Métodos Moleculares en Parasitología Diagnóstico de Leishmaniasis Visceral by José Araujo

DiagnĂłstico de Leishmaniasis Visceral con ĂŠnfasis en infecciones inaparentes

Editorial académica española 2019 Métodos Moleculares en Parasitología Diagnóstico de Leishmaniasis Visceral con énfasis en infecciones inaparentes Copyright José Araujo Blanco ©

ISBN 978-620-0-03450-2

Métodos Moleculares en Parasitología Diagnóstico de Leismaniasis Visceral con énfasis en infecciones inaparentes

Autor José Araujo

Contenido INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 7 PLANTEMIENTO DE LOS OBJETIVOS ................................................................................. 9 OBJETIVO GENERAL: .......................................................................................................... 9 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ............................................................................................. 10 DESARROLLO DE UNA HIPÓTESIS: ................................................................................. 11 METODOS ................................................................................................................................ 12 Identificación de área de estudio ................................................................................. 12 Análisis de las Localidades.............................................................................................. 13 Determinación de las Condiciones Sociales............................................................... 14 Estudios en Población Canina ........................................................................................ 15 Estudio del Reservorio Vertebrado ............................................................................... 15 Estudio de Vector .............................................................................................................. 16 Obtención y Procesamiento de muestras ................................................................... 16 Identificación del parasito por Microscopía Óptica .................................................. 17 Identificación del parasito por Microscopia Electrónica ......................................... 17 Microscopia Electrónica de Transmisión ................................................................. 17 Microscopia Electrónica de Barrido........................................................................... 19 Pruebas Serológicas (TAD, IFI, ELISA) ....................................................................... 20 Test de aglutinación directa (TAD)........................................................................... 20 Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ........................................................................ 21 Ensayo Inmunoenzimatico (ELISA) .......................................................................... 23 Pruebas Moleculares ......................................................................................................... 24 Parásitos y condiciones de cultivo ............................................................................ 25 Colección de sangre y muestras de biopsia humana para PCR ....................... 25

Extracción de ADN de promastigotes ...................................................................... 26 Extracción de ADN de muestras de biopsia ........................................................... 26 ............................................................................................................................................ 28 Ensayo de PCR telomérico .......................................................................................... 28 Geles de Agarosa para electroforesis ...................................................................... 29 Geles de Poliacrilamida ................................................................................................ 29 Electroforesis en gel de campo pulsado ................................................................. 29 Southern, dot, y slot blots .......................................................................................... 30 Etiquetado de sondas teloméricas ............................................................................ 31 Hibridación ....................................................................................................................... 31 Consideraciones éticas ..................................................................................................... 32 Estudio Biogeográfico y Eco-epidemiológico ......................................................... 32 Método Cartográfico...................................................................................................... 32 Método Croizat................................................................................................................ 33 ANÁLISIS ESTADISTICO DE LOS DATOS ....................................................................... 34 CRONOGRAMA ........................................................................................................................ 35 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 38

INTRODUCCIÓN

presente

manual

presenta

como

elementos

importancia

actualización de la data estableciendo un nuevo protocolo para la identificación de los casos del foco de la Leishmaniasis, bajo una nueva óptica diagnostica celular y molecular. En primer le lugar se propone el uso de las pruebas microscópicas atendiendo las indicaciones internacionales, adicional a esto se propone la identificación morfotaxonómica mediante el uso de la microscopía electrónica, bajo los parámetros recientemente establecidos por la OMS.

En segundo lugar es necesario establecer un protocolo que incluya el uso de tres pruebas serológicas en sinergia con pruebas moleculares PCR, Hibridación, con construcción de árboles moleculares. Estas pruebas permitirán la creación de una base de datos contrastada con los casos clínicos, subclínicos o inaparentes en humanos y caninos.

En tercer punto se propone contrastar la aparición de la fauna flebotomina con la presencia de Leishmania así como su relación con los aspectos ambientales, poblacionales, sociales y sanitarios junto a las condiciones bioclimáticas y de vegetación de la zona de estudio.

Como cuarto elemento de importancia del presente manual es la aplicación de métodos de detección molecular efectivos en áreas endémicas y bancos de sangre del foco falconiano. Como quinto elemento de importancia que presenta el proyecto está la detección del parasito en la población canina y animales sinantrópicos potenciales reservorios de Leishmania infantum. Toda la data molecular obtenida será evaluada para la determinación de los valores

eco-epidemiológicos,

así

como

generación

mapas

biogeográficos geo-referenciados de los diversos casos para la generación de mapas con el uso de SIG, de igual manera esta data será contrastada para el desarrollo de mapas biogeográficos estudiando la vicarianza y métodos de dispersión propuestos por el método Croizat.

PLANTEMIENTO DE LOS OBJETIVOS PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

La evaluación molecular de la Leishmaniasis incluye en la actualidad una serie de elementos en lo que es necesario definir un objetivo claro en principios podemos desarrollar

un objetivo hipotético como el que

presentamos a continuación:

OBJETIVO GENERAL: Evaluar la eco-epidemiología molecular de Leishmania infantum causante de LV en la región (COLOCA AQUÍ LA REGIÓN DE ESTUDIO) con especial referencia a la detección de infecciones inaparentes.

