ra12_10_Bil_3 by Jordbruksverket

Bilaga 3 Rapport om användning av sporfällor för detektion och prognos av växtpatogener Författare: Anna Berlin Institutionen för skoglig mykologi och växtpatologi, Sveriges lantbruksuniversitet

kyddet at s t x ä v Vässa tidens klim problem för fram och hanterar ökade er rebygg Hur vi fö rat klimat d n rä i ett fö

, växt egörare ed skad rar dessa och men m te le b ön. an ro h p ökar n till milj er som e klimat r metod ft och tar hänsy t varmar räs. Vi behöve ra et sk ed en av rr M g g • in s konku ar och o förbättr rlds sjukdom ärker näringen d omvä ning och t st en utöka samord samtidig re samt år ökad ra sl ö re eg fö ad et t ruksverk men för växtsk g för at • Jordb te forsknin ingssys llämpad tfunktion för bevakn ti å p g . per ing tsnin bevakn år en sa m och att en ex et föresl le ruksverk xtskyddsprob skapas. • Jordb vä re e ra d ö eg öka hantera växtskad ering av riskvärd

Rappor

Bilaga 3 till rapport 2012:10

t 2012:1

Bilder omslag Gulrost (Puccinia striiformis) p책 r책gvete. Foto: Rebecka Svensson, Jordbruksverket Anoplophora glabripennis. Foto: Sofie Persson, Jordbruksverket

Jordbruksverkets rapport ”Vässa växtskyddet för framtidens klimat – Hur vi förebygger och hanterar ökade problem i ett förändrat klimat” (2012:10) har följande bilagor: Bilaga 1

Ahrné, Karin, Institutionen för ekologi, SLU a. Jämförelse av utbredningsmodellerna CLIMEX och MaxEnt. b. Litteraturgenomgång för beskrivning av program som används för att modellera arters utbredning. c. Klimatmatchningar i CLIMEX.

Bilaga 2

Andersson, Lars m.fl., Institutionen för växtproduktionsekologi, SLU a. Metodutveckling för fortlöpande inventering av ogräsflorans samman sättning. b. Direkta och indirekta effekter av ett förändrat klimat på förekomsten av ogräs. c. Metod för detektering och uppföljning av förekomst av arter som är poten tiellt framtida ogräs och expanderande ogräs.

Bilaga 3

Berlin, Anna, Institutionen för skoglig mykologi och växtpatologi, SLU Rapport om användning av sporfällor för detektion och prognos av växt patogener.

Bilaga 4 Eckersten, Henrik & Alois Kornher, Institutionen för växtproduktionsekologi, SLU Klimatförändringars effekter på jordbrukets växtproduktion i Sverige – scenarier och beräkningssystem. Bilaga 5

Jönsson, Anna Maria m.fl., Institutionen för Naturgeografi och Ekosystem- vetenskap, Lunds universitet Kunskapssammanställning – Växtskydd och Klimat. Modellering av klimatets påverkan på produktion och risk för skadegörare inom jordbruket.

Bilaga 6

Lindelöw, Åke och Karin Ahrné, Institutionen för ekologi, SLU & Elna Stenström och Johanna Boberg, Institutionen för skoglig mykologi och växtpatologi, SLU Kunskapssammanställning av forskningsläget och metoder när det gäller nya allvarliga skogsskadegörare (svampar och insekter) som kan komma att över leva och etablera sig i Sverige. a. Registrering av insekts- och svampskador på skog i Sverige (Lindelöw & Stenström). b. Simuleringar av potentiell etablering av skadesvampar i svensk skog (Johanna Boberg). c. Simulering I CLIMEX av Anoplophora glabripennis möjliga utbredning I Sverige med nuvarande klimat och under olika klimatförändringsscenarior (Karin Ahrné).

Bilaga 7

Nilsson, Christer, Agonum konsult. Växtskydd och Klimat – en kunskapsinventering.

Bilaga 8

Samuelsson, Hans m.fl., Skogsstyrelsen Ökade risker för nya skadegörare på skog och åtgärder för att minska riskerna.

Bilaga 9

Sigvald, Roland, Nordic Association of Agricultural Scientists (NJF) Seminarium ”Risk assessment/risk management, forecasting pests and diseases of field crops in a changing climate”, 30 november–1 december 2011.

Bilaga 10 Thierfelder, Tomas, Institutionen för energi och teknik, SLU Statistisk genomlysning av Jordbruksverkets växtskyddscentralers prognosoch varningsverksamhet. Bilaga 11 Volk, Thomas m.fl., proPlant GmbH, Tyskland Simulation of infestation of plant pests of five agricultural crops in a changed climate 2011–2100 for Lund, Kalmar, Skara, Uppsala and Umeå.

Jordbruksverkets förord Jordbruksverket har av regeringen fått i uppdrag att utarbeta ett praktiskt inriktat och fördjupat kunskapsunderlag för att förebygga och hantera ökade problem med ogräs, växtsjukdomar och skadegörare till följd av ett förändrat klimat. Jordbruksverkets uppdrag redovisas i rapporten 2012:10. Inom ramen för uppdraget har Jordbruksverket låtit genomföra ett antal delprojekt vilkas resultat redovisas som bilagor till huvudrapporten. De är endast tillgängliga på Jordbruksverkets webbplats. Resultat från delprojekten har till viss del sammanfattats i Jordbruksverkets huvudrapport i relevanta kapitel. Delrapporterna är mer omfattande. Denna bilaga är redovisningen från ett sådant delprojekt. Anna Berlin har utfört studien på Jordbruksverkets uppdrag. Författaren ansvarar för innehållet i denna rapport.

