo. De esa manera, una célula que había sido destinada a desarrollarse como parte de una hoja, por ejemplo, puede llegar a ser embriogénica, produciendo embriones somáticos. El mecanismo por el cual una auxina causa desdiferenciación no es aun conocido. Altas concentraciones de auxinas exógenas pueden causar toxicidad, en gran parte porque ellas estimulan la producción de etileno, el cual causa inhibición al crecimiento.

Ejemplo: enraizado de brotes in vitro, el requerimiento de auxinas Frecuentemente es necesario enraizar brotes in vitro, con el objetivo de convertir los brotes a una planta funcional para así transferirlos a un invernadero. Los brotes con raíces generalmente crecen rápido en un cultivo. En muchas especies de plantas (e.g. especies de Nicotiana, pepino, especies de Acacias y algunos cultivos de rosas) la generación de raíces en brotes in vitro se realiza fácilmente después de la transferencia de un medio de regeneración, que por lo general contiene un alto nivel de citocinina, a un medio sin RCP. El tratamiento con auxinas in vitro es análogo a los tratamientos para enraizados con auxinas practicados por los jardineros. Las auxinas pueden inducir la iniciación radicular después de pocas horas de su aplicación. Comúnmente el AIA (0.6-60 µM), AIB (2.5-1.5 µM) y/o ANA (0.25-6 µM) son usados para promover el enraizado in vitro. No todas las auxinas indicadas tienen la misma eficiencia de promover el enraizado, su efectividad varía con la especie de planta, aunque rutinariamente no tiene importancia el tipo de auxina usada para enraizar. Es importante notar que la concentración de auxina provee una mayor cantidad de raíces pero esa concentración no produce mayores tasas de sobrevivencia.

Ocasionalmente mezclas de auxinas, usualmente a bajas concentraciones comparadas cuando se emplean solas, pueden promover la iniciación radicular mientras que auxinas

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individuales no muestran actividad, como se ha visto en el olivo, Eucalyptus, Hevea y Vitis. Altas concentraciones de auxinas pueden ser requeridas para inducir el enraizamiento, las cuales pueden causar efectos colaterales indeseables, tales como la inhibición al crecimiento de raíces inducidas y disturbio subsecuente del crecimiento de la planta.

2.3.2. Citocininas Las citocininas causan división celular. Cada división celular puede dirigir a regeneración de brotes in vitro, por estímulo a la formación de brotes apicales meristemáticos y, subsecuentemente a yemas. El término citocinina es usado para componentes con actividad biológica similar. Además, la división celular causada por citocininas puede producir callos no diferenciados. Generalmente, un alta concentración de citocininas bloqueará el desarrollo de raíces. Las citocininas pueden causar la liberación de dominancia apical de brotes, por lo tanto estimulará el crecimiento de yemas laterales resultando en múltiples formaciones de brotes. La primera citocinina aislada fue la cinetina (Fig. 4A); un poco después de su descubriendo, la adenina fue identificada como poseedora de actividad de citocininas (Fig. 4C), tales como muchos derivados de la adenina (Fig. 4). La zeatina (Fig.4C) y la N6-2-isopentenil adenina (2-iP; Fig. 4D) son otras dos citocininas que se encuentran de forma natural que se usan frecuentemente en cultivo de tejidos. Adicionalmente, la citocininas sintética 6-benciladenina (BA) (también conocida como 6-bencil aminopurina [BAP]; Fig. 4E) y thidiazuron (TDZ, Fig. 4F) son también usadas en el cultivo de tejidos vegetales. La zeatina ribósido es un ejemplo de un RCP acomplejado con una molécula de azúcar, alterando sus propiedades biológicas de un RCP (Fig. 4 G).

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Figura 4. Estructuras químicas de algunos RCP tipo citocininas. (A) cinetina; (B) adenina; (C) zeatina; (D) N6-2-isopentenil adenina (2-iP); (E) 6-benciladenina; (F) thidiazuron (TDZ); (G) zeatina ribósido (Imágenes transcritas de Gaba, BP, 2005).

