Os ANA no Diagnóstico Laboratorial das Doenças Autoimunes by KAHN atelier

Os ana no Diagnóstico Laboratorial das Doenças Autoimunes Maria José Rego de Sousa assistente graduada do serviço de patologia clínica do hospital fernando fonseca responsável do sector de imunopatologia laboratorial do centro de medicina laboratorial dr. germano de sousa

prefácio Nas últimas décadas tem-se assistido a um aumento exponencial do conhecimento na área da imunologia, quer na sua vertente básica quer nos aspectos mais directamente ligados à prática clínica. Hoje, reconhece-se o carácter integrador e de coordenação do sistema imunológico e consequentemente começam a ser identificados novos caminhos e mecanismos que mostram a omnipresença deste sistema no funcionamento global do corpo humano. Do ponto de vista estritamente clínico, as doenças auto-imunes sistémicas começaram a ganhar uma relevância significativa, fruto não só do desafio que por si só representam mas também como consequência de um aumento da capacidade de avaliação dos doentes e da disponibilidade de novas opções terapêuticas. Mais conhecimento gerou “novas doenças” e a difusão deste, uma maior necessidade de optimizar recursos e padronizar atitudes. Mas o diagnóstico deste tipo de doenças pode ser complexo, particularmente quando começamos a ser capazes de avaliar como pequenos desvios da resposta imune individual podem condicionar padrões clínicos tão díspares e respostas terapêuticas por vezes opostas. O laboratório de autoimunidade é actualmente a “ferramenta” mais importante no diagnóstico e tratamento destes doentes e por isso o seu uso deve ser criterioso e acompanhado a cada momento por uma atitude crítica de todos os profissionais de saúde envolvidos.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

“Mais laboratório” não tem de significar “melhor diagnóstico” e por isso é fundamental compreender as vantagens e limites de cada técnica, que ilações se podem transportar para a gestão clínica do respectivo doente e de que forma optimizar os recursos evitando despesas e sobre-informação que nem sempre é produtiva. Este livro pretende mostrar “caminhos” para o diagnóstico destas patologias, através de uma sistematização clara e simples das implicações que decorrem dos testes mais utilizados nesta área. Pode ser, por isso mesmo, uma ajuda preciosa para o clínico, quer na abordagem inicial dos doentes, quer no acompanhamento subsequente destes casos. Mais ainda, poderá permitir a unificação de conceitos, optimizando a colaboração entre colegas, grupos de trabalho ou instituições.

José Delgado Alves professor auxiliar convidado da faculdade ciências médicas-unl director de serviço de medicina iv do hospital fernando fonseca

prefácio

indice

capítulo 1

Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 capítulo 2

Nota histórica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 capítulo 3

Princípio do teste de imunofluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 capítulo 4

Prevalência dos ana nas doenças autoimunes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 capítulo 5

Nomenclatura dos autoanticorpos

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

capítulo 6

Autoanticorpos e padrões HEp-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 capítulo 7

Caracterização antigénica dos padrões de fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 capítulo 8

Quadros para interpretação dos resultados ANA positivo . . . . . . . . . . . 40 capítulo 9

Como proceder depois de um resultado ANA positivo? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 capítulo 10

Métodos para seguimento do ANA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Bibliografia

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Padrões de fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

nota editorial Valendo-se das mais sofisticadas ferramentas laboratoriais e de sólidos conhecimentos fisiopatológicos a Medicina Laboratorial vem ocupando gradualmente um lugar cada vez mais essencial na previsão, diagnóstico, prognóstico e monitorização das mais diversas patologias. Porém, sem existir uma excelente relação entre a clínica e o laboratório as potencialidades da Patologia Clínica perdem-se ou não são suficientemente aproveitadas, não se assegurando ao doente a plenitude dos cuidados de saúde a que tem direito. Sem essa conexão o diagnóstico será mais pobre, a terapêutica menos adequada e o prognóstico mais incerto. Da importância da interface clínico-laboratorial são exemplo maior as Doenças Autoimunes. A autora, a Dra. Maria José Rego de Sousa, tem dedicado grande parte do seu múnus de especialista em Patologia Clínica ao estudo dos achados laboratoriais próprios deste tipo de patologia e à sua interpretação e aplicação à clínica, designadamente frequentando laboratórios centros europeus de referência em Imunopatologia Laboratorial. Condensa agora a sua experiência neste manual que pela forma prática e de fácil consulta como é apresentado vai, por certo, contribuir grandemente para uma melhor interpretação dos dados do laboratório e uma eficiente relação entre este e a clínica. Muita da experiência agora vertida foi resultado da actividade da autora no Centro de Medicina Laboratorial que fundei e dirijo e que desde o seu início tem como missão colocar-se ao serviço dos doentes e dos médicos. Neste sentido entendemos editar este manual que esperamos possa ser útil a todos os colegas na sua prática clínica diária.

Germano de Sousa director clínico do centro de medicina laboratorial dr. germano de sousa

agradecimentos Dra. Margarida Franco e Professora Doutora Isabel Abreu, pelos ensinamentos e estímulo constante com que me têm distinguido. Dr. Germano de Sousa, pela postura profissional, saber clínico e estímulo para o meu desenvolvimento na área da Imunopatologia Laboratorial. Ao Dr. José Germano de Sousa e à Dra. Margarida Albuquerque, pelo apoio que me proporcionaram durante a elaboração deste livro. Colegas e a todos os Técnicos, elementos fundamentais para o trabalho de equipa.

1. introdução A pesquisa e identificação de autoanticorpos, incluindo os autoanticorpos contra o núcleo celular (ANA) e autoanticorpos contra antigénios específicos, como o dsDNA, são parte integrante do diagnóstico e do seguimento dos doentes com doenças autoimunes sistémicas, no âmbito das especialidades Médicas de Reumatologia, Medicina Interna e Imunologia Clínica. A utilização da técnica de imunofluorescência indirecta (IFI), em substrato de células HEp-2, para a identificação de autoanticorpos antinucleares (ANA), tem evidenciado ser um instrumento laboratorial muito útil no diagnóstico de muitas das doenças autoimunes sistémicas, desde há cerca de 30 anos. A determinação dos ANA em células HEp-2 está na base de um teste global, capaz de detectar mais de 100 autoanticorpos clinicamente relevantes. No entanto, apenas alguns testes são patognomónicos de determinadas doenças em particular, pelo que, são insuficientes para se estabelecer o diagnóstico de doença autoimune sistémica e devem ser sempre interpretados no contexto clínico. Não é raro a ocorrência de resultados positivos em doentes sem doença autoimune e mesmo em indivíduos sem doença. Deste modo as considerações técnicas são críticas para a correcta interpretação dos resultados dos testes ANA. A sua utilização de modo impróprio pode resultar em erros diagnósticos e terapêuticas desadequadas.