De igual manera se hace necesario el desarrollo de diversas actividades que concluyan o permitan que se logre a cabo el objetivo general para ello establecemos objetivos específicos que nos permiten organizar las diversas actividades, presentamos diversos objetivos específicos

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Estos objetivos pueden desarrollarse como como un flujo de actividades de la siguiente manera: 1- Identificar y caracterizar el hemoflagelado Leishmania infantum, por microscopía óptica y electrónica a partir de muestras obtenidas de hospedadores en la (REGION O LUGAR DE ESTUDIO).

2- Aplicar técnicas inmunológicas sensibles y específicas que permitan detectar la presencia de Leishmania infantum, en bancos de sangre, casos clínicos, subclínicos o asintomáticos de LV en pobladores, particularmente, niños y adolescentes, en comunidades rurales y periurbanas.

3- Utilizar pruebas moleculares para la identificación y caracterización filogenética del kinetoplastidia Leishmania infantum (REGION O LUGAR DE ESTUDIO).

4- Reconocer mamíferos domésticos y sinantrópicos que puedan jugar un rol como reservorios del agente patógeno, Leishmania infantum

5- Identificar especies flebotominas potencialmente vectoras (Lutzomyia longipalpis) o alternas (Lutzomyia evansi), determinando el porcentaje de infección natural.

6- Determinar las características ambientales y estructura ecológica de las áreas donde se encuentra el kinetoplastidia Leishmania infantum.

7- Aplicar un esquema holístico para la determinación de la prevalencia molecular de LV por Leishmania infantum en la (REGION O LUGAR DE ESTUDIO).

8- Crear un mapa de riesgo ecoepidemiológico y Biogeográfico en base a la data, social, ambiental, molecular LV por Leishmania infantum en (REGION O LUGAR DE ESTUDIO).

DESARROLLO DE UNA HIPÓTESIS:

Desarrollamos una hipótesis con el fin de evaluar la Leishmaniasis a partir de los factores de riesgo incluyendo una detección de las infecciones que pueden cursar como inaparentes.

Hipótesis:

La presencia de factores de riesgo de transmisión de Leishmania infatum en el (Área de Estudio… ) permite la detección de la infección en especial para casos sin signos clínicos como un problema de salud pública emergente.

MÉTODOS Los métodos que presentamos a continuación son de forma descriptica con el fin de que puedan ser reproducidos en un proceso donde se desee realizar un diagnóstico molecular de la Leishmaniasis con una consecuente identificación de las áreas, los pacientes, vectores, reservorios. Así como tambien los métodos para la identificación del agente etiológico de esta parasitosis.

Identificación de área de estudio Todo estudio de área debe estar acompañado de las zonas y demás coordenadas para ello se recomienda el uso de GPS para determinar las coordenadas de estudio así mismo realizar una indagación prospectiva mediante un mapa o mapa online con el fin de conocer el espacio o ñarea de estudio así como también determinar los puntos claves y zonas de donde se realizará el estudio.

Podemos establecer un ejemplo hipotético

como el que presentamos a continuación: ¨Se estudiarán 30 localidades ubicadas al noroeste de Venezuela estas localidades 28 de las cuales están dentro del estado Falcón el cuan se encuentra dentro de las coordenadas (10° 18´08´´- 11° 50´46´´N; 68°14´28´´71°18´21´´W), la dos localidades restantes se encuentran en el territorio del estado Lara (10° 34´23´´N - 69° 41´53´´W), las localidades de estudio serán determinadas dentro del perímetro de 14 municipios, de los cuales 13 son del estado Falcón y uno en el estado Lara.

En cada área de estudio, se

establecerán estaciones estas la diversas ubicaciones serán georreferenciadas con un GPS marca Garmin modelo EXtrex y serán clasificadas y jerarquizadas para las poblaciones humanas, canina y flebotomina¨

Análisis de las Localidades Se debe describir los aspectos de la localidades de estudio así como la descripción en coordenadas de estos espacios de estudio pata ello recomendamos el uso de equipos que permitan tomar las coordenadas de estos espacios geograficias presentamos a continuación un ejemplo de este tipo de descripción ¨Se estudiaran 30 localidades ubicadas al noroeste de Venezuela estas localidades 28 de las cuales están dentro del estado Falcón el cuan se encuentra dentro de las coordenadas (10° 18´08´´- 11° 50´46´´N; 68° 14´ 28´´- 71° 18´ 21´´W), la dos localidades restantes se encuentran en el territorio del estado Lara (10° 34´23´´N - 69° 41´53´´W), las localidades de estudio serán determinadas dentro del perímetro de 14 municipios, de los cuales 13 son del estado Falcón y uno en el estado Lara. Cada área de estudio, estas ubicaciones serán georreferenciadas con un GPS marca Garmin modelo Extrex y serán clasificadas

jerarquizadas

para

las

poblaciones

humanas,

canina

flebotomina.