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Ejemplo: Uso de citocininas en micropropagación La micropropagación es la producción en masa de plantas in vitro para propósitos comerciales. La micropropagación es realizada a través de la multiplicación de brotes seguido del enraizamiento (generalmente también in vitro), o más raramente de embriogénesis somática. La multiplicación de brotes, proceso que como ya se indicó es de tipo industrial, con el fin de producir gran número de plantas libres de patógenos para horticultura, donde el costo del producto final es importante. En el diseño de un proceso de micropropagación, lo mejor es evitar las formas inestables de multiplicación, tales como callos, debido a la probable variación somaclonal. Por ello, la vía principal para micropropagación es el de utilizar brotes auxiliares, conocidos por su estabilidad genética.

La multiplicación de brotes es inducida por la aplicación de citocininas exógenas en el medio de crecimiento. Las citocininas aplicadas rompen la dominancia apical de brotes (en plantas dicotiledóneas), estimulando el crecimiento de yemas auxiliares a brotes. Una alta concentración de citocininas aplicadas puede causar el crecimiento de pequeños brotes, los cuales fallan al desarrollo.

2.3.3. Giberelinas Las giberelinas son otra tipo de RCP con cerca de 100 diferentes variantes identificadas de varias fuentes, todas ellas basadas en la misma estructura de giberelano. La actividad de giberelinas exógenas aplicadas varía con el tipo de giberelinas y la especie de plantas tratadas. Las giberelinas comúnmente aplicadas en el cultivo de tejidos vegetales es el GA3, también conocida como ácido giberélico (Fig. 5A). Aunque las giberelinas tienen importantes papeles en el ciclo de vida de plantas (controlando longitud del tallo, florecimiento y secado del fruto), en el cultivo de tejidos el GA3 ha sido generalmente usado para estimular ya sea la elongación del brote o la conversión de yemas a brotes.

GA3 interfiere con la iniciación de las yemas en estados muy tempranos de la formación del meristemo, por lo que puede reducir la producción de brotes in vitro si se adiciona a los cultivos de tejidos vegetales en la etapa de iniciación de brotes. De forma similar, GA3, reduce la formación de raíces y la embriogénesis in vitro. Por lo anterior, para usos prácticos, es necesario optimizar los efectos de la etapa específica de GA3.

Ejemplo: Efecto de giberelinas en la prolongación (extención) de tallos Las giberelinas fueron descubiertas debido al efecto de la estimulación del crecimiento sobre la elongación de plantas. Las giberelinas son principalmente usadas en el cultivo de tejidos vegetales para estimular la elongación celular, produciendo por lo tanto elongación Universidad Abierta y a Distancia de México

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de brotes. El uso de giberelinas en un medio de elongación es un método valioso para convertir yemas a brotes funcionales. Por ejemplo, en algunas variedades de melón y calabacín después de la inducción de brotes sobre el medio con AB (5 µM), la elongación de brotes es mejor estimulada con un medio con una concentración reducida de citocininas (0.5 µM) y la adición de AG3 (1.5-3 µM).

Figura 5. Estructuras químicas de RCP de acciones variadas. (A) Ácido giberélico (GA3); (B) ácido abscísico (ABA); (C) etileno; (D) ancymidol (imágenes transcritas de Gaba, BP, 2005).

2.3.4. Ácido abscísico El ácido abscísico (ABA; Fig. 5A) ha sido principalmente usado en cultivo de tejidos vegetales para facilitar la maduración de embriones somáticos. En ciertas especies, los embriones no pueden ser madurados adecuadamente por la falta de ABA exógeno. La función del ABA exógeno es similar durante el desarrollo de semillas en plantas monocotiledóneas, dicotiledóneas y coníferas. El ABA induce la formación de proteínas esenciales LEA (late embriogenesis abundant) encontradas en etapas de embriogénesis tardía en ya sea embriones somáticos o sexuales. Ocasionalmente, ABA puede estimular algún proceso de regeneración y, raramente, puede también reducir la producción de embriones somáticos. ABA es el único integrante de esta clase.

