Unidad 3. Cromatografía

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Operaciones unitarias II CromatografĂ­a

Programa de la asignatura:

Operaciones unitarias II

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CromatografĂ­a

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Índice Presentación de la unidad…………………………………………………………..…………….3 Propósitos de la unidad…………………………………………………………….……………..3 Competencia específica…………………………………………………………….………….....4 3.1. Definición de cromatografía…………………………………………………….…………...4 3.1.1. Concepto de cromatografía…………………………………………………….…………5 3.1.2. Fundamento de la cromatografía……………………………………………….………..10 3.2. Métodos cromatográficos…………………………………………………….…….……....14 3.2.1. Cromatografía de intercambio iónico…………………………………………….……..14 3.2.2. Cromatografía en capa fina y en papel………………………………………….……..18 3.2.3. Cromatografía líquida……………………………………………………………….……24 3.2.4. Cromatografía de gases…………………………………………………………….…...27 3.2.5. Equipo cromatográfico……………………………………………………………….…..33 3.3. Usos de la cromatografía…………………………………………………………….........43 3.3.1. Separación de enzimas……………………………………………………………….….43 3.3.2. Separación de pigmentos……………………………………………………………......48 3.3.3. Separación de otros metabolitos……………………………………………………......51 Actividades……………………………………………………………………………………......54 Autorreflexiones………………………………………………………………………………......55 Cierre de la unidad…………………………………………………………………………….....55 Para saber más…………………………………………………………………………………...56 Fuentes de consulta……………………………………………………………………………...57

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Presentación de la unidad En esta última unidad de la asignatura Operaciones unitarias II, estudiarás la importancia de la cromatografía en diversos procesos biotecnológicos, sus aplicaciones y variables a controlar para la separación, caracterización y purificación de una gran cantidad de moléculas biológicas. Desde el punto de vista de operaciones unitarias, la cromatografía no puede considerarse como tal; sin embargo, su importancia es tal en la industria química o biológica que debe tratarse como una operación fundamental, por lo que en esta sección revisarás las principales características del proceso cromatográfico y de sus aplicaciones para la separación y purificación de biomoléculas.

Propósitos de la unidad

Al finalizar la unidad lograrás:   

Describir el fundamento del proceso de separación por cromatografía. Analizar los principales métodos cromatográficos. Determinar las aplicaciones de la cromatografía en procesos de separación biomolecular y de metabolitos.

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Competencia específica

Explicar los principios físicos de la cromatografía a través de sus efectos y variables para su aplicación en la separación de biomoléculas y metabolitos de interés biotecnológico.

3.1. Definición de cromatografía La cromatografía se puede considerar como un proceso de separación física de moléculas. Etimológicamente, cromatografía significa “escribir en colores” por sus raíces griegas chroma, que significa color, y graphos, que significa escribir. De manera breve podemos decir que para llevarse a cabo la separación se debe tomar en cuenta tanto la carga de las moléculas como su tamaño, pequeñas diferencias en el coeficiente de partición permiten la separación por retención diferencial de las moléculas en lo que se llama tiempo de retención. Se puede decir que cada molécula presenta un tiempo de retención único bajo condiciones de separación determinadas, esto permite predecir tiempos de separación en procesos biotecnológicos. Hay diferentes tipos de cromatografía, pero podemos clasificar a este proceso de separación en dos grandes grupos, cromatografía plana y en columna, esta clasificación depende exclusivamente de la fase estacionaria. En la fase estacionaria se lleva a cabo la retención de las moléculas, en donde se unen o anclan las moléculas que se desean separar o purificar. La fase móvil es la encargada de separar a las moléculas, puede ser líquida o gaseosa dependiendo del tipo de cromatografía utilizada. A continuación se abunda más sobre este tema. 4

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3.1.1. Concepto de cromatografía La cromatografía es un método de separación molecular a partir de una gran diversidad de muestras, tanto orgánicas como inorgánicas. La separación de las moléculas se logra a través del paso de las muestras por una fase estacionaria con ayuda de la fase móvil, como ya se comentó, el coeficiente de partición permitirá la separación de los diferentes componentes de las muestras generando gradientes en donde algunas moléculas se retrasarán y otras correrán más rápidamente a través de la fase estacionaria (Figura 1), este movimiento de las moléculas dependerá directamente de la velocidad de flujo de la fase móvil, del tipo de unión de las moléculas a la fase estacionaria y de la fuerza iónica del caudal, así mismo el tamaño de la columna será fundamental para la separación, ya que a mayor tamaño de la columna, mejor será el proceso de separación. Durante el proceso de separación se pueden apreciar diferentes perfiles que nos indican la separación de las diferentes moléculas de una mezcla compleja, a estos perfiles se les conoce como cromatogramas (Figura 2).

Figura 1. Separación de moléculas a través de una columna cromatográfica (tomado de quimicalibre.com, 2013).

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Figura 2. Cromatograma típico donde se aprecia el tiempo de retención que corresponde a diferentes moléculas (tomado de mazinger.sisib.uchile., 2013).

Los cromatogramas permiten identificar el tiempo de retención (tR) de cada molécula, es decir, el tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra hasta que la molécula (analito) es leída por el detector del equipo. Este tiempo es fundamental para el diseño de procesos de separación y purificación de moléculas de interés biotecnológico. El tiempo de retención es único para cada molécula y no es más que el tiempo que tarda cierta molécula en salir o separarse de la columna cromatográfica bajo condiciones únicas, es decir, temperatura, velocidad de flujo, sistema cromatográfico, principalmente (Abbott y Andrews, 2006). El cromatograma también permite identificar el tiempo muerto (tM), que es el tiempo que tarda el analito en ser leído por el detector del equipo analítico. Hay varios objetivos en un estudio cromatográfico, uno de ellos es simplemente saber la composición de una mezcla y el otro, la purificación de una molécula en particular por lo tanto, es fundamental conocer primero los tipos de cromatografías que tenemos a nuestra 6

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disposiciĂłn, asĂ­ como su fundamento. De acuerdo con Abbott y Andrews (2006), los mĂŠtodos cromatogrĂĄficos planos son los que dependen de la forma en que se pongan en contacto tanto la fase mĂłvil como la estacionaria y los mĂŠtodos cromatogrĂĄficos de columna dependen del tipo de fase mĂłvil a utilizar (es decir gaseosa, lĂ­quida o de fluidos sĂşper crĂ­ticos). Para iniciar el proceso cromatogrĂĄfico primeramente debes conocer las ecuaciones bĂĄsicas que controlan a este mĂŠtodo de separaciĂłn. Iniciaremos estudiando la constante de distribuciĂłn (K), esta constante no es mĂĄs que una constante de equilibrio que indica la relaciĂłn que hay del analito en la fase mĂłvil y en la fase estacionaria para una especie dentro de una mezcla. Esta constante de equilibrio para un analito estĂĄ dada por la siguiente relaciĂłn: đ??ž=

đ??śđ?‘ đ??śđ?‘€

Donde: CS es la concentraciĂłn molar del analito en la fase estacionaria CM es la concentraciĂłn molar del analito en la fase mĂłvil.

Otra variable importante a tomar en cuenta es el factor de capacidad que se utiliza para determinar la velocidad de migraciĂłn de los analitos a travĂŠs de las columnas. El factor de capacidad (k’) para una especie A se estima con ayuda de la siguiente relaciĂłn: đ?‘˜ ′đ??´ =

đ??žđ??´ đ?‘‰đ?‘† đ?‘‰đ?‘€

Donde: KA es la constante de distribuciĂłn VS es el volumen de la fase estacionaria VM es el volumen de la fase mĂłvil Si se desconoce alguna de estas variables, el factor de capacidad puede estimarse a partir de un cromatograma utilizando el tiempo de retenciĂłn como referencia. đ?‘˜ ′đ??´ =

(đ?‘Ąđ?‘… )đ??´ − đ?‘Ąđ?‘€ đ?‘Ąđ?‘€

Donde: (tR)A es el tiempo de retenciĂłn del componente A tM es el tiempo muerto para el analito no retenido 7

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La siguiente variable a estudiar es el factor de selectividad (ď Ą), este factor define la selectividad de una columna para separar dos picos. Cada columna presenta un factor de selectividad Ăşnica, es decir una afinidad por cierto analito determinada. Si se tiene una mezcla con dos analitos A y B, el factor de selectividad estĂĄ dado por: đ?›ź=

đ?‘˜â€˛đ??ľ đ?‘˜ ′đ??´

Donde: k’B es el factor de capacidad para el analito B (el mås retenido) k’A es el factor de capacidad para el analito A (el menos retenido)

El factor de selectividad siempre serå mayor a 1, es decir, siempre serå mayor la concentración del analito mayormente retenido. Por otra parte, si se desconoce alguna de estas variables, es posible obtener el factor de selectividad a partir de un cromatograma utilizando el tiempo de retención (tR) y el tiempo muerto (tM) para los analitos A y B, con la siguiente relación: �=

(đ?‘Ąđ?‘… )đ??ľ − đ?‘Ąđ?‘€ (đ?‘Ąđ?‘… )đ??´ − đ?‘Ąđ?‘€

Conocer la eficiencia de la columna es otro factor de suma importancia en un proceso cromatogrĂĄfico. La eficiencia de una columna se puede determinar cualitativamente al observar los cromatogramas que generan. Entre mĂĄs ancho sea un pico cromatogrĂĄfico, menor serĂĄ la eficiencia de la columna. Es importante seĂąalar que la eficiencia de una columna dependerĂĄ del tiempo de residencia del analito dentro de la columna y de la velocidad de la fase mĂłvil. Por regla general, entre mayor tiempo estĂŠ el analito dentro de la columna habrĂĄ mayor dispersiĂłn y, por lo tanto, la anchura del pico serĂĄ mayor. La eficiencia de una columna cromatogrĂĄfica se puede estimar cuantitativamente a partir de la altura equivalente del plato teĂłrico (H) o por el nĂşmero de platos teĂłricos (N) y ambos estĂĄn relacionados por la ecuaciĂłn: đ?‘ =

đ??ż đ??ť

Donde L es la longitud del relleno de la columna. ÂżCĂłmo estimar N y H?, es un hecho que la eficiencia de una columna es mayor cuando se tiene un alto nĂşmero de platos teĂłricos y menor es la altura de los mismos. N y H se pueden calcular utilizando las siguientes ecuaciones:

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đ??ť=

đ??żđ?‘Š 2 16đ?‘Ąđ?‘… 2

đ?‘Ąđ?‘… 2 đ?‘ = 16 ( ) đ?‘Š Donde: L es la longitud de la columna W ancho del pico a considerar tR tiempo de retenciĂłn del pico (analito) Hay otras variables que tienen una marcada influencia en la anchura del pico y que por lo tanto determinan la eficiencia de una columna. Se han generado una gran variedad de modelos que tratan de determinar las principales variables involucradas en la eficiencia de una columna cromatogrĂĄfica. Una de las ecuaciones mĂĄs aceptadas en la propuesta por Van Deemter indica que: đ??ť =đ??´+

đ??ľ + đ??śđ?‘˘ đ?‘˘

Esta ecuaciĂłn toma en cuenta otras variables que inciden en la anchura de un pico cromatogrĂĄfico y que se pueden interpretar como sigue: El tĂŠrmino A es atribuido a la difusiĂłn en remolino que no es mĂĄs que el efecto de la trayectoria de una partĂ­cula a travĂŠs de una columna empacada. En este tĂŠrmino se toma en cuenta la densidad del empaque (ď Ź) y el promedio del diĂĄmetro de la partĂ­cula del đ??ľ

empaque (dP), por lo que el tĂŠrmino A esta dado por 2ď ŹdP. El tĂŠrmino đ?‘˘ es conocido como difusiĂłn longitudinal y trata de explicar que el ensanchamiento de una banda se debe a la diferencia de concentraciones con que eluye un analito, es decir, siempre eluirĂĄ primeramente la zona de la columna con menos concentraciĂłn de analito y posteriormente eluirĂĄ la zona con mayor concentraciĂłn de analito, contribuyendo con esto, a la anchura del pico cromatogrĂĄfico. El tĂŠrmino B de la difusiĂłn longitudinal estĂĄ determinado por 2ď §DM, donde ď § es la tortuosidad de los canales de la columna empacada y DM es la difusiĂłn molecular del soluto en la fase mĂłvil. Finalmente, el tĂŠrmino C brinda informaciĂłn sobre la resistencia de transferencia de masa entre la fase mĂłvil y la 8

đ?‘˜

2đ?‘‘đ?‘“ 2

estacionaria y estĂĄ dada por: (đ?œ‹2 ) [(1+đ?‘˜)2 ] (

đ??ˇđ??¸

) donde: k es el factor de capacidad, df es

el espesor de la pelĂ­cula de la fase estacionaria y DE es el coeficiente de difusiĂłn del soluto en la fase estacionaria. U para todos los casos, es la velocidad de flujo de la fase mĂłvil.

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La resolución de la columna (RS) es la última variable a tomar en cuenta, la resolución de la columna es la capacidad que presenta una columna en separar dos analitos. La resolución se determina a partir de la siguiente relación: �� =

2[(đ?‘Ąđ?‘… )đ??ľ − (đ?‘Ąđ?‘… )đ??´ ] đ?‘Šđ??´ − đ?‘Šđ??ľ

En esta relaciĂłn se debe considerar el ancho del pico, ya que RS involucra las variables WA y WB que son los anchos de los picos para los analitos A y B, respectivamente. Hay otra relaciĂłn para calcular RS a partir de tĂŠrminos teĂłricos utilizando la siguiente expresiĂłn:

�� =

đ?›ź 2 1 + đ?‘˜â€˛đ??ľ √đ?‘ ( ) ( ′ ) 4 đ?›źâˆ’1 đ?‘˜đ??ľ

Se ha demostrado que una resoluciĂłn de 1.5 permite una separaciĂłn completa de dos analitos, mientras que resoluciones menores a 0.75 no lo permiten (Dabrio, 2000). Con estos conceptos bĂĄsicos pasaremos ahora a estudiar los fundamentos de la cromatografĂ­a.

