Unidad 1. Taxonomía microbiana

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Programa de la asignatura:

Microbiología y taxonomía microbiana

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Taxonomía microbiana

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Índice Presentación de la unidad ................................................................................................. 2 Propósitos.......................................................................................................................... 2 Competencia específica..................................................................................................... 3 1.1 Definición de taxonomía............................................................................................... 3 1.1.1. Nomenclatura .......................................................................................................... 5 1.1.2. Biología sistemática ................................................................................................. 5 1.1.3. Árboles filogenéticos ................................................................................................ 7 1.2. Crecimiento individual y poblacional………………………………………………………..9 1.2.1. Tasa de crecimiento y tiempo de generación ......................................................... 14 1.2.2. Crecimiento exponencial y sincrónico.................................................................... 14 1.2.3. Determinación del crecimiento ............................................................................... 15 1.2.4. Medida de masa microbiana .................................................................................. 16 1.2.5. Medida del número de individuos........................................................................... 18 Actividades………………………………………………………………………………………...22 Autorreflexiones…………………………………………………………………………………...22 Fuentes de consulta………………………………………………………………………………23

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Presentación de la unidad La importancia de estudiar Taxonomía Microbiana radica en conocer las investigaciones y logros científicos, mediante análisis taxonómicos, donde el alumno desarrollará habilidades para identificar los sistemas de clasificación de microorganismos y como es que llevan a cabo su proliferación de tal manera que se apliquen los conocimientos adquiridos para la elaboración de un ensayo

Propósitos

El alumno analizará la forma de nombrar a los microorganismos y su importancia dentro del ámbito ambiental e industrial, donde incorporará los conceptos fundamentales de taxonomía microbiana con el fin de entender el desarrollo cuantitativo de las bacterias, lo cual posteriormente le permita desarrollar habilidades para la investigación, resolución de problemas y toma de decisiones.

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Competencia específica

Analizar la taxonomía y crecimiento bacteriano mediante la comprensión de sus fundamentos y beneficios para proponer mejoras a los distintos procesos biotecnológicos.

1.1 Definición de taxonomía La Taxonomía es un área de la ciencia biológica que comprende tres disciplinas diferentes: clasificación, nomenclatura e identificación. La taxonomía se divide en microtaxonomía (su objetivo es identificar, describir y delimitar especies) y macrotaxonomía (su finalidad es construir clasificaciones de los taxones y se auxilia de la microtaxonomía) (Solomon et al., 2008).

Para llevar a cabo la clasificación de las bacterias los taxónomos bacterianos se vieron forzados a buscar además de las características estructurales, diferentes tipos de propiedades como las bioquímicas, fisiológicas, ecológicas. Dicha clasificación se basa en atributos funcionales, la mayor parte de las bacterias sólo pueden identificarse por lo que hacen y no simplemente por su apariencia. Esto representa un problema adicional para el taxónomo bacteriano, el estudio de estas propiedades funcionales conlleva a la realización de experimentos, por lo tanto éste nunca podrá estar seguro de haber llevado a cabo los experimentos adecuados con fines taxonómicos: podría ocurrir que omitiera la realización de ciertos experimentos que indicaran la existencia de agrupamientos significativos dentro de una colección de cepas.

Sin embargo, está tomando auge una nueva alternativa biotecnológica que podría resolver pronto el problema, son las técnicas moleculares para la caracterización genotípica bacteriana, que proporcionan una posible base objetiva para la definición de especie bacteriana (Tórtora, 2008).

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En el siglo XVII Carlos Linneo desarrollo un sistema de clasificación para nombrar a los microorganismos como una forma de facilitar la comunicación eficaz entre los microbiólogos, a Linneo se le conoce como el Padre de la Taxonomía que es la ciencia encargada de la clasificación y denominación de la gran variedad de especies existentes (Solomon et al., 2008).

