hemoglobinas

HEMOGLOBINAS Algunos Datos • 1 milímetro cúbico de sangre contiene aprox.

5 millones de glóbulos rojos • Cada eritrocito contiene aprox. 300 millones de moléculas de hemoglobina • La hemoglobina es la proteína más abundante de la naturaleza • La fracción proteica (globinas) permite ilustrar una gran variedad de facetas de la Genética

Esquema de la MolĂŠcula de Hemoglobina

http://www.people.virginia.edu/~rjh9u/globinevolve.html

Genes codificadores de las globinas

REGIÓN GENÓMICA DEL CLUSTER DE LAS GLOBINAS

LCR

LCR

Estructura Genes de las Globinas Intrones 5’

3’

CACCC

TATA CCAAAT

5’ UTR Promotor

Exones

3’ UTR

TRANSCRICCIÓN DE LAS HEMOGLOBINAS

Iniciador / Promotor

5´

ISV!

AG

TATA

GT

3´

ISV2

AG

GT

AG

5´

TAA 3´

3´

5´

Nucleo Citoplasma AAAA-A RIBOSOMA

GT

AUG UAC

UGC UUC ACG AAG

RNA t CADENA DE AMINOACIDOS

HEMOGLOBINA

RNA precursor

RNA procesado

http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW1/MG112286.html

Vogel & Motulsky. Human genetics. Problems & approaches

Cr. 16

Cr. 11 ε

ζ

γG γA

α2 α1 Familia Alfa

δ β Familia Beta

Cr. 16

Cr. 11 Globina ζ

ζ

141 aa.

ε γG γA

α2 α1

δ β

Cr. 16

Cr. 11 ε

ζ

γG γA

α2

Globina α

α1

141 aa.

δ β

Cr. 16 ζ

Globina 146 aa.

ε

Cr. 11 ε γG γA

α2 α1

δ β

Cr. 16

Cr. 11 ε

ζ

Globina

γ

G

146 aa.

(Glicocola en 136)

α2 α1

γG γA δ β

Cr. 16

Cr. 11 ε

ζ

Globina

γ

A

146 aa.

(Alanina en 136)

α2 α1

γG γA δ β

Cr. 16

Cr. 11 ε

ζ

γG γA

Globina α2 α1

146 aa.

δ

δ β

Cr. 16

Cr. 11 ε

ζ

γG γA

Globina β α2 α1

146 aa.

δ β

Cr. 16 ζ

Cr. 11

Hb Embrionarias ζ

Gower 1 ζ 2 ε2 Saco Vitelino

ε

ε γG γA

α2 α1

δ β

Cr. 16

Hb Embrionarias Saco Vitelino

ζ

Gower 2 α 2 ε2 α2 α1

Cr. 11 ε

ε γG γA δ

α

β

Cr. 16

Hb Embrionarias

ζ

ζ

ζ2 γ 2

α1

ε

Saco Vitelino

Portland

α2

Cr. 11

γ

γG γA δ β

Cr. 16

Cr. 11

Hb Fetales

ζ

ε

Hígado y Bazo

Fetal α2 γ 2

α2 α1

γ

γG γA δ

α

β

Cr. 16

Cr. 11

Hb Adultas

ζ

ε

Médula Ósea

γG γA

Hb A2 α2 α1

α2 δ2

α

δ

δ β

Cr. 16

Cr. 11

Hb Adultas

ζ

ε

Médula Ósea

γG γA

α2 α1

α

δ

Hb A α2 β2

β

β

Hemoglobinas Fisiológicas

• Embrionarias: – Gower 1: Zeta 2 - Epsilon 2 – Gower 2: Alfa 2 – Epsilon 2 – Portland : Zeta 2 - Gamma 2

Hemoglobinas Fisiológicas • Fetal: – Alfa 2 - Gamma-G 2 – Alfa 2 - Gamma-A 2 • Adulta – A: Alfa 2 - Beta 2 – A2: Alfa 2 - Delta 2

SĂ­ntesis de globinas a lo largo del desarrollo

Anemias hemolíticas • Heredadas • Defectos de membrana • Déficit de enzimas de glicólisis • Anomalías metabolismo nucleótidos • Déficit enzimas de shunt pentosas y metabolismo glutatión • Defectos estructura y síntesis de globina

• • • • • • • • • •

Adquiridas Inmunohemolíticas Traumática y microangiopática Infecciosa Químicos, drogas y venenos Físicos Hipofosfemia HPN Enfermedad hepática Déficit vitamina E en RN

Clínica - esplenomegalia: generalmente presente, desde leve a moderada y asintomática, no en drepanocitosis - colelitiasis: frecuente complicación que aumenta con la edad e intensidad de la hemólisis, patogenia es excreción de bilis supersaturada con bilirrubina no conjugada + calcio ionizado y baja en ácidos biliares; cálculos de 40% polímero de bilirrubinato y sales de calcio (“negros”); habitualmente pequeños y pueden ser radiopacos