3.1.2. Fundamento de la cromatografĂ­a La principal caracterĂ­stica que distingue a la cromatografĂ­a de otros mĂŠtodos fĂ­sicos de separaciĂłn es que estĂĄn en contacto dos fases inmiscibles, la estacionaria y la mĂłvil. La fase mĂłvil es la encargada de transportar al analito que se desea separar, esta fase transporta al analito a lo largo de la fase estacionaria, que a su vez se encuentra empacada en una columna cromatogrĂĄfica. La fase mĂłvil distribuye al analito o analitos en toda la fase estacionaria, en esta Ăşltima se lleva a cabo el anclaje de las diversas molĂŠculas a separar (Figura 3).

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Figura 3. Separación de moléculas a través de una fase estacionaria (tomado de javeriana.edu., 2013).

Las moléculas de la mezcla experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Es fundamental una adecuada elección tanto de la fase móvil como de la estacionaria, ya que esto permitirá una adecuada separación de las diferentes moléculas presentes en la mezcla. De acuerdo con Dabrio (2000), la separación puede ser de diferentes tipos:  Por tamaño de la molécula, en este caso hablamos de cromatografía de filtración en gel o de exclusión molecular.  Por carga, nos referimos entonces a cromatografía de intercambio iónico, adsorción o de partición y electroforesis.  Por afinidad.  Por temperatura, utilizando la cromatografía de gases.  Por presión, utilizando la cromatografía líquida de alta resolución.  Por velocidad de elución, utilizando la cromatografía en capa fina o papel. Naturaleza de la fase estacionaria Naturaleza de la fase estacionaria

Sólido Líquido

Naturaleza de la fase móvil

Líquido

Adsorción Exclusión Intercambio iónico Afinidad Partición Líquido-líquido (partición) Líquido-sólido (adsorción, intercambio iónico, exclusión, afinidad) 11

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Gas-líquido (CGL) Gas-sólido (CGS)

Gas

Tabla 1. Tipos de cromatografía más utilizados para la separación de biomoléculas. Fuente: javeriana.edu., 2013.

El principio que rige a la cromatografía es el mismo en todos los tipos anteriormente mencionados, es decir, las moléculas son acarreadas por la fase móvil y son separadas gracias a la fase estacionaria. Más adelante estudiaremos con más detalle cada tipo de cromatografía. Los métodos cromatográficos también pueden clasificarse en función de factores como el estado físico, soporte y mecanismos de separación, también es posible clasificarlos en función del tipo de soluto. Si se habla del estado físico, se hace referencia a la fase móvil !" #$%&' (()*" +, +-%. +/ 0#%&%.+1$%2 , #%3$45)(%. ! X! y a la fase estacionaria; si se hace alusión al soporte, necesariamente se debe especificar ! si se trata de cromatografía papel, columna, etc.; si nos referimos a la cromatografía en G0'+53/%8,#en !/0,?0,3# K! D /'5,. Z D f!g!k f!i j!D /'5,. ZI gk f!gD f! si se trata de adsorción, función del mecanismo de separación,I gdebemos especificar intercambio iónico, reparto, etc.; y+5!*0/!$ finalmente, si$/!'/%4# la cromatografía se +!45# clasifica en función " /!; /$+!%?6,-!$ *+-+!$ #-*3,?0!/3*# 0/( /!: !-/!$+4/5/3,?0!$ ( *3+! 4#5! -/! 3#%4+'+03,/! ) *+! $+! +$'/8-+3+! +0'5+! -#$! ,#0+$! ( +! -/! ; /$+! %?6,-! : ! -#$! ,#0+$! ( +-! del tipo de soluto, debemos hacer referencia si se trata de cromatografía iónica, de /0/-,'#! 4#5! -#$! 3+0'5#$! /3',6#$! ( +! -/! 5+$,0/<! L$'+! ',4#! ( +! 35#%/'#B5/; 2/! $+! *',-,. /! proteínas, etc. (Figura 4).+0! ) *2%,3/! ,0#5B10,3/! 4/5/! -/! $+4/5/3,?0! ( +! ,#0+$! %+'1-,3#$7! /$2! 3#%#! +0! /%4-,/%+0'+! $,$'+%/$!8,#-?B,3#$!4/5/!-/!$+4/5/3,?0!( +!3#%4*+$'#$!,?0,3#$!$#-*8-+$!+0!/B*/<! <0?*+4- 1* 4- 1*!. G><=

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Figura 4. Representación de los principales de separación cromatográfica (tomado 5=M<B%!&' KTK!\+45+$+0'/3,?0!+$) *+%1',3/!(mecanismos +!/-B*0#$!%+3/0,$%#$!( +!$+4/5/3,# 0+$!35#%/'# B51; ,3/$<! de ocw.usal.es., 2013). " /! @B: $ %9: MB%GL%! ; #! #N@><C=D7! '/%8,&0! $+! ( +0#%,0/! 35#%/'#B5/; 2/! ( +! ; ,-'5/3,?0! +0! B+-! #! 35#%/'#B5/; 2/! ( +! 4+5%+/3,?0! +0! B+-<! L0! +--/7!-/! ; /$+! +$'/3,#0/5,/! 3#0$,$'+! +0! *0!$?-,( #!,0+5'+!) *+!3#0',+0+!4+) *+U#$!4#5#$!+0!-#$!) *+!4*+( +0!4+0+'5/5!-/$!%#-&3*-/$!

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. 0/ 1 ( 5( . / . ( + ) ! , 3! 0+ 1 ! 2 3" + , + 1 ! . * + 2 / " + 4 * / 5( . + 1 ! En la figura se muestra un diagrama donde todo+!lo anteriormente " #$! 5%&'# ( #$! 35# %/'# B51; ,3#$ ! 4*+(se +0!resume 3-/$,; ,3/5$ /'+0( ,+0( #! /! ( ,$',0'#$! mencionado. La columna de separación es el principal instrumento de separación, es la ; /3'#5+$K! #C9%; : ! GLC=@: ! ( +! -/$! ; /$+$! %?6,-! : ! +$'/3,#0/5,/! NB/$Z-2) *,( #7! -2) *,( #Z-2) *,( #7! responsable de brindar versatilidad a los diferentes métodos de separación y proporciona, +'3O7! C: A: B9#! *',-,. /( #! N3#-*%0/7! 4/4+-7! +'3O7! $ #@%7=C$ : ! ( +! -/! $+4/5/3,?0! N/( $#53,?07! por lo tanto, amplias posibilidades de variación y de opciones de separación. Esta 5+4/5'#O7!+!,03-*$#!+-!',4#!( +!$#-*'#!N35#%/'#B5/; 2/!,?0,3/7!35#%/'#B5/; 2/!( +!45#'+20/$7! característica, se debe a la amplia gama de posibilidades de elección de materiales para +'3O<!L0!+-!3*/( 5#!( +!-/!; ,B*5/!RS<Q<!$+!%*+$'5/!*0/!3-/$,; ,3/3,?0!+0!; *03,?0!( +!/-B*0#$! las fases móvil y estacionaria. 4/51%+'5#$!%+03,#0/( #$!/0'+5,#5%+0'+<!

R< A*/0( +!*',-,. /!3#%#!;de /$+!%?6,-!*0!; -*,( # !/!45+$,?0!: !'+%4+5/'*5/!$ *4+5,# !/!-/!352',3/!$+!',+0+!*0!',4# ! Figura 5.#!$ Clasificación los métodos cromatográficos (tomado de5+$ ocw.usal.es., 2013). ( +!35#%/'#B5/; 2/!( +0#%,0/( /!( +!G><=; : !C<A#B@BL9=@: <! W< I ( +%1$! ( +! -#$! %+3/0,$%#$! %+03,#0/( #$! +9,$'+0! #'5#$! '/-+$! 3#%#K! G%C#! #7>%?%; %H! =79#B%@@=D7! =D7=@%H! %G=7=; %; H!I <#>%@=D7<! Las columnas cromatográficas permiten separar moléculas que difieren muy poco en sus Q< L-!%+3/0,$ %#!+$!( +!/( $#53,?0!3*/0( #!-/!; /$ +!%?6,-!+0!*0!-2 ) *,( #!4#-/5<! [ < L-!%+3/0,$ %# !4*+( +!$ +5!( +!5+4/5'# !3*/0( # !-/!; /$ +!%?6,-!+$ !*0!-2 ) *,( #!0# !4#-/5! la atracción o propiedades físicas y químicas. Los métodos cromatográficos reflejan

repulsión que presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por el soluto y 5=M<B%!&' KQ<!A-/$,; ,3/3,?0!( +!-#$!%&'#( #$!35#%/'#B51; ,3#$! entre sí. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden deberse a fuerzas de dispersión del tipo London. En cromatografía de intercambio iónico, las fuerzas en las moléculas del soluto son sustancialmente de naturaleza iónica; pero incluyen también fuerzas polares y no polares (Meyer, 2004).

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3.2. MĂŠtodos cromatogrĂĄficos Hay una gran diversidad de mĂŠtodos cromatogrĂĄficos para la separaciĂłn, a su vez, de una gran diversidad de molĂŠculas. Cada mĂŠtodo presenta ventajas y desventajas, lo que es un hecho es que no hay un mĂŠtodo Ăşnico de separaciĂłn de molĂŠculas, por lo que siempre es necesario primero definir el tipo de molĂŠculas a separar, es decir, su estructura, carga, naturaleza, etc. Una vez identificada la molĂŠcula se procede a elegir el mĂŠtodo cromatogrĂĄfico mĂĄs adecuado que permita el aislamiento, purificaciĂłn y, si es posible, la caracterizaciĂłn de la molĂŠcula. A continuaciĂłn estudiaremos los mĂŠtodos mĂĄs importantes utilizados en procesos biotecnolĂłgicos, ya sea para caracterizar molĂŠculas, extractos o para su purificaciĂłn.

3.2.1. CromatografĂ­a de intercambio iĂłnico El intercambio iĂłnico es un intercambio estequiomĂŠtrico de iones entre la fase mĂłvil y la fase estacionaria y generalmente es reversible. En este tipo de cromatografĂ­a juega un papel importante la carga de la molĂŠcula a separar que se encuentra en la fase mĂłvil; si la molĂŠcula tiene carga catiĂłnica, se necesita de una fase estacionaria que tenga aniones; si la molĂŠcula tiene carga aniĂłnica, la fase estacionaria necesariamente debe presentar carga catiĂłnica, por lo tanto se llega a un equilibrio entre cargas. Por lo anterior, es posible utilizar las siguientes relaciones: [−đ?‘…− :đ??ť + ]

−đ?‘… − + đ??ť + ⇄ −đ?‘…− : đ??ť + ; đ??žđ??ť + = [−đ?‘…−][đ??ť+ ] o [−đ?‘…− :đ?‘ đ?‘Ž+ ]

−đ?‘… − + đ?‘ đ?‘Ž+ ⇄ −đ?‘…− : đ?‘ đ?‘Ž+ ; đ??žđ?‘ đ?‘Ž+ = [−đ?‘…−][đ?‘ đ?‘Ž+] En la prĂĄctica el equilibrio no se presenta por separado sino por sustituciĂłn de un ion por otro generĂĄndose el siguiente equilibrio: +

−đ?‘… − : đ??ť + + đ?‘ đ?‘Ž+ ⇄ −đ?‘…− : đ?‘ đ?‘Ž+ + đ??ť ; đ??¸đ??ťđ?‘ đ?‘Ž = +

[−đ?‘…− :đ?‘ đ?‘Ž+ ][đ?‘ đ?‘Ž+ ] [−đ?‘…− :đ??ť + ][đ?‘ đ?‘Ž+ ]

=

đ??žđ?‘ đ?‘Ž+ đ??žđ??ť+

E es conocido como coeficiente de selectividad que, para el ejemplo, serĂ­a la selectividad por los iones sodio. En esta expresiĂłn, las constantes de equilibrio en realidad son coeficientes de distribuciĂłn, ya que varĂ­an con la cantidad de iones sustituidos, esto implica que el gasto de energĂ­a va en aumento conforme se van intercambiando iones, es decir, entre mayor intercambio de iones hay, mĂĄs efectos de repulsiĂłn entre las molĂŠculas (Figura 6). 14

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Figura 6. Intercambio de iones en una columna catiónica (tomado de catedras.química.unlp., 2013).

Los equilibrios teóricos de unión de iones en la fase móvil y cationes en la fase estacionaria dependen de la energía de unión de los enlaces químicos. Se utiliza la teoría de Lewis para determinar la capacidad de atraer u ofrecer electrones del anión o catión. Por ejemplo, el Fe+++ tiene tres cargas positivas, por lo que es un ácido fuerte de Lewis y es, por lo tanto, muy polarizante. El poder polarizante de diversos cationes en orden creciente es el siguiente: Cationes monovalentes Cationes divalentes Cationes trivalentes

Li+>H+>Na+>NH4+>K+>Rb+>Cs+>Ag+>Tl+ Mg++>Zn++>Co++>Cu++>Cd++>Ni++>Mn++>Ca++>Sr++>Pb++>Ba++ Fe+++>La+++>Ce+++>Cr+++

Para el caso de los aniones, la situación es similar, la unión depende de su basicidad de Lewis. Por regla general, a mayor radio atómico se formaran uniones más fuertes. El orden del radio atómico los aniones es el siguiente: F>H>Cl>CN>Br>NO3>I>SCN-

La combinación de cationes y aniones muy polarizables dan como resultado altas energías de enlace, por lo que se tienen altas constantes de formación de complejos y por lo tanto, la presencia de moléculas de alto radio atómico son de gran importancia en la fase estacionaria de una cromatografía de intercambio iónico. Las fases estacionarias se pueden clasificar en función de su poder de unión como: - Fuertes: sitios de unión de aniones y cationes muy polarizables - Intermedios y, - Débiles: sitios de unión de aniones o cationes poco polarizables