Figura 1. FCarl Von Linneo (1707-1778) desde la web http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Carl_von_Linn%C3% A9.jpg

La Taxonomía (del griego ταξις, taxis, "ordenamiento", y νοµος, nomos, "norma" o "regla") es la ciencia de la clasificación; está relacionada con la Sistemática que se refiere a la clasificación o agrupamiento sistemático de los organismos en grupos o categorías llamados taxa (del griego ταξις, transliterado como taxis, "ordenamiento") es un grupo de organismos emparentados, que en una clasificación dada han sido agrupados, asignándole al grupo un nombre en latín, una descripción, y un "tipo", de forma que el taxón de una especie es un espécimen o ejemplar concreto. La taxonomía se divide en tres partes:

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a) Clasificación: es el agrupamiento ordenado de unidades en grupos dentro de unidades mayores. b) Nomenclatura: es la denominación de las unidades definidas y por la clasificación. c) Identificación: hace uso del criterio establecido por la clasificación y nomenclatura mencionadas, los microorganismos se identifican comparando las características de las unidades desconocidas y las conocidas.

1.1.1. Nomenclatura Respecto a la Nomenclatura existen códigos como el zoológico, botánico y bacteriológico que se basan en determinados principios comunes mediante el sistema de clasificación de Linneo el cual se denomina “sistema binomial de nomenclatura” donde a cada especie se le asigna un nombre compuesto de dos partes: la primera designa el género, y la segunda, el epíteto especifico los cuales se escriben letra cursiva; los dos anteriores forman el nombre científico de cada especie. El epíteto específico siempre debe ir precedido del nombre del género abreviado o completo (Solomon et al., 2008).

1.1.2. Biología sistemática El sistema binomial de nomenclatura que agrupa a las especies dentro de un género común, estos a su vez se constituyen una familia, las cuales a su vez se agrupan en ordenes, los órdenes en clases, las clases en filums ó filo (phylum, plural phyla que es un tipo de organización), los filums forman reinos y los reinos dominios (Fig. 2 o Tabla 1) (Solomon et al., 2008).

La forma de nombrar a los microorganismos es mediante la clasificación en grupos de una serie grande de microorganismos; los cuales deben parecerse entre sí con un grado mayor de semejanza que los miembros de otro grupo. El objetivo del nombre científico es el de poseer un único nombre que deba ser utilizado en todo el mundo, en cualquier lengua, para referirse a un único taxón (Solomon et al., 2008).

Los nombres científicos son en latín, o latinizados; por ejemplo, nombre vulgar “perro” y su nombre científico es Canis familiaris o C. familiaris, latrans, la “bacteria que causa el cólera” Escherichia coli o E. coli, la “bacteria causante de la fermentación del yogurt” Lactobacillus bulgaricus o L. bulgaricus.

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Los nombres científicos no son muy usuales, puesto que se escriben en latín es muy difícil su pronunciación; por lo que es preferible usar el nombre vulgar o común ya que suele variar según las localidades, regiones.

Tabla 1.

Categoría o taxonómico Especie Género Familia Orden Clase Filum o Phylum Reino Dominio

nivel

Características Organismo que solo se puede reproducir con otro de su misma especie Grupo de especies relacionadas.

Grupo de géneros relacionados.

Grupo de familias relacionadas.

Grupo de órdenes relacionadas.

Grupo de clases relacionadas.

Grupo de phyla relacionados Grupo de reinos.

Figura 2. Niveles taxonómicos o categoría taxonómica.

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1.1.3. Árboles filogenéticos La clasificación moderna a menudo recibe el nombre de sistemática, porque se basa en relaciones evolutivas. Muchos taxónomos utilizan la sistemática ya que tratan de reconstruir la historia evolutiva o filogenia (producción de los filums) de los organismos.

Por lo tanto un árbol filogenético (fig. 3) muestra las relaciones evolutivas entre varias especies u otras entidades que se cree que tienen un ancestro en común; es una forma de cladograma (Solomon et al 2008).

Un cladograma es un diagrama representativo en la clasificación biológica taxonómica de los organismos, en el que se muestra la relación entre distintas especies según una característica derivada, resultado del análisis cladístico de una especie. Los cladogramas son importantes herramientas filogenéticas para el estudio de conceptos científicos.

En biología se utilizan árboles parecidos a los genealógicos para representar cómo se encuentran emparentados los organismos vivos, se les conoce como árboles filogenéticos. En los árboles genealógicos se utiliza información proporcionada por los familiares y para los árboles filogenéticos se usa información proveniente de fósiles, así como aquélla generada por la comparación estructural y molecular de los organismos (Solomon et al., 2008).

Figura 3. Árbol filogenético de la vida Editar de la web http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/55/Phylogenetic_tree-es.png

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En la figura se explica a manera de árbol filogenético el origen evolutivo de la vida en el planeta, de acuerdo a las características morfológicas de dichos organismos estos van desde las formas sencillas como las bacterias hasta las más complejas como las plantas y animales (Solomon et al., 2008).

