BIORREMEDIACIÓN: ESPACIOS MARINOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS HAPs Prospecto de Biotecnología aplicada al ambiente con Micoremediación
BIORREMEDIACIÓN: ESPACIOS MARINOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS HAPs Prospecto de Biotecnología aplicada al ambiente con Micoremediación
José Araujo Blanco y Francisco Yegres
Editorial académica española 2020 BIORREMEDIACIÓN: ESPACIOS MARINOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS HAPs Copyright José Araujo Blanco, Francisco Yegres ©
ISBN: 978-620-0-42434-1
Bahía de Amuay, Falcón Venezuela, donde se encuentra el complejo refinador del mismo nombre, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Introducción
Las operaciones petroleras pueden provocar derrames de crudo y sus derivados sobre los cuerpos de agua los cuales requieren su remoción, en especial la fracción de los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPS), dado que son el grupo con mayores efectos negativos sobre el ambiente y salud humana. Este hecho es común en puertos petroleros, motivo por el cual es de interés evaluar la biorremediación de los HAPs del ambiente para ello
Derrame de Petróleo de las orillas de la Playa A muay 26-octubre-2014, #Derrame #Amuay, Tomado de @ThinkingGren_, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco.
también es necesario monitorear los parámetros físico-químicos del agua como pH, conductividad eléctrica, temperatura, cloruros, fósforo total, nitrógeno, oxígeno disuelto, aceites y grasas y comparar los valores con la normativa nacional vigente. De igual manera es de interés conocer que la Micorremediación es una opción actual en especial con diversas especies quienes ha presentado diversas capacidades entre estas tenemos a los hongos del genero Aspergillus que presentan diversas especies útiles para tal fin algunas con capacidad para lograr remover hasta 85,9 % al 100% de los HAPs del agua (Araujo,2015, 2016).
Derrame de Petróleo de las orillas de la Playa A muay contención del derrame José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco.
Hidrocarburos Los hidrocarburos son considerados como una gran familia de compuestos formados por cadenas de átomos de carbono e hidrogeno, con una estructura química diversa que varía y determina su clasificación. Los más simples son los hidrocarburos alifáticos los cuales básicamente poseen cadenas lineales o ramificadas y pueden encontrase saturados (alcanos) o insaturados (alquenos y alquinos). Otros hidrocarburos poseen una o varias cadenas cíclicas, y pueden ser saturados (ciclo alcanos) o con uno o más anillos bencénicos (aromáticos). Estos compuestos son abundantes en la naturaleza y posee diversos orígenes pero el de mayor interés para el hombre es el petróleo (Olah, G. A., & Molnár, 2003).
Naftaleno, Hidrocarburo Policíclico Aromático en Modelo de esferas de Van der Waals, José Araujo 2020 © # prof.josearaujo #josearaujoblanco
Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HAPs) ____________________________________ Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) o (polycyclic aromatic hydrocarbons, por -sus siglas en inglés- PAH) son un conjunto de compuestos orgánicos formados por carbono e hidrógeno, que se caracterizan por contener dos o más anillos de benceno unidos entre sí, que pueden existir en varias disposiciones isoméricas, y son siempre estructuras polinucleares de tipo aromático (también se les conoce con el nombre de hidrocarburos polinucleares). Un HAPs resulta de la fusión de dos moléculas de benceno entre los que se conocen unos 100 miembros diferentes con una elevada cantidad de isómeros. Su estructura es estable termodinámicamente, gracias su resonancia negativa proporcionada por sus seis orbitales π por solapamiento cíclico, como elemento fundamental, por lo que todo compuesto con sistema electrónico π es catalogado como aromático (Viñas, 2005).
Naftaleno
Acenaftileno
Fenantreno
Pireno
Aconafteleno
Antraceno
Criseno
Fluoreno
Fluoranteno
Benzo (a) antraceno
Benzo (b) Fluoranteno
Benzo (K) Fluoranteno
Dibenzo (a,h) antraceno
Benzo (a) Pireno
Indeno (1,2,3-cd) Pyreno
Benzo (g,h,i) Perileno
16 HAPs de Interés Ambiental según la Agencia EPA, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo, josearaujoblanco
Los HAPS en el Ambiente ______________________________________ Los HAPs tienen diversos orígenes, básicamente las fuentes de HAPs se resumen en tres: por diagénesis, petrogénica y pirolítica. Los hidrocarburos que se generan por diagénesis son producto de una fuente natural o biosíntesis aunque por esta vía se producen cantidades muy pequeñas de hidrocarburos aromáticos policíclicos; por lo tanto, el aporte al ambiente es minoritario. Los hidrocarburos aromáticos policíclicos generados por el petróleo son de origen petrogénico, estos se generan a temperaturas entre 100 y 150° C, junto a elevadas presiones durante millones de años depositados en sedimentos, la liberación de este tipo de hidrocarburo es producto de actividades antropogénicas (Jianwang y col., 2010; Lau y col., 2010).
Los hidrocarburos de origen pirolítico (pirosíntesis o pirólisis) son liberados al ambiente como producto de actividades antropogénicas por la combustión de (fósiles, madera y erupciones, entre otros) este tipo de hidrocarburo es generado por diversos factores tales como altas temperaturas, cantidad de combustible, duración de la combustión y disponibilidad de oxígeno, factores que determinan la naturaleza y el grado de formación de los hidrocarburos policíclicos aromáticos. Una forma de diferenciar a los HAPS de origen pirolítico del petrogénico es que los de origen pirolítico tienden a poseer mayor número de compuestos alquilados debido a la temperatura de formación (Peña y col., 2003; Jianwang y col., 2010; Lau y col., 2010). Tanto las fuentes naturales como las antropogénicas, son de interés ambiental tales como: incendios, erupciones volcánicas, emisiones vehiculares, reacciones catalíticas e industriales, combustibles fósiles, sistemas de cocina con leña, estufa de queroseno y gas butano contribuyen a la liberación de los hidrocarburos aromáticos al policíclicos ambiente (Lau y col., 2010; Iwegbue, 2011).
Además, recientemente se ha demostrado que la combustión para cocinar o calentar es una de las fuentes de emisión más importantes para la producción de HAPs en los países en desarrollo, que no son productores de petróleo (Shen y col., 2011). Los HAPs están presentes en la atmósfera, litósfera y la hidrósfera, su comportamiento de los HAPs en el ambiente está íntimamente relacionado con las características fisicoquímicas y estructura de cada HAPs. De la misma manera es posible establecer una relación entre el transporte atmosférico y los sistemas biológicos que son afectados por los HAPs y sus intermediarios (Simonich y col., 2010).
Los HAPs son incluidos como contaminantes de interés prioritario, esto se debe a la peligrosidad intrínseca que presentan por su toxicidad aguda y a la capacidad de efecto teratogénico, mutagénico y carcinogénico que presentan (Araujo, 2015, 2016; Viñas, 2007; Li y col., 2011; Bin y col., 2010). La deposición atmosférica de los HAPs en espacios específicos de la litósfera puede ser usada para contar parte de la historia de los efectos antropogénicos. Además, en el agua los HAPs se encuentran presentes producto de diversas fuentes, su acumulación, dispersión y distribución es producto de la hidrodinámica, ciclo hidrológico, propiedades fisicoquímicas y origen de formación del cuerpo de agua, entre las que se encuentran las de origen volcánico, aludes o glacial, en esta última, se han encontrado hidrocarburos policíclicos aromáticos de diversas fuentes en especial de origen petrogénico, de hecho eventos del deshielo en cuencas urbanas muestran grandes cantidades de HAPs en aguas superficiales y subterráneas (Meyer y col., 2011; Guo y col., 2011).
Naftaleno, Hidrocarburo N (3) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Un aspecto de interés de los HAPs en el agua, es que tienden a ser hidrofóbicos, y esta propiedad aumenta cuanto mayor es el número de anillos en los HAPs, lo que sugiere que los HAPs de mayor peso molecular suelen reaccionar con la biota por precipitación, mientras que los de bajo peso molecular tienden estar más tiempo en la columna de agua y algunos por su bajo peso molecular son volátiles. Por otro lado las temperaturas bajas por debajo de los 30° C, generan un cambio de solubilidad que favorece la adsorción de los HAPs a los sedimentos y las plantas acuáticas, esta tendencia de adsorción a las superficies dificulta su biodegradación, así como su acumulación en la cadena trófica (Clements y col., 1994; Guo y col., 2011; Wang y col., 2011).
Derrame en las Costa de Falcón Agosto 2020 Prensa OEP, José Araujo ©, #prof.josearaujo, #josearaujoblanco.
Contaminación del Agua con HAPs ______________________________________ Los ecosistemas acuáticos son uno de los ecosistemas de interés para el planeta tierra pues representan la zona más extendida en este planeta su mantenimiento y salud es extendida al resto de los demás ecosistemas, es por esto que la recuperación de áreas marinas impactadas por hidrocarburos es de interés para biorremediación del agua y es el campo de interés para la biotecnología ambiental es la recuperación de áreas impactadas con hidrocarburos, promoviendo la restauración de ecosistemas acuáticos utilizando tratamientos biológicos, desarrollando diversas estrategias con el fin de mejorar la calidad ambiental, de acuerdo con las necesidades y dimensiones del problema (Robert, 1995).
Aconaftileno, Hidrocarburo N (3) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
La dispersión de petróleo en el agua expone a las diversas fracciones del hidrocarburo en este componente, desde los compuestos saturados y aromáticos hasta resinas y asfáltenos. Las primeras fracciones, corresponden a cadenas lineales y ramificadas que son susceptibles a degradación por diversos efectos físico-químicos y también por microorganismos, de igual manera la fracción de resinas y asfáltenos pueden ser removidos con relativa facilidad, pero los hidrocarburos aromáticos policíclicos, a los que denominaremos en adelante (HAPs), son de difícil remoción y son considerados contaminantes de interés, tanto para el ambiente como para la salud humana ya que son compuestos recalcitrantes y potencialmente carcinogénicos con alta capacidad de bioacumulación en las cadenas tróficas (Vives, 2001). Investigaciones realizadas sobre la biodegradación microbiana de hidrocarburos presentes en agua, muestran como los HAPs son susceptibles a ser degradados por la flora autóctona microbiana, por lo que son de elección para ser usados en la remoción de estos espacios (Guiraud, 2008). La presencia de microorganismos en el agua como bacterias y hongos conforman parte de la microflora en el agua, en el que es posible establecer el papel individual estos o como consorcios en la degradación de los hidrocarburos aromáticos policílcicos.
Derrame, de Petróleo en el Parque Nacional Morrocoy, tomado de reportaje de Jessica Dirinot Publicado 5 Agosto 2020, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Acenaftileno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Sin duda alguna en la era actual existen diversas actividades que contaminan el medio marítimo, entre estas encontramos a las que derivan de la actividad petrolera, la cual puede verter a los espacios acuáticos petróleo crudo o petróleo refinado, diésel, gasolina, kerosén, y otros productos obtenidos por destilación fraccionada y procesamiento químico del petróleo crudo, generado bien sea de forma accidental o deliberadamente desde diferentes fuentes, de buques-tanques, fugas de los equipos de perforación marina u otra fuente proveniente de tierra firme que es arrojada al suelo en las ciudades y en zonas industriales que posteriormente es arrastrada por corrientes fluviales terminando en los diversos cuerpos de agua de gran importancia (Hidalgo, 2009).
No obstante hoy en día, es evidente que la contaminación se ha intensificado al mismo ritmo en que se desarrollan las actividades de uso del petróleo como recurso energético con aumento de los transportes marítimos y de las actividades de perforación, lo cual ha provocado el aumento de accidentes ambientales que varían en escala. Uno de los más recientes y nefastos de estos, fue el producido en la plataforma Deepwater Horizon en el Golfo de México por una explosión, la cual fue estimada conservadoramente en 800 mil litros de petróleo, que fueron vertidos al Golfo de México por lo cual se considerada actualmente el accidente de derrame de petróleo más importante después del Exxon Valdez (Beaton, 2010).
Fluoreno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Costas de Falcón, impactadas por derrame de Petróleo, José Araujo 2020 ©, #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Biodegradación de Hidrocarburos ______________________________________
Diversos métodos son utilizados para degradar diversas fracciones del petróleo. Los procesos pueden ser insitu o ex situ, en incluyen dos formas la primera incluye el uso de microorganismos autóctonos y el segundo consiste en adicionar poblaciones foráneas de microorganismos que son escogidos por sus capacidades de degradar diversas fracciones del petróleo, este método de siembra de microorganismos requiere que sea agregando una cantidad de inoculo mayor a la biomasa que está presente en el medio para asegurar la supervivencia del inoculo y su efectividad, sin embargo este método ha probado ser menos eficiente. Estos procesos pueden ser acelerados al aplicar fertilización y aeración la cual son la base de los procesos de bioaumentación y bioestimulación (Atlas, 1995).
