Malezólogo Edición Especial

Autores José Luis González-Andújar Instituto de Agricultura Sostenible Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España) Albert Jean Fischer University of California-Davis Departament of Plant Sciences José Vicente Lazo Ariza Universidad Central de Venezuela Facultad de Agronomía Bernal E. Valverde Investigación y Desarrollo en Agricultura Tropical, S. A. (Costa Rica) Faculty of Life Sciences, The University of Copenhagen (Denmark) Aída Ortiz1, Alexis Abreu2 y Euval Solórzano3 1 Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía.

2 Instituto Nacional de Salud Agrícola Integral (INSAI)-Trujillo.

3 Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA)-Miranda.

Jesús Caripe Syngenta Crop Protection S.A. Venezuela José Alfredo Muñoz AGROISLEÑA Sucesora de Enrique Fraga Afonso C.A. Departamento Técnico Cástor Zambrano Universidad Central de Venezuela Facultad de Agronomía Pablo Manuel Rodríguez González Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” Decanato de Agronomía

Capítulo 1 ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS EN DEMOGRAFÍA DE MALEZAS José Luis González Andújar Instituto de Agricultura Sostenible (CSIC, España) Introducción Necesitamos ser capaces de identificar y conocer los factores biológicos y ecológicos que determinan la evolución de las poblaciones de malezas. Dichos conocimientos son vitales para desarrollar métodos predictivos y de manejo más efectivos de la flora arvense.

Las poblaciones de malezas están formadas por individuos que varían en su estado funcional (semilla, plántula, planta adulta,…). Un conocimiento mas profundo de dichas poblaciones y su evolución implica la cuantificación de los procesos demográficos que ligan los distintos estados funcionales. Por ello, la estructura de la población, es decir, del número de individuos presente en los diferentes estados en un momento determinado, es el punto de partida para el estudio de cualquier proceso demográfico.

Los estudios demográficos en malezología han demostrado tener una gran utilidad práctica y en general se basan en la división del ciclo biológico de la planta en diferentes estados funcionales, por ejemplo, los estudios mas simples, dividen el ciclo de vida de las malezas en cuatro fases: banco de semillas, plántulas, plantas adultas y lluvia de semillas, cada fase está unida a otra a través de los procesos demográficos: germinación (g), supervivencia (o longevidad) del banco de semillas (sb), supervivencia de las plántulas (s) y fecundidad (f) (Fig. 1).

Lluvia de semillas

f Adultos

s Plántulas

g

sb

Banco de semillas

Figura. 1. Modelo demográfico básico de una maleza. Emergencia (g), supervivencia del banco de semillas (sb), supervivencia de las plántulas (s) y fecundidad (f)

La estimación de los parámetros que representan los procesos demográficos nos permiten poder desarrollar modelos poblacionales y predecir la dinámica poblacional de la maleza y su evolución bajo diferentes escenarios de manejo.

Estimación de los parámetros demográficos Supervivencia del banco de semillas La presencia de una determinada población dentro de una zona se debe, habitualmente, a la existencia de una reserva de semillas (o de propágulos de otro tipo) enterrada en ese suelo.

Estos bancos de semillas suelen ser el origen principal de las infestaciones de malas hierbas. La mayoría de los suelos agrícolas contienen una enorme reserva de semillas y propágulos diversos, denominada banco de semillas. Algunos estudios en campos agrícolas han llegado a cuantificar hasta 39000 semillas m-2. El banco de semillas sufre un proceso de pérdidas debido a diferentes factores de mortalidad. Entre los principales motivos de pérdida de semillas y propágulos (bulbos, rizomas, etc.) se pueden citar las técnicas de laboreo, depredación, parásitos o los eventos de germinación. Generalmente, todos esos factores de mortalidad son cuantificados conjuntamente para estimar la tasa de supervivencia del banco de semillas (sb; Fig. 1).

La cuantificación de sb se puede realizar por diferentes métodos. Aquí explicaremos uno de los métodos más sencillos para establecer la supervivencia de semillas (sb) en el banco de semillas. En primer lugar tenemos que considerar el período de tiempo (anual, mensual, etc.) en el cual queremos evaluar la supervivencia. Una vez hayamos establecido dicho período de tiempo, pasaremos a evaluar el banco de semillas de la especie considerada en el tiempo 1 y en un tiempo posterior 2 (siempre antes de la reproducción de la planta). Para ellos tomaremos en ambos períodos de tiempo muestras del suelo. Una descripción mas detallada de la cuantificación del banco de semillas se puede encontrar en otro capítulo del presente libro Por lo general el banco de semillas está confinado a los 10 cm superiores, siendo esa la profundidad a que deberemos extraer las muestras. En relación con el número de muestras a extraer, dicho número lo podemos establecer a partir de la Tabla 1, considerando una estima del banco de semillas que vamos a encontrar y el nivel de precisión que deseamos alcanzar.

Si bien los bancos de semillas varían ampliamente en densidad, el valor medio para los cultivos de campo en Andalucía (España), es de cerca de 1000 semillas/m2 en cultivos cerealistas. La estimación de esta densidad podría requerir 21 muestras para un nivel de precisión recomendada de 0,3 de acuerdo con la Tabla 1. Claramente, las especies con densidades muy bajas (<100 semillas/m2) podrían requerir tantas muestras de suelo que una determinación precisa de sus bancos de semillas no es práctica.

En cuanto al diámetro que deberá tener el barreno para extraer las semillas, nuestra experiencia indica que las muestras de 5 cm. de diámetro son una solución adecuada (Fig. 2).

Esta medida de la muestra es lo suficientemente grande como para detectar semillas y lo suficientemente pequeña para no recargar al investigador con un exceso de materiales.

Tabla 1. Número de muestras de suelo (diámetro 5 cm.) necesarias para determinar las densidades de los bancos de semillas en cuatro niveles deseados de precisión suponiendo varias densidades de semillas.

-------------Nivel de precisión -----------Banco de semillas 0,2 0,3 0,4 0,5 2 (semillas/m ) 716 318 179 115 10 277 123 69 44 50 184 82 46 29 100 71 32 18 11 500 47 21 12 8 1000 18 8 5 3 5000 12 5 3 2 10000

Figura 2. Toma de muestras de banco de semilla Una vez se han extraído las muestras en los períodos considerados y contadas las semillas de la especie de interés, la tasa de supervivencia se obtendrá de la siguiente forma: sb= nº semillas período 2/ nº semillas período 1 (1) siendo el valor obtenido ≤ 1.

Emergencia de plántulas Las semillas de muchas malezas anuales de verano están latentes cuando ellas se desprenden de sus plantas progenitoras. Aun semillas más viejas en el banco de semillas pueden estar en estado de latencia al final del verano. A veces, durante el siguiente otoño, invierno y/o al comienzo de la primavera, una proporción de estas semillas se capacita para su germinación.

En este momento ellas tienen un máximo “potencial de emergencia”. Los potenciales máximos de emergencia de algunas especies, son por ejemplo: Abutilon theophrasti 54%, Avena sterilis 37%, Polygonum pensylvanicum 49%, Amaranthus spp. 13% y Chenopodium album 10% , si bien dichos porcentajes pueden variar bastante en función de la localidad y factores ambientales.

La tasa de emergencia (g) se calcula de la siguiente manera. Se colocan 10 marcos fijos de 0,50 x 0,50 cm al azar en el campo de cultivo. Semanalmente desde la siembra hasta la recolección se cuentan las emergencias que aparezcan de la especie estudiada. Después de los conteos, las plántulas se marcan, por ejemplo con un anillo de plástico semirrigido, para evitar volver a contarlas.

Una vez tengamos el total de plántulas emergidas y basándonos en el banco de semillas estimado anteriormente, podemos establecer de una forma sencilla la estima de la tasa de emergencia, g= nº de plántulas /nº de semillas período 1 (2) siendo el valor obtenido ≤ 1.

Supervivencia de las plántulas No todas las plántulas emergidas van a poder convertirse en plántulas adultas. Las plántulas van a sufrir un proceso de mortalidad debido a diferentes factores, como por ejemplo, herbívoros, competencia inter e intraespecifica, enfermedades, etc.

En el experimento para cuantificar las emergencias, las plántulas emergidas son marcadas con algún distintivo (e. j. anillos de plástico semirrigido), de esa manera podemos seguir la evolución vital de la planta hasta convertirse en planta adulta. Al final del período se realiza un muestreo final donde se cuantificará el nº plántulas y el nº total de las emergidas a través del nº total de anillos de plástico (o cualquier otro método de marcaje considerado). La tasa de supervivencia se cuantificará como, s= nº de plantas supervivientes/ nº total de plántulas emergidas (3) siendo el valor obtenido ≤ 1.

Fecundidad La capacidad de producción de propágulos es muy variable (por ejemplo, Avena sterilis produce 100 semillas/ planta, mientras que Salsola kali produce unas 200 mil/ planta), y depende tanto de la especie en sí, como de los factores ambientales que le afectan. En general, las especies de semillas más pequeñas son más prolíficas que las de semillas mayores (Salsola o Amaranthus > Avena o Galium aparine). La tabla 2 nos ilustra del poder de producción de semillas de las malezas

Tabla 2. Ejemplos de la capacidad reproductiva de algunas malezas Planta Amapola (Papaver rhoeas) Matricaria spp.

Zanahorias silvestres (Daucus carota) Jaramago (Sinapis spp.)

Número de semillas/planta 50-60.000 45.000 1.200-11.000 1.200-4.000

La estimación de la fecundidad la llevaremos a cabo recolectando las semillas de un mínimo de 10 plantas adultas, y estimándola de la siguiente manera, f= nº semillas total/ nº plantas adultas (4) en este caso el nº de plantas sería 10.

Desarrollando un modelo de dinámica de poblaciones Un sencillo modelo multiestados funcionales es el modelo conceptual representado por la Fig. 1 que puede ser transformado matemáticamente en las siguientes ecuaciones utilizando los parámetros demográficos ya definidos P = BSt * g (6) donde P representa el número de plántulas producida por el Banco de semillas (BS). En este punto podemos introducir las medidas de control introducidas por el ser humano (e. j. herbicidas), modificando la ecuación 6 de la siguiente manera, (7) P = BSt * g (1-c) siendo c el porcentaje de las semillas emergidas que van a sufrir el proceso de mortalidad. El valor del parámetro c se puede obtener de ensayos de herbicidas.

Del total de plántulas emergidas únicamente una proporción s se va a convertir en plantas adultas (PA) PA = P * s (8) Las plantas adultas tienen una tasa de fecundidad f , cuyo producto va a dar lugar a la lluvia de semillas (LLS, semillas/ m2), LLS = PA * f (9) Finalmente, el banco de semillas que inicia la siguiente campaña agrícola (BSt+1) vendrá dado por, (10) BSt+1=LLS+ BSt (1-g-sb) que representa la nuevas semillas que se incorporan (LLS) mas las semillas que han sobrevivido en el suelo durante el período de tiempo considerado. Es decir las semillas en suelo que iniciaron la campaña agrícola BSt se han visto mermadas por las semillas que han emergido (g) y la mortalidad que han experimentado en el suelo (1-sb).

Sustituyendo los parámetros demográficos por sus estimas, siguiendo la metodología expuesta, podemos simular el modelo por un período de, digamos, 5 años y tendremos una gráfica como la representada en la Fig. 3. En dicha gráfica se han considerado dos escenarios: El primer escenario consiste en no aplicar ninguna medida de control, observando que la población del banco de semillas crece exponencialmente. En el segundo escenario se ha

considerado un control anual del 90% (c= 0,9 en ecuación 7), con el cual la población decrece llegándose a la extinción de la misma a los 5 años (Fig. 3).

Banco de semillas (semillas/m2)

60 50 40 30 20 10 0 1

2

3

4

5

tiempo

Figura 3. Simulación de la evolución en el tiempo del Banco de semillas de una maleza. ● (sin medidas de control). ■ (aplicación de un control del 90%) Los modelos de dinámica de poblaciones son herramientas muy útiles para evaluar diferentes escenarios de control a medio y largo plazo y, de esa forma, ayudar a los productores en la toma de decisiones.

Lecturas para profundizar Cousens, R. and Mortimer, A. M. (1995). Dynamics of weed populations. Cambridge : Cambridge: Cambridge University Press.

Fernandez-Quintanilla, C. (1988). Studying the population dynamics of weeds. Weed Research 28, 443-441.

Gonzalez-Andujar, J. L. (2008) Weed Control Models. Population Dynamics. Vol. [5] of Encyclopedia of Ecology, 5 vols. (Eds. Sven Erik Jørgensen and Brian D. Fath), pp.3776-3780. Oxford: Elsevier.ISBN: 0-444-52033-3.

Gonzalez-Andujar, J. L. and Fernandez-Quintanilla, C. (2004). Modeling the population dynamics of annual ryegrass (Lolium rigidum) under various weed management systems. Crop Protection 23, 723-729.

Radosevich, S. R., Holt J. S. and Ghersa C. M. (2007). Ecology of Weeds and Invasive Plants: Relationship to Agriculture and Natural Resource Management, 3rd Edition.

John Wiley & Sons, Inc. Swanton, C. J., Booth, B. and Murphy, S. D. (2003) Weed ecology in Natural and agricultural systems. Wallingford, Oxfordshire, U.K.: CABI Publishing.

Torra, J; Gonzalez-Andujar, J. L and Recasens, J (2008). Modelling the long term population dynamics of poppy (Papaver rhoeas) under various weed management systems. Weed Research. 48:136-146.

Capítulo 2 LA INTERFERENCIA MALEZAS-CULTIVOS: ALGUNAS TÉCNICAS PARA SU INVESTIGACIÓN Albert Fischer Universidad de California-Davis (USA) Introducción Programas de manejo económico de malezas que contemplen reducciones en el empleo de herbicidas deben ser capaces de predecir los impactos potenciales de las malezas sobre las especies de interés. Estimaciones de las pérdidas de productividad basadas en la evaluación temprana de los niveles de infestación de malezas a fin de poder realizar evaluaciones de costo y beneficio que sirvan de guía para las tome de decisiones en control de malezas.

Factores tales como la densidad de la maleza y el cultivo, las proporciones relativas de las especies presentes, y el arreglo geométrico de las plantas en el terreno son relevantes en determinar el resultado de las interacciones de interferencia entre especies.

Una comprensión de los procesos involucrados en las interacciones de interferencia es esencial para conceptualizar tácticas y estrategias exitosas en el manejo de las malezas.

Presentamos aquí algunas técnicas experimentales básicas que pueden aplicarse en el estudio de la interferencia de las malezas con las especies de interés tomando ejemplo de diversas situaciones. Estas técnicas son la plataforma basal sobre la que un investigador puede montar estudios más elaborados; se basan muchas veces en conceptos desarrollados hace ya mucho tiempo, pero representan hoy en día una selección de ciertas herramientas fundamentales para un investigador moderno en la ciencia de las malezas.

Interferencia, competencia y recursos Cuando las plantas crecen en proximidad, su crecimiento se altera con respecto al que exhiben cuando crecen en ausencia de plantas vecinas. El crecimiento en comunidad es reflejo de las interacciones que ocurren entre las plantas. Así, el crecimiento de una planta individual puede ser estimulado, deprimido o permanecer inalterado.

El término interferencia negativa se refiere a las alteraciones estimuladoras, inhibidoras o neutrales del crecimiento que resultan de la proximidad de otras plantas (Donald 1963; Harper 1977; Radosevich et al. 2007). Las formas de interferencia entre plantas son diversas. Ésta puede resultar del consumo de recursos cuyo suministro por el ambiente es limitado, de la liberación de toxinas o estimulantes al sustrato de crecimiento, de efectos protectores o de acciones de depredación y parasitismo (Harper 1977; Radosevich et al. 2007). Competencia (alelospolía) y amensalismo son ejemplos de interferencia negativa. La competencia se relaciona con los recursos de crecimiento que una planta consume: principalmente luz, agua, nutrientes, oxígeno y dióxido de carbono. El sumninistro de estos recursos por el ambiente suele ser limitado y la presencia de vecinos agrava la situación (Radosevich et al. 2007).

Competencia (alelospolía es un término que también se usa en la literatura para referirse a esta interacción) es el efecto adverso expresado por aquellas plantas de una comunidad que deben sostenerse con recursos limitados. Amensalismo puede ocurrir cuando sólo se afecta el crecimiento de una especie mientras que el de otra especie coexistente no es alterado. Un

caso particular de amensalismo es la alelopatía que ocurre cuando ha existido una liberación de cierta sustancia tóxica por parte de la especie no afectada (Radosevich et al. 2007). La alelopatía puede inhibir a ambas especies si las dos producen sustancias tóxicas resultando en mutuo antagonismo. Existen también casos de interferencia neutral y positiva que no trataremos aquí, aunque algunos autores sostienen que el término interferencia solamente se refiere a las interacciones negativas (Silvertown 1987).

Relación productividad vs. densidad en monocultivo Monocultivo se refiere a comunidades monoespecíficas donde la densidad (número de plantas por unidad de área) puede ser variable. Cuando la densidad de individuos de cierta especie se incrementa, también lo hace la competencia intraespecífica entre esos individuos a medida que los recursos ambientales para el crecimiento se vuelven cada vez más limitados.

Una respuesta plástica al aumento de densidad es la reducción del crecimiento individual a medida que la productividad total de biomasa por área se incrementa (Harper 1977). A medida que las plantas crecen con el tiempo, se alcanzará en algún momento la capacidad de carga del ambiente. Esta capacidad de carga será alcanzada en primer lugar por las densidades más elevadas. Para que el crecimiento individual o la densidad pueda incrementarse aún más al aproximares la capacidad de carga de cierto ambiente, es necesario que ocurra mortalidad de ciertas plantas y que se liberen los recursos necesarios para sostener ese crecimiento individual adicional (Silvertown 1987). El resultado de esta situación se muestra en la Figura 1 donde la productividad total de biomasa por área se mantiene constante independientemente de la densidad una vez que se ha alcanzado la capacidad de carga debido a la compensación por la reducción del crecimiento individual y la mortalidad. Este balance da lugar a lo que se conoce como ley del rendimiento final constante (Harper 1977; Radosevich et al. 2007) donde la relación entre el peso promedio de la biomasa individual por planta (w) y la densidad (d) está dada por la expresión siguiente: w= kd-1

[1]

tal que log w = log k – log d

[2]

ahora, si la productividad total por área (Y) se expresa como: Y = wd,

[3]

Entonces Y = d(kd-1), para k = constante (Silvertown 1987).

[4]

Así, una población no muy densa cesará su crecimiento de biomasa total con el tiempo una vez que alcance la capacidad de carga de ese determinado ambiente. Cualquier incremento adicional en el crecimiento medio individual de cada planta ocurrirá a expensas de una reducción exactamente proporcional de la densidad como resultado de mortalidad y se cumplirá con la relación de la ecuación [2]. Una gráfica de log (w) vs. log(d) para una población no muy densa mostrará una línea de pendiente = -1 (Figura 2). En poblaciones muy densas, las pequeñas plantas también incrementarán su peso con el tiempo, pero enfrentarán mortalidad antes de que la productividad total haya alcanzado la capacidad de carga y antes de que el crecimiento total de biomasa de la población haya cesado (Silvertown

1987). Empíricamente se ha comprobado que poblaciones densas que hayan alcanzado el tamaño para el cual ocurre mortalidad muestran una relación entre log(w) y log(d) cuya pendiente generalmente se aproxima a -3/2 (Figura 2) (Westoby 1981). Entonces a elevadas densidades: W = kd-3/2

[5]

tal que log w = log k – 3/2 log d

[6]

Cuando se alcanza la capacidad de carga, la producción de biomasa total por área (w × d) no se incrementa con el tiempo. Pero mientras las poblaciones densas están aún bajo auto-raleo -3/2 (Radosevich et al. 2007; Silvertown 1987) antes de alcanzar la capacidad de carga, la producción de biomasa individual se incrementa con el tiempo a razón de 3 unidades por cada dos unidades de reducción de densidad y la biomasa total de la población crece con el tiempo (Silvertown 1987). Una vez que la densidad se haya reducido lo suficiente por este proceso de auto-raleo, la población se comportará según la ecuación [1] y la biomasa total se equilibrará como en el “plateau” de la Figura 1.

Si en lugar de considerar a la productividad como biomasa total como en el caso de la Figura 1, la consideramos en términos de rendimiento reproductivo (semilla o grano), su relación con la densidad generalmente muestra la respuesta parabólica de la Figura 3 (Donald 1963; Silvertown 1987). Esto puede deberse a factores dependientes de la densidad incremental, también llamados factores densodependientes, como mortalidad antes de la floración, incremento en la esterilidad, o reducción en el número de semillas producidas por planta (Sivertown 1982). En el caso del maíz, la esterilidad suele ocurrir con el incremento del sombreo a elevadas densidades (Duncan 1969). Esas plantas estériles utilizarán recursos ambientales para el crecimiento sin contribuir al rendimiento. Es por esa razón que cuando se trata de maximizar el rendimiento reproductivo con un cultivo, se hace necesario hallar una densidad óptima; mientras que cuando se trata de maximizar el rendimiento de un forraje, las densidades pueden ubicarse dentro del rango de horizontalidad de la curva en la Figura 1 (Donald 1963), lo cual hacen muchos agricultores para favorecer la competencia del forraje con las malezas. Si bien es bien sabido que incrementos en la densidad de un cultivo suelen aumentar su capacidad para competir con y suprimir malezas (Medd et al. 1985; Ghafar & Watson 1983; Walker & Buchanan 1982), la densidad de un cultivo de grano libre de malezas no puede incrementarse más allá de un óptimo si se mantiene un mismo arreglo espacial de plantío.

Captura de espacio y distancias entre plantas “Espacio” es un concepto que integra al conjunto de recursos ambientales que una planta requiere para vivir. Según De Wit (1960) cada planta ocupa un “espacio” que es reflejo del suministro limitado de recursos ambientales consumibles (luz, agua, nutrientes, oxígeno y CO2). La presencia de vecinos requiriendo los mismos recursos resultará en competencia por “espacio” (Radosevich et al. 2007). Asir este espacio mediante la apropiación de recursos es lo que se conoce como captura de espacio. La captura de espacio ocurre temprano en la vida de las plantas y aquellas que emerjan tarde dentro de una comunidad crecerán muy poco pues las plantas de aparición temprana ya se habrán apropiado de la mayoría de los recursos

disponibles (Fischer & Miles 1973; Radosevich & holt 1984). En ciertos casos un reajuste de las distancias de plantío permite incrementar la captura de espacio de un cultivo y así incrementar su capacidad de competir con malezas u otra especie asociada. Para una misma densidad, el empleo de un arreglo equidistante (equilateral o hexagonal) de plantío reduce la competencia intraspecífica entre plantas del cultivo en comparación con un arreglo rectangular (cultivo en hileras con plantas más próximas entre sí dentro de la hilera). Las plantas individuales pueden así desarrollarse mejor, lo cual a menudo incrementa su capacidad para capturar espacio y su competitividad interespecífica para competir con malezas u otra especie asociada (Fischer & Miles 1973; Spitters 1983; Altieri & Liebmann 1986; Walker & Buchanan 1982; Fischer & Burrill 1993). Según Fischer & Miles (1973), reducir la distancia entre hileras en un cultivo bajo una misma densidad (incrementando así la distancia entre plantas dentro de la fila) suele tener un mayor efecto supresor de la maleza que un incremento en la densidad. Una desventaja que puede tener el arreglo equilateral de plantío es que, al favorecer un mayor desarrollo temprano del dosel, se puede hacer un consumo prematuro de agua almacenada en el suelo y en años secos causar estrés hídrico a cultivos pluviales (Taylor 1980). Bajo condiciones de humedad adecuada, Wiese et al.

(1964) obtuvieron mejores rendimientos de sorgo bajo arreglo equidistante que en hileras amplias.

Algunas técnicas experimentales para estudiar interferencia entre especies La competencia entre plantas involucra relaciones complejas, donde diferentes especies interactúan por recursos ambientales. La capacidad de apropiarse de esos recursos suele diferir entre las especies (Roush & Radosevich 1985; Vengris et al. 1955) y está condicionada por el ambiente. Según Caldwell et al. (1985), la competencia entre plantas se estudia mediante experimentos que manipulan el escenario de la competencia de diferentes formas como por ejemplo, eliminando o adicionando individuos vecinos o variando los niveles de disponibilidad de recursos para el crecimiento. Limitando experimentalmente el suministro de ciertos recursos a una comunidad de plantas, puede generarse información sobre las relaciones y jerarquías competitivas entre las especies involucradas frente a recursos específicos. La complejidad de esas interacciones y de las asociaciones entre plantas ha llevado al desarrollo de ciertas técnicas experimentales para estudiar interferencia que al agrónomo se le hacen muchas veces extrañas. Algunas de estas técnicas discutiremos a continuación dado que permiten examinar la naturaleza de los recurso por los cuales se establece la competencia, los niveles intra- e interespecíficos de la interferencia, la respuestas densodependientes de las plantas, los efectos de proporciones variables entre las especies que componen una comunidad, y el efecto de la distribución geométrica de las especies en el terreno sobre las consecuencias finales de la interferencia. Siempre nos manejaremos en el marco conceptual de la interferencia, pero siempre que hacemos referencia a la manipulación y captura de recursos, nos estaremos refiriendo implícitamente a interacciones de competencia.

Parcelas apareadas Una forma inicial de estudiar el impacto de las malezas sobre los cultivos de una región puede ser el de instalar parcelas apareadas en campos de productor. Una parcela permanece desmalezada y otra representa las prácticas usuales de desmalezado del agricultor. Esta es

una excelente forma de evaluar la eficiencia del control de malezas que practica el agricultor.

Una tercera parcela, enmalezada, puede incluirse en campos con enmalezamiento heterogéneo para percibir cómo varían los rendimientos con diferentes niveles de infestación.

Los predios a evaluar deberán agruparse por tipo de cultivo y manejo. Se registrará el rendimiento del cultivo y el nivel de infestación por especie de malezas en cada parcela. El nivel de enmalezamiento puede evaluarse midiendo su biomasa en un área de muestreo, haciendo conteos, o mediante una evaluación visual de cobertura y vigor sobre el área total de las parcelas. Las dos (tres) parcelas deben instalarse como un grupo, una junto a la otra, y se pueden ubicar varios grupos de parcelas dentro de un mismo predio.

Experimentos aditivos En los experimentos aditivos una especie (frecuentemente un cultivo) se planta a densidad constante y la especie competidora se asocia a esta bajo diferentes densidades (Silvertown 1987). Esto permite comparar la agresividad de diferentes competidores contra una especie de interés. En general la relación densidad-productividad (o rendimiento de un cultivo) sigue la ley de las ganancias decrecientes, pudiendo incluso llegar a la pérdida de producción total (Radosevich & holt 1984). Esencialmente estos diseños se han usado para averiguar cuánto rendimiento comercial se pierde por la presencia de malezas. Los diseños aditivos se han empleado también para establecer umbrales de densidad de infestación de malezas; niveles de infestación menores a las densidades umbral no resultarían en daño físico o económico (Schweitzer & Bridge 1982). Los datos usualmente se someten al análisis de varianza y de regresión con modelos lineares y, más frecuentemente, no lineares.

Sistemas expertos computarizados basados en análisis económico a corto y largo plazo han sido desarrollados para diversos cultivosa fin de asistir en decisiones sobre control de malezas (Coble & Mortensen 1992; Lybecker et al. 1991; Wilkerson et al. 1991; Kwon et al.

1995). Tales programas deben basarse en ecuaciones precisas capaces de predecir pérdidas de rendimiento causadas por la competencia de malezas. Esos modelos simples y empíricos pueden tener mejor adopción por los usuarios que los más complejos modelos ecofisiológicos (Kropff 1993) que resultan extremadamente laboriosos de parametrizar (Kropff 1993; Kropff & Spitters 1991) y suelen más adecuados para la investigación que para el uso práctico. En su lugar, se han utilizado ampliamente diversas funciones hiperbólicas rectangulares, las que son más fáciles de estimar, a fin de predecir los efectos de la densidad de infestaciones de malezas sobre el rendimiento de cultivos (Cousens 1985a, 1985b; Kropff & Lotz 1993; Coble & Mortensen 1992). La Figura 4 muestra una relación densidad-pérdida de rendimiento hiperbólica descripta por una hipérbola rectangular usando la fórmula de Cousens (1985a): RP = iD/[1 + (iD/a)]

[7]

Donde: RP es porcentaje del rendimiento perdido, D es densidad de maleza, i es el porcentaje del rendimiento perdido con cada planta de maleza adicional cuando D es cercana a cero, y a es una asíntota que corresponde a la pérdida máxima de rendimiento cuando D tiende al infinito.

El período comprendido entre la emergencia del cultivo y la maleza afectan la jerarquía competitiva entre ambos, y puede ser un factor más critico aún que la densidad de la maleza en determinar la necesidad de la aplicación de medidas de control de malezas (Knezevic et

al.1993; Kropff 1988). El uso de modelos de simulación también ha demostrado que diferencias en las fechas relativas de emergencia entre malezas y cultivo suelen ser responsables por gran parte de la variación estacional que ocurre en los niveles de pérdida de rendimiento por competencia de malezas (Kropff & Lotz 1993). A fin de contabilizar este efecto fueron introducidas ciertas modificaciones al modelo hiperbólico básico de Cousens (1985a): RP = bD/[ect + (bD/a)]

[8]

Donde: t es el tiempo relativo de emergencia entre la maleza y el cultivo, b es el valor de i (Ec. [7] cuando t tiende a cero, y c es la tasa a la cual i decrece cuando t se incrementa hacia el infinito (Cousens et al. 1987). Otro modelo propuesto también por Cousens (1985b) intenta contabilizar el efecto de las densidades de amos, la maleza y el cultivo: RP = gfD/(1 + dC + fD)

[9]

Donde C es la densidad del cultivo, y d, f, y g son parámetros empíricos no lineares. Las relaciones para predecir pérdidas de rendimiento causadas por la competencia de malezas han a menudo considerado a una sola especie que emerge de una sola vez en una población uniforme de plantas cultivadas(Smith 1988; Dieleman et al. 1995; Van Devender et al. 1997).

En las condiciones reales de campo, las infestaciones de malezas usualmente consisten de diversas especies presentes en diferentes densidades y emergiendo en momentos diferentes.

Por lo tanto, una función para predecir pérdidas de rendimiento por malezas debe estar basadas en variables independientes que sean capaces de expresar la competitividad de una infestación multiespecífica de malezas dentro de poblaciones de un cultivo que pueden no ser demasiado uniformes come resulta de las siembras al voleo donde las semillas son enterradas con pases de rastras.

Relaciones densidad-pérdida de rendimiento basadas en conteos del número de plantas por área tienen el inconveniente de asignar el mismo valor a las plantas grandes que a las plantas pequeñas o a plantas de formas muy diferentes, sin tener en cuenta las diferencias en competitividad que eso puede implicar. Coble y Mortensen (1992) intentaron compensar esta limitación ponderando las densidades de las especies individuales en una infestación mixta de malezas por un factor que expresaba su competitividad relativa. Este factor (el i de la fórmula de Cousens [7], por ejemplo) se obtenía de experimentos aditivos con especies de maleza individuales. Un enfoque similar fue utilizado por Fischer & Ramírez (1993) con arroz de riego. Simulaciones conducidas con un modelo ecofisiológico demuestran que cuando los niveles de infestación se cuantifican como área foliar relativa de las malezas (áerea foliar de la maleza/área foliar cultivo+maleza) determinada al momento de la clausura total del dosel cultivo + maleza (cuando el índice de área foliar total es aproximadamente = 1) se relacionan mucho mejor con las pérdidas de rendimiento correspondientes que cuando las infestaciones se expresan en base a simples conteos de densidad (Kropff & Spitters 1991).

Por lo que el área foliar relativa puede ser un mejor descriptor de la presión competitiva de una infestación que la densidad. El área foliar relativa representa la captura relativa que hacen el cultivo y la maleza del recurso luz, que en la mayoría de los casos es un factor primordial determinante del resultado de la competencia. Kropff y Lotz (1993) propusieron otro modelo hiperbólico basado en área foliar relativa:

RP = qL/[1 + [(q/a)- 1]L

[10]

Donde la variable independiente L es el área foliar relativa de la maleza como fracción del área foliar total (cultivo+maleza), q es la pendiente de la hipérbola o el coeficiente relativo de daño que puede usarse como índice de competitividad relativa de esas especie de maleza con el cultivo (Kropff & Spitters 1991), a es la asíntota para la pérdida máxima de rendimiento.

Florez et al. (1999) hicieron un estudio en arroz donde poblaciones heterogéneas de malezas emergieron a los 15 y 30 días posteriores a la emergencia del cultivo. Usando los modelos [7], [9] y [10] concluyeron que con el modelo [10] y el área foliar relativa se obtenían mejores ajustes que con los otros modelos y la variable independiente (D) expresada como densidad, biomasa, o área foliar. La predicción con el modelo [10] era incluso mejor si la variable dependiente usada era una estimación visual de cobertura foliar relativa. Una variante del modelo [10] es un modelo similar donde se asume que a densidades de maleza realmente alta la pérdida de rendimiento del cultivo es total: RP = qL/[1 +(q-1)L

[11]

Florez et al. (1999) describieron adecuadamente niveles de infestación de mezclas de malezas de varias especies (mezcla multiespecífica) usando el área foliar relativa o la cobertura foliar relativa. Pero un tratamiento más adecuado y que dio una mayor precisión en la predicción de pérdidas de rendimiento se obtuvo al considerar el efecto de cada especie por separado y luego agregar todas las respuestas de forma aditiva en un solo modelo como había sido sugerido por Fischer & Ramírez (1993); Kropff & Lotz 1993; Parker & Murdoch 1996): RP = ∑{ inLn/[1 + (inLn/an)]}

[12]

Donde el subíndice n corresponde al efecto de la enésima especie de maleza y L es área foliar relativa o cualquier otra variable que exprese el nivel de infestación (densidad, biomasa por área, etc.). Kropff & Lotz (1992) proponen el siguiente y similar modelo cuando se usa área foliar relativa como variable para mantener coherencia con la derivación de su modelo anterior [10]: RP = ∑qnLn/[1 + ∑ (qn-1)Ln]

[13]

En la práctica nosotros no encontramos ninguna diferencia al usar cualquiera de los dos modelos [12] o [13] así como cuando se usaron los modelos [7] y [10] con área foliar relativa (Florez et al. 1999). Los modelos hiperbólicos de pérdida de rendimiento empleando variables que sean buenos descriptores de la competitividad de una mezcla multiespecífica de malezas permiten el análisis económico de opciones de manejo y control de malezas al permitir confrontar costos con el valor de las pérdidas potenciales.

El empleo de estos modelos para definir umbrales económicos de infestación siempre se ha criticado pues los efectos a largo plazo de no controlar malezas cuando las infestaciones son inferiores a los niveles de umbral puede conducir al incremento del reservorio de malezas en el suelo y a mayores niveles de infestación futuros (Bauer & Mortensen 1992) o a la propagación de biotipos de malezas resistentes a herbicidas. También Norris (1982) señala

que densidades de malezas mucho menores de las que usualmente aöarecen en los cultivos ya son capaces de causar cuantiosas pérdidas de productividad. Sin embargo, la utilidad de la predicción de pérdidas de rendimiento como componente de sistemas expertos de decisión va más allá de la simple decisión de si se aplica herbicida (u otra forma de control) o no. En realidad, este enfoque de predicción empírica de pérdidas debe usarse para la selección de alternativas económicas de control mediante la confrontación de costos y potenciales beneficios como se mencionó anteriormente. Debido a la variabilidad que existe entre un sitio y otro, la predicción de pérdidas de rendimiento basada en modelos matemáticos empíricos no puede extrapolarse con liberalidad de una localidad a otra. De forma que estas ecuaciones presentadas y discutidas aquí sugieren que su rango de aplicación puede expandirse cuando se detectan y se incorporan al algoritmo de predicción de pérdidas fuentes clave de variación entre localidades o estaciones de crecimiento. No obstante estas posibilidades, la extrapolabilidad de los modelos empíricos es limitada (Wagner et al. 2009; Spitters & van den Bergh 1982; Moechnig et al. 2003) y conviene restringirla a condiciones similares bien caracterizadas. Es necesario anotar también que las malezas no infestan un campo de forma uniforme, sino que las comunidades pueden variar de un lado a otro de un campo y presentarse en forma de parches heterogéneos. Esto causa dispersión de las observaciones alrededor de la curva predicha con la ecuación que ilustra la relativa baja precisión de esta técnica para decidir si uno controla malezas o no en un sitio específico (Figura 5). Este ruido puede limitarse si las evaluaciones se estratifican en sectores de un campo que sean más o menos uniformes dentro de sí.

Para que las predicciones de pérdidas puedan usarse con fines de toma de decisión es necesario que los niveles de infestación en un cultivo se cuantifique lo más temprano posible.

Por ejemplo, en el caso del trabajo presentado en la Figura 5 las evaluaciones se hicieron dos semanas después de que las malezas comenzaron a emerger. Pero cuando se usa el área foliar relativa como variable debemos recordar que los modelos de Kropff están basados en determinaciones hechas al momento del “cerrado” del dosel, es decir cuando se sabe cuál será la partición efectiva del recurso luz entre el cultivo y la maleza. Para poder hacer predicciones tempranas basadas en esta variable se hace necesario modelar o tener alguna relación empírica que permita simular el crecimiento del área foliar de cada especie de forma que, basándose en una determinación temprana de área foliar, se pueda predecir cuál será el área foliar de cada especie al momento de la intercepción completa del dosel (índice de árrea foliar ~ 1) (Kropff 1993). Es posible hacer esto en una hoja electrónica tipo Excel, asignando un porcentaje constante de incremento de área foliar diario (o según tiempo térmico = grados-día) basados en estudios previos de crecimiento temprano (el cual en esas etapas iniciales se aproxima bastante a la linearidad). Esto explica porqué los modelos que usan simples medidas de densidad han sido más más populares por ser más fáciles de parametrizar.

El diseño aditivo permite establecer el perjuicio económico de un control de malezas incompleto (Spitters & van den Bergh 1982). Simula la situación donde un cultivo es plantado en una densidad normal o deseada y sufre la infestación de un rango al azar de densidades de malezas (Silvertown 1987). Sin embargo, el arreglo topológico o geométrico de las plantas en el terreno así como las proporciones entre especies no son controladas por este diseño. Otra desventaja es que este tipo de diseño es inapropiado para determinar los niveles de interferencia intra- e interespecífica y tampoco permite establecer cuál de las

especies que compiten (mezcla de dos especies) es más competitiva que la otra (Radosevich et al. 2007; Silvertown 1987).

Es difícil ubicar en el campo parcelas experimentales con densidades perfectamente controladas y repetidas dentro de un diseño experimental convencional para medir su efecto sobre el rendimiento de un cultivo. Por esto se suelen definir en el campo aéreas con manejo y condiciones de crecimiento uniformes en donde se ubica un número abundante de parcelas de tamaño tal que permitan tener dentro de ellas una infestación de densidad uniforme (lo cual es fácil cuando se trabaja con relativamente pocas especies pero bastante más complicado si se quieren estudiar muchas especies). Las parcelas se marcan en el campo en lugares de infestación diferente de modo de tener al final un amplio rango de infestaciones, incluyendo áreas sin malezas (o desmalezadas experimentalmente).

Se hace una determinación temprana de las infestaciones uy luego a la madurez del cultivo se cosecha el grano en cada parcela. Naturalmente si se dispone de la mano de obra necesaria, pueden establecerse experimentos con densidades controladas de malezas mediante raleo de poblaciones naturales dentro de parcelas experimentales en diseños completamente aleatorizados o de bloques al azar, los que también pueden someterse al análisis por regresión. También es frecuente sembrar parcelas con densidades específicas y controladas de una o varias especies si se dispone de semilla de maleza de germinación confiable y/o si uno también está en condiciones de efectuar luego raleos de uniformización (Moechnig et al.

2003). Es frecuente ver experimentos parcelarios convencionales con arreglos factoriales de diversos niveles de fertilidad combinados con densidades de siembra u otra variable de manejo y dentro de cada parcela se definen luego sub parcelas donde se ubican densidades de infestación homogéneas y se mide el rendimiento a cosecha del cultivo como se mencionó anteriormente.

Series de reemplazo o diseños sustitutivos El diseño de series de reemplazo fue introducido para superar algunas de las limitaciones del diseño aditivo. Las series de reemplazo toman cuenta de los efectos de diferentes proporciones en una mezcla de especies y este diseño puede resultar muy informativo sobre el proceso de interacción entre dos especies. Consiste en hacer variar la proporción de dos especies, A y B, en una mezcla desde 0 a 100% mientras que la densidad total (A + B) se mantiene constante (Harper 1977) (Figura 6). La densidad total debe establecerse lo suficientemente elevada para asegurar que existe competencia entre las plantas. Según Radosevich et al. (2007) la densidad total debería corresponder al plarteau de la curva de rendimientos independientes del nivel de densidad de la figura 1. Sin embargo, Spitters (1980) propone que para trabajar con cultivos asociados (“intercropping”) la densidad total de ambas especies debería ser equivalente a aquella que usan los agricultores con esos cultivos; quizás porque estas densidades pueden representar, o estar cercanas, a la capacidad de carga del ambiente. Según Harper (1977) y De Wit (1960), cuatro diferentes modelos o diagramas de reemplazo ilustran los posibles resultados de la interferencia que puede establecerse en un experimento de series de reemplazo (Figura 7) . Estos modelos permiten identificar diversas interacciones tales como la competencia por los mismos recursos, diferenciación de nicho, antagonismo y otras. Experimentos con series de reemplazo se han empleado para estudiar el efecto de diversas condiciones de crecimiento sobre el resultado de la competencia entre dos especies (Patterson & Highsmith 1989; Wall 1993; Fischer et al.