introdução

2. nota histórica O primeiro teste utilizado no diagnóstico do Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE) foi o teste para pesquisa de “células LE”, desenvolvido em 1948 por Hargraves. Foi uma descoberta importante, pois permitia fornecer ao clínico um resultado que o ajudaria a suportar o diagnóstico de SLE, sem ter de recorrer à biópsia de tecidos eventualmente afectados. Mas, cedo se tornou evidente que este era um teste pouco sensível e inespecífico para o diagnóstico do Lúpus. Num esforço para melhorar os testes, foi descoberto que o fenómeno “LE” correspondia a existência no soro do doente, de um conjunto de anticorpos contra constituintes nucleares. Assim, no final dos anos 50 foram utilizadas cortes de rim ou fígado de roedores para detectar, por imunofluorescência, autoanticorpos contra as proteínas nucleares das suas células. Estes testes, embora apresentassem uma sensibilidade aumentada, evidenciavam uma especificidade reduzida. Num esforço para diminuir o número de falsos positivos ou resultados clinicamente irrelevantes, os laboratórios passaram a reportar também os títulos nos resultados. Dum modo geral, os doentes com SLE apresentavam títulos mais altos de ANA do que os indivíduos sem patologia. Embora os testes começassem com diluições de 1:10 ou 1:20, um resultado positivo apenas era reportado quando se obtinha positividade, na imunofluorescência, para diluições superiores a 1:40. Embora esta prática diminuísse o problema dos resultados espúrios, grande número de doentes apresentavam ANA positivos e não tinham SLE, ao passo que doentes com SLE ocasionalmente tinham resultados ANA negativos. Embora com estas limitações, um achado de ANA positivo foi incorporado nos critérios diagnósticos de SLE. Os testes em substrato de animal apresentavam diferentes padrões de imunofluorescência que começaram a ser reportados. Em algumas situações, parecia existir alguma correlação clínica com alguns padrões, no entanto a relevância destas associações foi largamente suplantada pela possibilidade de categorizar os resultados ANA positivos, tendo por base as especificidades

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

antigénicas encontradas. Usando técnicas laboratoriais como a imunodifusão, imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA), hemaglutinação e enzimoimunoensaio (EIA), foi demonstrado que os soros ANA positivos reagiam com um conjunto de diferentes antigénios nucleares, incluindo o dsDNA, snRNP, SSA, SSB, RNP, Sm, Scl-70, histonas. A reactividade com estes antigénios é mais específica da presença de doença do que os padrões acima mencionados, podendo ainda fornecer informação prognóstica útil. No final dos anos 60 o substrato passou para uma linha de cultura de células tumorais humanas (cultura de células HEp-2), e no final do anos 80, melhorou-se os métodos de fixação. O substrato em células HEp-2 já substituiu largamente os tecidos dos roedores e tornou-se o método padrão para executar o teste ANA. O aumento de sensibilidade do ANA em HEp-2 está, no entanto, ainda associada a uma especificidade diminuída, pelo que, têm sido utilizados pontos de corte mais elevados para uma diminuição dos falsos positivos.

nota histórica

3. princípio do teste de imunofluorescência O teste de imunofluorescência indirecta é baseado na ligação do autoanticorpo presente no soro do doente, com o antigénio das células HEp-2. Conforme o local de ligação do autoanticorpo, são expressos vários padrões de ANA, que podem ser nucleares, nucleolares, citoplasmáticos, do aparelho mitótico ou mistos. Após a ligação do anticorpo ao substrato, a reacção será revelada por uma imunoglobulina da classe IgG, conjugada com fluoresceína. A lâmina de vidro, coberta pela cultura de células HEp-2, será, depois de processada, observada ao microscópio de fluorescência.

fitc

3.1. Condições pré-analíticas Devem ser utilizadas amostras de soro, ou colhidas no próprio dia, ou armazenadas a 4ºC, no máximo por um período de uma semana. Se se pretende armazenar durante mais tempo, as amostras devem ser acondicionadas a -20ºC, sendo recomendado a adição de azida de sódio, para estabilizar a actividade dos anticorpos que eventualmente estarão presentes na amostra. Congelar e descongelar uma amostra, frequentemente, diminui a actividade dos anticorpos.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

3.2. Células HEp-2. O que são ? O conhecimento da estrutura da célula eucariótica e do seu ciclo celular é fundamental para a compreensão dos padrões observados no substrato de células HEp-2.

3.2.1. Estrutura das células HEp-2

mitocôndrias

centríolo

núcleo

membrana nuclear

ap golgi

r. e. liso ribosomas

princípio do teste de imunofluorescência

3.3. Porquê as células HEp-2 ? São células de carcinoma laríngeo humano, que: • Podem-se propagar indefinidamente, em cultura de células, e como tal o substrato pode ser mais facilmente padronizado; • Permitem disponibilizar todo um espectro de antigénios humanos e estão mais próximo da especificidade contra os quais os anticorpos são produzidos, possibilitando que um maior número de anticorpos seja detectado e facultando uma maior taxa de detecção; • Possuem elevada sensibilidade, possibilitando que anticorpos contra diversos tipos de antigénios possam ser detectados, em simultâneo, num único substrato; • Têm um núcleo maior, em que os diferentes anticorpos antinucleares podem ser mais facilmente diferenciados pelos seus padrões de fluorescência; • Têm um grande número de mitoses. Os anticorpos anti-estruturas específicas das mitoses e os anticorpos anti- centrómeros são diagnosticados com mais segurança. A elevada sensibilidade, presente nas técnicas de IFI em substrato de células HEp-2, contrasta com a sua baixa especificidade: apenas alguns padrões são específicos de alguns antigénios e muitas especificidades diferentes, dão origem a padrões semelhantes. Para além disso, muito doentes apresentam diferentes autoanticorpos que resultam em padrões mistos. As características acima referidas, fazem das técnicas de IFI em substrato de HEp-2, uma excelente técnica para o rastreio dos ANA. As células HEp-2 constituem um substrato de elevada sensibilidade que permite, preliminarmente, aceder a informação qualitativa (positivo ou negativo), ou semi-qualitativa (positivo com padrão e título associado) que pode ser, posteriormente, identificada e quantificada.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

3.4. O ciclo celular A interfase está dividida em 3 períodos sucessivos: G1 (“gap”1), S (síntese) e G2 (“gap”2). A fase G1 é preparatória para a biosíntese do DNA, que ocorre na fase S. Quando a célula atinge a fase G2 a síntese de DNA está completa e os pares de cromossomas estão unidos no centrómero. Na fase M (Mitose), a célula divide-se e a quantidade de DNA divide-se em dois. O ciclo celular das células HEp-2 é de 36 horas.

princípio do teste de imunofluorescência

3.5. Divisão celular A Mitose corresponde a cerca de 15% do ciclo celular e está dividida em 5 fases sucessivas: Profase, Prometafase, Metafase, Anafase e Telofase.

interfase

metafase

profase

anafase

prometafase

telofase

Os padrões característicos da células em Mitose, só aparecerão nessa fase do ciclo. A maior parte dos padrões associados a patologias, ocorrem durante a Interfase, pelo que as células HEp-2 escolhidas para serem o substrato utilizado, devem estar maioritariamente nessa fase, mas não todas.

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4. prevalência dos ana nas doenças autoimunes Os ANA, presentes no soro dos doentes, são característicos de muitas doenças. tabela 1. Doenças autoimunes

Prevalência do ANA

Doenças em que o ANA é muito útil para o diagnóstico Lúpus Eritematoso Sistémico

Activo

95-100%

Inactivo

80-100%

Sindroma do Lúpus Neonatal

< 90%

Esclerose Sistémica ou Esclerodermia

60-80%

Cirrose Biliar Primária

95-100%

Doenças em que o ANA é moderadamente útil para o diagnóstico Sindroma de Sjörgen

40-70%

Poliomiosite e Dermatomiosite

30-80%

Doenças em que o ANA é útil para a monitorização ou prognóstico Artrite Juvenil Crónica com Uveitis

20-50%

Fenómeno de Raynaud

20-60%

Condições em o ANA é critério diagnóstico Lúpus Eritematoso Medicamentoso

≈100%

Hepatite Autoimune

≈100%

Doenças Mista Tecido Conjuntivo

≈100%

Doenças para as quais o ANA não é útil para o diagnóstico Artrite Reumatóide

30-50%

Outras doenças reumáticas

20-50%

Esclerose Múltipla Púrpura Trombocitopénica Idiopática Colite Ulcerosa Lúpus Discoide Crónico Tiroidite