Gunilla Berg, växt- och miljöavdelningen

Rapport om användning av sporfällor för detektion och prognos av växtpatogener Denna rapport är skriven på uppdrag från Jordbruksverket inom ramen för projektet ”Kunskapsunderlag för att förebygga och hantera ökade problem med ogräs, växtsjukdomar och skadegörare till följd av ett förändrat klimat”.

Sammanfattning Syftet med den här rapporten är att beskriva olika typer av sporfällor, hur de används och möjligheter att i framtiden använda sporfällor för att tidigt kunna detektera växtpatogener, både i samband med prognosverksamhet men också för vissa karantänsskadegörare. I denna rapport beskrivs sporfällor och detektionsmetoder som bedöms vara användbara för provtagning för övervakning av växtpatogener.

I princip kan alla typer av växtpatogener detekteras med hjälp av sporfällor. De traditionella metoderna för diagnostisering, så som morfologiska undersökningar i mikroskop och odling av patogenen i laboratoriemiljö är tidskrävande och personen som utför uppgiften måste vara mycket erfaren inom området. Möjligheten att använda PCR-baserade metoder har öppnat nya möjligheter för korrekt detektion och av mycket små mängder växtpatogener. Genom att på något sätt fånga sporer och applicera den nya tekniken kan luftburna patogener tidigt upptäckas. Hittills har sporfällor främst använts i forskningssyfte inom växtpatologin, men det drivs vissa aktiva prognosoch varningssystem, exempelvis sojabönsrosten i USA. Det viktigaste med en detektionsmetod är att den sker snabbt, precist och att den är enkel att använda. I och med nya metoder har potentialen för användningen av sporfällor inom prognostiserings- och varningssystemen för växtskadegörare ökat. Beroende på i vilken skala fångsten av sporer sker, kan olika typer av patogener upptäckas. I karantänssyfte bör sporfällor placeras i närheten av riskområden/platser, till exempel vid införselpunkter av gods som kan tänkas innehålla karantänsskadegörare och andra strategiskt viktiga platser. De möjliggör även tidig detektion av växtpatogener, vilket ökar förståelsen för olika växtsjukdomar och chansen att avbryta potentiella epidemier i ett tidigt stadie ökar. Inom humanmedicin har utvecklingen gått betydligt snabbare och det finns mycket att lära från deras erfarenheter.

Bakgrund Med ett förändrat klimat kommer förutsättningarna för växtodling att förändras i Sverige. Idag är det i princip omöjligt att förutse vad som kommer att hända, det enda som vi kan vara säkra på är att det kommer att förändras (Garrett 2011). Effektiva metoder för varnings- och prognossystem är därför viktiga för att bekämpningsbehovet ska kunna anpassas till den ännu oförutsägbara framtiden (Shaw 2011). Sporfällor har under lång tid använts för att detektera pollen och sporer visuellt. Möjligheten till molekylär detektion av få sporer har ökat med ny teknologi, vilket också har utökat möjligheterna för att på ett mer tids- och kostnadseffektivt sätt använda olika typer av sporfällor som hjälpmedel för prognostisering och varning för växtpatogener som orsakar växtsjukdom. Syftet med den här rapporten är att beskriva olika typer av sporfällor, hur de används och möjligheter att i framtiden använda sporfällor för att tidigt kunna detektera växtpatogener, både i samband med prognosverksamhet men också för vissa karantänsskadegörare. I denna rapport beskrivs sporfällor och detektionsmetoder som bedöms vara användbara för provtagning för övervakning av växtpatogener. Sporfällor anpassade för inomhusklimat och provtagning under mycket korta intervall behandlas inte.

Sporfällor – verktyg och användningsområde

Det finns flera olika typer av sporfällor tillgängliga för insamling av material från luften. De delas in i grupper beroende på vilket sätt materialet samlas in; aktiva och passiva fällor, regnfällor och luftfällor (Jackson 2011). I vissa fall har även modellflygplan eller annat luftburet fordon använts för att samla in sporer (Maldonado-Ramirez 2005; Wang 2007). I princip kan vilken metod som helst för att samla in sporer från luften användas för att detektera växtpatogener i luften (Zijlstra 2009). Val av sporfälla beror på miljö och vad man är ute efter. Varje patogen har sin egna unika livscykel, vilket innebär att varje patogen endast kan detekteras inom sin räckvidd och sitt spridningsområde. Vad som hamnar i fällan beror på var provet tas, under hur lång tid och när. Dessutom är olika typer av sporfällor effektiva på olika nivåer eller anpassade för provtagning av olika partikelstorlekar. Det är därför viktigt att noga tänka igenom valet av både plats, mättidpunkt och sporfälletyp för att på bästa sätt kunna samla in ett representativt prov (Lacey 2006). Många av de metoder som tidigare användes för detektion av patogener med hjälp av mikroskop kan idag användas för DNA-analys eller immunologiska metoder (Lacey 2006).