2000). Conjuntamente con los diagramas de reemplazo los rendimientos relativos (RY) y el Rendimiento relativo total (RYT) representan índices útiles para examinar los datos que provienen de tal tipo de experimentos, y pueden ayudarnos a identificar los recursos por los cuales las especies pueden estar compitiendo (Hall 1974). La productividad para una determinada mezcla de especies (cada una a cierta proporción) puede expresarse como crecimiento relativo (RRA = biomasa por área de la especie A en la mezcla expresada como porcentaje de la biomasa por área de esa misma especie A en monocultivo). Para una determinada mezcla , los rendimientos relativos totales (RRT) se calculan como: RRT = RYA + RRB (Harper 1977)

[14]

Los diagramas de reemplazo de la Figura 7 resultan de graficar las proporciones de los componentes de las mezclas (A o B) vs. el RR de cada especie. El RYT aparece como la línea trasversal superior de cada diagrama. Cuando RYT = 100 significa que las especies están compitiendo por los mismos recursos cuyo suministro es limitado (Fig. 7, Modelos IIa y IIb); RRT > 100 significa que más biomasa es producida cuando las especies crecen en mezclas de diversas proporciones que cuando crecen en monocultivo (proporción = 100%), sugiriendo que las especies están recurriendo a recursos diferentes, evitan total o parcialmente la competencia, o que mantienen una relación simbiótica (Harper 1977)(Figura 7, Modelo IV). Evasión de la competencia puede ocurrir cuando las especies demandan recursos diferentes del ambiente o cuando la adquisición de recursos está separadaen el espacio o en el tiempo; esto se conoce bajo el término de diferenciación de nicho (Spitters 1983). Los Modelos IIa y IIb de la Figura 7 representan dos posibles alternativas de una interacción competitiva donde el crecimiento de una especie se deprime en la misma medida en que el crecimiento del competidor superior se incrementa por encima de la línea diagonal (punteada) de referencia. Si los recursos son limitados y las especies compiten por ellos, forzosamente lo que “gana” un componente de la mezcla lo “pierde” el otro. Las líneas diagonales de referencia indican que la competitividad de ambas especies es equivalente, es decir, nada cambia al sustituir una planta de una especie por una planta de la otra (Modelo I).

Cuando resulta un diagrama como el del Modelo I, las especies pueden ser de competitividad equivalente, o bien puede ocurrir que la densidad total es demasiado baja y las especies no alcanzar a entablar competencia por ningún recurso (Harper 1977). En el caso del Modelo III el crecimiento de ambas especies se deprime cuando crecen en mezcla; nadie gana: ambas pierden. Esto es un efecto antagónico mutuo, tal como podría ocurrir si cada especie liberara una sustancia alelopática que resulta nociva al crecimiento de la otra.

Otro índice de competencia útil es el Coeficiente Relativo de Aglomeración (CRA), el cual puede derivarse de los datos de un experimento de series de reemplazo a fin de cuantificar la agresividad relativa de una especie sobre la otra (Harper 1977). Así el CRA de la especie A vs. la especie B está dado por:

productividadmediapor plantadelaespecieAen mezcla productividadmediapor plantadelaespecieB enmezcla CRAAvs.B =

[15]

productividadmediapor plantadelaespecieA enmonocultivo productividadmediapor plantadelaespecieB enmonocultivo

Cuando organismos en una mezcla de dos especies compiten por recursos limitados, aquella especie que tenga el mayor valor de CRA será el competidor superior. La Figura 8 representa un ejemplo de cómo puede usarse este diseño para investigar la mecánica de la interacción entre dos especies que crecen asociadas.

Fischer et al. (2000) condujeron experimentos en cámaras de crecimiento para estudiar cómo las temperaturas ambientales en el estado de Dakota del Norte afectarían la interacción competitiva entre el cultivo de trigo (una especie tipo C3) y una maleza muy importante de este cultivo, Kochia scoparia (L.) Schrad. (una especie tipo C4). Se condujeron dos series de reemplazo simultáneamente en cámaras separadas y los experimentos se repitieron cambiando de cámara para minimizar efectos que no fueran exclusivamente las diferencias de temperatura (indicadas en la Figura 8). Las proporciones de reemplazo en las mezclas fueron 100/0, 75/25, 50/50, 25/75, y 0/100 para el trigo y la kochia, respectivamente. El peso individual de plantas para las tres mezclas interespecíficas se sometió al análisis de varianza (ANOVA); el tratamiento mezcla fue considerado como factor principal y la especie como tratamiento de subparcela. Se calcularon los rendimientos relativos y los valores de RRT correspondientes, así como valores de CRA para trigo y kochia; datos de CRA fueron también sometidos al ANOVA. El efecto mezcla y la interacción mezcla × especie resultaron significativos (P < 0.01) lo cual indica la presencia de efectos de competencia. En el régimen más frío, el trigo produjo más biomasa que la kochia (datos no mostrados), y ambas especies compitieron por recursos limitados (RRT = 100) y el trigo resultó más competitivo que la kochia (CRAtrigo = 4.1 vs. CRAkochia = 0.3). Esto último se ve claramente en el diagrama izquierdo de la Figura 8 donde la curva de rendimiento de kochia está deprimida y la del trigo es convexa con respecto a las diagonales imaginarias. Temperaturas más cálidas resultaron más favorables a la kochia (su curva de RR ya no está por debajo de la diagonal imaginaria, si bien ambos cultivos no difirieron en sus CRA (1.1 para la kochia y el trigo).

Bajo las temperaturas cálidas se obtuvieron RRT > 100 para todas las mezclas, lo cual sugiere que estas especies evitaban parcialmente la competencia, en particular en las mezclas de 25/75 y 50/50 kochia/trigo. Bajo temperaturas frescas los mayores costos energéticos del sistema fotosintético C4 (Hatch 1970) determinaron menores tasas fotosintéticas (datos no mostrados) reduciendo la producción de biomasa y la competitividad de la kochia. Los valores de RRT > 100 sugieren que, bajo esas condiciones, la interferencia en las mezclas fue menor que cuando cada especie creció en monocultivo debido a la presencia de rutas

alternativas de adquisición de recursos resultante de diferencias en las estructuras de la plantas de kochia y el cereal o de diferencias en la forma de explotar los recursos de crecimiento (Trenbath 1976). La existencia de efectos simbióticos también es posible cuando aparecen valores RRT >100, pero en este caso eso fue descartado dado los fuertes efectos competitivos (RRT = 100) observados a las bajas temperaturas. Este estudio de series de reemplazo permitió concluir que la intercepción de luz (las plantas estaban abundantemente fertilizadas y regadas)por un cultivo frondoso y tolerante al frío que se siembra temprano en la primavera, bajo condiciones frías, puede suprimir el establecimiento o la competencia temprana de la kochia.

Biomasa total por unidad de área Número de plantas sembradas por unidad de área

Figura 1. Relación entre densidad y producción de biomasa de una especie (adaptado de Radosevich et al.

2007).

A la capacidad de carga (producción final constante)

Antes de alcanzar la capacidad de carga

Figura 2. Efecto de la densidad (d) sobre el peso de una planta individual (w); sindo k = constante (adaptado de Silvertown 1987).

Rendimiento perdido (RP, %)

a

RP = i x D

ixD RP = ixD 1+ a Densidad (no. plantas m-2)

Figura 4. Relación hiperbólica entre la pérdida de rendimiento por competencia y la densidad de malezas ; donde: RP es porcentaje del rendimiento perdido, D es densidad de maleza, i es el porcentaje del rendimiento perdido con cada planta de maleza adicional cuando D es cercana a cero, y a es una asíntota que corresponde a la pérdida máxima de rendimiento cuando D tiende al infinito.

) % ( z o rr a e d o t n ie m i d n er e d a id d ré P Peso de biomasa aérea de malezas (g m-2)

Figura 5. Rendimiento de arroz afectado por la competencia de malezas que emergieron a los 15 (círculos negros) y 30 (círculos blancos) días posteriores a la emergencia del arroz predichos por un modelo hiperbólico (Cousens 1985a).

Figura 6. Proporción variable de dos especies en una serie de reemplazo (adaptado de Roush & Radosevich 1985)

A iec ep s e la ed d ad iv it cu d o rP

Modelo I

A ei c ep sd ead ailv iet cu d d d ao d irvP it c u d o rP

Modelo IIa

Modelo III

Modelo IV

Modelo IIb

P ro d u ct iv id ad d e la e sp e ci e B

P ro d u ct iv id a d d e la es p ec ie B

Figura 7. Posibles modelos resultantes de experimentos de serie de reemplazo. En el eje vertical se grafica alguna medida de productividad (biomasa, rendimiento de grano, etc.); si esta productividad fuera expresada como rendimiento relativo (RY), el máximo en cada eje sería de 100% para ambas especies. El eje horizontal represent a las proporciones (de 0 a 100%) de ambas especies en mezcla. (adaptado de Radosevich et al. 2007).

) (% o vi ta le r o tn ei m i d n e R  Trigo  Kochia

 Trigo  Kochia

Proporción de Kochia scoparia (%) Figura 8. Rendimientos relativos y rendimientos relativos totales (RYT) (triángulos blancos) de trigo (círculos negros) y Kochia scoparia (triángulos blancos) creciendo bajo dos regímenes día/noche de temperaturas en experimentos de series de reemplazo (adaptado de fischer et al. 1999).

Experimentos sistemáticos En este tipo de experimentos la densidad de plantas es incrementada sistemáticamente dentro de un arreglo espacial o geométrico constante. Los diseños originales fueron propuestos por Nelder (1962) y por Bleasdale (1967), y básicamente consistían en ubical plantas a lo largo de rayos que emanaban desde el centro de una “rueda”(o “abanico”, cuando sólo se consideran secciones o “tajadas” de esa rueda). La geometría del área alrededor de cada planta (definida por la posición de sus vecinos) puede ser determinada según los objetivos experimentales (Nelder 1962; Bleasdale 1967; Assemat 1986). Estos diseños se han usado mayormente para determinar el efecto de la densidad sobre la competencia intraespecífica y para determinar las densidades más apropiadas para un cultivo. Sin embargo, uno puede sobre imponer este diseño a una cobertura o stand uniforme de otra especie (maleza) y averiguar así la densidad y el arreglo de plantío de un cultivo que mejor suprime a la maleza. Estos experimentos pueden ubicarse en distintos lugares y los datos son típicamente analizados por regresión (Mead & Stern 1980). Las curvas provenientes de los diferentes experimentos (localidades) pueden compararse con pruebas normalmente usadas en la comparación de regresiones lineales o no-lineales (Chow 1960; Seefeldt et al. 1995).

No obstante hay quienes además usan ANOVA para comparar tratamientos (localidades, espaciamientos, especies) . En ese caso, se ha considerado al experimento como equivalente a un diseño en bloques al azar con bloques divididos, dado que según Nelder (1962) el muestreo de los “rayos” de las posiciones dentro de ellos puede ser tratado como un procedimiento realizado al azar (Sanderson & Elwinger 2002). Con experimentos en diferentes localidades los bloques (considerados como efecto al azar) irían anidados dentro de localidades. En el diseño tipo “rueda” de Nelder (1962), las densidades efectivas (A) en cada arco (n) pueden calcularse según Asiwe et al. (2005) como: An = (Xn+1 – Xn-1)/2b

[15]

Donde b es el número de plantas por arco y X la distancia del arco al centro de origen.

Una variante del diseño de Nelder (1962) fue propuesta por Freyman & Dolman (1976), la cual permite el uso de hileras de plantación paralelas espaciadas a una distancia fija, tal como ocurre en cultivos en hileras de maíz, frijol, y muchos otros que por razones agronómicas deban plantarse de esa forma. En todas las diversas variantes de los experimentos sistemáticos, la superficie de terreno que le corresponde a cada planta individual cambia sistemáticamente a lo largo de cada radio o hilera dentro del rango de densidades de plantación ensayadas. La forma del arreglo espacial se mantiene siempre el mismo para todas las plantas. A menudo la variación sistemática del espacio por planta es sólo uno de los diversos factores que se pueden combinar en estos experimentos (arreglo geométrico, genotipos, fertilización o nivel de recursos, y otros). Estos experimentos pueden sobre imponerse a otros experimentos con parcelas demasiado pequeñas para permitir su subdivisión en un gran número de densidades.

Fischer & Burrill (1993) utilizaron diseños sistemáticos con maíz para comparar la respuesta a la densidad para un espaciamiento equidistante (Nelder 1962) y otro rectangular (hileras fijas separadas a 76 cm; Freyman & Dolman 1971) entre plantas a fin de hallar una com binación de espaciamiento y densidad que rindiera más y que pudiera ser más competitiva

con un tapiz subyacente de trébol blanco (Figura 9). El experimento fue analizado usando regresión y demostró que cuando el maíz había sido plantado sobre un mulch suprimido de trébol blanco, rendía más en un arreglo de plantación equidistante que en siembras en hileras fijas distanciadas para un amplio rango de densidades de siembra. Esto se debía a que el desarrollo individual de las plantas equidistantemente separadas era mejor; la distribución equidistante había disminuido la competencia intraespecífica entre plantas de maíz y permitía la mejor competencia interespecíficas de éstas con la cobertura asociada de trébol blanco (Fischer & Burrill 1993). Estos diseños son muy útiles cuando se carece de información previa, por lo que representan una forma eficiente de obtener información preliminar. Se puede explorar un número elevado de densidades en un espacio pequeño. Se los ha utilizado mucho en ciencias forestales, y para el manejo de especies cultivadas asociadas y los distintos trabajos muestran la introducción de ciertas variantes a los diseños originales según las necesidades y la imaginación del investigador.

Figura 9a. Diseño sistemático de densidad con un arreglo de plantación aproximadamente cuadrado (solamente se han representado ocho arcos de lo que en el terreno constituyó una rueda entera tipo Nelder (1962)). Adaptado de Fischer & Burrill (1993).

Figura 9b. Diseño sistemático de densidad con un arreglo de plantación rectangular con hileras (horizontales) de espaciamiento fijo según Freyman & Dolman (1971). Adaptado de Fischer & Burrill (1993).

Peso fresco de mazorcas (Tons ha -1 )

Plantas por hectárera (x1000)

 Arreglo equidistante (cuadrado)  Hileras separadas a 76 cm Figura 10. Rend imiento d e mazorcas d e maíz d ulce cuand o el cultivo se plantó a d iferentes d ensid ad es en un arreglo aproximad amente equid istante o en hileras fijas (arreglo rectangular) separad as a 76 cm. Las regresiones son estad ísticamente d iferentes (P < 0.01) según una prueba F comparand o tod os los coeficientes d e ambas ecuaciones.

Como desventajas de los diseños sistemáticos presentados puede comentarse el hecho de que en las “ruedas”de Nelder las plantas quedan en el centro de un área trapezoidal que puede no reflejar la situación real en el campo; las relaciones espaciales no son un factor que puede manipularse dentro de un experimento determinado (Radosevich 1987). Frecuentemente es difícil introducir una adecuada aleatorización en estos diseños lo que es ciertamente una limitante para el análisis de los datos.

Series de adición Los experimentos en series de adición han sido propuestos por Spitters (1983a, 1983b) y han sido ya bien descriptos y discutidos por varios autores (Radosevich 1987; Rejmanek et al.

1989; Roush et al. 1989) . Estos modelos son una variante de los experimentos sistemáticos y se basan en la ley de los rendimientos inversos según la cual resulta el concepto de rendimiento final constante planteado en la ecuación [1]. Esta ley plantea que el peso individual de una planta decrece hiperbólicamente con el incremento de su densidad: w-p = a + kd

[16]

Donde al igual que en [1], w es el peso individual por planta, d es la densidad, a es un intercepto (que se incorpora ahora en esta relación empírica) y k es otra constante. El

exponente p representa la relación hiperbólica entre w y n la que en genera,l se aproxima a 1 (Figura 11). La relación en general puede linearizarse mediante la expresión: 1/w = a + kd

[17]

Spitters (1983) planteó que si los efectos de la competencia intra- e interespecífica eran aditivos, entonces los modelos de densidad-productividad podrían expandirse para considerar las mezclas de especies. La expansión del modelo de rendimiento inverso tomaba la forma: 1/w1 = a1,0 + b1,1d1 + b1,2d2

[18]

1/w2 = a2,0 + b2,2d2 + b2.1d1

[19]

Donde cada subscripto en cada término representa a la especie cuya biomasa está representada como variable dependiente y el segundo suscripto se refiere a la especie asociada. Los coeficientes b1,1 y b2,2 cuantifican los efectos de la competencia intraespecífica y los coeficientes b1,2d2 y b2.1d1 representan la magnitud de la competencia interespecífica de la especie 2 sobre la especie 1 y de la especie 1 sobre la 2, respectivamente.

Estas ecuaciones permiten una representación gráfica de superficie de respuesta que permite visualizar bien los efectos de competencia intra- e interspecífica en una y otra especie que componen la mezcla (Figura 12) (Rejmánek 1989):

De la Figura 12a se deduce claramente que el tomate es muy poco competitivo con la Echinochloa y que el crecimiento de esta es más afectado por la presencia de plantas de su propia especie; la competencia en este caso es fundamentalmente intraspecífica. En cambio el tomate crece mejor en presencia de vecinos de su propia especie que en competencia interespecífica con Echinochloa (Figura 12b). El gran valor de los experimentos de series de adición es que esta es pues la primera vez que tenemos un modelo conceptual y matemático para poder contabilizar por separado ambos tipos de efectos competitivos. Más especies pueden incorporarse de la misma forma al modelo. Por otra parte este enfoque permite trabajar con regresiones lineales sencillas para obtener información bastante mecanística sobre la interferencia entre las especies. Por ejemplo, las ecuaciones [18] y [19] permiten calcular índices para caracterizar la competitividad relativa de cada especie (Spitters 1983a y 1983b). Así (b1,2/b1,1) y (b2,1/b2,2) serían las competitividades relativas de la especie 1 y de la especie 2, respectivamente, cuando ambas crecen en mezcla y cuando se considera para cada especie su capacidad el crecimiento de otra a la vez que su propia capacidad de afectarse a sí misma. Conceptualmente ambos componentes podrían ser afectados de forma separada por factores ambientales (o de manejo agronómico) y resultar en consecuencias competitivas diferentes. Por lo que estos índices pueden resultar muy útiles para caracterizar los efectos

del manejo agronómico de las malezas o las variaciones del ambiente sobre sus efectos hacia los cultivos. De forma similar se puede estimar el grado de diferenciación de nicho. Si el cociente (b1,1/b1,2)/(b2,1/b2,2) resulta mayor que uno, es porque existe diferenciación de nicho y el RRT > 1, indicando que la mezcla total captura más recurso que los monocultivos (Spitters 1983a y 1983b). Lo que suele ocurrir cuando las especies difieren en su profundidad radical explotando diferentes zonas del suelo, o cuando una leguminosa que fija nitrógeno del aire crece asociada con una gramínea que esencialmente debe usar nitrógeno del suelo (Kropff & Lotz 1993).

En el caso de dos especies, el procedimiento experimental consiste en variar sistemáticamente la densidad y proporción de las especies en la mezcla como se ilustra lal siguiente matriz (Radosevich 1987):

Donde la densidad de cada especie (A o B) va desde 0 a 16 plantas por unidad experimental en monocultivo y de 2 a 32 plantas por unidad experimental en mezcla, o sea (1+1) a (16+16), respectivamente. La disposición parcelaria de una serie de adición con tres especies y cuatro densidades tendría la forma presentada en al Figura 13. Esta disposición debe aleatorizarse y si se desea poblar de puntos a las regresiones todo el esquema debería repetirse un cierto número de veces.

Naturalmente que el diseño de series aditivas puede analizarse usando regresión no linear con diversos modelos hiperbólicos, los que pueden ser simples hipérbolas tipo [7] o más simples (Daugovish et al. 2003), o realmente complejos incorporando una multiplicidad de coeficientes usando sofisticados procedimientos para el diseño de los modelos como el Akaike’s Information Criterion (AIC) , el Bayesian Information Criterion (BIC), o el Information Complexity Criterion (ICOMP) (Jasieniuk et al. 2008) que reemplazan la selección tradicionales de modelos alternativos empleando hipótesis nulas ( Jasieniuk et al.

2001). Por ejemplo, con la nube de puntos generados con muchos experimentos, uno de esos modelos seleccionados por esos criterios de información teórica mencionados, incorpora a la densidad del cultivo (Dc) la densidad de la maleza (Dw), el tiempo de emergencia del cultivo previo a la de la maleza (T), a la tasa de crecimiento intrínseca del cultivo (Rc), la tasa a la cual i (coeficiente visto en el modelo [7]) decrece hacia cero a medida que T se vuelve grande (c), coeficiente de competitividad interespecífica de la maleza (aw), y al coeficiente de competitividad intraespecífica de la maleza (b) en un mismo modelo con el fin de hacer predicciones para el manejo de una maleza en un cereal de invierno (Jasieniuk et al. 2008):

[20] El enfoque es complejo pero interesante; sin embargo, subsiste el problema que habíamos discutido antes, de la variabilidad de los coeficientes cuando los modelos intentan hacer

predicciones en rangos ambientales muy amplios. Esto ha llevado a cuestionar la insistencia de usar modelos matemáticos para hacer predicciones de vocación universal, cuando los datos empíricos de campo consistentemente sugieren que esto no sería lo más indicado. Esto contrasta con la inteligente elegancia y sencillez de los modelos de Spitters, los que fueron exitosamente empleados recientemente por Vasquez et al. (2008) para demostrar que modificando los niveles de nutrientes en el suelo se puede manipular la competitividad intrae interespecífica de Bromus tectorum, a fin de favorecer a las comunidades de gramíneas nativas en pasturas naturales del oeste americano.

Período crítico de control de malezas Esta es quizás una de las técnicas más viejas y utilizadas en el estudio de la competencia entre las malezas y las especies de interés, especialmente aquellas de interés agrícola (Nieto et al. 1968). Es una técnica que ha sido de enorme utilidad en la definición de estrategias de manejo económico de malezas con el concomitante potencial para reducir el impacto ambiental del sobreuso de herbicidas. En teoría controlar malezas antes o después del período crítico de control no redunda en beneficio económico o tiene efecto en evitar pérdidas de rendimiento por la competencia de las malezas. Existe en la literatura una infinidad de trabajos de determinación del período crítico con malezas en todo tipo de cultivos y por todo el mundo.

En muchos casos se observa que ciertos cultivos toleran la presencia de malezas en ciertos momentos y no en otros, de manera tal que hay momentos en que el desmalezado no sería necesario (Radosevich et al. 2007). El objetivo aquí es determinar en qué momento del ciclo de crecimiento de un cultivo es necesario ubicar el desmalezado a fin de prevenir pérdidas físicas y/o económicas de rendimiento. Para esto se emplea un diseño clásico (Figura 13) que consiste en una serie de tratamientos en los que el cultivo crece enmalezado desde su emergencia por períodos progresivamente más largos, al final de los cuales las malezas se quitan y el cultivo se mantiene desmalezado hasta la cosecha (Fischer et al. 1988). En otra serie de tratamientos complementaria, el cultivo se mantiene libre de malezas durante períodos progresivamente más prolongados desde la emergencia, al final de los cuales se permite el enmalezamiento (o incluso se siembran malezas) incontrolado hasta a cosecha.

Con los rendimientos del cultivo a cosecha se grafican los datos tal como se muestra en la Figura 14. De esta forma se determinan comparativamente los efectos de las malezas que emergen temprano y los de las que emergen tarde y en diferentes momentos.

El período crítico de control se inicia en el momento en que la presencia de malezas que emergen desde el inicio causa pérdidas de rendimiento físicas o económicas. Esto a veces define que haya un cierto período inicial de tolerancia durante el cual las malezas son muy pequeñas y su competencia con el cultivo es negligible (Figura 14A). Frecuentemente el período crítico de control se inicia cuando los doseles de las malezas comienzan a interceptar al del cultivo dando inicio a la competencia por luz (Fischer et al. 1988). En otros casos, no existe tolerancia inicial y los rendimientos se afectan por más breve que sea el período de enmalezamiento inicial, lo cual suele ocurrir cuando las plantas compiten activamente por recursos del suelo (agua y nutrientes); ésta es la situación típica para justificar tratamientos con herbicidas de preemergencia. Lo importante es poder ubicar el manejo que permite que en determinado momento el cultivo sea capaz de maximizar la captura de espacio y suprimir

el posterior establecimiento de nuevas cohortes de malezas. Este punto marca el fin del período crítico, y es el punto donde la curva de rendimientos en la Figura 14B se estabiliza, lo cual es importante pues indica que a partir de ese momento ya no es necesario continuar desmalezando al cultivo pues éste se encarga por sí mismo de suprimir malezas a partir de entonces. Esto no siempre ocurre y es importante optimizar el manejo del cultivo a fin de lograr un período crítico lo más breve posible. El fin del período crítico de control a menudo es determinado por la máxima captura de luz y ocurre cuando el dosel del cultivo se cierra sobre el terreno y logra una completa intercepción de luz (Gibson et al. 2002; Teasdale 1998). Por esta razón es útil efectuar mediciones secuenciadas de irradianción debajo del dosel con un fotómetro para determinar el momento en que se logra una intercepción de luz tal que maximiza la dominancia competitiva del cultivo (Evans et al. 2003; Norsworthy & Oliveira 2004).

Este es un tipo de experimento sumamente útil que debe ser parte de los primeros pasos de todo programa de manejo de malezas para un cultivo. Naturalmente, los resultados son denso-dependientes y lo mejor sería conducir el experimento bajo diferentes niveles de infestación. En general, lo que se hace es (a) conducirlo bajo infestaciones típicas de campos de producción o (b) buscar elevadas infestaciones que nos sitúen en el plateau asintótico de las pérdidas de rendimiento (Figura 4), donde variaciones en la densidad causan poco cambio en los niveles de pérdida. Los límites del período crítico (Figura 14C) dependen mucho de las especies involucradas y de su momento relativo de emergencia. El crecimiento de las malezas y del cultivo es afectado por las fluctuaciones en la disponibilidad ambiental de recursos y por los efectos que sobre ésta tienen las prácticas culturales (Hall et al. 1992). Los resultados de estos experimentos pueden variar de un año para el otro (Gibson et al. 2002) y es importante cuantificar variables ambientales asociadas que puedan relacionarse con variaciones en la ubicación en el tiempo del período crítico, lo que puede señalar oportunidades para el manejo agronómico (Evans et al. 2003; Northsworthy & Oliveira 2004). Por esta razón estos experimentos deben repetirse para cubrir un rango adecuado de variaciones ambientales típicas para una región. También resulta una buena idea conducir este tipo de experimento incorporando diferentes alternativas de manejo buscando identificar las situaciones que permiten reducir este período crítico. La emergencia, composición botánica y uniformidad de la distribución espacial de las malezas suele ser inconsistente y constituyen fuentes de variabilidad que pueden comprometer la exactitud de la ubicación del período crítico. Es común sembrar malezas a fin de garantizar infestaciones uniformes a través de toda la superficie del experimento. Otra fuente de inexactitud de los resultados es el hecho de que los extremos (principio y final) del período crítico se definen a partir de dos componentes distintos y medidos de forma separada (la serie de enmalezado inicial y la serie complementaria de desmalezado inicial). Sin embaro, el período crítico está definido como un único espacio de tiempo donde el inicio y el final se dan en la misma situación (Figura 14C), cosa que en general nunca se verifica y puede ser una fuente de error en las estimaciones (Weaver 1984).

Es importante evaluar los niveles de infestación a fin de poder establecer en qué momento y con qué nivel de severidad es que la supresión de malezas impacta positivamente los rendimientos y qué nivel de supresión es necesario para que los rendimientos se estabilicen.

Para esto suelen hacerse evaluaciones (mediante conteos, estimaciones de cobertura, mediciones de biomasa u otros) en las parcelas según cada serie de tratamientos. Así, en la

serie donde el enhierbado se permite que ocurra (o deliberadamente se inicia mediante la siembra de malezas) luego de distintos momentos iniciales de desmalezado, el muestreo se hace hacia finales del ciclo del cultivo. Mientras que en la serie donde el cultivo crece con malezas durante diversos períodos posteriores a su emergencia, el muestreo se hace justo antes de desmalezar la parcela. Los resultados pueden graficarse como en la Figura 15. Es útil también efectuar secuencialmente conteos de emergencia de malezas en las parcelas a fin de determinar en qué momento emergen las maleas responsables por las pérdidas de rendimiento observadas. Deberán registrarse las especies presentes y sus respectivos niveles de infestación.

Los datos de rendimiento del cultivo pueden expresarse en términos físicos (kg ha-1) o en términos económicos lo que permite definir al período crítico en términos de umbral económico para decidir, en base a la relación costo-beneficio, el momento económicamente adecuado para desmalezar (Fischer et al. 1993). La amplitud del período crítico y/o la duración de los tratamientos de en- y desmalezado suele medirse en unidades de tiempo (días, semanas), pero es mucho más probable que la duración del período crítico se relacione más con las etapas fenológicas del cultivo que con el tiempo cronológico (Radosevich ert al.

2007). Por esta razón frecuentemente se definen los tratamientos en base a etapas fenológicas o al tiempo térmico (grados de crecimiento/día), el que normalmente conduce la progresión fenológica (Webster et al. 2009) Figura 14).

Los experimentos de período crítico de control son usualmente implementados a campo y su diseño ese convencional, con tratamientos generalmente ubicados en bloques al azar con repeticiones. Frecuentemente el diseño es de parcelas divididas con cada serie (en- o desmalezamiento inicial) ubicada en las parcelas mayores y los períodos en las subparcelas (Kenezevic et al 2002). Los datos se someten a ANOVA y pruebas de separación de medias pueden usarse para comparar diferencias estadísticas entre tratamientos (Knake et al. 1974).

Sin embargo, como la presencia de malezas en el cultivo está considerada a distintos intervalos de tiempo y ésto constituye una variable incremental continua, el método de análisis de datos más adecuado es el de la regresión (Cousens 1988). Diversos modelos de regresión pueden ajustarse a los datos; desde simples modelos empíricos de regresión múltiple a modelos asintóticos más elaborados tales como funciones de Gomperz, logística, o hipérbolas rectangulares (Gibson et al. 2002; Hall et al. 1992; Cousens 1988). En general, la escogencia del modelo es empírica, basada en la forma de la curva, y luego se busca aquél que proporcione el mejor ajuste. Estos modelos no lineales suelen tener dos o tres coeficientes por lo que es aconsejable que el número de intervalos (tratamientos de des- o enmalezado inicial) sea por lo menos cuatro a fin de poder ajustar adecuadamente una curva los puntos; lo ideal sería usar seis o más intervalos para ganar precisión en la estimación y comparación de coeficientes (Knezevic et al. 2002). Los siguientes son ejemplos de modelos frecuentemente usados (Cousens 1988; Hall et al. 1992; Gibson et al. 2002; Knezevic et al.

2002): Y = [(1/{exp[c × (T – d)] + f} + [(f – 1)/f]] × 100

[21]

Este es un modelo logístico modificado usado frecuentemente para describir la respuesta a períodos de enmalezamiento inicial creciente (curva descendiente), donde Y es el rendimiento expresado como porcentaje de un testigo desmalezado, T es la variable independiente (tiempo

expresado en grados de crecimiento/día o en días después de la emergencia), d es el punto de inflexión de la curva (unidades de tiempo), c y f son coeficientes estimados (Hall et al. 1992).

Y = a exp(- b exp(- kT))

[22]

Este otro [22] es un modelo de Gomperz frecuentemente usado para describir la respuesta a períodos progresivamente más largos sin malezas desde la emergencia (curva de rendimientos crecientes) (Hall et al. 1992); donde Y es el rendimiento expresado como porcentaje del testigo libre de malezas todo el ciclo, a es la asíntota para el máximo rendimiento, b y k son constantes (coeficientes) estimadas por la regresión, y T es la variable independiente (tiempo expresado en grados de crecimiento/día o en días después de la emergencia). Para esta misma situación de rendimientos crecientes en respuesta a un desmalezamiento progresivamente más largo, Cousens (1988) propuso esta fórmula: [23]

Y = a + b/(1+cx)

Donde a, b y c son coeficientes de regresión estimados. Naturalmente se observarán en la literatura diversas variantes de todos estos modelos.

Período con control de malezas Período sin control de malezas

o t n ei m at ar tl e d o re m ú N

Semanas posteriores a la emergencia del cultivo Figura 13. conceptualización gráfica d e las serie d e tratamientos utilizad os en experiments para d eterminar el períod o crítico d e control d e malezas en un cultivo.

) m g( sa ze la m e d ac es ae r é a as a m o i B

-2

Días libres de malezas posteriores a la emergencia del arroz Figura 15. biomassa de malezas a la cosecha del arroz cuando dos variedades crecieron libres de malezas durante ciertos períodos posteriores a la cosecha, al fin de los cuales se permitió que las malezas crecieran libremente con el cultivo hasta la cosecha del mismo. En este caso el final del período crítico de control de malezas evaluado para ambas variedades se ubicaba en los 60 días posteriores a la emergencia del arroz. Adaptado de Fischer et al. (1993).

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Capítulo 3 TÉCNICAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA ALELOPATÍA ENTRE MALEZAS Y CULTIVOS José Vicente Lazo Universidad Central de Venezuela Introducción Durante la evolución, las plantas, debido a su condición de ser organismos sésiles, han desarrollado un conjunto de mecanismos de defensa ante los factores bióticos y abióticos del medio ambiente. Estos mecanismos, “grosso modo”, son de naturaleza física, fenológica y químicos, y una característica muy particular es que todos esos mecanismos de defensa operan en forma sinergística, lo cual confiere a las plantas una extraordinaria capacidad de adaptación para un amplio rango de condiciones ecológicas.

El tema de esta conferencia se refiere precisamente al mecanismo de defensa química que poseen las plantas, el cual tiene su origen en los llamados metabolitos secundarios. Como su nombre lo indica, estas sustancias son sintetizadas a través de la ruta del metabolismo secundario, también llamada ruta del ácido shikimico. Los metabolitos secundarios no solo participan en la defensa química de la planta, sino que además constituyen un mecanismo de comunicación química, tanto endógeno como exógeno. O sea que vienen a funcionar como un tipo de “lenguaje químico” por medio del cual las plantas se comunican con su medio ambiente biótico y abiótico. Las interacciones entre plantas, y entre las plantas y sus enemigos y/o amigos naturales (herbívoros, insectos, nematodos, microorganismos, etc.) son básicamente mediadas por metabolitos secundarios.

Las defensas químicas de la planta pueden ser constitutivas o inducidas. En el primer caso son sintetizadas aun cuando aparentemente no exista un factor estimulante o estresante del medio, mientras que en las segundas, su síntesis es estimulada ante la presencia de un factor estresante del medio, como sería por ejemplo la presencia de insectos entomófagos, microorganismos, herbívoros, o plantas de diferentes especies que alcancen niveles poblaciones críticos para el uso de recursos comunes.

Para describir las interacciones químicas entre plantas, se utiliza el término alelopatía (del griego allelon = uno al otro, del griego pathos = sufrir; efecto desfavorable de uno sobre otro) el cual fue utilizado por primera vez por el botánico austriaco Hans Molisch (1937) para describir los efectos perjudiciales o benéficos que de manera directa o indirecta ejercen unas plantas sobre otras (incluyendo microorganismos), mediante la acción de compuestos químicos que son liberados al medio ambiente. De hecho, Molisch definió la alelopatia como “Interacciones Bioquímicas entre todos los tipos de plantas incluyendo microorganismos”. Se ha sugerido que es un factor importante en la regulación de la estructura de las comunidades vegetales y en la velocidad de crecimiento de las plantas, y ha sido atribuida a flavonoides, estructuras fenólicas y terpenoides. En todo proceso alelopático existe una planta (donadora) que libera al medio ambiente (por lixiviación, descomposición de residuos, lavado de hojas, etc.) compuestos químicos los cuales al ser incorporados por otra planta (receptora) provocan

un efecto perjudicial o benéfico sobre la germinación, crecimiento o desarrollo de esta última.

Los compuestos que desencadenan el proceso se denominan aleloquímicos o sustancias alelopáticas. Es importante enfatizar que la definición de Molisch incluye tanto los efectos perjudiciales como benéficos e incorpora a hongos y otros microorganismos además de las plantas superiores. Sin embargo, en función de los objetivos de la presente conferencia, usaremos el concepto expresado por Müller, quien utiliza el término alelopatía para referirse a los efectos nocivos de un compuesto químico producido por una planta superior sobre otra planta superior.

El otro aspecto que es muy importante tener en cuenta cuando se estudian las interacciones entre plantas superiores, es diferenciar la alelopatía de la competencia. Esta última implica la reducción en la disponibilidad de algún recurso del entorno, debido a su utilización por un individuo vegetal, que es requerido también por otra planta que comparte el mismo hábitat, por ejemplo, el agua, los nutrientes minerales y la luz; mientras que la alelopatía implica la liberación al entorno por parte de una planta de un compuesto químico que ocasiona un efecto sobre otra.

En otras palabras, el efecto negativo sobre el crecimiento y desarrollo causado por la competencia, se debe a la reducción en la disponibilidad de recursos comunes, mientras que en la alelopatía tiene su origen en compuestos químicos liberados por una planta que afectan a otra. También pudiéramos decir que alelopatía es interferencia química, mientras que competencia es interferencia física. La respuesta a la competencia es por lo general una

reducción en el crecimiento de la planta, mientras que la respuesta a la alelopatía es estimulación a baja concentración e inhibición a medida que la concentración del aleloquímico aumenta. Como podemos ver, estos conceptos son diferentes entre sí, pero si los enfocamos con un criterio ecofisiológico nos daremos cuenta de que ambos procesos no solamente son interdependientes, sino que son complementarios en su efecto. En este sentido, si queremos describir cuales son los efectos totales de una plantas sobre otras en una comunidad vegetal monoespecífica o multiespecífica, utilizaremos el término interferencia el cual viene a ser la resultante de la sumatoria de los efectos causados por la alelopatía y la competencia o alelospolía de manera simultánea o secuencial.

El otro término que es importante conocer y que muchos autores han considerado como un caso especial de alelopatía, es la autotoxicidad; la cual ocurre cuando la planta donadora y la planta receptora del agente alelopático, son de la misma especie.

También vale la pena mencionar, aún cuando no sea objeto de esta conferencia, la importancia de los metabolitos secundarios de las plantas en la medicina humana.

Aproximadamente el 25% de los fármacos que se venden con prescripción médica hoy en día, se derivan de plantas medicinales tradicionales. Por ejemplo, en los EEUU los medicamentos naturales derivados de las especies Echinacea spp (St. John`s wort) y Hypericum perforatum, representan casi el 19% del consumo en medicina natural alternativa.

En el año 2002, este mismo país importó mas de 200 millones de Kg., de productos botánicos crudos de plantas medicinales por un valor de unos $ USA 332 millones. Esta misma tendencia se ha observado en otros países desarrollados, como el caso de Alemania Occidental donde un 56% de la población usa remedios naturales provenientes de plantas medicinales para la cura de un amplio rango de enfermedades comunes como gripe, úlceras estomacales, bronquitis, etc.

Metodología de la investigación en alelopatía Uno de los grandes retos de la investigación en alelopatía es poder separar el efecto alelopático del efecto competitivo, de manera que podamos determinar cuantitativamente la contribución relativa de la alelopatía y la competencia al efecto de interferencia como un todo. En consecuencia, cuando se diseña un experimento en alelopatía hay que tener en cuenta que se deben tomar todas las previsiones para tratar de separar el efecto alelopático del efecto competitivo, o sea medir alelopatía en ausencia de competencia.

La investigación de un fenómeno alelopático es complicada, porque aún cuando metodológicamente logremos separar el efecto alelopático del efecto competitivo, existen otros factores que hay que tomar en cuenta; por ejemplo, una vez que el metabolito secundario es liberado al medio ambiente, este puede experimentar transformaciones que aumenten o disminuyan su actividad antes de llegar a establecer contacto con la especie receptora. Si el metabolito secundario llega al suelo, por exudación radical o por lavado foliar, muy probablemente va a ser metabolizado y transformado por la microflora del suelo, lo que puede ocasionar que el verdadero efecto aleloquímico sea expresado por esta sustancia proveniente de la actividad microbiana del suelo y no por el metabolito secundario originalmente producido por la planta. En este caso particular hay que tomar en cuenta además que la actividad transformadora de la microbiota del suelo sobre el metabolito

secundario, va a depender en gran parte de la magnitud y calidad de la población microbiana, la cual a su vez está sometida y depende de la acción de factores abióticos (humedad y temperatura del suelo, contenido de materia orgánica del suelo, textura del suelo, etc.).

Muchos autores han cuestionado la forma en que se realiza la investigación de la alelopatía y han llegado a la conclusión de que “demostrar la alelopatía es extremadamente difícil; es lógicamente imposible probar que no existe y casi imposible probar que existe” pero lo mismo podría decirse acerca de la existencia de la competencia; dos especies pueden competir si hay una limitada suplencia de recursos que son requeridos por ambas, pero la competencia también puede existir aun cuando los recursos no tengan suplencia limitada ya que dos especies pueden interferirse en el uso de esos recursos.

