Unidad 3. Caracterización microbiana by Jazina Ruiz Hernández

Microbiología y taxonomía microbiana Caracterización microbiana

Programa de la asignatura:

Microbiología y taxonomía microbiana

Caracterización microbiana

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Índice Presentación de la Unidad………………………………………………………..….…….……..2 Propósitos…………………………………………………………………………...………………2 Competencia específica………………………………………………………………...…………3 3.1. Caracterización microbiana ……………………………………………………..…………..3 3.1.1. Caracteres morfológicos ………………………………………………………………..…4 3.1.2. Caracteres fisiológicos …………………………………………………………..…….…12 3.2. Caracteres quimiotáxicos…………………………………………………..……………….16 3.2.1. Fundamentos de la caracterización quimiotaxicos…………………………………….17 3.2.2. Principales técnicas……………………………………………………………….………20 3.2.3. Desventajas ………………………………..……………………………………………...23 3.3. Pruebas bioquímicas ……………………………………….…………………...………….23 3.3.1. Fundamentos de la caracterización por pruebas bioquímicas……………………….24 3.3.2. Principales técnicas ……………………………………………………...……………….25 3.4. Caracteres genéticos………………………………………………………………..……...35 3.4.1. Fundamentos de la caracterización genética……………….………………………....35 3.4.2. Principales técnicas ………………………………………………………...…………….38 3.4.3. Desventajas…………………………………………………………………….………….43 Actividades…………………………………………………………………………………...……43 Autorreflexiones……………………………………………………………………………..........44 Cierre de la Unidad………………………………………………………………………….……44 Para saber más……………………………………………………………………………………45 Fuentes de consulta………………………………………………………………………………45

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Presentación de la Unidad Nos resulta muy sorprendente que, con muchos avances en conocimientos científicos y tecnológicos de los que se disponen en la actualidad, aún miles de personas se vean afectadas por el ataque de una gama de bacterias. Hasta nuestros días el mundo oculto de los microorganismos no había sido descubierto, puesto que su diminuto e inapreciable tamaño los hace pasar por invisibles, salvo por las grandes consecuencias que estos ocasionan. El llevar a cabo la caracterización microbiana es de vital importancia y tiene el fin fundamental de poder conocer sus características morfológicas y fisiológicas y de esta manera diferenciar las principales técnicas que existen para estudiar en particular a las diferentes especies, pudiendo estas participar dentro de los ciclos biogeoquímicos del agua, oxígeno, carbono, nitrógeno, azufre. Reaccionan muy diferentes ante agentes químicos, positivamente con los nutrientes para el crecimiento bacteriano o de manera negativa como con los fármacos que atacan a las bacterias.

Propósitos

En esta Unidad comprenderás de qué forma influyen en la vida cotidiana las características morfológicas de las bacterias, a que se debe su importancia tanto a nivel industrial como ambiental, donde incorporará los conceptos fundamentales de la microbiología, medios de cultivo, pruebas y técnicas bioquímicas, así como caracteres genéticos y fisiológicos, para llevar a cabo la caracterización quimiotaxica o bioquímica comparar cualitativamente a las bacterias.

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Competencia específica

Analizar la caracterización microbiana mediante el estudio de técnicas para determinar las características apropiadas, según los propósitos del investigador.

3.1. Caracterización microbiana Para poder realizar una identificación microbiana es necesario identificar sus caracteres morfológicos, fisiológicos, serológicos y químicos, que son los que nos van a dar pauta para poder diferenciar entre una especie y otra, o bien identificarlos. El estudio de tales propiedades conlleva a la realización de experimentos, pruebas y técnicas para identificar a las bacterias. En la actualidad las técnicas bioquímicas están tomando auge como una nueva alternativa para resolver problemas que anteriormente se tenían en la identificación de las especies bacterianas, estas técnicas permiten la caracterización genotípica bacteriana y proporcionan una posible base objetiva para la identificación de las especies bacterianas. Una herramienta específica muy útil, es el microscopio para poder observar más a detalle sus estructuras, ya que como sabemos son microorganismos tan diminutos que no pueden ser observados a simple vista (Prescott, et al. 2000 y Madigan, et al. 2009). Por ejemplo cuando alguien se enferma y presenta variada sintomatología (tos, dolor de cabeza, fiebre, estornudo, cuerpo cortado) se puede asociar a diferentes patologías como un catarro, gripe, resfriado, y en casos más extremos a una neumonía, bronquitis y la muy conocida influenza. En dichos casos se acude por consiguiente al médico para que recete

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un medicamente que solucione el problema, pero antes que nada él realiza una serie de cuestionamientos para poder llegar a un diagnóstico y poder suministrar algún antibiótico, ya que existen variadas especies de bacterias que causan los mismos síntomas y se tiene que hacer una serie de pruebas de identificación para proporcionar un diagnóstico de la enfermedad que se tiene.

3.1.1. Caracteres morfológicos Vamos a comenzar aclarando algunos conceptos biológicos importantes: 



Morfología. Hace referencia a la forma de los microorganismos y con ayuda del microscopio electrónico se han podido estudiar y revelar detalles estructurales de las bacterias. Bacterias. Son consideradas organismos procariotas, las encontramos en forma de colonias o filamentos que contienen células especializadas, tienen dos formas comunes, ya sea la esférica (cocos) o cilíndrica (bacilos, espiroquetas) y dentro de cada una hay subvariedades de formas.

Una de las características principales de las bacterias es que no presentan un núcleo verdadero como los eucariotas, ya que almacenan su ADN (material genético o información genética) en una estructura denominada nucleoide, el cual sólo es perceptible por microscopio eléctrico y el material debe teñirse con ayuda de un colorante conocido como Feulgen, que va a indica la presencia de ADN (Brooks, et al. 2011).

Figura 1. Nucleoides de Bacillus cereus teñidas con Feulgen. Tomado de http://www.human-healths.com/bacillus-cereus-2/bacillus-cereus.php

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Para poder observar la presencia de la membrana nucleoidal es necesario hacerlo a través de una micrografía electrónica, a excepción de los plantomicetos, que son un grupo de bacterias acuáticas donde su nucleoide está rodeado por una cubierta nucleoidal formada por dos membranas compuestas de lípidos. Primero debes de saber que para poder diferenciar una célula procariota de una eucariota es que la primera no cuenta con un aparato similar al huso mitótico, la región nucleoidal está llena con fibrillas de ADN. El nucleoide de la mayor parte de las células bacterianas consiste en una molécula circular única y continua, que varía en tamaño de 0.58 a casi 10 millones de pares de bases, aunque como en todo hay sus excepciones ya que algunas bacterias poseen dos, tres o incluso cuatro cromosomas diferentes. Ahora bien el material genético que es de forma circular (plásmidos que son pequeñas moléculas circulares de ADN capaces de existir de forma independiente respecto a los cromosomas del huésped o sea que son insertados por los virus) hay dos excepciones que han mostrado poseer cromosomas lineales (Brooks, et al. 2011).

Figura 2. Corte delgado de célula de E. coli fijada con tetróxido de osmio y fijado más tarde con acetato de uranilo acuoso, que muestra dos regiones nucleares ocupadas con fibrillas de ADN. Tomado de Brooks, et al. (2011)

Para las bacterias el número de nucleoides y también el número de cromosomas, depende de las condiciones de proliferación. Con esto podemos ver que las bacterias con rápido crecimiento tienen nucleoides más grandes por célula que los que tienen crecimiento lento, aunque cuando se presentan varias copias, todas son similares (haploides) (Brooks, et al. 2011). Otra característica morfológica importante de las bacterias es la membrana plasmática que es la que rodea al citoplasma, esta membrana es el punto de contacto de la célula con el ambiente por ello es la responsable de la relación de la célula con el exterior. La membrana bacteriana difiere de otra debido a que esta carece de esteroles como el

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colesterol, aunque contienen moléculas pentacíclicas, similares al esterol, denominadas hopanoides, que los podemos encontrar en nuestro ecosistema. Estos hopanoides se sintetizan (derivan) a partir de los mismos precursores de los esteroides y estos hopanoides son los posibles encargados de la estabilización de la membrana (Prescott, et al. 2000).