Debido al origen evolutivo de las especies estas pueden tener diferentes formas de árboles filogenéticos y estos pueden ser: Monofiléticos: es un grupo de organismos que tiene un antepasado común con todos y cada uno de sus descendientes.

Figura 4. Árbol monofilético tomado de la web http://www.ual.es/GruposInv/myco-ual/galer13.htm

Parafilético: si faltan algunos de los descendientes, los cuales han sido incluidos en otros grupos.

Figura 5. Árbol monofilético tomado de la web http://www.ual.es/GruposInv/myco-ual/galer13.htm

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Polifilético: si contiene organismos de varios clados, es decir, que no proceden de un antepasado común cercan; simplemente, se han reunido por conveniencia de los investigadores.

Figura 7. Árbol monofilético tomado de la web http://www.ual.es/GruposInv/myco-ual/galer13.htm

1.2. Crecimiento individual y poblacional El crecimiento bacteriano implica un aumento ordenado en el número de células (población) y de los componentes celulares de un organismo del estado inmaduro al estado adulto; incluye inmersamente la división de una bacteria en dos células hijas en un proceso llamado fisión binaria, bipartición, las células hijas resultantes serán genéticamente idénticas a la célula original. De este modo tiene lugar la "duplicación local" de la población bacteriana. Las dos células hijas creadas tras la división no sobreviven necesariamente (Brooks, 2011) Sin embargo, si el número de supervivientes supera la unidad, la población bacteriana experimenta un crecimiento exponencial. La medición de una curva del crecimiento exponencial de las bacterias en un cultivo ha sido tema de estudio de los microbiólogos.

Los procesos fundamentales empleados para ello son la enumeración bacteriana (recuento celular) por métodos directos e individuales (microscopía), métodos directos y masivos (biomasa), por métodos indirectos e individuales (conteo de colonias), o por métodos indirectos y en bloque (número más probable (NMP), turbidez, absorción de nutrientes).

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El objeto de estudio del biotecnólogo es reconocer de manera teórica el crecimiento bacteriano en un cultivo que conlleva a resumirse en cuatro fases diferentes: fase Log, fase exponencial, fase estacionaria y fase de declive o muerte; y de esta manera podrá aplicar los conocimientos a nivel industrial y ambiental dichos microorganismos para un beneficio específico tomando en cuenta factores del ambiente tanto abióticos como pH, Temperatura en °C, O2, (oxigeno), presión osmótica, nutrientes (CHONSP) y bióticos como la competencia por los nutrientes, depredación y lisis viral (Tórtora, 2008).

Las células bacterianas son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño de unos pocos micrómetros (0.5 a 5 µm) y diversas formas incluyendo esferas (cocos), barras (bacilos) y hélices (espirilos) (Fig. 7). Las bacterias son procariotas (no tienen núcleo definido ni presentan orgánulos membranosos internos), poseen una pared celular compuesta de peptidoglucano estructura básica de la pared celular de las bacterias; la molécula es un copolímero formado por una secuencia alternante de N-acetilglucosamina y el Ácido N-acetilmurámico unidos mediante enlaces β-1,4. Muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de desplazamiento y son móviles. Del estudio de las bacterias se encarga la bacteriología (rama de la microbiología) (Tórtora, 2008).

Respecto al tamaño de las bacterias que son microscópicas, hablemos primero cuando medimos la longitud de un objeto, estamos viendo cuantas veces entra una unidad de medida en el largo del objeto. La unidad de medida de la longitud es el metro (m). El sistema de unidades de medida que incluye al metro junto a sus múltiplos y submúltiplos se llama Sistema Métrico Decimal (Tabla 2).

