Unidad 3. Expresión de proteínas recombinantes by Jazina Ruiz Hernández

Genética molecular bacteriana Expresión de proteínas recombinantes

Programa de la asignatura:

Genética molecular bacteriana

Expresión de proteínas recombinantes

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Índice

Presentación de la unidad…………………………………………………………………………3 Propósitos de la Unidad……………………………………………………………………………4 Competencia específica…………………………………………………………………………...5 3. Expresión de proteínas recombinantes…………………………………...………………….5 3.1. El operón como regulador de la expresión génica………………………………………...6 3.1.1. Operón……………………………………………………………………………………….8 3.1.2. El operón de lactosa……………………….………………………………………..….....10 3.1.3. El operón de triptófano…………………………………………………………….…...…17 3.2. Protocolos de expresión de proteínas………………………………………………....….20 Actividades …………………………………………………………………………...……….…..34 Autorreflexiones……………………………………………………………………………...……35 Cierre de Unidad………………………………………………………………………….……….35 Para saber más……………………………………………………………………………………36 Fuentes de consulta………………………………………………………………………………36

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Presentación de la unidad La revisión de las unidades previas se enfocó fundamentalmente a dos aspectos críticos, el flujo de la información génica en procariontes y los mecanismos que permiten su transferencia, esto enfocado a poder generar bacterias genéticamente modificadas (BGM) que permitan la obtención de un producto de utilidad, ya sea en la industria farmacéutica o alimentaria, principalmente. Si deseas recapitular y recordar más acerca de la dinámica de flujo de información, los avances en su estudio, las técnicas empleadas, revisa el siguiente recurso: Revista (2001). “Las ciencias del genoma”. ¿Cómo ves? 37 Recuperado de http://www.comoves.unam.mx/numeros/indice/37

Seguramente te estarás preguntando ¿las BGM son exclusivamente utilizadas en la industria biotecnológica? La respuesta es no. Hay otros organismos genéticamente modificados (OGM) como las levaduras, células de mamíferos, animales y plantas transgénicos, pero las bacterias presentan grandes ventajas, mismas que se precisarán a lo largo de esta Unidad. Podemos identificar varias de sus utilidades, por ejemplo: las levaduras dominan la industria del etanol, las plantas han empezado a conquistar el área de los alimentos, pero el uso de las bacterias continúa siendo primordial para la producción de los antibióticos y otros fármacos de naturaleza proteica. Es importante considerar que la selección del OGM va a depender del tipo de producto que se desee obtener, y esto a su vez se relaciona directamente con sus características y propiedades; en el caso de los péptidos como productos de interés, es de relevancia su localización celular y especie de origen, su estructura y posibles modificaciones posttraduccionales. Podemos examinar más lo anterior, con el caso de la insulina (Taniguchi 2006), esta es una hormona fundamental para el control del metabolismo de glucosa, y otros metabolismos, este mensajero químico es de naturaleza proteica, y dada la panorámica que se ha presentado en los últimos años, manifestada con una alta incidencia de la diabetes (defecto en la producción o acción de la insulina), se ha promovido un incremento en la demanda por esta proteína reguladora. La industria biotecnológica ha hecho loables esfuerzos por satisfacer estas necesidades: primeramente en atención a Universidad Abierta y a Distancia de México

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las características del péptido, se comenzó por aislarla de una fuente similar y el cerdo fue la solución. Sin embargo, las cantidades obtenidas no eran lo suficientes para el mercado y se tuvo que recurrir a la ingeniería genética, lo que se buscaba era contar con un sistema que permitiera una superproducción y que conservara sus características y propiedades, así fue que su obtención como proteína recombinante tanto de levaduras como de bacterias, ha resultado ser todo un éxito en la Industria Farmacéutica (Walsh 2006). A lo largo de esta Unidad nos enfocaremos a dilucidar las estrategias experimentales que pueden aplicarse durante y para la obtención de una proteína recombinante, y se discutirá la gran ventaja de utilizar a los procariontes como la fuente de generación.

Propósitos de la Unidad

 

Identificar los mecanismos de regulación de la expresión génica en procariontes que pueden ser modificados durante un uso biotecnológico. Aplicar diferentes protocolos de expresión de proteínas involucrados durante la generación de proteínas recombinantes.

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Competencia específica

Competencia General Ejemplificar diseños experimentales utilizados en la producción de proteínas recombinantes, a través de la conceptualización de las técnicas empleadas para la industria biotecnológica.

3. Expresión de proteínas recombinantes Con objeto de poder identificar y comprender las estrategias o protocolos experimentales que sustentan la obtención de proteínas recombinantes utilizando un modelo procarionte, es necesario saber cómo se manifiesta el flujo y transferencia de la información genética bacteriana e identificar los mecanismos de regulación presentes. Te cuestionarás ¿pero por qué? Con objeto de evidenciarlo, vamos a recurrir a una analogía: tu perteneces a una comunidad y acorde a tu edad, es de esperarse que ya conozcas con mucha familiaridad la dinámica del transporte, las rutas, los horarios de salida, las vías más conflictivas, etc. Ahora bien, no sólo basta con conocer dichos elementos, sino que resulta importante identificar el control de los mismos en cuanto a lo que debes hacer y lo que no. Podemos ilustrar esto con el uso del metro, dónde solo cuentas con cierto tiempo para abordar y no está permitido ingresar después de ese periodo. Ese es un mecanismo de regulación, porque el aplicarlo oportunamente el servicio puede brindarse de manera efectiva.

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Lo mismo sucede en todas las células, no sólo con los procariontes. Conocer los mecanismos de control, sobre todo cuando se busca obtener una proteína recombinante, resulta ser de gran relevancia para:   

Dirigir eficientemente y de forma específica la síntesis del péptido. Facilitar su aislamiento. Obtener cantidades elevadas y exclusivamente de la proteína en cuestión.

Uno de los objetivos será entonces identificar la importancia y el impacto de los mecanismos de regulación que subyacen en los sistemas bacterianos, con objeto de producir eficientemente una proteína recombinante, y además contar con las bases moleculares que permiten su obtención al aplicar diferentes estrategias experimentales.

3.1. El operón como regulador de la expresión génica La parte medular de todo protocolo para la obtención de un péptido recombinante implica necesariamente dos aspectos: el conocimiento de la secuencia de ADN y los mecanismos de regulación que subyacen para su expresión, por lo que será necesario repasar algunos conceptos previamente revisados, dando un mayor énfasis al control génico. 

Toda la información génica que contiene un organismo, procarionte o eucarionte, se localiza en su genoma. El genoma usualmente esta codificado por una doble hebra de ADN y este a su vez se organiza en cromosomas, donde dependiendo del tipo celular se presentan diferencias en su número (ver Tabla I). En las bacterias se trata de un solo cromosoma que presenta una estructura circular, sin olvidar que además pueden contener ADN extra-cromosomal en la forma de plásmidos.