Figura 3. Componentes químicos de la membrana plasmática. Tomado de Prescott, et al. (2000)

El modelo de mosaico fluido (S. Jonathan Singer y Garth Nicholson) es la estructura de membrana más aceptada donde diferencian dos tipos de proteínas de membrana (Prescott, et al. 2000): a) Proteínas periféricas: están débilmente conectadas a la membrana y pueden eliminarse fácilmente, son solubles en soluciones acuosas y constituyen aproximadamente del 20 al 30% del total de las proteínas de membrana. b) Proteínas integrales: están no se extraen fácilmente y son insolubles en soluciones acuosas cuando se eliminan los lípidos. El modelo de mosaico fluido de la estructura de la membrana bacteriana mostrado en la figura siguiente muestra a las proteínas integrales (azules) flotando en una bicapa lipídica. Las proteínas periféricas (morado) están asociadas de forma poco firme con la superficie de la membrana interna. Las esferas pequeñas representan los extremos hidrófilos de los

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fosfolípidos de membrana, y las colas onduladas son las cadenas de ácidos grasos hidrófobos. Puede haber también otros lípidos de membrana, como opanoides (amarillo). Para que quede más claro, los fosfolípidos se muestran con un tamaño proporcionalmente superior al que poseen en las membranas verdaderas.

Figura 4. Estructura de la membrana plasmática. Tomado de Prescott, et al. (2000)

La membrana plasmática retiene al citoplasma y lo separa del medio exterior, actuando como barrera selectivamente permeable que va a permitir el paso de iones y moléculas particulares, tanto hacia dentro como fuera de la célula, mientras que evita el desplazamiento de otras, por ello no hay pérdida de componentes esenciales por exudación (evaporación), mientras se facilita el movimiento de otras moléculas (Brooks, et al. 2011). Podemos encontrar dentro de la célula algunas sustancias que no puedan atravesar la membrana plasmática por lo que requieren emplear sistemas de transporte para dicha actividad, dentro de estos sistemas tenemos la absorción de nutrientes, la excreción de residuos y la secreción de proteínas. La membrana plasmática es una estructura importante ya que en ella se desarrollan numerosos procesos metabólicos como la respiración, fotosíntesis y síntesis de lípidos y de constituyentes de la pared celular. A su vez esta membrana ayuda a las bacterias a detectar y responder a sustancias químicas del medio exterior (quimiotaxia), por lo que sin esta membrana no sobrevivirían los microorganismos (Solomon, et al. 2008).

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Dentro de la membrana plasmática encontramos estructuras comunes una de ellas es el “mesosoma” que son invaginaciones de la membrana plasmática, para formar vesículas, túbulos o lamelas y los podemos observar tanto en bacterias grampositivas (más prominentes) como gramnegativas, aunque su función exacta se desconoce (Prescott, et al. 2000). La mayoría de las estructuras de una bacteria grampositiva se muestran en la siguiente figura, solamente una pequeña parte de las proteínas de superficie se han incluido para simplificar el dibujo, cuando existen, estas proteínas cubren la superficie. Las bacterias gramnegativas tienen una morfología similar.

Figura 5. Morfología de una bacteria grampositiva. Tomado de Prescott, et al. (2000).

Estos mesosomas suelen situarse a continuación de los septos o tabiques que dividen las bacterias y algunas veces parecieran estar unidas al cromosoma bacteriano, por lo que se cree que están involucrados en la formación de la pared celular durante su división o desempeñar un papel en la replicación del cromosoma y su distribución a las células hijas, o bien pueden participar también en procesos secretorios (Prescott, et al. 2000). Como en todo, dentro de las bacterias también encontramos sistemas internos diferentes a los mesosomas, ya que los plegamientos de la membrana plasmática pueden ser extensos y complejos en bacterias fotosintéticas, como las cianobacterias y las bacterias púrpura, o en bacterias con una intensa actividad oxidativa, como las nitrificantes (utilizan

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nitrógeno para su metabolismo y lo descomponen), ya que pueden construir agregados de vesículas esféricas, vesículas aplanadas, o membranas tubulares (Prescott, et al. 2000).

Figura 6. Membranas internas bacterianas. Tomado de Prescott, et al. (2000).

Se observa en la figura de arriba las membranas de bacterias nitrificantes y fotosintéticas, en a) Nitrocystis oceanus con membranas paralelas atravesando toda la célula obsérvese el nucleoplasma (n) con estructura fibrilar y b) Ectothiorhodospira mobilis con un sistema extenso de membranas intracitoplasmáticas resolución x60000. La pared celular bacteriana debe su resistencia a una capa compuesta de diversas sustancias conocidas como mureína, mucopéptidos o peptidoglucano (todos son sinónimos). La mayor parte de las bacterias se clasifican como grampositivas o gramnegativas con base en su respuesta al procedimiento de tinción de Gram (Brooks, et al. 2011).

Figura 7. Pared celular de bacterias grampositivas y gramnegativas. Tomado de Madigan, et al. (2009)

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Las paredes celulares de bacterias presentan una capa rígida que es la responsable de la resistencia de la pared celular. En especies gramnegativas existen capas adicionales que se sitúan en el exterior de ésta, dentro de estas especies de bacterias presentan puentes que se establecen por lo general mediante enlaces peptídicos directo entre el grupo amino del diaminopimélico de una cadena y el grupo carboxilo de la D-alanina terminal de otra cadena adyacente. En las bacterias grampositivas el entrecruzamiento se establece mediante un puente interpeptídico cuya composición varía en cuanto a tipo y número de aminoácidos de un organismo a otro. Por ejemplo, en una de las bacterias grampositivas (S. aureus), el puente interpeptídico está formado por cinco glicinas. La lisozima es una enzima que destruye al peptidoglucano originando la lisis celular (Madigan, et al. 2009).

Figura 8. Peptidoglucano. Tomado de Madigan, et al. (2009)

La estructura del peptidoglucano como en a) E. coli y otras bacterias gramnegativas no se forma puente intermedio y b) el puente intermedio de pentaglicina en S. aureus bacteria grampositiva. Las bacterias gramnegativas, además de peptidoglucano, tienen una membrana externa compuesta por lipopolisacáridos, proteínas (porinas facilitan la permeabilidad a través de la membrana externa) y lipoproteínas. El espacio entre la membrana citoplasmática y la membrana externa se le denomina periplasma y contiene importantes proteínas para las

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funciones celulares este espacio entre estas dos capas es de aproximadamente 15 nm de anchura y tiene un contenido gelatinoso (Madigan, et al. 2009). Otra característica morfológica y de las más importantes su movilidad mediante la natación que es debida a una estructura llamada “flagelo” que funciona por rotación (como si fuera la hélice de un helicóptero), impulsando a las células a través de un medio líquido (Madigan, et al. 2009). Los flagelos bacterianos son apéndices largos y finos que se encuentran libres por un extremo y unidos a la célula por el otro. Como son tan finos (15-20 nm de grosor dependiendo de la especie), un flagelo individual solo es visible por microscopía óptica después de una tinción especial (ayuda a aumentar su diámetro). De acuerdo a la posición del o los flagelos que presente la célula, estos pueden ser: sin flagelo (atrico), un solo flagelo (monotrico), un flagelo en cada extremo (anfitrico), grupos de flagelos en uno o en los dos extremos (lofotrico) y flagelos distribuidos sobre toda la superficie de la célula (peritricos) como se esquematizan en las figuras siguientes (Madigan, et al. 2009).

Figura 9. Formas de flagelos de una bacteria. Tomado de Madigan, et al. (2009)

Como pudimos observar en la figura anterior los flagelos tienen forma helicoidal y muestran una distancia constante entre cada dos vueltas o curvaturas adyacentes que se denomina longitud de onda y es constante para cada organismo. El filamento de los flagelos bacterianos se compone de subunidades de una proteína llamada “flagelina”. Un flagelo está constituido por varios componentes. En la base del filamento se halla una región más ancha llamada gancho que es la que une el filamento a la parte motora, este motor se ancla a la membrana citoplasmática y en la pared celular está constituido por un eje central que atraviesa una serie de anillos.