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Y tambiĂŠn se clasifican por su naturaleza quĂ­mica en: - Intercambiadores inorgĂĄnicos - PolĂ­meros sustituidos y, - Geles Vamos a hacer ĂŠnfasis en las fases estacionarias por su naturaleza quĂ­mica debido a que dependiendo de su estructura serĂĄ el poder de uniĂłn o de formaciĂłn de enlaces. Los intercambiadores inorgĂĄnicos mĂĄs utilizados son alumino-silicatos (zeolitas), que son activados con ĂĄcidos inorgĂĄnicos, la activaciĂłn tiene como fin generar los grupos que posteriormente se unirĂĄn a las molĂŠculas a separar. Este tipo de materiales son considerados como intercambiadores catiĂłnicos fuertes, son muy baratos y son muy utilizados como desionizadores de agua. Por otro lado, las resinas estĂĄn compuestas de polĂ­meros de diverso origen, las mĂĄs comunes contienen polĂ­meros de estireno entrecruzados con divinil benceno, a este complejo se le conoce como crosslinker y pueden ser funcionalizados con otros grupos funcionales dando origen a una amplia gama de resinas de intercambio iĂłnico, que a su vez es funciĂłn de la cantidad de crosslinker y del grado de sustituciĂłn de grupos funcionales. De manera general, las resinas se pueden funcionalizar con los siguientes grupos: -N(CH3)4+ -NHR2+ -SO3-PO3H-COO-

Intercambio aniĂłnico fuerte Intercambio aniĂłnico intermedio o dĂŠbil Intercambio catiĂłnico fuerte Intercambio catiĂłnico intermedio Intercambio catiĂłnico dĂŠbil

Por otra parte, los geles son polĂ­meros naturales sustituidos o funcionalizados. Generalmente estos polĂ­meros son grandes cadenas de carbohidratos como la celulosa, dextranos y agarosas principalmente. Debido al difĂ­cil control del tamaĂąo de estas molĂŠculas donde generalmente es complicado controlar el tamaĂąo de poro, son utilizados para separar macromolĂŠculas biolĂłgicas como proteĂ­nas o ĂĄcidos nucleicos. Es importante tambiĂŠn determinar la capacidad del lecho intercambiador, esto significa que hay que encontrar el nĂşmero de sitios iĂłnicos disponibles por unidad de peso seco. El nĂşmero de sitios iĂłnicos estĂĄ en funciĂłn directa de la calidad de la funcionalizaciĂłn de la resina y de la porosidad de la misma, entre mĂĄs porosa sea la resina se tendrĂĄ mayor calidad en la funcionalizaciĂłn. La capacidad de la resina se estima a partir de la siguiente relaciĂłn, la cual estĂĄ dada por el nĂşmero de miliequivalentes por gramo de resina o fase estacionaria (meq/g): đ?‘„đ?‘Š =

đ?‘›đ?‘’đ?‘ž đ?‘Šđ?‘

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Donde: neq es el número de miliequivalentes WS son los gramos de resina funcionalizada y seca Si se quiere estimar el número de miliequivalentes por unidad de volumen se debe utilizar la siguiente relación: �� =

��� ��

Ahora bien, durante el proceso cromatogrĂĄfico parte de los iones se encuentran en la fase mĂłvil y otros en la fase estacionaria, esto implica entonces que se presenta un equilibrio o particiĂłn de un ion individual. Si el ion se encuentra en la fase mĂłvil, la concentraciĂłn de iones debe estar dada en milimoles/mL de fase mĂłvil, si el ion se encuentra en la fase estacionaria, la concentraciĂłn de iones se debe dar en milimoles/g de resina. La ecuaciĂłn de equilibrio (coeficiente de particiĂłn) serĂĄ: đ??žđ?‘Š =

[�]�� [�]�

Donde: [M]WR es la concentraciĂłn de la resina por gramo [M]S es la concentraciĂłn normal en el equilibrio intersticial

Para la operaciĂłn de la columna cromatogrĂĄfica se debe tomar en cuenta el coeficiente de particiĂłn respecto al volumen, que se determina a partir de la relaciĂłn siguiente: đ??žđ?‘‰ =

[�]� [�]�

[M]R es la concentraciĂłn de ion en la resina y debe estar en miliequivalentes/mL de lecho. La relaciĂłn entre ambos coeficientes de particiĂłn (peso y volumen) se estima por: đ??žđ?‘‰ = đ??žđ?‘Š

đ?‘Šđ?‘&#x; 1 = đ??žđ?‘Š đ?œŒâˆ— = đ??žđ?‘Š đ?‘‹đ?‘† đ?œŒđ?‘† đ?‘‰đ?‘Ą (đ?›˝ + 1)

Donde: Wr es el peso de la resina seca Vt es el volumen total del lecho hidratado mĂĄs la fase mĂłvil đ?‘Š

ď ˛* son los gramos de fase estacionaria seca/mL de columna rellena ( đ?‘‰đ?‘† ) đ?‘Ą

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XS es la concentraciĂłn del ion en soluciĂłn ď ˛S son los gramos de fase estacionaria hĂşmeda/mL de fase estacionaria đ?‘‰

ď ˘ es la relaciĂłn de fases ( đ?‘‰đ?‘† ) 0

VS es el volumen de resina activada hĂşmeda V0 es el volumen muerto o fase mĂłvil Y el factor de capacidad del lecho se obtiene a partir de KV utilizando la siguiente relaciĂłn: đ?‘˜ ′ = đ??žđ?‘‰ đ?›˝

3.2.2. CromatografĂ­a en capa fina y en papel CromatografĂ­a en capa fina La cromatografĂ­a en capa fina es una tĂŠcnica muy utilizada para la separaciĂłn de molĂŠculas orgĂĄnicas, esta cromatografĂ­a tambiĂŠn conocida por sus siglas en inglĂŠs como TLC (Thin Layer Chromatography) es una tĂŠcnica que permite: - Estimar el grado de pureza de una molĂŠcula - Comparar si una molĂŠcula estĂĄ presente en mĂĄs de una muestra - Dar seguimiento a reacciones orgĂĄnicas

En este tipo de cromatografĂ­a, la fase estacionaria estĂĄ adherida a placas de aluminio, papel, plĂĄstico o vidrio. Esta capa es muy fina y funciona como absorbente tanto de la mezcla como de la fase mĂłvil. La placa con la fase estacionaria es colocada en una cĂĄmara que contiene disolventes que por capilaridad ascienden a travĂŠs de la fase estacionaria (Figura 7). En este movimiento, acarrean a las molĂŠculas que previamente son colocadas sobre la fase estacionaria (Figura 8). Para un correcto funcionamiento, la cĂĄmara debe estar saturada de la fase mĂłvil. Las molĂŠculas migran teniendo un reparto diferencial entre el disolvente (fase mĂłvil) y el adsorbente (fase estacionaria) (Figura 9).

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Figura 7. Cámara para cromatografía en capa fina (tomado de uprm.edu., 2013).

Figura 8. Colocación de la muestra antes de la separación cromatográfica (tomado de doschivos.com, 2013).

Figura 9. Separación de moléculas por cromatografía en capa fina (tomado de triplenlace.com, 2013).

Por lo anterior, es importante una adecuada elección de la fase móvil y de la fase estacionaria. Para la fase estacionaria hay dos materiales que son los más comunes para su uso en este tipo de sistemas de separación, estos son la sílica gel (SiO2) y la alúmina (Al2O3), que son fases polares. Al comparar las fases de las que disponemos se puede concluir que la alúmina es la más activa, es decir, es la que retiene con más fuerza a los compuestos, por lo que es comúnmente utilizada para separar compuestos apolares como hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y cetonas. Por el contrario, la sílica gel se utiliza para separar moléculas polares como alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos, pigmentos, etc. La adsorción de las moléculas por el soporte se debe principalmente a las interacciones dipolo-dipolo, por enlaces por puente de hidrógeno entre el soluto y adsorbentes. Un punto importante es que el adsorbente debe ser inerte, es decir, no debe intervenir en reacciones de ningún tipo. La elución de las moléculas se 19

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ve incrementada por la polaridad de la fase estacionaria y la fase mĂłvil. El eluyente puede ser Ăşnico o por mezclas de eluyentes miscibles todos ellos. Para mejorar la separaciĂłn es comĂşn probar diferentes mezclas de eluyentes a diferentes concentraciones, lo que generarĂĄ mezclas con polaridad diferente. La siguiente relaciĂłn nos permite definir por orden creciente la fuerza eluyente de los disolventes mĂĄs utilizados en procesos de separaciĂłn cromatogrĂĄfica. Hexano<tetraclorometano<cloroformo<diclorometano<acetato de etilo<acetona<2propanol<metanol<agua En la tabla 2 se presentan mĂĄs solventes que comĂşnmente son utilizados como eluyentes. Este tipo de disolventes ademĂĄs poseen caracterĂ­sticas especiales como baja viscosidad y puntos de ebulliciĂłn bajo, lo que permite una rĂĄpida movilidad a travĂŠs de la fase estacionaria. No existe definida una relaciĂłn de mezcla por lo que para determinar las proporciones adecuadas de eluyente para cada proceso cromatogrĂĄfico es necesario realizar pruebas previas. Tabla 2. Solventes utilizados como eluyentes.

La movilidad de las molĂŠculas es determinada por su valor de Rf, que es una relaciĂłn entre la distancia recorrida por el eluyente y por las molĂŠculas separadas (soluto) medidas desde el origen del movimiento (Figura 10). Para calcular el valor de Rf:

đ?‘…đ?‘“ =

đ??ˇđ?‘–đ?‘ đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘›đ?‘?đ?‘–đ?‘Ž đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘?đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘&#x;đ?‘–đ?‘‘đ?‘Ž đ?‘?đ?‘œđ?‘&#x; đ?‘™đ?‘Ž đ?‘šđ?‘œđ?‘™ĂŠđ?‘?đ?‘˘đ?‘™đ?‘Ž (đ?‘‹) đ??ˇđ?‘–đ?‘ đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘›đ?‘?đ?‘–đ?‘Ž đ?‘&#x;đ?‘’đ?‘?đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘&#x;đ?‘–đ?‘‘đ?‘Ž đ?‘?đ?‘œđ?‘&#x; đ?‘’đ?‘™ đ?‘’đ?‘™đ?‘˘đ?‘Śđ?‘’đ?‘›đ?‘Ąđ?‘’ (đ?‘Œ)

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La retención y, por lo tanto, la movilidad de las moléculas depende de varios factores, los principales son los siguientes: 1. Polaridad del compuesto. Los compuestos con alta polaridad se retienen más en la fase estacionaria, mientras que los menos polares eluyen más rápidamente. 2. Naturaleza del disolvente. Entre mayor sea la polaridad del eluyente, mayor será la movilidad de una molécula. Cada valor estimado de Rf es único, ya que está en función de las condiciones en que fue estimado (temperatura, tipo de diluyente, tipo de cámara, tipo de adsorbente). Es muy difícil encontrar valores universales del valor Rf, por lo que si se desea comparar resultados, es necesario comparar muestras que hayan sido eluídas en un misma cámara bajo las misma condiciones, de preferencia, se deben eluír a la vez en una misma cámara cromatográfica.

Frente del disolvente B

A

Y XB XA

Origen Figura 10. Cálculo de Rf. Se toman dos distancias dadas por Y (desde el origen hasta el frente del disolvente) y por X (desde el origen hasta el centro de la muestra). Por el valor de Rf se determina la movilidad de la molécula. Para este caso, la molécula B es más polar que la molécula A, ya que presentó mayor movilidad.

Una vez concluida la cromatografía en algunas ocasiones es necesario revelar la placa, ya que es muy común utilizar este método para separar moléculas orgánicas que no presentan color. En otras ocasiones es suficiente con exponer la placa cromatográfica a luz ultravioleta (UV) con una longitud de onda de 254 nm. El principio es muy sencillo, las placas cromatográficas llevan un indicador fluorescente que absorbe la luz UV emitiendo

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luz visible. Al exponer la placa a la luz UV toda la placa emitirá luz con excepción de la zona donde están las moléculas separadas (Figura 11).

Figura 11. Placa revelada con luz UV, se observa una mancha oscura en la zona donde están las moléculas separadas (tomada de lookfordiagnosis.com, 2013).

Si se presentara el caso de tener moléculas que no absorben luz UV, es necesario utilizar soluciones reveladoras que al ser absorbidas por ellas, generan complejos coloridos que facilitan la identificación. Cromatografía en papel Una variante de la cromatografía en capa fina es la cromatografía en papel. El principio es similar que la cromatografía en capa fina. Hay dos tipos de cromatografía en papel:  Ascendente, donde la molécula es arrastrada por la fase móvil mediante capilaridad  Descendente, donde la muestra y fase móvil se mueven a través del papel por gravedad (Figura 12).

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Temas Técnicas instrumentos Figura 12. Tipos de cromatografía en papel. En la primera (A), la movilidad de la faseemóvil se de análisis cromatográficas son técnicas de movilidad separación,es es por capilaridad debe a un fenómeno Las de técnicas capilaridad y en la segunda (B) la y por la básicos Análisis microbiológicos decir me permiten separarde solutos que están mezclados en un gravedad (tomada blafar.blogia.com, 2013). Análisis inmunoquímicos básicos

disolvente, en función de su afinidad por dos fases Biología diferentes.La fase móvil, puede ser un líquido o un gas en el cual están mezclados las sustancias a separar. La fase estacionaria es el lecho a través deles cual va a moverse la fase de alta pureza, en El papel utilizado en este tipo de cromatografía papel de celulosa móvil.En la cromatografía en papel se utiliza una hoja de Ar chivos donde se coloca la muestra que posteriormente separada papel de celulosa de elevada purezaes recubierta de uncuando capa de el papel agua asociada a lascámara fibras de celulosa, que es la la quefase constituye Mayo 2007 El cromatográfico es colocado en una que contiene móvil adecuada. la fase estacionaria.La fase móvil, en la que irá disuelta la Abril 2007 este tipo principio de separación es similar a la cromatografía en capa fina. Generalmente muestra, es líquida también y está formada por disolvente Marzo 2007 cuyacomún naturaleza se elige en función de de los componentes se de metodología es muy para la separación pigmentosque orgánicos y clorofilas de pretenden separar.Se aplica la muestra sobre el papel en un diversos vegetales, también se puede utilizar para la separación de moléculas orgánicas extremo de éste.Introducción del papel en la cubeta que que necesiten reveladores UV (Figura 13). el papel por capilaridad contieneoelluz disolvente. Éste atraviesa Enlaces arrastrando los componentes de la mezcla.Separación en Tinción Gram función de la afinidad por las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó la muestra, Blog CPR II

Figura 13. Cromatografía en papel, dos usos comunes: separación de pigmentos o colorantes y para pigmentos vegetales como clorofilas (tomado de panreac.com, 2013).