Debido a la existencia actual de casos agudos de LV los estos deben ser tratados en los servicios de salud, y a su vez deben ser evaluados dentro del grupo de individuos con manifestaciones, clínicas. De igual manera se debe realizar consultas integrales rotativas en las diversas localidades

de estudio con la finalidad de encontrar casos activos de esta parasitosis.

De igual manera deben ser evaluados a individuos sin

manifestaciones clínicas aparentes. El estudio en la población humana se realizará con una (N) estadísticamente representativa, de diferentes localidades con la finalidad de detectar la presencia de L. infantum. Los casos evaluados serán clasificados por grupo etario y se hará énfasis en la población infantil.

Determinación de las Condiciones Sociales Las implicaciones sociales deben ser realizadas aplicando el método propuesto para el estudio social de la Leishmaniasis del Dr. Benito Díaz- Díaz (2014). Estas entrevistas se realizaran bajo el apoyo de la sección de antropología e historia de la UNEFM. Para ello se realizará una revisión estructurada a partir de las historias clínicas de todos los casos registrados en los hospitales públicos del Estado Falcón, entrevistas, médicos tratantes y con familiares de casos pasados de Leishmaniasis visceral así como revisión de bases de datos electrónicas en un periodo retrospectivo de 20 años en el pasado, debe ser tratada con el programa EpiInfo V6.02. Las entrevistas incluirán la búsqueda de características socioeconómicas de los hogares, conocimientos sobre la enfermedad, su conducta de búsqueda de cura, detalles sobre el periodo de estadía intrahospitalaria de su caso de Leishmaniasis visceral, y tipos de consecuencias generadas por la enfermedad, estas entrevistas serán grabadas

y completadas con notas a mano utilizando la técnica de la temática conceptual según (Miles y Huberman, 1994; Riley, 1990).

Estudios en Población Canina En todas las localidades de deben realizar campañas con la finalidad de evaluar perros, mediante previo consentimiento de sus dueños para tomar las muestras a sus animales, bajo supervisión directa. Para ello se realizará una selección bajo consideración clínica y nutricional sugerida por un médico veterinario calificado. De igual manera se tomará en cuenta la población canina que pernota en el peridomicilio o cerca de los corrales de animales.

Estudio del Reservorio Vertebrado En los focos de Leishmaniasis debe realizar colecta de vertebrados silvestres, y en especial para la captura mamíferos pequeños se empleará técnica de captura viva con cebos de frutas o semilla en trampas de tipo Sherman y Tomahawk De Lima et al., 2002; Kerr., et al., 2006; Marest y Ernest, 1995; Oliveira et al., 2005). La manipulación de animales potencialmente

infectados

realizará

atendiendo

las

normas

bioseguridad establecidas por la Organización Panamericana de la Salud (Mills et al., 1998) así como también las normativas de ética para el manejo de animales (De Jesús, 2002; Demers et al., 2006).

Estudio de Vector La fauna flebotomina será obtenida mediante capturas diurnas y nocturnas llevadas a cabo en los domicilios humanos, el peridomicilio, refugios naturales y en corrales domésticos que en su mayoría posee rebaños de cabras (Capra hircus) la cual es la principal forma de explotación de la zona semiárida Falconiana.

Se aplicara el método de aceitado y aspiración directa con capturadores de vidrio en los refugios naturales, con el uso de trampas lumínicas de Shannon y CDC, según el método descrito por (Añez et al., 1988; Maroli et al., 1997). Posteriormente a la colecta y clarificación estas deben ser identificadas según la guía propuesta por Young & Duncan (1994). Una porción de flebotominos capturados serán disecados, separando el tubo digestivo el cual será almacenado a -20°C para ser luego procesado mediante ensayos moleculares.

Obtención y Procesamiento de muestras Cada individuo, perro, vertebrado se les debe aplicar un examen físico integral, para se le extraerá 6 cc de sangre por venopunción periférica, la cual posteriormente será centrifugada por 10 min a 2000 rpm, el suero

resultante será separado en dos alícuotas y preservadas a -20 ° C una para realizar ensayos serológicos y la otra para realizar pruebas moleculares respectivas.

Identificación del parasito por Microscopía Óptica Las muestras obtenidas para la identificación de las formas evolutivas deben ser tratadas y fijas en formaldehido al 10% se incluirán en parafina y se teñirán siguiendo el método de Giemsa-colofonio propuesto por Bray & Garhnam (1962).

Las imágenes resultantes serán registradas mediante

fotografía digital como cámara digital en un microscopio a diferentes aumentos.

Identificación del parasito por Microscopia Electrónica Microscopia Electrónica de Transmisión Las muestras colectadas que contienen células de Leishmania se le aplicará fijación primaria con glutaraldehido (fijador), luego se realizarán 3 lavados con buffer Cacodilato de Sodio a pH 6,8-7 al 2 molar con una temperatura de 4 ºC durante un tiempo de 15 a 30 minutos cada uno, con la finalidad de retirar los excesos de fijador usado.