Múltiplo

Submúltiplos

Longitudes microscópicas

miriámetro 1 mam = 10,000 m kilómetro 1 km = 1,000 m hectómetro 1 hm = 100 m

Metro m

Micrómetro 1µm = 0.001 mm

Decímetro 1 dm = 0.1 m Centímetro 1 cm = 0.01 m

1 mm = 1000 µm 1 µm = 0,001 mm = 1 × mm

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Milímetro 1 mm = 0.001 m 1 µm = 0,000 001 m = 1 × 101 m = 1 000 000 µm 1 m = 10 dm = 100 cm = 1 Tabla 2. Conversiones para determinar las diferentes longitudes decámetro 1 dam = 10 m

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Figura 8. Morfología de las bacterias. Editar desde la web http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Morfolog%C3%ADa_bacteriana.jpg

Generalmente el crecimiento de las bacterias es porque se reproducen ya sea por bipartición o fisión binaria (forma asexual); tras la duplicación del ADN, que está dirigida por la ADN-polimerasa que se encuentra en los mesosomas, la pared bacteriana crece hasta formar un tabique transversal separador de las dos nuevas bacterias. También presentan reproducción sexual o parasexual (intercambian fragmentos de ADN) (Tórtora, 2008).

Es importante distinguir el crecimiento individual de células y el crecimiento de poblaciones de células: Crecimiento individual: es el incremento de una célula respecto al tamaño y peso, es usualmente un preludio a la división celular Crecimiento poblacional: es el incremento en el número de células como una consecuencia del crecimiento y división celular

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El crecimiento microbiano se divide principalmente en cuatro etapas que son (fig. 8):

Figura 9. Etapas del crecimiento bacteriano Tórtora et al, (2007). a) Fase Lag, b) fase exponencial, c) fase estacionaria y d) fase de declinación o muerte.

a) Fase Lag o de Rezago.

Este periodo consiste en la adaptación de las células microbianas a su nuevo ambiente.

En esta fase, las células microbianas no tienen muchos metabolitos y enzimas, debido a las condiciones desfavorables que representaba el cultivo previo. En este lapso de tiempo se forman las enzimas y los metabolitos intermedios hasta alcanzar las concentraciones necesarias para reiniciar el crecimiento (Tórtora, 2008).

Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tan diferentes que las células sean genéticamente incapaces de sobrevivir, por lo que sólo unas cuantas mutantes podrán subsistir, y obviamente se requerirá más tiempo para que éstas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de células (Tórtora, 2008).

b) Fase Exponencial.

En esta fase las células se encuentran en un estado de crecimiento sostenido. Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante (tasa = relación entre la cantidad y la frecuencia de un fenómeno), pero éste material es en sí catalítico y la masa aumenta de manera exponencial, es decir crece muy rápidamente en el tiempo. Matemáticamente exponencial se refiere elevar un número o -base- X a un determinado –exponente- “y” (xy); por ejemplo, si la base x es igual a 2 y el exponente y es igual a 4; la potencia será 24 lo cual equivale a 2x2x2x2 = 16. Para el caso del crecimiento microbiano por razones y resultados experimentales la base de potencia que se considera es el número –e- que es la base de los logaritmos de Neper, el cual es un número importantísimo en la Universidad Abierta y a Distancia de México 12

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naturaleza que vale e = 2.7182818284; por lo tanto sus potencias se escriben y = ex o x = ey.

El crecimiento continuará hasta que uno o más nutrimentos se agoten, o hasta que se acumule tal cantidad de metabolitos tóxicos que se inhiba el crecimiento. El nutrimento limitante para los organismos aerobios suele ser el oxígeno: cuando la concentración bacteriana es de aproximadamente 1 x 107 ml es necesario incrementar el ingreso de oxígeno mediante agitación o burbujeo; pero cuando la concentración alcanza 4 o 5 x 109 bacterias por ml, la tasa de difusión de oxígeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye progresivamente (Tórtora, 2008).

A diferencia del crecimiento exponencial, el crecimiento lineal sólo implica que se está aumentando en solo una unidad la masa con respecto al tiempo.

c) Fase Estacionaria.

Ante el agotamiento de nutrimentos en el medio o la acumulación de metabolitos tóxicos el crecimiento cesa por completo después de un periodo de decrecimiento en la tasa de crecimiento. Por lo general en esta fase se observa recambio celular, lo cual se debe a que, aunque existe una pérdida lenta de células por muerte, dicha pérdida se compensa exactamente por la formación de nuevas células a través de crecimiento y división. Así, la cifra de células viables se mantiene constante, aunque en realidad en el conteo aumente poco a poco el número de células, si se cuentan también las muertas (Tórtora, 2008).