25% 10-30% 26% 5-25% 30-50%

prevalência dos ana nas doenças autoimunes

No entanto, resultados positivos devem ser interpretados com cautela e tendo por base a informação clínica do doente em causa. Os idosos e as mulheres grávidas apresentam frequentemente títulos positivos, ainda que baixos, do ANA, assim como os doentes com infecções crónicas, neoplasias, e muitas outras patologias. tabela 2. Doença População saudável Idoso (> 65 anos) Gravidez

Prevalência do ANA < 5% < 30% 5-10%

Doenças neoplásicas

10-30%

Infecções crónicas

10-50%

Febre reumática

< 5%

Embora o papel dos anticorpos antinucleares, no diagnóstico da doenças autoimunes esteja bem definido, o seu papel na etiopatogenia não é ainda claro.1

1 No caso do SLE, os anticorpos anti-DNA de dupla cadeia, formam imunocomplexos durante a evolução da doença, que se depositam no tecido celular subcutâneo, no rim, e em outros órgãos onde podem causar lesão por causarem activação do sistema do complemento. O título de anticorpos corresponde ao grau de actividade da doença.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

5. nomenclatura dos autoanticorpos Anticorpos antinucleares (ANA) são autoanticorpos dirigidos contra uma variedade de componentes do núcleo da célula. O termo ANA é utilizado para todos os anticorpos que podem ser visualizados por IFI em substrato de HEp-2. Embora a célula contenha milhares de diferentes proteínas, só algumas têm propriedades autoantigénicas. Os ANA podem, de modo grosseiro, ser divididos em cinco grupos: os que reconhecem antigénios do envelope celular, dos organelos do nucleoplasma, do nucleolo, do aparelho mitótico e do citoplasma. Algumas das proteínas nucleares alvo dos autoanticorpos, foram extraídas de células do timo, baço e de cultura de células, usando certos tampões. Foram agrupados sob a denominação de Antigénios Nucleares Extraíveis (ENA). Nestes estão incluídos SS-A, SS-B, RNP, Sm (Smith), PM/Scl-70, dsDNA. Na nomenclatura dos autoanticorpos dirigidos contra as proteínas nucleares alvo, foi tido em consideração tanto as características bioquímicas das proteínas nucleares alvo (ex. DNA, histonas, RNP), ou a doença com a qual estão associadas (SS-A, SS-B, PM- Scl,Scl-70), como por vezes até os nomes dos doentes em que os autoanticorpos foram primeiro diagnosticados (Sm, Ro, La). tabela 3. Componente nuclear

Antigénios nucleares

Cromatina (Polinucleótidos)

dsDNA, ssDNA,

Histonas

H1, H2A, H2B, H3, H4, complexo H2A-H2B

RNP do nucleoplasma

U1-RNP,Sm, SS-A/Ro, SS-B/La

Nucléolo

Fibrilharina, PM-Scl, RNA Polimerase I

Centrómeros

Prot. associadas ao Centrómero (CENP-A,B,C)

Corpos PML

Sp100

Complexo poro-nuclear

Laminas, L-BR, gp210

Outras proteínas

Scl –70 (Topo-I), Ciclina (PCNA)

nomencalatura dos autoanticorpos

6. autoanticorpos e padrões he p -2 Os autoanticorpos pesquisados por IFI, em substrato de células HEp-2, estão associados a determinados padrões de imunofluorescência, que embora meramente indicativos, e não permitindo uma identificação definitiva da especificidade subjacente, podem, tanto o título como o padrão, ser muito informativos por serem característicos do autoanticorpo procurado. O componente nuclear no qual se localiza o antigénio e que é reconhecido pelo ANA, vai determinar o padrão visual que se observará por imunofluorescência. (tabela 4) Têm sido descritos mais de 30 padrões e imunofluorescência, incluindo padrões nucleares e citoplasmáticos. Alguns deles são raros. Os padrões do ANA com mais significado clínico, são o homogéneo, finogranular, mosqueado, nucleolar e centrómero, associados ao dsDNA, Histonas, SS-A/Ro, SS-B/La, Mi-2, U1-RNP, Sm, Scl-70, PCNA, gp210, Sp100, CENP-B. tabela 4 Autoanticorpo

Padrão fluorescência nuclear

dsDNA , H1, H2A, H2B, H3, H4, complexo H2A-H2B

Homogéneo

U1-RNP, Sm

Mosqueado, nucleolos negativos

SS-A/Ro, SS-B/La

Fino granular, nucleolos negativos

Fibrilharina, RNA Polimerase I

Nucleolos granulares

PM-Scl/7-2-RNP (To)

Nucleolos homogéneos

NOR-90

Nucleolar e Metafase c/ 1 ou 2 grânulos

Proteínas associadas ao Centrómero (CENP-A,B,C)

Centromérico (grânulos típicos, mitoses positivas)

Scl –70

Quase homogéneo, nucleolos salientes

Sp100

Pontos Nucleares (Nuclear dots)

Laminas, L-BR, gp210

Membrana Nuclear (Complexo Poro-Nuclear)

Ku/Mi-1/Mi-2

Fino granular

Ciclina (PCNA)

Finogranular (50% são 10 x mais fluorescentes)

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

Os padrões encontrados, devem sempre ser confirmados por outras técnicas, tais como ELISA, CIE, Imunoblotting, de modo a determinar a sua especificidade. Muitos dos padrões ANA correspondem a antigénios, com significado clínico, mas de baixa prevalência, pelo que não são incorporados nos testes para determinar as especifidades referidas. Exemplos são o RNA polimerase I e III, To/Th, fibrilharina, PM/Scl entre outros, que revelam um padrão nucleolar, só podendo ser despistado por IFI. Muitos dos antigénios que são importantes para o diagnóstico das doenças autoimunes estão contidos no núcleo. Também podem ser utilizadas as células HEp-2 para detectar anticorpos contra antigénios citoplasmáticos ou contra estruturas específicas das mitoses. Relativamente aos padrões citoplasmáticos e às estruturas associadas, no entanto, e excepto os anticorpos anti-mitocôndria (AMA), anticorpos antimúsculo liso (ASMA), anticorpo anti-Ribossomas e o anticorpo anti-Jo-1, os restantes têm muito pouca importância diagnóstica, quer seja porque não estão associados a nenhuma doença em particular, quer seja porque ocorrem muito raramente. A caracterização dos diferentes anticorpos contra componentes do citoplasma, por imunofluorescência, pode ser difícil. tabela 5 Antigénios do citoplasma

Organelos celulares

Citoesqueleto Outras proteínas

Padrão de fluorescência citoplasmático

Mitocôndrias

Granular, compacto

Ribossomas

Fino granular, compacto

Aparelho Golgi

Paranuclear, granular

Lissosomas

Fino a grosseiro, semelhante a gotas

Actina

Feixe de fibras

Vimentina

Construção de fibras finas

Citoqueratina

Filamentos

Jo-1

Granular, compacto

autoanticorpos e padrões he p -2

Se, inicialmente tiverem sido pedidos testes para os antigénios nucleares, as reacções citoplasmáticas devem ser valorizadas, apenas se o significado clínico for inequívoco. A ocorrência de padrões associados a estruturas específicas relacionadas com a mitose, na observação de ANA, podem ser de importância significativa, em algumas situações (ex: SLE). tabela 6. Antigénios associados com Mitoses

Estruturas da Mitose

Padrão de fluorescência

Centríolos

2 dots: dirigidos p/ os polos

Fibras do fuso

Fibras no centríolo

Zona de separação

Fluorescência a nível médio

Antigénios associados a cromossomas Pericromossómica

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7. caracterização antigénica dos padrões de fluorescência Como foi referido, aos muitos padrões que podem ser encontrados por imunofluorescência indirecta, estão associados antigénios, cujas especificidades importa determinar, pois podem encerrar associações clínicas importantes. Deste modo, muitos laboratórios optam por fazer o rastreio da positividade para a presença de anticorpos antinucleares por IFI, recorrendo posteriormente à execução de testes anti ENA. Esta abordagem vai permitir acelerar o diagnóstico clínico laboratorial a partir de um só pedido. Nas circunstância em essa abordagem não é possível, dever-se-á requisitar os antigénios associados aos padões reportados.