Fenantreno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
La similitud entre estructura por la presencia de anillos entre la lignina y los hidrocarburos aromáticos policíclicos también pone al descubierto que los hongos que son capaces de degradar la lignina conocidos comúnmente cono ligninoliticos o lignoliticos, también pueden degradar e incluso mineralizar HAPs, ya que la lignina es una estructura química presente en plantas que posee anillos aromáticos. Cuando revisamos el proceso catalítico encontramos que esto puede ser logrado a un conjunto de enzimas constitutivas e inducibles que catalizan diversas fuentes de carbono (Bumpus et al., 1985; Bumpus, 1989; Cerniglia et al., 1997; Hammel et al., 1992; Sutherland et al., 1992).
La mayoría de estos compuestos son anillos aromáticos de tipo polinuclear condensados, que poseen una degradación más lenta que los alcanos, mientras que los compuestos alicíclicos normalmente no son usados como fuente de carbono para el crecimiento microbiano bacterias- a no ser que tenga cadenas laterales alifáticas suficientemente largas. Por otro lado estos compuestos pueden ser degradados en consorcios y gremios bacterianos, que actúan en cooperación (Atlas, 1981), sin embargo no siempre es posible generar la biodegradación y conversión completa de este tipo de compuestos que son altamente recalcitrantes para las bacterias, no obstante este proceso puede ser llevado por los hongos quienes poseen una alta capacidad hidrocarbonoclástica gracias a su maquinaria enzimática. Lo que permite la aceleración del proceso de degradación de los HAPs mediante la manipulación de los sustratos y del microambiente tales como la adición de nutrientes, más la introducción de un inoculo microbiano con un aumento de la viabilidad de los HAPs para ser degradados (Xu y Obbard, 2004).
Antraceno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Hongos y su capacidad catalítica hidrocarbonoclástica ______________________________________
La maquinaria enzimática que poseen los hongos le permiten catalizar diversos compuestos orgánicos por eso es posible la ruptura de los enlaces de carbono- carbono transformando una gran variedad de compuestos orgánicos logrando su conversión a CO2 y H2O lo que ofrece un gran potencial para ser utilizados en procesos de descontaminación o remoción de agentes contaminantes.
Enzimas como la la lignina peroxidasa (LiP), peroxidasa dependiente de Mn (MnP), lacasa, una fenoloxidasa que contiene principalmente cobre.
Y otras oxidasas como las glioxal oxidasa y superóxido dismutasa son algunas de las enzimas que pueden catalizar la transformación de diversos compuestos organicos que incluyen a los hidrocarburos (Miyamoto, 1997; De Lorenzo, 1994; Minowa, 1995).
Pireno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA La capacidad altamente oxidante de estas enzimas les otorga una considerable capacidad de degradar diferentes compuestos orgánicos polinucleares, así como diversos compuestos xenobióticos que pueden ser transformados por hongos, se encuentran fundamentalmente: pesticidas, hidrocarburos aromáticos (benzo -pireno, fenantreno, pireno, etc.) compuestos orgánicos clorados (pentaclorofenoles, cloroanilinas, bifenilospoliclorados) azocolorantes, entre otros (Bezalel, 1996, Araujo, 2015, 2016).
Fluoranteno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA Existen diversos factores que afectan la biodegradación de los contaminantes como los hidrocarburos (Ercoli et al., 2002). Los principales factores que influyen este proceso son los abióticos y bióticos en un tiempo finito en horas, días, meses o años que pueden ser evaluados. Igualmente los factores abióticos o fisicoquímicos agrupan aquellos que se relacionan con el contaminante (estructura química, concentración y biodisponibilidad) y las condiciones medioambientales (pH, humedad, temperatura, disponibilidad de oxígeno y nutrientes); mientras que los bióticos dependen de los microorganismos (población microbiana y cometabolismo) (Atlas, 1991; Araujo, 2015, 2016).
Biodisponibilidad: Los hidrocarburos son un sustrato viable para ser metabolizado por los microorganismos ya que es posible extraer carbono y energía a partir de su estructura molecular. Es por ello que su transformación catalítica y anabólica es útil para los diversos sistemas biológicos. Cuando hablamos de biodisponibilidad nos referimos al contacto entre el hidrocarburo que en el ambiente es un contaminante y
produce efectos nocivos (Mahro, 2000). Sin embargo el principal requisito de este sustrato es estar accesibles para su aprovechamiento, y esto es posible cuando este sustrato es soluble ya que la solubilidad de un compuesto aumenta su biodisponibilidad. En algunos casos estos compuesto como los hidrocarburos HAPs son compuestos que poseen estrcuturas químicas particulares que generan impedimentos físicoquímicos que impiden ser metabolizados por los microorganismos cundo esto ocurre se dice que la biodisponibilidad es limitada. Si por el contario la molécula puede ser introducida con facilidad al sistema metabólico celular microbiano se dice que la biodisponiblidad es positiva, sin embargo un exceso de biodisponibilidad positiva puede aumentar su concentración interior e inducir toxicidad. La palicación de compuestos tensoactivos son una estrategía utilizada con frecuencia para aumentar la solubilidad y biodisponibilidad de los contaminantes poco solubles, de esta manera la molécula orgánica penetra al medio intracelular a través de las micelas del tensoactivo (Cerniglia, 1995), estos tensoactivos pueden ser sintéticos como: (etoxilados, bencenosulfonatos) y microbiano que incluyen (ramnolípidos, lipopéptidos y emulsanos), estrategia la cual ha sido frecuentemente utilizada en el caso de hidrocarburos (Abalos, et al., 2004; Cubitto,et al., 2004).
Derrame de petróleo confirmado por PDVSA 2017, afecta a la bahía de Amuay cerca de la mayor refinería de Venezuela, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Derrame de petróleo en las costas de Falcón, esto puede afectar aún más los manglares y la biota marina de Venezuela, tomado: Fundación Azul Ambientalista José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Benzo (b) Fluoranteno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Estructura química y concentración del contaminante: Según la naturaleza de los hidrocarburos es también varían en complejidad con ello en su biodegradabilidad para ser utilizados por los microorganismos quienes utilizan estos compuestos como fuente de carbono (Viñas. et al., 2001). Si el contaminante se encuentra en altas concentraciones su degradación es muy baja ya que a ese nivel es toxico para los sistemas biológicos microbianos. Sin embargo la posibilidad de dispersión y solubilización son elementos que disminuyen la concentración y con ello el aumento a ser propensos para ser biotransformados. Si el sitio de acción o ataque de la enzima degradativa se encuentra bloqueado (isoprenoides o moléculas sustituidas con grupos voluminosos COOH, CH3), la reacción no tendrá lugar, disminuyendo entonces la actividad biodegradativa. Los compuestos alifáticos se degradan fácilmente por
oxidaciones sucesivas, pero cuando se incluyen como sustituyentes alcanos de cadena larga, se forman estructuras ramificadas estéricamente inaccesibles a la degradación (Ercoli, et al., 2002). Los compuestos alifáticos insaturados se degradan más lentamente que los saturados debido al impedimento estérico formado por la nube de hidrógenos. Los compuestos cíclicos y aromáticos se degradan a partir de la ruptura del anillo, pero la incorporación de halógenos disminuye la degradabilidad por estabilización del anillo aromático (Leahy y Colwell, 1990; Viñas, 1999). Este manera la degradación de PCBs (bifenilopoliclorado) es más compleja y más aún cuando se encuentra acomplejada con diversos grupos funcionales que hace menos accesible la ruptura de los enlaces carbónicos. Por lo tanto tenemos el siguiente orden creciente de biodegradación, n-alcanos > isoprenoides > aromáticos de bajo peso molecular > cicloalcanos > poliaromáticos > moléculas polares (Leahy y Colwell, 1990). Otro aspecto de interés es que en una mezcla de hidrocarburos la degradación sigue el orden SARA, primero son biodegradados hidrocarburos simples (S), luego los aromáticos (A), y por ultimo las resinas (S) y asfáltenos (A).
Hidrocarburos del petróleo como contaminantes: La transformación anaeróbica de materia orgánica en condiciones elevadas de temperatura y presión dan como origen al petróleo el cual sale a la superficie por fallas naturales por lo que siempre ha mantenido contacto con la biosfera. Pero este fenómeno por lo general es de baja magnitud al ser comparado con las actividades de extracción de crudo en perforaciones petrolíferas la cual se calcula en 2000 millones de toneladas anuales (Abraham, et al., 2002). Aunque la mayoría de los componentes del petróleo son biodegradables, pero este es un proceso lento.
Las actividades de obtención, transporte, refinado y eliminación de residuos arrojan al mar en estimaciones conservadoras de 3,2 millones de toneladas de petróleo y sus derivados (Lindstrom, et al., 1991), esto se concentra básicamente en las zonas de extracción en los espacios
acuáticos y, en las principales rutas de navegación y en las proximidades de las refinerías. Estas actividades producen vertidos que en ocasiones exceden generalmente la capacidad de autopurificación del ecosistema
local además el petróleo que flota en el agua es difícil de contener y de recoger. Benzo (K) Fluranteno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Y es un contaminante para biota como las aves y otras formas marinas causando graves perjuicios económicos, estéticos sobre la costa. El costo de limpieza de estos vertidos es elevado, y a menudo la limpieza alcanza los 2,5 a 4 millones de dólares por litro de petróleo derramado. Además con frecuencia las condiciones climatológicas impiden la contención y limpieza de la marea negra. La dispersión del petróleo mediante el uso de detergentes, o haciéndolo ir al fondo con caliza o arena siliconada son esencialmente medidas de carácter estético. Estos tratamientos eliminan el petróleo de la superficie pero aumentan la exposición de los organismos marinos al contaminante y por lo tanto es mejor evitarlos (Andreoni, et al., 1998). Además la contaminación con
petróleo con componentes aromáticos de los hidrocarburos disueltos alteran la biota aun en concentraciones de partes por millones (ppm), los mecanismos de quimiorrecepción de algunos organismos marinos. La quimiorrecepción es fundamental en la búsqueda de alimento y en la reproducción y generación de nueva prole (Atlas y Bartha, 1997). Otro efecto de interés es que algunos componentes polinucleados condesados del petróleo son cancerígenos y relativamente resistentes a la biodegradación, y pueden ascender por la cadena trófica, contaminando peces y mariscos (Carmichael y Pfender, 1997).
El petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos alifáticos, alicíclicos (estructuras ciclo alifáticas saturadas) y aromáticos. También contienen una menor proporción de compuestos que no son hidrocarburos como ácidos naftalenicos y fenoles, oles, compuestos heterocíclicos de nitrógeno, compuestos de azufre y metaloporfirina, cada tipo de crudo tiene vario cientos de componentes diferentes; la composición además varía según la procedencia del petróleo (Baker, 1994).
Benzo (a) Pireno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Aspergillus
como
agente
de
remoción de HAPs
______________________________________
Durante casi 30 años se han revisado las capacidades degradadoras de los hongos frente a los hidrocarburos aromáticos policíclicos entre los que destaca el género Aspergillus quien ha demostrado ser uno de los hongos con capacidad de degradación de hidrocarburos en diversos estudios en suelo, de hecho el bioaumento de Aspergillus sp. mejora la velocidad y magnitud de degradación de los hidrocarburos aromáticos policíclicos en comparación con otros microorganismos presentes en un consorcio microbiano (Juhasz y Naidu, 2000; Silva, 2010; Pernía, y col.,2012).
Por otro lado es uno de los géneros más comunes, aislados del agua con varias especies representantes que degradan hidrocarburos aromáticos policíclicos en condiciones de laboratorio (Okoro, y col 2008; 2010). El género Aspergillus ha sido encontrado en las primeras fases de extracción y manipulación de petróleo como un microorganismo oportunista capaz de degradar HAPs. Esta capacidad de degradación de HAPs presenta porcentajes de eficiencia que varían entre el 60 y 83% en especial para degradar antraceno (Okoro, y col., 2010).
Criseno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Las investigaciones sobre la degradación de los HAPs por hongos del género Aspergillus muestran que es un proceso dinámico de incluye adsorción extracelular con implicaciones de compuestos intracelulares, y los productos transformados no muestran aparente toxicidad (Sánchez y col., 2006; Guiraud y col., 2008; Qiang y col., 2009; Ye y col., 2011; Pernía, y col., 2012).