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3.2.3. Cromatografía líquida Ahora nos enfocaremos en la cromatografía líquida, específicamente en la cromatografía líquida de alta eficacia o resolución, comúnmente conocida como HPLC (High Performance Liquid Chromatography). En este tipo de cromatografía la fase móvil circula a través de una fase estacionaria que generalmente es un sólido o un líquido inmiscible. En la fase móvil se encuentran mezclados los analitos que se desean analizar y separar. Cada molécula avanzará a diferente velocidad en función de la afinidad que tengan las moléculas a la fase estacionaria. Es de esperarse entonces que al término del proceso cromatográfico se obtendrán diferentes fracciones con un tiempo de retención diferente. La cromatografía líquida se puede clasificar en función de la fase estacionaria, fase móvil o tipo de separación. La clasificación más útil es aquella que utiliza como referencia la fase estacionaria, ya que ésta define el proceso de separación. De acuerdo con García de Marina (2006), las principales técnicas cromatográficas son las siguientes: 

Cromatografía de adsorción (líquido-sólido). En esta técnica la fase estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en repetidas etapas de adsorcióndesorción. Cromatografía de reparto/adsorción (fases ligadas químicamente). La separación de las moléculas en esta técnica, se basa en un reparto del analito o molécula a separar entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cromatografía de intercambio iónico. En esta técnica la fase estacionaria cuenta en su superficie con grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones de signo contrario que circulan en la fase móvil. Cromatografía de exclusión molecular. En esta técnica de separación la fase estacionaria es un material muy poroso donde sus partículas cuentan con un tamaño determinado, este tipo de material permite el paso de moléculas específicas, según su tamaño (en función del tamaño del poro) haciendo selectivo el paso de ciertas moléculas, de ahí su nombre exclusión molecular.

Si la cromatografía se clasifica en función del mecanismo de retención, hay dos tipos de cromatografía: - Cromatografía de fase normal: En esta cromatografía, la fase estacionaria cuenta con moléculas en su superficie con alta polaridad, las interacciones que se producen con el analito son específicas del grupo activo. La fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente (sílice o alúmina), o bien, un soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que presentan grupos funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc.). - Cromatografía de fase reversa (inversa): La fase estacionaria es poco polar, considerándose como apolar, debido a que cuenta con moléculas como cadenas 24

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hidrocarbonadas o algún otro tipo de moléculas apolares, las interacciones que se generan son inespecíficas (efecto solvófobo). La cromatografía líquida de alta presión no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra, este tipo de cromatografía es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Esta técnica es muy versátil debido a la gran cantidad de fases estacionarias disponibles en el mercado, lo que la hace una de las técnicas más populares para separar e identificar moléculas de cualquier origen. En la figura 14 se muestra el procedimiento de la cromatografía líquida de alta resolución.

Figura 14. Procedimiento de la cromatografía líquida de alta resolución.

Las principales fases estacionarias se presentan en la tabla 3 de ellas se derivan otras fases que varían en el grado de funcionalización. Siendo una técnica muy comercial, las diferentes casas comerciales han desarrollado fases estacionarias muy diversas, solo basta consultar los catálogos comerciales. Tabla 3. Fases estacionarias más comunes utilizadas en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Mecanismo de separación Fase directa

Grupo activo (-R) Sílica

Fase directa Fase directa

-(CH2)3-CN -(CH2)n-NH2

Fase directa Fase reversa Fase reversa

-C18H37 -C8H17 -C6H5

Nombre comercial Nuclosil, Kromasil, Inertsil, Partisil. Nucleosil-CN, Micropak-CN Nucleosil-NH2, Lichrosorb-NH2, Bondpak-NH2. Nucleosil-C18, Lichrosorb RP8. Nucleosil-C8, Lichrosorb RP8. Bondpak-Phenyl

Una de las principales características de la HPLC es el uso de altas presiones (hasta 6000 psi = 414 atm), esto hace que el alto flujo provoque que la fase móvil que acarrea a los analitos a separar, se distribuya uniformemente en toda la fase estacionaria, 25

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generando que las moléculas tengan ese mismo comportamiento (Figura 15), por lo tanto, la separación es más eficiente obteniendo alta especificidad y resultados altamente reproducibles.

Figura 15. Movimiento de moléculas a través de una fase estacionaria durante la cromatografía líquida de alta eficiencia (tomado de upct.es., 2013).

La alta presión utilizada en esta técnica hace que el cuerpo exterior de las columnas esté fabricado de acero inoxidable (Figura 16), estén rellenas de materiales especiales de tamaño uniforme (entre menor sea el tamaño de partícula de la columna, mayor será la eficiencia de la misma) y con fases químicas ligadas a los soportes, lo que hace que se aumente la eficacia y, sobre todo, la resolución de la columna.

Figura 16. Columnas con carcasa de acero inoxidable para HPLC (tomado de anorsa.com, 2013).

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Una variante de la tradicional HPLC es la llamada HPLC de alta velocidad. En esta técnica se utilizan mayores velocidades de flujo de la fase móvil, reduciendo considerablemente los tiempos de análisis, el gasto de disolventes, la dispersión de analitos, los costos y se tiene mayor sensibilidad.

3.2.4. Cromatografía de gases Otra técnica cromatográfica que compite con la popularidad de la HPLC es la cromatografía de gases, de hecho ninguna técnica analítica puede ofrecer mejor capacidad de separación y sensibilidad en el análisis de analitos. El principal límite de esta técnica es que los analitos a separar deben ser muy volátiles, ya que la separación se lleva a cabo en la fase gaseosa. La utilización de la cromatografía de gases está restringida a la separación de compuestos con un peso molecular menor de 1000 å y a una temperatura máxima de trabajo de alrededor de los 400 °C, por lo que la o las muestras a analizar deben ser estables a estas condiciones. Para realizar una separación mediante cromatografía de gases, se inyecta una pequeña cantidad de la muestra a separar en una corriente de un gas inerte a elevada temperatura; esta corriente de gas atraviesa una columna cromatográfica que separará los componentes de la mezcla por medio de un mecanismo de partición (cromatografía gas líquido), de adsorción (cromatografía gas sólido) o, en muchos casos, por medio de una mezcla de ambos. Los componentes separados emergerán de la columna a intervalos discretos y pasarán a través de algún sistema de detección adecuado, o bien serán dirigidos hacia un dispositivo de recogida de muestras (Macnair y Miller, 1997). Los gases a utilizar son inertes ya que no deben tener ningún tipo de interacción con los procesos de adsorción y desorción o con el fenómeno de partición que se presenta en la columna. Sin embargo, la difusión de la fase móvil a través de la fase estacionaria si depende del tipo de gas acarreador, por lo tanto las curvas de Altura Equivalente de Plato Teórico (AEPT) variarán en función del gas acarreador utilizado (Figura 17). La AEPT se define como la longitud de columna equivalente al plato teórico, es decir, la longitud de relleno tal que las corrientes que abandonan la columna por su parte inferior y por su parte superior están en equilibrio. Si se conoce el valor de la AEPT, el cálculo de la altura es muy sencillo, basta con aplicar la relación anterior. Estimar el valor de la AEPT es muy difícil debido a que depende de factores como: el tipo, tamaño y naturaleza de la fase estacionaria, el caudal de las fases, las concentraciones de ambas fases, la temperatura de operación, la presión, etc. Una forma de obtener este valor es a través de prueba y error o por similitud con procesos de separación similares, pero se corre el riesgo de que al momento de extrapolar con nuestro proceso de separación no se obtengan los

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resultados esperados. Las metodologías más confiables para obtener el valor de la AEPT son las siguientes:

Estimación. Es la determinación experimental en condiciones similares a las de la columna a diseñar, es el método más seguro de determinarlo.

Correlaciones. Se han hecho muchos intentos de correlacionar la AETP con las variables del sistema, la más aceptada es la ecuación para rellenos de
anillos Raschig y operaciones gas-líquido.

Figura 17. Curvas de AEPT en función de tres gases acarreadores (nitrógeno, helio e hidrógeno) (tomado de mncn.csic.es., 2013).

Los gases utilizados en la cromatografía de gases son de alta pureza y deben estar en estado anhidro, estos gases deben estar almacenados en recipientes adecuados, ya que deben suministrarse a una presión constante durante la cromatografía. El tipo de gas a utilizar en esta técnica depende del metabolito a separar y del tipo de detector del equipo. La cromatografía de gases es una técnica muy versátil, por lo que hay una gran variedad de detectores que, dependiendo de la molécula a separar, será el detector a utilizar. Así, si se desean separar compuestos orgánicos se puede utilizar un detector de ionización de flama o de fotoionización UV, si se desean separar moléculas halogenadas se puede utilizar un detector de captura de electrones o para detectar compuestos nitrogenados es recomendable utilizar un detector de ionización de helio. También hay detectores 28

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universales que pueden ser utilizados para una gran diversidad de moléculas tanto orgánicas como inorgánicas. En la tabla 4 se presenta un resumen del tipo de detector, gas acarreador y tipo de análisis a utilizar.

Detector

Termoconductividad (TCD)

Ionización de flama (FID)

Captura de electrones (ECD)

Ionización de Helio (HID)

Fotométrico de flama (FPD)

Fotoionización UV (PID) Espectrómetro de masas (GC/MS)

Descarga fotoionizante (DID)

Ultrasonido (USD)

Emisión atómica (AED)

Gas Nitrógeno Helio Hidrógeno Argón Helio Nitrógeno Argón Hidrógeno 40 % H2/He 40 % H2/N2 Aire Helio Hidrógeno 5 % CH4/Ar 10 % CH4/Ar Aire Helio Hidrógeno Nitrógeno Aire Helio Hidrógeno Nitrógeno Helio Hidrógeno Nitrógeno Helio Nitrógeno Argón Argón Helio Hidrógeno Nitrógeno Helio Hidrógeno Nitrógeno Helio Hidrógeno Nitrógeno

Análisis

Detector Universal

Compuestos orgánicos

Compuestos halogenados Compuestos electromagnéticos

Compuestos nitrogenados o fosforados

Compuestos azufrados o fosforados

Compuestos orgánicos

Todo tipo de compuestos

Detector universal

Detector universal

Detector universal o específico

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Oxígeno Tabla 4. Principales gases acarreadores y detectores utilizados en la cromatografía de gases.Fuente: praxiar.com, 2013.

La elección de la columna también es un factor de suma importancia en la cromatografía de gases. En la columna es donde sucede la separación, por lo que una mala elección influirá en una mala separación. Una columna cromatográfica de gases puede estar fabricada de diferentes materiales (todos ellos inertes), dentro de la columna se encuentra la fase estacionaria, esta fase puede ser un sólido activo o un sólido que contiene un líquido depositado, el cual es necesario para la separación. Los principales tipos de columnas son: Columnas empaquetadas. Estas columnas están construidas de acero inoxidable con un diámetro de entre 2 y 5 mm y un largo de 1 a 15 m (Figura 18). Dentro de este tubo se encuentra la fase estacionaria en forma líquida (cromatografía gas-líquido) y que a su vez, está adherida a un sólido que está finamente pulverizado, comúnmente, las partículas del sólido son de 5 a 10 veces más pequeñas que el diámetro de la columna.

Figura 18. Columnas empacadas para cromatografía gas-líquido (tomado de uib.es., 2013).

Columnas tubulares abiertas. Estas columnas son también conocidas como columnas capilares (Figura 19). Son columnas tubulares fabricadas de vidrio o de sílice fundida, su diámetro va de 0.2 a 0.8 mm, la longitud varia de 15 a 50 m, debido a su longitud presentan una elevada eficiencia (de 30,000 a 50,000 platos teóricos) por lo que permite la separación de mezclas complejas con gran eficiencia. El principal problema que 30

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presenta este tipo de columnas es la pequeña capacidad de carga (alrededor de 1 L como máximo). Dentro de la columna capilar se encuentra la fase estacionaria distinguiéndose de dos tipos: 

Columna WCOT (Wall Coated Open Tubular). En estas columnas se encuentra la fase estacionaria en forma de una película líquida unida a las paredes del tubo capilar. Columnas PLOT (Porous Layer Open Tubular). Para este caso, la fase estacionaria que es sólida, recubre el interior de la columna, la fase está formado de un soporte adsorbente y es donde se realiza la separación.

Figura 19. Columnas para cromatografía de gases capilares (tomado de tecrom.com, 2013).

Ya se ha hablado de los soportes sólidos que son utilizados para fijar la fase estacionaria que es líquida. Los soportes sólidos deben cumplir una serie de requisitos para que el sistema funciones adecuadamente. Los principales requisitos son: 1. Deben contar con una superficie específica relativamente alta para facilitar que la fase estacionaria se distribuya uniformemente. 2. Deben ser porosos para evitar excesivas caídas de presión. 3. Deben ser duros para evitar la ruptura de las partículas. 4. Deben ser estables térmicamente por lo que no deben sufrir cambios en su estructura a altas temperaturas. 5. Deben ser químicamente inertes. 6. No deben presentar adsorción de moléculas para evitar interferencias en la separación.

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No existe el soporte ideal por lo que antes de montar una técnica es necesario definir el mejor soporte para el proceso de separación. El soporte más común son las tierras de diatomeas sinterizadas debido a que son muy resistentes a tratamientos químicos y resisten altas temperaturas. Finalmente vamos a referirnos a la fase estacionaria. Es la fase donde se llevan a cabo las interacciones moleculares y es la responsable de la separación. Al igual que los soporte, no existe la fase estacionaria perfecta y por lo tanto, antes de iniciar un proceso de separación, debe elegirse la mejor fase estacionaria. Las principales propiedades que deben cumplir la fase estacionaria son las siguientes:      

Tener un intervalo de temperatura lo más amplio posible (-60 a 400 ºC) Presentar una presión de vapor lo más bajo posible, para facilitar su evaporación Ser estable en el intervalo de temperatura donde se utilizará Ser químicamente inerte Presentar baja viscosidad en las condiciones de trabajo Impregnar todo el soporte y presentar baja movilidad cuando se aplica la fase móvil.