7.1. Padrão nuclear fig. 1

Homogéneo (figura 1) Autoanticorpos anti dsDNA O termo anticorpo anti-DNA refere-se, habitualmente, aos anticorpos que se ligam especificamente ao dsDNA. Testes para detectar o ssDNA estão disponíveis, no entanto a suas características técnicas e associações clínicas são bastantes distintas das dos anticorpos anti-dsDNA. Os anticorpos anti-ssDNA não têm nenhuma utilidade clínica e não devem ser requisitados.

Padrões de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Homogéneo - fluorescência uniforme e difusa de todo o núcleo celular. Não é possível distinguir os nucleolos. • Célula em Metafase: Mitoses positivas - os cromossomas condensados apresentam uma fluorescência aumentada, sendo a região em redor negativa.

caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

Antigénios Os anticorpos anti-DNA, podem ser de dois tipos: • Anticorpos-dsDNA (anti-DNA nativo, dupla cadeia). Os epitopos estão na região externa do DNA. • Anticorpos anti-ssDNA (DNA desnaturado, de cadeia única). Os epitopos estão na região das purinas e pirimidinas. Os outros métodos, onde dsDNA podem ser identificados, são o método de Farr (RIA), os ensaios em IFI em substrato de Crithidia luciliae e os métodos de ELISA. O método de ELISA, quando permitem detectar apenas os anticorpos de afinidade média e alta, devem ser utilizados para quantificação e monitorização terapêutica.

Interpretação clínica • Estes anticorpos têm uma especificidade de quase 100% para SLE. • A presença destes anticorpos constitui critério para o diagnóstico da doença. • Cerca de 85% dos indivíduos saudáveis em quem estes anticorpos foram detectados, desenvolveram SLE, nos 5 anos seguintes. • O doseamento destes autoanticorpos permite fazer a monitorização da terapêutica, uma vez que existe uma correlação directa entre os níveis destes anticorpos e a actividade desta doença. • Os anti-dsDNA correlacionam-se com alguns aspectos do prognóstico do SLE, tais como actividade, a presença de nefrite lúpica, e a actividade da nefrite lúpica. • A presença de anti-dsDNA positivo deve sempre ser interpretada no contexto clínico. • O diagnóstico de SLE não pode ser excluído, mesmo que não se encontrem estes autoanticorpos.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

Outras situações também associadas a estes autoanticorpos são: • • • • • •

L úpus eritematoso disseminado induzida por medicamentos: 60% DMTC: 20-50% Polimiosite / Dermatomiosite: 40-50% Esclerose Sistémica: 14% Sindroma de Sjörgen: 13% Artrite Reumatóide: 8%

Autoanticorpos anti-Histonas São uma grupo de proteínas básicas, altamente conservadas, encontradas no núcleo da célula eucariótica. Estão descritos 7 classes (H1,H2A, H2B, H3, H4, H5 e H2A-H2B-DNA). As histonas ligam-se ao DNA nativo celular, estabilizam a dupla hélice e é possível que tenham um papel na regulação genética. Juntamente com o DNA, as histonas formam nucleossomas altamente organizados São produzidos autoanticorpos contra cada uma destas proteínas. Têm sido utilizados muitos ensaios diferentes para detectar os anticorpos anti-histonas, tais como IFI, fixação do complemento, RIA, imunobloting e ELISA.

Padrões de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Homogéneo - fluorescência uniforme e difusa de todo o núcleo celular. • Célula em Metafase: Mitoses positivas - os cromossomas condensados apresentam uma fluorescência aumentada, sendo a região em redor negativa.

Interpretação clínica • É necessário a presença de um resultado ANA positivo para poder-se afirmar o diagnóstico de Lúpus induzida por medicamentos (95%). • As medicações mais habitualmente associadas com estes sindroma são a hidralazina, isoniazida, procainamida e vários anticonvulsivantes. • Anticorpos anti-histonas também podem ser observados no SLE idiopático (80%), assim como numa variedade de outras patologias, incluindo: Artrite Reumatóide, JCA, Esclerodermia, Vasculite e doenças hepáticas autoimunes. caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

fig. 2

Mosqueado (figura 2) Autoanticorpos anti U1-snRNP e Sm Os antigénios-alvo são as ribonucleoproteínas pequenas (snRNP), partes de partículas subcelulares (spliceosomas), compostas por polipéptidos que contêm RNA de baixo peso molecular com grande conteúdo de uridina U1, que se localizam no núcleo. A partícula de Sm é complexa, consistindo em diferentes proteínas, também associadas a RNA’s de baixo peso molecular.

Padrões de fluorescência na célula HEp-2 • Células em Interfase: Mosqueado - granular grosseiro. Os nucleolos são negativos. As células de fígado de primata produzem fluorescência granular com nucleolos negativos. Ao contrário do que acontece com os autoanticorpos anti SS-A e SS-B, a fluorescência é de idêntica intensidade entre as células de fígado de primata e HEp-2. • Células em Metafase: Mitoses negativas.

Interpretação clínica • Altos títulos de anticorpos anti-U1-snRNP são característicos de colagenoses mistas (DMTC - Sindroma de Sharp). A prevalência é de 95-100%. Os anticorpos anti-U1-snRNP, que são muitas vezes testados em paralelo com anticorpos anti-Sm, também podem ocorrer no SLE (30-40%), mas não são específicos nem são úteis para o diagnóstico de SLE. Os anticorpos anti-Sm têm uma grande especificidade SLE (ocorrem em 30% de SLE e 8% de DMTC), sendo utilizados no auxílio do diagnóstico. A ocorrrência de títulos elevados de anti-Sm, é mais específico para o diagnóstico de SLE. Tal como no caso dos anti-dsDNA, a sua ausência não exclui o diagnóstico. Juntamente com os anticorpos anti-dsDNA, podem ambos ser considerados como patognomónicos desta doença embora só ocorram em cerca de 15-30% dos doentes.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

Autoanticorpos anti hnRNP (matriz nuclear) A matriz nuclear consiste numa estrutura de proteínas nucleares insoluveis que são resistentes à DNAase, RNAase e tratamento rico em sal. O autoantigénio é composto por um grupo de proteínas ribonucleres heterogéneas (hnRNP).

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Células em Interfase: Mosqueado, com grandes grânulos de aspecto grosseiro e tamanho variável, numa rede nuclear. Nucleolos negativos. No fígado de primata, a fluorescência é mais fraca. • Células em Metafase: Mitoses negativas.