Mancha de Petróleo en las costas de Falcón, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Biorremediación y Biodegradación ______________________________________ La Biorremdiación es en si la remediación de ambientes contaminados con el uso de seres vivos en a diferencia de otras alternativas más costosas. Estos procesos incluyen tratamientos biológicos de degradación de compuestos que afectan un ambiente son eficientes y económicos en condiciones óptimas (Álvarez, 2001; Belloso, 1998; Cursi y Calleja, 2000). Es por ello que la biorremediación es el resultado del uso de técnicas que permiten la biodegradación de los contaminantes. De igual manera la biorremediación incluye la digestión, asimilación y metalización de un compuesto orgánico llevado a cabo por bacterias, hongos, protozoos y otros microorganismos (Ercolli, 2002).
Benzo (a) Antraceno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA La biorremediación es una técnica puede ser aplicada in situ, en el lugar donde se encuentra la contaminación, o ex situ, cuando el contaminante es trasladado a una instalación para su tratamiento (Saracino, 2001).La actividad de los organismos presentes en el sitio contaminado se pueden
favorecer mejorando determinadas condiciones: edáficas, añadiendo nutrientes, agua, oxígeno y modificando el pH.
Otra forma es la introducción de nuevas especies para aumentar la concentración de microbiota presente. La biodegradación es un proceso natural, ventajoso no solo por permitir la eliminación de compuestos nocivos impidiendo su concentración, sino que además es indispensable para el reciclaje de los elementos en la biosfera, permitiendo la restitución de elementos (carbohidratos, lípidos, proteínas) esenciales en la formación y crecimiento de los organismos (Garbisu, 2002). Los microorganismos utilizados pueden ser los ya existentes (autóctonos) en el sitio contaminado o pueden provenir de otros ecosistemas (alóctonos), en cuyo caso deben ser agregados o inoculados (Madigan, 2003).
Indeno (1,2,3-cd) pyreno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Aspergillus
como
agente
de
remoción de HAPs ______________________________________
Más de 30 años de estudios sobre el tema respaldan las capacidades degradadoras de los hongos frente a los hidrocarburos aromáticos policíclicos entre los que destaca el género Aspergillus quien ha demostrado ser uno de los hongos con capacidad de degradación de hidrocarburos en diversos estudios en suelo, de hecho el bioaumento de Aspergillus sp. mejora la velocidad y magnitud de degradación de los hidrocarburos aromáticos policíclicos en comparación con otros microorganismos presentes en un consorcio microbiano (Juhasz y Naidu, 2000; Silva, 2010; Pernía, y col.,2012).
Benzo (g,h,i) perileno,, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Por otro lado es uno de los géneros más comunes, aislados del agua con varias especies representantes que degradan hidrocarburos aromáticos policíclicos en condiciones de laboratorio (Okoro, y col 2008; 2010). El género Aspergillus ha sido encontrado en las primeras fases de extracción y manipulación de petróleo como un microorganismo oportunista capaz de degradar HAPs. Esta capacidad de degradación de HAPs presenta porcentajes de eficiencia que varían entre el 60 y 83% en especial para degradar antraceno (Okoro, y col., 2010).
Las investigaciones sobre la degradación de los HAPs por hongos del género Aspergillus muestran que es un proceso dinámico de incluye adsorción extracelular con implicaciones de compuestos intracelulares, y los productos transformados no muestran aparente toxicidad (Sánchez y col., 2006; Guiraud y col., 2008; Qiang y col., 2009; Ye y col., 2011; Pernía, y col., 2012).
Dibenzo (a,h) antraceno, Hidrocarburo N (2) de Interés Ambiental según la Agencia EPA
Derrame de petróleo en las costas de Falcón, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Métodos para la evaluación de HAPs ______________________________________ Existen diversos métodos de estudio para el análisis de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) en especial los normalizados por la (EPA) entre los que se incluye el método 418.1. Este método propone el uso de Freón que en la actualidad está prohibido por ser un compuesto que daña la capa de ozono lo que supone una modificación con otros solventes de similar polaridad, cambios válidos para los laboratorios de certificación y metrología de hidrocarburos.
En caso de uso de otros solventes como Hexano la agencia de protección ambiental en sus siglas en inglés (EPA) propone indicar al método como 418.1 modificado indicando el solvente de elección. Este método es el método estandarizado más usado para el análisis de HAPs por espectrofotometría UV-Visible en aguas domésticas y agua de mar. El método es sensible desde 1 mg/l y es el más usado para el monitoreo ambiental además de ser un método económico y factible, motivo por el cual fue el método de elección para este estudio (USEPA, 1978; 1996; 1997, De la Garza, 2005).
Existen otros métodos analíticos para el estudio de cuerpos de agua que permiten la cualificación y cuantificación de las diversas fracciones entre los que se incluye la cromatografía liquida con fase inversa (Ardag y col., 2011), y la cromatografía de gases (Amoako y col., 2011). Sin embargo, otros investigadores prueban nuevos métodos para la cuantificación de
HAPs en el agua, uno de estos es, el uso de la excitación de la matriz por emisión fluorescencia, aplicado en el análisis directo mediante selección de áreas (Wang y col., 2011).
Bahía de Amuay estado Falcón, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Mostraremos como caso de estudio a la Bahía de Amuay un espacio estudiado por más de 10 años por nuestro equipo de investigación, se trata de una zona de carga y descarga de crudo y derivados de
petróleo frente a la que años de otrora era la más grande refinería de Latinoamérica ubicada en la Bahia de A muay.
Nuestras investigaciones apuntan que las prospecciones de biorrediación en este espacio podrán ser en un futuro posible, para el saneamiento ambiental de estos espacios impactados con el uso de microorganismos autóctonos de un espacio marino costero. Históricamente contaminado por las descargas de los de los buques de petróleo y el puerto de carga y descarga que ha contaminado al agua de esta zona que han afectado no solo la naturaleza y la flora y fauna marina de esta zona, sino que también viene afectando de manera histórica a los pescadores de esta zona que provienen de antiguas civilizaciones de los indios de Amay quienes son pescadores desde tiempos antiguos antes de la explotación petrolera.
Establecimiento de la Zona de Estudio ______________________________________ Figura 2. Ubicación Mundial, Nacional y Regional de La Bahía de Amuay, y estaciones de muestreo, Modificado de Map Powered by Esri, Fuente: José Araujo (2015).
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B
Costas de Falcón, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
La zona donde se realizó el estudio fue en La Bahía de Amuay (Figura 2 A) ubicada al noreste de Venezuela, en el sector oeste de la Península de Paraguaná, geográficamente se localiza a 11º 45’ N y 70º 13’ O, con aproximadamente 9 Km de costa (Reyes, 2005).
Mapa de Ubicación del estduio, Bahía de Amuay, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Esta zona se caracteriza por ser un espacio acuático cerúleo donde entran barcos de gran calado, limitando por una zona playera y turística. Por otro lado, existe una zona donde se encuentran manglares en crecimiento de la especies Avicennia germinans L., que están muy cerca de la zona de estudio.
Para esta investigación se establecieron tres estaciones de muestreo (Figura 2 B), repartidas en la línea de costa con una separación equidistante de 1,5 Km entre cada estación para un total de 4,5 Km.
Las diversas estaciones de muestreo fueron georreferenciadas utilizando un GPS Garmin modelo Etrex con un rango de error de 3 mts. La cuales quedaron determinadas en las siguientes coordenadas UTM; (E1) 19P368403 -1301096; (E2) 19P368701-1300389; (E3) 19P36708-1299912.
Se tomó como criterio la zona de mayor influencia de actividad petrolera, desde la playa adyacente al puerto de la refinería hasta la población de Amuay, con el fin de obtener una muestra representativa y una mayor probabilidad de recuperación de hongos autóctonos de la zona.
Toma de Muestra ______________________________________
Figura 3. Ubicación geográfica de estaciones de muestreo en La Bahía de Amuay / embaces con muestras colectadas, Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco.
Se colectaron muestras de agua por triplicado (Figura 3) en botellas de 1,5 L previamente curadas para los análisis fisicoquímicos, y en envases de vidrio de 125 mL previamente esterilizados para el aislamiento de los hongos.
Esta colecta se debe realizar a una distancia de 1,5 metros de la orilla sumergiendo las botellas una profundidad máxima de 30 cm en el cuerpo de agua y llenando todo su contenido, este procedimiento se repite por un periodo de tres semanas con una frecuencia de una muestra semanal. Las diversas muestras colectadas deben ser selladas, rotuladas y transportadas en refrigeración hasta su posterior procesamiento en el laboratorio.
Análisis
Físico-Químico
y
naturaleza del Agua _________________________________________________________
Todo estudio que incluye la evaluación de un componente como el agua requiere de conocer sus propiedades y naturaleza por eso para ello a las muestras que son colectadas se les hace una análisis 1) por métodos normalizados para la determinación de parámetros físico-químicos. 2) por el método normalizado para la evaluación de hidrocarburos en este caso evaluamos un método estándar de bajo costo y regulado internacionalmente como el EPA 418.1 (modificado) establecido por la agencia de protección ambiental, con siglas en inglés (EPA).
Análisis físico-químicos (Standar Methods)
Las muestras de agua que deben ser colectadas de la zona de estudio en este caso La Bahía de Amuay en Falcón Venezuela una zona de alta
contaminación por descargas de petróleo en la refinería de Amuay, estas son analizadas por los siguientes métodos normalizados por el Standar Methods:
Métodos normalizados para el análisis del agua Analito / unidad
Método
Código
pH
Electrométrico
(4500-H+)
Conductividad eléctrica / (µS/cm)
Electrométrico
(2510-CE)
Temperatura / (°C)
Medición Directa
(2550-B)
Cloruros / (mg/kg)
Argentométrico
(4500-Cl)
Fósforo total / (Pt)
Espectrofotométrico
(4500-P)
Nitrógeno total / (Nt)
Titulométrico (Kjeldahl)
(4500-N)
Oxígeno Disuelto
Titulométrico (Winckler)
(4500-O)
Aceites y grasas / (AG)
Partición-Gravimetría
(5520-B)
Fuente:(APHA y col., 1998)
Análisis de HAPs _________________________________________________________
El análisis de hidrocarburos se realizó aplicando el método normalizado para HAPs en agua EPA 418.1 modificado, éste se logró con una extracción líquido-líquido (Figura 4) con 25 mL con solventes de extracción en un embudo de separación.
Después de ser agitada la fase acuosa fue separada de la fase orgánica, posteriormente se realizó una segunda extracción con otros 25 mL de solvente, la fase orgánica se evaporó al vacío en un equipo Büchi ® Rotavapor R-205 para obtener una solución concentrada de
hidrocarburos que fue posteriormente cuantificada por espectrofotometría según el método normalizado (EPA y col., 1978; De la Garza, 2005).
Figura 4. Procedimiento del método EPA 418.1 modificado, Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco .
Aislamiento y caracterización de cepas del género Aspergillus _________________________________________________________
Las cepas fúngicas son obtenidas mediante el uso, de medios de cultivo para su aislamiento, caracterización e identificación.
Aislamiento con medios de enriquecimiento
El medio Czapek - Czapek Dox comúnmente es utilizado para estimular la características diferenciales de Aspergillus spp, este medio definido sólido es ideal para el cultivo de los hongos que son capaces de utilizar nitrato de sodio como la única fuente de nitrógeno (Thom y Church, 1926). Para el aislamiento de las diversas cepas fúngicas, se utilizó como base las diversas sales del medio (Tabla 2) cambiando la fuente de carbono de sacarosa por un enriquecimiento con antraceno como HAPs representativo. Para ello se prepara el medio Czapek - Czapek Dox en placa de Petri por triplicado a una concentración:
Tabla 2. Composición del medio Czapek - Czapek Dox NUTRIENTES K2HPO4 NaNO3 KCl MgSO47H2O FeSO47H2O Agar
g/L 1,0 2,0 0,5 0,5 0,001 15,0 Fuente:(Casas, 1994).
La solución resultante se debe ajustar a pH 5,5 más la adición de cloranfenicol 0.4 gr/L como antibacteriano para inhibir el crecimiento de bacterias saprofitas que suelen contaminar los cultivos, este es utilizado en su presentación de succinato sódico de cloranfenicol la cual resistente a temperaturas de esterilización del autoclave. Las placas de Petri se sugieren que sean enriquecidas con 5% v/v de antraceno a 400 ppm diluido en n-hexano como HAPs de referencia y fuente de carbono, el control positivo poseía 30g sacarosa, y el control negativo no se le adicionó fuente de carbono. Todos los medios resultantes deben esterilizados en autoclave a 121 ºC a una atmósfera extra de presión.
Figura 5. Medios de Cultivo preparados para el crecimiento de hongos, Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco .