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Figura 10. Anclaje de los flagelos a las bacterias a) gramnegativa y b) grampositiva. Tomado de Prescott, et al. (2000).

3.1.2. Caracteres fisiológicos La versatilidad metabólica de las bacterias les confiere el gran éxito evolutivo, ya que todos los mecanismos posibles de obtención de materia y energía se encuentran en las bacterias, es como si fuese un coche, es decir cómo se lleva a cabo su funcionamiento, es a lo que se llama fisiología. La función de la membrana citoplasmática según Prescott et al; (2000) y Madigan et al; (2009) es: a. Da permeabilidad selectiva y transporte de solutos: la membrana citoplasmática forma una barrera hidrófoba impermeable a la mayor parte de las moléculas hidrofílicas, aunque existen varios sistemas de transporte de nutrientes que trabajan contra un gradiente de concentración hacia el interior de la misma y productos de desecho hacia el exterior. Este gradiente de concentración va a permitir el incremento de la concentración de nutrientes en el interior de la célula. Existen 3 mecanismos de transporte a través de la membrana y uno especial: 

Transporte pasivo no utiliza energía y funciona solo cuando el soluto se encuentra en concentraciones más elevadas fuera de la célula, sus variantes son la osmosis que es el paso del agua a través de membrana semipermeable desde una región de mayor concentración a otra de menor concentración y la otra es difusión es el movimiento

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neto de partículas como átomos, moléculas e iones desde una región de mayor concentración hacia otra de menor concentración. 

Transporte activo es el transporte de una sustancia a través de una membrana que no depende de la energía potencial de un gradiente de concentración, requiere ATP como fuente de energía. Muchos nutrientes se concentran más de 1000 veces como consecuencia del transporte activo, lo que depende de la fuente de energía utilizada: transporte acoplado con iones y transporte con casete unido a ATP.

Figura 11. Transporte pasivo y activo Tomado de http://recursos.cnice.mec.es/biologia/bachillerato/segundo/biologia/ud03/02_03_04_02_031.ht ml



Translocación de grupo: dicho proceso permite que las bacterias utilicen sus fuentes energéticas de manera eficiente al acoplar el transporte con el metabolismo. En este proceso, una proteína transportadora de membrana sufre fosforilación (ruta metabólica) en el citoplasma a expensas del fosfoenolpiruvato, la proteína transportadora fosforilada se une al azúcar libre en la cara exterior de la membrana, es transportada hacia el citoplasma y liberada en forma de carbohidrato unida a un fosfato. Imagina que tu estas en una fiesta y quieres salir pero no sabes cómo así que ves a una chica (o) solo cerca de la salida y le haces la plática y poco a poco la empiezas a rodear hasta que tu estas ya en la puerta y entonces ahí te encuentras a un amigo que va a entrar y corres a saludarlo y te sales junto él.

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b. Transporte de electrones y fosforilación oxidativa que es un proceso de la ruta metabólica en el cual se utiliza energía liberada por la oxidación de nutrientes y fin es la producción de ATP. Los citocromos y otras enzimas y componentes de la cadena respiratoria incluyen ciertas deshidrogenasas que se ubican en la membrana citoplasmática. La membrana citoplasmática bacteriano es un análogo funcional a la membrana mitocondrial de las células eucariotas. c. Excreción de exoenzimas hidrolíticas y patogenia de las proteínas. Todos los organismos que dependen de polímeros orgánicos macromoleculares como fuente energética excretan enzimas hidrolíticas que desdoblan los polímeros hasta subunidades lo suficientemente pequeñas para penetrar la membrana citoplasmática. Las bacterias secretan las enzimas directamente al medio externo o en el espacio periplasmático entre la capa de peptidoglucano y la membrana externa de la pared celular en el caso de las bacterias gramnegativas. d. Transporte de enzimas y moléculas que participan en la biosíntesis de ADN, polímeros de la pared celular y lípidos de la membrana, portar receptores y otras proteínas quimiotacticas y otros sistemas sensoriales de transducción. e. Funciones de biosíntesis: la membrana citoplasmática es el sitio de los lípidos transportadores sobre los cuales se ensamblan las subunidades de la pared celular así como de la biosíntesis de las enzimas de la pared celular. f.

Sistemas quimiotácticos: las sustancias con capacidad de atracción y repulsión se unen a receptores específicos en la membrana bacteriana. Hay al menos 20 quimiorreceptores diferentes en la membrana de E. coli, algunos de los cuales también actúan como el primer paso en el proceso de transporte (Brooks, et al. 2011).

La pared celular brinda protección osmótica y desempeña una función esencial en la división celular, también sirve como preparador para su propia biosíntesis. Varias capas de la pared son sitios de determinantes antigénicos mayores de la superficie celular y uno de sus componentes lipopolisacáridos (LPS) de las paredes celulares de bacterias gram negativas) son causantes de la actividad endotóxica inespecífica de las bacterias gram negativas. La pared celular no muestra permeabilidad selectiva, sin embargo, una capa de la pared gram negativa que es la membrana externa evita el paso de moléculas relativamente grandes (Brooks, et al. 2011).

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Aunque la principal función de la membrana externa es estructural, una importante propiedad biológica es que resulta tóxica para los animales. Estas propiedades tóxicas se asocian con la capa de lipopolisacáridos y en particular con el lípido A. Como ya se mencionó anteriormente las bacterias cuentan con un flagelo ahora vamos a ver cómo funciona este en una bacteria gram negativa: el anillo L se inserta en la capa de LPS y el anillo P en el peptidoglucano. El anillo MS se ancla en la membrana citoplasmática y el anillo C en el citoplasma. En el filamento existe un estrecho canal a través del cual la flagelina alcanza su destino durante la síntesis del flagelo. Las proteínas Mot funcionan como motor flagelar y las proteínas Fli constituyen el conmutador del motor. El motor flagelar determina el giro del filamento para propulsar a la célula a través del medio. Para explicar la rotación del flagelo se ha propuesto un modelo de “turbina de protones”. El flujo de protones a través de la proteína Mot puede ejercer fuerza sobre las cargas presentes en los anillos C y MS, haciendo girar el rotor (Madigan, et al. 2009). Ahora de manera general el movimiento flagelar se da de la siguiente manera: los motores rotatorios tienen típicamente dos componentes principales el rotor y el estator. El motor flagelar, el rotor está compuesto por el eje central y los anillos L, P, C y MS. En conjunto, estos elementos componen el cuero basal. El estator está representado por las proteínas Mot que rodean al cuerpo basal y que funcionan generando un par de torsión. El movimiento rotatorio del flagelo lo proporciona el cuerpo basal. La energía requerida para la rotación procede de la fuerza motriz de protones. El flujo de protones a través de la membrana citoplasmática se realiza por el complejo Mot que impulsa la rotación del flagelo se translocan aproximadamente 1000 protones. Se desconoce en realidad como ocurre esto por ello se propuso el modelo de “turbina de protones” en donde los protones que fluyen por canales a través del estator ejercen fuerzas electrostáticas sobre cargas de las proteínas del rotor que están dispuestas helicoidalmente. Las atracciones entre las cargas positivas y negativas originan que el cuerpo basal rote a medida que los protones pasan por el estator (Madigan, et al. 2009). Otro tipo de movimiento es por deslizamiento en superficies sólidas y se da en procariotas móviles carentes de flagelos. Este movimiento se da en bacterias como alguna gramnegativa (Myxococcus spp) y otras mixobacterias. Se cree que esto lo hace por medio de la excreción de un polisacárido que se va adhiriendo a la superficie y la célula se desplaza por tracción.