Interpretação clínica Este padrão não é muito frequente e pode ser encontrado em doentes com DMTC, Artrite Reumatóide, SLE e Esclerose Sistémica.

fig. 3

Fino Granular (figura 3) Autoanticorpos anti SS-A (Ro) e anti SS-B (La) É uma ribonucleoproteína implicada no processo de transcripção e traslacção proteica. A sua nomenclatura deriva do Sindroma de Sjörgen.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Células em Interfase: Finogranular, nucleolos negativos. No fígado de primata, a fluorescência é mais fraca. • Células em Metafase: Mitoses negativas

Interpretação clínica Este anticorpo ocorre em cerca de 35-60% no SLE, apresentando estes doentes sintomas clínicos de fotosensibilidade, sicca sindroma, trombocitopénia e rash cutâneo subagudo. Uma associação muito importante é a que ocorre caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

no caso do lúpus neonatal. Nesta situação, as IgG maternas atravessam a placenta, causando danos no reçém-nascido, cujos sintomas podem ir desde rash e outras manifestações de SLE, até o completo bloqueio cardíaco congénito. Apesar desta manifestação ser bastante pouco comum, as mulheres com SLE e que estejam a considerar engravidar, devem ser rastreadas para SS-A e a gravidez deve ser monitorizada apertadamente. A determinação destes anticorpos pode também ser muito útil nos doentes com SLE que são ANA negativos, porque são geralmente positivos. Está também associado ao Sindroma de Sjörgen (sindroma imunológico ocorre por destruição progressivadas glândulas de secreção exócrina levando a uma secura das mucosas e conjuntivas) em cerca de 40-90%. Os anticorpos anti-SS-B, virtualmente nunca ocorrem, excepto se os doentes também tiverem anti-SS-A. A presença de anti-SS-A e anti-SS-B, podem ser utilizados para o diagnóstico de Sindroma de Sjörgen. No entanto, e como estes anticorpos podem ser encontrados em outras patologias (Esclerose Sistémica, Miosite, DMTC), a sua presença deve sempre sempre interpretada no contexto clínico. Para além de ajudar no diagnóstico, a presença destes anticorpos fornece alguma informação prognóstica. Os doentes com estes anticorpos têm mais frequentemente doença extraglandular, como vasculite, púrpura, linfadenopatia, manifestações hematológicas (leucopénia e trombocitopénia, hiperglobulinémia e a presença de factor reumatóide positivo. Podem ocorrer em pouco mais de 20% dos doentes com PBC.

Autoanticorpos anti RNA-polimerase-III O RNA polimerase III está situado no nucleoplasma. As RNA polimerases são complexos multiproteícos, sendo que alguns dos polipéptidos são comuns a mais do que um RNA polimerase e apresentam reacções cruzadas entre eles.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Finogranular, nucleolos negativos. • Células em Metafase: Mitoses negativas

Interpretação clínica Este anticorpo tem sido mais descrito em doentes com uma forma cutânea difusa de Esclerose Sistémica. Não foi descrita nenhum envolvimento de orgãos internos.

Autoanticorpos anti Mi-2 Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Finogranular, nucleolos negativos • Células em Metafase: Mitoses negativas

Interpretação clínica s anticorpos anti Mi-2 são altamente específicos de Dermatomiosite O (> 96%) e ocorrem em 15-25% dos doentes com Dermatomiosite.

Autoanticorpos anti Ku Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Finogranular, nucleolos negativos • Células em Metafase: Mitoses negativas

Interpretação clínica Este anticorpo é encontrado num largo espectro de doenças do tecido conjuntivo, incluindo as sindromas de overlap como o Sindroma de Sjörgen acompanhado de Miosite, o fenómeno de Raynaud com envolvimento muscular e articular. Ocorre também em cerca de 5-10% em doentes com SLE e em cerca de 30-55% dos doentes com Poliomiosites e Dermatomiosites.

caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

fig. 4

Dots Nucleares (figura 4) Anticorpo anti-múltiplos dots nucleares As estruturas que dão origem ao padrão múltiplos dots nucleares, são complexos multiproteícos que formam discretos corpos nucleares. Estes antigénios incluem a proteína Sp-100, a proteína leucemia promielocítica (PML). A sua função é ainda mal entendida.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Presença de múltiplos pontos nucleares. Os pontos são de tamanho variado e encontram-se espalhados em todo o nucleoplasma, mas separados dos nucleolos. • Célula em Metafase: Fluorescência localizada na periferia da célula e não na cromatina da metafase, característica que permite distinguir este padrão do padrão anti-centrómero.

Interpretação clínica Este padrão é encontrado em cerca de 30% dos casos de Cirrose Biliar Primária, muitas vezes associado a Sindroma de Sjörgen.

Membrana Nuclear (figura 5) fig. 5

Anticorpo anti membrana-nuclear Os antigénio pertencem á família dos filamento intermédios, que compreendem as laminas A, B1, B2 e C. Estes filamento constituem locais de ancoramento para os cromossomas na interfase.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Fluorescência da membrana nuclear, com fluorescência homogénea de menor intensidade no nucleoplasma • Célula em Metafase: A fluorescência é difusa no citoplasma, enquanto a cromatina é negativa.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

Interpretação clínica Padrão raro, encontrado em doentes com doenças autoimunes, como hepatite autoimune, vasculite, trombocitopénia e SLE. Títulos baixos de anticorpos têm sido encontrados em doentes com sindroma de fadiga crónica.

Anticorpo anti-complexo poro-nuclear Os complexos poro-nucleares são estruturas distribuídas ao longo do envelope nuclear, cada uma com cerca de 100 proteínas. Os poros permitem a passagem de substâncias entre o núcleo e o citoplasma. O autoantigénio é uma glicoproteína integrante da membrana de 210kDa (gp210). A Nucleoporina p62 também tem sido identificada com alvo antigénico.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Fluorescência fino granular com reforço membranar. • Célula em Metafase: Padrão fino granular denso, sem fluorescência na cromatina. Podem ser encontrados anticorpos anti Mitocôndria.

Interpretação clínica Padrão frequentemente associado à Cirrose Biliar Primária. Nesta patologia, os doentes com anticorpos anti-gp210 apresentam um pior prognóstico.

fig. 6

PCNA (figura 6) Autoanticorpos anti-ciclina (PCNA) Ciclina ou Proliferanting Cells Nuclear Antigen é uma proteína auxiliar do DNA polimerase, que controla o ciclo celular e está envolvida na replicação e reparação do DNA.

caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

Padrão de fluorescência na Célula HEp-2 • Células em Interfase: Todo o nucleoplasma de cerca de metade (entre 30-60%) das células em interfase (fase S e G2) apresenta fluorescência fina granular ou mosqueada, excepto os nucleolos. A outra metade (células em interfase em fase G1) também apresenta fluorescência mas com uma intensidade 10 x menor. Os nucleolos são negativos. • Células em Metafase: As mitoses são negativas.

Interpretação clínica São bastantes específicos do SLE, sendo a prevalência apenas de 3-6%. Podem ser encontrados em doentes com hepatite crónica B ou C. fig. 7

Centrómero (figura 7) Anticorpo anti-centrómero Os anticorpos anti-centrómero reconhecem 4 proteínas: (CENP-B (80kDa), CENP-A (17kDa), são as proteínas mais frequentemente encontradas, e CENPC (140kDa) e CENP-D, mais raramente. Estão localizadas na face interna e externa do cinetocoro, interagindo com o aparelho mitótico, durante a mitose.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • •

Célula em Interfase: Todo o núcleo em interfase está coberto por 40-60 dots Célula em Metafase: As mitoses são positivas, encontrando-se os dots condensados

Interpretação clínica São encontrados em doentes com CREST (Calcinose, Raynaud, Dismotilidade Esofágica, Esclerodactilia, Telangiectasia), uma variante moderada da esclerodermia sistémica progressiva. Nos doentes com PBC também podem ser encontrados ac. anti-centrómero.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

fig. 8

7.2. Padrão nucleolar (figura 8) Autoanticorpos anti U3-nRNP / Fibrilharina É uma proteína básica, está localizada nas estruturas fibrilhares do nucleolo. É um componente da ribonucleoproteína U3-nRNP.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Células em Interfase: Nucleolar. Fluorescência granular dos nucleolos, o nucleoplasma é negativo. • Células em Metase: Mitoses positivas, tipo reticulares.

Interpretação clínica Está presente em 4-8% dos doentes com Esclerose Sistémica. Está associada a uma forma da doença mais difusa e mais grave pode estar associada à hipertensão pulmonar. Anticorpos antinucleolares podem ser também encontrados em doentes com SLE, Sindroma Sjörgen, Artrite Reumatóide, Fenómeno de Raynaud.