La Fijación secundaria se realizará al agregar tetraóxido de osmio al 1% preparado en el mismo tampón durante 1-2 horas. Posteriormente se retirará el osmio con agua destilada desionizada por un tiempo de 15 a 30 minutos. La muestra será deshidratada con una progresión de alcoholes de concentraciones crecientes, desde 50%, 70 y 90% durante 10 minutos y alcohol al 100% durante un tiempo de 30 minutos posteriormente la muestra será tratada con oxido de propileno por 10 minutos tres veces 3. La Inclusión se realizará en una resina epoxíca Epon 812 en proporción 2:1 durante 1-3 horas, se dejará evaporar cualquier exceso de solvente y dejar polimerizar la muestra durante toda la noche. La polimerización será realizada en unos moldes de plástico orientando las muestras en posición transversal para obtener las secciones deseadas de las muestras, los moldes se colocarán en un estuche por 48 horas a 60ºC, y luego se dejan enfriar para endurecer el plástico y obtener el bloque de tallado.

Se realizará un tallado en forma de pirámide con cortes gruesos, finos y ultrafinos con una cuchilla de diamante o vidrio de aproximadamente 300 nanómetros en el equipo ultra microtomo. Las muestras serán colocadas en rejillas, se realizaran pruebas para orientar la precisión del corte tiñendo cortes con azul de toluidina y observando en microscopio óptico. A los cortes respectivos se realizarán cortes ultra finos se contrastarán con acetato de uranilo y citrato de plomo, las diversas muestras obtenidas serán observadas en sesiones de observación en un microscopio electrónico

de transmisión (Hitachi H-7000), para la obtención de micrografías con magnificaciones de 5000X a 10000X), a voltaje (HV) correspondiente (Araujo, 2014).

Microscopia Electrónica de Barrido Las muestras seleccionadas para la observación de las formas evolutivas de Leishmania serán observadas en un microscopio de electrónico de barrido Marca Company FEI modelo Quanta 200, con el fin de generar micrografías con aumentos desde 500x hasta 50000x a 10000 Kv en alto y bajo vacío en modo ambiental hasta 15.000 Kv. Para ello, se utilizará un porta muestra sobre el cual se colocará una cinta adhesiva de carbón con una pinza metálica para soportar y sujetar la muestra, la cual será llevada al carril de porta muestra del microscopio electrónico de barrido hasta su posterior observación. La data obtenida será caracterizada en programa interno para generar fotografías digitales micrográficas con el fin de reconocer los elementos morfotaxonómicos estructurales en primer plano y en plano de contraste,

aplicando

herramientas

filtro

cálculo

tamaños

micrográficos, con un respectivo análisis de elementos de la muestra representados en porcentaje de átomos (FEI, 2008; Araujo 2014).

Pruebas Serológicas (TAD, IFI, ELISA) Las muestras serán consideradas como seropositivas cuando mostraron reactividad en al menos 2 de las 3 pruebas a realizar. Todas las pruebas serán aplicadas mediante el procedimiento previamente estandarizado para detección de Ac anti-Leishmania por Añez et al., 2000; 2007).

Test de aglutinación directa (TAD) A partir de cultivos de promastigotes de Leishmania en medio M199 suplementado con 10% de suero fetal de ternera

a 96 h, en fase

estacionaria de crecimiento, detectada por observación microscópica, se obtendrán alícuotas del medio, estas serán filtradas y la suspensión obtenida con células será centrifugada a 2000 x g durante 15m minutos a 25 °C. Los parásitos serán lavados 3 veces en solución buffer fosfato (PBS) a pH 7,2. Centrifugando luego de cada lavado. Las células serán resuspendidas en solución de tripsina (DIFCO) al 0,4% en PBS ajustado a pH 7,6 e inmediatamente incubado a 0 °C durante 5 min. Posteriormente será eliminada la tripsina con cinco lavados en PBS a pH 7,2 centrifugando a 900 x g durante 15 min a 4 °C luego de cada lavado. Finalmente las células obtenidas serán resuspendidas en formaldehido al 1% en PBS a pH 7,2 hasta ajustar la concentración de la solución antigénica a una absorbancia de 0,322 a 55nm, generado a una concentración final de 0,5 DO de antígeno crudo.

La prueba se realizará en placas de microtitulación de polivinil-clorhidro de 96 pozos, con controles positivos y negativos junto a las muestras a evaluar en cada pozo se agregará 20 µL de 3-mercaptoetanol (2-ME) al 1% en PBS a pH 7,2. Las Placas serán incubadas a 37 °C durante una hora. Luego de la incubación se realizarán diluciones seriadas de las muestras desde 1:2 hasta 1:4096, las placas serán sensibilizadas con 20 µL del antígeno previamente preparado e incubado por 24 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se realizará la lectura de las placas en un lector de

espejo

policubetas.

considerarán

positivas

mediante

aglutinación directa aquellas muestras de suero que presenten títulos de anticuerpos anti-Lehismania (Ac) mayor o igual a 1:64 evidenciados por la formación de una malla de aglutinación similar a la del control positivo.