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2.3.5. Etileno El etileno es el único RCP gaseoso natural (Fig. 5C). A pesar de que el etileno se conoce sobre todo en biología de plantas por sus efectos en la maduración de frutas, este es naturalmente producido por todos los órganos de la planta superior en una manera controlada. En el cultivo de tejidos de plantas, el etileno producido endógenamente puede acumular en un recipiente cerrado a niveles que son perjudiciales para el crecimiento y desarrollo de plantas. El resultado en especies sensibles al etileno, se muestra en un síndrome típico de la reducción de la elongación del tallo, restringido crecimiento de hojas, prematura senescencia foliar y, algunas veces, incremento en el crecimiento de yemas auxiliares. Mejorando concentraciones de etileno, se puede estimular la formación de callos, reduciendo la regeneración de yemas y brotes. La embriogénesis somática puede ser afectada por la concentración de etileno –bajas concentraciones estimula, mientras que altas concentraciones lo inhiben.

Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar.

Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BCTV1 _U2_A1_XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación.

Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BCTV1 _U2_ATR _XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu

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nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

Cierre de la unidad Hemos realizado un breve atisbo sobre la historia en el desarrollo de medios de cultivo, conocemos ahora que el cultivo de tejidos vegetales es importante comercialmente y en la actualidad se emplea como una herramienta de investigación en campos multidisciplinarios.

Uno de los principales pasos para desarrollar estas técnicas es el de conocer los diferentes ingredientes que conforman el medio de cultivo y su función, por lo que en la siguiente unidad, concluiremos con la construcción del conocimiento relacionada al establecimiento físico de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.

Para saber más

Catálogo de medios de cultivo de tejidos vegetales, Sigma-Aldrich. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/plant-biotechnology/planttissue-culture/product-lines.html Academia Alemana de Ciencias http://www.leopoldina.org/en/about-us/

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Fuentes de consulta La gran mayoría de citas se encuentran referenciadas directamente en los documentos revisados de Smith HR (2013) y Trigiano RN - Gray DJ (2005).

Beyl CA, (2005). Getting started with tissue culture: Media preparation, sterie technique, and laboratory equipment. En: Trigiano RN y Gray DJ. Plant development and biotechnology. USA: CRC Press. ISBN 0-8493-1614-6 Bhojwani, S.S., y Razdan, M.K. (1983). Plant tissue culture: Theory and practice: Developments in crop science. Amsterdam: Elsevier.

Gautheret, R.J. (1985). “History of plant tissue and cell culture: A personal account”. En: I.K. Vasil (Ed.) Cell culture and somatic cell genetics of plants (Vol. 2, pp. 1-59). New York:Academic Press.

Haberlandt, G. (1902). Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Akad.

Wiss. Wien, Math,-Naturwiss. Kl., Abt. 1, 111, 69-92.

Laimer M. y Rücker W. (Eds) 2003. Plant Tissue Culture, 100 years since Gottlieb Haberlandt. Vienna: Springer-Verlag Wien. ISBN 978-3-211-83839-6 SciPh (2013). Science photo library. London, UK. http://www.sciencephoto.com/ Thorpe T.A. (2013). History of plant cell culture. En: Smith HR. Plant Tissue Culture, techniques and experiments (2 ed.). USA: Academic Press. ISBN 978-0-12-415920-4.

White, P.R. (1963). The cultivation of animal and plant cells (2ª ed.) New York: Ronald Press.

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ANEXO Nombres de algunos compuestos químicos que aparecen en esta etapa.

Compuesto

Nombre

NH4NO3 NH4H2PO4 (NH4)2SO4 CaCl2∙2H2O Ca(NO3)2∙4H2O MgSO4∙7H2O

Nitrato de amonio Fosfato de amonio monobásico Sulfato de amonio Cloruro de calcio dihidratado Nitrato de calcio tetrahidratado Sulfato de magnesio heptahidratado Cloruro de potasio Nitrato de potasio Sulfato de potasio Fosfato de potasio monobásico Fosfato monosódico anhidro Sulfato de sodio Ác. Bórico Cloruro de cobalto hexahidratado Sulfato de cobre pentahidratado Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica Sulfato férrico Sulfato ferroso heptahidratado Sulfato de manganeso hidratado Ioduro de potasio Trióxido de molibdeno Molibdato de sodio dihidratado Sulfato de zinc heptahidratado

KCl KNO3 K2SO4 KH2PO4 NaH2PO4 Na2SO4 H3BO3 CoCl2∙6H2O CuSO4∙5H2O Na2EDTA Fe2(SO4)3 FeSO4∙7H2O MnSO4∙H2O KI MoO3 Na2MoO4∙2H2O ZnSO4∙7H2O

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