El siguiente factor, y no menos importante, es que la fase estacionaria debe ser selectiva para las moléculas que se desean separar. Para mejorar la selectividad es común utilizar polímeros líquidos de elevado peso molecular. Las interacciones que suceden entre la fase estacionaria y el analito son cualquiera de las siguientes:  Fuerzas de dispersión. Generadas por los campos eléctricos producidos por los dipolos generados por el movimiento de fases.  Fuerzas de inducción. Debidas a la interacción electrostática generada por la formación de dipolos.  Fuerzas de orientación. Que se forman por la interacción de dipolos permanentes.  Fuerzas donador-aceptor. Que se forman por interacciones químicas débiles. Con base en estas características se puede predecir la forma del cromatograma, por ejemplo para compuestos polares generalmente las moléculas de mayor tamaño saldrán primero que las de menor tamaño debido a que predominan fuerzas de inducción y orientación, para compuestos no polares la separación sucederá en función del punto de ebullición (en orden correspondiente) ya que predominan fuerzas dispersivas.

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3.2.5. Equipo cromatográfico Concluiremos este tema haciendo una revisión de las principales configuraciones de equipos que podemos encontrar en empresas con carácter biotecnológico. Vamos a hacer énfasis en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y en la cromatografía de gases que son las principales técnicas de separación, identificación y purificación de biomoléculas. Iniciaremos con el HPLC. La configuración más sencilla se muestra en la Figura 20. Esta configuración consta de un reservorio de solvente (fase móvil), de un desgasificador, una bomba de pistón, un inyector, una columna, un detector y una unidad de análisis. Las principales variantes de estos equipos inicia con el desgasificador, este accesorio es fundamental ya que elimina el exceso de aire de la fase móvil evitando la formación de burbujas en la tubería, columna y detector evitando el daño del sistema y lecturas inespecíficas, posteriormente sigue la bomba de pistón que puede elevar la presión del sistema hasta los 6000 psi, la presencia de una bomba implica que solo se generarán flujos isocráticos es decir flujos con una sola característica, esto implica que previamente se tendría que definir la composición de la fase móvil por lo que no se tendría la versatilidad de cambiar concentraciones y por lo tanto la polaridad de la fase móvil durante el proceso cromatográfico. La adición de una segunda bomba convierte al HPLC en un equipo más funcional y versátil. Esta segunda bomba permite utilizar de manera separada dos solventes lo que permite que durante el proceso de separación se generen diferentes mezclas con diferente polaridad lo que mejorará de manera sustantiva la separación de moléculas (Figura 21). Esto es de suma importancia ya la polaridad de la fase móvil es fundamental para la separación de moléculas. Posteriormente se tiene el inyector que puede ser manual o automático. Un inyector debe cumplir con varias características las principales son que debe facilitar que la muestra se introduzca a la columna en una banda lo más estrecho posible, debe ser de fácil manejo, debe dar lugar a resultados reproducibles y trabajar a altas presiones. Hay dos tipos de inyectores, los de jeringa y los de válvula. En los primeros la muestra se introduce por medio de una jeringa que coloca la muestra en la cabeza de la columna. Este tipo de inyectores son económicos pero presentan el problema que no generan resultados reproducibles, trabajan a bajas presiones y son difíciles de manejar (Figura 22). El inyector de válvula es más eficiente que el primero, su funcionamiento se divide en dos etapas, en la primera primero de llena el “loop” a presión atmosférica y con ayuda de válvulas lo que evita una disminución de la presión interna del sistema, posteriormente se abren otra válvula que permiten el paso de la fase móvil a la presión de trabajo (Figura 23). Este sistema permite una alta reproducibilidad en el análisis de muestras. La columna es el siguiente accesorio de importancia.

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Reservorio de solvente

Procesamiento de datos Bomba

Muestra

Columna

Detector

Inyecto r

Desecho

Figura 20. Configuración más sencilla de un HPLC (Flujo isocrático). Reservorio de solvente 1

Reservorio de solvente 2

Bomba 1

Bomba 2

Procesamiento de datos

Generado r de gradiente Muestra

Columna

Detector

Inyector

Desecho

Figura 21. Sistema binario de bombeo para un HPLC.

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Figura 23. Inyector de válvula de un HPLC (tomado de mncn.csic.es, 2013). ( 9DG@ 7*] IJ*, =[ ?; ; 9<=*B ?>97=C?*KQ6KG67*>?*Z*KE78

La columna es el siguiente accesorio del equipo y es donde se realiza la separación de las moléculas, en; ; 9temas anteriores ya se ha discutido sobre la importancia y tipos de ! A=>G A=?8*[ *; A =?^9A=?8 fases con las que se cuenta para el diseño de un sistema de separación. Es importante señalar que paraN+( ciertos es necesario a cierta temperatura lo +$K"$)análisis #$*+, +*' 1+-$/"$% &)#) , *'"$1) que $2+/F(la) ,columna ) #$( . ) &0+#$)este #$. , +$1) $/+#$4& ", 1) # %&+8/) ( "#$ 1) $/+#$ ) I . ' %+#$1) $al *&+(equipo, "0+4&"6L"$para 1) $/LI . ello ' 1+#-$K "$I .común ) $3#0+#$1",el$+& '4) , $"$ %3& 1'1"#$) , $/" hornos que hace todavía más eficiente es uso de pequeños 6' *"*'"$1) /$#' #0) ( "$K-$% ", 0+-$) , $/"$*"% "*' 1"1$1) $#) %"& "*' B, =$G, $%"&0' *.a/"& -$0+1"#$/"# que cubren) completamente a +& la$/+$0 columna y cuya función es mantener temperatura *+, 1. **' +, ) #$K $*+, ) V ' +, ) #$) , 0 & ) $', K ) *0 +& $K $*+/. ( , "-$K $) , 0 & ) $*+/. ( , "$K $1) 0 ) *0 +& $#+, $1) $/" Cabe constante a la columna mejorando la movilidad y separación de las biomoléculas. ( 5V ' ( "$ '( % +& 0 ", *'"= también señalar que previo a la columna debe haber una precolumna cuya función es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evitar el paso de partículas que puedan dañar a la columna de separación. El siguiente accesorio es el detector, este dispositivo permite medir la concentración de una cierta molécula o moléculas presentes en el líquido de salida de la columna de separación. Las principales características de un detector son las siguientes: -

Respuesta. La respuesta deberá ser proporcional a la concentración del analito que está eluyendo de la columna, la respuesta debe ser lineal preferentemente. Ruido. Se considera ruido a perturbaciones de la señal de salida y que no es causada por la salida del analito. Deriva. Este se genera a partir de la variación de la señal de base a lo largo del tiempo. Sensibilidad. Es la concentración mínima que puede detectar el detector. Rango dinámico. Es la concentración de analito donde la respuesta depende de la concentración de salida de analito.

Los detectores se pueden dividir en dos grandes grupos: los que aportan información estructural (como los de infrarrojo por transformada de Fourier FT-IR, UV-Vis y de matriz de diodos principalmente) y los que aportan información de concentración. Los primeros no son de uso común en HPLC. Los segundos son los más comúnmente utilizados. Los detectores más comunes para equipos HPLC son: a. Detector de índice de refracción (Figura 24). Mide el cambio del índice de refracción de las muestras que van eluyendo de la columna. Para que haya buena resolución necesariamente debe haber diferencias del índice de refracción del analito y de los demás componentes, entre mayor sea esta diferencia, mejor será la sensibilidad del detector.

Figura 24. Refractómetro de desviación de has óptico (tomado de elblogdeadepi.blogs., 2013).

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b. Detector UV-Visible (Figura 25). Este tipo de detectores captan la energía generada a partir de la excitación electrónica de grupos específicos funcionales (-NH2, -C=C-, -(C=C)2, bencenos, bifenilos, quinoleínas, antracenos, etc.). Esta energía se genera a partir de la radiación electromagnética cuando se hace pasar la muestra a cierta longitud de onda.

Figura 25. Detector UV-Visible de longitud de onda variable (tomado de espectrometría.com, 2013).

c. Detector de fluorescencia (Figura 26). Los detectores de fluorescencia detectan grupos funcionales específicos que se excitan a una longitud de onda determinada pero que emiten radiación a una mayor longitud de onda que la que absorben. Este tipo de detectores son utilizados para evitar interferencias o para corroborar ciertas estructuras químicas.

Figura 26. Funcionamiento de un detector de fluorescencia (tomado de institutocopernico., 2013).

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d. Detector electroquímico (Figura 27). Este tipo de detectores se basan en la oxidación de analito que durante este proceso, emite cierta intensidad de corriente que es captado por un electrodo adecuado gracias a la electrólisis de o de los analitos.

Figura 27. Célula de flujo de un detector amperométrico (tomado de mazinger.sisib.uchile., 2013.

e. Detector de conductividad electrolítica (Figura 28). Este tipo de detectores miden la conductividad de la fase móvil, un cambio en la conductividad es indicativos de la presencia de los analitos presentes en la fase móvil.

Figura 28. Célula de flujo de un detector de conductividad (tomado de mncn.csic, 2013).

Finalmente se tiene el analizador el cual es el encargado de analizar e interpretar los cromatogramas obtenidos. Afortunadamente los actuales equipos cuentan con software especializado que nos facilita la tarea de la interpretación de datos. Es claro que la interpretación de resultados dependerá de la calidad del cromatograma por lo que habrá que aplicar los conceptos antes estudiados para ir afinando el sistema de separación por HPLC. Ahora estudiaremos la cromatografía de gases, en temas anteriores ya se ha estudiado la importancia de las columnas, de los detectores y fases por lo que con la información que a continuación se expondrá se complementará lo ya estudiado. 38

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Un cromatógrafo de gases está formado por los siguientes componentes: (1) Fuente de gas; (2) Sistema de inyección; (3) Horno y columna cromatográfica; (4) Sistema de detección y, (5) Sistema de registro (Figura 29).

Figura 29. Componentes de un cromatógrafo de gases (tomado de mncn.csic., 2013).

Los gases utilizados en este método no deben interferir la separación por lo que deben ser inertes. Hay que recordar que el tipo de gas tiene efecto sobre la velocidad óptima de la fase móvil y en los tiempos de análisis. Los gases suelen estar almacenados en cilindros almacenados a alta presión que facilitan su manejo, El control de velocidad se realiza a través de válvulas que proporcionan un caudal y presión constante. Los gases deben pasar a través de filtro o de desecadores para mejorar el proceso de separación. Una parte importante del equipo es el horno del cromatógrafo. La función del horno el llevar a la columna a la temperatura de trabajo así como el evaporar las fases involucradas en la técnica. El horno debe ser muy preciso (con aumento de temperatura o mantenimiento del orden de  1 ºC). El horno debe ser capaz de aumentar la temperatura a la velocidad programada a una velocidad constante. Todos los hornos deben tener una escasa o nula inercia térmica y ser controlado por un sistema que permita su programación a diferentes temperaturas. Los inyectores son parte esencial del equipo, el objetivo de los dispositivos de inyección es la de vaporizar la muestra a analizar e incorporarla a la fase móvil (fase gaseosa). Se deben cumplir los siguientes requisitos:   

Instantánea vaporización de las muestras La vaporización debe ser total Las muestras deben llegar a la columna lo más compacta posible

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Los inyectores para cromatografía de gases se clasifican en dos tipos: inyectores para columnas empaquetadas e inyectores para columnas capilares. Los inyectores para columnas empaquetadas (Figura 30) son muy fáciles de utilizar y no presentan problemas particulares en su manejo, generalmente, este tipo de columnas aceptan mayores volúmenes de inyección sin observarse una caída significativa en la sensibilidad de la columna.

Figura 30. Inyector para columnas empaquetadas (tomado de es.wikipedia., 2013).

Este tipo de inyectores están cubiertos de un metal buen conductor de calor que mantiene caliente la cámara de mezcla esto hace que la muestra inyectada se vaporice inmediatamente y que sea arrastrada por la fase gaseosa. Los inyectores para columnas capilares (Figura 31) funcionan de manera similar que los inyectores de columna empacada pero con la diferencia que el volumen de inyección es mínima (< 1 L). Las columnas capilares son muy afectadas por disolventes por esta razón se deben inyectar volúmenes muy pequeños. Para evitar problemas, existen otros sistemas que evitan que se inyecten grandes cantidades de muestras y que lleguen a afectar la eficiencia de la columna capilar.

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Figura 31. Inyector de Split para cromatĂłgrafo de gases (tomado de mncn.csic., 2013).

Una configuraciĂłn comĂşn son los inyectores de Split (Figura 31) que frente a un exceso de muestra, automĂĄticamente abre una vĂĄlvula dejando escapar parte del gas con la muestra a la atmĂłsfera regulando la entrada de fase mĂłvil a la columna. Si se trabaja con sistemas automĂĄticos de inyecciĂłn esta se lleva a cabo con inyectores controladas por vĂĄlvulas. Este tipo de inyectores son del tipo de seis vĂ­as y son fabricados para diferentes volĂşmenes de inyecciĂłn, su funcionamiento es muy parecido a los inyectores de HPLC. Respecto a los detectores, en la tabla 4 se mostraron los tipos de detectores mĂĄs utilizados en la cromatografĂ­a de gases, analizaremos un poco mĂĄs sobre los mismos. La seĂąal del detector se determina a partir de la siguiente relaciĂłn: đ?‘† =đ?‘˜âˆ—đ?‘Žâˆ—đ?‘ Donde: k = constante propia del detector a = Magnitud de la seĂąal del detector N = NĂşmero de molĂŠculas eluidas La seĂąal que se obtiene del detector en un momento dado esta dada por la suma de todas las seĂąales, por lo tanto la seĂąal en un tiempo dado es: đ?‘†đ?‘Ą = đ?‘†đ?‘” + đ?‘†đ?‘– + đ?‘†1 + đ?‘†2 + â‹Ż La seĂąal que se obtiene por el detector por ausencia de analitos se le llama seĂąal de fondo del detector. 41

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La sensibilidad del detector se estima con la seĂąal medida (ď „S) que se origina por el cambio en la concentraciĂłn en el gas portador de la sustancia eluida (ď „NS). La expresiĂłn utilizadas para estimar la sensibilidad es: Δđ?‘† = đ?‘˜đ?‘Žđ?‘† Δđ?‘ đ?‘† Otro factor importante es la linealidad del detector que es donde la concentraciĂłn es proporcional a la seĂąal del detector (Figura 32). La linealidad se estima a travĂŠs de la obtenciĂłn de los logaritmos de la concentraciĂłn y de la sensibilidad. log đ?‘† = log(đ?‘˜đ?‘Žđ?‘† ) + 1 log đ?‘ đ?‘†

Figura 32. GrĂĄfico obtenido al linealizar la concentraciĂłn y la seĂąal de respuesta del detector (tomado de mncn.csic., 2013).