Passiva fällor

Detta är den enklaste typen av fällor och de kräver ingen strömkälla. Sporer samlas in med hjälp av regn eller gravitation och samlas upp på någon typ av insamlingsyta. Insamlingsytan kan vara ett filter, ett objektglas med någon typ av klibbig yta, en tejp eller petri-skål med för ändamålet lämpligt media. Gemensamt för de passiva fällorna är att de oftast är relativt billiga att tillverka och använda, flyttbara och enkla att hantera. 2

Varningsrutor Vid prognostisering av en specifik växtsjukdom eller specifik variant av en sjukdom kan varningsrutor vara ett effektivt sätt att detektera förekomsten. Det innebär att en ruta med en mottaglig sort planteras på en strategiskt viktig plats och lämnas obehandlad. När symptom av sjukdomen syns i rutan, bekräftar det att patogenen finns i området. Varningsrutor används till exempel som underlag för modellering av den aggressiva typen av svartrost, Ug99, i Rustmapper (för mer info se: http://apps.cimmyt.org/gis/rustmapper/RustMapper_Web.html).

JB fälla Denna sporfälla består av en tratt i vilken en filterhållare monterats i botten (figur 1a). Tratten står ute dygnet runt och regn och gravitation för partiklar ner i tratten och regnvatten och dagg sköljer ner sporer på filtret. Materialet på filtret kan användas för detektion med hjälp av PCR-baserade metoder.

Tubfälla Det är en tub i vilken ett objektglas täckt med något klibbigt material placeras lodrätt (figur 1b). Den är mycket enkel att använda och kan lätt placeras i olika miljöer. Sporfälletypen har använts för visuell detektion av sporer (se till exempel Hopkins 2009). Metoder för att separera sporerna från det valda klibbiga materialet har utvecklats och möjliggjort att PCR-baserade metoder också kan användas för analys av prover. Denna typ av fälla används bland annat i USA av Syngenta för att övervaka spridningen av sojabönsrost (von Qualen 2006).

Figur 1. Två typer av passiva sporfällor. 1a visar den så kallade JB-fällan och 1b visar en variant av tubfälla.

Aktiva fällor

Till de aktiva fällorna räknas de som kräver någon form av energi för att samla in prov. Exempel på aktiva fällor är aktiva regnfällor, Hirst fälla (Burkard Manufacturing Company Ltd), Coriolis luftprovtagare och joniserande sporfällor (Schneider 2007). 3

Aktiva regnfällor

Det finns flera olika modeller av aktiva regnfällor. Gemensamt för de aktiva regnfällorna är att de består av en behållare över vilket det finns ett lock (figur 2). Vid regn blöts en sensor, då aktiveras motorn och flyttar locket från behållaren och regnvattnet kan samlas upp i kärlet. Vattnet i behållaren töms med jämna mellanrum och filtreras. Från filterpapperet extraheras DNA och provet analyseras.

Figur 2. Skiss på en typ av aktiv regnfälla. Vid regn reagerar en sensor som aktivt flyttar locket från den ena behållaren över till den andra behållaren.

Aktiva luftfällor

Inom denna kategori finns flest typer av sporfällor. Gemensamt för de aktiva luftfällorna är att de provtar en viss känd mängd luft, vilket kan användas när mängden eller koncentrationen av sporer per m3 ska beräknas.

Sugfälla Bladlusfällan, eller sugfällan (figur 3) är en typ av aktiv luftfälla. De är speciellt anpassade för skonsam insamling av insekter (Teulon 2006) och används för att övervaka och prognostisera bland annat bladlössförekomsten i Sverige och andra länder. Fällan suger in en jämn mängd luft på en bestämd höjd över marken och fångar in insekter och andra luftburna partiklar. Traditionellt har denna typ av fällor använts för att övervaka främst insekter. Det pågår tester om denna typ av fälla även kan användas för insamling av andra växtskadegörare, såsom växtpatogena svampar.

Figur 3. Sugfällan på Ultuna. Foto: Anna Berlin

Hirst sporfälla Denna typ av fälla kallas antingen Hirst efter sin uppfinnare (Hirst 1952) eller ”Burkard 7 day sampler” efter företaget som idag marknadsför sporfällan (figur 4). Den fungerar genom att aktivt suga in luft i en cylinder där turbulensen för partiklarna till ett provrör eller en tejp. Om tejp används, kan förändringar i bioaerosolen mätas varje timme. Denna typ av sporfälla lämpar sig därför väl för intensiva provtagningar där behovet av att veta exakt när någonting sker är stort. Metoden är dock mycket arbetsintensiv och den provtagna luftvolymen är endast upp till 14,4 m3 luft per dygn. Fördelen med denna fälla är att provet även kan samlas direkt i ett provrör, vilket minskar kontaminationsrisken vid behandling av provet. Denna typ av fälla används ofta som referens vid testning av andra nyutvecklade fällor.

Figur 4. Hirst fälla, även kallad Burkard 7 day sampler. Foto: Lina Grönberg

Coriolis luftprovtagare Coriolis-fällan är en luftprovtagare anpassad för att kontinuerligt övervaka luftburna sporer och pollen (Carvalho 2008). De luftburna partiklarna separeras från luften och samlas upp i en vätska. Luftgenomströmningen kan varieras mellan 200 och 630 liter per minut. Provtagningen kan pågå från minuter upp till timmar. Nackdelen med denna typ av sporfälla är att den lämpar sig bäst för provtagning under korta perioder eftersom vätskan i vissa fall riskerar att dunsta bort vid längre provtagningsperioder. Det insamlade provet kan analyseras visuellt i mikroskop, med PCR eller genom immunoanalys. Joniserande fällor En relativt ny typ av fälla är joniserande fällor (DS Scientific) som baseras på deposition av material på en tejp genom elektrostatisk kraft. Luftgenomströmningen är relativt hög, upp till 500 liter per minut. Det insamlade provet kan analyseras med hjälp av immun- eller DNA-baserade metoder eller elektronmikroskop (Schneider 2010).