A partir de las muestras de agua contenidas en envases de 125 mL de las diferentes estaciones, se debe tomar alícuotas de 0,5 mL para sembrar placas de Petri por el método de diseminación con espátula de Driglasky, posteriormente estas se deben incubar a temperatura de 37 °C por un periodo de 5-14 días en una incubadora marca Jouan © modelo EB115.
Caracterización
basada
en
la
macro y micromorfología _________________________________________________________
La caracterización de hongos del género Aspergillus, se sugiere realizar a partir de hongos previamente aislados de medios enriquecidos, aplicando la técnica de siembra en placa (Casas, 1994) en medios de cultivos propuestos por el sistema de identificación desarrollado por
Klich y Pitt (1988), el cual consiste en el uso de tres medios de cultivo y dos temperaturas de incubación Klich (2000).
El primer medio se sugiere con Czapek y extracto de levadura sus siglas en inglés CYA (Yeast extract Agar) (Casas, 1994) preparado a una concentración equibalente como se muestra en la siguiente tabla:
Tabla 3. Composición del medio Czapek Yeast extract Agar (CYA) NUTRIENTES g/L K2HPO4 1,0 NaNO3 2,0 KCl 0,5 MgSO47H2O 0,5 FeSO47H2O 0,001 Extracto de levadura 3,0 Agar 15 Ajustando el pH 5,5 ± 0,2 y esterilizando el medio en autoclave a 121ºC. Fuente: Casas (1994).
Y el segundo medio de cultivo se sugiere utilizarlo para preparar placas de Petri fue Czapek con extracto de levadura al 20% de sacarosa (CY20S), (Abarca, 2000) preparado a una concentración de nutrientes:
Tabla 4. Composición del medio Czapek Yeast extract Agar (CY20S)
NUTRIENTES g/L K2HPO4 1,0 NaNO3 2,0 KCl 0,5 MgSO47H2O 0,5 FeSO47H2O 0,001 Extracto de Levadura 3,0 Sacarosa 20,0 Agar 15,0 Con ajuste del a pH 7,2 ± 0,2 y esterilización a 121ºC en autoclave del medio resultante. Fuente: Casas (1994).
El tercer y último medio se sugiere utilizarlo con el sistema de identificación para hongos del género Aspergillus (Abarca, 2000) que se logra al agregar extracto malta (MEA) un medio complejo preparado a una concentración proporcional de:
Tabla 5. Composición del medio Agar Extracto Malta (MEA) NUTRIENTES Extracto de Malta Peptona Micológica Agar
g/L 30,0 5,0 15,0 Fuente: Casas (1994)
Con ajuste de pH 5,4 ± 0,2, sin embargo para el caso de recuentos micológicos se recomienda preparar el medio más ácido con el fin de suprimir el crecimiento bacteriano. Para ello se debe ajustar el pH 3,5 ± 0,2 bajando la temperatura luego de autoclavado y añadiendo 2-3 ml de ácido láctico al 10%, sin volver a calentar (Galloway, 1952).
Los tres medios de cultivo deben ser sembrados en tres puntos equidistantes de la Placa de Petrí, la incubación de los medios se realizó en dos placas de medio CYA (Czapek Yeast extract agar), una placa de
CYA con 20% de sacarosa (CY20S), y una placa de MEA (agar extracto de malta). Figura 6. Método de siembra e incubación según el método identificación propuesto por Klich y Pitt José Araujo (2015).
(1988); Klich (2000), Fuente:
Una de las placas de CYA se sugiere incubar a 37 ºC y las restantes de CYA, CYA20S, y MEA a 25 ºC (Figura 6). Luego de siete días de incubación proceder a la observación de las características morfológicas macroscópicas y microscópicas de los cultivos según la revisión propuesta por Abarca (2000).
Para la evaluación de las características microscópicas, se sugiere aplicar el método de microcultivo en cámara húmeda (Riddell, 1950; Gomes y col., 2008). Este consistirá en la preparación de placas de Petri en las que se colocará en su interior papel absorbente cortado de forma circular, el cual se debe empapar con agua destilada estéril.
Por encima de este colocar una base en forma de U realizado con una barrilla de vidrio o pipeta Pasteur doblada al calor, esta base permitirá soportar una lámina portaobjeto sobre la cual se colocará 1 cubo de aproximadamente 1 cm3 (Figura 7) de agar (CZ-Dox) .
Figura 7. Procedimiento de método de microcultivo Riddell (1950), Fuente: José Araujo (2015).
Estos medios sugieren inocular con aguja de platino por punción, y posteriormente se tapar con láminas cubre objeto, finalmente se cerrar los discos de la placa de Petri y se proceder a incubar en condiciones de temperatura 37 °C y luz natural durante un lapso de 8-10 días (Riddell, 1950).
Una vez transcurrido ese tiempo descartar el cubo de agar (CZ-Dox) colocar la lámina cubre objeto resultante sobre un nuevo portaobjeto realizando una tinción simple, con lugol y azul de toluidina (Casas, 1994).
Los bordes de la preparación obtenida deben ser sellados con esmalte transparente para generar una preparación fija que puede ser evaluada por microscopía fotónica en un microscopio óptico de cualquier mara en la que pueda aplicar diversos aumentos 4X, 10X, 40X (Figura 7).
Los diversos cuerpos fructíferos pueden ser evaluados según las características morfológicas propuestas por la revisión de Abarca (2000).
Una o varias cepas representativas aisladas fueran caracterizadas por microscopía electrónica de barrido MEB (Figura 8).
Figura 8. Muestras fúngicas / Microscopio Electrónico de Barrido, con analizador EDX incorporado. Fuente: José Araujo (2015).
Las diversas muestras se sugieren ser analizadas modo ambiental, en alto y bajo vacío, generando aumentos entre 130-8000X, 15.000 Kv en primer plano y en plano de contraste, aplicando herramientas de filtro y cálculo de tamaños micrográficos, con un respectivo análisis de elementos de la muestra representados en porcentaje de átomos (FEI, 2008).
Selección de la cepa más eficiente en degradar HAPs utilizando un ensayo de factibilidad _________________________________________________________
Para seleccionar la cepa más eficiente en degradar al HAPs se debe hacer un ensayo con la finalidad de seleccionar las cepas de microorganismos en este caso de estudio del hongo Aspergillus que posee mayor capacidad de remoción de hidrocarburos aromáticos policíclicos en medios de cultivo líquido. Para ello se prepara un inóculo, agregándolo a las diversas unidades experimentales. Se sugiere hacer el experimento con dos grupos con el motivo de evaluar la biomasa y los (HAPs) en las mismas condiciones experimentales.
Obtención del Inóculo
Las diversas cepas aisladas y caracterizadas del género Aspergillus deben ser propagadas por triplicado en medio solido Sabouraud preparado a una concentración:
Tabla 6. Composición del medio Agar Sabouraud NUTRIENTES Peptona de Caseína Digerido Pancreático de Tejido Animal Dextrosa Agar Fuente: Casas (1994)
g/L 5,0 5,0 40,0 15,0
Los componentes se disuelven en un 1L de agua destilada, ajuntando el pH 5,6 ± 0.2 esterilizado por calor húmedo en autoclave a 15 libras de presión a 120°C, el medio esterilizado fue dispensado en botellas de vidrio de 125 mL previamente esterilizados de forma inclinada, e incubado a 30°C por 10 días (Larone, 1995).
Figura 9. Suspensión de esporas en solución isotónica de NaCL al 0,9 %. Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
. Cada envase se siembra el método de estría con asa. De las diversas cepas se colectaron esporas vivaces en una solución salina estéril al 0,9 % (Figura 9); en una pipeta Pasteur, la suspensión de esporas se vacía a un matraz tomando 5 mL de estas y aforando a 50 mL con agua destilada, logrando una dilución de 5:50 con un factor de dilución de 10x, posteriormente se cuenta una cantidad de esporas con el fin de lograr una concentración de esporas a través del microscopio aplicando el método de conteo con cámara de Neubauer (Vélez, 1997).
Se cuentan las esporas en la cámara utilizando la dilución adecuada, y la concentración de esporas se determina aplicando la siguiente ecuación:
(1)
NE: Número de esporas; SR: Superficie Recontada (mm2); PdC: Profundidad de la Cámara (mm); F: Factor de Dilución; Superficie recontada: Cuadrado grande: 1 mm2; Cuadrado de grupo: 0,04 mm2; Cuadrado pequeño: 0,025 mm2.
Para determinar el número de esporas por μL-1, estas se cuentan y el número resultante se divide entre la superficie recontada por grupo en cuatro cuadrados (4 x 1 mm2) = 4 mm2. La profundidad de la cámara de 0,1 mm y la dilución de 5:50. Los valores resultantes fueron ajustados a una concentración deseada, para ello se aplica la ecuación de balance de masas:
(2)
Montaje del Ensayo _____________________________________________________________
Las unidades experimentales se establecen mediante microambientes con diversos tratamientos en tubos de ensayo de 16x15 mm capacidad de 15 mL (Figura 10) previamente esterilizados.
Los tubos del ensayo se preparan con 10 mL de medio de cultivo líquido Czapek-Czapek Dox enriquecido, el cual contenían por litro de solución: K2HPO4 1g, NaNO3 2g, KCl 0,5g, MgSO47H2O 0,5g, FeSO47H2O 0,001g / L más la adición de cloranfenicol como antibiótico a una concentración de 0,4 g/L (Casas, 1994), ajustando a pH 5,5 con una solución de HCl 1N previamente esterilizado a 121º C por 15 minutos.
Colocando 5% v/v de antraceno a 400 ppm preparado a partir de un compuesto de 98% de pureza disuelto en n-hexano, como fuente de carbono.
Cada medio se inocula con un 5% de esporas previamente cuantificadas a una concentración final de 1,5x106 esporas. μL -1, de igual manera se colocan dos controles positivos con 30g de sacarosa; glucosa y un control negativo sin fuente de carbono.
Este proceso se realiza en dos grupos por triplicado, un grupo para realizar el análisis de la biomasa y otro para la determinación de análisis físico-químico HAPs (Figura 10).
Grupo para análisis F.Q.
Grupo para medición de la Biomasa
T3 T2 T1 To
Con Inoculo de esporas al 5 %
Sin Inoculo de esporas en medio líquido
CzapekCzapek Dox, enriquecido con 5% de antraceno a 400 ppm
Figura 10. Distribución de en ensayo de Factibilidad, Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Los dos grupos de unidades experimentales se incuban a 30°C con agitación a 150 rpm en una incubadora marca LAB-LINE modelo AMBI-HiLO CHAMBLB.
Análisis
Físico
–
Químico
y
Medición de la Biomasa. _____________________________________________________________
Los dos grupos ensayados para el análisis físico-químico HAPs y la medición de la biomasa fueron evaluados en periodos de tiempo de cero, 15, 30, 60 días simultáneamente. El primer grupo, fue analizado por el método normalizado EPA 418.1 modificado, previamente descrito (De la Garza, 2005).
El segundo grupo respectivamente fue evaluado mediante la técnica de peso seco, para ello se procedió a pesar un tubo de ensayo seco con papel filtro sin la biomasa (M1), posteriormente se hace pasar la biomasa producida en los cultivos líquidos en un embudo Millipore swinnex (Figura 11A) en un papel filtro (membrana de nitrocelulosa) de 0,45 µm marca Millipore (Figura 11B) y se coloca en un tubo de ensayo seco con la biomasa filtrada (M2) y se lleva a una estufa a 60° C por 24hrs (Figura 11C), luego se pesa en una balanza analítica marca (Mettler H80) (Figura 11D).
Figura 11. Pasos para la técnica de peso seco de la biomasa en tubo de ensayo, Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco .
Finalmente conforme a la diferencia de peso con respecto al tubo seco más el papel filtro sin o con biomasa, ésta se cuantificó según la siguiente ecuación:
(3)
Dónde: M: biomasa en (g L-1), M2: tubo de ensayo después de secar a 60° C por 24hrs más la biomasa de microorganismos soportada sobre papel
filtro pesado en (g), y M1: Tubo de ensayo más papel filtro sin microorganismos pesados en (g). V: volumen de cultivo.
Los resultados obtenidos se determinan como perfil del crecimiento medido en (g L-1) realizando gráficos (Rhodes y col., 1997) y tablas para la comparación de los datos de velocidad de crecimiento μ y tiempo de duplicación td (Madigan y col., 2004). Se identifica el aumento y crecimiento del micelio a partir del desarrollo de las esporas a través del registro fotográfico a 4X, 10X, 40X con un microscopio óptico.La eficiencia de remoción se evalúa por el consumo del sustrato calculando el (%) de degradación, según la siguiente ecuación:
Porcentaje de degradación (APHA, 1998):
–
(4)
Ensayo
de
Tratabilidad
en
Microcosmos. _____________________________________________________________
En este ensayo se evalúa la remoción de las concentraciones de HAPs previamente determinadas en muestras de agua de La Bahía de Amuay utilizando la cepa con mayor capacidad para la remoción de los HAPs evaluada en el ensayo factibilidad.