El otro aspecto mencionado por algunos autores es que los bioensayos de laboratorio para demostrar la alelopatía se han conducido sin tomar en cuenta el contexto evolutivo del organismo. Es muy difícil concluir mediante bioensayos de laboratorio que la aleopatía es o no es, uno de los factores fundamentales que influyen en la competencia en los ecosistemas naturales. La simple presencia de compuestos alelopáticos en órganos de la planta no demuestran la alelopatía, como es el caso de algunos compuestos fenólicos (ácidos vanílico, 4-hidroxibenzoicos, etc.) muy comunes en el reino vegetal, los cuales al ser extraídos de los tejidos de la planta ejercen efecto alelopático en la cápsula de Petri, pero no así en el campo.

No obstante las críticas que se le puedan hacer a los bioensayos en los estudios de alelopatía, en el sentido de que estos no demuestran consistentemente la interferencia química entre plantas en los ecosistemas naturales, es importante reconocer su importancia metodológica, por lo cual se ha insistido mucho en tratar de mejorar los protocolos de investigación de los bioensayos para tratar de simular tanto como sea posible, las complejas situaciones que se presentan en condiciones de campo, ya que las mayores críticas a los bioensayos se han enfocado precisamente en su artificialidad y poca correspondencia con lo que realmente ocurre en las interacciones entre plantas en el campo. Los compuestos alelopáticos son liberados a la rizosfera, directa o indirectamente, mediante lavado, incorporación y descomposición de residuos, volatilización, o por exudados radicales; esto implica que cuando realizamos bioensayos con extractos de plantas la relevancia ecológica de dichos resultados es muy limitada. Algunos autores opinan que es muy fácil, pero no conclusivo, demostrar el potencial alelopático de cualquier especie vegetal mediante algún bioensayo, porque casi todas las especies de plantas pueden, mediante una digestión apropiada, extracción y concentración, producir un potencial efecto tóxico sobre una planta receptora, por esta razón lo recomendable es evitar el uso de lavados y de extractos como procedimientos para demostrar alelopatía en los bioensayos de laboratorio.

En forma general la investigación en alelopatía comprende 2 etapas: 1. Fase biológica – ecológica.

2. Fase química – analítica.

Fase biológica – ecológica: Esta fase se inicia cuando por simple observación percibimos en condiciones de campo una aparente interacción negativa severa entre plantas. Esta puede visualizarse, por ejemplo,

como zonas de suelo desnudo alrededor de vegetación arbustiva, cobertura vegetal rala bajo un grupo de árboles, persistencia de un estado particular dentro de la sucesión vegetal o impedimento del desarrollo o reducción del rendimiento en un cultivo infestado con una maleza agresiva en particular.

El siguiente paso es determinar si competencia, alelopatía u otro proceso (un patógeno vegetal, una plaga, etc.) es responsable de la reducción de crecimiento observada en la especie afectada. Normalmente si el efecto observado no puede atribuirse a variables físicas ambientales (pH, temperatura, nutrientes minerales y contenido de agua), ni a los procesos indicados anteriormente, se considera que la alelopatía es la causa.

A continuación, debe determinarse el mecanismo de liberación y el camino por el cual se mueve el supuesto aleloquímico en el medio. Los métodos de extracción deben tratar de simular las rutas de entrada de las sustancias tóxicas al entorno natural. No es recomendable usar procedimientos de extracción que involucren el uso de solventes orgánicos o agua en ebullición, porque pueden llevar a la detección de fitotoxinas que en condiciones naturales están física o químicamente unidas de tal forma que no podrían actuar en la inhibición de crecimiento vegetal.

Los aleloquímicos, después de entrar al medio ambiente de la planta receptora pueden ejercer un efecto directo (rápido) o un efecto indirecto (retardado). Los efectos directos van a depender fundamentalmente de su concentración bioactiva, y de su destino y tiempo de residencia en el suelo; mientras que los efectos indirectos pueden ser causados por degradación y / o transformación del aleloquímico liberado, a través de reacciones bióticas o abióticas del suelo. Por ejemplo, tanto las arcillas minerales del suelo (abiótico) como

enzimas del suelo (biótico) han sido reportados como catalizadores de reacciones de oxidación de compuestos fenólicos en el suelo. De igual manera, se han reportado evidencias de que los elementos polivalentes Cu2+, Mn2+ y Fe3+ facilitan la transformación de compuestos fenólicos en el suelo. Los efectos retardados de los aleloquímicos podrían también estar relacionados con sus efectos sobre la biota del suelo y con las características fisicoquímicas del suelo.

Representación esquemática del efecto del medio hospedero (suelo) en la disponibilidad de los aleloquímicos. Tomado de Inderjit y K.M.M. Dakshini Bioensayos Para el estudio de una alelopatía en particular debe establecerse un bioensayo estándar seleccionando especies blanco (target o indicadoras) convenientes y se bioensayan los compuestos colectados anteriormente evaluando cambios en tamaño y peso en los órganos de éstas. Son frecuentes los bioensayos de germinación de semillas y crecimiento de plántulas.

También se han diseñado bioensayos con plantas enteras (por ejemplo. Lemna minor). Las especies blanco o indicadoras se seleccionan de acuerdo al objetivo que se persigue (por ejemplo, corroborar la sensibilidad a un aleloquímico de una supuesta especie receptora que se observó en campo). Es aconsejable seleccionar especies que presenten germinación uniforme, sensibilidad a gran variedad de aleloquímicos especialmente a bajas concentraciones de los mismos y crecimiento rápido. De esta manera en el análisis estadístico de la información se pueden obtener bajos coeficientes de variación y la más alta significación para los parámetros de crecimiento mensurables (por ejemplo. longitud de raíz y vástago).

Los métodos más frecuentes utilizados en bioensayos son: a) Para Extractos vegetales; Caja de Petri, Suelo y Arena. b) Para estudios de interacción entre plantas intactas; Suelo, Arena y Agar c) Para material vegetal; Esponja de celulosa, Suelo, Arena

Los ensayos de germinación y los de crecimiento de plántulas son ampliamente utilizados debido a que son sencillos y permiten una evaluación rápida de la respuesta de una especie vegetal a un agente presuntamente alelopático. Como especie receptora o indicadora, se puede utilizar cualquier maleza o cultivo. Algunas de las especies más comúnmente utilizadas son: Lepidium sativum L. (Berro), Lactuca sativa L. (lechuga), Lycopersicum esculentum L. (Tomate), Daucus carota L. (Zanahoria), Allium cepa (Cebolla), Triticum aestivum L. (Trigo), Hordeum vulgare L. (Cebada) y Zea mays L. (Maíz).

Las pruebas de germinación se conducen en cajas de Petri de 9 cm de diámetro conteniendo discos de papel de filtro completamente humedecidos con un volumen constante (4 a 8 ml) de la solución de prueba. Previo al estudio de germinación las semillas de la planta indicadora deben ser esterilizadas para evitar contaminación con microorganismos, mediante inmersión de las semillas con burbujeo de aire en una solución 2% (peso/volumen) de hipoclorito de sodio durante 15 minutos y luego enjuagar cuatro veces con agua destilada.

Otro método empleado para la desinfección de semillas, tanto de la especie donadora como de la receptora, consiste en sumergir las semillas en etanol (70% por 2,5 min.), seguido de 4 enjuagues con agua destilada estéril; luego son sumergidas en hipoclorito de sodio (2,5% por 15 min.), seguido de 5 enjuagues con agua destilada estéril.

Por lo general se colocan 50 semillas de cada especie indicadora, en cada caja de Petri, con papel de filtro o papel toalla. El criterio de germinación es cuando hay emergencia de la radícula. Debido a la solubilidad limitada en agua de algunos aleloquímicos, y para facilitar la penetración del aleloquímico en la semilla se ha sugerido la disolución de cantidades adecuadas de estas sustancias inicialmente en Dimetilsulfóxido (DMSO) y luego diluir en agua a la concentración deseada. Contenidos de 0,05% (v/v) de DMSO no tendrían efecto sobre la germinación. Los tratamientos testigos deben contener igual concentración de DMSO para evitar falsos resultados. Se sugieren concentraciones de 5 x 10-3 M, 1 x 10 -3 M, 1 x 10-4 M y 1 x 10-5 M. Posibles efectos aditivos o sinergismos pueden evaluarse usando combinaciones de varios de estos aleloquímicos. Entre cuatro a seis cajas de petri, cada una conteniendo 50 semillas, deberían ser usadas para cada concentración (tratamiento) de los agentes alelopáticos. Las cajas de Petri conteniendo las diluciones de prueba y las semillas deberían ser incubadas, preferiblemente en un germinador o una cámara de crecimiento con condiciones controladas de temperatura, humedad relativa, intensidad de luz y horas de luz.

Las lecturas de germinación, crecimiento radicular, del coleoptilo, etc., se realizan a determinados intervalos de tiempo después de haberse colocado la semilla en contacto con la solución potencialmente alelopática; por ejemplo, a los 2, 4, 6, días. Debe compararse la germinación de cada una de las soluciones de prueba contra la del control. El diseño estadístico más apropiado en estos estudios es el arreglo completamente aleatorizado de las unidades experimentales pero también se puede emplear el diseño de bloques al azar.

Con la información obtenida se construyen las correspondientes curvas de porcentaje de germinación en función de los días para cada concentración de aleloquímico, para los diferentes agentes alelopáticos y especies receptoras. Comparar la respuesta de las diferentes especies a las sustancias ensayadas. Estos resultados dan una idea del potencial alelopático de la especie donadora, pero no se pueden extrapolar a campo, dado que las concentraciones producidas de los metabolitos se desconocen, así como también se desconoce que ocurre con

los mismos una vez puestos en contacto con el sustrato, debido al pH, a la humedad, a la microbiota, etc.

Efecto de los extractos de hoja (H) y raíz (R) Rumex crispus sobre el crecimiento de la radícula y el vástago de varias especies indicadoras. Tomado de Gómez C et al. Algunos estudios de alelopatía de Rumex crispus y Polygonum cegetus HBK en Colombia.

Es muy importante, antes de realizarse los bioensayos, medir los potenciales osmóticos de las soluciones contentivas de los potenciales compuestos alelopaticos, para estar seguros de que el efecto sobre la germinación y sobre el crecimiento de la radícula o de la plántula indicadora, se debe a un potencial efecto alelopatico y no a un efecto osmótico. La existencia de potenciales osmóticos muy elevados en las soluciones de extractos a ser evaluados inhibe la germinación y crecimiento de muchas especies. El instrumento idóneo para medir el potencial osmótico de una solución es el osmómetro.

En caso de no disponerse de un osmómetro, se pueden usar soluciones de manitol o Dsorbitol, en orden creciente de concentraciones conocidas y potenciales osmóticos conocidos y se realizan bioensayos con estas soluciones de manitol para ver en que concentración o rango de concentraciones, se ve afectada la germinación de la planta indicadora. Para explicar el procedimiento de elaboración de curvas de calibración de potenciales osmóticos, usaremos un ejemplo obtenido del trabajo de Maestría del Ing. Zambrano C, realizado en el Laboratorio de Fisiología y Metabolismo Vegetal de Cultivos y malezas Tropicales, FAGRO, UCV. En este trabajo se elaboraron curvas de calibración para evaluar el efecto de la concentración osmótica de los eluatos y extractos de la especie donadora sobre la altura de las plantas indicadoras de las especies Echinochloa colona, Ischaemum rugosum, Lactuca sativa y Oryza sativa. Las soluciones utilizadas estuvieron entre 10 y 25mg diluidas en 50 ml de agua destilada, siendo la solución testigo agua destilada pura. El potencial osmótico de cada una de las concentraciones de D-sorbitol se midió en un Osmómetro, Osmette 5002 y con estos valores se construyó una curva de los valores de altura de plántula (Y) versus los potenciales osmóticos (X).

Curvas de calibración de potencial osmótico de las especies indicadoras utilizando la altura de planta como variable respuesta.

La metodología, sin lugar a dudas, es uno de los aspectos fundamentales para el estudio de la alelopatía. Por esta razón, muchos investigadores han considerado como prioritario estandarizar los métodos de estudio, lo cual ha llevado recientemente al desarrollo del Método de Análisis de Laboratorio ECAM (Equal-Compartment- Agar-Method), que permite simular la liberación natural de aleloquímicos desde plantas vivas donantes hacia un medio de cultivo estéril y sin nutrientes, evitando el efecto de microorganismos y la competencia por nutrientes, agua y luz entre las especies vegetales evaluadas. En este método, las etapas en órden de ejecución son: a) desinfección de las semillas de las especies donantes y receptoras; b) Pregerminación en cámara de crecimiento con condiciones controladas de luz, temperatura, HR, etc. c) Colocación de las semillas pregerminadas (donante y receptoras) en el medio de cultivo (agar esterilizado) Fase química-analítica: Si un efecto fitotóxico puede demostrarse a través de los bioensayos, se procede al aislamiento e identificación de los aleloquímicos potencialmente responsables. Mediante la

utilización de técnicas como las cromatografías en capa fina, en papel, líquida de alta presión (HPLC) y gaseosa acoplada a espectrómetro de masas, se pueden identificar la mayoría de los compuestos aislados.

Una vez identificado el agente alelopático, debe detectarse su presencia en la parte del entorno (aire, suelo, solución del suelo) a través de la cual estaría ejerciendo su acción, en la concentración adecuada, para causar la inhibición de la planta receptora. Esto no es fácil, porqué los compuestos biológicamente activos frecuentemente se encuentran en concentraciones muy bajas en el suelo, lo cual dificulta la extracción y detección de los mismos.

Muchos autores enfatizan que no se puede emplear una sola técnica para probar la presencia o no de un fenómeno alelopático. Los criterios expresados anteriormente, considerados en conjunto, pueden ser muy útiles en la evaluación de la naturaleza de un fenómeno de interferencia en particular.

Uso potencial de la alelopatía en la agricultura moderna.

La agricultura moderna a fin de satisfacer la enorme demanda de alimentos impulsada por una población mundial en continuo crecimiento, tiene como piedra angular para alcanzar los niveles de productividad necesarios para satisfacer dicha demanda, el uso extensivo e intensivo de agroquímicos, los cuales cuando son utilizados de manera racional y como parte de un sistema de agricultura sostenible dentro de programas de control integrado de plagas y enfermedades, cumplen su cometido sin afectar drásticamente al medio ambiente. Dentro de estos agroquímicos, los herbicidas ocupan el primer lugar de importancia, ya que entre los factores bióticos limitantes de la productividad agrícola, la flora maleza es considerada el factor mas relevante y es aquí precisamente donde las investigaciones en alelopatía pudieran aportar un elemento complementario, mas no alternativo, en el enriquecimiento de las estrategias de manejo de malezas en los agroecosistemas, dentro de programas integrados, orientados a una mayor sustentabilidad de los sistemas de producción agrícola. Para lograr una mejor utilización del fenómeno alelopático es necesario profundizar su estudio, con especial referencia a su aplicabilidad en sistemas de rotación de cultivos, manejo de residuos, prácticas de labranza y la búsqueda de nuevas moléculas herbicidas para hacer frente a la amenaza creciente de especies malezas particularmente problemáticas por haber evolucionado el carácter de resistencia a muchos de los herbicidas de mayor uso e importancia a nivel mundial. Debido al mejoramiento de las técnicas de aislamiento e identificación de los aleloquímicos, aunado a nuevos sistemas de cultivo y optimización de bioensayos, muchas de las investigaciones actuales en alelopatía están dirigidas a la determinación de la naturaleza estructural de los productos naturales que han demostrado su potencial alelopático, con la finalidad de buscar moléculas con actividades biológicas importantes. Desde este punto de vista, la alelopatía se constituye en una herramienta para identificar especies de plantas que puedan presentar efectos fitotóxicos sobre especies de malezas, particularmente aquellas donde se ha encontrado el carácter de resistencia a muchos de los herbicidas de mayor uso a escala mundial. De tal manera que hoy en día, la alelopatía tiene un renovado interés agronómico, ya que la proliferación de malezas que han mostrado resistencia frente a los herbicidas convencionales, hace imperante la necesidad de encontrar nuevos herbicidas, con nuevos mecanismos de acción, cuyas estructuras químicas pudieran estar impresas en muchos compuestos aleloquimicos, esperando ser descubiertos, pero no

como una fuente directa de herbicidas naturales, sino como una fuente de plantillas moleculares o estructuras bases, a partir de las cuales, mediante modificaciones y transformaciones sintéticas, se produzcan potenciales herbicidas.

La alelopatía ha sido y puede seguir siendo utilizada en agroecosistemas con fines prácticos: utilización de cultivos de supresión o cubiertas alelopáticas vegetales, rotaciones alelopáticas o cultivos acompañantes, incorporación de residuos de cultivos alelopáticos al suelo y uso de extractos fitotóxicos de plantas alelopáticas. Mas recientemente, se está realizando mucha investigación en la búsqueda de germoplasma con potencial alelopático para identificar cultivares con alta actividad alelopática y transferir esta característica a cultivares comerciales. Esta línea de investigación ha permitido conocer la existencia de muchas accesiones con alto potencial alelopatico en cultivos de arroz, cebada, y trigo.

Conclusiones Como hemos podido observar, el gran reto de la investigación en alelopatia es metodológico.

Es necesario continuar trabajando en la optimización de los bioensayos a objeto de que los resultados provenientes de esta herramienta puedan ser utilizados para explicar y demostrar, tanto como sea posible, las complejas situaciones que se presentan en la interferencia química entre plantas en condiciones de campo. En este sentido, la literatura científica en esta disciplina, propone el reforzamiento de las siguientes líneas de investigación: a) Diseño de bioensayos que simulen mejor la alelopatía bajo condiciones naturales b) Producción y liberación de aleloquímicos en respuesta a estreses bióticos y abióticos c) Influencia de los aleloquímicos en la dinámica de los nutrientes en el suelo d) Papel de la ecología de suelo en las transformaciones de los aleloquímicos e) Efectos de los herbicidas y otros agroquímicos sobre la acción de los aleloquímicos en el suelo. f) Uso de aleloquímicos en el biocontrol específico de algunas malezas, especialmente en áreas cultivadas g) Papel de la alelopatia en la recuperación y mejoramiento de suelos a través de fitorremediación. h) Evaluación de la especificidad alelopática (donador-receptor) y la influencia moduladora de las características fisicoquímicas del suelo sobre esta especificidad. i) Papel de la alelopatía en los aspectos evolutivos de donantes y receptores j) Profundizar el conocimiento de los mecanismos alelopáticos a la luz de la biología molecular y la biotecnología k) Profundizar el conocimiento del modo de acción de los aleloquímicos (liberación al medio ambiente, transformaciones, transporte donador-receptor).

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Capítulo 4 BIOANÁLISIS EN LA CIENCIA DE LAS IMPORTANTES Y EXPERIENCIA PRÁCTICA

MALEZAS:

CONCEPTOS

Bernal E. Valverde Investigación y Desarrollo en Agricultura Tropical, S. A. The University of Copenhagen, Denmark Introducción Los herbicidas por su naturaleza biológica se seleccionan buscando una alta eficacia para eliminar las malezas y el mayor grado posible de selectividad para los cultivos. Varios compuestos químicos que carecen de selectividad también se han desarrollado y comercializado, incluido el glifosato que es el herbicida más vendido en el mundo.

Tradicionalmente, las compañías productoras de agroquímicos han basado sus programas de escrutinio de herbicidas en la realización de bioanálisis con plantas enteras bajo condiciones controladas aunque la tendencia en la actualidad es la de trabajar con otros sistemas que permiten un escrutinio más rápido, automatizado y en gran escala. Los bioanálisis iniciales con plantas enteras se realizan utilizando una o dos dosis elevadas aplicadas sobre varias especies de monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluidos varios cultivos. Para lograr seleccionar un herbicida con potencial comercial, se requiere probar miles de compuestos químicos con costos sumamente elevados. En la actualidad, se estima que para llevar un nuevo herbicida al mercado, se debe realizar el escrutinio de unas 100 000 sustancias con una erogación de 200 millones de dólares. A pesar de todo este esfuerzo, el último modo de acción descubierto que permitió la comercialización de herbicidas novedosos se introdujo en 1991 con los inhibidores de la hydroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) entre los que se encuentran la sulcotriona y mesotriona (Ruegg et al. 2007). La inhibición de la enzima HPPD provoca la pérdida de pigmentos protectores lo que resulta en el blanqueamiento de los tejidos foliares jóvenes y en daño severo por exposición a la luz. En la búsqueda de nuevos herbicidas y modos de acción y gracias a los avances tecnológicos que permiten la prueba de muchos compuestos a la vez, se recurre a bioanálisis más elaborados, que requieren menor cantidad de producto para realizarlos y que se completan en muy poco tiempo con la ayuda de procesos automatizados.

En el uso práctico de los herbicidas, los bioanálisis también tienen mucha importancia y se emplean con regularidad en investigación y diagnóstico. En años recientes, los bioanálisis se convirtieron en una herramienta determinante para corroborar casos de resistencia a herbicidas.

En este capítulo introductorio se presentan conceptos fundamentales acerca del empleo de bioanálisis y describe en detalle el cómo realizarlos para determinar la respuesta a herbicidas solos o en interacción con otros productos utilizando plantas enteras. En lo posible, procuro incluir elementos prácticos, muchos de mi propia experiencia, de la realización de bioanálisis para quienes tengan interés o necesidad de realizarlos y no cuenten con información recopilada al respecto.

Utilidad de los bioanálisis Los bioanálisis tienen muchos usos como herramienta de investigación y de diagnóstico. Un bioanálisis puede consistir en algo tan sencillo como determinar a nivel práctico y en el campo, si un herbicida persistente ya ha perdido su actividad en el suelo para permitir la siembra del cultivo. Esta es una práctica común cuando se emplean herbicidas persistentes para controlar arroz maleza en arroz. Transcurrido un tiempo prudencial, se marcan pequeñas áreas en el campo y se distribuye semilla del cultivo para observar si las plántulas que emergen presentan algún síntoma de toxicidad. Esta operación se repite hasta que las plántulas muestran desarrollo normal garantizando que puede procederse con la siembra comercial del cultivo. Un enfoque similar puede emplearse con fines experimentales para determinar la persistencia de herbicidas y la sensibilidad relativa de posibles cultivos de rotación (Smith et al. 2005). En este caso, el bioanálisis de campo brinda información práctica rápida y confiable que ayuda en la toma de decisiones, especialmente cuando no se tiene los recursos económicos o técnicos para un análisis de laboratorio o cuando no hay un método de laboratorio validado para cuantificar los residuos y un procedimiento que permita relacionarlo con la fitotoxicidad.

Entre los usos importantes de los bioanálisis se incluyen la determinación de residuos biológicamente activos en suelos y aguas usando la curva de dosis-respuesta como estándar de referencia, la verificación de que un herbicida es causante de un daño al cultivo u otra planta de interés mediante la reproducción de los síntomas a través de la aplicación controlada del herbicida, la caracterización de la selectividad de los herbicidas y el diagnóstico de la resistencia a herbicidas. Además, los bioanálisis son muy útiles para estudiar la interacción entre herbicidas (sinergismo, antagonismo), la interacción entre herbicidas y otros compuestos (otros plaguicidas, coadyuvantes, y antídotos o “safeners”) y la eficacia de distintas formulaciones de un mismo compuesto. Sirven también para determinar la posible presencia de sustancias aleloquímicas y son fundamentales para identificar sustancias biológicamente activas a través del aislamiento de componentes activos dirigido por bioanálisis. También pueden ayudar a la identificación del modo de acción de una sustancia. El estudio de las respuestas a un compuesto novedoso mediante bioanálisis con plantas enteras puede brindar indicios de los procesos fisiológicos que afecta y ayudar a descubrir nuevos modos de acción. Este enfoque es muy útil en especial con sustancias de origen natural (Dayan et al. 2000). Los bioanálisis tienen la ventaja de ser cuantitativos y de registrar realmente la actividad biológica de las sustancias.

De acuerdo con los objetivos que se persigan, se puede utilizar diversos organismos como indicadores del efecto de sustancias químicas mediante bioanálisis, incluidos invertebrados, algas, y plantas superiores. Por ejemplo, las algas se han utilizado como complemento al análisis químico para determinar el efecto de sustancias tóxicas sobre cuerpos de agua como resultado de la escorrentía proveniente de áreas agrícolas (Okamura et al. 2002). Daphnia magna es un crustáceo de amplio uso en bioanálisis ecotoxicológicos.

En este trabajo se enfatiza los procedimientos prácticos a considerar en la conducción de bioanálisis con plantas enteras, los cuales son también aplicables a pruebas realizadas con otros organismos.

Pruebas con plantas enteras Los bioanálisis más frecuentes que se realizan a nivel práctico, fuera de los necesarios para el desarrollo por parte de las compañías de agroquímicos, son los que estudian el efecto de un herbicida sobre alguna especie vegetal con fines de diagnóstico (por ejemplo para tratar de reproducir daños por efecto de residuos del herbicida en el suelo o por deriva), para comparar la respuesta diferencial entre especies (selectividad) o entre poblaciones de una misma especie (resistencia), o para dilucidar interacciones de herbicidas entre sí o con otros compuestos. La mayoría de ellos se realizan con plantas enteras y, aunque en general no se requiere de equipo especializado para llevarlos a cabo, si es importante considerar muchos factores que determinan su éxito. La mayor parte de este trabajo se dedica a tratar los elementos más relevantes en la conducción de bioanálisis con plantas enteras.

Selección del material vegetal Para lograr los resultados propuestos en un bioanálisis es imperativo contar con material experimental adecuado y en cantidad suficiente. En la mayoría de los casos en que se trabaja con plantas enteras, las pruebas se realizan utilizando plantas producidas en condiciones controladas, por lo común, originadas de semilla. En algunos casos también se recurre a material vegetativo como fuente de las plantas a tratar con los herbicidas.

Semilla para los bioanálisis. La calidad y representatividad de la semilla a emplear en los bioanálisis es clave para el éxito de la prueba. La semilla debe de recolectarse o producirse teniendo en mente los objetivos del bioanálisis. Por ejemplo, si lo que se desea es realizar un diagnóstico de la posible resistencia de una maleza, la semilla debe de recolectarse en el campo siguiendo un patrón que asegure que representa la condición del lote donde se sospecha se tiene una población resistente. Lo más probable es que al realizarse la recolección, la semilla obtenida provenga de las plantas que efectivamente son resistentes y que lograron sobrevivir a la aplicación del herbicida en el campo, así como de otras que por distintas circunstancias evadieron al herbicida. Esta condición de semilla mezclada proveniente de individuos resistentes y susceptibles refleja, a pesar de los posibles problemas de evaluación en el invernadero y de interpretación de los resultados, la composición de la población en el campo. Si lo que se desea es realizar estudios más elaborados, por ejemplo, la determinación del posible mecanismo de resistencia, puede requerirse la producción de semilla por varias generaciones específicamente para este fin, mediante la selección de plantas que sobreviven a dosis altas del herbicida (o intermedias, según el objetivo del experimento y el posible mecanismo de resistencia) después de un bioanálisis preliminar. En cualquier caso, se ahorrará mucho tiempo en la conducción de los experimentos si se cuenta con semilla de calidad, con alto porcentaje de germinación y que produzca plántulas uniformes y vigorosas. En varias publicaciones se dan recomendaciones o se describen procedimientos útiles sobre la recolección, etiquetado y almacenamiento de la semilla de malezas para el diagnóstico de la resistencia (Bourgeois & Morrison 1997; Moss 1999; Paterson et al. 2002; Valverde et al. 2000). En algunos casos es necesario obtener semilla de malezas de otras fuentes para realizar las pruebas comparativas. Una posibilidad es obtener semilla de poblaciones previamente caracterizadas por otros investigadores en cuyo caso es importante seguir los procedimientos legales adecuados para obtenerlas. Además de los certificados sanitarios y requisitos impuestos por las autoridades locales, es posible que se

deba de firmar un Acuerdo de Transferencia de Materiales en el que se especifique las condiciones para la entrega la semilla y los usos para los cuales puede destinarse. También es posible comprar semilla de malezas de empresas comerciales, como por ejemplo HerbiSeed del Reino Unido (www.herbiseed.com) y Azlin Seed Service (Leland, MS – EE.UU).

En algunas especies predomina la reproducción vegetativa y se requiere establecer las poblaciones a tratar en el bioanálisis mediante la siembra de rizomas, culmos o tallos enraizados, u otros órganos. En estos casos, el enraizamiento y brotación pueden ser disparejos por lo que es mejor hacer brotar o crecer el material en bandejas por separado para luego transplantar a las macetas definitivas. La reproducción de hijos en gramíneas puede ser provechosa para tratar “la misma” planta con herbicidas diferentes. Si, por ejemplo, se sospecha de resistencia múltiple a herbicidas en una población se puede tomar una planta en el campo, separarle sus hijos y sembrarlos por separado para luego tratarlos con diferentes herbicidas para determinar la respuesta de la misma planta a varios productos aplicados de manera independiente. De la misma forma, plantas que crecen en el invernadero, por ejemplo las que sobreviven a dosis elevadas, pueden subdividirse en sus respectivos hijos y sembrarse por aparte para tratamientos adicionales o incrementar la recolección de semilla.

Preparación del material vegetal. La mayoría de los bioanálisis convencionales se hacen con plantas enteras en macetas. También se pueden hacer con plántulas recién emergidas en cajas de petri o en medio de cultivo sólido o líquido. Para la conducción de los bioanálisis es imperativo contar con suficientes plantas en el estado de crecimiento adecuado y con la mayor uniformidad posible. Desafortunadamente, producto de su variabilidad intrínseca, las semillas de las malezas no germinan de manera uniforme, en muchos casos producto de su latencia diferencial o del efecto de las condiciones de crecimiento de la plantas madre.

Dependiendo de la especie, es muy probable que se requiera dar a la semilla algún tratamiento para romper la latencia. Lo más recomendable es buscar literatura pertinente y hacer una prueba de germinación antes de iniciar los bioanálisis. El tiempo que de se demora realizando estas pruebas se recupera con creces en la realización de los estudios que realmente son críticos. Una fuente primaria de información sobre cómo hacer germinar las semillas de las malezas es la “Guía de Andersen” (Buhler & Hoffman 1999).

De acuerdo con mi experiencia de muchos años de realizar bioanálisis en invernadero con plantas enteras prefiero germinar la semilla en condiciones controladas y transplantar las plántulas recién emergidas a las macetas definitivas. Esta práctica me ofrece muchas ventajas, entre las que se puede citar:    

Ahorro en la cantidad de semilla utilizada para la conducción de un bioanálisis Obtención de plántulas requeridas en un espacio limitado Selección de plántulas uniformes que pueden transplantarse de manera simultánea para lograr mayor uniformidad de crecimiento Garantía de que sólo se incorpora al suelo semilla germinada. Esto es muy importante por cuanto si se siembra la semilla directamente en la maceta definitiva, la que no germine no puede eliminarse del suelo o medio de crecimiento con total

certeza antes de desecharlo. Si trabajamos con especies perniciosas, esto nos da la tranquilidad de no estarlas diseminando a sitios no deseados.

La germinación, en la mayoría de los casos, la realizo en cajas de petri con papel de filtro o de germinación. De rutina, siempre humedezco el papel con una solución de nitrato de potasio al 0.2% (p/v) para mejorar la germinación y dejo la semilla embeberse así por 24 horas. Luego procedo a lavarla con agua del tubo utilizando una piseta y la mantengo en los platos con humedad suficiente hasta que germine. Las cajas de petri pueden cerrarse con “parafilm” para evitar la desecación. Algunas especies tienen un crecimiento inicial muy lento en condiciones controladas. Si se siembra todo el material en las macetas definitivas ocupará espacio por mucho tiempo. En estos casos, puede transplantarse las plántulas en bandejas y luego hacer un segundo transplante a las macetas definitivas. Estas plantas de lento crecimiento, por ejemplo Paspalum paniculatum también tienden a crecer muy desuniformes por lo que el segundo transplante se puede aprovechar para escoger el material definitivo o agrupar por tamaño las plantas en las macetas para luego seleccionarlas por bloques.

Llegado el momento de la aplicación, se procede a preparar las macetas para el tratamiento.

Debe escogerse el material más uniforme. Muchos bioanálisis se realizan empleando un arreglo irrestrictamente al azar por lo que la uniformidad del material es muy importante.

También es de todos sabido que dependiendo del estado de crecimiento las plantas pueden variar en su respuesta al herbicida. Me sorprendería mucho que al momento de preparar el material para tratarlo, todas las plantas sean uniformes. Por el contrario, prácticamente en todos los casos, resulta necesario hacer algún tipo de clasificación (por altura, si todas las plantas tienen el mismo estado de crecimiento, o por estado de crecimiento propiamente dicho). Aún cuando el análisis de los datos se haga por regresión, esta clasificación en bloques es muy deseable, sobre todo para la evaluación visual y para poder valorar si los tratamientos testigo se comportaron de acuerdo con lo previsto. Recordemos que el efecto de los herbicidas lo medimos en relación con el comportamiento de plantas sin tratar. Si los testigos no crecen de la manera adecuada podemos perder por completo el bioanálisis o sacar conclusiones erradas.

Es importante tener un procedimiento sistemático de etiquetado, sobre todo cuando se realizan bioanálisis de forma rutinaria. Cada investigador puede diseñar su propio esquema de etiquetado. En mi caso particular, empleo tres dígitos para identificar el material vegetal: (biotipo o población), repetición y dosis. Por ejemplo, una maceta cuyo código es 314 corresponde al tercer biotipo, primera repetición y la cuarta dosis. Cuando los bioanálisis requieren mucho material, recurro a etiquetar con paletas plásticas de diferente color (por ejemplo, uso colores diferentes para herbicidas distintos, manteniendo la numeración anterior).

Selección del ámbito de dosis Selección del ámbito de dosis adecuado. La respuesta típica de las plantas a dosis crecientes de herbicidas tiene forma sigmoidea (Figura 1) de modo que para lograr un ajuste adecuado del modelo es importante seleccionar un ámbito de dosis apropiado.

Figura 1. Relación de la respuesta de las plantas al incremento de la dosis de herbicida (en escala logarítmica). Cuatro parámetros definen la curva: D es el nivel superior, C es el nivel inferior, b es la pendiente y ED50 es la dosis que inhibe la variable de respuesta medida en un 50% (ver sección sobre Análisis de los datos y presentación de los resultados para mayores detalles).

Antes de realizar los bioanálisis detallados es conveniente hacer una prueba preliminar.

Puede aprovecharse las pruebas de germinación de semilla para obtener plantas suficientes para el experimento preliminar en el que sólo se consideran unas pocas dosis (dos o tres) no mayores de la comercial. Si se observa respuesta diferencial entre las poblaciones tratadas, se puede hacer el ajuste correspondiente en el ámbito de dosis definitivo. Uno de los errores más frecuentes en la conducción de bioanálisis de respuesta a dosis crecientes en las que se compara especies o biotipos con respuesta diferencial a herbicidas es la escogencia de ámbitos de dosis inadecuados. Por sencillez, en el diagnóstico de la resistencia, muchas veces se una ámbitos comunes para las plantas resistentes y susceptibles. Las consecuencias son lamentables pues de desaprovecha la oportunidad de obtener información valiosa y confiable. Como regla general, se debe de tener ámbitos diferentes para las poblaciones susceptibles y resistentes, de modo que se pueda ajustar los modelos de regresión y obtener los valores de inhibición media con intervalos de confianza adecuados para poder calcular índices de resistencia y comparar dichas poblaciones. Las dosis deben seleccionarse en progresión geométrica, es decir, las dosis aumentan con base en una tasa común. Lo más común es que las dosis se dupliquen conforme se avanza en la progresión, aunque se puede utilizar otras tasas incrementales. En la Figura 2 se ilustra la importancia de seleccionar de manera apropiada los ámbitos de dosis.

Figura 2. Selección de ámbitos de dosis. Curvas de dosis-respuesta provienen de bioanálisis preliminares para determinar la respuesta a imazapir en biotipos de arroz maleza (Oryza sativa). Ámbitos adecuados para identificar un biotipo resistente por flujo de genes de variedades de arroz resistentes a imidazolinonas (A) y uno susceptible (B). Nótese la diferencia en la escala de las dosis. (C) Ámbito inadecuado (por escogencia de dosis muy elevadas) para identificar un biotipo susceptible. (D) Ámbito inadecuado (por selección de dosis muy bajas) para identificar un biotipo resistente.

Para poder ajustar un modelo de dosis-respuesta es necesario incluir al menos cuatro dosis (mínimo requerido por el modelo). Sin embargo, lo más deseable es incluir seis o más. Yo regularmente empleo ocho dosis más dos testigos sin tratar (por repetición). El número de repeticiones afecta la precisión con que se determina los parámetros. Debe de usarse tres o más repeticiones (mi preferencia es de cuatro a seis). Si el material vegetal es limitante, debe de hacerse un balance entre el número de dosis y el de repeticiones tratando de optimizar el análisis considerando los grados de libertad asociados con el modelo estadístico.

Es importante tener presente que la respuesta de las plantas a los herbicidas varía con el estado de crecimiento, lo cual puede hacer necesario realizar ajustes en los ámbitos de dosis a probar. Pero también puede darse el caso de que la expresión de mecanismos de resistencia dependa del estado de crecimiento. Este tipo de variaciones en la respuesta a los herbicidas

está documentado en la literatura, por ejemplo, las plantas de E. colona resistentes a propanil tienen niveles de resistencia superiores conforme se desarrollan más que no se explican por variaciones en la actividad de la arilacilamidasa responsable de la resistencia (por metabolismo acelerado del herbicida), lo cual sugiere que otros mecanismos coadyuvan a la resistencia cuando las plantas están más desarrolladas (Leah et al. 1995). Un caso más dramático se observó con Conyza canadensis resistente a glifosato (Dinelli et al. 2006).

Cuando las plantas se trataron con glifosato en dosis crecientes en el estado de dos hojas, no se observó diferencia alguna en la respuesta al herbicida entre las plantas supuestamente resistentes y las susceptibles. Si los autores se hubieran conformado con estos resultados habrían concluido que C. canadensis no había evolucionado resistencia al glifosato. Sin embargo, cuando el glifosato se aplicó a plantas en el estado de roseta, los biotipos resistentes requirieron tres veces más glifosato que los susceptibles para inhibir su crecimiento en un 50% (Figura 3).

Aplicación de los tratamientos y conducción del bioanálisis

Equipo de aplicación y su calibración. Si la calibración del equipo es importante en las aplicaciones comerciales en el campo, con mayor razón es fundamental en la ejecución de los bioanálisis. Lo ideal es aplicar los tratamientos con un equipo diseñado para este propósito de modo que se garantice que la presión, el volumen y la velocidad de aplicación sean constantes. En el mercado puede obtenerse cámaras de aspersión de herbicidas con diferentes niveles de automatización (Figura 4). Algunas de las compañías que ofrecen este tipo de equipo son Devries Manufacturing (http://www.devriesmfg.com) y su distribuidor R&D Sprayers (http://www.co2sprayers.com) y Engineering and Design Associates, Inc. (http://www.eda-inc.net). También se las puede construir según las especificaciones deseadas. En ausencia de una cámara de aspersión, la siguiente mejor opción es un equipo de aplicación portátil accionado por CO2 que garantiza una presión constante. R&D Sprayers tiene varios modelos disponibles. Herbiseed tiene un modelo construido en fibra de carbono que lo hace muy liviano. Si del todo no se cuenta con equipo especializado, los tratamientos se pueden aplicar con una bomba de mochila procurando el mayor control de las variables antes mencionadas (presión, volumen de aplicación y velocidad). Cualquiera que sea el equipo que se utilice, debe de calibrarse antes de realizar la aplicación. También es una buena práctica corroborar frecuentemente que la presión no varíe. La calibración se realiza con agua y la mezcla de herbicida a aplicar contiene el herbicida y los demás componentes que se estén evaluando. No está de más comprobar que la descarga no varía por efecto de la densidad del material.

Figura 3. Supervivencia de biotipos de Conyza canadensis resistentes [AR (○), DE ( ), OH ( ), y VA (□)] y susceptibles a glifosato [RE (•), WA ( )] tratados con dosis crecientes de glifosato en el estado de dos hojas (A) y de roseta (B). Las líneas describen las respuestas (de supervivencia) predichas de acuerdo con un modelo sigmoideo. Los datos corresponden a los promedios ± EE de tres repeticiones en las cuales se trató 25 plantas de cada biotipo con cada dosis. En los recuadros se indica los valores de ED50 (g ea ha−1) e índice de resistencia (IR, valor de ED50 del biotipo de C. canadensis dividido por el valor de ED50 del biotipo susceptible RE). Tomado y traducido libremente al español de (Dinelli et al. 2006).

Figura 4. Cámara de aspersión fabricada por Devries Manufacturing.

Preparación de las diluciones. Si se trabaja con productos formulados, es importante asegurarse que se cuenta con los instrumentos básicos de medición de pesos y volúmenes.