Övriga typer av aktiva fällor

Snurrande fällor/roterande arm-fällor Denna typ av fälla består av två metallarmar som med hjälp av en motor snabbt snurrar runt. På armarna placeras en tejp på vilken sporer och annat material 6

fastnar. Materialet som fastnat kan analyseras med hjälp av mikroskop eller molekylära metoder.

Obemannade luftburna fordon Små obemannade luftburna fordon (UAV, unmanned air vehicles, alternativt RPV remote piloted vehicles) har använts för att samla in sporer, pollen och andra biologiska partiklar upp till 1000 meter över markytan (Maldonado-Ramirez 2005; Wang 2007). På farkosten placeras någon typ av självhäftande material på vilket sporer och andra partiklar fastnar. Farkosterna kan manövreras över önskat område och på önskad nivå för att samla in sporer.

Metoder att analysera insamlade prover

Sporfällor har under lång tid använts i forskningssyfte för att studera specifika epidemiologiska sammanhang. Traditionella metoder för detektion av patogener har varit isolering, observationer i mikroskop, biokemisk karakterisering, serologiska metoder såsom ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), bioassays eller patogenicitetstest. De har ofta varit mycket tidskrävande och inte alltid tillräckligt känsliga för att kunna detektera små mängder av sporer i provet. Vissa patogener är också svåra att skilja åt, och det krävs stor erfarenhet för att kunna avgöra vad som kan ses i mikroskopet. Många patogener, till exempel rostsvampar (Puccinia spp.) går inte att isolera i laboratoriet, utan kräver en levande värdväxt för att kunna reproducera sig. Metoder som baseras på DNA är känsliga, specifika och möjliggör att man kan bestämma genetisk likhet med kända referensisolat. Det blir allt vanligare inom växtpatologi att använda sig av olika typer av PCR-baserade metoder (West 2008). Fördelen med PCR-baserade metoder är att patogenen inte behöver uppförökas innan testning, och vid användning av specifika primrar kan patogenen upptäckas även i orena prover samtidigt som metoden är relativt snabb. Det måste dock påpekas att de PCR-baserade metoderna måste valideras, vilket de endast kan göras med traditionella metoder, genom isolering, mikroskopering, biokemisk karakterisering och patogenetiska tester. Nedan beskrivs några generella metoder för analys av material insamlat med hjälp av sporfällor och när de använts.

Visuellt Den metod som använts under längst tid är visuell examination i mikroskop. Metoden har länge använts för både passiva och aktiva luftfällor. Ett exempel när visuell detektion från sporfällor används är övervakningen av Leptosphaeria maculans och L. biglobosa i Polen (för mer information om projektet, se webbplats: http://cropnet.pl/dbases/spec/specSZW/index.html) samt pollenprognoserna i Sverige (Anonym 2011). PCR PCR är en förkortning av polymerase chain reaction eller polymeraskedjereaktion, vilket är en metod för att få fram en stor mängd av en viss DNA-sekvens. Generellt för PCR-baserade metoder gäller att vid analys av prover från naturen är risken stor att olika typer av ämnen hämmar eller inhiberar PCR-reaktionerna (Lievens 2005). Det finns sätt att undvika detta, till 7

exempel genom att noggrant välja vilken typ av DNA-extraktion som används. Många detektionsmetoder baseras på denna teknik.

Kvantitativ PCR Kvantitativ PCR kallas ibland även realtids-PCR eller qPCR. Det är en metod som möjliggör kvantifiering av mängden sporer i ett prov med hjälp av fluorescent infärgning. Signalen av fluorescensen ökar med mängden DNA av den önskade sekvensen, vilken kan relateras till en standardkurva och därmed kan mängden av den eftersökta arten som fanns i provet från början uppskattas. Denna metod har använts för att detektera mängden rostsporer i passiva och aktiva regnfällor i USA för flera olika rostarter (Barnes 2007; Barnes 2009). Metoden kan detektera så få som två sporer i ett prov, vilket motsvarar 15-30 sporer/m2 (Isard 2011). Nackdelen med metoden är att den inte kan avgöra om sporerna är livsdugliga eller inte. PCR med omvänd transkription Med omvänd transkription (reverse transcript eller RT-PCR) menas att RNA används för att göra cDNA som därefter kan användas för PCR. RNA produceras bara av levande celler och att använda PCR med omvänd transkription är därför användbart för att undersöka genuttryck, och därmed om sporerna är livsdugliga. Det är dock en utrustnings- och tidskrävande process som i de flesta fall endast är lämplig i forskningssammanhang. Microarray Microarray kallas ibland för genchip, DNA-chip eller biochip. Det består av en samling unika DNA-prober (100-10000 baspar långa sekvenser) som placerats ut i ett visst mönster på ett underlag, vanligtvis glas eller silikon. Varje probe binder till en specifik sekvens, till vilket endast matchande DNA binder eller hybridiserar. Metoden är känslig och specifik och potentiellt kan många arter detekteras samtidigt. Utvecklingskostnaden är hög och än så länge används metoden endast i forskningssyfte inom växtpatologin. Detta är dock en metod som har stor potential för framtida bruk, eftersom genchip kan användas för att snabbt detektera väldigt många specifika och olika patogener.