Para esto se sometió los HAPs contenidos en el agua de La Bahía de A muay con el inóculo de la cepa seleccionada a un ensayo de bioaumentación, manteniendo una proporción fija de concentración de N/P de y un flujo constante de aire. Dividido en dos grupos uno para los análisis microbiológicos y otro para los análisis de HAPs (Xu y Lu 2010).
Toma de Muestra para Ensayo. ____________________________________________________________
La colecta se hace en embaces de vidrio colocando 20L de agua en cada punto de estación de muestreo, para un total de 60L estos se debe integrar y esterilizar para su posterior uso en el ensayo de tratabilidad.
Montaje de los tratamientos Figura 12. Ensayo de tratabilidad, microcosmos con sistema de aireación, Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco .
Para ello se prepararon microcosmos (Figura 12) en botellas de vidrio de 450 ml con tapa rosca perforada previamente esterilizada. A estas se les hizo pasar mangueras 1,5 cm de diámetro hasta un nivel interno adecuado para una aireación constante.
Las diversas mangueras fueron conectadas con uniones (T) divisoras de flujo y reductoras de presión a un sistema de aireación con compresores para acuario con capacidad de 140 L de una salida (Figura 12). Ajustando periódicamente la presión con las uniones reductoras para mantener un flujo constante y equitativo de aireación en todo el sistema preparado para los microcosmos. Cada microcosmo fue creado adicionando 50 ml del agua de La Bahía de Amuay previamente colectada e inoculado con esporas previamente ajustadas a una concentración de 2x106 esporas. μL-1 en proporciones de 5% y 10% v/v.
Figura 13. Inoculación de esporas con pipeta Pasteur, en sistema de tratabilidad en muestras de agua de la Bahía de Amuay con HAPs, Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco .
Las esporas fueron aireadas y fertilizadas para lograr un crecimiento que disminuya la concentración de HAPs presente en el agua de La Bahía de Amuay.
Cada microcosmo como unidad experimental fue sometido a tratamientos de fertilización de 1 mL / L Fertimax ® (Figura 14) con sus respectivos controles negativos como se muestra en la siguiente tabla:
Tabla 7. Características de tratamientos en microcosmos en ensayo de tratabilidad en muestras de agua de la Bahía de Amuay.
Fertilizante
Aireación
1 ml/L 1
+
+
2
+
+
3
-
+
4
-
+
5
-
-
Inoculo 2x106 esporas ml -1 5%
Inoculo 2x106 esporas ml -1 10%
+ + + + -
-
Fertilizante: (Fertimax ®), (+) selección, (----) Control no inoculado, (+++) Control inoculado, Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco .
Figura 14. Proceso de Fertilización con Fertimax ® en ensayo de tratabilidad. Fuente: José Araujo (2015) José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco .
Cada grupo de microcosmo fue diseñado con 5 tratamientos (Tabla 7) por triplicado cada uno con 4 réplicas para ser evaluados en los tiempos 0, 8, 15, 30, 60 días.
Análisis Físico-Químico y medición de la Biomasa. ____________________________________________________________
Los análisis físico-químicos que se realizan fueron descritos anteriormente (APHA, 1998; Araujo y col., 2006). Los hidrocarburos s aromáticos policíclico totales fueron determinados por el método EPA 418.1 (De la Garza, 2005) modificado, los cuales se determinaron al inicio y al final del ensayo.
La biomasa fue cuantificada por porcentaje de peso seco como fue descrito anteriormente por (Rhodes y col., 1997). El esquema de análisis físico-químico HAPs y medición de biomasa se realizó en un periodo de tiempo de 0, 15, 30, 60 días.
Así luce la bahía de Amuay tras derrame de petróleo por PDVSA, Panorama Digital, 2014 José Araujo 2020, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Las Costas de Falcón se ven afectadas por derrame de petróleo, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco.
Resultados y Discusión del Prospecto de Micorremediación
Aislamiento con Medios de Enriquecimiento. ____________________________________________________________
La tecnología con medios Czapek - Czapek Dox permitie aislar y caracterizar hongos en este caso de estudio se obtuvo hongos autóctonos de La Bahía de Amuay a partir de muestras de agua (Tabla 15) componente del que es posible aislar microorganismos del género Aspergillus (Okoro, 2008; Okoro y col., 2010, Petit, 2013).
Un estudio de referencia sobre el tema, señala que es posible obtener hongos del género Aspergillus en la Bahía, con capacidad para degradar hidrocarburos (Medina y col., 2014). Sin embargo el componente utilizado en el estudio antes mencionado fue el suelo de la playa de la zona, a diferencia del presente estudio cuyas muestras fueron del componente agua colectadas a un metro de la orilla.
Según lo antes expuesto se considera la interrelación entre el suelo con el agua donde existe un intercambio de las diversas poblaciones microbianas por efecto del oleaje por lo que es posible encontrar hongos del género Aspergillus tanto en el suelo como el agua del área de estudio. Este método es útil para obtener cepas características del genero Aspergillus con la aplicación de medios de enriquecimiento, similar a otros trabajos donde se usó el mismo método para el aislamiento de cepas fúngicas con capacidad de degradación de hidrocarburos (Petit, 2013; Medina y col., 2014).
Los hongos aislados fueron obtenidos de medios enriquecidos a una alta concentración de hidrocarburos (400 ppm) en la que fue posible aislar a diversas especies de hongos del género Aspergillus (Chávez-Gómez, 2003) (Figura 10), para garantizar que las cepas obtenidas tuviesen la capacidad de tolerar y crecer en presencia de estos. Esto permitió seleccionar cepas adaptadas para la evaluación de la degradación de HAPs (Tabla 3).
Nuestro caso de estudio nos permitió a partir del aislamiento se identificaron tres cepas de interés las cuales fueron caracterizadas e identificadas dentro del género de estudio. Unos de los aspectos de interés es que dentro del phylun Ascomycota el orden más común es el Eurotiales y dentro de este orden uno de los géneros con mayor frecuencia de aparición cosmopolita, asociada a la degradación de hidrocarburos es el género Aspergillus (Pernía, y col.,2012).
Caracterización Microbiana en la macro y micromorfología. ____________________________________________________________
Los medios aplicados para la caracterización por el sistema de identificación Klich y Pitt (1988); Klich (2000) permitieron aislar diversas cepas (Figura 20 y 21) mitospóricas del género Aspergillus (Abarca, 2000; Cruz, 2014). La clasificación sistemática de Aspergillus está asociada a los teleomorfos la cual se basa en las diferencias morfológicas y características culturales o de cultivo (Raper y Fennel, 1965; Samson, 2000).
Todos los hongos aislados caracterizados e identificados dentro del género Aspergillus (Figura 20 y 21) presentaron un símil con los caracteres morfológicos clásicos aun utilizados propuestos por Membrillera (1950); Klich y Pitt (1988); Samson (1985) y Kozakiewicz (1989); y los propuestos en las revisión de Abarca, (2000); Gautam (2012) así como en las guías de identificación morfológica y clave taxonómica actualizadas de Klich, (2000); Samson; (2004).
Los diversos cuerpos fructíferos de las cepas aisladas presentaron condióforos característicos de Aspergillus que incluyen aparatos conidianos los cuales parten de las hifas ordinarias del micelio, desarrolladas en el extremo libre de los pedicelos con tres zonas bien definidas (Minter y col., 1985; Nithiyaa, 2012),
La primera es la célula pie la cual une al cuerpo fructífero con el micelio, que puede o no estar separada con un septo (Eltem y col., 2004), la segunda es el estípe esta es una sección de la estructura con forma cilíndrica y alargada que proyecta al micelio reproductor fuera del micelio vegetativo (Klich, 2000; Samson; 2004) en forma aérea con geotropismo negativo.
La tercera es la vesícula, que se desarrolla en el extremo apical o ápice con forma esférica, hemisférica y a veces oval, globosa, subglobosa o elipsoidal (Abarca, 2000). Toda la estructura del conidióforo puede poseer (Figura 20 a, c, e) o no (Figura 21 a, c, d, e) una doble pared la cual es característica distintiva entre especies (Klich, 2000; Samson; 2004).
Sobre la vesícula se dispusieron células conidiogénicas denominadas comúnmente como fiálides (MSPINS, 2010; Cruz, 2014), sin embargo en diversas especies entre la vésicula y las fiálides se desarrollan otras células denominadas métulas (Minter y col., 1985).
Las cabezas conidiales que presentan únicamente fiálides se caracterizan como uniseriadas mientras que si presentan métulas y fiálides son biseriadas (Abarca, 2000; Cruz, 2014). A partir de la vesícula, se desarrollaron numerosas células conidiogénicas, que por un proceso de gemación dieron origen a esporas asexuales, los cuales produjeron rosarios o cadenas de conidias o conidios (Membriellera, 1950; Cruz, 2014). Este es el medio por el cual el hongo se propaga y da origen a
otros clones de la misma especie cuando consigue condiciones ambientales y de nutrientes favorables para su crecimiento.
Todos los caracteres evaluados para el género Aspergillus fueron consistentes con la revisión clásica de reuniones internacionales (Samson y Pitt, 1990; Klich y Pitt, 1988; 1990) y la caracterización morfológica moderna del género (Abarca, 2000; Klich, 2000; Samson, 2004; Samson y Varga, 2007; MSPINS, 2010; Cruz, 2014). La evaluación de las diversas cepas permitieron establecer dos especies en tres grupos de cepas, dos de Aspergillus flavus Link y uno de Aspergillus niger Van Tieghem (Tabla 15). Diversos trabajos documentan el aislamiento de hongos de Aspergillus flavus y Asperrgillus niger del agua con capacidades degradadoras de hidrocarburos (Petit y col., 2013; Okoro 2008; Okoro y col., 2010). Estas cepas (Tabla 3) fueron nombradas con la letra (A) para identificar su origen como la Bahía de Amuay, segundo del número de cepa y la letra (H) para identificar que el microorganismo asilado fue hongo, y los números siguientes corresponden a las estaciones de donde fueron colectadas las muestras.
Tabla 15 Caracterización Macro y Microscópica de las colonias de Aspergillus Cepa
Identificación Microscópica
Macromorfología del Micelio Borde
Elevación
Color
Forma
n
A2H123Af
Aspergillus flavus
Entero
Elevado Amarillo
Irregular
5
A1H23Af
Aspergillus flavus
Entero
Elevado
Redondo
3
A1H123An Aspergillus niger Ramificado Elevado
Verde
Negro Algodonoso 2
Características Macroscópicas de Biocatalizadores obtenidos ____________________________________________________________
Las cepas identificadas como Aspergillus flavus (Tabla 15) presentaron variantes macroscópicas características de la especie (Figura 20 b, c), con borde entero (Gautam, 2012), micelios elevados por encima del medio del cultivo en su crecimiento máximo dentro de la placa de Petri (Casas, 1994).
Las diversas colonias evaluadas fueron agrupadas en dos grupos que diferían en el color y la forma del micelio. Las cepas A2H123Af presentaron anverso en el de la placa un color amarillo de forma irregular (Figura 20 b) y las cepas A1H23Af poseían color verde con forma redonda (Figura 20 c), (Rodrígues, 2011) ambos grupos de cepas presentaron micelios blancos o incoloros vistos desde el reverso de la placa (Samson y Varga, 2007).
Estos resultados son consistentes con la morfología descrita para la especie a partir de los medios utilizados para la descripción estándar donde las diversas colonias de Aspergillus flavus Link, pueden presentar un color verde oliváceo a verde amarillento (Nithiyaa, 2012; Hedayati, 2007) con micelio blanco al reverso y en algunos casos esclerocios de color marrón a negro, con reverso incoloro (Abarca, 2000; MSPINS,
2010), la textura varió de lanosa a flocosa con micelios, variables en forma y tamaño (Figura 20 b, c), (Abarca, 2000; MSPINS, 2010).
Todas las características macroscópicas observadas en las diversas placas son variantes distintivas de la especie (Abarca, 2000; Samson y Varga, 2007; MSPINS, 2010) puesto que Aspergillus flavus Link mostró diversidad en las características morfológicas que dependen del hábitat proveniente (Rodrigues, 2011; Pildain, 2005).