Las cantidades de mezcla que se preparan para la aspersión de los tratamientos son bajas (de 50 a 500 mL) por lo que las cantidades del herbicida formulado que se adicionan también son bajas (en el orden de microlitros o microgramos). Si las concentraciones a asperjar son muy bajas puede ser necesario recurrir a la preparación de soluciones madre. Es de vital importancia verificar muy bien los cálculos puesto que un error en la preparación de dicha solución afectará todas las dosis aplicadas. Cuando el herbicida se formula como gránulos dispersables en agua es conveniente trabajar con soluciones madres. Si el tratamiento requiere la adición de un coadyuvante también es conveniente hacer una solución madre concentrada puesto que resulta muy difícil medir volúmenes bajos del coadyuvante en virtud de su viscosidad. Si el herbicida que se va a utilizar es un estándar analítico, verifique con el proveedor el procedimiento para diluirlo y asegúrese de tener los testigos o tratamientos en blanco necesarios. Es posible que el herbicida deba disolverse en un solvente orgánico como la acetona antes de prepararlo en agua para su aspersión.

Aspersión del herbicida y manejo de las plantas recién tratadas. Cuando se aplica un mismo herbicida en dosis crecientes, lo más conveniente es aplicar las dosis en orden ascendente para evitar el lavado del equipo después de cada tratamiento. Si los herbicidas a probar tienen diferentes formulaciones, es preferible aplicar de primero los que se formulan como soluciones acuosas concentradas o polvos solubles. Los polvos mojables deben dejarse de último y asegurarse de verificar frecuentemente de que los filtros de las boquillas estén limpios para garantizar que se asperja el volumen deseado. Aplicado el herbicida, conceda tiempo suficiente a las plantas para que la aspersión se seque antes de trasladarlas al sitio definitivo y asegúrese de regarlas de la manera apropiada para evitar el lavado del producto

desde el follaje o la contaminación del follaje de plantas adyacentes por efecto del salpique del agua de riego que se posa sobre las hojas recién tratadas.

Es importante asegurarse que las plantas se colocan en condiciones lo más homogéneas posibles. Preferiblemente, las macetas deben colocarse al azar, sin seguir un patrón definido.

En la práctica, es conveniente dejar una repetición con las macetas ordenadas por dosis creciente de modo que sea más fácil darle seguimiento al desarrollo de los síntomas. Provea riego a la base de las plantas, preferiblemente con un sistema de goteo, y evite el riego por aspersión. El lavado del herbicida desde las hojas puede hacer que el producto entre en contacto con plantas vecinas causándoles efectos no deseados. Es recomendable no hacer aplicaciones de insecticidas o fungicidas inmediatamente después de la aplicación de los herbicidas. Espere al menos dos días. De la misma forma, es mejor no aplicar estos productos antes de tratar las plantas con el herbicida para evitar el riesgo de que ocurran interacciones entre ellos.

Evaluación de los tratamientos y recolección de los datos Evaluación de los tratamientos y recolección de los datos. En el momento oportuno se procede a hacer la evaluación del material y recolectar los datos. ¿Pero cuándo es el momento oportuno? No es posible definir a priori cuándo realizar la evaluación. Mi recomendación es que observe las plantas regularmente y tome la decisión conforme evolucione el desarrollo de los síntomas. Uno de los problemas en la evaluación de los bioanálisis es su naturaleza comparativa en relación con un testigo sin tratar. Si la evaluación se realiza muy pronto, es posible que las plantas no hayan desarrollado los síntomas completamente y que se subvalore el efecto del herbicida. Si la evaluación se demora mucho, las plantas testigos pueden crecer demasiado por lo que el efecto del herbicida se sobredimensiona. El conocimiento del material experimental y del efecto del herbicida ayuda mucho a determinar el mejor momento para realizar la evaluación. Los herbicidas que tienen efecto de contacto, pueden evaluarse pocos días después de su aplicación. Por ejemplo, el efecto del propanil puede evaluarse entre 5 y 7 días después del tratamiento. Los herbicidas sistémicos son más lentos en ejercer su acción y requieren que transcurra mayor tiempo antes de que pueda evaluarse su efecto. Un buen indicador de que se ha llegado al momento de hacer la evaluación es cuando los tejidos de las plantas tratadas con el herbicida en sus dosis más altas se tornan necróticos y las plantas mueren. La tardanza en la evaluación, sin embargo, puede dar oportunidad a que plantas que sufren de un daño moderado se recuperen. Las condiciones ambientales (temperatura y luminosidad) afectan el tiempo necesario para el desarrollo de síntomas lo que obliga a justes en cuanto al tiempo de evaluación y cosecha.

Es importante tener una mentalidad abierta y valorar modificaciones en la conducción y evaluación de los bioanálisis cuando sea necesario, a pesar de que se tenga amplia experiencia y que supuestamente se conozca el material experimental. Por ejemplo, en un estudio del autor todavía en ejecución, la evaluación preliminar de la respuesta de poblaciones de P. paniculatum supuestamente resistentes a glifosato arrojó resultados inconsistentes y resultó muy difícil corroborar la resistencia, a pesar de que las poblaciones muestreadas no se lograban controlar en el campo con dicho herbicida. Parte de las dificultades para obtener datos confiables y reproducibles puede achacarse a la posible falta

de uniformidad intrínseca de las plantas al momento de tratarlas a pesar de los esfuerzos por seleccionar material semejante, mezcla de individuos susceptibles y resistentes en la muestra, y al nivel bajo de resistencia al herbicida y lento desarrollo de síntomas producto de un probable mecanismo de resistencia no asociado con una modificación en el sitio de acción del herbicida. Las evaluaciones visuales y por peso fresco no mostraron mayor diferencia entre las poblaciones supuestamente resistentes y las susceptibles de referencia. Sin embardo, una espera mayor para realizar la evaluación permitió verificar que las plantas resistentes tenían la capacidad de rebrotar aun cuando en la evaluación visual aparentaran estar completamente muertas (Figura 5).

Figura 5. Evolución de síntomas de toxicidad en un biotipo de Paspalum paniculatum resistente a glifosato. (A) Síntomas iniciales observados a los 5 días después de la aplicación (DDA) del herbicida en dosis crecientes (ámbito parcial); (B) Síntomas avanzados a los 35 DDA; (C) Detalle de síntomas a los 35 DDA en planta tratada con la dosis más elevada (en esta fecha la planta se transfiere a maceta de mayor tamaño para darle seguimiento); (D) Rebrote de la planta tratada con la dosis más alta a los 77 DDA; (E) Crecimiento de la planta tratada con la dosis más alta a los 150 DDA.

Otra decisión que enfrentamos es definir cómo realizar la evaluación. Las compañías de agroquímicos cuando realizan escrutinios de productos en gran escala usando plantas enteras, evalúan el efecto de los productos mediante una valoración visual del daño. La evaluación visual también es muy utilizada en el diagnóstico de la resistencia. Este tipo de evaluación por ser subjetiva depende de la agudeza visual y experiencia del evaluador. Un evaluador bien entrenado puede apreciar diferencias y plasmarlas en un set de datos confiables. La

escala utilizada más frecuentemente es la que asigna porcentajes de daño (grado de afectación de los tejidos) en comparación con el tratamiento testigo, cuyas plantas no han sufrido daño alguno.

Una valoración cuantitativa se obtiene mediante el peso (fresco o seco) de las plantas. Si el material tratado fue bien seleccionado en cuanto a uniformidad en el estado de crecimiento y condición de las plantas, los resultados de peso fresco y seco son fundamentalmente equivalentes, con algunas excepciones. Plantas tratadas con los herbicidas hormonales que tienen un crecimiento anormal por la obstrucción que dichos herbicidas causan al sistema vascular y las deformaciones que producen en los tejidos pueden acumular mucha agua y peso fresco a pesar de estar severamente afectadas en su crecimiento y desarrollo. En este caso particular, la evaluación visual puede ser incluso más informativa que la de peso fresco.

El peso fresco puede ser más válido que el peso seco porque plantas que se han necrosado o muerto recientemente pueden tener el mismo peso seco que plantas que se notan verdes y saludables (Santelmann 1977).

Por razones de conveniencia, espacio y costo energético, yo me inclino en mis bioanálisis por el peso fresco (casi siempre basta evaluar en peso del follaje y no el del sistema radical).

Antes de cosechar las plantas, procedo a hacer una evaluación visual detallada y a documentar fotográficamente las respuestas observadas. Confío más en estas herramientas que en mi memoria. Estas observaciones son muy útiles cuando se analiza los datos. La evaluación visual se puede detectar claramente valores atípicos (los denominados “outliers”) y proporcionar un criterio menos sesgado en caso de que se deba de eliminar el dato del análisis. También es oportuna por cuanto en algunas ocasiones las plantas en alguno de los tratamientos testigo crecen de manera anormal y se debe considerar su eliminación del set de datos a analizar (por eso la conveniencia de incluir dos testigos en cada repetición). Por último, no escapa a la realidad el hecho de que alguna planta sufra daño mecánico o que la devore un insecto. En la evaluación visual se constata la situación y se procede, sin pérdida de rigor científico, a eliminar el dato. Un asistente de investigación o estudiante bien entrenado detecta este tipo de problemas y consulta; un ayudante que diligentemente sigue la directriz de cosechar y pesar, recolecta un dato incierto y con él genera incertidumbre en toda la repetición o en el bioanálisis.

Algunos autores prefieren evaluar el efecto de los tratamientos determinando la mortalidad de las plantas. La validez de este tipo de evaluación depende del número de individuos que componen cada tratamiento. En el sentido estricto, una planta puede estar viva o muerta, no medio muerta ni medio viva. En mi experiencia la respuesta de las plantas a las dosis crecientes de herbicidas no está definida en blanco y negro sino en tonos de gris. Por ello, le veo mucha ventaja a la determinación de peso fresco. Además, el peso es una variable continua, mientras que la mortalidad (o supervivencia) corresponde a una variable de respuesta binomial, la cual debe ser sujeto de un análisis de probits.

El efecto de los herbicidas se puede valorar utilizando otras mediciones, dependiendo de los objetivos del experimento y del equipo y recursos disponibles. Entre ellas incluye altura de planta, longitud de raíz, área foliar (o índice de área foliar), rendimiento en grano o fruto, tasa de crecimiento relativo, tasa de asimilación neta, tasa fotosintética, fluorescencia de la clorofila, producción de algún metabolito específico. Se puede medir el consumo diario de

agua por las plantas como un indicador del efecto del herbicida siempre y cuando las condiciones ambientales sean homogéneas para todas las plantas (Santelmann et al. 1971).

Aunque resulte obvio, es importante registrar los datos y almacenarlos de manera segura. Si se registran en papel, hágalo con lápiz, no con bolígrafo. En caso de que el papel se humedezca, los registros no se dañarán. Con los medios disponibles en la actualidad, cada vez es más común el registro electrónico de los datos. No olvide realizar los respaldos necesarios.

Análisis de los datos y presentación de los resultados Análisis preliminar de los datos y ajuste de un modelo estadístico. Una vez obtenidos los datos, debe de procederse a su análisis, el cual, idealmente, debió haber sido planeado desde que se diseñó el experimento para así garantizar que se logrará cumplir con sus objetivos.

Me gusta recordar a mis estudiantes que la estadística es una herramienta y no la razón de ser del bioanálisis. Sin embargo, un buen set de datos mal analizado priva al investigador y al lector de información útil. Con este criterio, mi primer encuentro con los datos recolectados siempre es la elaboración de un gráfico con los datos “crudos” de peso fresco (o la variable medida) vs dosis. La dispersión de los datos y la forma en que se distribuyen me dan una primera impresión de la calidad del bioanálisis. Este ejercicio puede hacerse en una hoja de Excel o cualquier programa similar. Procuro ser el crítico más riguroso de mí mismo. Son muchas las ocasiones en que al llegar a este punto confirmo que el estudio fue un fracaso y que lo único que puede hacerse es repetir el experimento. Si hay valores atípicos (“outliers”), este es el momento de valorarlos y de tomar decisiones respecto de ellos. La gráfica también es útil para proporcionar los valores estimados de los parámetros del modelo de regresión que requiere la mayoría de los programas de cómputo para iniciar sus iteraciones para el ajuste definitivo del modelo. El módulo “drc” (dose response curve) empleado con el programa de uso libre “R” (http://www.r-project.org) preparado por Streibig (www.bioassay.dk) no requiere proporcionar tales estimados para iniciar el análisis.

El análisis de la respuesta a dosis crecientes de herbicidas requiere ajustar un modelo adecuado y que tenga significado biológico. Las respuestas obtenidas con plantas tratadas con dosis crecientes de herbicidas son de tipo sigmoideo. No tiene sentido alguno tratar de ajustar un modelo polinomial de quinto orden que puede ajustarse muy bien a los datos si sus parámetros no tienen el mínimo sentido biológico. También carece de sentido cuando se determina la respuesta de plantas a dosis crecientes de herbicidas hacer comparaciones de medias empleando pruebas de rango múltiple como las de Duncan, Tukey o DMS. La intención al momento de diseñar el experimento no era la de comparar el efecto de dosis discretas del producto sino el comportamiento de las plantas conforme aumenta la dosis del herbicida. Tampoco es de interés presentar ambos análisis (el de regresión y el de rango múltiple).

Conforme lo mencionado anteriormente, cuando se grafica el peso de las plantas u otra variable de respuesta contra el logaritmo de la dosis de herbicida, se obtiene una relación sigmoidea (en forma de “S”), similar a la observada en la Figura 1. Esta respuesta está descrita por un modelo logístico:

Y = C + {D – C / 1 + exp[b(log x – log ED50)]} Como se observa, el modelo está definido por cuatro parámetros, donde     

Y denota la respuesta de crecimiento (peso, longitud de la raíz o del tallo, tasa fotosintética) a la concentración x del herbicida: D corresponde al límite superior, es decir, representa la respuesta del testigo sin tratar

C denota el límite inferior, el cual, se aproxima a cero cuando las dosis del herbicida son muy altas (o el peso de las plantas al momento de ser tratadas).

b es la pendiente de la curva cerca de la ED50. Cuanto mayor sea el valor de b, más pronunciada es la pendiente

ED50 es la dosis del herbicida que reduce el crecimiento (o el valor de la variable de respuesta) en un 50%.

Una vez ajustado el modelo, fácilmente puede obtenerse el valor de respuesta a otro nivel, por ejemplo la ED25 o ED75, con base en la siguiente expresión dada en función de los parámetros, b y ED50:

ED50 = EDx / (x / 100 –x)1/b donde x es cualquier nivel de respuesta. De tal forma, si se desea calcular la ED25, entonces el valor de x es 25.

Comparación de respuestas. Cuando comparamos la respuesta de biotipos a un mismo herbicida para determinar si son resistentes o susceptibles, en realidad estamos determinando cuál dosis del herbicida tiene el mismo efecto sobre las poblaciones, es decir, se hace una comparación de tipo horizontal, que contesta la pregunta ¿Cuánto herbicida se requiere para inhibir el crecimiento en un 50% (o en otra magnitud previamente definida)? En sentido biológico, esto equivale a una comparación de tasas de cambio a niveles de respuesta predeterminados (Streibig 1988). La comparación más rigurosa se hace cuando las dos curvas de respuesta son similares en todos sus parámetros, excepto la ED50, en cuyo caso se pueden definir como paralelas (Figura 6). La magnitud del desplazamiento de estas curvas en el sentido horizontal está dada por un factor constante que se denomina la “potencia relativa” (Seefeldt et al. 1995) y que corresponde con el índice de resistencia. Cuando se tiene curvas paralelas la potencia relativa es independiente del nivel de respuesta que se seleccione (ED10, ED50, ED90 o cualquier otro) para hacer la comparación. La comparación de los valores de ED50 se realiza con un procedimiento que es básicamente una prueba de t: se verifica que no haya traslape en los intervalos de confianza de las dos curvas que se comparan a un nivel de probabilidad previamente establecido.

Figura 6. Comparación horizontal (A) y vertical (B) de curvas dosis-respuesta de dos herbicidas. Adaptado de (Streibig 1988).

Desafortunadamente, las curvas de dosis-respuesta rara vez son paralelas o muy similares.

Esto obliga a que los modelos de dosis-respuesta deban probarse estadísticamente para determinar si son similares antes de poder hacer las comparaciones de potencia relativa (Ritz et al. 2006). Estos análisis (como el de la prueba de F por falta de ajuste o “lack of fit”), aunque son complicados desde el punto de vista estadístico y metodológico, se convierten en rutina porque están contemplados en los programas estadísticos de uso común. Si la prueba de F para falta de ajuste es no-significativa, puede inferirse que el modelo se ajusta de manera aceptable.

El otro tipo de comparación de curvas de respuesta es la vertical, es decir, se compara la respuesta de las plantas o poblaciones a dosis preseleccionadas del herbicida (Figura 6). En la representación gráfica es muy evidente que cuando las comparaciones se hacen cerca del límite inferior o superior, las diferencias por efecto del tratamiento son mucho menores que si se hacen cerca del punto medio (cercano al valor de ED50). En otras palabras, los herbicidas afectan a las plantas de manera diferente conforme se varía la dosis. Por este motivo, cuando se hace un análisis de varianza se revela que existe una interacción significativa.

Al comparar la respuesta de poblaciones o biotipos a herbicidas, es importante usar consistentemente una misma metodología. Los datos pueden no ser comparables si se emplean métodos diferentes. Por ejemplo, en principio no debe de compararse los resultados obtenidos con una prueba realizada en papel de filtro con otra hecha en medio de cultivo preparado con agar. Si alguno de los métodos se va a emplear como herramienta de diagnóstico es aconsejable relacionar los resultados obtenidos con los de bioanálisis con plantas enteras (Cutulle et al. 2009; Yang et al. 2007).

Desigualdad de límites superiores e inferiores entre curvas a comparar. Como se mencionó previamente, las plantas a veces crecen de manera diferente, sin razón aparente, en un mismo

bioanálisis. Por esta razón es posible que el límite superior o inferior o ambos de los curvas a comparar sean distintos (de ahí la tendencia a expresar los datos como porcentaje). En estos casos, la potencia relativa no es constante a través de todos los niveles de respuesta y la transformación a porcentaje del testigo puede inducir a error por cuanto permite la comparación como si las curvas fueran paralelas. En este caso, lo más prudente es hacer las comparaciones a un nivel de respuesta que sí sea respaldado por los datos experimentales y utilizando las curvas ajustadas a los datos de peso (no porcentuales) originales de modo que se obtengan errores estándar válidos (Knezevic et al. 2007; Ritz and Streibig 2005). Para la presentación gráfica, se puede usar el valor relativo de biomasa (o de la variable de respuesta) en relación con el testigo para facilitarle al lector la comprensión del mensaje.

Es posible que al planear y realizar un bioanálisis que incluye a varias especies o biotipos, los ámbitos de dosis escogidos no nos permitan obtener curvas de respuesta completas. Si algún material es muy tolerante o resistente, la dosis mayor incluida en el ámbito puede ser insuficiente para poder estimar el límite inferior C (Figura 7). En este caso, el modelo de cuatro parámetros debe de modificarse para eliminar el parámetro C, por lo que la respuesta debe ahora ser ajustada con el modelo:

Y = D / 1 + exp[b(log x – log ED50)] Puesto que, en la mayoría de los casos de nuestro interés realizamos comparaciones de ED50s los valores estimados con el modelo de tres parámetros pueden compararse con los obtenidos para las otras plantas o biotipos que sí permitieron la estimación de todos los parámetros, siempre teniendo en consideración los correspondientes intervalos de confianza asociados con los valores de ED50. Si la comparación de interés fuera a niveles mucho mayores, por ejemplo ED90, no sería posible realizarla a no ser que se repitiera el experimento.

Figura 7. Curva de dosis-respuesta a un herbicida usando un ámbito de dosis insuficiente para alcanzar el límite inferior.

Hormesis. Con alguna frecuencia y dependiendo del ámbito de dosis empleado, puede observarse un aumento en la respuesta medida (crecimiento) cuando las plantas se tratan con dosis muy bajas (Figura 8). A este estímulo del crecimiento se le denomina hormesis y se observa no sólo con herbicidas en plantas sino con gran cantidad de compuestos tóxicos en muchas especies (Calabrese & Blain 2009). Se presenta con herbicidas de distintos modos de acción y se ha tratado de explicar en relación con los efectos filológicos de cada producto.

Cuando hay hormesis, la relación sigmoidea se altera. Si el objetivo del bioanálisis no es el estudio de los efectos subtóxicos del herbicida se puede obviar esta parte de la curva y ajustar el modelo simétrico de curva sigmoidea (Streibig 1988). Si hay interés en estudiar el efecto de dosis subletales, existen modelos apropiados que consideran la hormesis (Brain & Cousens 1989; Cedergreen et al. 2005).

Comparación de múltiples curvas de respuesta obtenidas en bioanálisis independientes.

Cuando se tiene muchas poblaciones o especies a comparar en estudios de dosis-respuesta no es posible ejecutar todos los bioanálisis en forma simultánea. Sin embargo, el objetivo final es poder diferenciar entre todas ellas la manera en que responden al herbicida (por ejemplo, cuáles poblaciones son resistentes). La pregunta que salta a la vista es ¿puedo hacer una comparación de todas las curvas a pesar de que se generaran en distintos momentos? En la práctica, hay dos aspectos que son de interés. El primero es cuán confiables desde el punto de vista biológico pueden ser las comparaciones, especialmente si los experimentos se realizan en condiciones donde no hay control de las variables ambientales, las cuales son homogéneas dentro de cada grupo de bioanálisis pero heterogéneas entre grupos. Me enfrento con esta encrucijada con mucha frecuencia. Para mi propia tranquilidad, recurro a una herramienta sencilla que me da la suficiente confianza en mis datos. Cada vez que hago los bioanálisis, incluyo un biotipo bien caracterizado que considero de referencia (por ejemplo, el susceptible en las pruebas de diagnóstico de resistencia).

Figura 8. Curva de dosis-respuesta a un herbicida usando en la que se nota la hormesis (estimulo del crecimiento cuando las plantas se tratan con dosis muy bajas).

El otro aspecto relevante, es cómo realizar la comparación estadística de modo que tenga validez. Una forma de proceder en estos casos es hacer los análisis estadísticos conforme se van completando los bioanálisis, lo cual de por sí es una práctica deseable para conocer mejor el material y poder determinar si hay problemas con los datos y deba repetirse algún experimento. De esta manera se obtienen los modelos de dosis-respuesta y sus parámetros con sus respectivos errores estándar e intervalos de confianza. Acumular datos y tratar de correr todos los análisis de regresión de una sola vez es contraproducente. Un número elevado de curvas para ajustarse de una sola vez no permite aplicar un modelo no-lineal mixto pues el número de parámetros sería tan grande que limitaría la convergencia del proceso. Si algunos los bioanálisis no aportan respuestas adecuadas, la comparación puede arrojar resultados incongruentes. Una vez obtenidos los parámetros de las regresiones dentro de cada grupo, se puede realizar una comparación de las ED50s utilizando un modelo lineal mixto balanceado en el cual la variación entre las corridas de bioanálisis (grupos) corresponde con un efecto aleatorio. Las desviaciones estándar de los distintos parámetros de regresión analizados se emplearan como balance del análisis de varianza (J.C. Streibig, 2009.

Universidad de Copenhague, comunicación personal).

Procedimientos estadísticos en mayor detalle. El fundamento teórico y los procedimientos específicos para realizar los análisis estadísticos de los datos obtenidos en los bioanálisis rebasan el objetivo de este trabajo. Quienes tengan interés en ahondar más en este tema pueden referirse diversas publicaciones especializadas (Brain & Cousens 1989; Cedergreen et al. 2005; Knezevic et al. 2007; Nielsen et al. 2004; Ritz et al. 2006; Ritz & Streibig 2005; Seefeldt et al. 1995; Streibig 1988; Streibig & Kudsk 1993).

Presentación de resultados. La forma más ilustrativa de presentar los datos es mediante gráficos que reflejen la respuesta del material evaluado. En el gráfico debe de incluirse los datos originales y la curva ajustada. De esta manera, el lector puede valorar la calidad de nuestro experimento. En un cuadro por separado, debe de proporcionarse los parámetros del modelo con sus respectivos intervalos de confianza. Si hay diferencias en el crecimiento de los biotipos o poblaciones (límite superior e inferior) los gráficos pueden resultar poco atractivos a la vista. En lugar de hacer una transformación a porcentaje del testigo, la cual es inadecuada (ver (Ritz et al. 2006) para detalles específicos), es preferible ajustar el gráfico de modo que el peso de los testigos sin tratar (límite superior) corresponda visualmente. La información relevante estará de todos modos en el cuadro que acompaña al gráfico.

Proporcionar la información completa sobre la ecuación de regresión también permite al lector calcular otros valores de inhibición que pueden ser de su interés (Ej. ED10).

La presentación de los datos provenientes de una curva-respuesta basada en una progresión geométrica usando una escala lineal provoca que los datos se agrupen hacia el extremo inferior del gráfico lo que dificulta visualizar el valor de la ED50 y tener una idea clara de la forma en que la planta responde al herbicida (Figura 9).

Pruebas rápidas La conducción de bioanálisis con plantas enteras requiere de mucho tiempo, sobre todo si se toma en cuenta la recolección y preparación de la semilla y crecer las plantas hasta el estado

adecuado para someterlas a los tratamientos. Cuando es necesario tener información en poco tiempo, puede recurrirse a pruebas rápidas diseñadas según el objetivo perseguido.

En la determinación de residuos de un herbicida en el agua, puede hacerse una prueba con Lemna spp. que permite obtener resultados en cinco o siete días. Si se desea corroborar la resistencia de una maleza a un herbicida, puede recolectarse plántulas en el campo y tratarlas en medio adecuado para caracterizarlas en un período de horas o unos pocos días, como en el caso de la respuesta de E. colona a propanil y otros herbicidas (Kim et al. 2000). De manera similar, se ha desarrollado pruebas con plántulas para diagnosticar resistencia a herbicidas inhibidores de ACCasa mediante la medición de la longitud del coleoptilo de Sorghum halepense (Burke et al. 2006).

A

Peso fresco en gramos

50 40 30 20 10 0

0

50

100

150

200

250

Fluazifop-p-butilo (g e.a. ha-1)

B

50

Peso fresco en gramos

300

40 30 20 10 0 Testigo 0.1

1

10

Fluazifop-p-butilo (g e.a.

100

ha-1)

1000

Figura 9. Respuesta de un biotipo de Eleusine indica proveniente de Malasia (MY21A) al herbicida fluazifop-p-butilo. Se compara la presentación de los datos utilizando una escala lineal (A) y logarítmica (B) para las dosis del herbicida.

Parámetros (valor [intervalo de confianza]) de la ecuación (según modelo logístico): D = 30.27 [23.93 - 36.62], C = 1.75 [1.37 - 2.13], b = 1.56 [1.12 - 2.01], ED50 = 5,05 [2,96 - 7,14]. Bioanálisis realizado por IDEA Tropical, S. A. en Costa Rica. Datos no publicados previamente.

También es posible realizar bioanálisis no destructivos empleando partes de órganos o tejidos. Koger et al. (2005) desarrollaron métodos simples para diferenciar biotipos de C. canadensis resistentes y susceptibles a glifosato. Uno de los métodos consiste en sumergir hojas en diluciones del herbicida por tres días y evaluar el daño visualmente. El otro, en incubar discos de hojas en diluciones del herbicida por 16 horas y medir los niveles de shikimato en un espectrofotómetro. La acumulación de shikimato dependiente de la dosis de glifosato en plantas susceptibles al herbicida es un método estándar para diferenciarlas de las resistentes (por sitio de acción) en las cuales no se acumula el shikimato.

Determinación de la presencia y comportamiento de herbicidas en el suelo Los bioanálisis pueden ser muy útiles para estudiar el comportamiento de los herbicidas en el suelo o sustratos de siembra. La presencia de residuos de triasulfurón y sulfosulfurón en el suelo fue determinada experimentalmente midiendo la longitud de la raíz de plantas de girasol con precisión de partes por millardo (Hernandez-Sevillano et al. 2001). El movimiento del herbicida pendimetalina a través de una capa de corteza de pino utilizada como medio de cultivo en viveros se cuantificó utilizando Digitaria sanguinalis como planta indicadora (Simmons & Derr 2007). La presencia de residuos de un herbicida auxínico (clopiralid) en composta fue analizada empleando arvejas y trébol como plantas indicadoras.

El nivel de salinidad del medio afectó los resultados impidiendo la detección del herbicida a niveles bajos cuando la salinidad fue muy elevada (Brinton et al. 2006).

Los bioanálisis pueden ayudar a identificar una sustancia que causa un daño fitotóxico a una planta de importancia comercial. Por ejemplo, es posible que se atienda un caso en el que se supone que se aplicó un herbicida no selectivo por error, que el agua empleada en el riego venía contaminada con un herbicida, o que productos persistentes empleados en el pasado tengan actividad biológica y afecten negativamente al cultivo sembrado. En estos casos, el bioanálisis pretende reproducir los síntomas de toxicidad. Para ello, pueden tratarse plantas con los herbicidas sospechosos de causar el daño en dosis que asemejen las que pudieron emplearse por error o presentes en el agua de riego para reproducir los síntomas y determinar cuál herbicida produjo el daño. También puede hacerse crecer plantas sensibles en suelo contaminado y comparar sus respuestas con las de plantas sembradas en suelo sin residuos o con contenidos conocidos del contaminante de interés. En este tipo de estudios hay dos premisas claves: la especie indicadora mostrará una respuesta que es proporcional a la concentración del herbicida y que las respuestas obtenidas sean reproducibles (Santelmann 1977).

Mediante el empleo de plantas indicadoras se puede determinar la movilidad de los herbicidas en asocio con experimentos en los que columnas de suelo se tratan con cantidades conocidas de un herbicida en forma superficial y se agrega cantidades conocidas de agua para propiciar su lixiviación. El movimiento del herbicida se determina sembrando plantas muy sensibles (indicadoras) y comparando el daño contra una curva estándar preparada con base en dosis conocidas del producto (Van Wyk & Reinhardt 2001).

Aislamiento de componentes activos dirigido por bioanálisis

Los bioanálisis sirven como un complemento indispensable para el descubrimiento de sustancias activas, principalmente de origen natural, bajo un esquema de aislamiento dirigido por bioanálisis. Este es un proceso iterativo en el que los compuestos de un organismo se separan en distintas fracciones, las cuales se someten a un bioanálisis para determinar la actividad biológica de interés. Las fracciones que muestran actividad se fraccionan aun más y se prueban nuevamente en los bioanálisis hasta que se encuentra y purifica el compuesto biológicamente activo. Este esquema de determinación de las sustancias activas se facilita mucho cuando se puede emplear bioanálisis rápidos en miniatura (Dayan & Duke 2006).

Interacción de herbicidas entre sí y con otras sustancias Las aplicaciones de herbicidas en el campo muy frecuentemente incluyen dos o más ingredientes activos en mezcla. En la mayoría de los casos el objetivo de realizar estas mezclas es el de ampliar el espectro de acción sobre las malezas, aunque también puede procurarse aprovechar posibles sinergismos (o antagonismos) entre los componentes de la mezcla. Los bioanálisis ayudan a determinar los tipos de interacciones que pueden presentarse y a identificar los posibles mecanismos de tales interacciones.

Aunque el tema excede los objetivos de este trabajo, es importante indicar muy brevemente algunos aspectos que deben considerarse en el diseño y ejecución de pruebas de interacciones de herbicidas entre sí o con otros compuestos. Estos temas son tratados en amplio detalle en publicaciones especializadas (Streibig et al. 1998; Streibig & Kudsk 1993).

Existen dos modelos de referencia principales para estudiar la acción conjunta de herbicidas (u otras sustancias químicas con acción biocida). El modelo de dosis aditivas (MDA) supone que los dos compuestos en interacción tienen modos de acción similares en la planta tratada y que pueden sustituirse el uno por el otro sobre la base de su potencia relativa (término que se definió en la sección sobre comparación de respuestas). Las desviaciones que se presentan de este modelo se caracterizan como sinergismo o antagonismo, cuando el efecto de la mezcla es superior o inferior al del herbicida individual, respectivamente (Streibig et al.

1998). Si determinamos experimentalmente que el herbicida A en una dosis de 600 g ha-1 proporciona un control del 50% y que del herbicida B se requiere 10 g ha -1 para lograr el mismo efecto; entonces la potencia relativa es de (600/10) = 60. Si quisiéramos por alguna razón agronómica o económica usar solo 400 g ha-1 del herbicida A, entonces requeriríamos adicionar 3,33 g ha-1 del herbicida B para alcanzar el 50% de control. Es decir, aplicando un total de 403,33 g de la mezcla según el modelo, permitiría lograr un control del 50%.

El modelo de supervivencia multiplicativa (MSM) que supone que las dos sustancias ejercen su efecto independientemente en la planta. Este modelo es el que sirve de base a las comparaciones según el criterio de Colby (Colby 1967) que son muy populares en la ciencia de las malezas por su simpleza, facilidad de cálculo e interpretación. Para una prueba de Colby basta con aplicar cada uno de los herbicidas por separado y luego en mezcla a las mismas dosis que los tratamientos individuales para determinar el tipo de interacción. El siguiente ejemplo ilustrativo puede aclarar conceptos. Para determinar la interacción entre los herbicidas glifosato o glufosinato con MSMA se realizó un experimento de campo en el que se aplicaron los herbicidas solos y en mezcla sobre varias malezas, entre ellas Sesbania exaltata (hoja ancha) y Sorghum halepense (gramínea) proveniente de semilla (Koger et al.

2007). Las dosis a que se aplicaron los herbicidas y los resultados de la evaluación visual de daño se presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Control visual (observado y esperado) de Sesbania exaltata (SEBEX) y Sorghum halepense (SORHA) dos semanas después del tratamiento con glifosato, glufosinato, y MSMA en mezcla de tanque (Adaptado de (Koger et al. 2007)).

Herbicida

Dosis

Glifosato

0,84 kg e.a. ha-1

Glufosinato

0,5 kg i.a. ha

Glifosato + MSMA

0,84 + 2,2

MSMA

Glufosinato + MSMA DMS (0,05) 1 2

2

2,2 kg i.a. ha 0,5 + 2,2

-1 -1

SEBEX

SORHA

Observado (Esperado)

Observado (Esperado)

41

99

95

92

47 (56)1

95 (99)

6

5

21

92 (99)

68

91 (97)

Valores esperados calculados por autores originales de acuerdo con Colby (1967).

Diferencia mínima significativa.

El glifosato solo a la dosis empleada controló al S. halepense en un 99% y a S. exaltata en un 41%. Estos valores provienen de evaluaciones visuales realizadas en cuatro repeticiones dos semanas después de la aplicación en una de las dos localidades (Louisiana, EE.UU.) donde se realizaron los experimentos. La valoración visual se basó en una escala de 0% (ausencia de control) a 100% (muerte de la planta) considerando, de acuerdo con los autores, clorosis, necrosis y reducción del crecimiento. El MSMA también fue más eficaz para controlar S. halepense que S. exaltata. Cuando se aplicaron en mezcla de tanque, se consideró que el MSMA actuó como un antagonista del glifosato (comparar los valores de control esperados y observados). El valor esperado para la mezcla de glifosato más MSMA en S. exaltata corresponde a E = 41 + [(100 - 41)*0,21)] = 53,4% y en S. halepense a E = 99 + [(10099)*0,68] = 99.7%(autores indican 56% y 99%, respectivamente, posiblemente por efecto de redondeo). Una situación similar se presentó con el glufosinato, aunque este herbicida aplicado solo igualmente controló ambas especies. Si los valores esperados se calculan de la misma manera se obtiene 96.1% y 97.4%, respectivamente (no es posible saber si las diferencias se pueden atribuir a errores de cálculo o redondeo). En este caso, se está comparando herbicidas en mezcla que tienen modos de acción diferentes. En el caso del glifosato, la dosis es lo suficientemente elevada como para llevar la respuesta de la planta a su límite inferior en la curva dosis-respuesta dejando “poco margen” para que el herbicida complementario ejerza su efecto. En la publicación no se da intervalos de confianza para los valores observados y el lector puede preguntarse cuál es la diferencia en una evaluación visual entre 100% y 99% como promedios de daño.

De acuerdo con lo que se ha discutido, sin embargo, es más adecuado planificar y evaluar el experimento haciendo las mezclas con base en la potencia de cada herbicida aplicado individualmente y decidiendo cuál modelo usar con base en nuestro conocimiento sobre el modo de acción de los herbicidas. Inderjit et al. (2002) presentan un ejemplo de cómo se

calcularon las dosis para probar mezclas en un experimento de isobolas con compuestos fenólicos de naturaleza alelopática.

Los resultados de los experimentos de mezclas por lo general se presentan gráficamente de forma de isobolas (líneas de igual efecto) con base en un nivel de efecto preseleccionado (casi siempre la ED50). En este gráfico las desviaciones que muestren los valores experimentales obtenidos con las muestras que indiquen un efecto superior al de la isobola de referencia designan como sinérgicos; en el caso opuesto, representan una mezcla antagónica.

En la Figura 10 se ilustran las posibles isobolas.

Figura 10. Ilustración del modelo de isobolas. La línea recta corresponde al modelo de dosis aditivas y las líneas punteadas al antagonismo y sinergismo.

Existen procedimientos estadísticos para determinar si la isobola correspondiente a las mezclas se ajusta a los datos experimentales así como para determinar la significancia de la desviación, es decir, para respaldar estadísticamente si en efecto existe el sinergismo o antagonismo (Kudsk & Streibig 1993).

El mismo concepto de isobolas se puede emplear para estudiar el efecto de sustancias biológicamente inactivas sobre la acción del un herbicida. Tal es el caso del efecto de coadyuvantes o “surfactantes” que, en principio, en las dosis de uso normal no afectan el crecimiento de las plantas. Las isobolas de referencia para estos casos se ilustran en la Figura 11.

Figura 11. Ilustración esquemática de las tres posibles situaciones que pueden presentarse cuando se incrementa la dosis de un coadyuvante en interacción con un herbicida. I denota aditividad, II antagonismo, y III sinergismo. Adaptado de (Kudsk & Streibig 1993)

Si la curva de dosis-respuesta del herbicida no es alterada por la adición del coadyuvante, la isobola tendrá la forma lineal (I) de la Figura 11, es decir, la adición del coadyuvante no varia la dosis del herbicida necesaria para lograr producir un efecto determinado. Si el coadyuvante reduce la eficacia del herbicida, la isobola correspondiente se elevará como en II porque ocurre un antagonismo. La otra posibilidad (III) es que el adyuvante mejore la eficacia por lo que la dosis necesaria del herbicida para lograr el mismo efecto se reduce, es decir, se presenta sinergismo.

Comentarios finales Los bioanálisis constituyen una herramienta muy valiosa en el diagnóstico fitosanitario y en la investigación sobre la acción de los herbicidas. La gama de posibilidades de utilizar organismos vivos para detectar la presencia y concentración de herbicidas en el ambiente o para evaluar la respuesta biológica y fisiológica de las plantas a estos productos es muy amplia y permite adaptar métodos y técnicas según sean los objetivos perseguidos. En este trabajo se describe algunas de las oportunidades que ofrecen los bioanálisis así como los procedimientos fundamentales que deben de tomarse en cuenta en su planeamiento, ejecución e interpretación. Se ha puesto énfasis en los estudios que utilizan plantas enteras pero los fundamentos discutidos tienen aplicación independientemente del organismo indicador que se emplee. En la medida de lo posible, la información se ha presentado de la manera más sencilla y con el objetivo de ayudar a quienes requieren realizar bioanálisis en su práctica profesional, aportando experiencia propia y referencias selectas de la literatura científica. Por su naturaleza introductoria, se espera que este trabajo estimule al lector a ahondar más en el tema y le sirva como base para planear trabajos que requieran el empleo de bioanálisis.

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Capítulo 5 MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DEL BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS EN EL SUELO Aída Ortiz1, Alexis Abreu2 y Euval Solórzano3.

1 Universidad Central de Venezuela.

2 Instituto Nacional de Salud Agrícola Integral 3 Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas INTRODUCCIÓN Las malezas causan cuantiosas pérdidas a los cultivos en el mundo. Los agricultores gastan alrededor entre 15 a 30% de los costos de producción en el control de malezas. Las infestaciones de malezas están relacionadas con el cultivo y su manejo, principalmente con la preparación del suelo y los sistemas de siembras, ellos condicionan la emergencia de pocas especies del total que se encuentran en el banco de semilla del suelo, en una situación agrícola en particular.

Cuando se estima acertadamente el tamaño de los bancos de semillas viables de malezas del suelo, esto puede ser de mucha utilidad para planificar con antelación el manejo integrado de las mismas.

El propósito de este trabajo es proporcionar a técnicos, investigadores, estudiantes y productores agrícolas una metodología de evaluación del banco de semillas de malezas en el suelo.

BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS DEL SUELO El banco de malezas del suelo es una reserva viable de semillas no germinadas en un hábitat determinado (Basking y Basking, 2001). La mayoría de los bancos de semillas del suelo consisten en semillas enterradas (Grime, 1979). El banco de semilla de malezas del suelo está constituido por semillas vivas y muertas. Las semillas vivas del banco puedan estar en estado quiescente y latente (Bigwood e Inouye, 1988). Se considera que una semilla está quiescente cuando alguno de los factores que controlan la germinación, tales como: contenido de humedad, temperatura, oxígeno y luz, no están en el estado óptimo requerido por la especie en particular. Cuando se restituye el nivel de exigencia de estos factores ocurre la germinación. En contraste, la semilla latente es aquella que está viva pero no germina a pesar de tener óptimos los factores que afectan la germinación (Besnier, 1989).