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3.2. Caracteres quimiotáxicos El hablar de quimiotaxis que es un fenómeno que experimentan los microorganismos, en especial las bacterias, van a dar una respuesta dirigiendo sus movimientos de acuerdo a la concentración de agentes químicos y nutritivos que hay en el ambiente donde se encuentran. Para entender mejor la quimiotaxia recordemos cuando de niño se asistía a la primaria, al escuchar los diferentes timbres reaccionábamos dependiendo de cual fuese la situación, así los timbrados más importantes eran la hora de entrada, la hora del recreo y la hora de salida, y por consiguiente se experimentaba una respuesta para cada uno. Si era la hora de entrada se apuraba uno para no llegar tarde y que le pusiesen retardo, si era la hora del recreo se sabía que era momento de jugar, comer golosinas y por último el timbre que anunciaba la salida indicando el término de jornada escolar.

Figura 12. Por fin la hora del recreo es una analogía a la quimiotaxia Tomado de http://www.pintodibujos.com/2010/11/recreo-paracolorear.html 17 Nov 11 8am

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3.2.1. Fundamentos de la caracterización quimiotaxicos Las bacterias como sabes las podemos encontrar en casi todas partes desde lugares donde se presentan gradientes de agentes físicos y químicos lo cual los ha hecho evolucionar para responder de modo positivo o negativo a estas variables, lo cual hará que la molécula realice movimientos dirigidos denominados “tactismos”. Dentro de estos tactismos tenemos a uno que es la quimiotaxis que es la respuesta a agentes químicos y otra no menos importante la fototaxis que es la respuesta a la luz. La quimiotaxis se ha estudiado con detalle en bacterias flageladas y se conoce bastante a nivel genético acerca de cómo se transmite el estado del medio ambiental externo al conjunto flagelar. Por lo que respecta a este tema nos enfocaremos en la quimiotaxia en bacterias flageladas, aunque también se presentan en bacterias deslizantes.

Figura 13. Bacteria E. coli Tomada de http://www.sciencephoto.com/media/395331/view y http://www.sciencephoto.com/media/297239/view 17 de Nov 11 8:10 am

La quimiotaxia ha sido estudiada en gran parte en E. coli que tiene flagelación peritrica (flagelos distribuidos por varios lugares de la pared celular). Para poder comprender como afecta la quimiotaxis a E. coli debemos centrarnos en el comportamiento de una célula enfrentada a un gradiente químico de una sustancia. En ausencia de un gradiente, las células de E. coli se mueven al azar y realizan carreras mediante las cuales se desplazan hacia delante de una forma suave, y también tumbos, mediante los cuales la célula se para y cambia de dirección girando al azar. Durante el movimiento hacia delante en una carrera, el motor flagelar rota en el sentido contrario a las agujas del reloj, el movimiento hacia delante cesa y tiene lugar un tumbo (Madigan, et al. 2009).

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Figura 14. Quimiotaxis en una bacteria con flagelación peritrica como E. coli. Tomado de Madigan, et al. (2009)

a) En ausencia de una sustancia atrayente, la célula se desplaza al azar mediante carreras y cambia de dirección mediante tumbos. b) En presencia de un atrayente, las carreras se favorecen y la célula se mueve en la dirección del gradiente positivo de la sustancia atrayente Tras un tumbo, la dirección de la siguiente carrera ocurre al azar. De este modo, mediante sucesivas carreras y tumbos, la célula se desplaza aleatoriamente por su entorno sin ir a una parte concreta. Sin embargo, la presencia de un gradiente de una sustancia atrayente cambia este comportamiento de movimiento sin sentido. A medida que el organismo capta concentraciones más altas de la sustancia quimiotactica, las carreras son más frecuentes y los tumbos más escasos. El resultado neto de este comportamiento es que el organismo se desplaza por el gradiente hacia concentraciones más elevadas de la sustancia atrayente. Si lo que el organismo detecta es una sustancia repelente opera el mismo mecanismo, pero en este caso es la disminución de la concentración del repelente lo que estimula la frecuencia de las carreras y favorece su alejamiento (Madigan, et al. 2009).

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Figura 15. Movimiento flagelar en procariotas con flagelación peritrica. Tomado de Madigan, et al. (2009)

En la figura anterior se muestra el movimiento hacia delante se debe a la rotación de los flagelos en sentido contrario a las agujas del reloj. La rotación inversa, en sentido de las agujas del reloj, origina una voltereta, y luego, cuando vuelve a producirse una nueva rotación contraria a las agujas del reloj, la célula se desplaza en una nueva dirección. Por lo mismo que las células procariotas son muy pequeñas ellas se guían solamente por una comparación del estado físico o químico de su entorno que ocuparon segundos atrás utilizando una serie de proteínas denominadas quimioreceptores las cuales se ubican en la membrana. Por lo que dice que las bacterias son capaces de responder a gradientes temporales más que a espaciales, por lo que podría considerarse como un sistema de respuesta sensorial análogo al de las respuestas del sistema nervioso de los animales (Madigan, et al. 2009). En bacterias con flagelación polar (los flagelos se localizan en uno o ambos extremos de la célula) pueden invertir la dirección de rotación de sus flagelos e invertir así el sentido de movimiento, aunque algunas giran solamente en el sentido de las del reloj. Aunque este último tiene la facilidad de reorientarse por medio de un flagelo que es de tipo inserción subpolar detiene periódicamente su rotación y durante ese breve momento reorienta al azar por movimiento browniano (movimiento aleatorio sin razón aparente).

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Figura 16. Movimiento flagelar procariota con flagelación polar Tomado de Madigan, et al. (2009)

Las células cambian de sentido invirtiendo la rotación flagelar o bien, en el caso de los flagelos unidireccionales, mediante paradas periódicas que permiten la reorientación. La flecha amarilla indica la dirección del desplazamiento de la célula.

3.2.2. Principales técnicas La demostración de la quimiotaxis bacteriana puede llevarse a cabo sumergiendo un pequeño capilar de vidrio, que contenga una sustancia quimiotactica, en una suspensión de bacterias móviles que no contengan dicha sustancia. A partir de la punta del capilar se establece un gradiente en el medio, de tal modo que la concentración disminuye gradualmente a medida que se aumenta la distancia a la punta del capilar. Cuando el capilar contiene una sustancia atrayente, las bacterias se moverán hacia el capilar formando un enjambre alrededor del extremo abierto y, posteriormente, muchas de las bacterias móviles se introducirán en el capilar incluso si contuviera una solución de la misma composición que el medio, debido a movimientos es al azar (Madigan, et al. 2009).

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Figura 17. Medida de la quimiotaxis mediante ensayo en tubo capilar Tomado de Madigan, et al. (2009)

a) Inserción de un capilar en la suspensión bacteriana. Cuando se inserta el capilar comienza la formación del gradiente. b) Capilar control que contiene una solución salina que ni atrae ni repele c) Acumulación de bacterias en el capilar que contiene una sustancia atrayente. d) Repulsión de bacterias por una sustancia repelente. Sin embargo, si se trata de un compuesto atrayente, la concentración de bacterias dentro del capilar será varias veces mayor que la de fuera. Cuando se extrae el capilar después de un cierto período de tiempo, se cuentan las células y se compara el resultado con el de un control, se pueden identificar fácilmente sustancias atrayentes y repelentes.

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Figura 18. Cinética de la acumulación de bacterias en capilares con varias sustancias Tomado de Madigan, et al. (2009)

Si el capilar que se inserta contiene una sustancia repelente, la concentración de bacterias en el capilar será considerablemente menor que la del control. En este caso, las células perciben un aumento en la concentración del repelente y los quimioreceptores correspondientes influyen sobre el motor flagelar para que la rotación permita el alejamiento del repelente. Utilizando el método del capilar, es posible analizar si las sustancias son atractivas o repelentes para una bacteria determinada es (Madigan, et al. 2009). La quimiotaxis también puede estudiarse microscópicamente. Utilizando una cámara de video que capte la posición de las bacterias a distintos tiempos y marque la trayectoria de cada célula, es posible visualizar este fenómeno. Este método ha sido adaptado a estudios de bacterias quimiotácticas en medios naturales. Se piensa que en la naturaleza los principales agentes quimiotacticos para las bacterias son los nutrientes secretados por células microbianas de mayor tamaño o por otros microorganismos vivos o muertos es (Madigan, et al. 2009). La siguiente figura muestra huellas de bacterias móviles en agua marina al desplazarse por las proximidades de una célula de un alga (mancha blanca en el centro) que fueron detectadas mediante un sistema de videocámara acoplado a un microscopio. Adviértase que las células responden positivamente al oxígeno (aerotaxis) que el alga produce por fotosíntesis. La velocidad media de las células fue de 25 µm/segundo. El alga tiene unos 60 µm de diámetro es (Prescott, et al. 2000 y Madigan, et al. 2009).