Autoanticorpos anti RNA-polimerase-I É um complexo enzimático nucleolar que consiste em cerca de 13 proteínas.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Nucleolar. Fluorescência granular dos nucleolos, o nucleoplasma é negativo, quando não estão presentes outros anticorpos. • Células em Metafase: Mitoses positivas.

Interpretação clínica A presença deste anticorpo tem sido associada com uma forma difusa e rapidamente progressiva de Esclerose Sistémica (30%), com elevada prevalência de envolvimento de orgãos internos.

caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

fig. 9

Autoanticorpos anti NOR-90 (figura 9) O antigénio é a região organizadora nucleolar (NOR), ou seja, onde o nucleolo se regenera depois da mitose. O NOR-90 apresenta duas isoformas e (97kDa e 94 kDa) e é uma factor de transcricção da RNA polimerase I.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Nucleolar • Células em Metafase: Dots fluorescentes na região da cromatina condensada

Interpretação clínica É um padrão muito raro e que pode ser observado no soro dos doentes com Esclerose Sistémica e fenómeno de Raynaud. Também tem sido descrito em doentes com Artrite Reumatóide, SLE e neoplasias, sendo destas a mais frequente o carcinoma hepatocelular.

Autoanticorpos anti 7-2-RNP (Th/To) O antigénio é uma proteína de 40 kDa que é comum a duas sRNP, contendo 7-2 RNA (Rnase MRP) e 8-2 RNA (RNase P). Ambas são endoribonucleases.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Nucleolar Homogéneo. Pode ocorrer fluorescência no nucleoplasma e no citoplasma. • Células em Metafase: Mitoses negativas

Interpretação clínica Este anticorpo tem sido associado a uma forma cutânea limitada de Esclerose Sistémica. Não foi descrito nenhum envolvimento de orgãos internos. Os doentes com Esclerose Sistémica, habitualmente, apenas evidenciam uma das especificidades de anticorpos antinucleolares descritos. Os anticorpos anti nucleolares podem ser encontrados em doentes com SLE, Sindroma Sjörgen, Artrite Reumatóide e fenómeno de Raynaud.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

fig. 10

Autoanticorpos anti PM-Scl (figura 10) É um complexo poliproteico (11 péptidos) localizado no nucleolo. Pensa-se estar associado à biosíntese de ribossomas.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Nucleolar Homogéneo, com uma fluorescência fina granular no nucleoplasma (de fraca intensidade). • Células em Metafase: Mitoses negativas.

Interpretação clínica Estes anticorpos são encontrados num contexto de sindroma overlap de Polimiosite com Esclerose Sistémica. É encontrado em 50% dos doentes com uma combinação de sintomas de Poliomiosite, Dermatomiosite e de Esclerose Sistémica Progressiva.

fig. 11

7.3. Homogéneo nucleolar (figura 11) Autoanticorpos anti Scl-70 (Topo-I) O Scl-70 é um producto de degradação activo da Topoisomerase-I. Esta é uma enzima DNA topoisomerase-I, está localizada no nucleoplasma e em particular e alta concentração nos nucleolos. A sua função é catalizar o DNA.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Células em Interfase: Homogéneo Nucleolar. Nucleoplasma homogéneo e nucleolos com fluorescência homogénea e um pouco mais forte. • Células em Metafase: As mitoses são positivas.

Interpretação clínica Estes anticorpos são encontrados em cerca de 25-50% em doentes com Esclerodermia Sistémica Difusa, com envolvimento de orgãos internos, nomeadamente fibrose pulmonar intersticial. Também pode ser encontrado em caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

doentes com Sindroma de Raynaud antes dos sintomas sistémicos se instalarem e em doentes com SLE (cerca de 25%). Os resultados devem ser utilizados no adequado contexto clínico.

fig. 12

7.4. Fuso Mitótico Anticorpo Anti Centríolo / Centrossoma (figura 12) O Centrossoma é um centro organizador de microtúbulos, tendo um papel na organização do citoesqueleto da interfase. É o local onde os microtúbulos se polimerizam para formarem o aparelho mitótico.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Dois pontos de fluorescência brilhante no citoplasma, adjacente ao núcleo. • Célula em Metafase: Discretos pontos fluorescentes em cada polo do aparelho mitótico.

Interpretação clínica É um padrão raramente encontrado. Pode estar associado ao fenómeno de Raynaud, Esclerose Sistémica, Sindroma Sjörgen e CREST ou a alguns sindromas crónicos pós-virais.

fig. 13

Anticorpo Anti NUMA – 1/ MSA- 1 (figura 13) O antigénio NuMA-1 (210kDa) tem um papel importante na formação do aparelho mitótico.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Fluorescência fino granular nos núcleos. • Célula em Metafase: Fluorescência dos polos do fuso mitótico e das fibras proximais.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

Interpretação clínica Padrão muito raro e sem associações clínicas conhecidas. Pode ser encontrado em doentes com uma variedade de patologias autoimunes, tais como, SLE, DMTC, poliartite, Sindroma Sjörgen.

Anticorpo anti-NUMA 2 O antigénio NuMA - 2 (130kDa) é uma proteína que está envolvida na formação dos microtúbulos, sendo essencial para a separação, migração e manutenção do centrossoma.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: não se observa fluorescência. • Célula em Metafase: fluorescência dos polos do fuso mitótico e das fibras, de polo a polo. O midbody e as pontes celulares apresentam fluorescência nas células em interfase.

Interpretação clínica Este padrão é muito raro. Tem sido associado com SLE e Sindroma Sjörgen. fig. 14

Anticorpo anti-midbody / MSA- 2 (figura 14) Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: fluorescência fino granular fraca nos núcleos. • Célula em Metafase: fluorescência da cromatina e no midbody (células em anafase e telofase).

Interpretação clínica Padrão muito raro, podendo ser observado na Esclerodermia e no Sindroma de Raynaud.

caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

fig. 15

Anticorpo anti-MSA 3 (figura 15) Padrão de fluorescência na célula HEp-2 • Célula em Interfase: Fluorescência fino granular densa nos núcleos . • Célula em Metafase: Fluorescência fina granular das fibras do fuso mitótico.

Interpretação clínica Padrão muito raro, associado por vezes com tumores do tracto respiratório.

7.5. Padrão citoplasmático As células HEp-2 também exibem uma multitude de antigénios no citoplasma podendo assim os anticorpos correspondentes ser detectados com imunofluorescência indirecta.

fig. 16

Anticorpos anti Ribossoma P proteína (figura 16) Os principais antigénios são as Proteínas P Ribossomais (P0, P1, P2). Os ribossomas são organizados nos nucleolos e são depois transferidos para o citoplasma.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 Finogranular muito compacto, no citoplasma. Pode-se encontrar fluorescência acentuada perinuclear e por vezes nos nucleolos, mas o nucleoplasm é negativo.

Interpretação clínica Pode ser encontrado em 10-20% dos doentes com SLE, por vezes na ausência de anticorpo anti-dsDNA. Estes anticorpos por vezes são associados a sintomas neuropsiquiátricos.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

fig. 17

Anticorpos anti aparelho de Golgi (figura 17) Os antigénios associados a este padrão são as golginas (67, 95, 97, 160 e 245). Pensa-se que as golginas tem uma papel na organização do aparelho de Golgi.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 Rede granular colocada num dos polos do núcleo celular, composta por grandes grânulos irregulares.

Interpretação clínica Padrão incomum associado a doentes com SLE ou Sindroma de Sjörgen ou outras doenças reumáticas crónicas.