El banco de semilla de malezas del suelo se enriquece periódicamente (Figura 1), según las circunstancias preexistente del sitio, con las nuevas producto de la lluvia de semillas desde las plantas madres o progenitoras que tras su dispersión llegan y se incorporan al suelo; también se empobrece gradualmente con las semillas que desaparecen, mueren o germinan (Besnier, 1989).

Haciendo una analogía con un banco comercial, las semillas latentes estarían en una cuenta de ahorro y las quiescentes en una cuenta corriente, tal manera que se establece un flujo bidireccional entre éstas y proveen la dinámica de emergencia en de malezas en los suelos agrícolas (Harper, 1977). Este flujo está controlado por interacciones de los factores abióticos del ambiente del suelo (Figura 1). Por ejemplo, los cambios de la temperatura del

suelo y la humedad, el fotoperíodo y los rayos rojos/infrarrojos han sido implicados en el control del flujo de la latencia (Karssen 1981; Baskin y Baskin 1989).

Figura 1. Modelo de un banco de semilla de malezas del suelo

El desgrane de las semillas a medida que maduran es un mecanismo importante para su dispersión y distribución en el campo, asegurando que buena parte de las semillas caídas se distribuyan sobre la superficie del suelo donde pueden ser esparcidas por el viento y el agua (Delouche et al., 2007).

La latencia de las semillas es un mecanismo efectivo de sobrevivencia para las especies silvestres, nativas y las malezas anuales/perennes propagadas por semillas, debido a que satisface varias condiciones críticas tales como: (a) bloquea la germinación de modo que la especie sobrevive bajo la forma de semilla hasta que las condiciones son nuevamente favorables para crecer y desarrollarse como plantas; (b) la intensidad o grados de latencia varía entre todas las semillas de una población de, modo de distribuir la germinación en el tiempo y aumentar la posibilidad de que algunas semillas germinen cuando las condiciones sean favorables; (c) La latencia inhibe los procesos fisiológicos de deterioro de modo que las semillas retienen su viabilidad; (d) la ruptura de latencia ocurre bajo determinadas condiciones, el más común es el tiempo pero también la luz, bajas o altas temperaturas, la acidez o los nitratos del suelo y otros elementos pueden liberarla (Delouche et al., 2007).

El modelo espacial de las semillas de malezas en el banco del suelo en campos agrícolas, por lo general siguen un patrón de dispersión agregada y pueden ser descrito matemáticamente por una distribución binomial negativa (Chauvel et al., 1989; Wiles y Schweizer, 1999; Navarro y Pérez, 2002; Forcella et al., 2003). Desde un punto de vista práctico esto significa que muchas muestras representativas de suelo de un banco de semillas para una especie

particular pudieran no contener semillas, mientras que unas pocas muestras podrían contener un alto número de semillas. Quizás la forma de distribución agregada podría ser el resultado de una dispersión limitada desde las plantas madres o también cuando el hombre ayuda a su diseminación con las prácticas culturales aplicadas durante el proceso de producción de los cultivos, por ejemplo, utilización de semilla, uso de la cosechadora, preparación del suelo, entre otras (Forcella et al., 2003).

La composición y densidad de las semillas de malezas en el suelo varían grandemente y están muy relacionadas con la historia de los cultivos y la preparación del suelo. La composición está influenciada por las prácticas agronómicas y varía de campo en campo, incluso entre áreas de un mismo campo. Reportes del tamaño del banco de semilla del suelo van desde cero a más de 1 millón semillas.m-2 (Buhler et al., 1997).

Generalmente el banco de semillas está compuesto por muchas especies, con pocas que comprenden el 70 a 90 % del total de malezas. Estas especies son las primeras plagas en el sistema agronómico porque resisten las medidas de control y están adaptadas al sistema de cultivo. Un segundo grupo comprende un 10 a 20% del banco de semilla, son generalmente adaptadas a estas áreas geográficas pero no a las prácticas de producción de cultivos.

También hay un pequeño grupo de semillas recalcitrantes de previos bancos de semillas; especies nuevas introducidas y semillas de anteriores cultivo. Estos grupos cambian constantemente debido a la dispersión por humanos, otros animales, maquinarias, viento y agua (Wilson et al., 1985).

En teoría eliminar un banco de semillas en el suelo es relativamente fácil si se para la producción de semilla de las malas hierbas y se dan las condiciones óptimas para la germinación y emergencia, sin embargo, en la práctica el manejo de los bancos de semilla es más complejo debido a que es difícil prevenir la producción e introducción de semillas, así como la persistencia de pequeños porcentajes de semillas en el banco y la alta producción potencial de algunas especies de malezas (Buhler et al., 1997).

La periodicidad de la emergencia de diferentes especies es también un aspecto importante del manejo de las malezas. Conociendo cuando las diferentes especies son la principales en emerger es importante para la planificación de un programa efectivo de control de malezas (Ogg y Dawson, 1984). El uso de la información sobre el banco de semilla de malezas del suelo sirve para usar modelos bioeconómicos y predecir la emergencia dentro del proceso de toma de decisiones (Swinton y King, 1994 citado por Buhler et al., 1997).

MÉTODOS DE ESTIMACIÓN DEL BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS DEL SUELO Muestreo del suelo No existe un protocolo universal para el muestreo de banco de semillas de malezas del suelo, cada investigador debe adecuarse a sus objetivos, tiempo, equipo disponible y limitaciones (Forcella et al., 2003). Por lo general se usan barrenos de muestrear suelo con fines edáficos, con orificio circulares siendo el más común el de 5 cm de diámetro y 10 cm de profundidad que se adapta muy bien a la detección de semillas pequeña, sin embargo para especies de

semillas más grandes como el arroz rojo no es muy eficiente. En el caso de los estudios de arroz rojo se ha diseñado un toma de muestras más grande haciéndolo como una caja de metal sin dos paredes, con dimensiones de 13 cm de ancho; 17 cm de largo y 10 cm de profundidad. Este toma de muestra se introduce en una de las paredes de una trinchera excavada previamente y cuidadosamente se sacan las muestras de suelo usando un machete, ver Figura 2 (Ortiz, 2005). El promedio de peso de cada muestra estuvo en el orden de 1,8 a 2 kg (Abreu y Solórzano, 2006).

Figura 2. Modelo del toma muestra de suelo y cómo muestrear el suelo para la determinación del banco de malezas haciendo énfasis en el arroz rojo.

Número de muestras En la determinación del número de muestras a tomar para estimar el banco de semilla de malezas del suelo en un campo, Forcella et al, 2003, recomienda utilizar la ecuación diseñada por Dessaint et al. (1996):

N  10 0.45 (m / 509) 0.59 D 2

donde, N es el número estimado de muestras necesarias para representar adecuadamente un banco de semillas (muestras de suelo recogidas con un barreno de 5 cm de diámetro) y D representa el nivel deseado de precisión. D es definido como el error estándar de la media dividido entre la media (SEm.m-1). El valor de m es dividido entre 509 para convertir el área de una muestra de 5 cm de diámetro a 1 m2. Se indica que un valor de D = 0,3 tiene un nivel práctico de precisión para los estudios sobre bancos de semillas (Cuadro 1). Se deben hacer muestreos pilotos previos para conocer el tamaño del banco de semillas de malezas y luego ajustar esa densidad a la ecuación indicada.

Cuadro 1. Número de muestras de suelo tomadas con un barreno de diámetro 5 cm se necesitan para determinar las densidades de los bancos de semillas en cuatro niveles deseados de precisión suponiendo varias densidades de semillas.m-2 Banco de semillas semillas.m-2 0,2 716 10 277 50 184 100 71 500 47 1 000 18 5 000 12 10 000 Fuente: Forcella et al, 2003

Nivel de precisión (D) 0,3 0,4 318 179 123 69 82 46 32 18 21 12 8 5 5 3

0,5 115 44 29 11 8 3 2

Profundidad de muestreo La profundidad a que se deberían tomar las muestras depende completamente de los objetivos de la investigación. Tal como se ha dicho en la descripción del banco de malezas del suelo realizada arriba, la mayoría de las semillas se encuentran en los primeros 10 cm de profundidad (Forcella et al., 2003; Venegas, 1994; Ferrero et al., 1996; Abreu y Solórzano, 2006). En el caso de la estimación del banco de semilla de arroz rojo del suelo la profundidad de 0-10 cm es suficiente para estimar su tamaño (Figura 3).

Tipo de muestreo en campo Existen varios modelos de muestreo horizontal en campo para estimar el banco de semilla de malezas del suelo que proporcionaban resultados equivalentes, siendo el de diagonal doble el de uso más simple y fácil de ejecutar, ver Figura 4 (Ortiz, 2005). Cualquier diseño de muestreo es aceptable siempre que abarque el largo y el ancho del campo (Colbach et al., 2000).

Figura 4. Metodología de muestreo en diagonal doble usado para detectar arroz rojo Si el objetivo de la investigación es relacionar los bancos de semillas con la vegetación que emerge sobre el suelo, los bancos de semillas deberían ser muestreados inmediatamente después de la dispersión de las semillas pero antes de su germinación. El muestreo de los bancos de semillas después de la emergencia de las plántulas tiene poco valor, tanto en la teoría como en la práctica (Forcella et al., 2003).

Si el objetivo de la investigación es usar la información del banco de semillas para contribuir a hacer recomendaciones para los tratamientos de manejo de malezas, entonces la información deberá estar disponible en el momento en que se deban realizar los tratamientos (Schweizer et al., 1997).

Una vez que se han extraído las muestras del suelo hay dos técnicas básicas para enumerar el número de semillas en las mismas; estos son (1) Extracción de semilla directa (Malone, 1967) y (2) método de la emergencia (germinación). Los dos métodos han dado resultados diferentes pero ellos están generalmente correlacionados entre sí (Ball y Miller, 1989; Bàrberi et al., 1998; Forcella, 1992).

MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE SEMILLA Las muestras de suelo son colocadas en una solución con sustancias dispersantes como el hexametafosfato de sodio que ayudará a separar la arcilla y el limo de las semillas (Malone, 1967), se ha usado cloruro de sodio (sal común) con el mismo fin (Ortiz y González; Abreu y Solórzano, 2006). Posteriormente la solución, las partículas disgregadas y las semillas se pasan por tamices con diferentes diámetros de los orificios (Figura 5) El tamaño de los tamices es un factor fundamental para determinar la eficiencia de la separación de las semillas (Malone, 1967).

La etapa siguiente incluye la remoción de la arcilla, el limo y las partículas pequeñas de arena de la muestra; esto se hace habitualmente sacudiendo la muestra colocada en un cedazo o pasando un chorro de agua sobre la misma. Los sopladores con aire a presión también pueden ser usados para separar los restos orgánicos de las semillas en las muestras secas (Forcella et al. 2003).

Figura 5. Extracción de semillas de malezas provenientes del banco de semilla del suelo.

Se pueden utilizar equipos para lavar las muestras tales como los levigadores que son unas máquinas que ejecutan los mismos procedimientos manuales para la separación de las semillas del suelo (Gross y Renner, 1989). Los levigadores tienen la ventaja de poder procesar varias muestras simultáneamente.

Todos los métodos de extracción directa de las semillas proporcionan estimaciones de la densidad total del banco de semillas, incluyendo las semillas muertas. Por ello, esta técnica es especialmente valiosa para los estudios que involucran la dinámica de la población de las malezas, sin embargo, a veces no siempre es la apropiada para la correlación de los bancos de semillas con las poblaciones de plántulas ya que se podría confundir semillas muertas, latentes y no latentes (Forcella et al, 2003), especialmente en semillas muy pequeñas, no es el caso del arroz rojo ya que en ella se pueden detectar estos estados de la semilla con facilidad (Abreu y Solórzano, 2006).

Una vez que las semillas han sido aisladas por el método de extracción directa, deben ser identificadas (Figura 6). La parte que requiere más tiempo en este método es la identificación de las semillas bajo una lupa estereoscópica. El evaluador debe tener experiencia en la identificación morfológica de las semillas, cuando no tiene la experticia necesaria, entonces puede hacer uso de catálogos con imágenes de las semillas de las malezas

comunes en su región (Forcella et al., 2003). También puede acudir a expertos para que los ayuden a clasificar las semillas de las malezas.

Otros investigadores identifican las semillas aisladas a través de programas computarizados (Benoit et al., 1992; Buhler y Maxwell, 1993). Cuando no es posible identificar la especie se puede recurrir al uso de marcadores moleculares de ADN (Fennimore et al., 1999; Joel et al., 1998; Mucher 2000). También se pueden hacer germinar las semillas y verificar la especie cuando exprese los rasgos que la identifican.

Las semillas que se separan por medio del método de extracción directa pueden ser viables o estar muertas. Estas semillas deben ser sometidas a la prueba de la viabilidad. En primer lugar se separan las semillas llenas de las vana simplemente apretándolas con una pinza fina.

Se eliminan las semillas vanas (muertas) y se ponen a germinar las llenas. El número de semillas que germina proporciona una estimación de la densidad de las semillas quiescentes, sin embargo, no estima la cantidad de semillas latentes.

La determinación de las semillas latente en el banco de malezas se realiza usando la prueba de tetrazolio, la cual se basa en el cloruro de tetrazolio. Las semillas grandes o medianas se cortan longitudinalmente o se puyan a la altura del embrión las pequeñas, las mitades se colocan en unos recipientes donde se ha colocado previamente una solución de tetrazolio al 0,1-0,2 %, el tiempo de incubación y temperatura depende de la especie, la cual varía desde unas pocas horas hasta una semana, a 10-30°C. El hidrógeno liberado por la reacción de la dehidrogenasa en los tejidos vivos se combina con el TZ para formar un pigmento rojo. Por lo tanto, si las semillas expuestas al TZ se vuelven rojas o rosadas, contienen tejidos vivos mientras que aquellas que no se tiñen se consideran muertas (ISTA, 1993). En la Figura 6 se muestra como se realiza la prueba de tetrazolio en el caso del arroz rojo.

Figura 6. Etapas de la prueba de viabilidad de las semillas de arroz rojo y arroz voluntario

El método de extracción directa de semillas del banco de malezas del suelo es laborioso y poco práctico para caracterizar la composición de las especies en el banco de semillas (Forcella et al., 2003).

MÉTODO DE EMERGENCIA El método de la emergencia (germinación) es usado normalmente para determinar el tamaño del banco de semillas quiescentes. En este caso cada muestra de suelo se coloca en bandejas plásticas bajo condiciones de invernadero o umbráculos, cercano a fuente de agua para el riego (Figura 7).

Figura 7. Técnicas consideradas para la estimación del banco quiescente o activo de arroz rojo del suelo La profundidad del suelo en las bandejas no debería ser mayor de la profundidad en que se espera normalmente que germinen las especies, por lo general menor o igual a 10 cm.

Cuando no se observa más emergencia de malezas, el suelo se mezcla y se hace un nuevo ciclo de conteo. El número de ciclos varía según los objetivos de la investigación.

Muchos investigadores prefieren los métodos de emergencia en comparación con el método de la extracción directa de semillas, porque el último presenta varias limitaciones. Los

métodos de emergencia son relativamente menos laboriosos pero requieren de varios meses antes de obtener datos, lo que hace que este método no sea práctico para predecir el potencial de las poblaciones de malezas que crecen en un determinado ciclo y el evaluador necesita tener conocimiento en la identificación de plántulas. Adicionalmente, el método de emergencia no estima el tamaño del banco de semilla latente (pasivo) importante para las implementar programas de manejos al largo plazo (Forcella et al., 2003) ESTUDIO DE CASO: Estimación del banco de semillas de malezas en el suelo en un lote de una finca de arroz en el Estado Portuguesa con énfasis en el arroz maleza/rojo.

Los resultados revelaron que a través del método de extracción de semillas se detectaron 15 malezas en un lote de la Finca Soledad de Armo en Portuguesa, de ellas tan solo cinco (Cyperus iria; arroz rojo; Cyperus sp; Ammania latifolia y arroz voluntario) tuvieron el 95% del total de semillas.m-2, mientras que las otras 10 especies representan el 5 %, a ambas profundidades de muestreo. No obstante, por el método de emergencia 10 malezas representaron el 95% del banco de semilla del suelo y seis el 5 %. Las malezas con mayor densidad de semillas en el banco activo de malezas del suelo fueron Sphenoclea zeylanica; Ammania latifolia y Cyperus iria (Cuadro 1,2, 3 y 4).

Estos resultados arrojaron diferencias entre el banco pasivo y activo de malezas en el orden de importancia de las malezas detectadas, pero se pudo corroborar que ambos métodos fueron efectivos para detectar arroz rojo. Por ejemplo Sphenoclea zeylanica que tuvo menor importancia en el método de semilla (70,14 semillas.m-2) fue la que tuvo mayor relevancia por la técnica de la emergencia (786,10 plántulas.m-2); también se observó que las malezas acuáticas no fueron detectadas por el método de semillas pero si con el de emergencia. Estos casos, quizás signifiquen que las semillas de las especies en cuestión fueron difíciles de extraer de las muestras, a lo mejor los tamices tenían los orificios muy grandes y ellas fueron descardas al momento de la separación. De cualquier manera estos estudios podrían ayudar al evaluador a tomar decisiones acertadas sobre el manejo de las malezas que aparecerán en el campo en el ciclo siguiente a la evaluación, principalmente a programar el control de arroz rojo (203,62 plántulas.m-2) el cual podría requerir hasta tres prácticas de falsa siembra con glifosato y/o batido antes de sembrar el arroz cultivado.

Cuadro 1. NĂşmero de semillas de malezas por m-2 en el banco de semilla del suelo a la profundidad de 0 a 10 cm en la Finca Soledad de Armo. Potrero de Armo. Portuguesa.

Cuadro 2. NĂşmero de plĂĄntulas de malezas por m-2 en el banco del suelo a la profundidad de 0 a 10 cm en la Finca Soledad de Armo. Potrero de Armo. Portuguesa.

En general la proporción de malezas detectadas fue mayor a la profundidad 0-10 cm que a 10-20 cm con ambos métodos de conteo de semilla y plántulas. Algunas excepciones ocurrieron como el caso de Ipomoea grandifolia que solamente se encontró en el muestreo superficial y Cyperus odoratus en el profundo. Otros casos que ameritan su mención son los de Leptpchloa virgata; Ischaemum rugosum que se encontraron en mayor cantidad a los 10-20 cm de profundidad por el método de la emergencia (Figura 8).

Figura 8. Comparación de la detección de malezas por dos métodos, uno por la extracción directa de semillas (a) y otro por emergencia en bandejas (b) El método de extracción directa de semillas permitió conocer como estaba la estructura poblacional de semillas de arroz rojo en el suelo, mostrando que el 73 % de la semilla del banco de semillas del suelo estaba viva, con más de 80% de latencia (Figura 9).

En el cuadro 3 se observa que se encontró una gran cantidad de semillas de arroz rojo viable, con una media de 595,02 semillas.m-2, considerada como infestación intensa que amerita la implementación de un manejo integrado al largo plazo con énfasis en el uso de semilla

certificada libre de arroz rojo, falsa siembra, limpieza de maquinaria y equipos, control de agua de riego; entre otras.

Cuadro 3. Número de semillas totales, viables, latentes y germinadas de arroz rojo y porcentaje de latencia y germinación del arroz rojo del banco de semillas del suelo en ocho melgas de un lote de siembra de arroz en la Finca Soledad de Armo, estado Portuguesa.

Melgas

1 2 3 4 5 6 7 8 Media Desv Melgas

1 2 3 4 5 6 7 8 X Desv

Total s em illas Sem . Muertas

760,18 515,84 823,53 941,18 1113,12 696,83 742,08 895,93 811,09 178,52

190,05 108,60 262,44 361,99 497,74 117,65 153,85 36,20 216,06 151,62

Total s em illas Sem . Muertas

488,69 470,59 696,83 850,68 742,08 832,58 398,19 561,09 630,09 173,47

190,05 144,80 126,70 343,89 244,34 27,15 54,30 27,15 144,80 111,99

0-10 cm Sem. Vivas Sem. Latentes Sem Germinadas % Latencia %Germinación 570,14 515,84 54,30 90,48 9,52 407,24 334,84 72,40 82,22 17,78 561,09 488,69 72,40 87,10 12,90 579,19 452,49 126,70 78,13 21,88 615,38 542,99 72,40 88,24 11,76 579,19 506,79 72,40 87,50 12,50 588,24 524,89 63,35 89,23 10,77 859,73 533,94 325,79 62,11 37,89 16,88 595,02 487,56 107,47 83,12 124,25 67,97 90,81 9,41 9,41 10-20 cm Sem. Vivas Sem. Latentes Sem Germinadas % Latencia %Germinación 298,64 289,59 9,05 96,97 3,03 325,79 307,69 18,10 94,44 5,56 570,14 461,54 108,60 80,95 19,05 506,79 443,44 63,35 87,50 12,50 497,74 461,54 36,20 92,73 7,27 805,43 696,83 108,60 86,52 13,48 343,89 316,74 27,15 92,11 7,89 533,94 398,19 135,75 74,58 25,42 11,78 485,29 421,95 63,35 88,22 166,02 131,67 48,37 7,49 7,49

Figura 9. Número de semillas.m-2 de arroz rojo totales, vivas, muertas, latentes y germinadas.

Porcentaje de latencia y germinación de las semillas viables de arroz rojo.

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Capítulo 5 MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DEL BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS EN EL SUELO Aída Ortiz1, Alexis Abreu2 y Euval Solórzano3.

1 Universidad Central de Venezuela.

2 Instituto Nacional de Salud Agrícola Integral 3 Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas INTRODUCCIÓN Las malezas causan cuantiosas pérdidas a los cultivos en el mundo. Los agricultores gastan alrededor entre 15 a 30% de los costos de producción en el control de malezas. Las infestaciones de malezas están relacionadas con el cultivo y su manejo, principalmente con la preparación del suelo y los sistemas de siembras, ellos condicionan la emergencia de pocas especies del total que se encuentran en el banco de semilla del suelo, en una situación agrícola en particular.

Cuando se estima acertadamente el tamaño de los bancos de semillas viables de malezas del suelo, esto puede ser de mucha utilidad para planificar con antelación el manejo integrado de las mismas.

El propósito de este trabajo es proporcionar a técnicos, investigadores, estudiantes y productores agrícolas una metodología de evaluación del banco de semillas de malezas en el suelo.

BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS DEL SUELO El banco de malezas del suelo es una reserva viable de semillas no germinadas en un hábitat determinado (Basking y Basking, 2001). La mayoría de los bancos de semillas del suelo consisten en semillas enterradas (Grime, 1979). El banco de semilla de malezas del suelo está constituido por semillas vivas y muertas. Las semillas vivas del banco puedan estar en estado quiescente y latente (Bigwood e Inouye, 1988). Se considera que una semilla está quiescente cuando alguno de los factores que controlan la germinación, tales como: contenido de humedad, temperatura, oxígeno y luz, no están en el estado óptimo requerido por la especie en particular. Cuando se restituye el nivel de exigencia de estos factores ocurre la germinación. En contraste, la semilla latente es aquella que está viva pero no germina a pesar de tener óptimos los factores que afectan la germinación (Besnier, 1989).

El banco de semilla de malezas del suelo se enriquece periódicamente (Figura 1), según las circunstancias preexistente del sitio, con las nuevas producto de la lluvia de semillas desde las plantas madres o progenitoras que tras su dispersión llegan y se incorporan al suelo; también se empobrece gradualmente con las semillas que desaparecen, mueren o germinan (Besnier, 1989).

Haciendo una analogía con un banco comercial, las semillas latentes estarían en una cuenta de ahorro y las quiescentes en una cuenta corriente, tal manera que se establece un flujo bidireccional entre éstas y proveen la dinámica de emergencia en de malezas en los suelos agrícolas (Harper, 1977). Este flujo está controlado por interacciones de los factores abióticos del ambiente del suelo (Figura 1). Por ejemplo, los cambios de la temperatura del

suelo y la humedad, el fotoperíodo y los rayos rojos/infrarrojos han sido implicados en el control del flujo de la latencia (Karssen 1981; Baskin y Baskin 1989).

Figura 1. Modelo de un banco de semilla de malezas del suelo

El desgrane de las semillas a medida que maduran es un mecanismo importante para su dispersión y distribución en el campo, asegurando que buena parte de las semillas caídas se distribuyan sobre la superficie del suelo donde pueden ser esparcidas por el viento y el agua (Delouche et al., 2007).

La latencia de las semillas es un mecanismo efectivo de sobrevivencia para las especies silvestres, nativas y las malezas anuales/perennes propagadas por semillas, debido a que satisface varias condiciones críticas tales como: (a) bloquea la germinación de modo que la especie sobrevive bajo la forma de semilla hasta que las condiciones son nuevamente favorables para crecer y desarrollarse como plantas; (b) la intensidad o grados de latencia varía entre todas las semillas de una población de, modo de distribuir la germinación en el tiempo y aumentar la posibilidad de que algunas semillas germinen cuando las condiciones sean favorables; (c) La latencia inhibe los procesos fisiológicos de deterioro de modo que las semillas retienen su viabilidad; (d) la ruptura de latencia ocurre bajo determinadas condiciones, el más común es el tiempo pero también la luz, bajas o altas temperaturas, la acidez o los nitratos del suelo y otros elementos pueden liberarla (Delouche et al., 2007).

El modelo espacial de las semillas de malezas en el banco del suelo en campos agrícolas, por lo general siguen un patrón de dispersión agregada y pueden ser descrito matemáticamente por una distribución binomial negativa (Chauvel et al., 1989; Wiles y Schweizer, 1999; Navarro y Pérez, 2002; Forcella et al., 2003). Desde un punto de vista práctico esto significa que muchas muestras representativas de suelo de un banco de semillas para una especie

particular pudieran no contener semillas, mientras que unas pocas muestras podrían contener un alto número de semillas. Quizás la forma de distribución agregada podría ser el resultado de una dispersión limitada desde las plantas madres o también cuando el hombre ayuda a su diseminación con las prácticas culturales aplicadas durante el proceso de producción de los cultivos, por ejemplo, utilización de semilla, uso de la cosechadora, preparación del suelo, entre otras (Forcella et al., 2003).

La composición y densidad de las semillas de malezas en el suelo varían grandemente y están muy relacionadas con la historia de los cultivos y la preparación del suelo. La composición está influenciada por las prácticas agronómicas y varía de campo en campo, incluso entre áreas de un mismo campo. Reportes del tamaño del banco de semilla del suelo van desde cero a más de 1 millón semillas.m-2 (Buhler et al., 1997).

Generalmente el banco de semillas está compuesto por muchas especies, con pocas que comprenden el 70 a 90 % del total de malezas. Estas especies son las primeras plagas en el sistema agronómico porque resisten las medidas de control y están adaptadas al sistema de cultivo. Un segundo grupo comprende un 10 a 20% del banco de semilla, son generalmente adaptadas a estas áreas geográficas pero no a las prácticas de producción de cultivos.

También hay un pequeño grupo de semillas recalcitrantes de previos bancos de semillas; especies nuevas introducidas y semillas de anteriores cultivo. Estos grupos cambian constantemente debido a la dispersión por humanos, otros animales, maquinarias, viento y agua (Wilson et al., 1985).

En teoría eliminar un banco de semillas en el suelo es relativamente fácil si se para la producción de semilla de las malas hierbas y se dan las condiciones óptimas para la germinación y emergencia, sin embargo, en la práctica el manejo de los bancos de semilla es más complejo debido a que es difícil prevenir la producción e introducción de semillas, así como la persistencia de pequeños porcentajes de semillas en el banco y la alta producción potencial de algunas especies de malezas (Buhler et al., 1997).

La periodicidad de la emergencia de diferentes especies es también un aspecto importante del manejo de las malezas. Conociendo cuando las diferentes especies son la principales en emerger es importante para la planificación de un programa efectivo de control de malezas (Ogg y Dawson, 1984). El uso de la información sobre el banco de semilla de malezas del suelo sirve para usar modelos bioeconómicos y predecir la emergencia dentro del proceso de toma de decisiones (Swinton y King, 1994 citado por Buhler et al., 1997).

MÉTODOS DE ESTIMACIÓN DEL BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS DEL SUELO Muestreo del suelo No existe un protocolo universal para el muestreo de banco de semillas de malezas del suelo, cada investigador debe adecuarse a sus objetivos, tiempo, equipo disponible y limitaciones (Forcella et al., 2003). Por lo general se usan barrenos de muestrear suelo con fines edáficos, con orificio circulares siendo el más común el de 5 cm de diámetro y 10 cm de profundidad que se adapta muy bien a la detección de semillas pequeña, sin embargo para especies de

semillas más grandes como el arroz rojo no es muy eficiente. En el caso de los estudios de arroz rojo se ha diseñado un toma de muestras más grande haciéndolo como una caja de metal sin dos paredes, con dimensiones de 13 cm de ancho; 17 cm de largo y 10 cm de profundidad. Este toma de muestra se introduce en una de las paredes de una trinchera excavada previamente y cuidadosamente se sacan las muestras de suelo usando un machete, ver Figura 2 (Ortiz, 2005). El promedio de peso de cada muestra estuvo en el orden de 1,8 a 2 kg (Abreu y Solórzano, 2006).

Figura 2. Modelo del toma muestra de suelo y cómo muestrear el suelo para la determinación del banco de malezas haciendo énfasis en el arroz rojo.

Número de muestras En la determinación del número de muestras a tomar para estimar el banco de semilla de malezas del suelo en un campo, Forcella et al, 2003, recomienda utilizar la ecuación diseñada por Dessaint et al. (1996):

N  10 0.45 (m / 509) 0.59 D 2

donde, N es el número estimado de muestras necesarias para representar adecuadamente un banco de semillas (muestras de suelo recogidas con un barreno de 5 cm de diámetro) y D representa el nivel deseado de precisión. D es definido como el error estándar de la media dividido entre la media (SEm.m-1). El valor de m es dividido entre 509 para convertir el área de una muestra de 5 cm de diámetro a 1 m2. Se indica que un valor de D = 0,3 tiene un nivel práctico de precisión para los estudios sobre bancos de semillas (Cuadro 1). Se deben hacer muestreos pilotos previos para conocer el tamaño del banco de semillas de malezas y luego ajustar esa densidad a la ecuación indicada.

Cuadro 1. Número de muestras de suelo tomadas con un barreno de diámetro 5 cm se necesitan para determinar las densidades de los bancos de semillas en cuatro niveles deseados de precisión suponiendo varias densidades de semillas.m-2 Banco de semillas semillas.m-2 0,2 716 10 277 50 184 100 71 500 47 1 000 18 5 000 12 10 000 Fuente: Forcella et al, 2003

Nivel de precisión (D) 0,3 0,4 318 179 123 69 82 46 32 18 21 12 8 5 5 3

0,5 115 44 29 11 8 3 2

Profundidad de muestreo La profundidad a que se deberían tomar las muestras depende completamente de los objetivos de la investigación. Tal como se ha dicho en la descripción del banco de malezas del suelo realizada arriba, la mayoría de las semillas se encuentran en los primeros 10 cm de profundidad (Forcella et al., 2003; Venegas, 1994; Ferrero et al., 1996; Abreu y Solórzano, 2006). En el caso de la estimación del banco de semilla de arroz rojo del suelo la profundidad de 0-10 cm es suficiente para estimar su tamaño (Figura 3).

Tipo de muestreo en campo Existen varios modelos de muestreo horizontal en campo para estimar el banco de semilla de malezas del suelo que proporcionaban resultados equivalentes, siendo el de diagonal doble el de uso más simple y fácil de ejecutar, ver Figura 4 (Ortiz, 2005). Cualquier diseño de muestreo es aceptable siempre que abarque el largo y el ancho del campo (Colbach et al., 2000).

Figura 4. Metodología de muestreo en diagonal doble usado para detectar arroz rojo Si el objetivo de la investigación es relacionar los bancos de semillas con la vegetación que emerge sobre el suelo, los bancos de semillas deberían ser muestreados inmediatamente después de la dispersión de las semillas pero antes de su germinación. El muestreo de los bancos de semillas después de la emergencia de las plántulas tiene poco valor, tanto en la teoría como en la práctica (Forcella et al., 2003).

Si el objetivo de la investigación es usar la información del banco de semillas para contribuir a hacer recomendaciones para los tratamientos de manejo de malezas, entonces la información deberá estar disponible en el momento en que se deban realizar los tratamientos (Schweizer et al., 1997).

Una vez que se han extraído las muestras del suelo hay dos técnicas básicas para enumerar el número de semillas en las mismas; estos son (1) Extracción de semilla directa (Malone, 1967) y (2) método de la emergencia (germinación). Los dos métodos han dado resultados diferentes pero ellos están generalmente correlacionados entre sí (Ball y Miller, 1989; Bàrberi et al., 1998; Forcella, 1992).

MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE SEMILLA Las muestras de suelo son colocadas en una solución con sustancias dispersantes como el hexametafosfato de sodio que ayudará a separar la arcilla y el limo de las semillas (Malone, 1967), se ha usado cloruro de sodio (sal común) con el mismo fin (Ortiz y González; Abreu y Solórzano, 2006). Posteriormente la solución, las partículas disgregadas y las semillas se pasan por tamices con diferentes diámetros de los orificios (Figura 5) El tamaño de los tamices es un factor fundamental para determinar la eficiencia de la separación de las semillas (Malone, 1967).

La etapa siguiente incluye la remoción de la arcilla, el limo y las partículas pequeñas de arena de la muestra; esto se hace habitualmente sacudiendo la muestra colocada en un cedazo o pasando un chorro de agua sobre la misma. Los sopladores con aire a presión también pueden ser usados para separar los restos orgánicos de las semillas en las muestras secas (Forcella et al. 2003).

Figura 5. Extracción de semillas de malezas provenientes del banco de semilla del suelo.

Se pueden utilizar equipos para lavar las muestras tales como los levigadores que son unas máquinas que ejecutan los mismos procedimientos manuales para la separación de las semillas del suelo (Gross y Renner, 1989). Los levigadores tienen la ventaja de poder procesar varias muestras simultáneamente.

Todos los métodos de extracción directa de las semillas proporcionan estimaciones de la densidad total del banco de semillas, incluyendo las semillas muertas. Por ello, esta técnica es especialmente valiosa para los estudios que involucran la dinámica de la población de las malezas, sin embargo, a veces no siempre es la apropiada para la correlación de los bancos de semillas con las poblaciones de plántulas ya que se podría confundir semillas muertas, latentes y no latentes (Forcella et al, 2003), especialmente en semillas muy pequeñas, no es el caso del arroz rojo ya que en ella se pueden detectar estos estados de la semilla con facilidad (Abreu y Solórzano, 2006).

Una vez que las semillas han sido aisladas por el método de extracción directa, deben ser identificadas (Figura 6). La parte que requiere más tiempo en este método es la identificación de las semillas bajo una lupa estereoscópica. El evaluador debe tener experiencia en la identificación morfológica de las semillas, cuando no tiene la experticia necesaria, entonces puede hacer uso de catálogos con imágenes de las semillas de las malezas

comunes en su región (Forcella et al., 2003). También puede acudir a expertos para que los ayuden a clasificar las semillas de las malezas.

Otros investigadores identifican las semillas aisladas a través de programas computarizados (Benoit et al., 1992; Buhler y Maxwell, 1993). Cuando no es posible identificar la especie se puede recurrir al uso de marcadores moleculares de ADN (Fennimore et al., 1999; Joel et al., 1998; Mucher 2000). También se pueden hacer germinar las semillas y verificar la especie cuando exprese los rasgos que la identifican.

Las semillas que se separan por medio del método de extracción directa pueden ser viables o estar muertas. Estas semillas deben ser sometidas a la prueba de la viabilidad. En primer lugar se separan las semillas llenas de las vana simplemente apretándolas con una pinza fina.

Se eliminan las semillas vanas (muertas) y se ponen a germinar las llenas. El número de semillas que germina proporciona una estimación de la densidad de las semillas quiescentes, sin embargo, no estima la cantidad de semillas latentes.

La determinación de las semillas latente en el banco de malezas se realiza usando la prueba de tetrazolio, la cual se basa en el cloruro de tetrazolio. Las semillas grandes o medianas se cortan longitudinalmente o se puyan a la altura del embrión las pequeñas, las mitades se colocan en unos recipientes donde se ha colocado previamente una solución de tetrazolio al 0,1-0,2 %, el tiempo de incubación y temperatura depende de la especie, la cual varía desde unas pocas horas hasta una semana, a 10-30°C. El hidrógeno liberado por la reacción de la dehidrogenasa en los tejidos vivos se combina con el TZ para formar un pigmento rojo. Por lo tanto, si las semillas expuestas al TZ se vuelven rojas o rosadas, contienen tejidos vivos mientras que aquellas que no se tiñen se consideran muertas (ISTA, 1993). En la Figura 6 se muestra como se realiza la prueba de tetrazolio en el caso del arroz rojo.

Figura 6. Etapas de la prueba de viabilidad de las semillas de arroz rojo y arroz voluntario

El método de extracción directa de semillas del banco de malezas del suelo es laborioso y poco práctico para caracterizar la composición de las especies en el banco de semillas (Forcella et al., 2003).

MÉTODO DE EMERGENCIA El método de la emergencia (germinación) es usado normalmente para determinar el tamaño del banco de semillas quiescentes. En este caso cada muestra de suelo se coloca en bandejas plásticas bajo condiciones de invernadero o umbráculos, cercano a fuente de agua para el riego (Figura 7).

Figura 7. Técnicas consideradas para la estimación del banco quiescente o activo de arroz rojo del suelo La profundidad del suelo en las bandejas no debería ser mayor de la profundidad en que se espera normalmente que germinen las especies, por lo general menor o igual a 10 cm.

Cuando no se observa más emergencia de malezas, el suelo se mezcla y se hace un nuevo ciclo de conteo. El número de ciclos varía según los objetivos de la investigación.

Muchos investigadores prefieren los métodos de emergencia en comparación con el método de la extracción directa de semillas, porque el último presenta varias limitaciones. Los

métodos de emergencia son relativamente menos laboriosos pero requieren de varios meses antes de obtener datos, lo que hace que este método no sea práctico para predecir el potencial de las poblaciones de malezas que crecen en un determinado ciclo y el evaluador necesita tener conocimiento en la identificación de plántulas. Adicionalmente, el método de emergencia no estima el tamaño del banco de semilla latente (pasivo) importante para las implementar programas de manejos al largo plazo (Forcella et al., 2003) ESTUDIO DE CASO: Estimación del banco de semillas de malezas en el suelo en un lote de una finca de arroz en el Estado Portuguesa con énfasis en el arroz maleza/rojo.

Los resultados revelaron que a través del método de extracción de semillas se detectaron 15 malezas en un lote de la Finca Soledad de Armo en Portuguesa, de ellas tan solo cinco (Cyperus iria; arroz rojo; Cyperus sp; Ammania latifolia y arroz voluntario) tuvieron el 95% del total de semillas.m-2, mientras que las otras 10 especies representan el 5 %, a ambas profundidades de muestreo. No obstante, por el método de emergencia 10 malezas representaron el 95% del banco de semilla del suelo y seis el 5 %. Las malezas con mayor densidad de semillas en el banco activo de malezas del suelo fueron Sphenoclea zeylanica; Ammania latifolia y Cyperus iria (Cuadro 1,2, 3 y 4).

Estos resultados arrojaron diferencias entre el banco pasivo y activo de malezas en el orden de importancia de las malezas detectadas, pero se pudo corroborar que ambos métodos fueron efectivos para detectar arroz rojo. Por ejemplo Sphenoclea zeylanica que tuvo menor importancia en el método de semilla (70,14 semillas.m-2) fue la que tuvo mayor relevancia por la técnica de la emergencia (786,10 plántulas.m-2); también se observó que las malezas acuáticas no fueron detectadas por el método de semillas pero si con el de emergencia. Estos casos, quizás signifiquen que las semillas de las especies en cuestión fueron difíciles de extraer de las muestras, a lo mejor los tamices tenían los orificios muy grandes y ellas fueron descardas al momento de la separación. De cualquier manera estos estudios podrían ayudar al evaluador a tomar decisiones acertadas sobre el manejo de las malezas que aparecerán en el campo en el ciclo siguiente a la evaluación, principalmente a programar el control de arroz rojo (203,62 plántulas.m-2) el cual podría requerir hasta tres prácticas de falsa siembra con glifosato y/o batido antes de sembrar el arroz cultivado.

Cuadro 1. NĂşmero de semillas de malezas por m-2 en el banco de semilla del suelo a la profundidad de 0 a 10 cm en la Finca Soledad de Armo. Potrero de Armo. Portuguesa.

Cuadro 2. NĂşmero de plĂĄntulas de malezas por m-2 en el banco del suelo a la profundidad de 0 a 10 cm en la Finca Soledad de Armo. Potrero de Armo. Portuguesa.

En general la proporción de malezas detectadas fue mayor a la profundidad 0-10 cm que a 10-20 cm con ambos métodos de conteo de semilla y plántulas. Algunas excepciones ocurrieron como el caso de Ipomoea grandifolia que solamente se encontró en el muestreo superficial y Cyperus odoratus en el profundo. Otros casos que ameritan su mención son los de Leptpchloa virgata; Ischaemum rugosum que se encontraron en mayor cantidad a los 10-20 cm de profundidad por el método de la emergencia (Figura 8).