Tabla I. Número de cromosomas determinados en algunas especies/tipos celulares con su respectivo contenido de genes aproximado (predecido/determinado) Tomado de Walsh 2006. Universidad Abierta y a Distancia de México

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Especie/tipo celular E. coli S. cerevisiae Helecho Mosca de la fruta Ratón Rata Perro Humano 



Número de cromosomas 1 16 1 200 18 40 42 78 46

Número de genes 4 400 6 200 13 600 13 000 30 000-35 000 23 000 19 300 30 000-35 000

Ahora bien, todos los cromosomas contienen regiones codificantes, que corresponden a segmentos de nucleótidos que codifican una secuencia específica de aminoácidos de un polipéptido o bien, una secuencia de nucleótidos de ARNt o ARNr; por su parte también están las regiones no codificantes (Figura 1), donde como dato curioso es el hecho de que estas regiones no-codificantes representan cerca de un 70% del genoma y las regiones codificantes son la minoría (30%), de ahí que es común escuchar que tenemos mucho ADN basura, aunque se debe ser cuidadoso porque el hecho de que aún se desconozca su función no implica que no la tenga. En relación a las secuencias de los genes debemos recordar los elementos regulatorios, que corresponden a secuencias cortas de ADN que marcan el inicio o término de un gen o una serie de genes relacionados o que regulan el nivel de expresión génica (Figura 1). Una secuencia regulatoria localizada hacia el extremo 5´de un gene es denominada la región promotora (P), la cual es identificada de forma específica por la ARN polimerasa (enzima responsable de transcribir la secuencia génica en ARN). Inmediatamente adyacente a esta región se encuentra una secuencia característica, la cual representa el punto de inicio de la transcripción (TC) y al final de dicha secuencia, sujeta a ser transcrita, se ubica el sitio de terminación (tC), este segmento determinado corresponde a la unidad transcripcional. Dentro de esta unidad también se identifican dos puntos, que son las señales de inicio y término (TL y tL) que definen la secuencia de nucleótidos que será específicamente la traducida en una proteína particular, con objeto de lograr lo anterior primero deberá suceder un proceso de edición, que se encarga de eliminar las secuencias no codificantes de la secuencia de ADN.

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Existen otras regiones reguladoras que pueden controlar la expresión génica y pueden presentarse arriba del extremo 5´, o bien adelante del 3´ de la unidad de secuencia transcripcional.

Figura 1. Organización génica general dentro de un genoma eucarionte. Modificado de Walsh 2006.

Acorde a lo anterior hemos recordado rápidamente la organización y precisado algunas características de la regulación involucrada para que suceda la expresión génica en eucariontes, lo cual nos permitirá comprender los mecanismos de regulación que operan en los procariontes.

3.1.1. Operón La expresión génica es el proceso que abarca desde la transcripción, el procesamiento del ARN mensajero hasta su traducción en proteína, y el control de esta expresión sucede fundamentalmente a nivel de la transcripción.

Este control se realiza a través de la unión específica de proteínas y la secuencia de ADN particular. A diferencia de lo que sucede en los eucariontes, los procariontes presentan agrupaciones de genes que están sujetos a una sola región regulatoria o promotora (ver figura 2). Universidad Abierta y a Distancia de México

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Pero ¿cómo se llegó a determinar esta organización de la expresión genética en las bacterias? Todo comenzó con la observación de cómo algunas bacterias, en particular E.coli, que si bien crecía en un medio con glucosa como fuente de carbono, también podía utilizar otra fuente sin problema alguno, como el disacárido lactosa. Lo curioso de esta observación es que ninguna ruta metabólica de este microorganismo presenta a este metabolito. Y entonces surgió la duda: si la lactosa no está presente en ninguna vía metabólica ¿cómo es que puede utilizarla como fuente de carbono? En el metabolismo de la lactosa, una enzima la -galactosidasa que hidroliza al disacárido y produce galactosa y glucosa, es de suma importancia y resulta que esta se expresaba en células que crecían en un medio con lactosa, pero además se expresaba junto con otras dos enzimas; es decir había un patrón que sugería que los niveles de expresión de una serie de enzimas que participaban en la adaptación a una determinada modificación de su entorno, en este caso, el medio con lactosa, implicaba una regulación coordinada y fue entonces que Jacob y Monod propusieron el modelo del operón para dar una explicación a la expresión coordinada que observaron. Acorde a lo anterior, un operón está constituido por un gen regulador, una secuencia reguladora del ADN denominada centro operador y un conjunto de genes estructurales (Figura 2).

Figura 2. Esquema general de la organización de un operón.

Acorde al esquema de la Figura 2, un operón consiste en una unidad de secuencia transcripcional constituida por varios genes en secuencia (z, y y ) la cual contiene una región reguladora, el promotor que es P y sería el equivalente al que presentan los eucariontes; o es el centro operador y además presenta una región hacia el 5´correspondiente a un promotor p que controla la expresión de un gen regulador i, el cual modula la expresión de los genes que incluye el operón. El gen regulador codifica para una proteína represora (el represor) que se une al centro operador, la unión del represor en este sitio, da como resultado que la transcripción de los genes que contiene el operón no se lleve a cabo. En la transcripción de los genes incluidos en el operón se origina una única molécula de ARN mensajero que codifica para las correspondientes proteínas; cuando una molécula Universidad Abierta y a Distancia de México

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de ARN mensajero codifica para más de una proteína recibe el nombre de transcrito policistrónico. A continuación vamos a ejemplificar con más detalle el cómo funciona un operón a través de dos casos, los operones de lactosa y el del triptófano.

3.1.2. El operón de lactosa Durante muchos años el operón lactosa u operón lac fue uno de los operones más intensamente estudiado. Es un operón bastante simple que consiste de tres genes estructurales designados como lacZ, lacY y lacA (Fig. 3). El gen lacZ codifica para la enzima β-galactosidasa que cataliza la hidrólisis del disacárido lactosa en glucosa y galactosa. El gen lacY codifica para una permeasa de galactósido que proporciona funciones de transporte para una variedad de azúcares, incluidas la lactosa, melibiosa, y rafinosa. El gen lacA codifica para una tiogalactósido transacetilasa, una enzima de función incierta que puede desempeñar un papel en la desintoxicación de algunos tiogalactósidos. Las tres proteínas están normalmente presentes en cantidades traza (cantidades muy pequeñas o apenas detectables) en una célula, pero cuando esa célula está creciendo y usando lactosa, los niveles de estas enzimas aumentan hasta 1000 veces sus niveles. A este proceso de estimular el aumento de las enzimas involucradas en el operón lactosa se le llama inducción, y por lo tanto las enzimas del operón lactosa se consideran inducibles. Cualquier compuesto, como la lactosa, cuya presencia en el medio de como resultado una inducción, es considerado un inductor. Después de que el suministro del inductor en un medio se agota, debido a la acción de la enzima βgalactosidasa, la síntesis de enzimas del operón lactosa se reprimen una vez más, y la célula vuelve a su estado original.

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Figura 3. Regulación del operón de lactosa (modificado de Stryer 2003).