Finalmente, cuando se obtiene un cromatograma es fundamental interpretarlo adecuadamente. En muchas ocasiones la seĂąal de un analito puede confundirse con la seĂąal de fondo o ruido del detector (Figura 33). Es comĂşn que el ruido del detector oscile alrededor de la seĂąal del analito por lo que el valor de la seĂąal correspondiente a la mĂ­nima cantidad detectable debe calcularse en base al incremento de seĂąal necesario, es decir, deben de realizarse mĂĄs de una lectura para identificar la seĂąal deseada. Por regla general se considera que si el valor de una seĂąal es dos veces superior a la seĂąal de ruido se tiene una probabilidad del 95 % que esa seĂąal corresponda a un analito, si esa diferencia aumenta a 2.65, la probabilidad aumenta a 99 %.

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Figura 33. Parámetro a tomar en cuenta (señal/ruido) para detectar señales correspondientes a analitos (tomado de ifent.org., 2013).

3.3. Usos de la cromatografía En temas anteriores se estudiaron los principios y fundamentos así como las técnicas y equipos más comunes en los diversos procesos cromatográficos. Es claro que los métodos han evolucionado de tal forma que actualmente se cuentan con algunas hechas a la medida para la separación de ciertos metabolitos de interés biotecnológico. A continuación se estudiaran algunas aplicaciones de la cromatografía para el estudio, separación, purificación y caracterización de algunas moléculas de origen biológico y que tienen un amplio rango de aplicación en procesos biotecnológicos.

3.3.1. Separación de enzimas Uno de los principales usos de la cromatografía en la industria biotecnológica es la purificación de proteínas o enzimas. Las enzimas son la base de la biotecnología debido a que en todo proceso biológico están involucradas reacciones de catálisis que son mediadas por enzimas. Las enzimas tienen una amplia gama de aplicaciones como por ejemplo en la industria de los detergentes llamados “biológicos”, estos detergentes están suplementados con enzimas lipasas que facilitan la degradación de las grasas, en la industria farmacéutica las tendencias actuales es el uso de enzimas para la síntesis de medicamentos específicos ya que estas son capaces de llevar a cabo reacciones químicas específicas, en la industria de los alimentos las enzimas son utilizadas por ejemplo para la clarificación de jugos naturales ya que son capaces de hidrolizar a 43

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compuestos causantes de turbidez en el jugo. Antes de la aplicación a cualquier proceso es fundamental el estudio cinéticos de las enzimas, es decir, saber su velocidad de reacción, su afinidad por sustrato y su inhibición principalmente que es posible saberlo cuando es caracterizada una enzima que previamente fue sujeta a un proceso de purificación. Los métodos cromatográficos disponibles para la purificación de enzimas son muchos, debe quedar claro que cada enzima es única y representa un reto único para su purificación pero también es posible generar métodos generales de purificación cuando se trabajas con clases de enzimas similares con sus debidas restricciones. El proceso de purificación de enzimas comienza con la estimación del punto isoeléctrico que nos indicara el pH adecuado con que se debe iniciar este proceso, posteriormente se debe elegir una técnica cromatográfica adecuada, generalmente se habla de intercambio iónico, exclusión molecular, isoelectroenfoque o una técnica de afinidad. Cuando se logra que la enzima interaccione con el soporte con el soporte elegido se tiene que separarla a través de un cambio en la fuerza iónica, esto se logra aplicando gradientes salinos a la columna que como resultado, se despegará la enzima del soporte que será colocada en diferentes fracciones. Durante este proceso se debe monitorear el proceso de purificación a través de la cuantificación de la actividad enzimática, concentración de proteína y a través de electroforesis. El proceso de separación puede repetirse varias veces utilizando la misma columna con diferentes condiciones o cambiado la columna para mejorar la resolución y la purificación (Figura 34). A continuación vamos a presentar algunos ejemplos de purificación de enzimas para ser más específicos en este tema.

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Extracto enzimático

Punto Isoeléctrico

Separación cromatográfica No

Electroforesis ¿Esta pura? Si Enzima purificada

Figura 34. Proceso general de un método de purificación de enzimas.

Medina y col. (2008), desarrollaron un proceso de purificación de la enzima fotorreceptora rodopsina de retinas de ojos de bovino. Esta proteína es la encargada de captar lo fotones de luz a través del 11-cis-retinal isomerizándolo a 11-tras-retinal desencadenando una serie de reacciones biológicas concluyendo en el cerebro. El proceso de purificación de esta proteína implico la extracción de la proteína a partir de ojos de bovinos utilizando métodos químicos y para la purificación se utilizaron técnicas cromatográficas como exclusión molecular y cromatografía de afinidad utilizando como fase estacionaria Sephacryl S-300. En la Figura 35 se muestra el proceso de purificación de la enzima. Los autores muestran un tren de purificación donde identifican diferentes etapas de purificación observándose por electroforesis, que conforme aumentan los pasos de purificación van obteniendo mayor grado de purificación.

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Figura 35. Proceso de purificación de la Rodopsina. En el carril 1 se observa el extracto crudo (sin purificar). Los carriles 2, 5, 6, 7 y 8 muestran el proceso de purificación y los carriles 3 y 4 son las membranas no retenidas por la columna cromatográfica (Medina y col., 2008).

Las técnicas cromatográficas de purificación también pueden ser utilizadas para la purificación y caracterización de enzimas producidas por hongos filamentosos como en el caso de la enzima fenol oxidase producida por el hongo filamentoso Scytalidium thermophilum. Sánchez-Rosario y col. (2011) purificaron parcialmente esta enzima a partir de un extracto crudo. Después de un proceso preparativo que incluyó filtración, concentración y centrifugación se utilizó una columna cromatográfica de intercambio iónico utilizando como fase estacionaria DEAE Sephadex, Las proteínas fueron eluídas con una solución amortiguadora de Tris-HCl 10 mM a pH 8 con 500 mM de NaCl. El proceso de purificación se observa en la figura 36. Los autores obtuvieron una purificación parcial (tal y como se muestra en el gel de electroforesis) la cual les permitió la caracterización posterior de la enzima. Este tipo de resultados es muy importante ya que antes de desarrollar el sistema de purificación hay que definir el futuro uso de la enzima, por ejemplo, el uso de lipasas para detergentes no necesita de enzimas puras, el extracto crudo es suficiente, sin embargo, si la lipasa se utiliza para la industria farmacéutica, necesariamente son indispensables enzimas purificadas hasta homogeneidad.

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U3 SM

D1

D2

D3

D4

D5

KDa 1 20

250

10

130

0

Medio

mU/ml

95

20

72

10

55

2

L A IN IG R O

Y

Cromatografía

3

87 KDa

0

Tiempo

Sánchez-Rosario, Y. et al. Producción y caracterización de la fenol oxidasa de Scytalidium thermophilum

36 ión de cepas, medio y tiempo sobre la l oxidasa de S. thermophilum durante su 28 uadro superior -izquierdo interacción cepa uadro superior -derecho interacción cepa erior -derecho interacción medio -tiempo. Figura 36. Purificación de una enzima polifenol oxidasa producida por el hongo filamentoso S-0601; ECS-0602 y ECSFigura 5. Gel electroforético de la fenol oxidasa de S. thermophilum Scytalidium thermophilum una de purificación que en cargado ase unaobserva concentración 6.869 U/mg.parcial Línea 1 ya marcador de el carril 3 después que infusión de pasto (GI) ; el extracto almidón crudopeso fuemolecular; sometidolínea al proceso cromatográfico se observan 2, 39.75 µg de proteína, línea 3, 13.25 µg de más de una enzima pa-dextrosa-levadura (PDY). (Sánchez-Rosario col., 2011). proteína parcialmente purificada de fenoly oxidasa.

Otro uso común de las técnicas cromatográficas para la separación de enzimas o proteína fue el dado por Leiva y col. (2009) que desarrollaron una técnica cromatográfica para purificar una enzima serin proteasa encontrada en el(Machuca veneno yde la serpiente Crotalus base de aserrín de Eucalyptus grandis Duran, ón durissus. Esta proteasa asociada efecto que causa veneno de serpiente llamado 1993). está Sin embargo, estealdato contrasta con los el observados alteración hemostásica, que son cambios en los mecanismos de interrupción de se determinaron las condiciones de para la cepa ECS-0603 que presentó la máxima producción hemorragias, éste es el primer paso hacia la coagulación de la sangre. La metodología de entre pHparcial 6.5 y 7.5utilizando con una actividad extracelular de cultivo, temperaturapurificación y pH) de la enzima incluyóenzimática un aislamiento la técnica cromatográfica de exclusión más baja. molecular usando fase estacionaria Sephadex G75. Posteriormente se llegó a una cepas de S. thermophilum. Así mismo, se como purificación utilizando técnica de cromatografía por afinidad La cepa ECS-0602 nola presentó crecimiento a pH 6. y caracterizar la enzima de la cepa hasta más homogeneidad utilizando como fase estacionaria Benzamidina-Sepharosa 6 B. En la figura 37 se muestra vidad fenol oxidasa fue detectada durante Este resultado difiere parcialmente de los resultados el gel de electroforesis donde los autores alcanzan la purificación de la enzima hasta por Sánchez al. (2008) en un de medio s tres medios de cultivo a 45°C. La cepa El reportados homogeneidad. caso anterior es unaetclara muestra quedelacultivo aplicación de la enzima es sólido caja de Petri, ya que esta la cepa S. thermophilum ECS- una purificación total laelque define el grado deenpurificación, para caso, era necesario producción más alta en medio infusión de laoxidasa enzima posterior del comportamiento esta enzima y su papel en el 0601 mostró el crecimiento más alto a valores de de pH de 7-8 y áxima producción de fenol fue para de estudio efecto tóxico en el veneno de Crotalus durissus. Los anteriores ejemplos solo son una egundo día de incubación. Esta actividad una tasa de crecimiento de 0.3 mm/h a pH 6. Sin embargo, esta pequeña muestra de los usos de las técnicas cromatográficas para la separación de diferencia puede deberse las características particulares La del gran diversidad de r que la obtenida pormoléculas Ögel et al. (2006) biológicas para nuestro caso,a de enzimas o proteínas. medio cultivo y a lade cepa. 75 mU/ml, aunque se debe considerar que todo técnicas y sobre deldedesarrollo nuevas fases estacionarias hacen que la cromatografía sea actualmente una técnica muy común el estudio de moléculas de La producción más alta de enzima fuepara observada en mizaron la producción de la fenol oxidasa diverso origen. No hay límites en cuanto técnicas ni tampoco están restringidas a cierto e las diferencias en producción de la fenol el medio GI, probablemente por la presencia de oligómeros de organismos, el límite es nuestra capacidad y disposición de equipos y materiales y sobre lignina en la infusión de pasto; aunque en este medio no se ión de biomasa de S.todo thermophilum fue del el uso futuro producto purificado.

bos estudios y se situó entre 5 y 6 g/L.

presentó ni el crecimiento ni el consumo de glucosa más altos.

e mayor producción enzimática, el pH del

Esta observación concuerda con lo expresado por Ögel et al.

s ECS-0601 y ECS-0602 fue de alrededor

(2006), quienes indicaron que la presencia de compuestos

e pH es similar a los observados para la

fenólicos induce la expresión enzimática. Por otra parte, es

ermoascus aurantiacus en medio líquido a

comprensible que los azúcares simples presentes hayan

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Figura 37. Purificación de la serin proteasa presente en el veneno de Crotalus durissus. En la figura B se observa la presencia de una sola proteína lo que nos indica una purificación hasta homogeneidad (Leiva y col., 2009).

3.3.2. Separación de pigmentos La cromatografía es una técnica muy popular para el estudio y caracterización de pigmentos biológicos. Este tipo de moléculas son muy apreciadas en la industria biotecnológica debido a sus bondades. Debido a su origen, son moléculas biodegradables por lo que su uso se ha extendido a la industria de los alimentos, farmacéutica y química. Las fuentes de pigmentos naturales son muy diversas, se pueden obtener de microorganismos, plantas e insectos principalmente. La demanda de pigmentos de origen natural día a día crece por su menor impacto ambiental, es por esta razón que la búsqueda de fuentes naturales de obtención de estas moléculas ha crecido enormemente. El estudio de las características químicas de los pigmentos naturales como estructura química y estabilidad a pH y temperatura hace necesario su purificación. La cromatografía es una excelente herramienta que permite la purificación de estas biomoléculas. Dependiendo del tipo de pigmentos será la técnica cromatográfica a utilizar por lo que actualmente se han desarrollado una infinidad de técnicas de separación y purificación de pigmentos donde la cromatografía juega un papel muy importante. A continuación se describirá brevemente algunos usos de la cromatografía en la purificación de pigmentos de origen natural. López y col. (2007) estudiaron los pigmentos naturales de flores y plantas llamados antocianinas. Estos pigmentos naturales presentan coloraciones que van desde rojo hasta el azul y han sido muy estudiados porque son una excelente alternativa del uso de colorantes químicos ya que además presentan propiedades antioxidantes. Las 48

Scientia et Technica Año XIII, No 3

276 en capa fina sobre cromatoplacas de celulosa y papel. De igual manera se tomaron cromatogramas de HPLC y espectros de RMN de extractos, fracciones y sustancias puras para elaborar un perfil de cada fruto. La fase móvil usada en los corridos de HPLC para los extractos y las fracciones consistió en diferentes proporciones de metanol- H2O y HCOOH, con un flujo de 0.5 ml/min.