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Figura 19. Huellas de bacterias móviles en agua marina Tomado de Madigan, et al. (2009)

Otros tipos de técnicas utilizadas es por medio de preparación de medios de cultivo con diferentes gradientes de concentración.

3.2.3. Desventajas Existen algunos agentes químicos que en ciertas concentraciones van a afectar indirectamente a las bacterias circundantes del ambiente, sin que el fin haya sido eliminarlas, por ejemplo existen algunos derivados como el Eugenol que es utilizado como agente bactericida en enfermedades infecciosas bucales que cuando las bacterias están en contacto con esta sustancia mueren. Algunos ensayos para la medición de quimiotaxis no están disponibles por lo que no es confiable su reproducibilidad es (Madigan, et al. 2009).

3.3. Pruebas bioquímicas La extrema diversidad que existe entre las bacterias se ve reflejada más intensamente en sus propiedades fisiológicas y bioquímicas que en la forma que estas presentan. Aunque parece sencillo explicar la morfología bacteriana, las características bioquímicas y fisiológicas están basadas en la química de los componentes estructurales de la célula bacteriana, por lo que se consideran de gran utilidad en la descripción de los microorganismos es (Prescott, et al. 2000 y Madigan, et al. 2009). Se necesita conocer detalladamente que cambios sufren las bacterias durante los

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procesos metabólicos, como es que se llevan a cabo las reacciones bioquímicas, que enzimas intervienen y cuáles son los productos intermedios que se generan.

Figura 20. Reacción ante las pruebas bioquímicas Tomado de Prescott, et al. (2000)

La figura anterior muestra la forma de expresar una respuesta ante las pruebas bioquímicas o medios de cultivo especiales para obtener alguna especie en particular de bacteria. El cambio o vire de color significa que reaccionan positivamente o favorable a la producción de una enzima, fermentación de lactosa, producción de indol, entre otras.

3.3.1. Fundamentos de la caracterización por pruebas bioquímicas Los microorganismos se suelen cultivar en medios que generalmente contienen sustancias nutritivas específicas o sustratos los cuales se incuban y después de cierto tiempo el cultivo se examina para ver los cambios bioquímicos que han ocurrido. Al observar en el microscopio los cultivos microbianos solamente permite visualizar como están distribuidos en varios grupos los microorganismos basados exclusivamente en su forma, sin embargo cada grupo presenta una extrema diversidad de tipos basándose en su actividad bioquímica, serológica y su poder patógeno es (Prescott, et al. 2000 y Madigan, et al. 2009). Para poder estudiar a fondo los microorganismos es fundamental la obtención de un cultivo puro y después realizarle una serie de pruebas bioquímicas, ya que las bacterias reaccionan de modo distinto a los diversos métodos que existen y tales reacciones son útiles para clasificarlas es (Prescott, et al. 2000 y Madigan, et al. 2009).

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Figura 21. Ejemplos de bacterias teñidas vistas al microscopio electrónico Tomadas de Prescott, et al. (2000) y Madigan, et al. (2009)

En la Unidad anterior se estudió la forma de obtener cultivos puros a partir de una serie de cultivos bacterianos y de materiales que se suponen contaminados por gérmenes patógenos, mediante una serie de resiembras con ayuda de un asa bacteriológica que tiene un alambre de platino, la cual es pasada al fuego para esterilizarla y así evitar la contaminación de cepas.

3.3.2. Principales técnicas En la actualidad al convivir con una gran mayoría de microorganismos, es de gran utilidad el poder identificar que especies intervienen negativamente en una actividad o de manera benéfica, ya que es de gran importancia para entender de qué forma atacarla o explotarla. Para llevar a cabo la identificación bacteriana es necesario procesarlas a nivel de laboratorio conocer tanto sus características morfológicas, la reacción que presentan a la tinción de Gram, agrupación y morfología de las colonias, reacciones metabólicas como la producción de enzimas, entre otras es (Prescott, et al. 2000 y Madigan, et al. 2009). Uno de los métodos más usados es la utilización de colorantes para teñir a las células y facilitar su observación. Los colorantes son compuestos orgánicos y cada tipo de colorante tiene afinidad por determinados componentes celulares. Muchos colorantes que se utilizan químicamente sus moléculas están cargadas positivamente, es decir son básicos o catiónicos, por ejemplo el jugo de limón o la coca-cola son ácido y por lo tanto están cargados negativamente a diferencia del sudor o la sal de mesa que son salados (básico) y tienen carga positiva es (Prescott, et al. 2000 y Madigan, et al. 2009).

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Para llevar a cabo las tinciones de muestras bacterianas se requiere llevar los siguientes procesos: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Realizar un frotis y fijarlo Aplicar un colorante Decolorarlo con alcohol puro (96%) Lavarlo con agua. Aplicar otro colorante de contraste. Observarlo al microscopio electrónico.

Figura 22. Metodología de tinción de bacterias Tomada de Madigan, et al. (2009) pág. 31

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Para la preparación de los frotis se necesita un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, en donde se va a colocar una gota de la muestra bacteriana que se va a teñir en el caso de que sea líquida o toma un hisopo haciéndolo pasar sobre el cultivo, el hisopo se parece a un cotonete con los que usualmente se limpian los oídos. La muestra se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de una flama hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme, de esta forma se evita contaminación de la muestra. Posteriormente se realizan los pasos siguientes que corresponden para cada tinción que se va a llevar a cabo es (Prescott, et al. 2000 y Madigan, et al. 2009). A continuación se muestra una serie de tinciones y pruebas bioquímicas que se emplean en los test rutinarios para la descripción e identificación de las bacterias (Prescott, et al. 2000, Madigan, et al. 2009 y Brooks, et al. 2011). 

Tinción de Gram: este tipo de tinción revela la forma de la célula bacteriana, su agrupación y grupo taxonómico al que pertenece ya sea Gram positivo o Gram negativo.

La tinción de Gram fue introducida en el año de 1884 por el danés Christian Gram, para teñir a las bacterias. En la actualidad es una técnica comúnmente utilizada que consiste en teñir la muestra bacteriana (frotis) con el colorante violeta de genciana, someterla a la acción mordiente de lugol, lavar con alcohol puro (96%) hasta eliminar el exceso de colorante y teñir luego con un colorante de contraste, como la fucsina básica o safranina. Las bacterias que retienen la violeta de genciana se llaman Gram positivas (Gram +) y las que se decoloran y se tiñen en rojo por el colorante de contraste son Gram negativa (Gram -).

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Figura 23. Tinción de Gram en bacterias bacilares Edición propia tomada de Madigan, et al. 2009 y http://pathmicro.med.sc.edu/fox/gram-st.jpg 24 Nov 11

La figura anterior muestra la reacción ante la tinción de Gram de las bacterias bacilares, las grampositivas aparecen teñidas de color morado mientras que las gramnegativas de color rosa. Esta diferencia en respuesta a la tinción de Gram se debe a la estructura de su pared celular como ya se especificó anteriormente. Después de la tinción con el colorante básico (cristal violeta o violeta de genciana), se le agregó el alcohol el cual decolora a las células gramnegativas pero no a las grampositivas y por último antes de observarlas al microscopio se tiñen con un colorante de contraste (safranina) para que se pueda visualizar perfectamente. Algunos ejemplos de bacterias que reaccionan a la tinción de Gram positivo son: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Micrococcus sp, Clostridium perfringens, C. septicum, Listeria sp, Actinomycetes israelii, Nocardia sp. Ejemplos de bacterias que reaccionan a la tinción de Gram negativo son: Neiseria meningitidis, Moraxella sp, Acinetobacter sp, E. Coli, Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni, Fusobacterium sp.