Ahora bien, lo contrario de una enzima que es inducible y reprimible es una enzima constitutiva. Una enzima constitutiva es por tanto una enzima que se produce a una velocidad constante en todas las condiciones celulares presentes. La producción constitutiva de una enzima implica una falta de mecanismos de control, y ciertos tipos de mutaciones pueden hacer que la producción de las enzimas del operón lactosa sean constitutivas (que estén siempre presentes) en lugar de que sean inducibles. Por estudios de mutaciones se encontró un gen represor llamado lacI, que se encuentra adyacente a los genes del operón lactosa lacZ, lacY y lacA. El gen lacI codifica para una proteína represora que ejerce un control negativo sobre el operón lactosa (es decir, evita la transcripción). Ahora bien, este represor debe interactuar con el operón lactosa de alguna manera para evitar la transcripción. Se encontró que la proteína represora interactúa en un sitio llamado “operador”. Hay que tener en cuenta que el operador es sólo un sitio de unión en el ADN y no produce ningún producto difusible. Si la presencia de la proteína represora en el operador evita la transcripción y la ausencia de un represor lo permite, la inducción debe consistir en la eliminación del represor de un operador, presumiblemente debido a un cambio en las propiedades del represor, Universidad Abierta y a Distancia de México

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resultante de la interacción con el inductor. Varias moléculas que tienen una unión y ligadura β-galactósido, tal como la que se encuentra en la lactosa, funcionan como inductores in vivo e in vitro. Algunas de estas moléculas, a diferencia de la lactosa, que no son degradados por la β-galactosidasa se les denominan inductores gratuitos. Entre estos compuestos o inductores gratuitos se encuentra el tiometil-β-D-galactopiranósido (TMG) y el isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), ambos de los cuales con frecuencia se han utilizado para los estudios sobre inducción. Debido a que no se degradan, su concentración no cambia en la célula, incluso si estas crecen durante muchas generaciones. El represor lac (proteína codificada por el gen lacI) fue el primer ejemplo de una clase de proteínas que Jacques Monod y Jean -Pierre Changeaux llamaron proteínas alostéricas. Tales proteínas tienen al menos dos configuraciones estables de mínima energía, y cada una tiene una actividad característica (o falta de actividad) asociada a ella. En el caso del represor lac, una configuración alostérica de la proteína es cuando se une al operador como un complejo tetramérico, mientras que la otra configuración enzimática no lo hace. El cambio en la configuración de una proteína alostérica se desencadena por una molécula denominada efector alostérico que es una pequeña molécula que se une a un sitio especial en una proteína alostérica. Para el represor lac, el efector alostérico es cualquiera de las moléculas inductoras (TMG o IPTG) enunciados anteriormente. El inductor en realidad no compite por unirse al operador sino que se une a la proteína represora y esto resulta en que el represor ya no se puede unir al ADN. La baja concentración de inductor que se requiere para un cambio alostérico es importante debido a que el inductor químico del operón lactosa no es en sí la lactosa, sino un derivado de la lactosa llamado “alolactosa”. La enzima β-galactosidasa produce cantidades muy pequeñas de alolactosa a partir de lactosa por desplazamiento del enlace glucosídico presente en esta molécula. Así, molecularmente hablando, la alolactosa es el resultado de mover el resto de glucosa unida en el carbono 4 de la galactosa al carbono 6 de la galactosa. En otras palabras, la enzima no rompe el enlace glucosídico, tan sólo mueve la posición del enlace de la posición 4 a la posición 6. Una implicación de esta observación es que una cantidad mínima de β-galactosidasa debe estar presente en todo momento, o la inducción del operón lactosa no podría ocurrir. Otra es que un azúcar no tiene que ser desglosado por la β-galactosidasa para ser un inductor. Además de los inductores gratuitos mencionados anteriormente, la melibiosa es un inductor que sólo requiere la función galactósido permeasa, ya que se descompone a través de una vía enzimática diferente. La rafinosa, por otra parte, no es un inductor, pero es transportada por la galactósido permeasa. Sólo las células que expresan constitutivamente el operón lac son capaces de crecer en rafinosa.

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El modelo original del operón asumia que la ARN polimerasa se unía o ligaba al operador para iniciar la transcripción, y que, por tanto, la represión era una simple competencia entre la polimerasa y la proteína represora para el mismo sitio de ADN. Sin embargo, Agnes Ullman y Jacques Monod mostraron, a través de experimentos con bacterias mutantes, que si hay modificaciones corriente arriba (que quiere decir hacia el extremo 5’ por arriba del inicio del promotor), la unión de la ARN polimerasa es más eficiente. Pero, si había mutaciones corriente abajo, lo que quiere decir hacia el extremo 3’ abajo del promotor es cuando la polimerasa se une con menos eficiencia y, en definitiva, producen menos transcripciones. Para cuestiones prácticas, las mutaciones promotoras entre el gen lacI y los sitios del operador lacZ, se designan lacZp. La designación Z indica que el promotor esta "corriente arriba" del gen Z (hacia el extremo 5’). El último elemento regulador importante descubierto fue también el que finalmente explicaba las primeras observaciones. Este fenómeno, que fue demostrado por Boris Magasanik, era parte de un grupo más grande de eventos reguladores llamado represión de catabolitos o represión de glucosa. El concepto básico es que algunos componentes liberados durante la descomposición (catabolismo) de la glucosa causaban inhibición de sistemas enzimáticos auxiliares, tales como el operón lactosa. Sin embargo, el mediador real de la represión catabólica no fue descubierto hasta que Earl Sutherland y colaboradores identificaron una molécula pequeña denominada 3', 5' adenosinmonofosfato cíclico (o AMPc o AMP cíclico), como un elemento regulador en las células animales y bacterianas. Colaboradores mostraron más tarde que la adición de este compuesto a cultivos en la fase de crecimiento de E. coli liberaba la represión catabólica y permitía la inducción de una variedad de operones incluidos el de lactosa. La concentración de AMPc no varíaba en E. coli durante el crecimiento exponencial sobre glucosa o lactosa. Por lo tanto, la concentración de AMPc no puede ser el mecanismo responsable de la represión catabólica. Experimentos sobre el transporte de glucosa (Hogema et al. 1998) han proporcionado una explicación para este fenómeno. La glucosa entra en la célula a través del sistema fosfotransferasa, PTS por sus siglas en ingles de Phosphotransferase system. Una de las enzimas en la vía es la enzima IIA (Glc), una proteína que se fosforila y desfosforila alternativamente durante el transporte de glucosa, ya que proporciona el grupo fosfato para producir glucosa 6-fosfato. En su estado no fosforilado, la enzima IIA causa la exclusión del inductor de lactosa mediante la unión a la escasa lactosa permeasa presente en la membrana celular, lo que significa que el operón lac no se puede encender mientras que la glucosa está siendo transportada. Una vez más, las mutaciones sirven para definir el papel del nuevo elemento regulador en el operón lac. Las mutaciones situadas en la región promotora podrían liberar la necesidad de AMPc (por ejemplo, que las células se vuelvan insensibles a la represión

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catabólica). Otro tipo de mutación bien localizada y que está lejos del operón lactosa dio como resultado la incapacidad de AMPc para activar el operón lactosa (así como algunos otros). Este nuevo sitio genético (crp) se demostró que codifica para una proteína, a la cual se le han otorgado varias denominaciones como la proteína de activación de catabolitos o CAP por sus siglas en inglés (catabolite activation protein), proteína del receptor de AMPc o CRP por sus siglas en inglés (cAMP receptor protein), o gen de la proteína de activación catabólica o CGA por sus siglas en inglés (catabolite gen activation protein). El requerimiento de esta proteína también podía ser liberado por mutaciones localizadas en la región promotora. La CRP y restos de cAMP actúan como elementos reguladores positivos de control debido a que en su ausencia la transcripción no puede ser aumentada por encima de los niveles basales. La región reguladora del operón lactosa ha sido completamente secuenciada, como ha sido el gen lacZ. Se han hecho comparaciones entre las regiones de transcripción conocidas (Tabla II), y se ha elaborado un modelo exhaustivo (Fig. 4). Tabla II. Algunas secuencias reguladoras que se encuentran en los operones de E. coli.