Figura 8. Comparación de la detección de malezas por dos métodos, uno por la extracción directa de semillas (a) y otro por emergencia en bandejas (b) El método de extracción directa de semillas permitió conocer como estaba la estructura poblacional de semillas de arroz rojo en el suelo, mostrando que el 73 % de la semilla del banco de semillas del suelo estaba viva, con más de 80% de latencia (Figura 9).

En el cuadro 3 se observa que se encontró una gran cantidad de semillas de arroz rojo viable, con una media de 595,02 semillas.m-2, considerada como infestación intensa que amerita la implementación de un manejo integrado al largo plazo con énfasis en el uso de semilla

certificada libre de arroz rojo, falsa siembra, limpieza de maquinaria y equipos, control de agua de riego; entre otras.

Cuadro 3. Número de semillas totales, viables, latentes y germinadas de arroz rojo y porcentaje de latencia y germinación del arroz rojo del banco de semillas del suelo en ocho melgas de un lote de siembra de arroz en la Finca Soledad de Armo, estado Portuguesa.

Melgas

1 2 3 4 5 6 7 8 Media Desv Melgas

1 2 3 4 5 6 7 8 X Desv

Total s em illas Sem . Muertas

760,18 515,84 823,53 941,18 1113,12 696,83 742,08 895,93 811,09 178,52

190,05 108,60 262,44 361,99 497,74 117,65 153,85 36,20 216,06 151,62

Total s em illas Sem . Muertas

488,69 470,59 696,83 850,68 742,08 832,58 398,19 561,09 630,09 173,47

190,05 144,80 126,70 343,89 244,34 27,15 54,30 27,15 144,80 111,99

0-10 cm Sem. Vivas Sem. Latentes Sem Germinadas % Latencia %Germinación 570,14 515,84 54,30 90,48 9,52 407,24 334,84 72,40 82,22 17,78 561,09 488,69 72,40 87,10 12,90 579,19 452,49 126,70 78,13 21,88 615,38 542,99 72,40 88,24 11,76 579,19 506,79 72,40 87,50 12,50 588,24 524,89 63,35 89,23 10,77 859,73 533,94 325,79 62,11 37,89 16,88 595,02 487,56 107,47 83,12 124,25 67,97 90,81 9,41 9,41 10-20 cm Sem. Vivas Sem. Latentes Sem Germinadas % Latencia %Germinación 298,64 289,59 9,05 96,97 3,03 325,79 307,69 18,10 94,44 5,56 570,14 461,54 108,60 80,95 19,05 506,79 443,44 63,35 87,50 12,50 497,74 461,54 36,20 92,73 7,27 805,43 696,83 108,60 86,52 13,48 343,89 316,74 27,15 92,11 7,89 533,94 398,19 135,75 74,58 25,42 11,78 485,29 421,95 63,35 88,22 166,02 131,67 48,37 7,49 7,49

Figura 9. Número de semillas.m-2 de arroz rojo totales, vivas, muertas, latentes y germinadas.

Porcentaje de latencia y germinación de las semillas viables de arroz rojo.

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Capítulo 4 EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE HERBICIDAS Jesús Caripe Syngenta Crop Protection S.A. Problemas y objetivos: Las especies de malezas son plantas que crecen en lugares no deseados y por lo tanto causan más daños que beneficios, ellas juegan un rol dominante ya que muchas veces son más numerosas que los cultivos y afectan en gran medida a la producción agrícola del mundo. En muchas regiones las medidas para el control de malezas son imperativas y toman una alta prioridad; el principal propósito en el control de malezas es:  Liberar al cultivo de competencia por nutrientes, agua, luz y espacio para así poder tener oportunidad de obtener el mejor rendimiento posible.  Para liberar la interferencia al momento de la cosecha de los cultivos y poder así mejorar la calidad de la cosecha.  Minimizar por largo tiempo la proliferación de malezas en áreas cultivadas.

El principal objetivo de los ensayos de campo con herbicidas es poder determinar el efecto de los herbicidas sobre los diferentes tipos y especies de malezas, así como la tolerancia o fitotoxicidad que pueda estar generando sobre los cultivos. Para poder alcanzar estos objetivos el fin es definir:  La dosis requerida o necesaria para lograr el control eficaz de las malezas.  La tolerancia al cultivo, sin disminuir el potencial genético de los mismos.  Lograr un amplio espectro de control entre los diferentes tipos de malezas.  Regulación y flexibilidad en la forma de aplicación de los herbicidas.  La duración de la actividad del herbicida en el medio ambiente.  Comportamiento de los herbicidas en diferentes suelos.  Comportamiento en condiciones meteorológicas diversas.  Comportamiento de las diferentes formulaciones disponibles.  Comparación con los estándares comerciales presente en el mercado.  Detección del modo de acción de los herbicidas.  Adaptación al manejo agronómico de los cultivos.  Estudios de los efectos prorrogados de los herbicidas sobre los cultivos.

Diseño de experimentos con herbicidas: Selección del lugar:  Es un componente crítico para el caso de los ensayos de herbicidas, hay que darle un cuidado en particular al tipo de suelo, condiciones y la distribución de las especies de malezas en el campo. El suelo debe ser de naturaleza uniforme y tener características adecuadas para el tipo de ensayo planeado, esto se debe de confirmar antes de la ejecución del ensayo.  Una completa descripción de las características de los suelos, las cuales son relevantes para los ensayos de herbicidas.

 El sitio puede ser seleccionado en base a la uniformidad del cultivo, las malezas y las condiciones del campo para cumplir el objetivo del ensayo. Es responsabilidad del ensayista seleccionar el sitio para poder así maximizar los cambios o sucesos que ocurran en los ensayos para lograr los objetivos planteados. En necesario chequear varias veces el campo, con la finalidad de estar seguro que tenemos la uniformidad conforme con lo buscado en el ensayo.  El sitio debe ser lo suficientemente grande para garantizar que entre el número definido de repeticiones o réplicas de cada uno de los tratamientos, pero esto debe ser lo más justo posible para evitar aumentar la variabilidad del ensayo.  El sitio debe de ser identificado y ubicado en todos los sitios del ensayo con coordenadas de GPS, la latitud y longitud de la cuadrícula del ensayo junto con la orientación del norte, identificando cuidadosamente la ubicación del ensayo de una manera referencial.  La geo-referencia es una herramienta útil para el mapeo de malezas, especialmente para los ensayos de herbicidas pre-emergentes, pudiendo localizar las poblaciones de malezas en los cultivos.

Población de malezas y cultivos: En las pruebas de eficacia los bloques de los diseños estadísticos pueden representar poblaciones uniformes y típicas de malezas, las cuales podrían corresponder a las buscadas en el espectro de control de malezas de los productos que se están probando. Sin embargo, la presión excesiva de malezas podría evitarse si el ensayista lo decide así.

En las pruebas de tolerancia o fitotoxicidad, las parcelas deben estar libres de malezas para eliminar efecto de competencia de las malezas sobre el cultivo y no sean las malezas las que afecten al cultivo.

El ensayo debe tener condiciones uniforme en los siguientes puntos:  Se debe cultivar el mismo material vegetal, variedad o hibrido.  Los estados de desarrollo deben de ser lo más uniforme posible (plantas de la misma edad).  Deben tener la misma densidad de siembra y una buena uniformidad.  La infestación de las malezas en el ensayo debe ser uniforme.  La infestación de malezas debe sobrepasar el umbral económico.  Tipo de suelo, estructura, condiciones de humedad y topografía.  Manejo agronómico se debe hacer en su totalidad en el ensayo.  Se debe de llevar un historial del lote donde se realiza el ensayo.

Evaluaciones: Los ensayos debe de estar localizados en zonas de fácil acceso o razonables, que garantice la seguridad del o los ensayistas, lo cual nos permitirá la evaluación eficiente y la cosecha del ensayo. Además, deben estar localizados en áreas donde se minimice el riesgo de errores en las aplicaciones por deriva.

Los ensayos deben de estar etiquetados siguiendo la dirección de las hileras del cultivo, esto hace el acceso más fácil para las evaluaciones de malezas en las parcelas de cada uno de las repeticiones

Cuando los ensayos están ubicados en sitios aledaños a vías o carreteras, se debe de guardar una gran cantidad de hileras de borduras para tratar de aislar el ensayo. No se deben seleccionar sitios donde se encuentren árboles grandes, vías o carreteras, aeropuertos agrícolas, edificios etc. Los drenajes del terreno deben de evitarse dentro del ensayo, así como los gradientes excesivos.

Evitar usar poblaciones de malezas resistentes o que se sospeche de ello, a menos que se especifique en el protocolo. Las parcelas de los testigos absolutos deben ser seleccionadas para determinar poblaciones de malezas y distribución del cultivo.

La selección del tipo o diseño del ensayo, número de ensayo, número de repeticiones, tratamientos y tamaño de las parcelas: En general la selección del diseño estadístico esta definido por la etapa de desarrollo del producto, desde pequeñas parcelas hasta llegar a grandes parcelas de validación.

Los ensayos se pueden clasificar en las siguientes categorías:

Tipo de ensayo

Objetivo

Sin repeticiones

Eficacia/ Tolerancia

Con repeticiones

Eficacia/ Tolerancia/ Rendimiento Eficacia/ Tolerancia/ Rendimiento

Demostraciones

Estado de desarrollo del producto

Número de dosis

Número de tratamientos

Número de repeticiones

Tamaño de la parcela (m2)

Desarrollo

4-8

20 -50

1-2

4-10

Desarrollo Registro Antes del lanzamiento

2-5 2-3 1-2

10-20 6-12 2-6

3-4 4-5 1-2

7.5-30 10-30 >100

Ensayos de residuos: El objetivo de estos ensayos es proveer de información acerca de la cantidad de residuos de herbicidas que puedan estar presentes en los cultivos donde se han utilizado estos productos, así como también en suelos, agua y varias plantas no objetivo y animales.

Estas pruebas son diseñadas para casos hipotéticos o considerando el peor escenario y dependerán del riesgo del uso del producto en cuanto a:  Su máxima dosis de aplicación en función del ingrediente activo propuesto.  Por el máximo número de aplicaciones propuesta.  El mínimo intervalo entre las aplicaciones.

Ensayos de compatibilidad: El objetivo de estos ensayos es visualizar la compatibilidad entre las diferentes mezclas de herbicidas o solo. Estos ensayos son llevados a cabo para establecer los siguientes puntos:

 Evaluar los efectos fitotóxicos.  Evaluar la posibilidad de haber sinergismo o antagonismo.  Evaluar la posibilidad de haber potenciación y/o aditividad.

Cuando en el sitio se encuentren las especies de malezas objetivos para evaluar el efecto de fitotoxicidad, no es importante para el control de esta, sino lo que pueda estar causando dicha mezcla al cultivo. Para el resto de las evaluaciones si es importante tomar en cuenta el control de las especies de malezas y el efecto sobre el cultivo.

Ensayos de desecantes: Los herbicidas desecantes son utilizados para facilitar o mejorar las labores de cosecha de los cultivos; además, puede mejorar la calidad de la misma, principalmente a través de las promociones de pérdida de humedad del tejido de la planta.

Estas actividades pueden ayudar a mejora las cosechas, por ejemplo como la desecación de las partes vegetales de las plantas de papa, con el objetivo de limpiar mejor los tubérculos y mantener una uniformidad en el tamaño de los mismos Los ensayos de desecación se pueden enfocarse en síntomas de calidad de las cosechas tales como:  Aumento del rendimiento de la cosecha en tiempo.  Uniformidad de la cosecha.  Menor cantidad de materia inerte.  Menor pérdida de la cosecha en el campo.

Los desecantes también son usados para eliminar la variación en la maduración de algunos cereales o leguminosas y así poder reducir el costo de secado en la post cosecha en algodón y oleaginosas.

Ensayos de pérdidas por lluvias: La eficacia de un herbicida se puede ver severamente afectada o reducida si es sometida a una lluvia después de la aplicación; la determinación de este período es importante para poder publicarla en la etiqueta del herbicida.

Para determinar el período de riesgo de lavado del herbicida por la lluvia, los tratamientos químicos son aplicados bajo condiciones normales y la lluvia es aplicada artificialmente a través de equipos de irrigación agrícola a varios intervalos de tiempo; por ejemplo:  Inmediatamente después de los tratamientos con herbicidas.  Una hora después de los tratamientos con herbicidas.  Tres horas después de los tratamientos.  Veinticuatro horas después de los tratamientos.

La intensidad y duración de la lluvia artificial pueden variar para imitarla, en fuerte o suaves lluvias. Las evaluaciones se hacen para comparar el control de malezas entre los bloques, los cuales han recibido lluvia y en aquellos que permanecen secos.

Requerimiento general para los ensayos: El número de ensayos que serán necesarios por serie para cumplir un objetivo, depende de muchos diferentes factores; los más importantes son:  Objetivo de los ensayos seriados.  Estado del conocimiento.  Soporte del proyecto.  Extender hasta donde se pueda, para generalizar las conclusiones.  La variabilidad natural de los individuos en diferentes suelos y condiciones ambientales, ensayos, cultivos y factores limitantes  Extender hasta tanto los tratamientos pueden interactuar con los diferentes ambientes.  Poder de decisión para poder detectar cierto nivel de diferenciación entre los tratamientos.  El número de repeticiones en ensayos individuales.  Disponibilidad de recursos técnicos y financieros.  Los testigos o controles deben de ser incluidos en cada ensayo, debido a que las evaluaciones de la acción de los herbicidas está basado en la comparación entre los bloques tratados y no tratados; de hecho, de haber la posibilidad de tener dos testigos o controles se garantiza la mejor representación posible de las condiciones de suelo y ambientales, así como de las especies de malezas.  Los compuestos estándares deberían ser incluidos a las dosis recomendadas para la localidad o cultivo.  Para determinar el límite de tolerancia del cultivo o para chequear la tolerancia del cultivo, hay que incluir el doble de la dosis a probar.  Los ensayos planeados pueden que no se lleven todos a cabo satisfactoriamente para proveer información útil, por ejemplo debido a las condiciones climáticas desfavorables en los ensayos.

Aplicaciones de los herbicidas Tiempo de las aplicaciones: La definición del tiempo de aplicación se refiere al estado del cultivo y los momentos ideales de la aplicación Métodos de aplicación de los herbicidas: 1. Aplicaciones superficiales, es tratado todo el bloque con cada uno de los tratamientos.

2. Aplicaciones en bandas, el herbicida solo se aplica en bandas, cubriendo al cultivo para protegerlo de la aplicación.

3. Aplicaciones post-dirigida, el herbicida es aplicado entre las hileras del cultivo o entre el cultivo, sin tocar las hojas del mismo.

4. Aplicaciones en manchas, el herbicida es aplicado en algunas partes del campo solamente, para controlar zonas o especies especificas de malezas.

Parámetros importantes para la realizar de las aplicaciones:  Para la propia interpretación de los resultados de los ensayos de campo, la colección cuidadosa de los datos y el reporte de la información básica en el tiempo de la aplicación es muy importante.

Parámetros relacionados al cultivo y a las malezas:

 Se debe de llevar registro o estimación de la cobertura del suelo por el cultivo; además, se debe establecer rangos que puedan indicar dichas coberturas, también se debe reportar la fase de crecimiento, por ejemplo: número de hojas, longitud de las plantas y por último comentar el vigor y la sanidad del cultivo.  Las especies de malezas se deben levantar estimando su número por especies, haciendo así un registro por malezas objetivo. El registro detallado de las especies de malezas presentes en el momento de la aplicación, incluso aquellas que se encuentre en menor número es especialmente importante.  Cuando sea posible, evaluar las malezas en una fase de crecimiento muy temprano y estados posteriores, cuestión muy importante para poder así interpretar cualquier resultado  Estimar y establecer el registro de la cobertura de las malezas en el suelo, de manera individual, establecer un rango si es posible e indicar la fase de crecimiento.  Para la descripción de los estados de crecimientos puede ser utilizada la escala BBCH.  Si hay distintas poblaciones de malezas, estas deben separarse para poder realizar el reporte final.

Parámetros relacionados a las condiciones ambientales:  Temperatura del suelo y aire.  Humedad del suelo y del aire.  Condiciones del suelo.  Velocidad del viento y dirección.  Presencia de lluvias después de la aplicación.

Para ensayos relacionados con las características del suelo y la acción de los herbicidas residuales, los resultados pueden variar principalmente con la adsorción, contenido de M.O. y pH del suelo, por lo que una descripción precisa de las características del suelo es sumamente importante. El suelo es frecuentemente descrito como liviano, medio o pesado; sin embargo, esta señalamiento no es adecuado, ya que carece de precisión.

Evaluación de los ensayos de herbicidas Evaluación de la acción de los herbicidas en el control de malezas: Debemos de tomar en cuenta los siguientes puntos: 1. Siempre seguir los lineamientos del protocolo.

2. Para un tiempo de evaluación, debe existir un mínimo de 3 evaluaciones y deben realizarse durante la duración del ensayo.

3. El reporte y evaluación de la tasa de daño al cultivo se debe expresar en porcentaje de fitotoxicidad, que a su vez es capaz de combinar todos los síntomas, por ejemplo: reducción de la biomasa, quemado, decoloración, deformación etc., Una escala de porcentaje (%) donde el 0% es igual al testigo y el 100% es la planta completamente muerta es muy utilizada. Para la evaluación de la fitotoxicidad siempre debe hacerse una comparación con el testigo no tratado.

4. Pueden realizarse evaluaciones para los síntomas individuales, por ejemplo: porcentaje de necrosis o porcentaje de clorosis; esto se requiere cuando las especies de malezas exhiban daños que excedan el 10% o que sea inaceptable bajo las condiciones de la prueba. Los tratamiento sin ningún daño son igual a cero

5. Para cada especie de maleza la evaluación y reporte se debe hacer por prueba de eficacia sobre todo (% de control de malezas), ya que es la que combina todos los síntomas, como por ejemplo: clorosis, necrosis y inhibición del crecimiento.

6. Las escala a utilizar en él % de control de malezas es el siguiente: 0 % control, testigo o no tratado y 100 % completamente muerto, en comparación con un bloque no tratado.

Si la cuantificación es hecha para determinar el control de las malezas, el área y el número de muestra por cada bloque debe ser reportada en la evaluación descrita. Los ensayos desarrollados para malezas perennes, donde las plantas necesitan crecer para ser evaluadas, necesitan de muchas más evaluaciones. La caracterización del cultivo y flora de malezas (composición y grado de infestación) en un área no tratada y representativa del ensayo siempre es necesaria. Las condiciones ambientales deben ser reportadas durante la duración del ensayo, estos comentarios son extremadamente útiles, ya que al final de las evaluaciones hay que hacer un breve resumen de cualquier factor el cual puede haber afectado los resultados de los ensayos.

La consolidación final de los datos de campo es muy importante, sin esto no es posible llegar a una buena conclusión; marcar los datos perdidos es una buena práctica. Las fotografías frecuentemente proveen una ayuda útil para describir los efectos vistos en el ensayo Ejemplo típicos de evaluaciones usadas en ensayos de herbicidas: Parámetro Control Fitotoxicidad Clorosis Decoloración Inhibición Deformación Defoliación Cobertura del suelo Emergencia Altura Floración Biomasa fresca Biomasa seca Humedad Peso de granos

Tipo de evaluación % de control de malezas: debe incluir todos los síntomas característicos de daño del herbicida % de fitotoxicidad general: síntomas típicos; decoloración, detección del crecimiento etc. % del área o del tejido clorótico % del cambio de color (púrpura, blanco) Se deben establecer escalas para hacer las evaluaciones, éstas pueden ir desde 0% daño hasta 100 % de daño Se debe reportar el número de plantas que presenten deformaciones. Esto aplica para cultivos % de defoliación en comparación con el testigo % cobertura de cultivo o de las malezas cuando se ve directamente desde arriba % de emergencia de las plántulas en comparación con el testigo Mediciones de la altura % de floración de las plantas en comparación con el testigo Peso de las plantas vivas en comparación con el testigo Peso de las plantas secas en comparación con el testigo % de humedad de las semillas en comparación con el testigo Peso de 1000 semillas

Capítulo 7 EVALUACIÓN DE MEZCLAS DE HERBICIDAS Albert Fischer Universidad de California-Davis (USA)

Introducción Las mezclas de herbicidas son de uso común como herramientas para el manejo de malezas.

Estas mezclas se pueden obtener como productos formulados o pueden ser hechas por los mismos productores. Las razones por las que las mezclas pueden ser utilizadas son variadas, pero entre ellas destacan el aumento del espectro de acción del control químico aplicado, el manejo de casos de resistencia o, simplemente, el ahorro que supone la aplicación de más de un producto fitosanitario en una misma labor.

Las ventajas de la mezcla de herbicidas son evidentes, pero esta práctica debe ser evaluada, ya que pueden suceder (y suceden) interacciones entre los herbicidas que se mezclan que pueden traer como consecuencia el desmejoramiento de la acción fitotóxica de alguno de los herbicidas mezclado, lo que redunda en pérdidas económicas y un deficiente nivel de control de las malezas. Por el contrario, también suele ocurrir que mezclas de herbicidas o de un herbicida con otro producto pueden resultar sinérgicas y con ello incrementar la eficiencia del control y constituir una valiosa herramienta para el manejo de la resistencia a herbicidas. Es por ello que en este capítulo se desarrollarán las ideas básicas de los aspectos que son necesarios para evaluar una mezcla de herbicidas, y se hará énfasis en la utilidad que tiene esta técnica para el combate de los problemas de malezas resistentes a herbicidas.

Conceptos básicos Cuando se mezclan dos o más ingredientes activos herbicidas o un herbicida con otro compuesto (el cual puede por sí sólo no tener ningún efecto aparente sobre la planta), puede suceder una de tres tipos de interacciones: 1. La acción herbicida es menor de lo esperada ≈ ANTAGONISMO 2. La acción herbicida es similar a lo esperada ≈ SIN INTERACCIÓN, ADITIVIDAD 3. La acción herbicida es mayor a lo esperada ≈ SINERGISMO Si bien los efectos parecen claros, la interpretación matemática complica las definiciones.

Antagonismo El antagonismo entre herbicidas sucede cuando el efecto es menor de lo esperado o cuando sucede un menor control que con el mejor componente de forma individual. El antagonismo puede suceder no sólo cuando se mezclan dos herbicidas, sino cuando mezclamos herbicidas con otros productos fitosanitarios, como fertilizantes foliares, insecticidas, hormonas de crecimiento, etc.

El antagonismo puede expresarse como una pérdida en la capacidad de control de una o varias especies de uno o ambos componentes de la mezcla, pero también puede suceder que la mezcla de dos o más herbicidas produzca la pérdida de la selectividad de uno de sus componentes, observándose un daño directo sobre el cultivo. Esta pérdida de la selectividad también puede suceder por antagonismo con otros productos fitosanitarios que se agreguen a la mezcla. Por todo ello, es necesario conocer las posibilidades de mezcla que poseen los

herbicidas; en la mayoría de los casos, los antagonismos conocidos se registran en las etiquetas o materiales técnicos del herbicida, pero hay que considerar que todas las posibilidades de mezcla no son evaluadas, por lo que la acción de mezcla no reportadas con anterioridad deben ser evaluadas antes de su uso. El antagonismo puede darse como incompatibilidad química entre los herbicidas y/o las formulaciones y causar precipitados insolubles en el tanque de la asperjadora, por lo cual es aconsejable hacer una mezcla previa de esos herbicidas, a las mismas diluciones de uso, en una botella y observar si existen notorias incompatibilidades antes de vertirlos al tanque. Por otra parte es importante mantener el orden de mezclado de diferentes formulaciones que indica la etiqueta de ese producto. A menudo se recomienda que el orden de agregado de formulaciones a mezclar en el tanque sea: 1. Agregar y agitar agua a ¾ del volumen del tanque de la aspersora.

2. Productos dispersibles en agua (flowables, polvos mojables, concentrados en suspensión, o suspo-emulsiones).

3. Productos solubles en agua.

4. Concetrados emulsionables.

5. Surfactantes y otros aditivos solubles en agua.

6. Completar el volumen de agua.

En este trabajo nos referiremos más bien a las interacciones entre ingredientes activos dentro de las plantas. El principio general en todo esto de las interacciones es de que uno no debiera mezclar productos sin antes haberlos probado en un experimento en el campo contemplando: a) los herbicidas por separado y a las mismas dosis en que se usarán en la mezcla; b) juntos y en mezcla a esas mismas dosis, y c) con un cierto número de repeticiones.

Tal como se comentó, uno de los usos más comunes de las mezclas de herbicidas en la actualidad tiene como objetivo retardar la aparición de biotipos resistentes. Este uso esta limitado a mezclas de herbicidas que posean las siguientes características:  Los herbicidas deben afectar sitios de acción diferentes (Ejemplo: inhibidores de la ALS e inhibidores del Fotosistema II) o se fijan en a regiones diferentes si comparten el mismo sitio de acción (Ejemplo: Inhibidores del Fotosistema II, donde existen dos grupos según región de unión: triazinas y el resto de herbicidas con este mecanismo de acción [ej. derivados de urea]).  Los herbicidas de las mezclas no deben ser degradados por la misma ruta metabólica.  Controlan a la misma especie de maleza(s) con la misma eficacia.  Tienen similar persistencia.

Los componentes ideales además tendrían que exhibir resistencia cruzada negativa y presentar sinergismo.

Sinergismo El sinergismo sucede cuando el efecto de los herbicidas mezclados es mayor que la suma de los efectos individuales de cada componente. Este fenómeno puede ser utilizado para incrementar la eficacia en el control, reducir dosis, mayor economía, etc. Lo importante aquí no es solamente contemplar el grado de control de la maleza, sino también ver si se mantiene o se afecta el nivel de selectividad deseado hacia el cultivo. El sinergismo no resulta en

perdida de selectividad si uno o ambos de los componentes de la mezcla sinérgica puede ser detoxificado por el cultivo y no por la maleza (bispiribac-tiobencarbo en arroz), cuando un componente bloquea a una isoenzima detoxificadora en la maleza y no en el cultivo (casos en Echinochloa y arroz), o cuando el sinergista forma inhibidores estables en la maleza y no en el cultivo (caso de tridifane y atrazina en maíz vs. Setaria spp.). El sinergismo entre herbicidas puede suceder cuando:  Los componentes de mezcla de amplio espectro coinciden en actividad sobre ciertas especies.  Los componentes poseen diferentes sitios de acción en la misma planta y pueden activar complejas redes de efectos secundarios.  Un componente interfiere con la detoxificación del otro.

Sin embargo, a menudo resulta difícil hallar una explicación mecanística para un efecto sinérgico.

Por su parte, el uso del sinergismo en el manejo de resistencia es importante sí es capaz de “quebrar” la resistencia de un biotipo o se reduce la dosis para el control de la especie y así disminuye la presión de selección. ¿Cómo de determina el sinergismo?

Existen tres metodologías para la determinación del sinergismo. Ellas son: Detectar y cuantificar modificaciones en la I50 (o GR50, LD50, etc.) usando curvas de respuesta a dosis, Análisis de isóbolas, y la comparación con efectos “esperados” predichos por el modelo de Colby.

1. Modificaciones en la I50: En este manual se describe en detalle la forma como se determina la I50 (capítulos 4 y 10), que no es más que la dosis de un herbicida que reduce en un 50% una variable de control, que normalmente está asociada al crecimiento (peso, por ejemplo). Es importante resaltar que un sinergista puede no tener efecto herbicida, actuando sólo en la prevención del catabolismo del herbicida (o de sus metabolitos tóxicos) o simplemente facilitando la absorción o translocación del herbicida.

En la Figura 1 se puede observar como la reducción del I50 lograda al mezclar dos herbicidas es indicativo de sinergismo. Esto se detecta por un cambio significativo en el coeficiente de pendiente de la curva de regresión ajustada a los datos; el valor de la I50 concomitantemente se reduce.

Figura 1. Detección de sinergismo entre herbicidas por medio del estudio de la I50.

2. Análisis de isóbolas: Las isóbolas son líneas que unen puntos de igual efecto. Por ejemplo la isóbola para el 50% de efecto es aquella línea que une los puntos para los cuales herbicidas individuales o en mezcla tienen un efecto del 50% sobre la especie en estudio. La Figura 2 muestra isóbolas para inhibición de crecimiento del 50% donde cada punto (azul) es el efecto en la planta que resulta de mezclar los herbicidas A y B a una serie de dosis cuya combinación resulta en el efecto inhibitorio del 50% tal como lo muestran las flechas de línea punteada.

Figura 2. Diagrama isobólico para 50% de inhibición con mezclas de dos herbicidas. La línea que une los puntos y se ubica por debajo de la diagonal punteada (no interacción o efecto aditivo) sugiere que las mezclas tienen efecto sinérgico

Puede establecerse como referencia una línea (línea diagonal punteada) donde los efectos de las combinaciones tiene efecto aditivo (no hay interacción; el efecto de una dosis de A se suma al de la dosis complementaria de B para obtener un 50% de inhibición). Si los efectos son sinérgicos (o mejores de lo esperado), las respuestas de las mezclas (o de algunas de ellas) se encuentran por debajo de la línea punteada. Lo opuesto ocurriría si los efectos son antagónicos: las respuestas se encuentran por encima de la línea de aditividad (Figura 3).

Figura 3. Representación esquemática de efectos de mezclas de herbicidas (A) o de un herbicida y un coadyuvante inerte (B) empleando isóbolas (Adaptado de Streibig, et al.

1993).

Los puntos isobólicos pueden unirse por una línea de regresión empírica, pero es posible que la línea isobólica adquiera una forma irregular o asimétrica donde, por ejemplo, haya aditividad en una porción y sinergismo en otra porción de la respuesta. El empleo de isóbolas es bastante adecuado para describir la sustitución de dos herbicidas en mezcla, pero presupone la confección de experimentos de dosis de respuesta para obtener la matriz de efectos isobólicos (I50, I90, etc.). Los modelos presentados aquí asumen que los herbicidas pueden sustituirse el uno por el otro a dosis biológicamente equivalentes, es decir que se trata de un modelo aditivo. Esto puede ocurrir con herbicidas que tengan el mismo modo de acción, aunque en la realidad esto también se observa con diversos herbicidas y modos de acción. Bajo el modelo aditivo y para un determinado nivel de respuesta, es válida la siguiente expresión: (za/Za) + (zb/Zb) = 1

[1]

Donde za y zb son las dosis de los herbicidas usadas en mezcla y Za y Zb son las dosis de ellos empleadas en aplicaciones independientes (Finney 1971; Streibig et al. 1993). El empleo de la I50 con respuesta es estadísticamente lo más adecuado pues representa el punto de inflexión de la curva de respuesta a dosis que es donde se obtiene la mayor sensibilidad en la estimación de efectos. Pero a nivel de campo los efectos a nivel de la I90 pueden resultar

más relevantes. La consideración de efectos aditivos facilita el tratamiento estadístico convencional de los datos.

Es posible, sin embargo, que el efecto de los herbicidas sea multiplicativo. Esto ocurre cuando ejercen su efecto sobre la planta de forma independiente y donde las respuestas se pueden expresar como porcentaje de una respuesta máxima. El modelo multiplicativo puede formularse en términos de porcentaje de control mediante la conocida fórmula de Colby (1967): E= X+Y – XY/100

[2]

Donde E es el efecto esperado de la mezcla expresado como porcentaje de control, X es el porcentaje de control obtenido con el herbicida X la dosis x e Y es el porcentaje de control obtenido con el herbicida Y a la dosis y. La Figura 4 representa lo que serían efectos multiplicativos; en ese caso el herbicida B controla un 50% de ese 30% que el A no controló.

El modelo multiplicativo supone que los herbicidas actúan de forma independiente y en secuencia, lo que es naturalmente válido con herbicidas que tienen diferente modo de acción, aunque en la práctica el análisis según supuestos multiplicativos pueda emplearse con una gran diversidad de herbicidas que puedan o no diferir en modo de acción. Si se dispone de dosis de respuesta el modelo multiplicativo puede representarse como isóbolas; en este caso la curva de no interacción ya no es una diagonal, sino que adopta forma curvilínea. Para una discusión más amplia de modelos aditivos y multiplicativos se puede consultar a Streibig et al (1993) y a Streibig & Jensen (2000).

3. El método de Colby Es más frecuente ver el análisis multiplicativo efectuado según Colby (1967) en base a pocas dosis en lugar del empleo de curvas de respuesta a muchas dosis.

Figura 4. Representación esquemática de efectos multiplicativos en la mezcla de herbicidas.

En base a experimentos con replicaciones donde los herbicidas se emplean a las mismas dosis por separado y en mezclas pueden obtenerse los datos para implementar la fórmula de

Colby. Muchas veces el porcentaje de control se obtiene directamente por estimación visual.

También puede evaluarse la biomasa y expresar el porcentaje control como: (100 – Biomasa tratada/Biomasa testigo sin herbicida x 100).

Aplicando esta fórmula, si: E < % control observado: los efectos son mayores a lo esperado (sinergismo) E = % de control observado: no hay interacción E > % de control observado: el efecto es menos de lo esperado (antagonismo) Dado que los efectos multiplicativos no satisfacen los requisitos de aditividad y los valores expresados como porcentaje no conforman distribuciones normales, estos datos no son teóricamente adecuados para los análisis estadísticos basados en esos supuestos y Flint et al.

(1988) y Blouin et al. (2004) ofrecen elaboraciones matemáticas para subsanar algunas de esas dificultades. No obstante, es frecuente ver comparaciones de valores observados y esperados (E) mediante pruebas t a una cola o usando ANOVA y diferencia mínima significativa con datos provenientes de experimentos con replicaciones, previa transformación angular (arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción de control) de los datos de porcentaje a fin de aproximar la distribución binomial a la normal (Fischer et al.

2004; Lanclos et al. 2002). En definitiva el análisis de Colby es muy usado, es fácil de usar y su fundamento es válido. Simplemente alcanza con probar las mismas dosis individuales y en mezclas y se pueden probar varias dosis en un diseño factorial. A menudo se hace el análisis si la prueba de ANOVA muestra efecto significativo de la interacción (en experimento factorial).

Conclusiones:  Los componentes de una mezcla de herbicidas deben: (1) carecer de antagonismo; los cuáles suelen superarse elevando dosis: pero se incrementa la presión de selección; (2) diferir en el mecanismo de acción; (3) tener rutas de degradación diferentes y (4) si es posible exhibir resistencia cruzada negativa.  Se deben combinar herbicidas de diferentes mecanismo de acción, pero cuyo espectro, eficacia y residualidad no difieran.  Diferencias de residualidad son problemáticas con malezas de germinación escalonada pues las malezas de germinación tardía quedarán expuestas a la presión de selección de uno sólo de los componentes. Mutantes con resistencia a este componente no podrán ser eliminados por el otro herbicida de la mezcla si su efecto ya se ha disipado al tiempo en que emergen esas malezas tardías.  La resistencia evolucionará rápidamente si la especie ya es resistente a uno de los componentes.  Al mezclar es posible encontrar casos de potenciación.  Los sinergistas son útiles para “romper” resistencias no conferidas por un sitio de acción alterado.  Podemos también considerar sinergizar los herbicidas alternativos para el manejo de una especie resistente (especialmente con inhibidores de ALS o ACCasa).  Los efectos de sinergismo suelen ser especie-dependientes.

 Las aplicaciones secuenciales con herbicidas de diferente Modo de Acción y/o ruta metabólica cumplen un papel similar al de las mezclas y poseen como ventaja que el último herbicida contribuye a evitar la producción de semillas. Sin embargo, no está protegido y selecciona por resistencia, por lo que debe rotarse de herbicidas en el ciclo siguiente.

Bibliografía recomendada Colby, S.R. 1967. Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide mixtures.

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Brain, P., and R. Cousens. 1989. An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research 29:93-96.

Finney, D.J. 1971. Probit Analysis, #rd ed.Charles Griffin: London.

Flint, J.L., P.L. Cornelius, and M. Barrett. 1988. Analyzing herbicide interactions: a statistical treatment of Colby's Method. Weed Technology 2:304-309.

Blouin, D.C., E.C. Wbster, and W. Zhang. 2004. analysis of synergistic and antagonistic effects of herbicides using nonlinear mixed-model methodology. Weed Technol 18:464-472.

Fischer, A.J., D.P. Cheetham, and R. De Prado. 2004. Enhanced effect of thiobencarb on bispyribac-sodium control of E. phyllopogon (Stapf) Koss in California rice (Oryza sativa L.). Weed Biology and Management 4:206-212.

Gressel, J. 1990. Synergizing herbicides. Rev. Weed Sci. 5:49-82.

Gressel, J. 2000. Molecular biology of weed control. Transgenic Research 9:355-382.

Lanclos, D.Y., E.P. Webster, and W. Zhang. 2002. Glufosinate tank-mix combinations in glufosinate-resistant rice (oryza sativa). Weed Technology 16:659-663.

Limpel, L.E., P.H. Schuldt, and D. Lamont. 1962. Weed control by dimethyl tetrachloroterephthalate alone and in certain combinations. Proc. Northeastern Weed Control conference. 16:48-53.

Schabenberger O & Birch J. 2001. Statistical dose-response models with hormetic effects.

Human and Ecological Risk Assessment, 7, 891-908.

Streibig, J.C. and J.E. Jensen. 2000. Actions of herbicides in mixtures. Pages 152-180. In A.H. Cobb and R.C. Kirkwood (eds.) Herbicides and Their Mechanisms of Action, CRC Press: Boca Raton, FL. Streibig J, Rudemo M & Jensen J. 1993. Dose-response curves and statistical models. In: Herbicide Bioassays. pp. 30-55: CRC Press, Boca Raton, FL.

Capítulo 8 FORMULACIONES DE HERBICIDAS: CRITERIOS PARA SU SELECCIÓN José Alfredo Muñoz AGROISLEÑA C.A. I. Introducción.

Los plaguicidas constituyen un extenso y complejo grupo de sustancias, dentro de las cuales se encuentran los herbicidas. Dichos productos pueden destruir toda la vegetación sobre la que se aplican o actuar selectivamente contra determinadas especies, bien por contacto o por vía sistémica. Se pueden aplicar en presiembra, como preemergentes a la maleza y/o el cultivo o en post-emergencia total (cultivo y maleza), o de forma dirigida a las malezas.

Debido a su alta concentración, la mayoría de los principios o ingredientes activos (i.a), no pueden usarse tal como se obtienen de los procesos de extracción o síntesis. Por tal razón, deben prepararse o acondicionarse en mezclas denominadas FORMULACIONES. Estas se obtienen al mezclarse el ingrediente activo con las llamadas sustancias auxiliares (inertes o coadyuvantes), para así facilitar la aplicación de concentraciones de i.a. adecuadas de manera homogénea y, en algunos casos, para aumentar su eficacia. Este hecho reviste especial importancia en la actualidad, cuando las dosis de los herbicidas,- referidas al producto comercial-, se han reducido significativamente como consecuencia de la mayor actividad biológica de los nuevos grupos químicos sintetizados.

II. Formulación. Concepto. Características.

Se entiende por “Formulación”, la adecuada preparación de un ingrediente activo (i.a.) para darle un uso práctico; es decir, alcanzar el objetivo, interactuar con él y llegar al sitio donde ejercerá su acción. Para lograrlo, es imprescindible que la formulación no se degrade. Para una mejor comprensión del concepto, se podría sintetizar de la manera siguiente: Formulación = i.a. + sustancias auxiliares (inertes y coadyuvantes).

En la formulación de un herbicida se deben considerar los siguientes aspectos:  Facilidad de aplicación  Distribución homogénea del i.a., tanto en la formulación como en las mezclas a aplicar, especialmente las líquidas.  Eficacia biológica con la menor cantidad posible de i.a.  Estabilidad en las diferentes condiciones de almacenamiento.  Facilidad de manipulación y transporte.  Reducción de riesgos toxicológicos al usuario, en su manipulación y / o aplicación.  Reducción de riesgos de contaminación ambiental.  Facilidad de descontaminar los cultivos tratados o acelerar la descomposición del i.a., una vez cumplida la acción.  Costos de formulación.  Compatibilidad con otros productos.



Reducción de posibles problemas de contaminación que pueden derivar del desecho de empaques o envases, una vez utilizados.

Seleccionando adecuadamente las sustancias auxiliares y la formulación apropiada, se logra compensar, en cierta medida, las propiedades colaterales indeseables de algunos ingredientes activos.

III. Componentes principales de una formulación. a) Ingredientes activos: Generalmente, se obtienen con diversas calidades de pureza, cuales son: 

 

Purísima o proanálisis: con un porcentaje mínimo o en los límites de detección de impurezas. Se usa en determinaciones analíticas y en la preparación de patrones, especialmente en análisis de residuos.

Pura o de Uso químico: tiene mayor porcentaje de impurezas que la anterior. Se usa en la preparación de muestras para ensayos de eficacia en condiciones ambientales controladas.

Técnica o Industrial: con porcentaje de pureza inferior a las anteriores. Se usa en la preparación de formulaciones comerciales.

b) Sustancias auxiliares: Son de origen orgánico o mineral, empleadas para adecuar los i.a. a las concentraciones necesarias y condiciones óptimas para su aplicación.

Dentro de las sustancias auxiliares destacan dos grandes grupos: 1.- Vehículos inertes: Los más usados en el mercado son los de consistencia sólida y líquida, siendo clasificados ambos de acuerdo con la función que deben cumplir.