Para comprender lo anterior debemos considerar que, para una célula microbiana, muerte significa la pérdida irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cual se comprueba cuando una célula es incapaz de producir una colonia en cualquier medio. De lo anterior se deriva que designar a una célula microbiana como muerta no implica su destrucción física. La duración de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio. d) Fase de Declinación y/o Muerte.

Esta fase representa el decremento de células debido al aumento progresivo de la tasa de mortalidad, misma que tarde o temprano alcanza un valor sostenido. Por lo general, una vez que la mayoría de las células ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por lo que un número pequeño de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o años. Dicha persistencia puede deberse a que las células consiguen crecer gracias a los nutrimentos liberados por las células que mueren y se lisan, observándose recambio celular (Tórtora, 2008).

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1.2.1. Tasa de crecimiento y tiempo de generación El crecimiento microbiano que es el cambio en el número de células por unidad de tiempo determinada. El tiempo juega un papel muy importante para que la célula se divida en dos, el cual puede ser desde minutos, horas y hasta días.

Tasa de crecimiento: es el cambio del número de células o masa por unidad de tiempo Generación: intervalo para la formación de dos células provenientes de una.

Tiempo de generación: tiempo que tarda una población en duplicarse. Se puede definir también como la cantidad de tiempo requerida para completar un ciclo de división.

Factores que influyen en el crecimiento: a.

Factores externos

Condiciones ambientales o culturales: pH, T° (en escala centígrada = grados °C), disponibilidad de H2O, O2, CO2 y tiempo.

Condiciones nutricionales: Tasa C/N 10:1, 12:1, azufre y otros microelementos. b.

centígrados

Factores internos

Capacidad metabólica

1.2.2. Crecimiento exponencial y sincrónico El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población.

Crecimiento exponencial: durante el crecimiento exponencial, la tasa de crecimiento de las células (medida en gramos de biomasa producida por hora), cuando el crecimiento no es limitado por los nutrimentos, se puede obtener multiplicando la constante de la tasa de crecimiento por la concentración de biomasa. La constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cual las células producen más células, y el valor que esta toma se interpreta como los gramos de biomasa producidos por cada gramo de biomasa preexistente creados en una hora.

El crecimiento se denomina exponencial porque la biomasa se incrementa exponencialmente con respecto al tiempo. De lo anterior se deriva que, si graficamos el logaritmo de la concentración de la biomasa (o celular) en función del tiempo, como ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos una línea recta como representación de esta fase (Tórtora, 2008).

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Crecimiento sincrónico: todas las células se encuentran simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrónicas (Tórtora, 2008).

1.2.3. Determinación del crecimiento Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. Se mide por cambios sucesivos en el número de células o por el peso de la masa de las células.

Existen varios métodos para contar las células o estimar la masa de éstas (Brooks, 2011).

Figura 10. Formas de visualizar el crecimiento bacteriano Caja petri autoría nuestra de practica en el laboratorio (crecimiento bacteriano colonias blancas) y Tubos de ensaye color amarillo indica presencia de colonia

A. Recuento de células 1) Conteo de células al microscopio: se emplea un dispositivo graduado con 25 cuadrados cuyo volumen y área es conocido: Cámara de PetroffHausser, cámara de Neubauer, hemocitómetro.

Limitaciones:  Es muy cansado, no es práctico para un gran número de muestras.  No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/ml para que sean observadas al microscopio  No distinguen células vivas de muertas.

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Figura 11. Dispositivo graduado para el conteo de células bacterianas Tomado de la web para editar 2). Conteo de células viables: una célula viable es definida como aquélla que es capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de cultivo. El conteo en placas es el método más utilizado.

Pueden ser: Diseminación en placa (siembra en placa por extensión).

Se asume que cada colonia surgió de una simple célula, contando el número de colonias uno puede calcular el número de células viables en la muestra.

Método de vaciado en placa.

Figura 12. Forma de contar células bacterianas en placas de agar.

1.2.4. Medida de masa microbiana Métodos directos: estos métodos requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.

1. Determinación del peso húmedo:  se tara (calibrar hasta que la balanza especifique el peso real) un tubo de centrífuga  se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante  se determina el peso del sedimento.

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 Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.

2. Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105oC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.  Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

3. Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.

4. Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, entre otros.

Métodos indirectos 1. Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.