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Tinción de Ziehl-Neelsen: este tipo de tinción es esencialmente para aquellas

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bacterias ácido-resistentes como el bacilo que causa la tuberculosis. Resulta difícil teñirlas, pero una vez que el colorante ha penetrado en la bacteria, las cuales lo conservan después del tratamiento con ácido diluido. La propiedad de resistencia se debe tanto que en la capa de su membrana celular y dentro de la célula (citosol) poseen lípidos. Se lleva a cabo realizando el frotis habitual, salvo que este se fija por calor, se cubre la preparación con fucsina fenicada, se calienta hasta producir vapores (aprox. 3 minutos), se decolora con alcohol-clorhídrico hasta que las partes más finas no tengan colorante y las más gruesas tomen un color rojizo. Después se le coloca una tinción de contraste con azul de metileno (1minuto), se lava con agua y seca para por ultimo observarlas al microscopio. Las bacterias ácido-resistentes se tiñen en rojo y las células y otras bacterias en azul.

Figura 24. Bacilo causante de la tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Tomada de http://www.auxiliaresenfermeria.net/2011/07/la-tincion-paramicobacterias.html

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Tinción de azul de metileno: para teñir a las bacterias se emplea una mezcla de azul de metileno, alcohol etílico e hidróxido de potasio (KOH), la cual se vierte sobre la muestra bacteriana y se deja actuar de 3 a 5 minutos lavándola posteriormente con agua y se observa al microscopio electrónico.

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Tinción de capsulas: las capsulas de las bacterias son frágiles, por lo que nos se tiñen con los métodos corrientes, se utiliza una solución de colorante cristal violeta que se calienta y después se realiza un lavado con sulfato de cobre. La capsula bacteriana se tiñe de color azul pálido, mientras que la célula y su interior aparecen teñidas de color azul obscuro.

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Tinción de Esporas: algunas especies de bacterias producen intracelularmente

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estructuras especiales llamadas endosporas, que son células diferenciadas resistentes al calor, agentes químicos y radiación. Funcionan como estructuras de supervivencia para proporcionar al organismo resistencia a condiciones adversas como temperaturas extremas, desecación, limitación de nutrientes. Los géneros más estudiados con esta técnica son Bacillus y Clostridium. El método de Schaeffer y Fulton es habitual para teñir esporos, se cubre el frotis con verde malaquita en solución acuosa dejándolo reposar media hora, después se calienta hasta observar vapores durante medio minuto, eliminar con agua el exceso de colorante y por último aplicar safranina. Los esporos retienen el color verde y las partes vegetativas se tiñen de rojo.

Figura 25. Bacillus subtilis, observe los esporos teñidos de verde Tomada de http://bacillus8.blogspot.com/ 25 Nov 11

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Tinción de flagelos: los flagelos de las bacterias son invisibles en las preparaciones corrientes, por lo que solo pueden visualizarse con tinciones especiales. Los flagelos se observan en cultivos bacterianos recientes (12-18 horas), en un tubo con 5 ml de caldo nutritivo, se cultiva la muestra procedente de la placa de agar hasta que se observe una ligera turbidez, se coloca en la estufa a 37°C durante 1 hr.

Posteriormente se colocan 2 o 3 gotas de la muestra sin mezclarlas ni extenderlas, se flamean en la parte azul de la llama y se deja secar al aire. Para la tinción se ocupa una mezcla homogénea en agua destilada de fucsina básica, alcohol etílico, ácido tánico y cloruro de sodio. Se coloca el colorante a la muestra dejándolo actuar de 5 a 15 minutos hasta observar un precipitado y se lava para finalmente observarse al microscopio electrónico. Observándose los flagelos de color rosa o rojo y el resto de la célula es de color rosa tenue o bien sin color. 

La tinción de Feulgen es una técnica para teñir nucleótidos, fue descubierta por Robert

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Feulgen, se basa en la hidrolización del DNA por medio de una solución diluida de ácido clorhídrico (HCl) donde se van a liberar las bases puricas del ADN.

Figura 26. Nucleoides de Bacillus cereus teñidas con Feulgen Tomada de http://www.human-healths.com/bacillus-cereus2/bacillus-cereus.php

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Prueba de Catalasa: este tipo de prueba bioquímica es muy útil para observar la presencia de la enzima catalasa que se encarga de descomponer el peróxido (H2O2) en oxígeno y agua, se localiza en las bacterias que son aerobias y anaerobias facultativas. El método usual es realizar un frotis, agregarle una gota de peróxido, si se visualiza la formación de burbujas el resultado es positivo, mientras que si no sucede de lo contrario el resultado es negativo. Una especie que reacciona positivamente a la catalasa es Penicillium simplicissimum.

Figura 27. Catalasa a) en tubo positiva, b) en tubo negativa, c) en portaobjetos positiva y d) en porta objetos negativa Tomada de Prescott, et al. (2000)

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Prueba de Oxidasa: esta prueba comúnmente se utiliza para determinar la enzima citocromo-C-oxidasa, entre algunos géneros que resultan positivos a esta prueba destacan Pseudomonas sp, Neisseria sp, Moraxella sp, Vibrio sp, Aeromonas sp. Se

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lleva a cabo para determinar la oxidación en presencia del citocromo C. Usualmente se ocupan discos de papel de filtro, una caja petri, reactivo de oxidasa (solución dedihicloruro de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%). Se coloca un disco inmerso de reactivo oxidasa que se pone sobre la muestra bacteriana, inmediatamente si la reacción se hace positiva indica un color azul-violeta intenso, de lo contrario la prueba será negativa.

Figura 28. Pseudomonas aeruginosa es oxidasa positiva y E. coli es negativa Tomada de Prescott, et al. (2000)

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Prueba de Indol: se prepara utilizando usando caldo triptófano y se observa la producción de indol. Se inocula el medio y se incuba durante 2 días y pasado el tiempo se utiliza el reactivo de Kovac para evidenciar la prueba. Se lleva a cabo cubriendo el medio con 2 ml de cloroformo, seguido de 2 ml del reactivo de kovac, una reacción positiva denota la aparición de color rosa o rojo intenso en la capa de cloroformo, de lo contario la prueba es negativa.

Figura 29. a) E. coli indol positivo y b) Enterobacter indol negativo Tomada de Prescott, et al. (2000)

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Voges-Proskauer y Rojo de Metilo: se basan principalmente en la determinación de acetoina que es un producto final de la síntesis de la glucosa. La acetoína es también conocida como butanodiol o acetil-metil-carbinol. Estas pruebas se asocian, ya que permiten la identificación de enterobacterias que son microorganismos anaerobios facultativos. Para llevar a cabo estas pruebas se necesita de un medio de cultivo caldo de Clark y Lubs que tenga 3 días de inoculación, pasado el tiempo se separa en dos muestras, una para cada ensayo correspondiente.

Rojo de metilo al tubo se le añaden de 4-5 gotas de reactivo indicador Rojo de Metilo, se agita para homogeneizar y se observa la coloración que se obtuvo, será positiva si cambia a un color rojo y negativa si permanece amarillo.

Figura 30. a) E. coli rojo de metilo positivo y b) Enterobacter aerogenes rojo de metilo negativo Tomada de Prescott, et al. (2000)

Voges-Proskauer (VP) a la otra muestra del tubo de cultivo se le añade una mezcla del reactivo A Voges-Proskauer que contiene alfa-naftol 5% en etílico absoluto observando que el medio adquiere un aspecto lechoso y reactivo B de Voges-Proskauer hidróxido de potasio (KOH), se observara que desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente. La prueba se torna positiva cuando en menos de cinco minutos aparece un color rosadovioláceo que inicia en la parte superior del tubo y si no hay coloración alguna la pruebas es negativa.