Anticorpos anti-lissosomas Os antigénio lissosomal e as proteínas associadas às membranas lisossomais (LAMP’s) ainda não são bem conhecidas.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 Ponteado grande e irregular distribuído em todo o citoplasma.

Interpretação clínica Podem ocorrer em pessoas saudáveis e ser observado no citoplasma como estruturas semelhantes a gotas de tamanho médio, dando um aspecto global grosseiro. fig. 18

Anticorpos anti-mitocôndria (AMA) (figura 18) São vários os autoantigénios mitocondriais, sendo o M2 o mais frequentemente detectado. O M2 compreende um conjunto de proteínas da membrana interna da mitocôndria, incluindo o complexo piruvato desidrogenase (PDC), o 2-oxo-glutarato desidrogenase (OGDC), a cadeia ramificada 2-oxo-ácido desidrogenase (BCOADC). Cerca de 80-90% dos doentes com PBC reagem com subunidades E2 do PDC, enquanto a prevalência dos anticorpos contra OGDC e BCOADC está entre 50-70%. Anticorpos só anti-OGDC ou BCOADC apenas são observados em cerca de 3-10% dos casos de PBC.

caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 Padrão citoplasmático fino granular, estendendo-se desde em redor do núcleo através de todo o citoplasma. Núcleo, nucleolo e célula em metafase não apresentam fluorescência. O resultado encontrado na célula HEp-2, deve ser confirmado usando o CT3 (rim, fígado e estômago de roedores). Este resultado deve, por sua vez, ser confirmado utilizado técnicas de imunoblotting e/ou ELISA.

Interpretação clínica São pesquisados para confirmar o diagnóstico de Cirrose Biliar Primária (PBC). Cerca de 95% dos doentes com PBC são AMA-M2 positivos. Estes anticorpos são menos frequentes noutras patologias, como sejam Esclerodermia, CREST, SLE, Sindroma de Sjörgen e ocasionalmente em sindromas de Overlap.

fig. 19

Anticorpos anti histidil tRNA sintetase (Jo-1) (figura 19) O Antigénio é a histidil-tRNA sintetase. Outras tRNA sintetases podem também dar origem ao mesmo padrão.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 Grânulos finos condensados em redor do núcleo e em todo o citoplasma. As mitoses são negativas. Os nucleolos são negativos.

Interpretação clínica Estes autoanticorpos têm sido encontrados em associação com poliomiosite (com fibrose intersticial pulmonar) numa prevalência de 25-35%. Os anticorpos são muito específicos (>95%) e as concentrações correlacionam-se com a actividade da doença.

Anticorpos anti-signal recognition particle (SRP) O SRP é um complexo ribonucleoproteico, consistindo em 6 polipéptidos.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 Padrão fino granular citoplasmático. Ausência de fluorescência nuclear.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

Interpretação clínica Encontrado em cerca de 4% dos doentes com Miosite, com significativa associação a polimiosite. Não ocorre em doentes com sindroma de overlap.

fig. 20

Anticorpos anti-ASMA (fibras de actina) (figura 20) É um dos microfilamentos que fazem parte do citoesqueleto e está envolvido no movimento celular.

Padrão de fluorescência na célula HEp-2 Fibras fluorescentes ao longo de todo a extensão da célula HEp-2. Núcleo e nucléolo não são fluorescentes. O triplo substrato (rim, estômago e figado de rato) é mais sensível e específico para detectar este autoanticorpo.

Interpretação clínica Estes anticorpos são sobretudo importantes para o diagnóstico de hepatite autoimune tipo I.

fig. 21

Anticorpos anti-vimentina (figura 21) A vimentina é um filamento intermédio tipo III do citoesqueleto, é responsável pela manutenção da forma celular.

Padrão de fluorescência nas células HEp-2 Fibras finas que radiam através do citoplasma e fazem conexões com as membranas nuclear e plasmática, fazendo padrões reticulares e enovelados.

Interpretação clínica Não existem dados concretos sobre o significado clínico destas fibras. Existem, no entanto, em algumas situações associadas, como doenças hepáticas e reumáticas crónicas (>90%), SLE, neoplasias, Doença de Crohn e doenças hematológicas.

caracterização antigénica dos padrões de fluorescência

8. quadros para interpretação dos resultados ana positivo caso 1a Resultado: Positivo Padrão: Mosqueado / Fino Granular, Título ≥ 320, Mitoses: Negativo Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti- SSA

Anticorpo Anti-SSB

Sindr. Sjögren

40-95% Sindr. Sjögren

40-95%

SLE (neonat.)

20-60% SLE

10-20%

AIH

30-40%

Anticorpo Anti- U1nRNP

Anticorpo Anti-Sm

DMTC

95-100% SLE

SLE

5-30%

15-40%

caso 1b Mitoses: Positivo Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti-dsDNA

SLE

Anticorpo Anti-Histonas

30-90% SLE Lup. Medic.

Anticorpo Anti-Nucleossomas

50-80% SLE

40-70%

95%

caso 2 Resultado: Positivo Padrão: Homogéneo, Título ≥ 320, Mitoses: Positivo Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti-dsDNA

SLE

Anticorpo Anti-Histonas

30-90% SLE Lup. Medic.

Anticorpo Anti-Nucleossomas

50-80% SLE 95%

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

40-70%

caso 3 Resultado: Positivo Padrão: Homogéneo e Fino Granular, Título ≥ 320 Mitoses: Positivo Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti- SSA

Anticorpo Anti-SSB

Sindr. Sjögren

40-95% Sindr. Sjögren

40-95%

SLE (neonat.)

20-60% SLE

10-20%

AIH

30-40%

Anticorpo Anti- U1nRNP

Anticorpo Anti-Sm

DMTC

95-100% SLE

SLE Anticorpo Anti-dsDNA

SLE

5-30%

15-40% Anticorpo Anti-Histonas

30-90% SLE Lup. Medic.

Anticorpo Anti-Nucleossomas

50-80% SLE

40-70%

95%

caso 4 Resultado: Positivo Padrão: Ac.Anti-Ku, Título ≥ 320 Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti-Ku

SLE

5-10%

Síndr. Overlap (Poliomiosite/Dermatomiosite)

30-55%

caso 5 Resultado: Positivo Padrão: Ribossomal P Protein, Título ≥ 320 Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti-Ribossomal P Protein

SLE (Psicose Lúpica)

5-20%

quadros para interpretação dos resultados ana positivo

caso 6 Resultado: Positivo Padrão: Anticorpo Anti-PCNA, Título ≥ 320 Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti-Ciclina I (PCNA)

SLE

caso 7 Resultado: Positivo Padrão: Nucleolar ou Fino Granular e Nucleolar, Título≥ 320 Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Esclerodermia (f.difusa) Poliomiosite/Dermatomiosite

Anticorpo Anti-Scl-70 (Topo I) *

25-75%

Anticorpo Anti-PM-Scl Anticorpo Anti-Fibrilharina (U3-nRNP) Anticorpo Anti-RNA Polimerase III (RNA POL III)**

5-10% 4%

Anticorpo Anti- 7-2-RNP (Th/To)***

raro

Anticorpo Anti-NOR (NOR-90)

raro

*Fibrose Pulmonar/Doença Vascular Periférica/Insuficiência Pulmonar **Crise Renal ***Hipertensão Pulmonar e Fibrose Pulmonar

caso 8 Resultado: Positivo Padrão: Anticorpo Anti-Centrómero, Título≥ 320 Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti-Centrómero (CENP-B)*

Esclerodermia (forma limitada – CREST) PBC *Doença Vascular Periférica/HTPulmonar isolada/PBC

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

80-95% 10%

caso 9 Resultado: Positivo Padrão: “Nuclear dots”, Título≥ 320 Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti-Sp100 e/ou Anticorpo Anti-PML