Inmunofluorescencia indirecta (IFI) A partir de células Leishmania obtenidas en fase de crecimiento se resuspenderán los hemoflegelados hasta ajustar 40 promastigotes por campo microscópico visualizado a 400X. Posteriormente se añadirán 20 µL de la suspensión celular en cada uno de los círculos de las láminas preparadas para la prueba IFI para dejar secar durante 12h a temperatura ambiente. Las células en las láminas serán fijadas con acetona pura y almacenada a -20 °C hasta su uso. En placas de microtitulación de polivinil-

clorhidro se añadirán 20 µL de PBS a pH 7,2. Seguidamente en los pozos correspondientes a la primera columna se agregarán 20 µL de muestra de suero problema, suero, control positivo y suero control negativo.

Posteriormente se realizarán diluciones seriadas desde 1:2 hasta 1:4096 a cada uno de los círculos de las láminas preparadas previamente con el antígeno. Luego serán las láminas serán incubadas con los sueros durante 1h en cámaras húmedas para luego ser lavadas 3 veces con PBS a pH 7,2 por 10 min en cada lavado. En cada circulo de las láminas se añadirá 20 µL de una solución con anticuerpo polivalente An-humano conjugado a isotiocianato de fluresceina (FITC) marca Sigma diluido 1:128 en PBS a pH 7,2 para incubar en un periodo de 1h a temperatura ambiente en cámaras húmedas en oscuridad. Posteriormente se realizarán lavados de las láminas con PBS a 7,2 por 10 min para cada lavado. Finalmente se cubrirán las láminas de IFI con láminas cubreobjetos de 25x25 mm conteniendo glicerol tamponado a pH 2,5. La lectura se realizará a 400X en un microscopio de fluorescencia marca Zeiss modelo axioskop a una luz de 490 nm de longitud

onda.

considerarán

positivas

por

técnica

inmunofluorescencia indirecta aquellas muestras de sueros cuyos títulos de anticuerpos polivalentes estén ≥ 1:64 comparables con el suero positivo.

Ensayo Inmunoenzimatico (ELISA) Se deben sensibilizar placas de microtitulación de poliestireno (Corning fondo plano) con utilizando 4μg/ μl de proteína soluble por pozo diluido con 100 μl de buffer carbonato - bicarbonato pH 9.6, para luego ser incubadas por 18 horas a 4 °C tapadas y protegidas para evitar la evaporación. A la par se preparará el buffer de lavado PBS al 0.05% de Tween 20 (PBS - T) y PBS-T al 2% de caseina (PBS-TC).

Las placas se lavaran con PBS -T a pH 7.2

sin rebozar en los pozos y

palmando cada cubeta vigorosamente sobre un papel absorbente, a cada a pozo se le añadirá 100 μl de PBS -T y caseina al 2% (PBS - TC) y serán incubados por 1 hora para bloquear los sitios libres de proteínas en el plástico. Las placas serán lavadas de nuevo con PBS - T, para ser utilizadas o para ser almacenadas a –20 °C. Posteriormente los sueros a temperatura ambiente, se diluirán en (PBS - TC) y colocados en cada pozo, a razón de las siguientes diluciones 1:64, 1:256, 1:1024, 1:4096 en volúmenes de 100 μl por pozo que luego lavaran 5 veces con PBS - T.

Posteriormente se colocará el conjugado IgG (humano) peroxidasa en una dilución de 1:1000 con PBS - TC en volúmenes de 100 μl en cada pozo se

Incubará por una hora a 37 ºC, y lavando 5 veces las placas con PBS - T y añadiendo en cada pozo

una solución de sustrato conteniendo buffer

citrato-fosfato pH 5 y OPD al 0.02 % con H2O2 al

30 %, para Incubar

protegido de la luz por 45 min a temperatura ambiente. La reacción se detendrá mediante la adición de 50 μl de ácido sulfúrico H2SO4 al 20%. Para luego leer las placas en el espectrofotómetro de ELISA utilizando un filtro de lectura a 492 nm, la interpretación se realizará usando la hoja de protocolo para ELISA. Los resultados obtenidos serán de tipo colorimétrico y cualitativo, para tomar como positivas aquellas muestras en las que ocurrirá un cambio de color de una anaranjado más oscuro a otros de menor intensidad. El (cut off) es el valor de densidad óptica que determina si la prueba realizada es positiva o negativa. Para la obtención del (cut off) se sumaran las diluciones del control negativo y al promedio, se le sumaran ± cuatro desviaciones estándar. Se consideran positivos los valores de densidad óptica de las muestras problema que estuviesen por encima del cut off, y negativo si el valor obtenido en densidad óptica de una muestra problema estuviese por debajo del cut off.

Pruebas Moleculares Se aplicarán ensayos moleculares para muestras de suero humano, canino, de animales sinantrópicos, el tracto digestivo de flebotominos disecados, mediante la prueba de PCR y PCR-hibridación. Para ello se utilizarán iniciadores específicos derivados de secuencias teloméricas de L. donovani

desarrollados por Chiurillo et al. (2000), que poseen una alta sencibilidad y especificidad para L. donovani y L. infantum = L. chagasi. Los iniciadores poseerán la siguiente secuencia de nucleotidos 5´CCCCGTCCTGTTGGAG 3´ y 5´ACGGTGTACTGGTGTACTGG 3´, de igual manera se aplicará el procedimiento desarrollado por según Chiurillo et al., (2001). Todo esto con el propósito de comparar los datos obtenidos con el análisis de muestras colectadas en bancos de sangre y en las diversas localidades en estudio, que incluyen casos agudos, y asintomáticos, perros, animales sinantrópicos y vectores.