Sekvensering DNA-sekvensering innebär att ordningen på nukleotiderna i DNA-sekvensen bestäms, det vill säga den genetiska informationen. DNA-sekvensen är till stor del unik för varje organism. Sekvensering är nödvändig vid utveckling av andra metoder så som realtids-PCR och microarray. En annan tillämpning är att genom att använda sig av pyrosekvensering av ITS-regionen (internal transcript spacer) på alla svampar i ett prov och genom att därefter jämföra resultatet med ett referensbibliotek, kan sekvenserna artbestämmas. Metoden ger svar på om arten finns i det insamlade materialet, men möjliggör ingen kvantifiering. Detta är ett tids- och kostnadskrävande alternativ och lämpar sig därför bäst i forskningssammanhang. Immunoanalys ELISA (enzymkopplad immunoanalys) är den mest kända typen av immunoanalys och används för att detektera och kvantifiera en antikropp eller 8

en antigen. Principen går ut på att antikroppar binds i brunnarna på en platta, när provet tillsätts och när plattan behandlas reagerar provet med antikropparna och avger en signal. Fördelen med metoden är att den är relativt enkel och specifik. Skottrup (2008) beskriver olika typer av immunosensorer som kan användas för detektion av patogener. Nackdelen är att det kan vara tidskrävande och svårt att producera antikroppar. Biosensorer Biosensorer är analytiska instrument som integrerar biologiska sensorer med fysiska eller elektrokemiska signaler. Dessa har hittills främst utvecklats i syfte att detektera bakterier i mat och biologiska hot (Zijlstra 2009), men det finns exempel på metoder för detektion av växtpatogener (Wilson 2004). Biosensorer är fortfarande under utveckling, men på grund av att de möjliggör direkt detektion och kvantifiering av patogener och i vissa fall även är återanvändningsbara så är de ett framtida alternativ. Ett exempel på biosensorers användning beskrivs av Pan et al. (2009), som genom fluorescerande spektrofotometer har visat att det är möjligt att skilja olika arter av pollen och svampsporer. Denna metod är under utveckling. Nackdelen med denna typ är att de än så länge utvecklade metoderna endast kan detektera ett fåtal arter, och i vissa fall inte skilja patogena från mer harmlösa varianter. Ytterligare en potentiell metod som kan användas i biosensorer är elektrokemisk-baserad detektion av specifika DNA-sekvenser (Drummond 2003).

Gemensamt för ovanstående metoder är att de måste processas i laboratorier för att kunna detektera och kvantifiera proverna. Undantaget från detta är MTIST (Microtiter Immunospore Trapping Device), ett integrerat självstyrande system vilket tillåter snabb identifiering och kvantifiering av prover utan ytterligare analys (Kennedy 2000). Tyvärr verkar denna metod inte fått någon större kommersiell spridning, utan rapporteras främst från olika forskningsstudier.

Framtida möjligheter och situationen inom humanmedicin

Inom humanmedicin används sporfällor för att undersöka till exempel inomhusklimat på sjukhus, spridning av sjukdomar vid gränsövergångar och strategiska offentliga miljöer som marknader eller tunnelbanesystem. Växtpatologin har stora möjligheter att lära från humanmedicin. Xu et al. (2011) beskriver situationen inom bioaerosolforskningen inom humanmedicin. Hittills har det vanligaste användningsområdet varit att detektera och kvantifiera mikroorganismer i mat (Yang 2008). Inom humanmedicin är målet att kunna identifiera partiklar inom minuter (Xu 2011). Då är extraktion av DNA och PCR alldeles för långsamt, eftersom det tar flera timmar eller till och med dagar innan något resultat kan ges.

Idag ligger därför fokus på att utveckla och förbättra automatiserade system. I automatiserade system för detektion och kvantifiering av kontroll av patogener i mat och eller biologiska hot används två olika typer av metoder för att säkerställa resultatet. Ett exempel på ett sådant integrerat system är APDS (autonomous pathogen detection system), vilket är utvecklat i USA och används 9

för att upptäcka luftburna smittor i offentliga miljöer såsom flygplatser och tunnelbanor (Hindson 2005). APDS är ett helautomatiskt system som använder sig av multiplex immunoanalys och om provet är positivt bekräftas resultatet med hjälp av en PCR-reaktion. Eftersom det använder två olika metoder för att analysera prover minskar risken för falska resultat.

Nanoteknologin är på frammarsch, men idag finns endast ett fåtal tekniker för detektion av humanpatogener på marknaden (Driskell 2009). Många av teknikerna är antingen specifika för en eller ett fåtal patogener, eller kan uppskatta den totala mängden biologiskt material i luften. Det finns ännu ingen snabb teknik utvecklad där flera olika arter av patogener kan identifieras på kort tid.

Framtida möjligheter för användning av sporfällor inom växtpatologi

I princip alla typer av växtpatogener kan detekteras med hjälp av sporfällor. Traditionella metoder för diagnostisering, så som morfologiska undersökningar i mikroskop och odling av patogenen i laboratoriemiljö är tidskrävande och personen som utför uppgiften måste vara mycket erfaren inom området. Möjligheten att använda PCR-baserade metoder har öppnat nya möjligheter för korrekt detektion och av många olika arter och mycket små mängder av respektive växtpatogen. Det viktigaste är att detektionen sker snabbt, precist och är enkel att använda. I och med nya metoder har potentialen för användningen av sporfällor inom prognostiserings- och varningssystemen för växtskadegörare ökat. Beroende på i vilken skala fångsten av sporer sker, kan olika typer av patogener upptäckas. I karantänssyfte bör sporfällor placeras i närheten av riskområden/platser, till exempel vid införselpunkter av gods som kan tänkas innehålla karantänsskadegörare och andra strategiskt viktiga platser. De möjliggör även tidig detektion av växtpatogener, vilket ökar förståelsen för olika växtsjukdomar och chansen att avbryta potentiella epidemier i ett tidigt stadie ökar.