El segundo producto de importancia e derivado de la pelargonidina. El 3-O Cromatografía producto minoritario en Rubus idaeus (“ mismo que en Rubus occidentalis (“b [4]. En cuanto al mortiño la cromatogr HPLC muestra una sola sustancia mayo la abundancia en antocianinas reportad para este fruto [5]. A diferencia de la m árbol, el mortiño y otras especies antocianinas estructuralmente son glicósidos de polihidroaflavilio y actualmente se buscan sometidos a extensos análisis para demo e incluso 3. RESULTADOS Y DI SCUSI ÓN fuentes alternas de obtención enfocándose muchos estudios en frutos como uvas, col[6,7] se tratan de obtener a Los cromatogramas en capa fina muestran claras cultivos in vitro [8]. morada, aceitunas, grosellas, zarzamoras, manzanas, fresas, ciruelas y cerezas y en diferencias en los contenidos de las antocianinas de mora, Finalmente, existen en el mercado d vegetales poco estudiados. Losyautores estudiaron de mora tomate de castilla mortiño tomate de árbol. Así,laslaantocianinas mora tiene tres de árbol, Rojo y Común, sien productos coloreados, siendo ely menos el más ellas la que produce la mayor cantidad d (Rubus glaucus), mortiño (Vaccinium meridionale) tomatepolar de árbol (Cyphomandra abundante y cuyo espectro de RMN indica un derivado sus frutos y aunque su contenido es betacea). Para su estudio fue necesario la purificación de estos pigmentos que incluyo el de cianidina. De otro lado, el mortiño se caracteriza por cantidad producida es muy reducid uso de técnicas cromatográficas, como primera extrajeron pigmentos utilizando tener casi exclusivamente un etapa producto de intenso los color diferenciarse de lo reportado en la litera rojo-violáceo, probablemente yun derivado delfinidina. solventes químicos, procesos de concentración finalmente los pigmentos fueron 4. CONCLUSI ONES Y RECOM END Por sucromatográfica parte el tomate de árbol muestra tresSephadex purificados con una columna utilizando comotambién soporte y Se LH-20 ha estandarizado una metodolog sustancias pero en proporciones distintas a las de mora. de HPLC como etapa final para obtener perfiles de loscon pigmentos purificar antocianinas con lo que s Estos resultados están de acuerdo los análisisdedecada muestra de manera rutinaria y masiva HPLC (figuras 1, 2 y que 3), pero difieren para estudiada. El perfil cromatográfico indico el fruto denotablemente la mora contenía tresanalizar pigmentos en diferentes variedades colombianas. lo reportado en la literatura para otras especies e incluso diferentes, el mortiño solo presento un tipo de pigmento y el tomate de árbolposible presentó hacer un banco de datos para variedades. Por ejemplo en tres variedades españolas de también tres pigmentos Rubus pero con tiempos de retención diferentes a la de la mora (Figura contenido de antocianinas, el tipo y el p idaeus se han reportado 3-O-glicósidos de de los extractos y de los compue 38). cianidina como los productos mayoritarios [3]. seleccionar el mejor material para el me mercado externo. En este sentido el do antioxidante del mortiño lo ha cotizado precios que doblan y hasta triplican lo obstante la mora parece ofrecer muy bu por las facilidades de cultivo y una a Igualmente puede servir como una fue para la industria alimenticia y de nutracé

5. AGRADECI M I ENTOS Los autores agradecen la financiación de Antioquia a través del Programa de S

Figura 1. Perfil cromatográfico mora

0.5 50

AU

% Mobile Phase

Chromatogram

1.0

100

0

0 0

20

40

Minutes

Figura 2. Perfil cromatográfico de tomate de árbol Chromatogram

100

50

AU

1

% Mobile Phase

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fracciones porII cromatografía Operaciones unitarias

0

0 0

50

100 Minutes

Figura 3. Perfil cromatográfico de mortiño.

6. BI BLI OGRAFÍ A [1] KONGA, J., CHIAA, L-S., GLOH T-F.2003. Phytochemistry 64, 923– [2] JIAO Z., LIU J., WANG, S. 200 Biotechnol. 43, 97–102 [3] DE ANCOS, B., GONZALEZ, E. 1999. Lebensm Unters Forsch A. 20 [4] SUTHANTHANGJAI, W., ZABETAKIS, I. 2005.Food Chemi [5] CABRITA, L., FROYSTEIN, N, 2000. Food Chemistry 69, 33-36. [6] YAO, Y., VIEIRA, A. 2007. Neu 93–100 [7] WANGA, S. Y., BALLINGTON, J doi:10.1016/j.lwt.2006.09.005 [8] MEYER, J.E.PEPIN, M.-F., SMI Journal of Biotechnology. 93, 45–5 [9] BOBBIO, F.O., BOBBIO, P.A AMAYA D. B. 1983. Food Chemi

Figura 38. Perfil cromatográfico de las antocianinas presentes en la mora (figura 1), tomate de árbol (figura 2) y el mortiño (figura 3). En las tres figuras de aprecian diferentes perfiles cromatográficos con tiempos de retención diferentes. (Tomado de López y col., 2007).

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Operaciones unitarias II

U3

Cromatografía

Este análisis es una muestra de la importancia de las técnicas cromatográficas ya que permiten un estudio preciso de separación cuantitativa de los diferentes constituyentes de una muestra, es importante aclarar que las técnicas cromatográficas no pueden ser utilizadas para determinar estructuras nifrom para identificar compuestos a menos Básaca-Loya et al.: Extraction and purification químicas of B-phycoerythrin Rhodosorus marinus que previamente se utilicen estándares y que por comparación de los tiempos de nm (i.e., purityentre of B-PE los = A estándares /A ) (Bermejo et y al.las 2001), mediante cromatografía de intercambio aniónico fue de 0.2 mga concluir que retención sustancias problemas se pueda llegar mL . Se usó un amortiguador de fosfato de sodio 10 mM (pH since the absorption spectrum of this protein exhibits a peak at hay estructuras similares sin embargo, hay encon cuenta que hay 2 y pHque 7) y eltener pH se ajustó ácido clorhídrico diluido.una La infinidad de 545 nm. estructura secundaria se analizó utilizando la paquetería moléculas que pudieran incidir en nuestras conclusiones por lo que siempre será DICHROWEB (http://www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/ Results home.html) y la información molecular en relación a la B-PE necesario que una vez que se ha purificado una molécula se procesa a la caracterización se obtuvo de Bermejo et al. (2001). Todos los espectros se We obtained 145 mL of crude extract from the microalga registraron a temperatura ambiente. (como RT-IR, RMN, etc). culture. analysis indicated that the protein contentde was otras de su The estructura química a través técnicas analíticas 1.6372 mg mL . The absorption spectrum of the crude extract Algunos microorganismos son productores de pigmentos Procedimientos analíticos que presentan alta potencialidad is shown in figure 1. In this spectrum, three peaks corresponded to the B-PE maxima (562 and 540 nm, with a shoulder biotecnológica. La producción de pigmentos generados porenmicroorganismos es unas de La concentración de proteína las muestras se estimó por at 498 nm), one peak corresponded to the R-phycocyanin el método de Bradford (1976). La pureza de B-PE fue determimaximum (620 nm), and another peak was observed for allolas principales áreas de investigación actualmente, se han desarrollado diferentes nada como la relación entre las absorbancias a 545 y 280 nm phycocyanin (650 nm). This shows that R-phycocyanin and (i.e., purezade de B-PE = A tipo /A )de (Bermejo et al. 2001), yasiendo que técnicas para la purificación y caracterización este moléculas, allophycocyanin contents are only minor components of the el espectro de absorción de esta proteína presenta un pico a total phycobilins of these cells; the bulk consists of B-PE. nuevamente la cromatografía, una técnica esencial para el estudio. Básaca-Loya y col. en 545 nm. The precipitate obtained after 60% ammonium sulfate saturation was resuspended in 30 mL of 0.01 M Na-phosphate 2009 generaron un proceso de purificación de un pigmento de origen proteico llamado Resultados buffer. The protein concentration was 2.445 mg mL . This solution was desalted using Sephadex the roja ficoeritrina producido porG-25 la (Sigma) microandalga Rhodosorus marinus. La Se obtuvieron 145 mL de extracto crudo de técnica los cultivos de fractions obtained were applied to a Q Sepharose column. In microalgales. El análisis mostró que el contenido de proteína purificación primeramente en la ruptura celular ya que este pigmento es de some experiments consistió we used different buffers for elution in fue 1.6372 mg mL . En la figura 1 se muestra el espectro de anionic chromatography: a discontinuous gradient with 0.01 M absorción del extracto crudo. En talcon espectro, tres picos origen intracelular, posteriormente se utilizó una precipitación sulfato de amonio y Na-phosphate/0.1 M NaCl (pH 7) and 0.05 M Na-phosphate/ correspondieron a los máximos de B-PE (562 y 540 nm, con un 0.1 M NaCl was not found to yield results. Better hombrode a 498 nm), un pico molecular correspondió al máximo de R- como fase para la purificación sesatisfactory utilizó cromatografía exclusión utilizando results were found using a discontinuous gradient with differficocianina (620 nm) y otro correspondió a la aloficocianina estacionaria G-25 e intercambio aniónico una columnay Zorbax GFent concentrations ofSephadex NaCl in 0.01 M Na-phosphate (pH 7.0): (650 nm). Esto indica utilizando que los contenidos de R-ficocianina 0.1 M, 0.25 and 0.5 M NaCl and the majority of B-PE and Raloficocianina son componentes menores del total de ficobili250 que utiliza como fase estacionaria Q Shepharosa. Los resultados obtenidos del phycocyanin in the phycobiliproteins were eluted with 0.01 M nas en estas células, siendo B-PE el pigmento predominante. Na-phosphate/0.1 M NaCl (fig. 2). Therefore, the resultsen laElfigura precipitado obtenido después de la saturación con sulproceso de purificación se muestran 39. 545

280

1

1

545

280

1

1

fato de amonio al 60% fue resuspendido en 30 mL de amortiguador de fosfato de sodio 0.01 M. La concentración de Básaca-Loya et al.: purification of B-phycoerythrin from Rhodosorus marinus proteínas entonces fue 2.445 mg Extraction mL 1. Estaand solución se desaliBásaca-Loya et al.: Extraction and purification of B-phycoerythrin from Rhodosorus marinus nizó en una columna Sephadex G-25 (Sigma) y las fracciones obtenidas se introdujeron en una columna Sepharose Q. En 0.7 algunos ensayos se 250utilizaron diferentes amortiguadores para la 250 elución en la cromatografía aniónica: un gradiente discontinuo 200 0.6 con fosfato de sodio 0.01 M/NaCl 0.1 M (pH 7) y fosfato de 200 sodio 0.05 M/NaCl1500.1 M no produjo resultados satisfactorios. 0.5 Se obtuvieron mejores resultados usando un gradiente disconti100 nuo con diferentes concentraciones de NaCl en fosfato de 150 50 sodio 0.01 M (pH 7.0): la elución de NaCl 0.1, 0.25 y 0.5 M y 0.4 la mayor parte de B-PE y R-ficocianina en las ficobiliproteínas 0 500 100 se obtuvo con fosfato de sodio 0.01600M/NaCl 0.1 700 M (fig. 2). Por Wavelength (nm) 0.3 lo tanto, los resultados mostraron que la fuerza iónica fue sufiFigure 4. Visible fluorescence emission spectra of purified B-phycoerythrin. ciente para la separación de delaemisión ficoeritrina. La absorbancia a Figura 4. Espectros visibles de fluorescencia de la B-ficoeritrina 50 purificada. 0.2 280 nm (la mayoría de las proteínas aborben a 280 nm) disminuyó notablemente en relación con el extracto crudo, lo que 40 pH7 0 indica una purificación considerable de la ficobilina en compa0.1 pH2 500 con otras proteínas 600 700 máximos 300 400 500 600 ración celulares, mientras que los 20 (nm)los componentes principales. Wavelength (nm) de B-PE (540 y 562 Wavelength nm) fueron 5. SDS-PAGE of purified B-phycoerythrin. From left to right the También se observó0 que la elución con fosfato 0.01Figure M/NaCl FigureFigura 1. Absorption 39. spectrum of crude extract obtained from Rhodosorus correspond to marker proteins and purified B-phycoerythrin Proceso de purificación Figure cromatográfica del pigmento proteicobands -ficoeritrina. La after 4. Visible fluorescence emission spectra of purified B-phycoerythrin. HPLC. 0.5 M en la cromatografía de intercambio aniónico produjo Bmarinus biomass. -20 Figura 5. SDS-PAGE de la B-ficoeritrina purificada. De izquierda a derecha Figura 4. Espectros visibles de emisión de fluorescencia de la B-ficoeritrina primera figura (de izquierda a derecha) se aprecia el perfil de absorción del extracto crudo, enpurificada la las bandas corresponden a proteínas marcadoras y B-ficoeritrina PE; sin embargo, se obtuvieron bajas concentraciones de Figura 1. Espectro de absorción del extracto crudo obtenido de la biomasa purificada. después de la cromatografía líquida de alta resolución. de figura Rhodosorusde marinus. proteínas con menor-40 pureza. en medio de muestra el espectro de absorción de la muestra después de haber sido Milidegrees

Intensity

a 210 y 222 nm se observan en la fracción a pH 7, sometido a HPLC. En la última figura 363 se presenta un gel de electroforesisnegativas donde el asegundo pero la intensidad disminuyó pH 2. En la tabla 1 se muestran los resultados del análisis con DICHROWEB, en donde se usó el programa CDSSTR para determinar la curva que mejor se carril corresponde a la muestra obtenida y col., 2009). 40 del HPLC (tomado de Básaca-Loya pH7 ajusta a los datos. -60

180

200

220

240

260

Wavelength (nm)

Figure 6. Far UV circular dichroism spectra of B-phycoerythrin in 0.01 M Na-phosphate buffer at pH 7 and pH 2. Protein concentration was pH20.2 mg mL 1. Figura 6. Espectros de dicroísmo circular en el lejano UV de B-ficoeritrina en amortiguador de fosfato de sodio 0.01 M a pH 7 y pH 2. La concentración de proteína fue 0.2 mg mL 1.