2. Métodos turbidimétricos (ópticos). La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.

3. Medición de luz transmitida:

Escala de MacFarland: Se trata de una serie de patrones de turbidez (no son claros o transparentes como el agua) previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen {1% de Cl2Ba + cantidades crecientes de H2SO4 (ácido sulfúrico) al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO4Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en céls/ml) que genera una turbidez similar. Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen {1% de Cl2Ba + cantidades crecientes de SO4H2 al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO4Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en céls/ml) que genera una turbidez similar.

Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia.

D.O. = A = -logT/100 donde T= transmitancia Universidad Abierta y a Distancia de México

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C) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.

1.2.5. Medida del número de individuos Métodos directos 1. Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:  excavación con 0.02 mm de profundidad  área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes  cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños.  sea, la muestra se distribuye en 16X25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).  La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas  en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:  n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Ventajas: es un método muy rápido Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 céls./ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.

2. Recuento en preparaciones teñidas: Se dispone de un porta con una excavación circular (de área At) con un volumen conocido (v). Sobre esta excavación se extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija y tiñe por algún colorante. Se observa con un microscopio dotado de un juego de ocular y objetivo que delimitan un área de campo (Ac). Si en dicho campo se cuentan n bacterias, la concentración de bacterias por mililitro será: n·At/Ac· 1/v

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3. Recuento proporcional de Wright: Se mezcla la suspensión bacteriana problema con una cantidad conocida de bolitas de látex o de hematíes (células sanguíneas = sangre). La concentración bacteriana se deduce de la proporción de bacterias y partículas observadas en el mismo campo microscópico. Este método se emplea más frecuentemente en Virología.

4. Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión bacteriana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula). Recientemente se ha introducido la citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Es una sofisticada modificación en la que las partículas a contar se marcan previamente con un anticuerpo monoclonal anticuerpo homogéneo producido por una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoralu otro ligando específico hacia alguna molécula de superficie, unidos a su vez a un fluorocromo, una molécula que emite fluorescencia al incidir sobre ella un haz de luz láser.

Métodos indirectos: Son métodos que miden el número de bacterias viables (que no equivale al de totales).

1.

Método del número más probable: Su fundamento estriba en la distribución de Poisson: una distribución aleatoria de partículas en una serie de muestras iguales, en función del número medio de partículas presentes en una suspensión (presencia y ausencia de microorganismos).

La técnica consiste en sembrar alícuotas de la suspensión original problema sobre un medio líquido o sólido adecuado; tras el tiempo de incubación adecuado se anota la proporción obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P0 (x = 0). Entonces, según la distribución de Poisson: P0= e—m y por lo tanto es fácil calcular el valor de m: m = -lnP0

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Figura 13. Conteo de número más probable (NMP) para bacterias Editar de la web http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p4- nmpenumeracion.pdf

2. Recuento de viables en placa: Como esta técnica será explicada al alumno en clase, y además la realizará en las prácticas, remitimos a las pertinentes explicaciones "en vivo". Es una de las técnicas de recuento más usadas en la rutina del laboratorio de Microbiología.  Precauciones:  para minimizar los errores estadísticos de muestreo (para que los resultados san concretos y creibles), se recomienda sembrar  5 placas de cada dilución, porque llega haber ocasiones en donde no crece nada.  hay que usar pipetas nuevas en cada dilución  contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias 3. Determinación de la proporción células viables/células totales: Si se está interesado en conocer esa proporción se recurre a una técnica de microcultivos en cubreobjetos: hay que seguir periódicamente la evolución del crecimiento de células individuales y determinar la proporción de aquellas células no viables (visibles al microscopio, pero incapaces de crecer).

4.

Recuento sobre filtros de nitrocelulosa: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa estéril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro y se cuentan, deduciéndose la concentración original en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

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Actividades

La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar.

Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BMTM_U1_A1_XXYZ, donde BMTM corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones

Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación.

Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BMTM_U1_ATR _XXYZ, donde BMTM corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

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Fuentes de consulta

 

González, G. M. (2007) Microbiología ambiental. Corpus. Pidello, A. (2011) Ecología microbiana. Corpus Willey, J. (2009) Microbiología Mc. Graw Hill / Interamericana

Bibliografía complementaria  

Tortora, G., et al 2007 Introducción a la microbiología. Pearson Education Murray, P.2009 Microbiología médica. Séptima Edición Elsevier Spicer, W. 2009 Microbiología Clínica Y Enfermedades Infecciosas. Segunda Edición. Elsevier

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