1.1.- Vehículos sólidos: - Portadores (carriers): o acondicionadores de la preparación inicial. En este caso, el i.a. se incorpora a cada partícula del portador, el cual tiene capacidad de absorción rápida por el diámetro de sus partículas y su porosidad interna. Así, a menor diámetro y mayor porosidad, mas elevado será el contenido de i.a. por unidad de peso.

- Acompañantes: sirven para asegurar la distribución adecuada de la aplicación. Son de bajo poder absorbente, gran densidad volumétrica y buen poder de soltura.

Los vehículos inertes sólidos pueden ser de origen vegetal (harina, partes molidas de estos) o minerales, agrupados en óxidos (tripolitas, óxidos de calcio o magnesio), carbonatos (calcita, dolomita), sulfatos (sulfato de calcio o yeso), silicatos (micas, vermiculitas, pirofilitas) o fosfatos (apatitas).

1.2.- Vehículos líquidos: Pueden ser, al igual que los sólidos, portadores o acompañantes (disolventes). El principal grupo de disolventes empleados en las formulaciones líquidas, lo constituyen algunos derivados de petróleo, dentro de los cuales existen distintos tipos o clases según el contenido de hidrocarburos parafínicos tipo hexano normal, anillos naftenos tipo ciclohexano y anillos aromáticos tipo benzol y xilol.

Entre los grupos mas importantes destacan: - Destilados con reducido contenido de hidrocarburos parafínicos y nafténicos y elevado contenido de aromáticos (benceno, tolueno, xileno). Por su costo, se limitan a la preparación de Concentrados Emulsionables.

- Fracción de destilados de petróleo con 20 – 50 % de aromáticos. Se usa en la formulación de Soluciones Concentradas y Emulsiones Concentradas.

Lo cierto es que no se dispone de disolventes que reúnan todas las características deseables (capacidad disolvente, volatilidad, viscosidad) para los distintos tipos de i.a. y maneras de aplicación, de tal manera que lo que suele hacerse son mezclas de ellos.

2.- Coadyuvantes: Son sustancias que contribuyen a mejorar la eficacia y estabilidad del producto formulado.

Son especialmente importantes para la aplicación de productos de baja solubilidad o que se aplican sobre superficies poco permeables, como follaje con cutícula cerosa o pubescente.

Los coadyuvantes más importantes son: - Acidificantes: mejoran el contacto con la superficie así como la calidad de la mezcla; reducen el pH de la solución y demoran la degradación de los i.a.

- Activadores: reducen la tensión superficial y aumentan el contacto entre el herbicida y la maleza a controlar.

- Adherentes: mejoran la adherencia y persistencia del herbicida sobre la superficie; impiden o disminuyen las pérdidas de los depósitos del producto sobre la superficie, causadas por el viento, lluvias o los riegos por aspersión; disminuyen el proceso de fotodegradación y la volatilización.

- Agentes de compatibilidad: mejoran la compatibilidad entre las sustancias que componen el caldo a aplicar, reduciendo el riesgo de floculación o precipitación.

- Antiespumantes: impiden la formación de espuma en los tanques de los equipos de preparación y aplicación.

- Tampones (buffers): estabilizan el pH de la solución; demoran la degradación del herbicida; mejoran la calidad de la mezcla a utilizar.

- Dispersantes: mantienen la estabilidad de las suspensiones de polvos mojables, evitando la floculación y sedimentación; reducen la tensión superficial; ayudan al herbicida a penetrar por pequeños espacios; mejoran el contacto del mismo con la superficie de la planta tratada. Entre los más comunes, destacan los polímeros de alquil-aril-sulfonatos y las ligninas sulfonadas de sal sódica.

- Emulgentes: favorecen la mezcla de dos sustancias líquidas insolubles. Se utilizan en la preparación de formulaciones emulsionables, ya que son compuestos tensoactivos constituidos por moléculas que contienen grupos de carácter hidrofílico (polares) y lipofílico (no polares). Se sitúan en la interfase de los líquidos emulsionados, de tal forma que la parte hidrofilica queda orientada hacia el agua y la lipofilica, hacia la sustancia emulsionable.

- Espesantes: dificultan la volatilización; reducen la deriva; aumentan la viscosidad de la solución; aumentan el tamaño, peso y velocidad de caída de las gotas, mejorando la penetración y cobertura. Destacan los derivados de algina, la hidroxietil celulosa y la poliacrilamida aniónica.

- Humectantes: logran un buen mojado sobre la superficie de aplicación; evitan que el polvo flote; favorecen la penetración del i.a. por los estomas.

- Penetrantes: maximizan la acción del herbicida al facilitar su paso a través de la cutícula.

- Surfactantes: reducen la tensión superficial de los líquidos; ayudan al herbicida en su penetración y contacto; impiden el lavado y abrasión; dificultan la volatilización. Pueden ser de dos tipos: iónicos y no iónicos.

La elección de los coadyuvantes más adecuados se debe considerar cuidadosamente en cada caso, teniéndose en cuenta:     

Las características fisicoquímicas del i.a. de los herbicidas.

La naturaleza del portador y del diluyente usado en la formulación.

El tamaño de gota que ha de producir la asperjadora.

El volumen de líquido por unidad de superficie.

Las características de las superficies a tratar (Ej: cutículas foliares).

IV. Tipos de formulaciones: a) Formulaciones líquidas: 1) Concentrados emulsionables: son diluciones de i.a. en disolventes orgánicos. Son insolubles en agua pero, agregando los emulgentes adecuados, esas disoluciones pueden mezclarse con agua, convirtiéndose en una emulsión blanquecina y lechosa; es decir, tienen la propiedad de formar una emulsión cuando se mezcla con agua.

       

De fácil producción y manejo.

Pueden medirse y dosificarse fácilmente con un vaso graduado.

Emulsifican espontáneamente, formando una emulsión estable.

Tienen efecto coadyuvante del disolvente.

Mejoran la penetración por la cutícula.

Mayor resistencia al lavado.

Envases vacíos fáciles de lavar.

Estabilidad depende del pH, dureza del agua, temperatura y condiciones de almacenamiento.

Es fundamental que la emulsión por aplicar se mantenga estable; sin embargo, en caso de que se separen los componentes, la homogeneidad se restablece mediante agitación.

Ejemplos: 2,4-D éster butílico, clefoxydim (Aura), butaclor (Crusher), S-metolacloro (Dual Gold), oxifluorfen (Goal, Koltar), fluazifop-p-butil (Hache Uno 2000), propanil (Propanol), pendimetalin (Prowl 400), acetocloro (Zulú).

2) Concentrados solubles en agua: Consisten en concentrados del i.a. o sus sales, disueltos en agua o en disolventes miscibles con agua. Ello significa que los i.a. deben tener suficiente solubilidad en agua, facultad que solo la poseen pocas sustancias en la actualidad.  Llevan tres componentes básicos: Ingrediente activo, solvente y coadyuvante.  No requieren de mayor agitación en el tanque.  No requieren de premezcla.  Poco inflamables.  Reaccionan con aguas duras.  Buena penetración foliar (sistémicos/contacto).  Mayor riesgo de lixiviación.

Ejemplos: ácido 2,4-D (2,4-D Amina), naptalam (Alanap), dicamba + 2,4.D (Banvel DBanvel S), paraquat + diquat (Doblete 200), picloram + 2.4-D (Huracán 40 SC, Potreron), imazetapyr (Brioso 10 SL), clomazone (Command 4), MSMA (Initox, Daconate), glifosato (Candela Super, Glyfosan), paraquat (Gramoxone).

3) Suspensiones concentradas: consisten en una suspensión de partículas finas del material técnico en una fase acuosa e ingredientes adicionales de la formulación.Se presentan en forma cremosa y lista para ser mezclada con agua.  No desprenden polvos ni contienen solventes orgánicos.  Se pueden medir y dosificar fácilmente.  Pueden descomponerse durante el almacenamiento.  Fabricación costosa.

Ejemplos: quinclorac (Celtic 25 SC, Facet 250 SC), bispiribac sodio (Designee 40 SC), glifosato + 2,4-D (Faiter), alaclor (Gramisso), diuron (Hierbatox), linuron (Linurex 50), hexazinona (Velpar L), atrazina (Triazol Suspensión).

4) Microemulsiones:  Formulación estable. Gotas muy pequeñas.  Disminuyen el número de aplicaciones.  Mayor absorción.  Reducen mermas del i.a. por evaporación.  Aumentan la eficacia del i.a.

Ejemplos: picloram + fluroxypir (Centella ME). b) Formulaciones sólidas: 1) Gránulos dispersables en agua: son una mezcla homogénea de los materiales técnicos, inertes y adicionales de la formulación. Tienen forma granular, que se aplica luego de la desintegración y dispersión en el agua.  Son secos y libres de grumos y están sustituyendo a los polvos mojables y polvos solubles.  Dan mayor seguridad al usuario.  No desprenden polvo.  Se pueden medir con un vaso graduado.  Los envases se pueden vaciar con facilidad.  Formulación costosa.  Pueden aplicarse al follaje o al suelo.

Ejemplos: sulfonilureas (Accent, Ally), ametrina (Ametrol Fácil), atrazina (Limpiamaíz Fácil GD 90), diuron + ametrina (Dimetrin Fácil 80 GD), metribuzina (Hexone Fácil 80 GD), ciclosulfamuron (Invest GD).

2) Polvos mojables: Son una mezcla homogénea de los productos técnicos con las sustancias auxiliares apropiadas. Se presentan en forma de polvo fino y se aplican como suspensiones después de su dispersión en el agua. Las partículas sólidas, pueden formar una suspensión en el agua.  El polvo es capaz de mojarse y mantenerse en suspensión en el agua.  El producto es seco y libre de gránulos.  Alta concentración del i.a.  Fáciles de empacar y formular.  Más económicos.  Precipitan.  Pueden aglomerarse durante el almacenamiento.  Pueden ser abrasivos, causando mayor desgaste de las boquillas.

Ejemplos: atrazina (Limpiamaíz 80 PM), ametrina (Ametrol 80 PM), diuron (Hierbatox 80), pirazosulfuron etil (Fortius), metribuzina (Hexone 70 PM).

3) Polvos solubles: se aplican como una dilución verdadera del i.a. después de su dilución en el agua. Actualmente son muy pocos los existentes en el mercado.  Solubles en agua.

    

Alta concentración del i.a.

No requieren de agitación en el tanque.

Higroscópicos.

Pueden reaccionar con aguas duras.

Lixiviables.

Ejemplos: algunas formulaciones de diuron y triazinas. c) Formulaciones mixtas: Algunos productos pueden formularse en varias presentaciones, tanto líquidas como sólidas, dependiendo del ingrediente activo, como por ejemplo: Atrazina, ametrina Glifosato Metribuzina

Gránulos dispersables en agua, Suspensión concentrada, Polvo mojable, Polvo soluble.

Gránulos dispersables en agua, Concentrado soluble.

Gránulos dispersables en agua, Polvo mojable.

V. Factores que afectan la eficacia de los herbicidas.

Existen tres elementos a considerar a la hora de aplicar un tratamiento herbicida, cuales son: Las malezas: especie (gramíneas o poáceas, de hojas anchas, ciperáceas), tipo (herbáceas, arbustivas, leñosas), reproducción (semillas, vegetativa), tamaño, condición al momento de la aplicación (vigor, agotamiento, turgencia, estado nutricional, etc), estado de desarrollo (germinación, fase de plántula, floración, etc).

Las condiciones ambientales: precipitación, temperatura ambiental, humedad relativa, insolación, evaporación, suelo (humedad, temperatura, contenido de materia orgánica y sales, textura, etc).

El herbicida a aplicar: selección y uso correcto, proporción adecuada del material aplicado por unidad de área (dosis), cobertura apropiada (humedecimiento, penetración), frecuencia de aplicación, pH de la superficie foliar, mezclas apropiadas y procedimientos de mezcla correctos (compatibilidad, orden de mezcla), calidad del agua, conductividad, pH, temperatura, equipos a emplear.

VI. Selección de la formulación.

Usualmente, la selección de la formulación se decide tomando en cuenta tres factores: precio, disponibilidad en el mercado y conveniencia del usuario, con base en la disponibilidad de equipos.

Como ejemplo, las formulaciones de polvos mojables contienen las mayores cantidades de i.a. por peso unitario y son las menos costosas; sin embargo, al estimar los costos totales, es

necesario considerar también la técnica de aplicación, ya que puede aumentar la necesidad de mano de obra, equipo y tiempo de aplicación.

Años atrás, la acción biológica y la forma de aplicación jugaron un papel importante en la elección de las diferentes formulaciones en tanto que, hoy en día, son determinantes la seguridad para el usuario y la compatibilidad con el ambiente. Además de la acción biológica, las formulaciones de herbicidas deben satisfacer otros requisitos como: fácil dosificación, escaso desprendimiento de polvo y posibilidades de vaciar bien el empaque o envase utilizado. Esto significa una tendencia a reemplazar los productos en polvo por suspensiones concentradas o gránulos dispersables en agua. Así mismo, dada la influencia demostrada por las sustancias auxiliares sobre el efecto biológico de los i.a. y su eficacia, éstas cobrarán más importancia en el futuro, conllevando ello a reducir aún mas las dosis necesarias de los ingredientes activos.

VII. Glosario A los fines de entender un poco mejor los términos y conceptos antes expresados, se presenta a continuación, un breve glosario de términos relacionados con el tema:  Absorción: proceso por el cual un herbicida pasa de un sistema para otro; es decir, de la solución del suelo para las células de las raíces de las plantas (absorción radicular) o de la superficie de la hoja para las células (absorción foliar).  Acrópeta: translocación del producto dentro de la planta, de los órganos inferiores para los superiores.  Adyuvante: material sin propiedades herbicidas que, cuando es adicionado a un producto formulado o a la mezcla a aplicar, le aumenta su actividad o sus características.(sinónimo: coadyuvante).  Agua dura: aquélla que contiene de 6 a 9 mg/l equivalente de carbonato de calcio.  Antagonismo: interacción entre dos o mas productos químicos cuyos efectos, cuando combinados, son inferiores a lo previsible, basado en la actividad de cada uno, por separado.  Apoplásto: conjunto de todas las partes continuas, no vivas, de la planta, tales como las paredes celulares, espacios intercelulares y los vasos del xilema.  Activación: proceso por el cual un herbicida aplicado en la superficie del suelo, se torna fitotóxico después de un riego o lluvia. Resulta del movimiento del herbicida en el suelo donde puede ser absorbido por las semillas, plántulas o plantas y no por modificación química del ingrediente activo.  Basípeta: translocación del producto dentro de la planta, desde los órganos superiores hasta los inferiores.  Caldo: dilución del herbicida en un líquido, normalmente agua, cuando va a ser aplicado.  Compatibilidad: capacidad de unirse dos o más formulaciones de herbicidas sin que sean perjudicadas sus características o efecto de sus componentes.  Concentración: cantidad de ingrediente activo o su equivalente ácido en una solución. Se expresa en g / l ó g / k.  Corrosividad: acción de dañar o destruir materiales metálicos.  Degradación: proceso por el cual un producto altera sus propiedades físicas o químicas.  Densidad: relación entre la masa y el volumen de un cuerpo.

 Deriva: movimiento de las gotas de la aspersión fuera del área deseada.  Deriva de vapor: movimiento de vapores químicos de los herbicidas desde el área de aplicación hasta áreas circunvecinas. Algunos herbicidas, aplicados a las dosis y temperaturas normales, tienen presión de vapor suficientemente alta para evaporarse y provocar fitotoxicidad en plantas susceptibles , fuera del área de aplicación.  Diluyente: cualquier material gaseoso, líquido o sólido, usado para reducir la concentración del ingrediente activo en una formulación.  Dosis: cantidad de producto aplicado por unidad de área o por planta. Puede ser expresada en ingrediente activo, equivalente ácido o producto formulado.  Emulsión: mezcla en la cual las gotas de un líquido se encuentran en suspensión en otro líquido, normalmente aceite o agua.  Emulsión invertida: es la emulsión de agua en aceite.  Emulsificante: producto usado en las formulaciones para reducir la tensión interfacial permitiendo la formación la emulsión de un líquido neutro.  Equivalente ácido: cantidad de ingrediente activo expresado en términos del ácido de que es derivado el producto.  Floema: conjunto de tubos cribosos o liberianos por los que se realiza el transporte de la savia elaborada.  Ingrediente activo: componente de la formulación del cual es obtenida su eficacia.  Ingrediente inerte: fracción no activa de los productos técnicos o sustancias utilizadas en la formulación como diluyentes o como vehículos.  Kd: coeficiente de adsorción en el suelo. Es la relación entre el producto adsorbido y el disociado en la solución del suelo.  KOC: coeficiente de adsorción de carbono orgánico: es la relación entre el Kd y el peso de la fracción de carbono orgánico presente en el suelo. Se expresa en ml/g de suelo.  KOW: coeficiente de partición o distribución entre octanol y agua.  Lixiviación: proceso por el cual la solución se infiltra en el suelo, pasando por horizontes donde no hay presencia de raíces.  Mezcla en tanque: mezcla de dos o más productos en el tanque de la asperjadora, antes de usarse.  Orden de mezcla: los productos que se mezclan pueden encontrarse en formulaciones muy variadas. Esto puede acarrear problemas de incompatibilidades físicas (grumos, flóculos, precipitaciones, sedimentación, etc.) que provocan que el caldo de aspersión no se forme bien, los productos pierdan eficacia, que las boquillas se taponen y que se ocasione fitotoxicidad al cultivo. El orden de mezcla correcto es: primero los sólidos y luego los líquidos. Ejemplo: Polvo Mojable - Polvo Soluble - Gránulos Dispersables en agua - Suspensión Concentrada - Concentrado Emulsionable- Líquido Soluble o Concentrado Acuoso - Abonos Foliares - Coadyuvantes.  Persistencia en el medio ambiente: período durante el cual una sustancia permanece en el ambiente: puede ser: corta (vida media hasta 90 días en el suelo), media (vida media entre 91 y 180 días en el suelo) y larga (vida media por encima de 180 días en el suelo).  Pka: -log10 de la constante de disociación de ácido.  Presión de vapor: presión ejercida por una molécula gaseosa que está en equilibrio con las moléculas de sólido o líquido del cual se deriva. Se expresa en mm de Mercurio o en Pascal.

 Producto técnico: sustancia obtenida directamente de la síntesis de materias primas, cuya composición contiene un porcentaje definido de ingrediente activo.  Simplasto: masa viva total de células de la planta, ligadas unas a otras por los plasmodesmos.  Solubilidad: cantidad máxima de una molécula que se disuelve en agua pura a una determinada temperatura. Se expresa en: mg/l; g/l; mg/ml.  Surfactante: sustancia que afecta las propiedades físicas de la superficie de los líquidos, aumentando las características humidificantes de las gotitas asperjadas.  Suspensión: mezcla que contiene partículas finamente divididas, dispersas en un sólido, líquido o gas.  Textura: referida a suelos. Arenosa: suelos con menos de 15% de arcilla; Arcillosa: suelos con más de 35% de arcilla y franco entre 15% y 35% de arcilla.  Vida media: tiempo necesario para que un producto, después de aplicado, alcance y mantenga la mitad de la concentración original.  Volumen de caldo: cantidad de líquido que contiene al herbicida aplicado por unidad de área: Alto volumen: superior a 600 litros por ha.

Medio volumen: entre 200 y 600 litros por ha.

Bajo volumen: entre 50 y 200 l/ha.

Muy bajo volumen: entre 10 y 50 l/ha.

Ultra bajo volumen: entre 1 y 10 l/ha.

VIII. Bibliografía Consultada.

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Muñoz B. J.A. 2008. Manual Técnico de AGROISLEÑA C.A.: productos agroquímicos y biológicos, semillas y equipos.400 p. Cagua. Venezuela.

Capítulo 9 EVALUACIÓN DE TÉCNICAS PARA LA APLICACIÓN DE HERBICIDAS Pablo Rodríguez Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” Introducción El manejo de las diferentes plagas, malezas y enfermedades requiere de un conjunto de conocimientos y procedimientos que deben ser aplicados de forma correcta para alcanzar los objetivos propuestos. Entre estos aspectos se encuentra la tecnología de aplicación de los diferentes productos, como una parte del manejo integrado de estos problemas.

Cuando se realiza la aplicación de un producto fitosanitario, generalmente se le da mucha importancia al producto a utilizar (argumento que no está de más) y se desestiman los equipos con los que se va e realizar esa aplicación. Al momento de aplicar un producto se deben usar equipos de buena calidad y que tengan condiciones de funcionamiento y seguridad apropiadas; con esto se logra una buena eficiencia en el tratamiento, así como disminuir los daños al cultivo y los riesgos de contaminación ambiental.

La ineficiencia de algunas aplicaciones de productos se debe, en un número importante de casos, a problemas que presentan los equipos pulverizadores, bien sea en el adecuado funcionamiento de cada uno de sus componentes o en la calibración de estos equipos. Estos inconvenientes pueden traer como consecuencia sobredosificaciones, subdosificaciones y/o riesgo de deriva en las aplicaciones; aumentando los costos, las posibilidades de un manejo poco eficiente, afectación a cultivos cercanos y contaminación ambiental.

La aplicación en forma líquida es la más usada. En una pulverización existen factores no controlables, como el clima, y otros controlables entre los que tenemos los equipos de pulverización. Aspectos como manómetros y reguladores de presión en mal estado, filtros tapados, boquillas no apropiadas o desgastadas, mala agitación de la mezcla, inestabilidad de las barras portaboquillas, velocidad de trabajo inadecuada, entre muchos otros, pueden ocasionar deficiencias marcadas en las pulverizaciones de los productos fitosanitarios.

El conocimiento de una serie de aspectos técnicos, de las condiciones climáticas y la calibración de equipos, son fundamentales a la hora de realizar una aplicación en un escenario de campo.

Formas de aplicación de los productos Cualquiera que sea la técnica de aplicación de un producto fitosanitario debe garantizar utilizar una materia activa en su dosis mínima efectiva, aplicación en el momento oportuno, con una distribución homogénea sobre el objetivo y sin causar efectos negativos sobre el resto de los elementos del ecosistema.

Los productos fitosanitarios pueden aplicarse en forma sólida, líquida o gaseosa. Las aplicaciones sólidas y gaseosas han venido decayendo en los últimos años, por el contrario las aplicaciones líquidas se han incrementado notablemente. Esta situación se debe al considerable desarrollo que han experimentado los equipos para la aplicación en forma

líquida de los diferentes productos fitosanitarios y a formulaciones adaptadas a este tipo de aplicación.

La pulverización, fraccionamiento de un líquido en pequeñas gotas, es un método sencillo y eficaz que permite lograr los objetivos de la aplicación de un producto fitosanitario. Los equipos utilizados han avanzado marcadamente en los sistemas de control, en la calidad de los materiales y medidas de seguridad tanto para el operario como para el medio ambiente.

Factores a considerar para las aplicaciones en forma líquida.

Existen una serie de factores que deben ser tomados en cuenta a la hora de realizar una aplicación de un producto fitosanitario en forma líquida, diluido en agua.

Volumen de aplicación: Es la cantidad de mezcla (producto(s) más agua) a aplicar por unidad de superficie, expresada en litros por hectárea (L/ha). El volumen a aplicar va depender de la recomendación técnica que indique el producto, su clasificación se puede apreciar en la tabla 1. Los equipos utilizados pueden variar según el volumen de mezcla que se necesite aplicar.

Tabla 1. Denominación de las pulverizaciones según el volumen de mezcla a aplicar.

Denominación Volumen (L/ha) Ultrabajo volumen <5 Muy bajo volumen 5 – 50 Bajo volumen 50 – 100 Volumen reducido 100 – 200 Volumen medio 200 – 500 Alto volumen > 500 Tamaño de las gotas: En los equipos de aplicación de líquidos las gotas se forman gracias a la energía hidráulica o la neumática. La más usada es la hidráulica donde el líquido sometido a presión es obligado a salir por un pequeño orificio (boquilla pulverizadora) el cual posee una forma determinada; este líquido se separa en pequeños ligamentos y luego en pequeñas gotas debido a la diferencia de presiones. Cada modelo de boquilla genera un rango de tamaños y un patrón de distribución de estas gotas. En la tabla 2 se observan los diferentes rangos de tamaño de gota, el tamaño de la gota está representado por su diámetro y se expresa en micrómetros (µm).

Tabla 2. Clasificación del tamaño de las gotas.

Rango aproximado Categoría (símbolo) DV0,5 o VMD (µm) Aerosol (A) < 50 Muy fina (MF) 50 – 145 Fina (F) 145 – 225 Media (M) 226 – 325 Gruesa (G) 326 – 400 Muy gruesa (MG) 401 – 500 Extremadamente gruesa (EG) > 500 Fuente: ISO, ASABE S572, Universidad de Virginia.

Código Color Rosado Rojo Naranja Amarillo Azul Verde Blanco

* (1 µm equivale a 0,001 mm)

El color indicado para cada tamaño de gota debe ser señalado en las tablas que caracterizan las diferentes boquillas trabajando a determinadas presiones, junto con la abreviatura o símbolo de cada categoría.

El tamaño de las gotas es un aspecto difícil de determinar. Actualmente laboratorios especializados utilizan equipos sofisticados como la fotografía de alta velocidad, analizadores digitales de imágenes, analizador láser por difracción (figura 1), sondas de matriz óptica y analizador de fase Doppler. El análisis de estos equipos para una misma muestra puede diferir entre ellos. El alto costo de estos equipos, el manejo complicado y la variabilidad de los resultados, según el analizador utilizado, hacen muy complicado la determinación del tamaño de las gotas.

Figura 1. Analizador láser por difracción para determinar el tamaño de gotas pulverizadas (Spraying Systems Co.).

Por esta razón es muy importante y obligatorio que los fabricantes indiquen en los manuales de sus productos el rango de tamaño de gotas que generan las boquillas a presiones de trabajo preestablecidas.

A nivel de campo esta determinación se complica aún más, ya que las condiciones de trabajo a la intemperie agregan más dificultad. Para obtener una aproximación del tamaño de gota que se está aplicando se pueden usar los objetivos artificiales como el papel hidrosensible; láminas de plástico, cápsulas de Petri o trozos de cristal con silicona; uso de colorantes; papel adhesivo; entre otros. Para medir el tamaño de las gotas se utilizan la observación con lupa o microscopio (comparando contra patrones establecidos o con cristales reticulados a una distancia determinada) o el análisis digital de imágenes.

Una limitante muy importante de estos métodos de campo es la tendencia de la gota a expandirse, distorsionando el diámetro real de esta. Los fabricantes de papel hidrosensible proporcionan un factor para corregir este error en función del diámetro medido, la temperatura y la humedad. Otro problema que puede presentarse es el ángulo de impacto de la gota o la colocación de los objetivos artificiales, los cuales pueden ocasionar una distorsión importante en las gotas como puede observarse en la figura 2.

Figura 2. Distorsión de las gotas pulverizadas por inclinación del objetivo artificial.

La condición ideal sería que las boquillas de los pulverizadores generarán gotas de un mismo tamaño, pero esto no sucede, las gotas producidas se encuentran en un rango determinado.

Además, el tamaño de estas está muy influenciado por la presión generada en el sistema (figura 3).

Figura 3. Gotas generadas por las boquillas e influencia de la presión de trabajo en el tamaño de estas.

El tamaño promedio de las gotas producido por las boquillas viene expresado por el diámetro medio volumétrico (DV0,5 o VMD por sus siglas en inglés), expresa el tamaño en función del volumen pulverizado, 50% del volumen pulverizado proviene de gotas más pequeñas y 50% de gotas más grandes que el valor medio (figura 4).

Figura 4. Representación gráfica del diámetro medio volumétrico (DV0,5) Otros términos usados en cuanto al tamaño de gotas son: DV0,1: Valor del diámetro donde el 10% del total del líquido pulverizado está formado por gotas más pequeñas o iguales a este valor. Este valor es adecuado para evaluar el potencial de deriva de gotas individuales.

DV0,9: Valor del diámetro donde el 90% del total del líquido pulverizado está formado por gotas más pequeñas o iguales a este valor.

RSF: Factor de homogeneidad relativo (Relative span factor, RSF), es una medida adimensional indicativa de la uniformidad del tamaño de las gotas, cuanto más cercano a uno más uniformes son las gotas producidas, viene dado por la siguiente expresión: RSF = (DV0,9 - DV0,1 ) / DV0,5 Cobertura de las gotas: El porcentaje de cobertura viene dado por el tamaño de las gotas y el número de impactos por centímetro cuadrado. Para estimar este valor indicativo de la calidad de la pulverización, se pueden utilizar los objetivos artificiales colocados para valorar el tamaño de las gotas. En la figuras 5 y 6 se pueden apreciar un patrón de comparación para estimar el número de impactos/cm2 y el tamaño de gotas de una aplicación.

Figura 5. Patrones de comparación para estimar el número de impactos / cm2 (Spraying Systems Co.).

Figura 6. Patrón de comparación para estimar el tamaño de las gotas. (Hardy) Existen recomendaciones técnicas sobre el número de impactos / cm 2 según el tipo de producto a aplicar, deberían indicarse en la etiqueta del producto. En la tabla 3 se presentan algunas recomendaciones al respecto.

Tabla 3. Impactos / cm2 y tamaños de gotas según el producto a aplicar.* Cobertura gotas / cm2 Rango aproximado Categoría gota DV0,5 o VMD (µm) Herbicidas Pre emergentes 20 – 30 >226 M – G – EG Sistémicos 30 – 40 226 – 400 M–G Contacto 40 – 50 150 – 300 F–M Fungicidas Sistémicos 30 – 40 226 – 400 M–G Contacto 50 – 70 150 – 300 F–M Insecticidas Sistémico 30 – 40 226 – 400 M–G Contacto 50 – 70 150 – 300 F–M Fuente: Kuhn, Teejet, Universidad de Virginia.

*Consultar recomendación fabricante

Condiciones climáticas: Las condiciones climáticas son factores muy importantes a tomar en cuenta a la hora de realizar una aplicación, principalmente la temperatura, la humedad relativa y el viento.

El viento excesivo influye negativamente sobre la calidad de la distribución de la aplicación, además de aumentar el riesgo de deriva. No se deben realizar aplicaciones con vientos superiores a 7 km/h.

La temperatura y la humedad relativa tienen una marcada influencia sobre la vida de la gota, tiempo que transcurre desde la formación de la gota hasta que se evapora. Temperaturas elevadas y baja humedad relativa reducen considerablemente la vida de las gotas, disminuyendo la posibilidad de penetración en el objetivo o inclusive que se evapore totalmente antes de alcanzarlo; se deben evitar las horas del día donde se presenten estas condiciones.

Valores altos de humedad relativa favorecen la penetración de los ingredientes activos, pero si son excesivos pueden propiciar el escurrimiento y la dilución excesiva de la mezcla, lo que aumenta las pérdidas del producto y desfavorece la penetración.

Deriva: Es el término usado para definir el movimiento de las gotas de la mezcla pulverizada a través del aire fuera del área objetivo. Las gotas más propensas a deriva son aquellas con diámetro inferior a 150 µm. Se deben tomar en cuenta los siguientes aspectos para minimizar la deriva: 1. La velocidad del viento tiene un gran influencia en la deriva, no realizar la aplicación en condiciones de viento elevadas. Evitar pulverizaciones con vientos superiores a 7 km/h a menos que se disponga de mecanismos antideriva.

2. Ajustar la distancia de la boquilla al objetivo, bajar en lo posible sin comprometer el patrón de distribución.

3. Regular la velocidad de trabajo para evitar la generación de turbulencia.

4. Evitar las aplicaciones con altas temperaturas y baja humedad relativa.

5. Disminuir la proporción de gotas pequeñas (boquillas de mas caudal, con inducción de aire, disminuir presión) manteniendo cobertura y volumen a aplicar.

6. Usar mecanismos antideriva (cortinas de aire).

Calidad del agua: Este es un factor que influye en el éxito de una aplicación y que es ignorado en muchas oportunidades, se debe tener en cuenta su pH, presencia de materia orgánica y partículas de suelo.

El agua utilizada para realizar la mezcla puede tener un pH no adecuado para el ingrediente activo que se va a utilizar, pudiendo modificarlo o inactivarlo, lo que reduciría de forma elevada su efectividad.

Las partículas de suelo pueden inmovilizar algunos ingredientes activos, producir desgaste en ciertos elementos del equipo, tapar filtros y boquillas; la materia orgánica también puede ocasionar el taponamiento de estos últimos.

Equipos utilizados para la aplicación de líquidos.

Para la aplicación de productos en forma líquida existen una gran variedad de equipos.

Generalmente se usan los acoplados al tractor (suspendidos o de arrastre), los manuales (de espalda o barra portaboquillas) y los centrífugos.

Los diferentes equipos de pulverización deben estar conformados por un conjunto de elementos, los cuales cumplen una función específica, que garantizan la calidad de la aplicación. Entre ellas tenemos el depósito, la bomba, sistema de filtrado, regulador de presión, manómetro, boquillas, líneas de conducción, barras portaboquillas.

El depósito o tanque: Reservorio donde se coloca el producto con el agua, debe ser de un material adecuado, fácil de recargar, de buena capacidad para mejorar la eficiencia, con un sistema de agitación que mantenga la mezcla homogénea, fácil de limpiar.

La bomba: Elemento fundamental ya que es la que genera el caudal que se transforma en presión a través del confinamiento del líquido en los componentes del equipo. Debe impulsar suficiente caudal para mantener el flujo de retorno y mantener la presión en todas las boquillas, inclusive al cambiarlas por unas de más caudal.

Filtros: Componente que cumple la importante función de retener las impurezas a lo largo del recorrido del líquido a través del equipo hasta llegar a las boquillas. Debería existir un filtrado en secuencia desde el llenado del tanque, pasando por la aspiración de la bomba, luego entre la bomba y la barra portaboquillas (impulsión) y por último el filtro de las boquillas. La forma de catalogar los filtros es por el número de mesh, lo que define su capacidad de filtrar partículas de diferente tamaño. En la tabla 4 se puede apreciar una recomendación de las medidas de los filtros en sus diferentes ubicaciones en el equipo. En la boca de llenado del depósito debe existir un filtro que tenga orificios de 1 mm.

Tabla 4. Tamaño de los filtros (mesh) en las etapas de filtrado según caudal de las boquillas* Caudal boquillas Aspiración Impulsión Boquilla (L/min) <0,2 50 100 200 0,2 - 0,4 50 100 120 0,40 - 0,80 50 100 100 0,75 – 1,25 30 80 80 >1,25 30 50 50 *Valores aproximados, consultar tablas de recomendación del fabricante.

Regulador de presión y manómetro: El regulador permite adecuar la presión a las necesidades específicas de la aplicación. El manómetro indica la presión a la que está trabajando el equipo, debe ser de buena calidad, con una escala que permita la regulación exacta de la presión a la que se necesita trabajar. En la tabla 5 se presentan las equivalencias entre las diferentes unidades de presión.

Tabla 5. Equivalencias entre las unidades de presión Unidad Equivalencia 2 1 kg/cm 14,2 lb/pulg2 1 bar 14,5 lb/pulg2 1 atm 14,7 lb/pulg2 1 Kpa 0,01 kg/cm2 Boquillas: Son las encargadas de pulverizar el líquido a aplicar, además determinan el tamaño de las gotas (junto con la presión de trabajo), la forma y tamaño del chorro, entregan un caudal determinado a una presión establecida. En la figura 7 se pueden observar los tipos de patrones más comunes generados por las boquillas.

Figura 7. Tipos de patrones generados por las boquillas de pulverización.

Las boquillas están clasificadas de acuerdo a las normas ISO por un código de colores que define el caudal que entregan a una presión determinada (3 bar) y un número que indica el ángulo de pulverización.

El fabricante debe indicar en sus manuales el código ISO de colores, tipo de boquilla, ángulo de pulverización, tamaño de gotas generado a diferentes presiones de trabajo. A continuación

se presentan una serie de tablas (tablas 4, 5, 6, 7) con diferentes tipos de boquillas según la codificación ISO 10.625.

Tabla 4. Boquillas de abanico Código F Caudal Color (Abanico) (L/min) 0,05 0,2 Violeta 0,1 0,4 Naranja 0,15 0,6 Verde 0,2 0,8 Amarillo 0,25 1,0 Turquesa 0,3 1,2 Azul 0,4 1,6 Rojo 0,5 2,0 Marrón 0,6 2,4 Gris 0,8 3,2 Blanco 10 4,0 Azul claro 15 6,0 Verde claro Tabla 6. Boquillas cono hueco baja descarga Código H Caudal Color (Cono hueco) (L/min) 0,015 0,06 Verde claro 0,025 0,10 Azul claro 0,037 0,15 Gris claro 0,050 0,20 Violeta 0,067 0,27 Negro 0,075 0,30 Rosado 0,088 0,35 Beige

Tabla 5. Boquillas deflectoras Código D Caudal Color (Deflector) (L/min) 0,5 0,4 Naranja 0,75 0,6 Verde 1,0 0,8 Amarillo 1,5 1,2 Azul 2,0 1,6 Rojo 2,5 2,0 Marrón 3,0 2,4 Gris 4,0 3,2 Blanco 5,0 4,0 Azul claro 7,5 6,0 Verde claro Tabla 7. Boquillas cono hueco alta descarga Código H Caudal Color (Cono hueco) (L/min) 0,1 0,4 Naranja 0,15 0,6 Verde 0,2 0,8 Amarillo 0,25 1,0 Turquesa 0,3 1,2 Azul 0,4 1,6 Rojo 0,5 2,0 Marrón 0,6 2,4 Gris

Existen otros tipos de boquillas, destaca entre ellas la de inducción de aire. Esta tiene un orificio por donde el aire es succionado y mezclado con el líquido, formado gotas grandes con burbujas internas que al llegar al objetivo se rompen en gotas más pequeñas, mejorando la cobertura y reduciendo la posibilidad de deriva.

Las boquillas tienen un tiempo de vida útil, luego del cual deben ser reemplazadas, ya que pierden la forma del orificio, deformando el patrón original y entregando un caudal diferente al nominal. Las de cerámica son las más duraderas, le siguen las de polímeros, las de acero inoxidable y por último las de latón.

De forma general se usan boquillas deflectoras y de abanico para productos pre emergentes, abanico y de inducción de aire para los sistémicos, y cónicas y de abanico para los de contacto. Se debe consultar el catálogo del fabricante para una recomendación más precisa.

Calibración y evaluación de los equipos Es necesario realizar una revisión general de todos los elementos que componen los equipos de aplicación de líquidos antes de realizar cualquier pulverización. Los diferentes procedimientos de prueba señalados a continuación se realizarán con agua limpia. En el caso de los equipos montados al tractor se deben hacer los ajustes necesarios en sus acoples al tractor.

Funcionamiento del manómetro: Se debe comprobar el funcionamiento del manómetro a diferentes presiones, con otro de prueba cerca del sitio donde va colocado. Además, se debe chequear la presión en la barra portaboquillas, en los extremos y en el centro de cada sección (figura 8), tan cerca de la boquilla como sea posible.

Para el caso de los pulverizadores de espalda se debe comprobar la presión en la punta de la lanza cerca de la boquilla (figura 8).

Figura 8. Puntos de comprobación de presión.

Uniformidad de las boquillas: Las boquillas deben entregar un caudal determinado a una presión establecida. Para comprobar este parámetro se realiza el siguiente procedimiento de prueba (Márquez, 1998; FAO, 2001): 1. Se llena el depósito con agua.

2. Ajustar la presión a la recomendada. La prueba debe realizarse a las siguientes presiones: máxima, mínima y recomendada de trabajo.

3. Se deja trabajar el equipo por unos instantes para que se carguen todos los elementos y se estabilice la presión.

4. Luego de estabilizada la presión, recoger y medir el líquido pulverizado por cada una de las boquillas en un tiempo determinado (caudal en L/min). Se deben realizar 5 mediciones por cada boquilla y registrar la media para realizar la comparación.

5. Comparar los datos recolectados para cada una de las boquillas con el valor nominal de esta (valor de fábrica).

6. Las boquillas cuyo valor medido se desvíe en un 10% por exceso o por defecto deben ser reemplazas o chequeadas.

Boquillas con valores superiores pueden ser originados por desgaste del orificio o la boquilla puede ser de mayor caudal que la recomendada. Boquillas con valores inferiores pueden ser originados por taponamiento de esta o de su filtro o la boquilla puede ser de menor caudal que la recomendada.

Patrón de distribución de las boquillas: Para realizar este procedimiento de prueba se utiliza un perfilómetro o banco de distribución (FAO, 2001), con columnas seleccionadoras separadas 100 mm como se observa en la figuras 9 y 10; los pasos son los siguientes: 1. Se llena el depósito con agua.

2. Tomar datos a 2, 3 y 4 bar de presión. Ajustar la presión establecida.

3. Se deja trabajar el equipo por unos instantes para que se carguen todos los elementos y se estabilice la presión.

4. La altura de la boquilla sobre el banco de distribución debería cumplir con las recomendaciones del fabricante relativas a la altura de la boquilla sobre el objetivo. Si no hay recomendación de realizarán las pruebas a 300, 400 y 500 mm de altura para pulverizadores de espalda y a 400, 500, 600 y 700 mm para los acoplados al tractor, medidos desde el borde del banco de distribución hasta el orificio de la boquilla. Realizar tres repeticiones por cada presión y altura seleccionada.