Sporfällor inom växtpatologin idag Sporfällor kan användas för alla typer av patogener, och redan idag finns metoder utvecklade för att detektera de flesta av de mest allvarliga växtpatogenerna. De i nuläget mest använda metoderna är visuell detektion i mikroskop och realtids-PCR. Idag är det dock få protokoll som är standardiserade för detektion av växtpatogener och ofta gäller de endast en eller ett fåtal specifika arter. Nackdelen med många av dagens metoder är att det krävs stora insatser för att kunna ge snabbt och riktigt resultat samtidigt som det vid detektion i många fall är omöjligt att avgöra om sporerna är levande eller inte. Om de inte är levande så kommer de inte leda till sjukdom. För varje art måste en specifik metod testas och utvecklas. I vissa fall kan närbesläktade arter som inte är patogener på odlade grödor ge falska positiva svar. Tänkbara metoder för framtiden Det är inte troligt att de mest lovande av de ovan beskrivna metoderna (automatiserade system med både immunoanalys och realtids-PCR) kommer att kunna erbjuda kostnadseffektivt sätt att detektera växtsjukdomar inom den 10

närmsta tiden (Lievens 2005) men förhoppningsvis kommer någon av dem att vara ett alternativ i framtiden. Microarray har stor potential eftersom det är möjligt att detektera väldigt många olika patogener i samma körning. Detta tillsammans med en nano-version av immunoanalys eller realtids-PCR, vilken bekräftar resultatet och möjliggör kvantifiering av mängden av patogenen i provet. Arbete med att utveckla dessa metoder har pågått under lång tid, men den allmänna tillämpningen har inte kommit igång. Detta beror troligtvis på att systemen fortfarande är mycket dyra i drift och att det än så länge krävs hög kompetens för att analysera och förstå resultatet. Förhoppningsvis kommer detta att ändras när metoderna utvecklas för andra områden (exempelvis inom humanmedicin) och göra dem mer tillgängliga även inom växtpatologin.

I Sverige finns möjligheten att använda nätet av Jordbruksverkets växtskyddscentraler. Det är en unik möjlighet att kunna jämföra insamlat material från sporfällor med växtskyddscentralernas graderingar av olika grödor inom ett område. Självklart innebär det ett mycket stort arbete, men det skulle också innebära att vi får en ökad förståelse för hur och när olika typer av växtpatogener sprids och därmed öka precisionen inom det integrerade växtskyddet.

Optimering av sporfällor nödvändig Det krävs inte bara en förbättring av analysmetoderna, utan även en förbättrad förståelse för hur proven samlas in. Jackson och Bayliss (2011) diskuterar de nu mest använda sporfällorna, och slutsatsen av deras diskussion är att olika sporfällor passar för olika ändamål. Hittills har sporfällor främst använts för att undersöka en eller ett fåtal växtpatogener i ett visst specifikt sammanhang. Jackson och Bayliss (2011) hävdar även att det ytterligare krävs stora investeringar i sporfälledesign för att de ska mäta mer noggrant, effektivt och kunna provta större luftvolymer över ett större område. De metoder som finns idag täcker endast korta avstånd och det är svårt, om inte omöjligt, att få en översiktsbild av vilka patogener som finns inom ett större område. De olika sporfällorna har olika egenskaper (se sammanställning i tabell 1). Exempelvis kan de i denna rapport beskrivna fällorna provta mellan 4 och 800 liter luft per minut. Den allra vanligaste fällan, Hirst-sporfällan, vilken också är den som används vid pollenprognostisering i Sverige (Anonym 2011), provtar ungefär 10 liter per minut. Det betyder ungefär 600 liter per timme eller 14,4 m3 per dygn. För att sätta det i relation till något annat så rymmer en betongbil vanligtvis cirka 6 m3. Det ger en fingervisning om hur lite luft som egentligen provtas varje dag.

Slutsatser Varje metod för detektion är specifik och om modeller för prognostisering av olika typer av organismer (till exempel insekter och svampar) ska kunna kombineras krävs att de inte inhiberar eller förhindrar detektion av varandra. En möjlig kombinationsmodell som för tillfället testas är om vattnet från bladlussugfällorna kan användas för att detektera växtpatogena svampar. Den i dagsläget mest reella metoden för detektion av växtpatogener är realtids-PCR. Inom humanmedicin har utvecklingen gått betydligt snabbare och där finns olika system beroende på vilken organism som ska detekteras. 11

Utvecklingskostnaderna för metoderna är höga och villigheten att betala för till exempel utvecklingen ett genchip för växtpatogener har hittills inte varit tillräckligt stor. Om resurserna fanns skulle det vara möjligt att göra ett sådant chip inom en inte alltför avlägsen framtid.