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Figura 31. a) Enterobacter aerogenes VP positivo y b) E. coli VP negativo Tomada de Prescott, et al. (2000)

Además de las tinciones y las pruebas antes mencionadas existen medios de cultivo que van a funcionar como evidencia de crecimiento de alguna especie bacteriana muy en particular, entre los que destacan es (Prescott, et al. 2000 y Madigan, et al. 2009): 

Citrato de Simmons: este tipo de medio se emplea para la diferenciación de cepas de E. coli fecal de las del grupo aerogenes las cuales crecen también en este medio ya que se utiliza citrato. También existen otras especies como las del género Salmonella, en especial S. typhimurium, S. typhosa y S. paratyphi que utilizan citrato como nutriente para crecer.



El agar Nitrato: sirve para identificar bacterias que realizan la reducción de los nitratos a nitrito, se añade una solución al tubo con cultivo microbiano, esta es una mezcla de ácido acético más ácido sulfanílico y ácido acético con alfa-amidonaftaleno. Si al observar el tubo de color rojo-rosado indica la presencia de nitritos.

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Medio SIM: este medio tiene tres finalidades en las muestras bacterianas, sirve para comprobar hidrógeno sulfurado, Indol y motilidad. Se lleva a cabo una siembra por picadura, donde la aparición de una ligera zona negra a lo largo del trayecto de la siembra, se considera una producción positiva de hidrógeno sulfurado. La motilidad se nota por el crecimiento en forma de limpia tubos alrededor del trayecto central de la picadura, las bacterias inmóviles no penetran en el agar semisólido y por ultimo para comprobar la formación de Indol se utilizan tiras de papel empapadas de solución saturada de ácido oxálico y se corrobora con el reactivo de Kovac.

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3.4. Caracteres genéticos Habrás escuchado hablar de la ingeniería genética, te preguntaras a que se refiere, es una ciencia auxiliar de la genética que se encarga del uso y aplicación de técnicas in vitro para modificar el material genético de los microorganismos en el laboratorio, dicho material genético (ADN) puede después reinsertarse en el microorganismo de donde se extrajo o bien en otra especie de interés. Recientemente han tenido gran auge los análisis moleculares genéticos. Ha pasado por tu mente hacerte la pregunta del por qué no tienes algún rasgo que te identifique con tus progenitores y has encontrado respuesta alguna. He aquí donde actúa la genética que es una ciencia auxiliar de la biología que se encarga del estudio de la herencia, de cómo es que las características fenotípicas y genotípicas se van a transmitir de una generación a otra (herencia genética). Esta ciencia se inició con el monje austriaco Johann Gregor Mendel (1822-1884), que es considerado el padre de la Genética, experimentó con guisantes (chicharos) con los cuales llevo a cabo una serie de experimentos respecto a su apariencia física cruzó organismos con características físicas diferentes con los que demostró la transmisión de los caracteres genéticos. Aunque sus experimentos no fueron tomados en serio, fue hasta 1900 que sus trabajos se volvieron a retomar y posteriormente durante las décadas siguientes sirvieron de base para los genetistas que se dedican a estudiar la transmisión de los caracteres y la expresión de la información genética. En la actualidad son de gran utilidad, por ejemplo sabrás que en criminología son esenciales para esclarecer crímenes, muy importantes en pleitos de paternidad, para erradicar y combatir enfermedades, mejoramientos de semillas y de especies animales y la más importante dentro del estudio de los microorganismos para su identificación (Prescott, et al. 2000, Madigan, et al. 2009 y Brooks, et al. 2011).

3.4.1. Fundamentos de la caracterización genética Las estructuras que son esenciales para la genética microbiana, se encuentran dentro de la célula, específicamente estamos hablando del cromosoma bacteriano, donde se localiza el ácido desoxirribonucleico (ADN o DNA). El ADN es el material genético que se utiliza para guardar la información genética, supongamos que es el disco duro de una computadora, sabes pues que en él puedes guardar toda la información que se genera al trabajar. Una secuencia de ADN es simplemente la unión de miles de nucleótidos. Un nucleótido está formado por una azúcar de 5 carbonos (pentosa) llamada desoxirribosa,

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un grupo fosfatado y una base nitrogenada, que en este caso se dividen en bases púricas como la adenina (A) y guanina (G) y en bases pirimídicas que son timina (T) y citosina (C) (Solomon, et al. 2008). Cada especie microbiana tiene una secuencia genética diferente, lo cual le confiere características que las diferencian y son de suma importancia para la identificación bacteriana. Se tiene conocimiento de la secuencia genética de algunas bacterias, pero en general la mayoría contienen entre 500 a 6000 genes. En 1949 Edwin Chargaff y sus colegas de la Universidad de Colombia llegaron a determinar la composición de bases de ADN de diversos organismos y tejidos, entre los que destacan el de la bacteria E. coli que contiene 26.1 % de adenina, 23.9 % de timina, 24.9 de guanina y 25.1 % de citosina (Solomon, et al. 2008).

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Figura 32. Estructura de un nucleótido que forma parte del DNA Tomado de Solomon, et al. 2008)

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3.4.2. Principales técnicas En la actualidad se han secuenciado completamente los genomas de muchas bacterias, lo que ha revelado el número y la disposición de los genes que poseen. La clonación y la secuenciación han revolucionado el estudio de la estructura y la función del genoma en todos los organismos. Los procesos de transformación, transducción y conjugación se han utilizado para mapear la localización de los genes en un cromosoma bacteriano (Madigan, et al. 2009). Se han desarrollado y mejorado técnicas para auxiliar a la ingeniería genética, dichas técnicas se basan en la capacidad para cortar el ADN de interés en fragmentos específicos y purificar dichos fragmentos para su posterior manipulación. Entre las herramientas básicas destacan: enzimas de restricción, separación de ácidos nucleícos por electroforesis, hibridación de ácidos nucleícos, las sondas de ácido nucleíco, clonación molecular y vectores de clonación.

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Figura 33. Electroforesis en gel Tomadas de http://es.dreamstime.com/fotograf-iacutea-de-archivo-electroforesis-del-gel-de-ladna-image2223462, http://betbettybea.blogspot.com/2011/11/electroforesis.html y Madigan, et al.(2009)

Las imágenes anteriores muestran cómo es que se lleva a cabo una electroforesis en gel, la figura de la izquierda ejemplifica como el investigador coloca con mucho cuidado y con ayuda de una micropipeta la muestra de ADN en los posos del gel de agarosa, se sumerge en bromuro de etidio y se aplica corriente eléctrica y posteriormente la imagen derecha es la observación final de la técnica con la ayuda de una cámara de luz ultravioleta, donde las marcas son el ADN (Madigan, et al. 2009). Después de aislado y purificado el DNA se siembra la muestra en una placa porosa de gel de agarosa o poliacrilamida, la cual es sometida aplicándole corriente eléctrica. Al aplicarse la corriente lo que va a provocar es que las moléculas se van a mover a través

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del gel impulsadas por la corriente. Esta técnica nos permite separar moléculas de acuerdo a su peso molecular y carga (positiva o negativa), debido a esto provoca que las moléculas pequeñas o las de cierta carga se va a mover con mucha mayor velocidad que las moléculas grandes. Los ácidos nucleícos por naturaleza están cargados negativamente, por lo tanto se van a dirigir hacia el polo positivo (Madigan, et al. 2009). Durante el siglo pasado se han llevado a cabo experimentos para encontrar la secuencia completa del genoma de varias especies bacterianas, esto implica una serie de trabajo excesivo llevadas a cabo en laboratorios dotados de nuevas tecnologías de obtención, procesamiento y visualización de los microorganismos (Madigan, et al. 2009). Cada organismo tiene una secuencia única de DNA genómico, excepto los gemelos idénticos. A diferencia de los organismos superiores cuyo material genético contiene cadenas repetitivas de ADN, las cuales varían en número y disposición respecto a cada especie. El DNA se puede sintetizar in vitro mediante un método en fase sólida, donde se obtienen copias de secuencias específicas de ADN y son necesarias para muchas técnicas moleculares, un método por el cual se sintetizan estas copias in vitro de ADN es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue inventada por Kary Mullis, el cual recibió el premio nobel por su invento (Madigan, et al. 2009). La PCR puede copiar segmentos de ADN hasta mil millones de veces en un tubo de ensayo, un proceso llamado amplificación, que genera grandes cantidades de genes específicos u otros segmentos de ADN para toda una serie de aplicaciones en la biología molecular. Imaginemos pues que es una fotocopiadora a la cual manipulamos y programamos para que nos de cómo resultado una cantidad específica de copias de algún documento, al final tendremos pues copias idénticas a la original y básicamente eso es lo que hace la técnica de PCR. Utiliza una DNA-polimerasa que copia moléculas de ADN de manera natural, no las copia de manera completa, sino que amplifica fragmentos de hasta algunos miles de pares de bases de una molécula de ADN más grande (Prescott, et al. 2000, Madigan, et al. 2009 y Brooks, et al. 2011). La técnica básica para el estudio molecular de las bacterias es: i. ii. iii. iv. v.