Promotores Consenso Lac Operon Promotor 1 Promotor 2 gal Operón Promotor 1 Promotor 2 Consenso de unión a CRP lac gal

Secuencia - 10 TATAAT

Secuencia - 35 TTGACA

-10

- 35

TATGTTG

GCTTTACACT

-30

-55

TTACACT

TCACTCATT

-10

-35

TATGGTT

TGTCACACTTT

-15

-40

TATGCTA AANTGTGANNTNNNTCANATW -75

ATGTCACACTT

-55

CAATTAATGTGAGTTAGCTCACT -50

-40

AATTTATTCCATGTCACACTTTTCG

Nota: Se utilizan las abreviaturas habituales para las bases nitrogenadas, donde N representa cualquier base y W puede ser adenina o timina. Sólo se muestran las hebras antisentido. Los números encima de la secuencia son el número de bases antes del inicio del ARNm cuando se usa el promotor 1. Donde Secuencia consenso de unión se refiere al promedio de secuencias de nucleótidos que son reproducidas con mínimas variaciones en un grupo de ADN o ARN

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relacionadas. La secuencia consenso de unión muestra los nucleótidos más comúnmente encontrados en cada posición (Modificado de Birge 2006).

Experimentos de unión a proteínas han demostrado que el represor lac se une a tres sitios dentro de la región del operón lac. O1 es el sitio operador original; y hay dos operadores auxiliares. O2 es un sitio entre el gen lacZ en sí (401 pb corriente abajo), y O3 es un sitio de 92 pb corriente arriba cerca del sitio de unión a AMPc. La configuración más estable es cuando un tetrámero de proteína represora puede unirse a O1 así como también a O2 y O3 de manera simultánea. Esta unión provoca la formación de una estructura en forma de U constituida por la hélice de ADN y que hace al promotor 1 no disponible a la ARN polimerasa.

Figura 4. Regulación del operón lactosa. Las líneas azules representan ADN de doble cadena en la región del operón lac. Las flechas horizontales representan los transcritos de ARNm, con la cantidad de transcrito indicada por el grosor de la línea. Los sitios promotores se indican por P, los sitios de terminación de la transcripción se indican por t, y los sitios de unión del represor se indican por O. El transcrito lacI se sintetiza en todo momento, pero la proteína represora resultante es sólo activa en ausencia de alolactosa (producto del metabolismo de lactosa). Un tetrámero represor activo se une a O1 y O2 u O3 para formar un bucle que bloquea el acceso a la región promotora 1. Incluso si el promotor 1 está accesible, la ARN polimerasa se unirá sólo cuando AMPc y las proteínas de PCR están presentes. Los promotores 2 y 3 son activos en niveles bajos en todo momento y proporcionan la síntesis de fondo de ARNm.

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Entonces el represor se une al operador y la ARN polimerasa no puede unirse y se bloquea la transcripción. Ahora bien, este evento génico, la transcripción, puede ser sujeto de modulación a través de proteínas que establecen contacto con la secuencia que está siendo codificada por la ARN polimerasa, que sería el complejo AMPc-CAP. Entonces en resumen, el complejo AMPc-CAP es capaz de unirse a una secuencia específica del ADN y promueve la transcripción de los genes involucrados en el metabolismo de la lactosa. Ten en cuenta que aunque los elementos reguladores positivos y negativos están presentes, el operón lac (definido como: promotor, operador, Z, Y, A, los genes, y la secuencia de terminación) se considera que es bajo control negativo porque se produce una proteína represora. El gen lacI no es parte del operón lac, ya que tiene su propio promotor y secuencias de terminación. Normalmente se expresa constitutivamente en un nivel bajo. Como se señaló anteriormente, varias mutaciones hasta-promotor se han aislado que causan un aumento considerable en la cantidad de represor producido. (Los detalles adicionales de la secuencia de ambos operones se pueden encontrar en el libro titulado El lac Operonby. Müller-Hill [1996]). Entonces, ¿para qué nos sirve lo anterior? Si hemos comprendido los mecanismos que regulan la expresión de los genes involucrados en el metabolismo de la lactosa, podemos aplicar este saber para la generación de una proteína recombinante ¿Cómo? Recuerda la estructura de los plásmidos, además de poseer genes que le permiten resistir la acción de los antibióticos, puede contener otros genes y resulta que suelen contener operones; acorde a lo revisado, si conocemos como se regula el operón de lactosa podemos manipular su expresión en un plásmido, pero además se puede integrar una secuencia de un gen de nuestro interés ya sea homólogo o bien heterólogo, y se puede acoplar su expresión al del operón, por eso es tan importante que identifiques los elementos del mismo para poder aplicar este conocimiento más adelante. El gen lacZ juega un papel importante en la biología molecular. Se utiliza con frecuencia como un indicador de la actividad operón (un gen reportero) por clonación en un sitio adyacente al promotor y operador en estudio debido a que es muy estable y rápida de ensayo con reacciones colorimétricas.

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3.1.3. El operón de triptófano Vamos ahora a revisar otro ejemplo de este tipo de regulación en procariontes, el operón de triptófano. La biosíntesis de este aminoácido es un proceso complejo que se inicia con el ácido corismático compuesto (un producto de las enzimas codificadas por los arogenes) y es catalizada por enzimas cuyas tres subunidades están codificadas dentro de los cuatro genes (A-E). Los productos de los genes trpA y trpB forman la enzima triptófano sintetasa, y los productos de los genes trpE y trpD forman la enzima antranilato sintetasa. El gen trpC para la enzima indol-glicerofosfato sintetasa, ver Figura 5.

Figura 5. Estructura del operón triptófano. Modificado de Birge, 2006.