Parásitos y condiciones de cultivo Se mantendrán promastigotes de Leishmania en medio M199-10% con suero fetal de ternera (ver anexo M199) durante 96 h, hasta alcanzarla fase estacionaria de crecimiento.

Colección de sangre y muestras de biopsia humana para PCR Se procesarán biopsisas humanas para PCR. muestras de sangre y muestras de medula ósea de pacientes confirmados con Lehismaniasis Visceral LV del semiárido falconiano, tomadas durante el desarrollo de este proyecto.

Extracción de ADN de promastigotes La extracción de ADN se normalizará a partir de aproximadamente (105) células, la cuales se sedimentaron aplicando una centrifugación a 5.000 r.p.m. por 15 min a 4 °C. El sedimento se lavó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,2 se resuspenderán 100 µL en buffer para lisis (8% Chelex [Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA], con 0.33 mg/mL de proteinasa K), y se incubará durante 15 min a 65 °C, posteriormente se hervirá durante 10 min en baño de agua. Esta muestra se centrifugará a 12.000 r.p.m. por 20 min y el sobrenadante será colectado en un tubo nuevo, a partir del cual se utilizarán 10 µL de la muestra de ADN para realizar la PCR.

Extracción de ADN de muestras de biopsia Las muestras de médula se mantendrán a temperatura ambiente durante 30 min, posteriormente se centrifugarán a 1.000 r.p.m. durante 1 min y el sobrenadante obtenido será trasvasado en un tubo nuevo.

Este sobrenadante se centrifugó a 5.000 r.p.m. durante 15 min a 4 °C. El pellet obtenido se lavará dos veces con PBS a pH 7,2. Posteriormente se le agregó al pellet saponina fría al 0,5% en PBS con un pH de 7,2. El tubo se golpeará suavemente para luego incubar en hielo durante 5 min. Luego se centrifugará a 4.000 r.p.m. durante 10 min a 4 °C. El sedimento resultante

se lavará con PBS a pH /,2 y 400 microlitros de buffer NET (NaCl al 150 mM, ácido etilendiaminotetraacético 10 mM [EDTA], Tris-HCl a 50 mM, en un pH 7.5).

Después del lavado se adicionará 1,25% de sarcosilo y 0,25 mg de ribonucleasa. La muestra se incubará 1 hora a 37ºC, y se añadirán 0,15 mg de proteinasa K y se incubó a 50 ºC durante 2 h. La muestra será extraída con una mezcla (25: 24: 1) de Fenol, cloroformo y alcohol isoamilico. Se precipitará con 1/10 del volumen con acetato sódico a 3M a pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol. El sedimento será lavado con etanol al 70%, posteriormente secado y será resuspendido en TE (Tris a 10 mM, a pH 8,0 y EDTA 1 mM).

Figura 2. Tomado: Chiurillo et al, 2000.

Ensayo de PCR telomérico (Figura

usara

CCCCGTCCTGTTGGAG-3´y

primer el

directo

primer

con

inverso

una a

secuencia

usar

será

5´5´-

ACGGTGTACTGGTGTACTGG-3´, El anclaje inicial comienza con 62-meros y luego continua con secuencias octamericas. Se utilizará un oligonucleótido de

captura,

cual

fue

diseñado

con

secuencia

5´-

CGCTGTGCAAGGAATCAGTG-3´, para la detección de productos de PCR para los experimentos de hibridación. Esta última secuencia será utilizada en todos los ensayos PCR para comprobar la especificidad del ensayo en muestras complejas.

Estos oligonucleotidos serán obtenidos de la marca Operon Technologies Inc. (Alameda, CA). La PCR se realizará con 0,8 microM de cada de los primer inversos, y 0,2 mM dNTP durante 35 ciclos por 1 Min a 63 ºC; 1 min a 72ºC y 1 min a 94ºC. Los ciclos seguirán en 1 min a 63ºC y 5 min a 72ºC.

Geles de Agarosa para electroforesis Los amplificados de la PCR serán revelados en geles de agarosa al 1%, y luego el ADN genómico sobre geles de agarosa al 0,7% con un gradiente de 6V/cm.

Geles de Poliacrilamida La electroforesis en geles de poliacrilamida se realizará con el fin de revelar amplificados por PCR de productos de Leishmania asociados a cepas de casos viscerales. Estos serán digeridos con la enzima endonucleasa de restricción RsaI y resueltos en geles de poliacrilamida al 6% con 0,5 de Tampón de emulsión bacilar de tuberculina (TBE) a 5V/cm

Electroforesis en gel de campo pulsado La electroforesis en gel de campo pulsado de las cepas Leishmania se realizará en un gel de agarosa CHEFDR III (Bio-Rad Laboratories). Los

bloques se preparán con se ha descrito anteriormente. Para ello se aplicará en un gel al 1% con un buffer de 0,5 TBE (Tris-borato 45 mM, 1 mM EDTA) a 6 V / cm a 120ºC. Se utilizará un ángulo de separación de 60 seg - 120 seg durante 24 horas, las bandas serán reveladas con bromuro de etidio.