5. Luego de estabilizada la presión y seleccionada la altura, recoger el líquido pulverizado por un minuto o hasta que alguno de los recipientes alcance un 90% de su capacidad.

6. Se calcula el coeficiente de variación de las medidas, el cual no debe ser mayor a un 10%.

Es conveniente realizar un gráfico de los valores para observar en que sector de la barra puede haber problemas de distribución.

Figura 9. Banco de distribución portátil para observar el patrón de distribución del líquido pulverizado.

Figura 10. Patrón de distribución de una barra portaboquillas mostrando el solape (s) necesario entre las boquillas.

En el caso que el coeficiente de variación supere el 10%, se deben realizar los ajustes necesarios para mejorar la distribución, como por ejemplo: estado de las boquillas, distancia entre boquillas, altura de pulverización, horizontalidad de la barra y del banco de distribución.

Volumen a aplicar: El volumen a aplicar es la mezcla del producto diluido con el agua el cual será distribuido en una superficie determinada.

Para pulverizadores montados al tractor, el volumen a aplicar se puede calcular con la siguiente fórmula:

Vol.Aplic.(L/ha) 

Qboq(L/min)  600 V(KPH)  Dboq(m)

donde, Vol.Aplic.(L/ha) : volumen a aplicar en litro por hectárea.

Qboq(L/min) : caudal de la boquilla en litros por minuto.

V(KPH) : velocidad en kilómetros por hora.

Dboq(m) : distancia entre boquillas en metros.

600 : factor de conversión.

 Verificación de la velocidad de trabajo.

La velocidad de trabajo del conjunto tractor-pulverizador tiene influencia directa sobre el volumen a aplicar, inclusive en algunos equipos con asistencia electrónica; por lo tanto, se debe determinar la velocidad de trabajo. Un método sencillo y preciso es el siguiente: 1. Acoplar el pulverizador al tractor y llenar el depósito con agua hasta la mitad de su capacidad.

2. Medir una distancia de 50 a 100 m en un terreno similar al que se va a aplicar el tratamiento.

3. Ajuste las revoluciones de trabajo del motor y seleccione la velocidad en la caja de transmisión, recuerde que las revoluciones de la toma de fuerza deben ser 540 RPM (valor más común para la mayoría de los implementos en Venezuela, verificar).

4. Recorra la distancia marcada, registrando el tiempo en segundos que tarda en recorrerla, debe comenzar el recorrido unos metros antes de la marca inicial de forma que el tractor haya estabilizado la velocidad.

5. Repita la operación 3 veces y calcule la media.

6. Determine la velocidad con la fórmula: distancia (m) Velocidad (km/h)   3,6 tiempo (seg) 7. Realice los ajustes necesarios a la velocidad de trabajo.  Área efectiva de aplicación.

Es el área cubierta por el conjunto tractor-pulverizador, ancho de trabajo (At) multiplicado por la distancia recorrida (Dr). Para el caso de aplicación total el At es el número de boquillas multiplicado por su separación (figura 11); en el caso de aplicación en bandas el At es el

ancho de cada banda. Para el caso de los pulverizadores de espalda hay que tomar en cuenta que al variar la altura de aplicación varía el At.  Volumen aplicado.

Conocido el tiempo que tarda el tractor en recorrer la distancia establecida, se procede a recoger la cantidad de líquido aplicado en ese mismo tiempo, en por lo menos 5 de las boquillas de la barra. Las boquillas deben haber sido chequeadas previamente (procedimiento de prueba de uniformidad boquillas). Repetir el procedimiento 3 veces, obtener el promedio y multiplicar por el número total de boquillas, consiguiendo el volumen total aplicado. Si es el caso de una sola boquilla (pulverizadores de espalda), este será el volumen aplicado o se puede medir el volumen gastado en el depósito del pulverizador.  Volumen aplicado por hectárea.

Se relaciona el volumen aplicado en el área efectiva de aplicación con una superficie de una hectárea y se compara con el volumen a aplicar recomendado.

Figura 11. Área efectiva de aplicación para el cálculo del volumen a aplicar, pulverizador montado en el tractor y de espalda.

Para efectuar correcciones al volumen a aplicar se puede variar la velocidad de trabajo, aumentar o disminuir la presión y/o cambiar las boquillas. Se debe hacer la modificación de un parámetro a la vez y verificar nuevamente el volumen de aplicación hasta llegar al recomendado.

Distribución de la aplicación: Para la evaluación de la calidad de la distribución de la aplicación de un producto se utilizan diferentes métodos o combinación de estos, entre ellos tenemos:  Trazadores fluorescentes: son aplicados sobre los objetivos y luego medidos por fluorometría, son susceptibles a la degradación por la radiación solar.

 Trazadores metálicos: no son susceptibles a la degradación por la radiación solar, para cuantificarlos se hacen lavados de las hojas o de los objetivos artificiales y se determinan las cantidades de producto por unidad de superficie a través de la conductividad eléctrica.  Micronutrientes marcados: se han utilizado zinc, manganeso, cobre, entre otros, las cantidades depositadas sobre los objetivos son lavadas y determinadas por espectrometría y colorimetría.  Colorantes: se usan colorantes solubles en agua que son aplicados sobre los objetivos y luego analizados ópticamente.  Objetivos artificiales: se han utilizado papel hidrosensible, papel sensible al aceite, láminas de plástico con vaselina o rociadas de silicona, trozos de cristal o de espejo, cápsulas de Petri, papel adhesivo, entre otros. Generalmente son analizados ópticamente a través de fotografías o escáner, para luego estudiar la distribución de la aplicación con lupas, microscopios o programas de análisis digital de imágenes.

El uso de trazadores fluorescentes, metálicos y micronutrientes es costoso y requiere de equipos de laboratorio de cierta magnitud. Para el uso de los objetivos artificiales se requiere de la colocación de estos según sea el equipo y el objetivo a alcanzar (figuras 12, 13, 14, 15).

Figura 12. Ubicación objetivos artificiales con pulverizadores montados al tractor y aplicación al suelo u objetivos sobre el suelo.

Figura 13. Ubicación objetivos artificiales con pulverizadores de espalda o centrífugos y aplicación al suelo u objetivos sobre el suelo.

Figura 14. Ubicación objetivos artificiales con pulverizadores montados al tractor y aplicación a objetivos sobre plantas arbóreas.

Figura 15. Ubicación objetivos artificiales con pulverizadores aéreos.

Es conveniente enumerar los objetivos artificiales de manera de identificar su posición y realizar un correcto análisis de la distribución de la aplicación. Los objetivos artificiales pueden ser colocados sobre soportes rígidos, horizontal o verticalmente tomando en cuenta el posible desplazamiento de las gotas por la inclinación de este.

Para el caso de papel hidrosensible, no deberá ser colocado sobre soportes mojados o húmedos, se deben recoger inmediatamente después que las gotas hayan secado.

Existe la posibilidad de plantear la comparación de tratamientos (diferentes equipos, boquillas, volúmenes de aplicación, entre otros) para observar como es la distribución de una pulverización (tamaño de gota, gotas/cm2, alcance de la distribución, sobredosificaciones, subdosificaciones) se deberá realizar el análisis estadístico de los datos de distribución de la aplicación en dependencia del diseño experimental seleccionado, completamente al azar, bloques al azar, parcelas divididas, entre otros.

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Capítulo 10 TÉCNICAS PARA LA EVALUACIÓN DE RESISTENCIA A HERBICIDAS Cástor Zambrano Universidad Central de Venezuela Introducción La confirmación de casos de resistencia con el uso de metodologías científicamente aceptadas es un paso inicial y fundamental para afrontar el problema de resistencia; pues producto de ésta se podrán idear estrategias de manejo aplicables en los campos de los agricultores.

En la literatura es posible encontrar variada información sobre los modelos estadísticos y las curvas de dosis-respuesta, además de una nutrida cantidad de publicaciones de alto nivel donde se aplican los principios teóricos enmarcados en la comparación de poblaciones susceptibles contra poblaciones “posiblemente resistentes” sometidas a dosis crecientes de herbicidas, y de allí la estimación de un índice de resistencia Pero los casos de resistencia crecientes en forma exponencial demandan a nivel mundial, regional y local, la incorporación de nuevos talentos que comienzan a aplicar, algunos en forma errada, diversas metodologías, muchas veces por falta de experiencia e información sobre consideraciones y herramientas prácticas, las cuales deben ser tomadas en cuenta para garantizar resultados confiables.

El propósito de este capítulo es ofrecer una serie de consideraciones prácticas y herramientas metodológicas a investigadores que recién se inician en esta área, con la finalidad de unificar criterios en las diferentes etapas que deben cumplirse en la evaluación de la resistencia de malezas a herbicidas; entre ellas se encuentran: colección de semillas en campo y manejo en el laboratorio; diseño, instalación y manejo de los ensayos de dosis-respuesta, análisis estadístico, etc.

Consideraciones al momento de colectar las semillas en campo: - Nivel de control de las plantas de malezas, debe considerarse que en la medida en que la tasa de mortalidad de malezas sea mayor, igualmente mayor es la presión de selección que ejerce el herbicida.

- La presencia de malezas solas al lado de plantas muertas podría indicar la presencia de individuos R (resistentes).

- Historial de los lotes: esta información es fundamental para tener una idea inicial sobre la existencia, naturaleza y magnitud del problema; por tanto se recomienda hacer una pequeña encuesta que en términos generales incluya las siguientes preguntas:  ¿cuál herbicida aplicó?  ¿se aplicó la dosis correcta del herbicida?  ¿lo hizo en el momento adecuado?  ¿las condiciones antes y después de las aplicaciones eran “ideales”?  ¿por cuántos años o ciclos de cultivo ha usado el herbicida?

1

     

¿lleva registros del manejo de cada uno de sus campos? ¿éste herbicida se aplica para controlar esta especie y/o además para controlar otras especies? ¿las controló o no? ¿los campos están nivelados? ¿cuenta con la cantidad de agua suficiente para irrigar a tiempo sus campos? ¿qué fuente de agua usa?

Debe tenerse en cuenta que herbicidas con mecanismos de acción muy específicos, amplio espectro de control, dosis bajas y altamente eficaces, son productos que tienden a generar resistencia más rápido.

- Manchas en el campo podrían indicar poblaciones R, normalmente cuando se alcanza una proporción de aproximadamente un 30 % de los individuos resistentes, es cuando el productor se percata de la falla en el control (manchones y/o escapes); quiere decir que el proceso está bastante avanzado (Fischer, com. per)1.

- Recolección de semillas: a. Madurez fisiológica: en la mayoría de los casos un buen indicativo de madurez fisiológica, consiste en que las semillas puedan desprenderse con cierta facilidad de la estructura que las une a la planta. b. Selección del área para la recolección: se recomienda iniciar la recolección en los manchones y/o escapes de malezas, siempre tratando de ir del centro hacia los bordes; y evitando aquellos manchones ubicados en sitios donde el campo presente una condición particular que lo haga diferente al resto del mismo (algún bajío, una loma, una escape en franja típico de un error de aplicación, etc.). c. Cantidad de semilla: se recomienda recolectar la mayor cantidad posible; como referencia, Martinez (com per)2 señala que 1000 semillas de Sorghum halepense pesan unos 3,6 g. Por otra parte Blanco (com per)3 afirma que 1000 semillas de Ischaemum rugosum pesan unos 7,5 g., y que para un bioensayo de dosis-respuesta con la misma especie con 8 dosis, 10 repeticiones y 6 – 8 plantas por recipiente, se necesitan unas 1520 semillas (11,4 g) con un 50% de germinación. d. Evite cosechar semillas húmedas: si no tiene otra alternativa, luego de la recolección coloque un ventilador (soplador de aire) frente a las semillas al menos 24-48 horas. e. No almacenar en bolsas plásticas: aún cuando las semillas estén lo suficientemente secas; recuerde que la semillas son una estructura viva que respira y, por ende, el material plástico atenta contra la calidad de las semillas. f. Rotule adecuada y oportunamente las bolsas: errores relacionados a confusión de bolsas luego de la recolección generan dudas y finalmente los resultados no serán confiables. g. Secar con aire natural tan pronto sea posible.

1

Albert Fischer; PhD. Profesor Asociado, Universidad de California-Davis, USA. Mariano Martínez; Estudiante Tesista, Laboratorio de Malezas, Facultad de Agronomía. Universidad Central de Venezuela.

3 Solsiré Blanco; Estudiante Tesista, Laboratorio de Malezas, Facultad de Agronomía. Universidad Central de Venezuela.

2

2

h. Limpiar las semillas. i. Punto de georeferencia (coordenadas): esta consideración es muy importante, pues con ello se ubica en un mapa y por consiguiente se le puede hacer seguimiento en el tiempo.

Instalación de ensayos para la detección de poblaciones resistentes a herbicidas: - Sitio y condiciones donde se llevará a cabo el bioensayo: Un aspecto fundamental en cuanto al establecimiento de un bioensayo para el estudio de resistencia, es garantizar sobre todo la radiación, temperatura, fuente de agua de calidad y substrato apropiados.

Particularmente la radiación debe ser monitoreada durante el desarrollo del bioensayo, más aún si se están utilizando moléculas inhibidoras de la ALS (AHAS) como por ejemplo las sulfonilúreas. Probablemente si se realiza una corrida de dosis-respuesta en el período lluvioso (días nublados con limitada radiación), con toda seguridad obtendrá resultados muy diferentes a los que obtendría en durante el período seco (días con escasa nubosidad).

La temperatura afecta notablemente los procesos metabólicos de la planta; además, en nuestro caso por encima de 50C, se pudiese estar agregando un factor estresante adicional al que se plantea considerar con las diferentes dosis.

En el caso del agua, la presencia de carbonatos y restos de materia orgánica, por ejemplo, podrían estar afectando la eficacia de la molécula objeto a estudio; por lo tanto se recomienda realizar un análisis de calidad de agua para descartar esta fuente de variación.

El substrato debe tomarse en consideración sobre todo en función de su naturaleza: suelo, substrato sintético. Por ende, si se usa suelo, un análisis de macro y micro nutrimentos es importante sobre todo para descartar sales y/o realizar las respectivas correcciones de posibles deficiencias nutricionales que pudiesen generar cierto grado de estrés en la maleza.

Si es el caso del uso de un substrato de origen sintético, debe considerar lavarlo con suficiente agua antes de realizar la siembra o trasplante del material vegetal; y obligatoriamente debe considerar el suministro de nutrimentos bien sea por fertirriganción o aplicaciones constantes de soluciones nutritivas tipo Hogland.

- Métodos utilizados para la ruptura de latencia y producción de plántulas uniformes: Un componente importante del control local en este tipo de experimentos, además del ambiente bajo el cual se desarrolle el bioensayo, consiste en garantizar plántulas lo mas homogéneas posibles, situación de la cual depende en alto grado la confiabilidad de sus resultados. En algunos casos, como los planteados por Pérez (2009) y Fardella (2008) se ha tenido que plantular malezas tal y como se hace en los sistemas de producción forzada de hortalizas, y en otros se han aplicado técnicas de escarificación mecánica usando papel lija, inmersión de semillas en fiolas con constante suministro de oxígeno, uso de soluciones ricas en KNO3, temperaturas variables, escarificación química con H2SO4, y escarificación manual 3

e, incluso, en la mayoría de los casos el objetivo se cumple combinando alguno de los métodos citados anteriormente.

Otra razón importante por la cual conocer particularmente el mejor método o la combinación de los mismos para la ruptura de la latencia, es la economía de las semillas de biotipos o poblaciones, que en algunos casos puede llegar a ser un factor limitante.

A continuación se citan algunos ejemplos relacionados con la aplicación de algunos métodos de ruptura de latencia en biotipos asociados a la detección de resistencia: Espinoza (2004) trabajando con biotipos R de Echinochloa colonum aplicó en primera instancia la escarificación mecánica con un envase de vidrio de 0,5 litros en la cual la parte interior del envase se forró con papel de lija número 120, se introdujeron las semillas y se procedió a un movimiento circular manual. Después de este tratamiento, las semillas se colocaron en unas fiolas de 250 ml con agua, las cuales tenían un sistema de aireación (motores para peceras con mangueras que finalizaban con una aguja de inyectadota o piedra porosa), con la finalidad de oxigenar el agua y, con la presión generada, permitirle un movimiento continuo a las semillas durante tres días para remover posibles sustancias inhibidoras de la germinación; posteriormente se colocaron las semillas sobre papel húmedo en bandejas dentro de una estufa y se usaron diferentes temperaturas por tres días (primer día a 55 °C, el segundo a 32 °C y el tercero por 6 horas a 28 °C), aplicando agua continuamente; posteriormente estas semillas germinadas fueron colocadas en la cámara de germinación para que recibieran luz artificial.

Por su parte, Delgado (2004) y Delgado et al. (2008) al evaluar la resistencia de biotipos de Rottboellia cochinchinensis, separaron manualmente la semilla del artículo de todas la poblaciones que utilizaron.

Fardella (2008) y Araujo (2008) al trabajar con semillas de diferentes biotipos de Ischaemum rugosum, en primera instancia utilizaron la escarificación mecánica igual a la previamente descrita para E. colona, se oxigenaron, posteriormente se lavaron las sustancias inhibidoras de germinación del material sometiéndolas a una corriente de aire con agua destilada y una solución de KNO3 al 2% durante 2 días (tiempo que tarda la radícula en aparecer), cambiando el agua de las fiolas cada 24 horas. Una vez germinadas fueron colocadas en bandejas de germinación con sustrato inerte en la cámara de germinación durante dos (2) días a una temperatura de 30º C. Pérez (2009), Zambrano y Medina (2006) utilizaron una metodología similar a Espinoza (2004)en semillas de poblaciones de Echinochloa colonum, pero una vez germinadas las semillas se colocaron en las bandejas de germinación para su plantulación tal y como lo realizó Fardella (2008). Por su parte, Ortíz (com. per.)4 de acuerdo a la ISTA (2004), al trabajar con poblaciones de Echinochloa oryzoides utilizó ácido sulfúrico puro (95-98%) por 20 minutos, luego eliminó el ácido sulfúrico en un colador de orificios muy pequeños lavando cuidadosamente con agua y al final se pasaron por una solución al 2% de carbonato de calcio por un minuto.

4

Aída Ortíz; MSc. Profesora Agregado, Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela.

4

Si se cuenta con suficiente número de semillas y la latencia no es tan marcada y/o escalonada, se procede entonces a pre-germinar las semillas y colocar en los recipientes plásticos (materos) en cantidad suficiente para su posterior raleo.

- Consideraciones sobre dosis (S) y (R), número de réplicas y duplicación de bioensayos: La dosis juega un papel protagónico en este tipo de ensayos, de hecho su nombre es bioensayos dosis-respuesta, por lo tanto, deben seleccionarse cuidadosamente basadas en ensayos preliminares, pues el rango de dosis va a depender de cuan susceptible (S) o resistente (R) sea la población objeto a estudio.

Los ensayos preliminares se llevan a cabo con la finalidad de, en primer término, conocer la respuesta de las poblaciones recolectadas a 0X ,½ X y 1X (donde X se considera como la dosis comercial recomendada por el fabricante del herbicida). El testigo 0X se debe aplicar con agua + el coadyuvante que se va a aplicar con el herbicida. Se pueden “etiquetar” las poblaciones en posiblemente resistentes (aquellas poblaciones que sobrevivan a la dosis comercial utilizada) y susceptibles. En este punto se recomienda hacer un análisis de varianza (ANAVAR o ANOVA) y su respectiva prueba de medias, entre los tratamientos para cada una de las poblaciones seleccionadas. Si estadísticamente no hay diferencias entre los tratamientos, es decir 0X y 1X son iguales, existe alta probabilidad de que dicha población tenga problemas de resistencia.

Un segundo objetivo de los preliminares es la determinación de las dosis que generen una cantidad de puntos suficientes, ubicados de tal forma que permitan hacer un buen análisis de los datos. En este sentido, se considera particularmente importante tener dosis que generen puntos suficientes en la pendiente de la curva, pues de esto depende que el modelo indique la dosis que reduce en un 50% la variable evaluada (ED50), parámetro con el cual se determina el índice de resistencia (IR). Es importante considerar que el rango de dosis para ambas poblaciones no siempre es la misma, y es allí donde cobran importancia los ensayos preliminares.

Un análisis confiable depende en gran medida de la población que se use como susceptible “S”. Se recomienda utilizar poblaciones susceptibles provenientes de la misma zona agroecológica de donde se obtuvieron las poblaciones sospechosas de resistencia. Pero no siempre eso es posible, entonces el investigador debe prever el desarrollo de una línea pura homocigota susceptible, la cual sea producto de sucesivas autofecundaciones, si la especie lo permite; sino, se genera una población con varias generaciones de endocruza entre un número limitado de individuos. Fischer1 (com. per.) plantea que además esta consideración debe tenerse en cuenta incluso para las poblaciones ya determinadas como resistentes, pues se requieren líneas puras homocigotas para estudios metabólicos y moleculares.

Por lo general, se recomienda utilizar un factor de dilución constante, lo cual genera puntos equidistantes en un eje (X) logarítmico (Streibig et al, 1993); aún cuando, dependiendo la naturaleza de los datos y si así lo estima el conocimiento previo de la población, se pueden agregar dosis para incrementar la potencia del análisis (sobre todo en lo que respecta a la pendiente de la curva), aprovechando el alcance que brinda el modelo de regresión no lineal.

5

Un rango de dosis frecuentemente utilizado para poblaciones sospechosas de resistencia es 0 x; 1/16x; 1/8x; 1/4x; 1/2x; x; 2 x y 4x; aunque frecuentemente el rango de dosis utilizado para el susceptible debe ser diferente. En tal sentido, por lo general para la población “S” se usa 0x; 1/64x; 1/32x; 1/16x; 1/8x; 1/4x; 1/2x; x; y 2x.

En la Fig. 1 se observa una respuesta diferencial entre la población control y aquella que fue objeto de estudio (Guárico). En este caso Fardella (2008) utilizó para la población control el siguiente rango de dosis: 0X; 1/128X; 1/64X; 1/32X; 1/16X; 1/4X; X; 2,5X y 3,5X; mientras que para la población Calabozo usó: 0X; 1/32X; 1/16X; 1/4X; X; 2,5X y 3,5X. Además, se observa que existen puntos que se generaron a partir de dosis a lo largo del trazado de la curva (incluso en la pendiente), esto producto de 2 ensayos preliminares para ajuste de dosis.

120

P eso freco (% de no tratado)

100 80 60 40 20 0

0 .0 0 1

0 .0 1

0 .1

1

10

100

1000

B is p irib a c (g . i.a /h a ) V a lo re s o b s e rv a d o s Is c h a e m u m c o n tro l V a lo re s o b s e rv a d o s Is c h a e m u m G u á ric o

Figura 1. Efecto de dosis crecientes de bispiribac sodio sobre el peso fresco de las poblaciones control (susceptible) y Guárico (Fardella, 2008).

Si la cantidad semillas de la población objeto a estudio lo permite, es recomendable utilizar doble batería de testigos (0x), pues es el punto inicial de comparación en la respuesta de una misma población a dosis crecientes de herbicidas (Valverde, com per)5.

Los estadísticos plantean que en la medida en que se aumente el número de replicas el error experimental disminuye, lo cual genera entonces la necesidad de trabajar con el mayor número posible de las mismas. Bajo condiciones normales de trabajo en cuanto a espacio y recursos se considera razonable utilizar entre 6 y 9 replicas por tratamiento. Claro está, si se trabaja con poblaciones homocigotas recesivas generadas por el investigador producto de autofecundaciones, donde la variabilidad es relativamente manejable; el número de replicas puede disminuirse. Normalmente se requiere hacer el análisis directamente a poblaciones colectadas en campo; acá hay una variabilidad enorme, lo cual sugiere que se incrementen al mayor número posible las réplicas para poder tomar decisiones con datos que “hagan mucho ruido” previos al análisis estadístico. En algunas ocasiones, partiendo del conocimiento de la 5

Bernal Valverde; PhD. Idea Tropical. San José, Costa Rica.

6

o las poblaciones bajo estudio, y bajo ciertas limitantes (espacio, numero de semillas, etc) se puede pensar incluso en sacrificar repeticiones e incrementar el número de dosis en el ensayo (Valverde, com per)5.

- Consideraciones sobre capacidad de materos, número de plántulas a utilizar por unidad experimental y estado de desarrollo de las mismas: Para la evaluación de gramíneas anuales con herbicidas post-emergentes sistémicos se usan frecuentemente recipientes (materos) de 0,5 a 1 kg de capacidad, en el cual se siembran o trasplantan de 5 a 10 plántulas para dejar finalmente al momento de la aplicación de 1 a 4 plántulas por unidad experimental. Es importante considerar que al momento de hacer el raleo, se dejen en la medida de lo posible plantas equidistantes entre sí, para corregir el posible efecto paragua en la aplicación del herbicida que se pudiese generar en aquellos recipientes con más de una plántula.

Otro factor a considerar es el estado óptimo de desarrollo de las plántulas para la aplicación del herbicida; acá, el criterio producto de la experiencia del investigador juega un papel importante, además de que en muchos casos es necesario hacer un bioensayo preliminar para determinar el momento óptimo de aplicación. La información que provee el fabricante puede usarse como de referencia; aunque generalmente en herbicidas post-emergentes sistémicos graminicidas el estado óptimo de desarrollo para la aplicación es de 3 a 4 hojas.

- Equipos y metodología de aplicación: La aplicación de los tratamientos en los bioensayos de dosis-repuesta confiables, debe realizarse garantizando: presión, velocidad, descarga y altura constante. La calibración debe hacerse al menos cada vez que se vaya a cambiar de dosis y se sugiere la preparación por separado de cada una de las soluciones herbicida que represente una réplica o al menos un grupo de ellas, bien sea mediante el uso de soluciones madres ó directamente con micropipetas tratando en lo posible minimizar un error al momento de su preparación, pues significaría un fracaso en el bioensayo. Cuando realice los cálculos, es saludable que terceros revisen los mismos; cada dosis debe ir en el recipiente del equipo a la mitad de su valor y al momento de hacer la aplicación considere hacerla de ida y vuelta, para alcanzar la concentración estimada.

- Variables a evaluar y metodología para la toma de resultados (tiempo): Para cuantificar el efecto de un herbicida sobre la fisiología de la maleza, debe evaluarse el peso fresco de la misma; pues si bien puede generar por si misma una variabilidad enorme, es quien refleja en mayor grado el efecto sobre la planta. Lo antes expuesto genera la necesidad de aleatorizar el muestreo para repartir entre todos los tratamientos el error que se genera producto de su naturaleza.

La evaluación se hace dependiendo de la naturaleza del herbicida y de la especie de maleza objeto a estudio, aunque para herbicidas post-emergentes sistémicos graminicidas se ha estandarizado que 22 días luego de la aplicación es el tiempo necesario para hacer una apreciación bien ajustada a la realidad. No obstante, hay especies como Eleusine indica en el 7

caso de evaluar glifosato o Fimbristylis miliacea en el caso de pirazosulfuron-etil, en las cuales el rebrote de plantas prácticamente muertas debe ser considerado.

Análisis estadístico: Ensayos de dosis-respuesta: el concepto de dosis-respuesta en la ciencia de la maleza consiste en una cantidad de herbicida que genera un efecto deseable en una población de plantas de interés (Streibig et al, 1993).

Típicamente la forma de la curva de dosis-respuesta es sigmoidal. Con un límite superior definido por la respuesta de las plantas no tratadas (control), o de las plantas tratadas con una dosis muy baja de herbicida, y un límite inferior determinado por la respuesta de una alta dosis de herbicida. La dosis correspondiente al punto medio entre el límite superior e inferior es conocido como el ED50 (Streibig, 1988).

El modelo comúnmente usado es el log-logístico de tres y cuatro parámetros. La ecuación de cuatro parámetros es la siguiente:

yc

d c 1  expb(log( x)  log(e)))



donde, e=ED50, d=límite superior, c=límite inferior y b es la pendiente alrededor de e. Si c es igual a cero, entonces la ecuación se reduce a tres parámetros, y cuya ecuación es la siguiente:

y

d 1  expb(log( x)  log(e)))



Otras ecuaciones utilizadas en este tipo de ensayos son las de Weilbull para cuatro y tres parámetros; la diferencia entre éstas y las anteriormente descritas radica en que el modelo de Weilbull no es simétrico en ningún punto. En tal sentido se muestran a continuación, Weilbull de cuatro parámetros:

y  c  (d  c) exp expb(log x  e

Weilbull de tres parámetros:

y  d # exp expb(log x  e

Otro de los modelos utilizados en algunos bioensayos es el de Brian Cousens para el análisis de bioensayos donde ocurre la “Hormesis”, fenómeno donde a dosis bajas existe un incremento en la variable independiente y con el posterior incremento de la dosis, los valores decrecen. La modificación se realiza en la ecuación de cuatro parámetros, con la adición de un término “f” en el numerador:

y  c  d  fx  c / 1  expblog x  log e  8

a) Simétrica

b.1) Asimétrica rápido descenso

b.2) Asimétrica lento descenso

b.3) Asimétrica estimulación inicial del crecimiento

Figura 2. Curvas simétricas y asimétricas de dosis-respuesta. Adaptado de Knezevic et al.

(2007).

Debido a la naturaleza de estos bioensayos y al exhaustivo control local que debe establecerse, el diseño comúnmente utilizado por los investigadores es el completamente aleatorizado, el cual es recomendado por los estadísticos para ensayos que se llevan a cabo bajo condiciones controladas.

Herramientas disponibles para el análisis de datos: - SAS®: bajo este software se pueden analizar los datos de un ensayo dosis-respuesta, pero existen dos limitantes importantes, la primera de ellas la constituye el alto precio del programa; y en segundo lugar es bastante tedioso el manejo del mismo.

- R®: El programa para análisis estadístico R® (R Development Core Team, 2009) es una licencia gratuita que ha sido desarrollado con la colaboración de una gran cantidad de personas que contribuyen en el desarrollo y prueba de diferentes paquetes para diversos tipos de análisis. Toda la información necesaria, así como los manuales de uso de esta herramienta estadística puede ser consultada en la web http://www.r-project.org/.

Para el caso particular de el estudio de curvas de dosis respuestas se ha desarrollado el paquete ´drc´ (dose-response curve), el cual posee una serie de ventajas sobre otros paquetes estadísticos, ya que ha sido diseñado específicamente para este tipo de análisis y facilita el cambio de opciones para el estudio del ajuste del modelo a los datos disponibles; sin embargo, es necesario estudiar a profundidad el lenguaje en el que se desarrolla R® y las opciones que el mismo posee para realizar el análisis. El programa posee limitaciones en cuanto a su accesibilidad, ya que no es “amigable” para el usuario, pero después de su estudio y utilización constante, el mismo es capaz de generar reportes de análisis sencillos y fáciles de comprender, además de gráficos muy apropiados a este 9

tipo de análisis. Una descripción de las potencialidades de R para el análisis de curvas dosis respuesta puede ser consultado en “Utilizing R software package for dose-response studies: The concept and data analysis” (Weed Technology, 2007, 21:840–848), así como en “Bioassay Analysis using R” (Journal of Statistical Software, January 2005, Volume 12, Issue 5 - http://www.jstatsoft.org/).

Como referencia de un modelo de programación para el análisis de una curva de dosis respuesta se presenta el siguiente:

library(drc) library(agricolae) nombre de la curva <-read.csv("ubicación del archivo (.csv) en el computador") nombre de la curva (para verificar que los datos fueron leídos correctamente nombre del modelo <- drm(peso ~ dosis, fct = LL.4(), data = nombre de la curva) summary(nombre del modelo) modelFit(nombre del modelo) plot(nombre del modelo, xlab = "etiqueta de x", ylab = "etiqueta de y") ED(nombre del modelo, c(10, 50, 90))

En este caso se subrayan aquellas líneas en las cuales el operador del programa decide los nombres o valores que desea colocar como referencia de su análisis. Los datos se colocaron en dos columnas, cuya primera fila se corresponde con el nombre de las variables; en este caso “peso” y “dosis”; además deben ser guardados bajo el formato .csv (separados por comas). Esta programación esta hecha para el ajuste de los datos a un modelo de cuatro parámetros [LL.4()], pero puede utilizarse el modelo de preferencia, de acuerdo a los que dispone el paquete `drc`. También se incluyen las instrucciones para generar el gráfico correspondiente al modelo generado.

- SigmaPlot®: El primer paso para la corrida de los datos bajo este software es la organización de los datos, para ello se colocan las columnas Dosis, Peso fresco, % con respecto al control no tratado, Promedio y Error Estándar. Los datos pueden ser transcritos directamente en las celdas del SigmaPlot® o copiados de la hoja de cálculo de Excel.

El objetivo de usar el % con respecto al control no tratado es facilitar la presentación comparativa de los datos, aun cuando hay investigadores que prefieren hacer los cálculos de la regresión Log-logística con los datos originales (con la finalidad de preservar la estructura del error) y usar los datos de % solo para presentar los gráficos.

Las barras de error estándar se colocan para dar una idea al lector de cuan variable eran los datos alrededor de una media para una dosis determinada; aunque Streibig (com. per) 6 plantea que el análisis correcto de los datos en una regresión no lineal parte de que el error estándar debe ser tan bajo que no tiene mucho sentido calcularlo y presentarlo.

Un segundo paso consiste en seleccionar en (Statistics) la opción (Regression Wizard), y luego seleccionar (Four Parameter Logistic Curve) y en la misma ventana debe seleccionarse (Edit Code), al desplegarse esta ventana se deben constatar los siguientes aspectos:

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Carl Jens Streibig; PhD. Profesor Asociado, Universidad Real de Dinamarca.

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(Equation): f = min + (max-min)/(1+(x/EC50)^Hillslope) fit f to y ''fit f to y with weight reciprocal_y ''fit f to y with weight reciprocal_ysquare (Variables): x = col(1) y = col(3) (Initial parameters): min = min(y) ''Auto {{previous: 10}} max = max(y) ''Auto {{previous:100.0000}} {{previous: 100.726}} EC50 = x50(x,y) ''Auto {{previous: 6.7012}} Hillslope = if((y[1]-y[size(y)])/(x[1]-x[size(x)])>0,-1,1) ''Auto {{previous: 0.709439}} (Constrains): min>10 (Options): (Iterations): 200 (Step Size): 10 (Tolerance): 0.000001 Una vez terminado el chequeo se presiona (Run) Se despliega una ventana de (Regression Wizard), donde es importante chequear que se muestre el aviso siguiente (Converged, tollerance satisfied), luego debe presionarse el cuadro (Next). Posteriormente se despliega una ventana, donde a mano derecha debe estar seleccionada o seleccionar (Create Report) y luego presionar (Next). En la nueva ventana a mano izquierda aparece un grafico de ejemplo y a mano derecha de todas las opciones debe estar seleccionada (Create New Graph) y luego pulse (Next).

Luego se despliega otra ventana titulada (Regression Wizard- Graph data), allí vaya a la ventana (Curve Data column) y sobre la opción (X column) mueva el ratón hacia la ventana donde se visualizan los datos y seleccione la columna 6, e inmediatamente observará que aparece (X column: column 6). Haga la misma operación para (Y column) y seleccione la columna 7. Posteriormente seleccione (Finish).

Inmediatamente se despliega su primer gráfico (figura 3), y a mano izquierda en la página principal notará que ha desplegado: una ventana de datos (Data 1), el reporte de los datos estadísticos del análisis (Report 1) y el gráfico mencionado anteriormente (Graph 1). En cuanto el reporte allí podrá constatar: R; Rsqr; Adj Rsqr; Standard Error of Estimate , también podrá ver la probabilidad (significancia) de cada uno de los parámetros de la ecuación: min; max; EC50 y Hill slope, y finalmente el análisis de varianza de la regresión, donde es importante chequear la probabilidad de la misma Regression 3; así como también algunas pruebas estadísticas conocidas. Del mismo modo al ver en la ventana (Data 1) podrá 11

constatar que en la columna 6 y 7 se observan una cantidad grande de datos (producidos por el modelo). En este punto es muy importante que chequee que el primer dato de la columna (6 x-column) no sea cero (0), si lo reporta así, cambie ese cero por un valor menor o igual a 0,001, y eso mismo debe hacerlo en la columna de dosis. Esto debido a que posteriormente se va a dar la instrucción al programa que transforme el eje X de lineal a logarítmico, y al haber ceros el programa da un error.

2D Graph 1 140 120 100

Y Data

80 60 40 20 0

0

50

100

150

X Data x column vs y column Col 1 vs Col 3

Figura 3. Figura de datos hipotéticos con ejes X y Y lineales Es importante destacar que el valor de EC50 mostrado en el (Report 1), es el valor de X (la dosis de herbicida) en el punto de inflexión de la curva sigmoidal cuando el valor min: 0 y el max: 100; si estos preceptos se cumplen se puede decir con seguridad que el EC50 es la dosis herbicida que reduce en un 50 % el crecimiento de una población.

Ahora si las asíntota son diferentes (min>0), necesariamente debe utilizar un artificio matemático que le permita obtener el valor de X cuando Y= 50; el cual lo obtiene de la ecuación: f = min + (max-min)/(1+(x/EC50)^Hillslope)

De estos tendría en el (Report 1), min: 0 ; max: 100; Hill slope: ver valor en el Report 1; EC50: ver valor en el Report 1; f: 50 ; y solo restaría despejar X de la ecuación, quedando de la forma siguiente:

 max  min  x  E 50   hillslope  1  f min    La mayoría de los trabajos presentan errores en este sentido, lo cual genera valores errados de índice de resistencia (IR).

Otro punto que siempre se debe tener en cuenta es que al chequear las probabilidades de los parámetros antes citados, en algunos casos puede existir cierta anomalía (no significancia) en alguno de ellos. Considerando que en la mayoría de los casos se trabajan con poblaciones recolectadas en campo y ensayadas directamente, no es un asunto tan grave (claro está, aquí juega un papel importante la experiencia del investigador, pues al 12

ver los datos y la curva, se puede tomar la decisión de cuan grave puede ser el detalle mencionado anteriormente), lo importante en un caso donde ocurra esto y se decida hacer caso omiso, es hacer mención en los resultados (pues así el lector hará su propio juicio sobre la veracidad de lo publicado).

Una vez chequeados los parámetros antes mencionados con la ventana (Graph 1) desplegada, mueva el ratón a las opciones que se encuentran en la parte superior de la página y seleccione (Graph) y una vez desplegada una pequeña ventana seleccione (Create Graph), en la ventana (Create Graph type) debe seleccionar (Scatter Plot) y luego pulse (Next), en la siguiente ventana seleccione (Multiple Error Bars) y pulse (Next); en la siguiente ventana en la sección (Symbol values) debe seleccionar (Worksheet Columns) y pulse (Next); en la siguiente ventana seleccione (XY Pairs). Ahora en la ventana desplegada debe seleccionar en la sección (Selected Columns) (X1:), en ese momento muévase a la página de los datos y sombree todos los valores colocados en la columna de las dosis; automáticamente queda seleccionada en la ventana pequeña (Y1:), en ese momento seleccione todos los valores colocados en la columna de los promedios; y luego le aparece en la ventana pequeña seleccionada también la opción (Y error 1:) y allí sombrea en los datos la columna correpondiente al error estándar; y finalmente seleccione (Finish), produciéndose el siguiente gráfico (figura 4).

2D Graph 4 120 100

Y Data

80 60 40 20 0

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

X Data Col 1 vs Col 4

Figura 4. Errores estándar de valores hipotéticos.

Posteriormente, seleccionando el gráfico de los errores estándar, mueva el ratón a la parte superior de la página principal y seleccione (Graph) y en esta ventana pulse (add plot), seleccione (line plot) y pulse (next), luego seleccione (Simple straight line) y pulse (next), luego selecciones (XY pair) y pulse (next), y posteriormente colocado sobre (X:) seleccione en la página (Data 1) toda la columna (6-X column), y repita la misma operación para (Y:) y selecciones toda la columna (7-Y column) y luego pulse (Finish).

Inmediatamente le aparece sobre el gráfico de los errores estándar, un gráfico de líneas que representa los valores modelados (figura 5) 13

2D Graph 4 120 100

Y Data

80 60 40 20 0

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

X Data Col 1 vs Col 4 x column vs y column

Figura 5. Valores modelados y los respectivos errores estándar de los valores observados hipotéticos.

Finalmente, seleccione el gráfico mostrado anteriormente y mueva el ratón a la parte superior de la página principal y pulse (Graph), luego seleccione (Graph Properties) y en la parte superior de la ventana pulse (axes); en la parte superior en (Axis) seleccione (X data) y en la parte izquierda pulse (Scaling), inmediatamente vaya a la opción (Scale type) y seleccione (log common) y pulse (apply) y luego seleccione (Ok) (figura 6) 2D Graph 4 120 100

Y Data

80 60 40 20 0

0.0001

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

X Data Col 1 vs Col 4 x column vs y column

Figura 6. Curva sigmoide de datos hipotéticos generados por regresión log-logistica de cuatro parámetros con datos hipotéticos.

En esa misma ventana de (Graph Properties), se pueden modificar y personalizar todas las opciones que se requieran.

Si se desean colocar en el mismo gráfico dos poblaciones, luego de graficar una, se repite la misma operación con otra población, considerando de los datos deben colocarse en la misma hoja de datos y dar las instrucciones respectivas para que el programa pueda leer las columnas apropiadas para los cálculos y gráficas.

Referencias Bibliográficas: 14

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