För att detektion av växtpatogener med hjälp av sporfällor ska kunna ske, krävs att det insamlade materialet antingen kan analyseras direkt i ett automatiskt system eller att det skickas till ett centralt laboratorium. Vilken typ av fälla som bör användas beror på vilken typ av patogen som önskas övervakas. I princip kan alla luftburna patogener vara aktuella i ett detektions- och prognostiseringssyfte. Men det krävs fortsatt forskning och jämförelse mellan de olika fångstmetoderna för att kunna svara på vilken typ av fälla som är mest lämplig för en generell insamling. Det bör också beaktas vad ett sådant system skulle kosta jämfört med vad det skulle tillföra näringen. Fortsatta studier om vilka patogener som är luftburna, och under vilka perioder, krävs för att kunna optimera användningen av sporfällor. I så fall skulle dagens mest använda metod, realtids-PCR kunna användas inom aktuella tidsramar och därmed förbättra möjligheten att kunna göra en tillförlitlig prognos för respektive växtsjukdom.

Referenser Anonym. (2011). "Så mäter vi pollen." Retrieved 2011-09-26, from http://www.nrm.se/sv/meny/faktaomnaturen/vaxter/pollen/samatervi pollen.285.html. Barnes, C. W., and Szabo, L. J. (2007). "Detection and Identification of four common rust pathogens of cereals and grasses using real-time polymerase chain reaction." Phytopathology 97(6): 717-727. Barnes, C. W., Szabo, L. J., and Bowersox V. C. (2009). "Identifying and Quantifying Phakopsora pachyrhizi Spores in Rain." Phytopathology 99(4): 328-338. Carvalho, E., Sindt, C., Verdier, A., Galan, C., O´Donoghue, L., Parks, S., and Thibaudon, M. (2008). "Performance of the Coriolis air sampler, a highvolume aerosol-collection system for quantification of airborne spores and pollen grains." Aerobiologia 24: 191-201. Driskell, J. D., and Tripp, R. A. (2009). "Emerging Technologies in Nanotechnology-Based Pathogen Detection." Clinical microbiology newsletter 31(18): 137-144. Drummond, T. G., Hill, M. G., and Bartion, J. K. (2003). "Electrochemical DNA sensors." Nature Biotechnology 21(10): 1192-1199. Garrett (2011). "Complexity in climate-change impacts: an analytical framework for effects mediated by plant disease." Plant Pathology 60: 15-30. Hindson, B. J., Anthony J. Makarewicz, Ujwal S. Setlur, Bruce D. Henderer, Mary T. McBride, John M. Dzenitis (2005). "APDS: the autonomous pathogen detection system." Biosensors and Bioelectronics 20(10): 1925-1931. Hirst, J. M. (1952). "An Automatic Volumetric Spore Trap." Annals of Applied Biology 39: 257-265. Hopkins, A. J. M., and Dick, M. A. (2009). "An examination of assessor variation during spore counting on spore traps of Neonectria fuckeliana." New Zealand Plant Protection 62: 250-255. Isard, S. A., Barnes, C. W., Hambleton, S., Ariatti, A., Russo, J. M.,Tenuta, A., Gay, D. A., and Szabo, L. J. (2011). "Predicting soybean rust incursions into the North American contintental interior using crop monitoring, spore trapping, and aerobiological modeling." Plant Disease 95: First look. Jackson, S. L., Bayliss, K. L. (2011). "Spore traps need improvement to fulfil plant biosecurity requirements." Plant Pathology 60: 801-810. Kennedy, R., Wakeham, A. J., Byrne, K. G., Meyer, U. M., and Dewey, F. M. (2000). "A New Method To Monitor Airborne Inoculum of the Fungal Plant Pathogens Mycosphaerella brassicicola and Botrytis cinerea." Applied and Environmental Microbiology 66(7): 2996-3000. Lacey, M. E., and West, J. S. (2006). The Air Spora A manual for catching and identifying airborne biological particles. Dordrecht, the Netherlands, Springer. Lievens, B., and Thomma, B. P. H. J. (2005). "Recent Developments in Pathogen Detection Arrays: Implications for Fungal Plant Pathogens and Use in Practice." Phytopathology 95(12): 1374-1380. López, M. M. (2009). "Are Molecular Tools Solving the Challenges Posed by Detection of Plant Pathogenic Bacteria and Viruses?" Curr. Issues Mol. Biol 11: 13-46. 13