El mapa génico de E. coli del operón trp parece convencional, aunque los genes estructurales están dispuestas en orden alfabético inverso (Fig. 5). El gen trpR, que codifica para una proteína represora, se encuentra a cierta distancia del operón que regula. Una vez más, las mutaciones han definido un promotor discreto y los sitios del operador, en este caso el operador se encuentra dentro del promotor. La fuerza del promotor se ve afectada por dos bloques ricos en Adenina y Timina localizados corriente arriba a partir del promotor (en -50 y -90). La supresión de estas regiones reduce en gran medida la eficiencia de promotor. El examen de las cepas que llevan mutaciones en el gen polares E o la primera parte de D muestra que un segundo promotor de baja eficiencia está presente, el cual puede proporcionar la transcripción constitutiva de los genes trp CBA. A pesar de su similitud con el operón de lactosa, el operón trp tiene varias características genéticas nuevas. A diferencia de los operones de carbohidratos, no hay participación de cAMP o CRP en esta regulación. En su lugar, hay una regulación de la producción de enzimas biosintéticas acorde con la cantidad de triptófano disponible en la célula. Esta regulación requiere un método de detección de la presencia de triptófano en el citoplasma

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y detener la transcripción del mRNA siempre que la concentración de triptófano sea lo suficientemente alta. Un sistema de detección es por medio de la molécula represora. Los estudios de unión demuestran que la proteína represora, codificada por el gen trpR, es un co-represor y no se une al operador trp a menos que este acomplejado con el triptófano. Por lo tanto, la formación del complejo inhibidor es dependiente de la presencia del producto final de la ruta bioquímica, el triptófano. El complejo represor compite directamente con la ARN polimerasa por la unión con el promotor. En las células suministradas con exceso de triptófano, un inmunoensayo reveló la presencia de dímeros de 120 represor, pero en ausencia de triptófano hay 375 dímeros represor, la mayoría de los cuales no son funcionales debido a la falta de triptófano. Cabe señalar de paso que el triptófano también actúa como un efector alostérico para inhibir directamente la antranilato sintetasa enzima, proporcionando de este modo dos niveles de regulación. Cuando el triptófano está presente en exceso, la primera etapa enzimática en la vía bioquímica se bloquea, y el complejo represor recién formado impide aún más la síntesis del ARNm del operón. La represión del operón reduce la cantidad de enzima presente alrededor de 70 veces. Parecería que el PRT operón tiene mecanismos reguladores suficientes para sus necesidades, pero Charles Yanofsky y sus compañeros de trabajo, que se dedicaban a análisis de la secuencia del operador y promotor de ADN, descubrió otro mecanismo. En casi todas las moléculas de ARNm hay una región llamada la secuencia líder que viene antes que el código para el primer producto principal del operón, y el líder de E. coli trp consta de 162 pb que se extiende entre el extremo de la región del promotor-operador (el sitio en el que el ARN polimerasa se une) y el codón de iniciación para el gen trpE (el sitio donde los ribosomas se unen). A este sitio se le ha denominado sitio atenuador después de un sitio similar identificado en el operón de histidina por T. Kasai. Por analogía con los operadores y promotores, el atenuador se designa trpEa. Esta región es capaz de adoptar varias estructuras alternativas, es deci,r presenta dos estructuras secundarias alternativas, ambas forman horquillas, solo que una inhibe la transcripción y otra la favorece. Cuando la concentración de triptófano es adecuada, se transcribe el ARNm de la secuencia líder y se forma una horquilla que impide la unión de la ARN polimerasa. Cuando el triptófano escasea también se forma una horquilla alternativa que no impide que se una la ARN polimerasa y de este modo continúa la transcripción, ver Figura 6.

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Figura 6. Mecanismo de atenuación del operón de triptófano. (A) Inhibición de la transcripción y (B) A bajas concentraciones de trp se favorece la transcripción (Modificado de Stryer et al. 2003).

El análisis de secuencia de ARN líder ha demostrado que puede doblar en varias formas inmediatamente después de la transcripción para producir las diversas estructuras de tallo-bucle (Figura 6). Al comienzo del primer bucle de potencial (27-68 bases) hay un marco de lectura abierto que codifica para un pequeño polipéptido de 14 aminoácidos. Entre los aminoácidos que aparecen en este polipéptido son dos residuos de triptófano adyacentes cerca del extremo carboxilo terminal. El triptófano es un aminoácido relativamente poco usado, y dos residuos de triptófano en la sucesión son raros. Yanofsky y sus colegas sugirieron que este polipéptido es la clave para la regulación por atenuación. Con esta revisión contamos con los fundamentos de la regulación génica que puede presentarse en los procariontes, es importante precisar que hay más operones en las bacterias, pero estos dos ejemplos permiten contar con una visión general de este fascinante mecanismo de control. Acorde a esto podemos abordar la parte experimental implicada en la generación de una proteína recombinante.

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3.2. Protocolos de expresión de proteínas Con el conocimiento recién adquirido de la regulación de la expresión génica en procariontes y lo revisado en las unidades previas, estamos listos para abordar las estrategias experimentales que permiten la producción de una proteína recombinante utilizando un sistema de bacterias. La Figura 7 esboza el procedimiento general para la generación de un péptido recombinante, a partir del cual se irá desarrollando el tema que nos entretiene. Como primer acercamiento debemos recordar el significado del término recombinante, el cual tiene como raíz la recombinación, es decir, involucra el intercambio de la información genética entre dos organismos que pueden pertenecer a la misma o diferente especie. Por tanto, es requisito tener disponible la secuencia de ADN y a partir de este dato, se puede comenzar con el protocolo. Los protocolos que se irán revisando permitirán desarrollar y conocer varias estrategias experimentales de cada uno de los puntos señalados en la Figura 7.

Obtención de la secuencia de ADN del péptido Como requisito inicial se necesita conocer la secuencia de ADN a partir de la cual se pretende generar la proteína de interés, para realizar este punto es necesario:  Realizar una búsqueda en bancos de datos como el GenBank, donde primeramente se identifica la proteína y se analizan las secuencias reportadas, donde es conveniente seleccionar aquella información que contenga una secuencia lo más completa posible.  Se compara dicha secuencia con otras secuencias que codifican para la misma proteína pero entre diferentes especies y dependiendo del tipo celular del que se desea obtener, se seleccionan aquellas secuencias más cercanas, esto se puede realizar a través de un programa denominado BLAST que el mismo GenBank proporciona de forma gratuita.  Una vez que se cuenta con la secuencia, se procede a diseñar los cebadores o primers, los cuales permitirán aislar dicha secuencia de la especie de interés.

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Figura 7. Protocolo general para la obtención de proteínas recombinantes utilizando un sistema bacteriano.

Procedimiento para el diseño de cebadores Con objeto de poder amplificar la secuencia de ADN de interés se requiere diseñar secuencias cortas de oligonucleótidos que se unen específicamente a la cadena de ADN que son denominados parejas de cebadores o bien primers, que corresponden al cebador hacia adelante (primer forward) y el que permite el avance hacia atrás (primer reverse), los cuales se unirán a la secuencia de ADN de forma complementaria y de esta manera facilitan el inicio de la actividad de la polimerasa, los criterios que deben considerarse durante su diseño son que:     

Su longitud debe ser entre 19 y 25 nucleótidos. Se caracterizan por un alto contenido de guanina y citosina (GC). Ambos cebadores deben ser de la misma extensión. Su secuencia de nucleótidos es complementaria a la región que se desea amplificar. Tienen una temperatura de fusión mayor a 58 oC.