A partir del aislamiento se obtuvo colonias caracterizadas e identificadas como Aspergillus niger (Tabla 15), las placas de Petri (Figura 21 b) mostraron colonias con bordes ramificados, micelio elevado, color negro y forma algodonosa con aspectos típicos de la especie evaluados en placa de Petri en medio Czpeck (Casas, 1994; Gautam, 2012). Las diversas colonias se agruparon en la cepa A1H123An cuya característica principal observable fue poseer color negro (Abarca, 2000) con textura granular y una faz incolora o color crema (MSPINS, 2010).
Figura 20. Aspergillus flavus Link A. Idiotipo de cuerpo fructífero, B. Cepa en placa de Petri cepa A2H123Af (amarillo), C. Cepa en placa de Petri cepa A1H23Af (verde), D. Cuerpo fructífero 100X (tinción azul), E. Cuerpo fructífero 40X, F. cuerpo fructífero 10X (tinción azul), G. cuerpo fructífero 10X. Fuente: José Araujo (2015).
Figura 21. Aspergillus niger A. Idiotipo de cuerpo fructífero, B. Crecimiento en placa de Petri, C. Micelio reproductor y vegetativo a 40X, D. Micelio reproductor a 10X, E. Cuerpo fructífero 100X, F. cuerpo fructífero 40X. Fuente: José Araujo (2015).
Características Microscópicas ____________________________________________________________
Aspergillus flavus (A. flavus): Las cepas A2H123Af y A1H23Af presentaron gran cantidad de cabezas aspergilares de color amarillo a verdoso caracteres distintivos de Aspergillus flavus. La evaluación del micelio reproductor mostró cuerpos fructíferos característicos de la especie (Abarca, 2000; Casas, 1994), esta descripción corresponde a la propuesta por Link (1809) primer trabajo establecido para la especie (Abarca, 2000).
En la actualidad esta especie se encuentra dentro del grupo que describe su nombre, como grupo flavi, flavus o Aspergillus flavus que agrupa a 9 especies y 2 variedades genéticamente relacionadas (Hedayati, 2007). La taxonomía del grupo es por demás complicada por la existencia de divergencias morfológicas en los diversos aislados, por lo que la identificación aún está basada en criterios únicamente morfológicos distintivos (Klich y Pitt, 1988; Klich 2000, Samson, 2004), ya que los aspectos de identificación polifásica evidencian diferencias tan pequeñas que no permiten lograr un consenso para definir nueva subespecies o variedades por lo que aún se consideran las diversas variantes como una especie (Kurtzman, 1986; Klich 2000; Samson, 2004).
El micelio reproductor mostró al análisis de microscopía fotónica conidióforos con doble pared en toda la estructura del cuerpo fructífero (Figura 20 a, d, e), desde la base o pie hasta el estípe y la vesícula, donde
se observó bien diferenciada. La constitución de la estructura fue hialina o pigmentada y los tamaños de las estructuras variaron entre 3-6 μm (Tabla 16), esta data es similar a lo propuesta por otros trabajos considerados como bibliografía clásica quienes establecen un rango para los conidióforos entre 1,5 a 3 mm de largo y 15 a 20 mm de diámetro (MSPINS, 2010; Casas, 1994). Y corroborada por los trabajos específicos para la identificación taxonómica propuesta por (Klich, 2000; Samson, 2004).
La observación al microscopio esterioscópico (Tabla 16), de los cuerpos aspergilares conidianos presentaron estipes de 500-700 μm de longitud y vesículas del conidióforo con 20-45 μm de ancho con formas globosas y subglobosas (Figura 20 d, e, f, g) con fiálides uniseriadas de 8-12x3-4 μm o con un esterígma intermedio o métula (fiálide biseriada) cuyos tamaños fueron de 8-10x5-7 μm.
Los dos tipos de fiálides fueron observados en el mismo cultivo (Casas, 1994). Las disposiciones morfológicas de las conidias fueron observadas ligeramente columnares (Figura 20 d) y radiales (Figura 20 e). Todos los conidióforos estuvieron conformados por fialoconidias a partir de las cuales se desarrollaron los conidios o conidias, de formas globosas y rugosas con tamaños de 3-6 μm, con color castaño, marrón o negro (MSPINS, 2010).
El hallazgo de la especies A. flavus a partir de muestras de agua supone que su introducción a este componente y al suelo en La Bahía de Amuay sea a partir de aire exterior puesto que este es un hongo de distribución mundial ya que sus conidios se dispersan y transportan en las corrientes aéreas (Hedayati, 2007).
De igual manera se ha documentado que este tipo de hongo mitospórico posee habilidad para sobrevivir en condiciones climáticas áridas y secas (Kameswaran y col., 1992; Khairallah, 1992), y prospera en climas cálidos y húmedos, por lo que es muy frecuente en países tropicales (Pildain, 2005; Hedayati, 2007). Es por ello que este tipo de hongo tiene un rango de crecimiento entre 12 a 48 ºC con una temperatura optima de 37 ºC (Hedayati, 2007), puede estar presente en el agua superficial (Warris, 2001).
Un Aspecto de interés es que A. flavus está descrita como una principal especie productora de aflatoxinas, además el A. flavus produce otras sustancias, entre ellas ácido oxálico, ácido kójico, ácido aspergílico y sustancias afines, ácido betanitropoínico. Algunas de estas sustancias son antibióticas como el ácido kójico (Casas, 1994).
Arpergillus niger (A. niger) Las cepas A1H123An presentaron cabezuelas aspergilares de color negro carbón (Figura 21 c, d) o pardo negruzco de diversos tonos oscuros (Figura 21 e, d), a partir del cual se describe las características microscópicas (Tabla 16) definidas para la especie Aspergillus niger Van Tieghem (Vega, 2002; Gautam, 2012).
Estas características son tomadas en cuenta en la clasificación de la sección Nigri; Niger o complejo de especies A. niger, que incluye diversos organismos dentro del taxón en el que se ilustran 132 especies dentro de 18 grupos como describe Raper y Fennell (1965) los cuales siguen basándose en caracteres morfológicos y fisiológicos para su distinción (Abarca, 2004; Wucherpfennig, 2011; Gautam, 2012).
Las evaluaciones microscópicas evidenciaron un micelio vegetativo con hifas septadas, el micelio reproductor presentó cuerpos fructiferos
donde casi todos los conidióforos arrancaron a partir de células pie o hifas sumergidas incoloras (Figura 21 d) o amarillentas, con colores pardos en las proximidades de la vesícula (Vega, 2002).
Las texturas observables del conidióforo fueron lisas (Figura 21 e), con pared gruesa. Normalmente estas estructuras se rompen con facilidad hendiéndose longitudinalmente en lacinias (Figura 21 d), aunque no son tabicadas algunas veces pueden presentan algún tabique delgado (Menbrillera, 1950). La longitud y grueso fue muy variable de unas estípes a otras, oscilando entre 400-2500 micras (Tabla 4) (Gautam, 2012).
Las vesículas del conidióforo (Tabla 16) presentaron pared gruesa, con formas redondas, globosas o subglobosas (Colin, 2013), de 30-75 micras (Figura 21 c, e, f) sin embargo estas pueden llegar hasta las 100 micras de diámetro (Gautam, 2012). Sobre estas estructura con un centro globoso esférico se desarrollaron radialmente métulas y fiálides como esterígmas que en las colonias jóvenes se presentaron como pequeñas cabezuelas reducidas a una serie (uniseriadas) (Figura 21 d) (Samson 2004, Abaraca, 2004; Cruz, 2014).
Sin embargo corrientemente se observaron dos series (biseridas), casi siempre de color pardo negruzco, a veces incoloros (Figura 21 a, e); los de la primera serie o métulas se encontraron apretados y midieron entre 12-20 micras por 3-6 micras de diámetro; y los de la segunda serie o fiálides, más flojos, midieron 7-10 micras por 3-4 de diámetro (Tabla 4) (Klich, 2000; Samson, 2004).
Posterior a estas estructuras se escinden en columnas radiantes cadenas conidiales de conidios o conidias que se desarrollaron como esporas asexuales con tamaños evaluados al microscopio fotónico de 3-4,3
micras de forma globosa, sub esféricas de color hialino a café (Kozakiewicz, 1989; Gautam, 2012; Cruz, 2014). .
Aspergillus niger no es un patógeno humano significativo ya que solo se ha reportado ser capaz de producir reacciones alérgicas, aunque esta especie es capaz de producir varias micotoxinas, sin embargo, la producción de micotoxinas parece ser controlada por las condiciones de fermentación (Casas, 1994).
Tabla 16 Diámetro de colonias y dimensiones estructurales de las especies del género Aspergillus del Phylum Ascomycota del orden Eurotiales caracterizadas.
Característica
A. flavus
A. niger
500-700
400-2500
20-45
30-75
Métula (μm)
8-10x5-7
12-20x3-6
Fialides (μm)
8-12x3-4
7-10x3-4
Conidios (μm)
3-6
3-4,3
Estipe (longitud, μm) Vesícula (anchura, μm)
Microscopía Electrónica ____________________________________________________________
El análisis por microscopia electrónica mostró diversas estructuras típicas del cuerpo fructífero de la especie Aspergillus niger (Figura 22) en el que fue posible identificar a 130X hifas y cabezas conidiales a que se correspondían con los caracteres propuestos para la especie (Abarca, 2004; Samson 2004), de igual manera fue posible evidenciar columnas de esporas o conidios asexuales (Gautam, 2012).
Las observaciones que resolvieron imágenes a 800X (Figura 23), permitieron evidenciar con mayor detalle la naturaleza cenocítica de las hifas, la presencia de estipes como parte de la célula conidiogénica y el conjunto de conidos que forman cadenas abundantes como racimos de esporas o rizos conidiales desde la vesícula del conidióforo. También es posible detectar en la parte superior de la micrografía como grupos de esporas se separan de las cadenas o en el plano contraste detrás de la estructura del cuerpo fructífero como se encuentra esporas aisladas, la cual es la base de la dispersión de estas esporas que son transportadas por el aire hacia otros componentes como el suelo y el agua.
Figura 22. MEB, Aspergillus niger, (H) hifas; (Co) Cabeza condial o conidióforo; (E) Estípe; (Col) Columna de cadenas conidiales o conidas (esporas asexuales). Fuente: José Araujo (2015). La visualización con aumentos de 8000X (Figura 24) permitió identificar la naturaleza de los conidios con textura rugosa y espinulosa (Kozakiewicz, 1989). El uso de la herramienta de cálculo micrográfico en plano de contraste del microscopio electrónico FEI Quanta (FEI, 2008) permitió evaluar los diversos tamaños de las esporas de la especie evaluada (Tabla 17), la media de las esporas evaluadas fue de 4,06 μm con un mínimo de 3,46 μm y un nivel máximo de 4,55 μm (Colin, 2013).
Figura 23. Micrografía de cuerpo fructífero de Aspergillus niger; (H) hifa; (E) estípe (CF) Cuerpo Fructífero, Fuente: José Araujo 2015, 2016.
Los diámetros obtenidos son más grande que las reportadas para la especie en 3,5 micras (T-H Fang, 2011) lo cual puede ser un indicio del reforzamiento de la pared fúngica frente al estrés sometido, o una posible modificación de una cepa adaptada al uso de HAP de igual manera estas construyen una guarnición de reserva como agentes remediadores cuando de forma natural sea necesario, o la base para la
extracción de enzimas capaces de degradar compuestos de interés ambiental como los HAPs.
Tabla 17 Medidas de resumen de estadística descriptiva para la evaluación del diámetro en micras de conidios o esporas evaluadas por microscopía electrónica de barrido. n
Media
D.E.
Mín
Máx
15
4,06
0,32
3,46
4,55
Desviación Estándar (D.E.), Valores Mínimos (Min), Valores Máximos (Máx). Fuente: José Araujo (2015, 2016).
Figura 24. Micrografía de conidios o esporas en plano de contraste con cálculo de tamaños. Fuente: José Araujo 2015 José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco .
Figura 25. Micrografía de conidia o espora. Fuente: José Araujo 2015; 2016 José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco .
La ornamentación (Figura 25) superficial de las esporas o conidias estudiadas presentó una estructura globosa, rugosa y espinulosa (Kozakiewicz, 1989; Abarca, 2004), las proyecciones con pigmento depositado en los tubérculos o espinas entre las capas de tegumento los que es propio de la ornamentación de una espora verrucosa característica de A. niger (Kozakiewicz, 1989; Varga, 2000; Gautam, 2012; Cruz, 2014).