Southern, dot, y slot blots La pruebas de Southern blot, los geles deben ser tratatadas con HCL al 0,25 N durante 25 min para depurinar de igual manera estos serán tratados en Buffer desnatuarlizante con (NaOH 0,4 N, NaCl 0,6 M) durante 45 min Con un cambio de solución. El ADN se transferirá a una membrana Hybond - N (Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Paisley, Reino Unido) por acción capilar, y esta será tratada para un reticulado ultravioleta, secado y mantenido para la hibridación. Para el dot blot, se usarán productos de ADN

genómico

PCR.

Las

muestras

ADN

cargar

desnaturalizarán añadiendo volúmenes iguales de buffer desnaturalizante (NaOH 0,5 M, 0,25 N NaCl) e incubando a temperatura ambiente durante 10 min. Las muestras desnaturalizadas se mantendrán en hielo y se diluirán en 0,1X Citrato salino (SSC) (15 mM NaCl, 1,5 mM de Citrato de sodio), NaOH 0,125 N, de manera que el volumen final de cada uno será de 200 µL.

Etiquetado de sondas teloméricas Octámero, 62-ameros y hexámeros de la sonda oligonucleótidos serán marcados con [γ-32P] adenosina trifosfato, 3,000 Ci/mmol (Amersham Pharmacia) con T4 polincleotido kinasa (13). El oligonucleótido de captura se marcará sintetizando DUTP-digoxigenina con un terminal deoxynucleotil transferasa (14).

Hibridación Las hibridaciones se realizarán con 0,5 M de Na-fosfato a pH 7,2, dodecilsulfato sódico al 7% (SDS), a 1MM de EDTA, y 0,1 mg /ml de ARNt de Escherichia coli a 65ºC durante 18 h. Después de la hibridación, los filtros se lavaron dos veces con 40MM de fosfato de Na, y SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 Min, y dos veces a 65 ºC durante 15 min. Temperaturas de hibridación serán de 58 °C para la sonda de hexámero; 54 °C para el octamero; 65 °C para la sonda oligonucleotídica delantera de 62-amero. Después de la hibridación, el último lavado será a la misma temperatura que la utilizada para la hibridación.

Para la sonda de captura marcada con digoxigenina, la hibridación será llevada a cabo en 5 SSC a 0,1% de N-laurilsarcosinato de sodio; 0,02% de SDS y 1% de reactivo de bloqueo (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) a 58ºC durante 3 h. Después de la hibridación, Los filtros se

lavarán a temperatura ambiente en 6 SSC Y SDS al 0,1% durante 5 min, luego se lavarán con 2 SSC y SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 min, y finalmente a 58 ºC durante 15 min. La sonda hibridizada se detectará mediante Quimioluminiscencia con Lumi-Phos 530 según las Instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim) (Sambrook et al., 1989; Gonzalez N et al., 1994)

Consideraciones éticas Para todos los casos se utilizarán consentimiento escrito previa información (CPI) sobre el propósito del muestreo para cada individuo ha muestrear o de su representante legal en el caso de menores de edad antes de proceder a la toma de dicha muestra. De igual manera el muestreo de los caninos se llevará a cabo previo consentimiento de sus dueños. De igual manera este estudio debe ser presentado ante el comité de Ética para realizar el estudio.

Estudio Biogeográfico y Eco-epidemiológico Para este estudio se debe desarrollar un mapa de riesgo ecoepidemiológico y un estudio biogeográfico utilizando el método Croizat.

Método Cartográfico Se diseñará un mapa de riesgo ecoepidemiológico de la Leishmaniasis visceral, aplicando el método propuesto por Méndez, 2012. Para ello se

georreferenciarán estaciones de muestreo así como también el desarrollo de una cartografía digital, estableciendo 5 capas o elementos de riesgo para la enfermedad. Altitud, Temperatura, Precipitación, Vegetación, Relieve y Localidades. Se utilizará el método jerárquico analítico (Analytic Hierarchy

Process,

AHP)

desarrollado

por

Saaty,

basado

una

metodología que permite asignar valores numéricos a juicios subjetivos considerando la importancia relativa de las variables y la data será cartografiada en un SIG. Estos datos serán procesados en bajo los modelos BIOCLIM, DOMAIN, GARP y regresión logística en la predicción de la distribución potencial.

Método Croizat El método Croizat será utilizado la revisión propuesta por Espinosa y LLorente y Morrone, 2004. Generando la construcción de trazos por el procedimiento

del

árbol

tendido Mínimo;

Orientación

trazos

individuales; Construcción de Matrices de Conectividad y cálculo del trazo estándar; Evaluación de la congruencia de trazos; Desarrollo de un mapa indicando los trazos estándar, las líneas base, nodos y centros de masa.