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Aislamiento y purificación del ADN codificante Una vez que se diseñaron los cebadores y se sintetizan, se sigue un procedimiento que consiste en aislar la secuencia génica de la especie de interés. Esto se realiza a través del uso de protocolos comerciales, que permiten aislar ADN o ARN, y una vez aislado el material genético, se procede a recuperar de forma específica la secuencia génica que codifica para la proteína, es decir, de todo el genoma lo que se pretende es únicamente extraer una secuencia codificante, pero además se persigue que este en grandes cantidades. Para ello, la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa por transcripción reversa (RT-PCR) resulta una estrategia ampliamente utilizada, ya que permite amplificar de forma específica sólo la región codificante de interés y evita otras secuencias no deseadas, el procedimiento para realizar lo anterior se resume en la Figura 8.

Figura 8. Eventos principales involucrados en la técnica de RT-PCR.

Como se observa en la figura, primero se debe obtener el material biológico, por ejemplo, un tejido, una línea celular, una hoja, etc. del cual se procede a purificar el ARN de dicha fuente, una vez que se ha analizado la integridad del ARN, se puede desarrollar la técnica del RT (transcripción reversa), en otras palabras, se obtendrá ADN a partir de ARN, la secuencia de ADN recuperada se denomina cADN, el cual tiene una estructura muy estable, comparado con el ARN y es el sistema a partir del cual se realizará la amplificación a través del PCR. Con la obtención de dicha secuencia se está listo para iniciar la clonación de la misma en un sistema bacteriano, mismo que permitirá obtener la proteína en grandes cantidades y de manera muy rápida. Clonación de la secuencia génica de interés en un sistema procarionte La estrategia para clonar una secuencia de ADN se indica a continuación, ver Figura 9:

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1) Fragmentación del material genético a través del uso de enzimas de restricción. 2) Integración del segmento en un vector de clonación, que puede ser moléculas de ADN pequeñas y con capacidad de auto-replicación, como los plásmidos. 3) Introducción de los vectores que portan la secuencia de interés en células hospederas, en este caso, células procariontes. 4) Crecimiento de las células en placas de cultivo. 5) Identificación de las células que contienen dicha secuencia.

Figura 9. Visión general del proceso de clonación del ADN. Modificado de Walsh 2006.

De acuerdo a esto, primeramente se fragmenta el material génico a través del uso de enzimas de restricción, estas reconocen, se unen y cortan secuencias de ADN de forma específica, la Tabla III ejemplifica algunas enzimas de restricción ampliamente utilizadas. El siguiente punto es seleccionar el vector de clonación, el cual debe ser capaz de autoreplicarse en el interior de la célula hospedera, donde E. coli es una de las bacterias más utilizadas. Dos de los típicos vectores utilizados son los plásmidos y el bacteriófago lamda ().

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Tabla III. Enzimas de restricción ampliamente utilizadas para la fragmentación del ADN. Tomado de Walsh, 2006.

Los plásmidos son arreglos circulares de ADN que son extra-cromosomales y contienen entre 5000 y 350 0000 pb de longitud, estos vectores albergan varios tipos de genes cuyos productos le confieren a las células portadoras la habilidad de resistencia a los antibióticos de forma natural. De ahí que resulten ser un excelente sistema para introducir la secuencia de interés, ya que a través de esta resistencia se puede identificar aquellas bacterias que han recibido de forma exitosa la clona del gen de interés. Vamos a discutir esto examinando un ejemplo de un plásmido comúnmente utilizado, el plásmido pUC18, ver Figura 10. Este plásmido es utilizado para propósitos de clonación, acorde a la estructura mostrada contiene 3 genes: el gene de resistencia a ampicilina (ampR), el gene lacZ que codifica para la -galactosidasa y el gene lacI que codifica para un factor que controla la transcripción de lacZ. Además tiene un origen de la replicación (ori) que es esencial para la replicación del plásmido dentro de la célula. También está una secuencia corta de ADN denominada región de poliunión (usualmente se le conoce como la región de clonación múltiple). Esta secuencia tiene sitios de corte para 13 enzimas de restricción, lo cual facilita la inserción de fragmentos de ADN en este sitio.

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Figura 10. Características del plásmido pUC18. Modificado de Walsh, 2006.

Podemos observar cómo el sitio de clonación múltiple está incluido en la región del gene lacZ, si el fragmento de ADN de interés se introduce en ese sitio, la secuencia de lacZ se alarga y esto impide su transcripción, por tanto, no hay formación de -galactosidasa y esto es una estrategia de aislamiento, es un control negativo, porque en un medio con galactosa solo crecerán aquellas bacterias que no tienen el inserto. Pero seguramente te estarás cuestionando ¿puedo introducir cualquier tamaño de fragmento de ADN en un plásmido? No, depende de la longitud de la secuencia de interés, fragmentos cortos suelen introducirse en plásmidos, arriba de 50 000 pb es recomendable un bacteriófago y más de 100 000 hay unos vectores denominados BAC (cromosomas bacterianos artificiales). Continuemos la revisión del evento de la clonación, si ya han seleccionado su vector de clonación, ahora hay que introducirlo en la bacteria, y el mecanismo de transferencia génica de preferencia es la transformación, ¿recuerdas las características que presenta?, si no, puedes volver a repasarlo en la Unidad 2. Este mecanismo de recombinación consiste en introducir un fragmento de ADN en la célula aceptor, pero requiere que la célula sea competente, hay diferentes estrategias experimentales para lograr dicha competencia, siendo la electroporación y la incubación en cloruro de calcio con choque térmico los métodos predilectos.| A continuación las bacterias son cultivadas en placas de agar con una composición en el medio muy específica con objeto de discriminar aquellas colonias que no contienen el

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plásmido, donde cada célula individual puede formar una colonia (clona de células), ver Figura 9. En este caso, el vector de clonación facilita mucho este quehacer, ya que el plásmido contiene genes que facilitan la resistencia a los antibióticos y entonces sólo crecerán aquellas clonas de células que tengan el plásmido en su interior, con esto se evalúa la eficiencia de la transferencia del plásmido a la célula hospedera. Esto da como resultado tres tipos de células:   

Aquellas células que no tomaron el plásmido y por tanto, no crecerán. Células que contienen el plásmido pero este no integro el segmento de ADN de interés, pero si crecen en el medio suplementado con antibiótico. Células que contienen el plásmido y además tiene integrado el segmento de ADN de interés; crecen en la placa.

Pero entonces, ¿cómo podemos distinguir entre las clonas que crecen si contienen el segmento de ADN de interés? Para ello, ahora aplicaremos lo aprendido de los operones, ya que en el ejemplo del plásmido pUC18 resulta que dicho segmento se puede integrar en uno de los genes del operón de lactosa, en particular en el gen lacZ, donde ya revisamos que codifica para la -galactosidasa, en el medio de crecimiento se adiciona una galactosa unida a un colorante azul (X-gal) cuando no hay inserto en este gene la glucosidasa corta el complejo colorido y las células se ven azules. Si el fragmento de ADN se inserta en el gen lacZ, entonces no hay -glucosidasa y las clonas crecen de color normal, sin azul (figura 11).