Selección Aspergillus
de mas
la
cepa eficiente
de en
degradar HAPs ______________________________________ Inoculo Obtenido
Los métodos aplicados lograron recuperar esporas viables frescas del género Aspergillus con cepas de las especies Aspergillus niger y Aspergillus flavus estas se encontraron ajustadas a 1,5 x106 esporas/ μL-1 en solución isotónica de NaCl cuyas características son similares a una patente propuesta para catalizadores fúngicos (León y col., 2007). Estas esporas permitieron escalar su volumen a los diversos tratamientos para cada microcosmo que permitió activar la bioconversión in vitro y propiciar la actividad carbonoclástica sobre los hidrocarburos aromáticos policíclicos HAPs.
Análisis Físico-Químico y medición de la Biomasa ______________________________________ Medición de la biomasa por peso seco Los resultados obtenidos para las tres cepas (Figura 26, 27, 28) previamente caracterizadas fueron analizadas por la técnica de peso seco, estas mostraron un perfil de crecimiento para el control positivo conformado por dos tratamientos donde la fuente de carbono fue glucosa (C+glu) y sacarosa (C+sac) respectivamente, un control negativo sin fuente de carbono (C), y la unidad de estudio cuyo tratamiento poseía HAPs como fuente de carbono (C + H).
La comparación de los diversos tratamientos aplicados para la evaluación del perfil de crecimiento por peso seco mostró diferencias significativas (p<0,05) en los diferentes tratamientos, con máximos crecimientos en los controles positivos con glucosa (C+glu) y sacarosa (C+sac) en las tres cepas evaluadas (Figura 26, 27, 28), Glu: A. flavus A2H123Af (4,00 g.L-1); A1H23Af (4,10 g.L-1) y A. niger A1H123An (4,00 g.L-1) Sac: A. flavus A2H123Af (3,30 g.L-1); A1H23Af (3,40 g.L-1) y A. niger A1H123An (4,50 g.L-1) y mínimos o casi nulos en los controles negativos (C).
Las tres cepas evaluadas donde la fuente de carbono fue HAPs, presentaron una elevación constante de la biomasa (Tabla 18) y el análisis de la varianza no mostró diferencias significativas entre las
medias del peso evaluado. Sin embargo la cepa que mostró mayor valor fue la identificada como Aspergillus niger 3 g.L-1,
En cuanto a la velocidad de crecimiento (μ) las cepas Aspergillus niger A1H123An, presento el mayor valor con (0,8 g.día-1) seguido de Aspergillus flavus A2H123Af (0,7 g.día-1) y Aspergillus flavus A1H23Af (0,5 g.día-1) respectivamente, a evaluar los valores máximos de la velocidad de crecimiento, los cuales se encontraron en el periodo correspondiente entre 0-8 días (Tabla 19).
De igual manera las cepa Aspergillus niger A1H123An presentó el menor tiempo de duplicación td (1,2 días) seguido de Aspergillus flavus A2H123Af con un td (1,4 días) y Aspergillus flavus A1H23Af con un td de (2,0 días).
El estudio metabólico sobre el uso de estos carbohidratos por el género Aspergillus y las cepas estudiadas supone el aprovechamiento de los carbohidratos según su concentración y la capacidad de inducir comportamientos de represión y activación catabólica, que impulsan rutas anapleróticas para su uso, lo que permite desplazar el control de la glucolisis para su aprovechamiento desde la ingeniería metabólica (Aguilar y col., 2001; Torres, 1994).
Los tratamientos presentaron valores de aumento en la biomasa con comportamiento similares a los controles positivos, los cuales incorporaron carbono disponible del medio proporcionados en forma de HAPs. Esto es posible dado que el género Aspergillus posee un conjunto de oxidasas que le permiten la transformación de compuestos aromáticos como los HAPs presentes en los hidrocarburos como lo demostró el crecimiento durante todo el ensayo similar a lo obtenido por Naranjo y col., (2007) y Pernía, y col., (2012).
De hecho, la actividad oxigenasa de Aspergillus sobre los HAPs es capaz de degradar diversos hidrocarburos con anillos con un orden de actividad de benceno < antraceno < fenantreno < pireno. Este tipo de actividad enzimática tiene como primer pasó asimilatorio la formación de moléculas intermediarias donadoras de electrones, conocidas como sustratos de partida la cuales son donadores de electrones, estas son el catecol, protocatecuato y el gentisato; (Ramachandran y col., 1979)
Estas moléculas son transformadas por las oxigenasas aerobias que incorporan el carbono al ciclo de Krebs, por medio de succinato, acetilCoA, piruvato o bajo una vía glucolítica anaplerótica (San Martín, 2011), que incluye la obtención de energía a partir de los HAPs (Chaillan, 2004) en reacciones de óxido-reducción de la cadena respiratoria la cual constituye el principio bioquímico de la biorremediación (Häggblom y col., 1995).
5
biomasa (g .L-1)
4,5 4
C + glu (C)
3,5
C + sac (d)
3 2,5
C + H (b)
2 1,5 1
C
0,5
(a)
0 0 8 Czapeck libre de hidrocarburos Czapeck + sacarosa
15
30 60 Czapeck + glucosa Czapeck + hidrocarburo
dias
Figura 26.Promedio aritmético de la biomasa de Aspergillus flavus cepa A2H123Af evaluada en ensayo de factibilidad medido en (g L-1). Czpeck libre de hidrocarburos (C); Czapeck + glucosa (C+ glu); Czpaeck + sacarosa (C+sac); Czapeck + hidrocarburo (C+H); Las letras distintas (a), (b), (c), (d) indican diferencias significativas (p<=0,05) en análisis de varianza, Fuente: : José Araujo 2015, 2016 a y b, 2020 ©.
4,5
C + glu
biomasa (g. L-1)
4 3,5
(C)
C + sac
(d)
3 2,5
C+H
2
(b)
1,5 1
C
0,5
(a)
0 0
8
15
Czapeck libre de hidrocarburos Czapeck + sacarosa
30
60
dias
Czapeck + glucosa Czapeck + hidrocarburo
Figura 27.Promedio aritmético de la biomasa de Aspergillus flavus cepa A1H23Af evaluada en ensayo de factibilidad medido en (g L-1). Czpeck libre de hidrocarburos (C); Czapeck + glucosa (C+ glu); Czpaeck + sacarosa (C+sac); Czapeck + hidrocarburo (C+H); Las letras distintas (a), (b), (c), (d) indican diferencias significativas (p<=0,05) en análisis de varianza, Fuente: : José Araujo 2015, 2016 a y b, 2020 ©. 5
C + sac
4,5
(b)
C+H (C) C + glu
4
biomasa (g.L-1)
(d)
3,5 3 2,5 2
1,5 1
C
0,5
(a)
0 0
15
30
90
Czapeck libre de hidrocarburos
Czapeck + glucosa
Czapeck + sacarosa
Czapeck + hidrocarburo
días
Figura 28.Promedio aritmético de la biomasa de Aspergillus niger cepa A1H123An evaluada en ensayo de factibilidad medido en (g L-1). Czpeck libre de hidrocarburos (C); Czapeck + glucosa (C+ glu); Czpaeck + sacarosa (C+sac); Czapeck + hidrocarburo (C+H); Las letras distintas (a), (b), (c), (d) indican diferencias significativas (p<0,05) en análisis de varianza, Fuente: : José Araujo 2015, 2016 a y b, 2020 ©.
Tabla 18 Medidas de resumen de estadística descriptiva para la evaluación del peso seco (g.L-1) de cepas aisladas y caracterizadas del género Aspergillus.
Especie
D.E.
Mín
Máx
Media
Aspergillus flavus A1H23Af
0,7
0,03
2
1,01 (a)
Aspergillus flavus A2H123Af
0,75
0,01
2,1
1,06 (a)
Aspergillus niger A1H123An
1,04
0,01
3
1,51 (a)
Desviación Estándar (D.E.), Valores Mínimos (Min), Valores Máximos (Máx). Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05), Fuente: : José Araujo 2015, 2016 a y b, 2020 ©.
Tabla 19 Medidas de resumen de estadística descriptiva para la evaluación de la velocidad de crecimiento μ / td (g.dias-1) de cepas aisladas y caracterizadas del género Aspergillus.
Velocidad de crecimiento μ
0-8
8-15.
15-30
30-60
D.E.
MIN
MAX
Aspergillus flavus A2H123Af
0,7
0,03
0,2
0,3
0,25
0,03
0,7
Aspergillus flavus A1H23Af
0,5
0,03
0,2
0,3
0,17
0,03
0,5
Aspergillus niger A1H123An
0,8
0,1
0,3
0,5
0,28
0,09
0,8
Aspergillus flavus A2H123Af
1,41
1,20
0,96
0,87
0,21
0,87
1,4 7
Aspergillus flavus A1H23Af
2,02
1,58
1,24
1,07
0,36
1,07
2,0 5
Aspergillus niger A1H123An
1,18
1,02
0,87
0,76
0,16
0,76
1,2 8
Velocidad de crecimiento μ
Desviación Estándar (D.E.), Valores Mínimos (Min), Valores Máximos (Máx), Fuente: : José Araujo 2015, 2016 a y b, 2020 ©.
Eficiencia
de
remoción
y
porcentaje de degradación ____________________________________________________________
Las cepas evaluadas en el grupo para el análisis físico-químico HAPs presentaron una disminución de la concentración de HAPs en el tiempo, la pendiente de disminución se puede observar en la Figura 29. A los 60 días se evidencia una notable disminución de los hidrocarburos ensayados, la cual se mantuvo constante para las tres cepas ensayadas las cuales no presentaron diferencias significativas (p<0,05) en los diversos tratamientos excepto en el control negativo, este tipo de comportamiento es similar al reportado por otros trabajos (Petit y col, 2013; Medina y col, 2014)
Concentraciòn de HAPS mg/L
25 20 15 10 5 0 0
8
15
30
60
Dias
Aspergillus flavus A2H123Af HPA Czapeck + hidrocarburo
Aspergillus flavus A1H23Af HPA Czapeck + hidrocarburo
Aspergillus niger A1H123An HPA Czapeck + hidrocarburo
Control Testigo HPA Czapeck + hidrocarburo
Figura 29. Concentración de HAPs, para cada cepa identificada en ensayo de factibilidad Fuente: : José Araujo 2015, 2016 a y b, 2020 ©.
La evaluación del porcentaje de remoción mostró diferencias significativas (p< 0,05) entre las tres cepas ensayadas (Figura 30). La cepa Aspergillus niger A1H123An presentó el mayor % de remoción de hidrocarburos con 72,2 % seguido de Aspergillus flavus A1H23Af con 64,8 % y por ultimo Aspergillus flavus A2H123Af con 61,9 %. Las diversas cepas evaluadas mostraron ser capaces de disminuir la concentración de hidrocarburos la cual se contrasta con aumentos de biomasa, esto es consistente con revisiones sobre el tema donde se consideran mayores capacidades de remoción de hidrocarburos para Aspergillus niger seguido de Aspergillus flavus y en especial los de tipo aromático motivo por el cual fue utilizada para ser probada en el ensayo de tratabilidad (Pernia, 2012).
Entre los 0-60 se evidencia una fase típica de crecimiento exponencial de la biomasa (Figura 26,27, 28), de igual manera la mayor disminución de la concentración de los hidrocarburos fueron entre los 15 y 60 días (Figura 29) consistente con otras investigaciones que tratan sobre el tema, la cual propone la influencia del tiempo en el resultado lo que relaciona estos datos con la capacidad máxima de adaptación con aumento de biomasa (Pernía, y col.,2012).
Los resultados son consistentes con el modelo no estructurado de crecimiento en el cual se relaciona el aumento de la biomasa del microorganismo y con la variación de la concentración del sustrato, el cual suele ser limitante es por esto que a medida que aumenta la biomasa por peso seco en el tiempo también en posible contrastarla con la disminución de la concentración de los hidrocarburos (Wunder y col., 1994; Petit, 2013; Medina y col., 2014).
(c)
74,0 Aspergillus niger A1H123An; 72,2 72,0
70,0
(b) 68,0
Porcentaje %
(a) 66,0
Aspergillus flavus A1H23Af; 64,8
64,0
62,0
Aspergillus flavus A2H123Af; 61,9
60,0
58,0
56,0
Figura 30. Remoción de hidrocarburos totales durante el estudio de factibilidad en las cepas del género Aspergillus, Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05). Fuente: : José Araujo 2015, 2016 a y b 2020 ©.
Tratabilidad en Microcosmos
Ensayo de Tratabilidad ____________________________________________________________ El ensayo de tratabilidad permitió evaluar el diseño experimental para la determinación del peso seco (Figura 31). Los resultados mostraron diferencias estadísticas (p<0,05) conformando 3 subgrupos el grupo que obtuvo mayor elevación de la biomasa (b) consistió en los tratamientos con fertilización sin diferencias entre las concentraciones de esporas al F 5% y F 10%. De igual manera el subgrupo (ab) estuvo conformado por los tratamiento en donde no se aplicó fertilización y el tercer subgrupo (a) correspondió al control negativo.