Cultivar la muestra bacteriana en un medio general. Llevar a cabo un aislamiento para purificar la bacteria. Si es necesario volver a resembrar el microorganismo en un medio especial para evitar contaminación de cepas. Aplicar una serie de pruebas y tinciones mencionadas en el tema anterior que sirven para identificar la especie bacteriana. Teniendo el cultivo puro, seguir incubando hasta obtener varias generaciones.

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vi. vii.

Tomar una masa de microorganismos y centrifugarlos para obtener por diferencia de peso molecular el ADN. Aplicar técnicas específicas para lo que se requiere conocer cómo, la secuencia de nucleótidos, las proteínas, los genes.

Una herramienta que auxilia para el estudio del material genético son los microscopios, que con los grandes avances tecnológicos han ido especializándose más respecta a los intereses particulares del investigador, entre los cuales destacan los microscopios ópticos de campo brillante, de campo obscuro, de fluorescencia, con focal, de contraste de fases, de interferencia, también microscopios electrónicos de transmisión, de barrido. Cósmidos: son vectores plasmídicos que contienen el sitio cos del genoma lambda (λ), que genera extremos cohesivos cuando se cortan, son muy útiles en la tecnología del DNA recombinante, con estos es posible clonar fragmentos de ADN más grandes, se utilizan para fabricar genotecas de cDNA y son estudiados cuando el gen se expande de 30 a 40 kilobases (kb), es decir miles de bases que componen el ADN. La ventaja que tienen los cósmidos, es que es posible clonar fragmentos de DNA foráneo más grandes que los originales (Prescott, et al. 2000, Madigan, et al. 2009 y Brooks, et al. 2011).

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Figura 34. Esquema de un cósmido Tomado de http://books.google.com.mx/books?id=33GIdnSf56oC&pg=PA338&lpg=PA338&dq=cosmidos&so urce=bl&ots=zwkb0bRbLw&sig=Yypszx6eqkyxaLXXUhSuT7LgGZE&hl=es&ei=hhzRTuGJJMyFs gKphfm2Dg&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=6&sqi=2&ved=0CEAQ6AEwBQ#v=onepa ge&q=cosmidos&f=false http://genetica-moderna.blogspot.com/2010/08/manipulacion-genetica.html

Plásmidos: son elementos genéticos que se replican independientemente del cromosoma, forman parte de otro elemento genético. Existe una inmensa cantidad de plásmidos de ADN de doble cadena moléculas de material genético que la mayoría son circulares, no obstante hay algunos que son lineales. Los plásmidos difieren de los virus ya que no causan daño alguno a la célula huésped y no presentan formas extracelulares. Los plásmidos se diferencian de un cromosoma bacteriano, ya que los primeros portan solo genes no esenciales y los cromosomas genes que son muy esenciales. En cepas de E. coli se han asilado más de 300 plásmidos naturales. El DNA de los plásmidos es bicatenario y contienen de 1 Kbp hasta 1 Mbp (Prescott, et al. 2000, Madigan, et al. 2009 y Brooks, et al. 2011).

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Figura 35. Localización de un plásmido bacteriano Tomado de http://caibco.ucv.ve/caibco/vitae/VitaeDos/Articulos/BiologiaCelular/carcter.htm

3.4.3. Desventajas Respecto a los cósmidos y plásmidos los investigadores se han topado con un gran problema, el cual es que agentes químico, condiciones del medio ambiente hacen que los genes sufran mutaciones. Una mutación es aquella que produce cambios en la secuencia nucleótida del DNA, no obstante el índice de mutación global es mayor que la frecuencia de daños en el DNA, puesto que todos los organismos tienen complejos enzimáticos que reparan algunas lesiones que llegase a sufrir el ADN (Prescott, et al. 2000, Madigan, et al. 2009 y Brooks, et al. 2011). Otro problema al que suelen enfrentarse es que al momento de cultivar la cepa, esta no se pueda obtener pura, ya que existen especies bacterianas que comparten genéticamente secuencias de nucleótidos, las cuales con los métodos de tinción o pruebas no se puedan diferenciar.

Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar. Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BMTM_U3_A1_XXYZ, donde BMTM corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la

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actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BMTM_U3_ATR _XXYZ, donde BMTM corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

Cierre de la Unidad Como te habrás dado cuenta con los temas vistos en esta Unidad, la gran capacidad metabólica que tienen los microorganismos para reaccionar a las diferentes pruebas y tinciones, así como está involucrado el material genético para poder estudiar los caracteres del genoma para determinar específicamente la huella dactilar de cada especie y que tan importante son en la actualidad las diversas técnicas para llegar a la obtención de ADN purificado y de esta forma conocer más acerca de estos microorganismos para poder aplicarla en experimentos de gran utilidad para poder erradicar enfermedades, mejoramiento de cepas para producción de vinos o lácteos e incluso remediar nuestro medio ambiente haciendo en las bacterias que intervienen en los procesos de fijación del nitrógeno, el tratamiento de aguas residuales. Con estos temas vistos en esta Unidad te ayudaran a comprender como la ecología estudia a los microorganismos y la evolución dentro de su hábitat que es el tema principal de la siguiente Unidad.

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Para saber más

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Para corroborar lo aprendido sobre la técnica de tinción de Gram observar el siguiente video http://www.gefor.4t.com/bacteriologia/tinciondegram.html. Para entender mejor la técnica de electroforesis en gel ver los siguientes videos http://www.youtube.com/watch?v=sbCusDyYoi0 y http://www.youtube.com/watch?v=WeRwsr5JUwA Para comprender como se lleva a cabo la PCR observa el siguiente video http://www.youtube.com/watch?v=i1o4jYepdxs. Para comprender que son los plásmidos ver el siguiente video http://www.youtube.com/watch?v=RfMTv1km0RU.

Fuentes de consulta

Bibliografía básica  González, G. M. y C. A. M. (2007). Microbiología ambiental. Corpus.  Pidello, A. (2011). Ecología microbiana. Corpus.

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 Willey, J., Sherwood, L. M. y Woolverton, C. J. (2009). Microbiología. 7a ed. Mc Graw Hill-Interamericana. Bibliografía complementaria  Atlas, M. R. y Bartha, R. (2002). Ecología microbiana y Microbiología ambiental. (4ª ed). Madrid, España. Pearson Addison Wesley.  Brooks, G. F., Carroll, C. K., Mietzner, a. T., Butel, J. S. y Morse, S. A. (2011). Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología Médica. (25ª ed). D.F., México. Mc Graw Hill.  Madigan, M. T., Martinko, J. M. y Parker, J. (2009). Brock. Biología de los microorganismos. (12ª ed). Madrid, España. Pearson Adison-Wesley.  Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. (2000). Microbiología. (4ª ed). Madrid, España. McGraw-Hill Interamericana.  Solomon, P. E., Berg, R. L. y Martin, W. D. (2008). Biología. (8ª ed). D.F., México. Mc Graw Hill.

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