Figura 11. Identificación de las clonas que contienen el inserto de ADN de interés. Modificado de Walsh, 2006.

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Por tanto, hemos observado que no solo el vector de clonación permite introducir la secuencia del gen que codifica para la proteína de interés, sino que también facilita la identificación de aquellas bacterias que se transformaron exitosamente. Además puede tener más aplicaciones como para la generación de mutantes, para ello revisemos el siguiente caso (Ordoñez, S/f): Algunas especies del orden Actinomicetales como Corynebacterium, son bacterias Grampositivas, saprófitas que son ampliamente utilizadas en procesos biotecnológicos y gracias la generación de mutantes en un operón que regula el metabolismo del Arsénico fue que se evidencio su gran capacidad para resistir los efectos tóxicos del arsénico.

Figura 12. Crecimiento de Corynebacterium a diferentes concentraciones de arsénico. Acorde a la imagen anterior, se observa que las colonias 1, 2 y 5 tienen gran resistencia al arsénico y por tanto, deben de tener en su cromosoma un operón que regula el proceso de detoxificación del arsénico, el operón arsRBC.

Para demostrar lo anterior, se obtuvieron mutantes en dicho operón a través de interrumpir los genes del operón. Para generar las mutantes, se insertaron secuencias de nucleótidos en los genes del operón localizado en el cromosoma de la bacteria receptora, por lo cual ya no se lograron expresar y el resultado fue que las bacterias ya no crecieron en un medio con arsénico como se puede ver en la siguiente imagen:

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Figura 13. Crecimiento de las bacterias con las inserciones en el operón estudiado. El crecimiento de las cuatro colonias disminuye conforme aumenta la concentración del arsénico, evidenciando que se pierde la resistencia a este metal como consecuencia de la interrupción del operón. Recuperado de http://s3.amazonaws.com/publicationslist.org/data/m.letek/ref24/POSTER%20ARSENICO%20BIOTEC%2004.pdf

Expresión de la proteína recombinante El vector de clonación facilita este objetivo, ya que el segmento de ADN está localizado en un gen perteneciente a un operón y por tanto, la expresión de esta secuencia génica puede ser inducida de forma controlada. Es indispensable que previo a realizar la expresión del gen, se verifique la autenticidad del mismo, esto es, hay que aislar de la clona de células dicho ADN y determinar su secuencia, habría que utilizar las mismas enzimas de restricción usadas durante la clonación y verificar el tamaño de la secuencia y secuenciarla, es decir, determinar la composición de nucleótidos presentes, dicha secuencia debe ser idéntica a la que se utilizó para aislar el cADN. Con lo anterior, entonces se procede a tomar la clona de células que contienen el fragmento de ADN y se crecen en un medio de cultivo que contiene el inductor, de tal forma que se produce la proteína recombinante en grandes cantidades.

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Purificación de proteínas recombinantes La parte final corresponde al aislamiento y purificación de la proteína recombinante, para ello se puede seguir la siguiente estrategia: 1. 2. 3. 4. 5.

Crecimiento de la clona de células que contienen la secuencia de ADN de interés. Inducción de la expresión del gene para producir la proteína Extracción de la proteína Purificación Evaluación de la pureza

Con la clona de células ya bien identificada se procede a crecer dicha clona en un medio, usualmente un medio de cultivo líquido que contiene el inductor de expresión. Con lo anterior se pretende obtener la proteína de interés en grandes cantidades. Técnicas de extracción del sistema biológico de interés: proteína recombinante Comprender la regulación de la expresión de proteínas, las posibles modificaciones que sufren, las interacciones proteína-proteína y sus funciones durante diferentes fases del desarrollo celular son necesarias para entender la fisiología de los organismos. Estos análisis complejos sobre la función de las proteínas es uno de los mayores retos que enfrentan los científicos hoy en día. Aunque el campo de la proteómica (rama de la ciencia que estudia específicamente a las proteínas) descrita originalmente como el estudio de proteínas codificadas por el genoma de los organismos, en la actualidad se ha expandido para incluir la función y la expresión de todas las proteínas. Así, la proteómica no sólo facilita el estudio de todas las proteínas expresadas en la célula sino también de todas las isoformas de una misma proteína y sus modificaciones, interacciones, estructura y complejos altamente ordenados que pueden llegar a conformar (Tyers y Mann 2003). Un paso fundamental para el estudio de proteínas individuales es su purificación. Hay una variedad de estrategias que han sido desarrolladas para la purificación de proteínas. En este caso, nos enfocaremos para las proteínas recombinantes. Así, estas estrategias tienen diferentes requerimientos de aplicación incluyendo cantidad y rendimiento. Hay cuatro pasos básicos requeridos: 1) lisis celular; 2) unión a una matriz; 3) lavado; y 4) elución. La lisis celular puede lograrse a través de varias formas, incluyendo métodos no enzimáticos (por ejemplo: ruptura por fricción donde los equipos a utilizar pueden ser el mortero, la licuadora, el sonicador, etc; así como el choque térmico suele facilitar este evento sonicación) o usando enzimas hidrolíticas como lisozima o detergentes para lograr la lisis celular.

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Es importante que durante los procedimientos se utilicen medios apropiados que controlen el pH, la presión osmótica y la temperatura. Estos cuidados se deben de tener ya que cualquiera de estos parámetros puede alterar la estructura de las proteínas y dependiendo del estudio a realizar, ya sea con proteínas con estructuras en estado nativo (como se encuentra en las células de origen) o en estado desnaturalizado (cuando pierden su estructura tridimensional que es funcional para la célula).

Técnicas de purificación de proteínas Un punto crítico durante la purificación involucra el conocimiento de la localización a nivel celular de la proteína, ya que dependiendo de su residencia es que se realizarán técnicas en particular para su purificación. Es necesario conocer si es una proteína membranal, si es el caso, en un sistema bacteriano esta probablemente estará ubicada en la membrana biológica de la bacteria; si es soluble probablemente este localizada en el citosol o bien, lo usual es que se localice en el interior de inclusión bacterianos, que son agregados proteicos y que la bacteria suele formar en respuesta al estrés que sufre durante la producción masiva de la proteína recombinante.  Proteínas membranales Si es el caso que se trate de una proteína membranal, lo recomendable es que se purifique la fracción membranal a través de una centrifugación diferencial, usualmente la primera velocidad de sedimentación de 5000g permite eliminar células completas y otros restos celulares de gran tamaño y el sobrenadante se somete a una segunda velocidad de sedimentación de 100 000g para recuperar la fracción membranal.  Proteínas localizadas en cuerpos de inclusión Las proteínas recombinantes expresadas en un sistema bacteriano llegan a formar parte de los cuerpos de inclusión (mismos que representan una de las principales desventajas del uso sistemas bacterianos), los cuales albergan la proteína de interés pero en un estado no nativo, es decir, no son funcionales porque su estructura nativa no está favorecida. Los cuerpos se forman porque la proteína se produce en grandes cantidades y la bacteria no puede hacer el plegamiento del péptido porque carece de los elementos necesarios, esto considerando que se trata de una proteína de origen eucarionte; y otro aspecto puede ser porque no se forman correctamente los puentes disulfuro necesarios para darle la estabilidad que requiere la proteína. Por tanto, la estrategia es separar los cuerpos por centrifugación, donde al menos se cumple con el aislamiento y purificación, pero se debe atender la calidad del péptido, en otras palabras, hay que favorecer que la proteína se estructure apropiadamente, ya que solo así podrá ser funcional (Figura 14).