Maldonado-Ramirez, S. L., Schmale, D G., Shields, E. J., and Bergstrom G. C. (2005). "The relative abundance of viable spores of Gibberella zeae in the planetary boundary layer suggests the role of long-distance transport in regional epidemics of Fusarium head blight." Agricultural and Forest Meteorology 132: 20-27. Pan, Y.-L., Pinnick, R. G., Hill, S. C., and Chang, R. K. (2009). "Particle-Fluorescence Spectrometer for Real-Time Single-Particle Measurements of Atmospheric Organic Carbon and Biological Aerosol." Environmental Science and Technology 43: 429-434. Schneider, R. W., Durr, E., and Giles, C.G. (2007). "A new spore trap that utilizes electrostatic deposition and scanning electron microscopy." Phytopathology 97: S105. Schneider, R. W., Haudenshield, J.S., Hartman, G.L., Mahaffee, W.F. (2010). "Development and Use of Fluorescent Antibody and qPCR Protocols for the Electrostatic Spore Trap." Phytopathology 99: S115. Shaw, M. V., and Osborne, T. M. (2011). "Geographic distribution of plant pathogens in response to climate change." Plant Pathology 60: 31-43. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., and Justesen, A. F. (2008). "Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors." Biosensors and Bioelectronics 24: 339-348. Teulon, D. A. J., and Scott, I. A. W. (2006). "The use of suction traps for detection of unwanted invasive insects and other invertebrates." New Zealand Plant Protection 59: 125-131. von Qualen, R., and Yang, X. B. (2006). "Spore traps help researchers watch for soybean rust." Integrated Crop Management 16: 185. Wang, J., Patel, V., Woolsey, C. A., Hovakimyan, N., and Schmale, D.G. (2007). L1 Adaptive control of a UAV for aerobiological sampling. Proceedings of the 2007 American Control Conference. New York, USA July 11-13: 46604665. West, J. S., Atkins, S. D., Emberlin, J., and Fitt, B. D. L. (2008). "PCR to predict risk of airborne disease." Trends in Microbiology 16(8): 380-387. Wilson, A. D., Lester, D. G., and Oberle, C. S. (2004). "Development of Conductive Polymer Analysis for the Rapid Detection and Identification of Phytopathogenic Microbes." Phytopathology 94(5): 419-431. Xu, Z., Wu, Y., Shen, F., Chen, Q., Tan, O., and Yao, M. (2011). "Bioaerosol Science, Technology, and Engineering: Past, Present, and Future." Aerosol Science and Technology 45: 1337-1349. Yang, L., and Bashir, R. (2008). "Electrical/electrochemical impedance for rapid detection of foodborne pathogenic bacteria." Biotechnology Advances 26(2): 135-150. Zijlstra, C., Lund, I., Justesen, A. F., Nicolaisen, M., Jensen, P. K., Bianciotto, V., Posta, K., Balestrini, R., Przetakiewicz, A., Czembor, E., and van de Zande, J. (2009). "Combining novel monitoring tools and precisison application technologies for integrated high-tech crop protection in the future (a discussion document)." Pest Management Science 67: 616-625.

Vanligtvis dygnseller veckovis

Variabel

Aktiv regnfälla

Bladlussporfälla

Ca 150

Beror på hastig heten

Roterande armar 24 h eller längre

Obemannade luftburna fordon

Variabel

500

200-630

50-800+

Passiv

PCR

Mikroskopi, PCR

Differentiallinjer

Sporidentifieringsmetod

Klibbig yta, petri-skål

Tejp

Tejp på alumi nium

Vätska

Mikroskopi, PCR

Elektronmikroskopi, PCR, immunoanalys

Mikroskopi, PCR, immunoanalys

Tejp, eppendorf- Mikroskopi, PCR rör

Vätska, filter

Vatten, filter

Objektglas med kladdig yta

Filter

Mottaglig värd

Volym luft Fångstyta provtagen (l/min)

Joniserande (DS Scientific)

5 min till 8 h

Vanligtvis dygnseller veckovis

Tubfälla

Coriolis luftprov tagare

Vanligtvis dygnseller veckovis

JB-sporfälla

24 h el 7 dygn

Kontinuerlig

Varningsrutor

Hirst fälla

Provtagningstid

Typ av sporfälla

Variabel

Specifik för arten

Ja, beror på insamlingsyta

Nej

Ja, beror på val av vätska

Möjlig, beror på typ av tejp

Variabel

<4 till >10

Variabel

Provtar specifikt område

Batteridriven, effektiv för stora sporer, ej känslig för vind, möjligt att direkt använda PCR

Insamlingen är elektrosta tisk, scanning av sporer kan automatiseras

Kort provtagningstid, risk för avdunstning av vätskan

Kontinuerlig provtagning, möjligt att reglera mängden luft, hög insamlings-effekti vitet, möjligt att använda PCR direkt

Mycket stora luftvolymer kan snabbt provtas, lång provtagningstid möjlig

Billig, enkel att hantera

Billig att tillverka och han tera, flyttbar

Enkel att gradera

Sporstorlek Fördelar

Ja, beror på typ Variabel av vätska res pektive filter

Nej

Sporers livsduglighet

Endast kortare provtag ningstider möjliga, svårt att manövrera fordonet

Korta provtagnings-peri oder, måste användas konti nuerligt för att upptäcka låga sporkoncentrationer, svårt att identifiera sporer i mikroskop

Kräver tillgång till elektron mikroskop eller avancerat laboratorium för immuno analys eller qPCR

Olika alternativ för prov analys möjliga, provtar stor luftvolym

Känslig för partikelstorlek och lufthastighet, tidskrä vande, kräver säker kraft källa, begränsad användning vid regn

Provet kan kontamineras under behandling, PCRreaktioner inhiberas pga föroreningar

Ingen fångst om det inte regnar

Svårt att skilja sporer och klibbigt material innan PCR

Relativt liten yta provtas, kontaminering mellan prov tagningsomgångar om inte rengörs ordentligt

Relativt dyrt att avsätta yta

Nackdelar

Tabell 1. Översikt över de vanligast använda sporfälletyperna, deras Tabell 1. Översikt över de vanligast använda sporfälletyperna, deras användningsområde samt för- och nackdelar med respektive fälla. användningsområde samt för- och nackdelar med respektive fälla. Tabell 1. Översikt över de vanligast använda sporfälletyperna, deras användningsområde samt för- och nackdelar med respektive fälla.

Rapporten kan beställas från Jordbruksverket • 551 82 Jönköping • Tfn 036-15 50 00 (vx) • Fax 036-34 04 14 E-post: jordbruksverket@jordbruksverket.se www.jordbruksverket.se

ISSN 1102-3007 • ISRN SJV-R-12/10-SE • RA12:10