PBC

24%

caso 10 Resultado: Positivo Padrão: Ac. Anti-Membrana Nuclear/ Complexo Poro-Nuclear, Título≥ 320 Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpo Anti-Gp210

PBC

26%

caso 11 Resultado: Positivo Padrão: Citoplasmático Granular positivo (Observações) Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpos Anti-Mitocôndria (AMA) - M2 e/ou BPO (3E)

PBC

88-95%

AIH

caso 12 Resultado: Positivo Padrão: Citoplasmático Finogranular positivo (Observações) Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: Anticorpos Anti-JO-1

Poliomiosite*

25-35%

*Fibrose Pulmonar

quadros para interpretação dos resultados ana positivo

caso 13 Resultado: Positivo Padrão: Citoplasmático Filamentoso positivo (Observações) Pesquisar os seguintes anticorpos, se o quadro clínico assim o justificar: AnticorpoS Anti-Músculo liso (fibras de Actina)

AIH I

40-90%

caso 14 Resultado: Positivo Padrão: Citoplasmático Padrão

AMA ASMA - fibras de actina LKM-1*

Patologia

PBC AIH I AIH II

Prevalência

95% 40-90% 7%

*Antigénio-alvo: Citocromo P450 IID6

caso 15 Pedido específico de SLA/LP: Padrão

SLA/LP*

Patologia

AIH I

Prevalência

30%

*VPP 100% (se sintomas clínicos estiverem presentes). Não ocorre em Hepatites Virais.

caso 16 Pedido específico de LC-1: Padrão

LC-1*

Patologia

AIH II

*Antigénio - alvo: FTCD (formiminotransferase ciclodeaminase)

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

Prevalência

1-2%

9. como proceder depois de um resultado ana positivo?

homogéneo

dsDNA · Histonas

mosqueado

RNP · Sm

fino granular

ana positivo padrão

nucleolar

Scl-70 · NOR · Fibrilharina · PmScl

membrana nuclear

dots nucleares

citoplasma

SSA · SSB · Ku · PCNA · Mi2

Gp210

Sp100 · PML

Mitocôndrias (M2 · BPO) · F-Actina · Rib P Prot · Jo-1

como proceder depois de um resultado ana positivo?

10. métodos para seguimento do ana Imunodifusão e Imunoelectroforese contracorrente Método barato, fácil de executar, específico, pouco sensível. Soros positivos devem ser confirmados por outra metodologia mais específica.

Imunoblotting Ferramenta essencial para caracterização de muitos anticorpos. As proteínas extraídas de uma cultura de células são separadas por electroforese em gel de poliacrilamida. As proteínas do gel transferidas para papel de nitrocelulose, constituindo um suporte sólido para os antigénios. O papel de nitrocelulose é incubado com o soro a estudar.

Ensaios Imunoenzimáticos Estes ensaios são habitualmente utilizados para quantificar o dsDNA e os ENA’s, embora muitos laboratórios os usem como método de screening para ANA. Embora a performance dos screen EIA possa ser optimizada, a sensibilidade dos ensaios de screening dependem, em última análise da escolha dos antigénios. Enquanto que as HEp-2 têm todos os antigénios de interesse clínico, por cada antigénio usado no EIA screen, o seu custo aumenta. Haverá sempre uma proporção de ANA que escapará ao diagnóstico laboratorial.

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

bibliografia Concepción González, Teresa Martin, “ Comparison and Variation of Different Methodologies for the Detection of Autoantobodies to Nuclear Antigens (ANA), Journal of Clinical Laboratory Analisys 11: 388-392 (1997) David F. Keren, MD, “ Guidelines for the Clinical Use of ANA and related Specific Autoantibody Testing”, Arch Issues, 2000, Vol 11, nº 2 Kavanaug A, Tomar R, “Guidelines for clinical use of ANA test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens”. Arch Pathol Lab Med. 2000 (jan) 124: 71-81 “Antinuclear Antibody (ANA) Testing for Connective Tissue Disease” Guidelines and Protocols- Advisory Committee - British Columbia Medical Association (Ministry of Health), 2001 Daniel H. Solomon, Athur J. Kavanaugh et al, “Evidence-Based Guidelines for the use of Immunologic Tests: Antinuclear Antibody Testing” Arthritis and Rheumatology, vol 47, nº 4, August 2002 Allan Wiik, “Appropriateness of autoantibody testing in clinical medicine”, Clinica Chimica Acta 333 (2003), 177-180 John D. Reveille, Daniel H. Solomon, “Evidence-Based Guidelines for the use of Immunologic Tests: Anticentromere, Scl-70, and Nucleolar Antibodies” Arthritis and Rheumatology, vol 49, nº 3, June 2003 Peter J Roberts-Thomson, Tony Nikoloutsopoulos, “Antinuclear antibody testing in a regional immunopathology laboratory”, Immunology and Cell Biology (2003) 81, 409-412 Elizabeth Bento-Garcia, Peter H. Schur, “Guidelines for Immunologic Laboratory Testing in Rheumatic Diseases: Anti-Sm and Anti-RNP Antibody tests” Arthritis and Rheumatology, vol 51, nº 6, December 2004 Mogens Fenger, Allan Wiik, “Detection of Antinuclear by Solid-Phase Immunoassays and Immunofluorescence Analysis”, Clinical Chemistry 50:2141-2147, 2004 J.G.M.C. Damoiseaux, J.W. Cohen Tervaert, “From ANA to ENA: How to proceed?”. Autoimmunity Reviews. 2005 (April) Allan Wiik, “Guidelines for Antinuclear Antibody Testing” eJIFCC 2006, 17(3) Paper 14 Edward K.L. Chan, Marvin J.Fritzler, Allan Wiik, ”AutoAbSC.Org – Autoantibody Standartization Committee in 2006”, Autoimmunity Reviews 6 (2007) 577-580 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG: Description “Indirect Immunoflourescence: An easy and Modern Method”

bibliografia

fig.1 fig. 2

figura 1 - Padrão Homogéneo

fig. 3

figura 2 - Padrão Mosqueado

figura 3 - Padrão Fino Granular

padrões de fluorescência

fig. 4 fig. 5

figura 4 - Padrão Dots Nucleares

fig. 6

figura 5 - Padrão Membrana Nuclear

figura 6 - Padrão PCNA

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

fig. 7 fig. 8

figura 7 - Padrão Centrómero

fig. 9

figura 8 - Padrão Nucleolar (Fibrilharina)

figura 9 - Padrão Nucleolar (NOR-90)

padrões de fluorescência

fig. 10 fig. 11

figura 10 - Padrão Nucleolar Homogéneo

fig. 12

figura 11 - Padrão Homogéneo Nucleolar

figura 12 - Padrão Centríolo

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

fig. 13 fig. 14

figura 13 - Padrão NuMA-1

fig. 15

figura 14 - Padrão Midbody

figura 15 - Padrão MSA-3

padrões de fluorescência

fig. 16 fig. 17

figura 16 - Padrão Ribossoma P proteína

fig. 18

figura 17 - Padrão aparelho de Golgi

figura 18 - Padrão anti-mitocôndria

os ana no diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes

fig. 19 fig. 20

figura 19 - Padrão histidil tRNA sintetase (Jo-1)

fig. 21

figura 20 - Padrão fibras de actina (ASMA)

figura 21 - Padrão vimentina

padrões de fluorescência

ficha técnica Título: Os ANA no Diagnóstico Laboratorial das Doenças Autoimunes Autora: Dra. Maria José Rego de Sousa Edição: Centro de Medicina Laboratorial Dr. Germano de Sousa www.germanodesousa.com 1ª edição: Novembro 2009 Tiragem: 5.000 Design Gráfico: Kahn Impressão: M2