ANÁLISIS ESTADISTICO DE LOS DATOS Los

datos

serán

analizados

utilizando

estadística

descriptiva

paramétrica, a través de las medidas de la varianza, la frecuencia, tendencia central y dispersión, así como también el análisis multivariado, para la elaboración de tablas de contingencia, gráficos y dendogramas. Utilizando el programa Infostat 2016.

CRONOGRAMA DE UN PROYECTO DE EVALUACIÓN DE LEISMANISIS VICERAL Objetivo General: Evaluar la eco-epidemiología molecular de Leishmania infantum causante de LV en la región semiárida del occidente de Venezuela con especial referencia a la detección de Año: infecciones inaparentes

1- Identificación y caracterización del hemoflagelado Leishmania infantum, por microscopía óptica y electrónica a partir de muestras obtenidas de hospedadores en la región semiárida del estado Falcón. Actividad 1.1 Consideraciones éticas Actividad 1.2 Obtención de muestras de Bancos de Sangre del Semiárido Falconiano Actividad 1.3 Obtención de muestras Pacientes Activos y Asintomáticos mediante jornadas de salud integral Actividad 1.6 Identificación de L. infantum mediante pruebas parasitológica por microscopía óptica Actividad 1.7 Identificación de L. infantum mediante Microscopía Electrónica de Barrido y análisis EDX Actividad 1.8 Identificación de L. infantum mediante Microscopía Electrónica de Transmisión

2- Reconocer mamíferos domésticos (Canis lupus familiaris) y sinantrópicos que puedan jugar un rol como reservorios del agente patógeno, Leishmania infantum en el semiárido Falconiano. Actividad 2.1 Aplicación de encuesta a dueños de perros domésticos Actividad 2.2 Obtención de muestras de perros domésticos Actividad 2.3 Captura de animales sinantrópicos por el método Sherman y Tomahawk Actividad 2.4 Obtención de muestras de animales sinantrópicos Actividad 2.5 Preparación de muestras para ensayos inmunológicos y moleculares

3- Identificar especies flebotominas potencialmente vectoras (Lutzomyia longipalpis) o alternas (Lutzomyia evansi) entre otras especies presentes en el semiárido falconiano, determinando el porcentaje de infección natural. Actividad 3.1 Capturas diurnas y nocturnas en los domicilios y peridomicilios humanos Actividad 3.2 Capturas diurnas y nocturnas en refugios naturales y en corrales domésticos

Año:

Actividad 3.3 Método de aceitado Actividad 3.4 Método de aspiración directa con capturadores de vidrio Actividad 3.5 Método de Shannon y CDC Actividad 3.6 Identificación de fauna flebotomina. Actividad 3.7 Disecado de flebotomos para ensayos inmunológicos y moleculares

4- Aplicar técnicas inmunológicas sensibles y específicas que permitan detectar la presencia de Leishmania infantum, en bancos de sangre, casos clínicos, subclínicos o asintomáticos de LV en pobladores, particularmente, niños y adolescentes, en comunidades rurales y periurbanas del semiárido falconiano. Actividad 4.1 Cultivo de Promastigotes de L. infantum Actividad 4.3 Test de Aglutinación Directa (TAD) Actividad 4.3 Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Actividad 4.4 Ensayo Inmunoenzimático (ELISA)

5- Utilizar pruebas moleculares para la identificación y caracterización filogenética del kinetoplastidia Leishmania infantum en la región semiárida del estado Falcón. Actividad 5.1 Mantenimiento del Parásito y condiciones de cultivo Actividad 5.2 Colección de sangre y muestras de biopsia humana para PCR Actividad 5.3 Extracción de ADN de promastigotes Actividad 5.4 Extracción de ADN de muestras de biopsia Actividad 5.5 Ensayo de PCR telomérico Actividad 5.6 Gel de Agarosa para electroforesis Actividad 5.7 Gel de Poliacrilamida Actividad 5.8 Electroforesis en gel de campo pulsado Actividad 5.9 Southern, dot, y slot blots Actividad 5.10 Etiquetado de sondas teloméricas Actividad 5.11 Hibridación

6- Aplicar un esquema holístico para la determinación de la prevalencia molecular de LV por Leishmania infantum en la región semiárida del Estado Falcón. Actividad 6.1 Estudio Sociológico Actividad 6.1 Desarrollo de un esquema de trabajo bajo la metodología holistica

7- Determinar las características ambientales y estructura ecológica de las áreas donde se encuentra el kinetoplastidia Leishmania infantum. Actividad 7.1 Determinación de las características ambientales Actividad 7.2 Determinación de la estructura ecológica principales elementos de (Fauna y Flora) del área de estudio Actividad 7.4 Identificación de Pisos bióticos

8- Crear un mapa de riesgo ecoepidemiológico y Biogeográfico en base a la data, social, ambiental, molecular LV por Leishmania infantum en la región semiárida del Estado Falcón. Actividad 8.1 Método Biogeográfico para obtener Mapa de riesgo ecoepidemiológico Actividad 8.2 Aplicación de los modelos BIOCLIM, DOMAIN, GARP Actividad 8.3 Aplicación del modelo Croizat según data molecular

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