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Figura 14. Mecanismo de plegamiento proteico. Se ilustra el proceso de traducción proteica y los posibles arreglos estructurales que se presentan para las proteínas recombinantes. Tomado y modificado (de Marco 2013).

Para alcanzar este punto, una estrategia puede ser que se utilicen agentes desnaturalizantes, como aquellos que modifican los puentes disulfuro, donde se puede promover su ruptura y evitar la formación de nuevos enlaces. Posteriormente se debe proveer de condiciones que favorezcan el plegamiento correcto de la proteína, como la remoción del agente desnaturalizante, y finalmente se purifica a través de diferentes técnicas que se basan en las características propias del péptido. Las técnicas de purificación de las proteínas se basan en sus características en cuanto a su superficie, forma, tamaño, carga y reactividad que presentan, acorde a esto podemos citar lo siguiente: 1) Técnicas basadas en la superficie proteica La superficie proteica está definida por las cadenas laterales de los aminoácidos externos de la estructura del péptido y dependiendo del solvente y del pH, la proteína puede exhibir una carga en su superficie, lo cual puede favorecer su purificación ya sea desde el uso de un solvente en particular, hasta utilizar otras metodologías como el inmunoensayo a través de emplear anticuerpos que reconocen específicamente elementos de esta superficie.

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Figura 15. Representación esquemática de los pasos a realizar en una Cromatografía de afinidad para la purificación de proteínas recombinantes. Se ilustra los pasos básicos para desarrollar una purificación, donde se presenta el equilibrio de la columna (1), adsorción y lavado (2) y desorción (3) (Coelho et al 2012).

2) Técnicas con base en la forma y tamaño del péptido. La cromatografía de exclusión por tamaño y la electroforesis son dos de las técnicas más ampliamente utilizadas para el aislamiento y purificación de las proteínas. Ambas metodologías pueden facilitar la recuperación de las proteínas en su estado nativo, aunque la electroforesis puede ser desnaturalizante. 3) Técnicas que consideran la carga neta de la proteína. La carga de una proteína es el resultado de su mismo contenido de aminoácidos donde aquellos aminoácidos cargados son los principales contribuyentes. Las técnicas de cromatografía de intercambio iónico y la electroforesis son las más utilizadas.

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Figura 16. Una mezcla de proteínas es cargada en una resina de intercambio catiónico en un buffer Mes. Las proteínas cargadas positivamente desplazando los cationes de sodio

se adsorben en la resina,

. Un flujo de los cationes y aniones de un

amortiguador es descargado , y dependiendo de la concentración de las sales se eluye diferencialmente la proteína a purificar (Recuperado de http://www.reachdevices.com/Protein/ProteinPurification.html)

4) Basadas en su reactividad química (afinidad). Una técnica eficaz de purificación es considerar la reactividad de la proteína, es decir, utilizar alguna de las propiedades de la proteína, ya sea un grupo funcional como un tipo de aminoácidos o bien, la función biológica de la proteína, por ejemplo, si tiene función enzimática, se puede fijar su sustrato y por afinidad se puede separar dicha enzima a través de una cromatografía de afinidad. 5) Utilizando marcaje molecular. Otro tipo de purificación de proteínas es el uso de marcajes moleculares que son moléculas unidas específicamente a las proteínas recombinantes de interés, facilitando la purificación de las proteínas por medio de las propiedades de afinidad de dicho marcaje. Los marcajes moleculares más ampliamente utilizadas son pequeños polipeptidos, pequeñas proteínas o enzimas adicionadas al amino o al carboxilo terminal de una proteína recombinante. Las características bioquímicas de los diferentes marcajes influencian la estabilidad, solubilidad y expresión de las proteínas a las cuales están unidas. Lo anterior se consigue con el uso de vectores de expresión que incluyen dichos marcajes moleculares de fusión facilitando la

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purificación de proteínas recombinantes. Algunos ejemplos son, las colas de polihistidinas y de Glutatione-S-Transferasa (GST) entre otras. Para finalizar a continuación se resume las consideraciones generales para lograr una purificación proteica adecuada: 1. Definir los objetivos de la purificación: grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos. 2. Seleccionar el material biológico de inicio: Dependerá de la localización de la proteína tanto en tejidos como en compartimentos subcelulares. 3. Desarrollar una técnica de análisis: Para la determinación de la pureza, actividad o contenido total de proteína. 4. Minimizar la manipulación de la muestra. 5. Remover desde el inicio, posibles contaminantes: por ejemplo proteasas 6. Reducir el uso de aditivos. 7. Apoyarse en el uso de técnicas diferentes en cada paso: Para ello se debe considerar las propiedades fisicoquímicas de la proteína. 8. Minimizar el número de pasos.

Ahora sí, estamos listos para generar una proteína recombinante utilizando un sistema procarionte, ya que cuentas con todos los fundamentos teóricos, moleculares y las estrategias que facilitan su obtención.

Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar. Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BGMB _U3_A1_XXYZ, donde BGMB corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

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Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BGMB _U3_ATR _XXYZ, donde BGMB corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

Cierre de Unidad Durante la presente Unidad se describieron los mecanismos de regulación genética en procariontes con objeto de identificar su potencial de aplicación en la biotecnología. Por ello, se discutió la estructura que presentan los genes en las bacterias, mismos que se encuentran agrupados en relación a su mecanismo de regulación, ejemplificando lo anterior con la revisión de los operones de lactosa y triptófano. Lo anterior permitió contar con las bases moleculares necesarias para comprender la utilidad de emplear estos operones en las estrategias de clonación para la generación de proteínas recombinantes. La segunda parte de esta revisión consistió en conocer los procedimientos generales que están involucrados para la generación de proteínas recombinantes, implícitamente este conocimiento provee la habilidad de poder visualizar las variantes que pueden subyacer en los mismos y que es la práctica o experiencia del trabajo de laboratorio lo que va a determinar el protocolo más adecuado. Felicidades, con ello haz concluido esta asignatura.

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Para saber más

Revista (2001). “Las ciencias del genoma”. ¿Cómo ves? 37 Recuperado de http://www.comoves.unam.mx/numeros/indice/37 Valdez-Cruz, N., Ramírez Reivich, O.T., Trujillo-Roldán M. A. (2013). “Proteínas recombinantes terapéuticas, una esperanza contra enfermedades crónicas”. Hypatia 32 Recuperado de: http://hypatia.morelos.gob.mx/index.php?option=com_content&task=view&id=555&Itemid= 490

Fuentes de consulta

ArgenBio. Recuperado de http://www.argenbio.org/index.php?action=novedades&note=245

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