5 4,5 4
Gramos gr
3,5 3
(b)
2,5
(ab) 2 1,5 1 0,5
(a) 0 0 1 - F 5% (b)
8 2 - F 10% (b)
15 3 - 5% (ab)
30 4 - 10% (ab)
60 5 - (-) (a)
Figura 31.Promedio aritmético de la biomasa de Aspergillus niger cepa evaluada en ensayo de tartabilidad medido en (g L-1); las letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05) en análisis de varianza, Fuente: : José Araujo 2015, 2016 a y b, 2020 ©.
El ensayo de tratabilidad aplicado a las unidades experimentales evaluadas para la concentración de HAPs (Figura 32) presentó 3 subgrupos con diferencias estadísticas (p<0,05) el grupo en el que se observó mayor disminución de la concentración de HAPs totales fue en el que se aplicó fertilización (a) sin diferencias estadísticas entre los grupos donde se utilizó 5% y 10% de esporas para el tratamiento, seguido de los tratamientos donde no se aplicó fertilización (ab) a dos concentraciones de esporas y el ultimo subgrupo conformado por el control negativo.
El uso del carbono proveniente de los HAPs es producto de la escisión del anillo aromático el cual es usado como fuente de carbono disminuyendo su presencia dentro de los microcosmos evaluados y su disminución es equivalente a la descontaminación de matrices como el agua que puede ser vehículo de este tipo de contaminante de interés ambiental (Rozalska y col., 2010).
25
(c)
20
15
(ab) 10
(a) 5
0 0
8
15
1 - F 5% (a)
2 - F 10% (a)
4 - 10% (ab)
5 - (-) (c)
30
60
3 - 5% (ab)
Figura 32. Concentración de HAPs en ensayo de Tratabilidad, las letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05) en análisis de varianza Fuente: : José Araujo 2015, 2016 a y b 2020 ©.
La eficiencia de remoción evaluada en el ensayo de tratabilidad (Figura 33) por el (%) de degradación no mostró diferencias significativas entre los diferentes tratamientos, excepto con el control negativo. En el ensayo de tratabilidad fue posible obtener porcentajes superiores al 50% donde en especial en los tratamientos que incluyen la conbinación de aireación y fertilización lo que es consistente con porcentajes similares obtendos en trabajos similares (Acevedo y col., 2010; Sánchez, 2006; Guiraud y col., 2008; Qiang y col., 2009; Ye, 2001).
100 90
85,7
85,9
84,3 77,1
80 70 60 50 40 30 20 10
0
0 1 - F 5%
2 - F 10%
3 - 5%
4 - 10%
5 - (-)
Figura 33. Remoción de HAPs durante el estudio de tratabilidad en la cepa de Aspergillus niger. Fuente: José Araujo 2015, 2016 a y b 2020 ©.
Las especies estudiadas se encuentran dentro de un grupo capaz de generar conversiones crabonoclásticas puesto que la revisión sobre el tema de degradación de hidrocarburos como fuente energética establece entre las especies representativas a del género Aspergillus. Varios estudios demuestran que Aspergillus niger es capaz de degradar con facilidad HAPs Bamforth (2005); Wunder y col., (1994) y como especie es utilizada como un catalizador de interés en la industria clasificada como GRAS (generally regarded as safe) por su amplia capacidad enzimática. De hecho, es posible encontrar a A niger con capacidad de degradar diversos tipos de HAPs. (Cortés-Espinosa y Absalón, 2013). De igual manera Aspergillus flavus se ha probado ser capaz de degradar diversos tipos de hidrocarburos (Adekunle, 2005) incluyendo la fracción aromática (Pernía, y col.,2012).
A través del análisis multivariado se obtuvo un cluster (Figura 34) para comprar los el porcentaje de remoción de los diversos tratamientos aplicados en el ensayo de tratabilidad. Se estructuraron jerarquías por similitud que dimensionaron las variables, con un nodo que genera un árbol binario en el que se destaca la formación de dos grandes grupos uno para el control negativo y otro donde se conglomeran de forma binaria los tratamientos donde no se aplicó fertilización y otro donde se encuentran los tratamientos donde se aplicó fertilización.
Encadenamiento promedio (average linkage)
5 - (-) 3 - 5% 4 - 10% 2 - F 10% 1 - F 5%
-0,11
0,49
1,10
1,70
2,31
Dis tancia
Figura 34. Análisis multivariado para de degradación y aumento de biomasa para los diversos tratamientos Jose Araujo 2016, 2020 ©
Los hongos filamentosos del género Aspergillus se desarrollan en ambientes donde la fuente de carbono es de difícil acceso y proviene de compuestos recalcitrantes debido a la extraordinaria capacidad de
adaptarse a los cambios ambientales utilizando su maquinaria enzimática la cual es útil para hacer disponibles compuestos tóxicos, exógenos y xenobióticos, por lo que son capaces de crecer en ambientes donde están presentes los HPAs y juegan un papel de interés en la mineralización de este tipo de contaminante ambiental. Es por esto que son una elección para generación de tecnologías que permitan la catálisis de reacciones carbonoclásticas para la remoción y descontaminación de matrices como los cuerpos de agua. Los catalizadores hidrocarnoclásticos utilizados son efectivos para la descontaminación de aguas contaminadas con HPAs. Se propone el aislamiento e inmovilización de las enzimas hidrocarbonoclásticas para procesos de biorremediación a gran escala (Araujo, 2016).
A. flavus HPA Agua de Bahía de Amuay A. niger HPA Agua de Bahía de Amuay A. flavus Biomasa Agua de Bahía de Amuay A. niger Biomasa Agua de Bahía de Amuay 3,5 3
20
Biomasa de Biocatalizadores [g/l]
Concentración de HPAs [mg/l]
25
2,5
15
2
10
1,5 1
5
0,5
0
0 8
15
30
90
180
360
Fuente José Araujo 2015, 2016, 2020 ©
La siguiente figura muestra como disminuye la concentración de hidrocarburos HAPs e inversamente proporcional aumenta la biomasa de los biocatalizadores. Entre los 8-15 se evidencia una dinámica de fase de adaptación típica a partir de 15 hasta 180 se evidencia una fase típica de crecimiento exponencial de la biomasa.
De igual manera, se evidencia que las mayores degradaciones fueron entre los 90 y 180 días consistente con otras investigaciones que
tratan sobre el tema, la cual propone la influencia del tiempo en el resultado lo que relaciona estos datos con la capacidad máxima de adaptación con aumento de biomasa y constante de crecimiento así como la disminución de la concentración de los HPAs como sustrato.
Los resultados obtenidos son consistentes con el modelo no estructurado de crecimiento en el cual se relaciona el aumento de la biomasa del microorganismo y con la variación de la concentración del sustrato, el cual suele ser limitante. Se presenta una correlación directa con la Ley de Malthus en el que se describe un crecimiento balanceado en el que fue posible describir el sistema en el que existe un consumo del sustrato y un aumento de la biomasa. Sin embargo este sistema no puede describir la fase estacionaria y solo es útil para los sistemas naturales donde la disponibilidad de sustrato tiende a ser ilimitada para el sistema (Araujo, 2016).
A través del análisis multivariado de los componentes principales y análisis de cluster. Se estructuraron jerarquías por similitud que dimensionaron las variables, se destaca la formación de dos grandes grupos compuestos en el dendograma o árbol binario como muestra la figura anterior entre el aumento de la biomasa y la degradación de los HPAs estos dos grupos heterogéneos poseen una variabilidad interna homogénea con reconocimiento de patrones. Cada rama posee dos nodos diferenciados entre la biomasa y la degradación de HPAs (Araujo, 2016).
Las transformaciones microbianas generan transferencia de materia entre las fases del sistema. Los valores de aumento de biomasa y disminución de HPAs generan un balance de materia que permite establecer las condiciones del esquema tecnológico. El sistema tecnológico se establece en función de los elementos de entrada y salida en el flujo del proceso a partir de los resultados obtenidos en el que es posible hacer un proceso de biorremediación aplicando mcirorremediación. Esto permite establecer las fases de interés y para la preparación del biocatalizador y establecimiento de sus propiedades biocatalíticas el biotratamiento y separación entre el aumento de la biomasa y la descontaminación del agua con HPAs y la posterior evaluación de la naturaleza del componente luego de aplicar la tecnología de biorremediación.
Derrame en las Costas de Falcón, tomado de foto prensa, José Araujo 2020, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco
Conclusiones sobre el Tema ____________________________________________________________
1.-Los parámetros físico-químicos evaluados se encontraron dentro los límites establecidos en la normativa ambiental y permitieron el crecimiento de hongos del género Aspergillus.
2.-El uso de hongos autóctonos del género Aspergillus de la Bahía de Amuay permitió la remoción de HAPs presentes en agua contaminada con estos contaminantes ambientales.
4.- Los hongos evaluados Aspergillus niger yAspergillus flavus son capaces de crecer en presencia de concentraciones elevadas de antraceno como principal representante de HAPs.
5.- La evaluación por microscopía electrónica permitió identificar un aumento en el tamaño reportado para Aspergillus niger es puede ser producto de un reforzamiento de la pared celular fúngica cuando el hongo crece en presencia de HAPs como el antraceno
6.-Los HAPs presentaron altos porcentajes de remoción lo que permite a esta tecnología ser un elemento de interés para la descontaminación del agua
7.-Los resultados de tratabilidad muestran que la aplicación de la técnica de bioaumentación y fertilización con los hongos seleccionados son efectivos para la descontaminación de aguas impactadas por este tipo de hidrocarburo.
Derrame en las Costas de Falcón, afecta a los Manglares este ecosistema puede desaparecer por el efecto nocivo del petróleo en las raíces aéreas de los manglares tomado de foto prensa, José Araujo 2020 © #prof.josearaujo #josearaujoblanco.
Frente a los derrames de Petróleo que siguen ocurriendo en las costas Falconianas de Venezuela, se encuentran en peligro de existencia especies de Manglares que conforman un ecosistema de transición clave para los ecosistemas marinos y terrestres permitir su daño y muerte masiva traerá a futuro consecuencias catastróficas, el estudio y uso de tecnologías de biotecnología ambiental con el uso de microorganismo es un hecho demostrado que ha permitid sanear espacios impactados con hidrocarburos.
La limpieza de estos espacios debe incluir la eliminación de los HAPs en el medio ya que estos son los más tóxicos y perjudiciales a la salud de todos los seres vivos de la flora y fauna e incluso la salud humana. Los hongos y bacterias autóctonos han desarrollado un proceso evolutivo de inducción que en algunos casos permite utilizar estas propiedades para ser utilizados como agentes de remoción y catálisis de estos compuestos recalcitrantes, teratogénicos y mutagenicos, es por esto que este tipo de xenobiotico debe ser eliminado, afortunadamente su naturaleza hidrocarbonada puede ser fuente nutritiva tanto para las bacterias como los hongos.
Sin embargo los hongos estas más capacitados para degradar compuestos más difíciles recalcitrantes y en mayores concentraciones, es por ello que en es posible generar una prospección a futuro del uso de este tipo de tecnología, para usar a los hongos como biocatalizadores carbono clásticos, es decir herramientas que nos permitan degradar este tipo de hidrocarburo toxico y nocivo a la salud del ambiente, sin embargo en la actualidad enfrentamos desafíos en el aumento y propagación de los hongos y como poder controlarlos para poder lograr el saneamiento sin dañar el equilibrio ecológico, pensamos que el futuro inmediato estas limitaciones desaparecerán y será posible la micorremediación como un hecho que permita recobrar el estado natural de los espacios naturales como son los medios marinos que son golpeados constantemente por el vertido y derrame de petróleo y sus derivados a este componente vital
Acciones
a
Futuro
para
la
aplicación del prospecto ____________________________________________________________
1.- Se recomienda evaluar la cinética del proceso como un paso para el entendimiento del proceso de descontaminación por la remoción de los HAPs en el agua.
2.- Se recomienda evaluar la técnica a partir de micelio inmovilizado bajo una matriz para la remoción de HAPs.
3.- se recomienda utilizar marcadores moleculares de crecimiento en la pared celular del hongo Aspergillus niger para corroborar por microscopía electrónica de transmisión el aumento del tamaño de la espora y el reforzamiento dela pared fúngica.
4.- Se recomienda evaluar la estequiometria del proceso mediante la transferencia de masa y energía entre los HAPs y la biomasa catalítica
5.- Se recomienda la extracción e inmovilización de las enzimas oxidasas para el desarrollo de una tecnología fúngica de descontaminación
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