20

Milidegrees

Absorbance

Intensity

showed that an ionic strength was enough for separation of the phycoerythrin. The absorbance at 280 nm (most proteins

0

-20

Discusión Rhodosorus marinus presentó tres tipos de ficobiliproteínas: ficoeritrina, ficocianina y aloficocianina. Para la microalga roja Porphyridium cruentum, Bermejo et al. (2002) encontraron que el contenido de aloficocianina era insignificante o inexistente en comparación con la R-ficocianina y la Figure 5. SDS-PAGE of purified B-phycoerythrin. From left to right the B-PE. bands correspond to marker proteins and purified B-phycoerythrin after En el presente trabajo se obtuvo la elución de la mayor parte de B-PE con fosfato de sodio 0.01 M/NaCl 0.1 M. HPLC. Rossano et al. (2003) utilizaron la misma fuerza iónica para la Figura 5.con SDS-PAGE de que la B-ficoeritrina purificada. De izquierda a derecha elución de R-ficoeritrina un amortiguador contenía fosfato de sodio M/NaClcorresponden 0.1 M (pH 7.0) en una columna las0.05 bandas a proteínas marcadoras y B-ficoeritrina purificada de hidroxiapatita y fosfato de sodio 0.01 M/NaCl 0.1 M

bands at about 208 and 222 nm. Figure 6 shows the behavior of the protein at pH 7 and pH 2 in the range of 180 260 nm. As can be observed the curve shows an intense positive band at about 195 nm, which decreased when the protein was under acidic conditions. The negative bands at 210 and 222 nm are present in the fraction at pH 7, but the intensity of the bands decreased at pH 2. The results of the DICHROWEB analysis are shown in table 1, where the CDSSTR program was used to obtain the curve that best fits to the data.

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después de la cromatografía líquida de alta resolución.

-40 365

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negativas a 210 y 222 nm se observan en la fracción a pH 7, pero la intensidad disminuyó a pH 2. En la tabla 1 se muestran

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Operaciones unitarias II Cromatografía

En el trabajo de investigación anterior se muestra que es posible combinar más de una técnica cromatográfica para llegar al producto requerido. En este caso se llegó a la conclusión que el alga roja estudiada presentaba más de un tipo de -ficoeritrina sobresaliendo dos de ellas que son las que se observaron en el gel de electroforesis. Para concluir este tema vamos a estudiar la purificación del pigmento presente en el fruto de Maracuyá púrpura (Passiflora edulis). Díaz y col. (2010) diseñaron un proceso de purificación del pigmento presente en la cáscara del maracuyá púrpura. La técnica consistió en una extracción del pigmento presente en la cáscara utilizando una mezcla de solventes, posteriormente el extracto fue concentrado utilizando un rota vapor. La separación de los pigmentos fue mediante cromatografía en capa fina (TLC) utilizando una placa sílica gel 60G, se observaron dos manchas cromatográficas una amarilla y una roja más débil. La mancha amarilla que fue la más intensa, se extrajo utilizando una mezcla de solventes. Por el valor de Rf obtenido y por análisis químicos se llegó a la conclusión de que se trataba de una molécula de antocianato. Para este caso, el pigmento purificado utilizando técnicas cromatográficas fue caracterizado para determinar su composición de azúcares y su posición en la molécula. Los ejemplos vistos son una pequeña muestra del uso de las técnicas cromatográficas en procesos de separación para el estudio de biomoléculas y su posterior caracterización de las mismas.

3.3.3. Separación de otros metabolitos La cromatografía no solo se utiliza para la purificación de enzimas, proteínas o pigmentos, se puede utilizar para purificar otro tipo de biomoléculas. Por ejemplo, es común utilizarlas para purificar ADN de diverso origen, por ejemplo ADN de café. Los métodos tradicionales de extracción de ADN no evitan la presencia de compuestos fenólicos que llegan a afectar a las técnicas posteriores de análisis de ácidos nucleicos, por esta razón algunas técnicas cromatográficas eliminan la presencia de estos compuestos inhibitorios facilitando el uso de ADN para otras técnicas moleculares. García y col. (2006) utilizaron la cromatografía de exclusión molecular para la purificación del ADN del café. Después de la extracción de ADN, las muestras se inyectaron a una columna que contenía como fase estacionaria Sephacryl S-1000 la cual funciona como una matriz de exclusión molecular. Los resultados mostraron una mayor limpieza del ADN en comparación con muestras no sometidas a un paso cromatográfico (Figura 40).

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Operaciones unitarias II Cromatografía

Figura 40. Resultados obtenidos de la purificación de ADN de café. El grupo a muestra el ADN sometido a purificación utilizando técnicas cromatográficas, los grupos b y c muestran el ADN extraído por técnicas tradicionales (sin ser purificado) (tomado de García y col., 2006).

Otro potencial uso de la cromatografía está en la purificación de macromoléculas como los bacteriófagos, estas moléculas son partículas virales que cuentan en su superficie con proteínas que pueden ser aprovechadas para diseñar técnicas cromatográficas de separación y purificación. Camacho y col. (2012) utilizaron cromatografía de exclusión molecular para la purificación de bacteriófagos de Escherichia coli TG1. Después de la ruptura celular los fagos fueron purificados utilizando una columna de exclusión molecular empaquetada con Sepharosa CL-4B. Esta técnica fue comparada con la técnica tradicional de precipitar fagos con polietilenglicol (PEG), los resultados mostraron una mayor pureza al utilizar técnicas cromatográficas (Figura 41).

Figura 41. Purificación de fagos de E. coli. Se observa que al utilizar técnicas cromatográficas (CEM) se obtiene un mayor grado de pureza que con la precipitación tradicional con PEG (tomado de Camacho y col., 2012).

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Operaciones unitarias II Cromatografía

También es posible utilizar técnicas cromatográficas para eliminar productos tóxicos generados de reacciones químicas fuertes, tal es el caso de la purificación de hidrolizados obtenidos de residuos agrícolas. El bagazo de caña de azúcar tiene bajo valor económico pero si es sometido a una hidrólisis ácida se puede obtener jarabes con alto contenido de azúcares que posteriormente pueden ser utilizados en procesos fermentativos para obtener bioetanol o xilitol. La hidrólisis ácida genera compuestos inhibitorios de la fermentación, estos compuestos son generados a partir de azucares que en medio ácido se transforman en furfurales, también es posible encontrar alto contenido de compuestos fenólicos que son el resultado de la lignina presente en los vegetales. Viñals y col. (2006) compararon técnicas cromatográficas para limpiar hidrolizados provenientes de la caña de azúcar y el método tradicional con carbón activado. Para el caso de las técnicas cromatográficas usaron dos condiciones es decir, resinas aniónicas fuertes y resinas catiónicas fuertes. Los resultados obtenidos mostraron que el uso de resinas tiene un efecto significativo en la reducción de furfurales, fenoles y color comparados con la técnica con carbón activado (Figura 42). Estos resultados no sugieren que las técnicas cromatográficas son muy eficientes para la remoción de contaminantes y permiten tener soluciones más limpias que pueden ser utilizadas para otros procesos biotecnológicos.

Figura 42. Remoción de compuestos inhibitorios de hidrolizados de la caña de azúcar. En TH1 se utilizó un tren de tratamiento con resinas aniónicas fuertes, en TH2 se utilizó un tren de tratamiento con resinas catiónicas fuertes y en TH3. Se utilizó el método tradicional de purificación con carbón activad (tomado de Viñals y col., 2006).

En el control biológico de plagas o para la purificación de nuevos antibióticos es común el uso de técnicas cromatográficas ya que en muchos casos es necesario el uso de moléculas puras para estudios clínicos. Debe quedar claro que cada molécula exige una técnica cromatográfica diferente por lo que siempre será necesario realizar investigaciones previas para definir el mejor tren de purificación. León y col. (2005) diseñaron un tren de purificación parcial para una molécula producida por Alteromonas sp. con capacidad antimicrobiana. El tren de purificación incluyo la extracción, precipitación y purificación parcial utilizando cromatografía de intercambio iónico usando como fase 53

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estacionaria Sephadex G-25. Los resultados obtenidos indicaron que la molécula estudiada era de origen proteico lo que facilito la purificación parcial (Figura 43). León et al.

SC P 2050 1160 97,0

centración de proteínas totales de la sustancia SP aplicadas a cada carril de PAGE-SDS, fue estimada en 170 mg/mL. Espectro de actividad antimicrobiana de la substancia SP

La sustancia semipurificada (SP) de Alteromonas N22.C, presentó actividades inhibitorias de amplio rango contra bacterias patógenas de peces y moluscos. Las cepas tes45,0 tigo ensayadas han resultado ser sensibles a la sustancia SP cuando éstas fueron inoculadas BI con 15 mL de muestra sobre la superficie de 29,0 los cultivos en placa. Esta sensibilidad se muestra en la Tabla 3. El patógeno de mayor sensibilidad resultóproducida ser Vibrio ordalii Figura 43. Purificación parcial de 2. una molécula antimicrobiana porNCMB 2167, Figura Electroforesis encon gel deactividad poliacrilamida halo de de inhibición logró superar 18 mm - SDS de la sustancia inhibitoria (SI) de Alteromonas sp. En el carril P se observa la fracción obtenida de lacuyo columna intercambio de diámetro. Otras cepas (tomado sensibles a la acción Alteromonas N22.C, tinción delaplata. iónico donde se presenta la banda BI quecepa es la quecon presenta actividad antimicrobiana Carril C, extracto crudo del sobrenadante; carril inhibitoria fueron V. anguillarum RP-13 (14 de León y col., 2005). P, SI semipurificada (eluidos activos después del mm), V. al gi nol yti cus A32 (13 mm), filtrado por Sephadex G-25); carril S, estándar Pseudomonas aer ugi nosa (14 mm) y

66,0

de pesos moleculares (MW-SDS-200, Sigma), 205000; 116000; 97000; 66000; 45000 y Lo anterior solo es un pequeño ejemplo 29000 daltons de (Da).laLapotencialidad flecha (BI) indicade la las técnicas banda de proteína(s) involucrada(s) en las pruecromatográficas. El uso de este tipo de técnicas está muy extendido en las bas de inhibición.

Pdiversas S

2050

actividades da la biotecnología solo debe quedar claro que en la mayoría de los casos es de una banda masa molecular oscila en- que los productos necesario una optimización previa de lacuya técnica para asegurar 1160 tre 45000 y 29000 fue persistente en todas las obtenidos poseen el grado decorridas purificación deseado. 97,0 electroforéticas, (Figura 3). Esta fracción de proteínas cuya masa molecular fue estimada entre 34000 ± 4000 Da se denominó Con esto concluimos este tema, la unidad y la asignatura de Operaciones Unitarias II. Se 66,0 «banda I» (BI). te invita a que profundices más sobre los temas ya vistos. La biotecnología es un área Las pruebas efectuadas mediante el ensamuy amplia donde los métodos son de uso común yo estudiadas directo de actividad antimicrobiana en pero debemos de tener 45,0 conducentes a determinar la actibien claro el principio de cadaPAGE-SDS, técnica ya estudiada y de la gran variedad de fases vidad de las bandas proteicas de la sustancia estacionarias y móviles con las que contamos. Esperamos que la información expuesta te SP, revelaron una zona de fuerte inhibición a haya sido de utilidad y que nolasolo quedes estudiado que investigues más BI (34,0) altura te de la banda BI con (cepa lo testigo S. aureus si no 29,0 11632) (Figura 4). sobre principio y métodos másATCC recientes.

Actividades

http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/biologia/biologiaNEW.htm

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Operaciones unitarias II

Otros ensayos en PAGE-SDS conducenFigura 2. Electroforesis en gel de tes a la determinación de la presencia de azú- poliacrilamida - SDS de la SI semipurificada cares unidos a las proteínas inhibitorias mostra- de Alteromonas N22.C. La flecha (BI) indica la ron ausencia de dichas moléculas (Figura 5). En banda de proteína(s) cuyo peso molecular fue consecuencia la sustancia inhibitoria producida calculado en 34000 Da (entre los marcadores por Alteromonas N22.C fue catalogada simple- de 45000 y 29000 Da). Tinción con nitrato de actividades estará guiada por tu La docente en Carril línea, mismo que teS, estándar P, SI semipurificado; mente como de naturaleza proteinacea. con- plata.

La elaboración de las de pesos moleculares. indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y peru. biol. 12(3): 359- 368 (2005) tus compañeros (as) llevarán realizar. 364a cabo, así como los envíos que tendrán queRev.

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Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BOU2_U3_A1_XXYZ, donde BUO2 corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la etapa de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BOU2_U3_ATR _XXYZ, donde BOU2 corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

Cierre de la unidad En esta tercera unidad se estudiaron diferentes técnicas cromatográficas que son comúnmente utilizadas en la industria biotecnológica. Se estudiaron los principios de separación de la cromatografía, los tipos de separación más comunes y se estudiaron algunos ejemplos de aplicaciones para la separación, purificación y caracterización de biomoléculas. La cromatografía es un proceso de separación muy complejo pero muy versátil, actualmente es una poderosa herramienta analítica y día a día va evolucionando de tal forma que se cuenta con una gran gama de fases sólidas y fases estacionarias que han hecho de la cromatografía una herramienta indispensable en la industria biotecnológica.

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Para saber más

Te recomendamos revisar los siguientes libros, ya que te serán de gran ayuda. 

Abbott, D., Andrews, R.S. (2006). Introducción a la Cromatografía, España, Ed. Alhambra. Es un libro básico que nos introduce al estudio de los procesos cromatográficos, expone una amplia visión de las metodologías para la separación de moléculas y la interpretación de resultados.

Dabrio, M.V. (2000).Cromatografía y electroforesis en columna. Springer-Verlag. 1ra. Ed. España. Libro básico donde se expone de manera clara los principios cromatográficos y sobre todo de hace énfasis en los tipos de columnas y su uso para la separación de diferentes moléculas.

García de Marina, A.B. (2008). HPLC fundamental. España, Ed. Universidad Politécnica de Valencia. Es un libro muy interesante donde encontraras información fundamental sobre la cromatografía en general, Es capítulos posteriores se brinda valiosa información sobre métodos cromatográficos y sobre todo, de las resinas y su función y utilización de las mismas.

Macnair, M, H., Miller, M. J. (1998). Cromatografía de Gases Básica. USA, John Wiley and Sons. Un libro donde se expone claramente todas las variables involucradas en la cromatografía de gases, hace referencias desde fases gaseosas, equipos y condiciones de cromatografía.

Meyer, V.R. (2004). Cromatografía Líquida de Alta Resolución Práctica. USA. Wiley. En este libro encontraras los principios básicos y teóricos de la

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cromatografía, descripción de los equipos más comunes de HPLC así como estrategias para la purificación e identificación de moléculas. 

V.V. A.A. (1996). Técnicas instrumentales de análisis en bioquímica. España. Ed. Síntesis. En este libro encontrarás la descripción de equipos cromatográficos, así como la metodología de uso y sus aplicaciones para la separación de una gran diversidad de moléculas.

Fuentes de consulta

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