Clínica - úlceras crónicas de extremidades inferiores: poco frecuentes, características de esferocitosis hereditaria y drepanocitosis; generalmente bilaterales , recurrentes y con hiperpigmentación como secuela - alteraciones esqueléticas: turricefalia, estriación de huesos frontales y parietales, anomalías dentales y maxilares; en talasemia mayor, drepanocitosis

Clínica • Depende de duración y severidad • Anemia hemolítica crónica (congénita) - anemia variable: desde asintomática, palidez hasta manifestaciones cardiovasculares severas - ictericia variable, sin coluria ni prurito - crisis: periodos de compensación de hemólisis con eritropoiesis acelerada, con períodos de desequilibrio por factores desencadenantes (parvovirus B19) ---> crisis aplásticas; hemólisis acelerada ---> crisis hemolíticas; carencia de folatos ---> crisis megaloblásticas - esplenomegalia

HEMOGLOBINOPATÍAS Clasificación • Variantes estructurales:  Hemoglobinas con solubilidad alterada  Hemoglobinas inestables  Hemoglobinas con afinidad alterada por el O2  Metahemoglobinas • Sindromes talasémicos:  β talasemia  α talasemia  δβ talasemia y Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal • Hemoglobinopatías talasémicas

LABORATORIO • • • •

Citología Estabilidad: calor, isopropanolol Metabisulfito Elución en columna: Elución de la fracción EF » »

Microcolumna de celulosa Densitometria

• Electroforesis: ácida » »

alcalina IEF

LABORATORIO  Electroforesis de zona.  Soporte y anortiguador Celulosa, agar, poliacrilamida  Tinción

 Proteinas con diferente carga eléctrica  COO NH3+

Si predominan radicales – se desplaza al ánodo Si predominan radicales + se desplaza al cátodo Tiempo e intensidad de la carga eléctrica

LABORATORIO • Electroforesis: alcalina 8.6 – Acetato de celulosa en medio alcalino • A, F, S (D G O), A2 (C E)

• Electroforesis: ácida 6 – Agar, interacción con Hb • F, A (muchas), S, C

• IEF – Desplazamiento hasta su punto isoelectrico

LABORATORIO

LABORATORIO

LABORATORIO • • • •

HPLC Electroforesis capilar Síntesis de las cadenas de Hb Diagnostico molecular

LABORATORIO • HPLC • Columna de intercambio catiónico con gradiente de incremento de fuerza íonica.

• Espectofotometro 415/690 • Cronograma: tiempo de retemción » Lectura fotocolorimetrica

LABORATORIO

LABORATORIO • Síntesis de las cadenas de Hb • • • • • •

Símtesis de cadenas de globina in vitro Reticulocitos Aminoácidos Isoleucina marcada isotopicamente EF y lectura Relación de alfa y beta

LABORATORIO • Diagnostico molecular • Analisis • Secuenciación

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS

Variantes estructurales Variantes por sustituci贸n de amino谩cidos.

Variantes de cadena corta.

Variantes de cadena larga.

Fusi贸n de genes de globinas

Variantes que afectan a la tasa de s铆ntesis de las globinas

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 1. Variantes estructurales • Variantes por sustitución de aminoácidos.

La mutación productora es una sustitución de un nucleótido de un triplete por otro nucleótido distinto. Es el grupo más numeroso (>600 variantes). Ej.: HbS (Anemia falciforme), HbC, etc. Solo detectables si cambia la carga neta de la proteína (electroforesis) o si se producen anomalías funcionales patentes (hemoglobinopatías).

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 1. Variantes estructurales Variantes de cadena corta.

Mutaciones productoras: a. Sustitución de un nucleotido, produciéndose un triplete de terminación. Ej.: Hb McKees Rock (cadena beta. Triplete de terminación en posición 145, UAU (Tyr) ----> UAA (Stop) b. Sobrecruzamiento intragénico desigual: Se eliminan nucleótidos (múltiplos de 3) y en consecuencia desaparecen aminoácidos en la globina correspondiente. Ej.: Hb Gun Hill (deleción de los tripletes 91 al 95 de la cadena beta).

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 1. Variantes estructurales Variantes de cadena larga.

Mutaciones productoras: a. Sobrecruzamiento intragénico desigual: se duplican nucleótidos (múltiplos de 3) y en consecuencia aumenta el número de aminoácidos. Ej.: Hb Grady (cadena alfa.

Tripletes 116-118 duplicados).

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 1. Variantes estructurales Variantes de cadena larga.

Mutaciones productoras: b. Sobrecruzamiento intragénico desigual: Duplicación/deleción de nucleótidos NO MULTIPLOS DE 3.

Cambia la pauta de lectura. Ej.: Hb. Cranston (cadena beta duplicación de la 2ª y 3ª base del triplete 144. El triplete de terminación no se reconoce, continuando la transcripción y traducción hasta que se encuentre un triplete de terminación. La cadena beta alcanza 157 aminoácidos).

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 1. Variantes estructurales Variantes de cadena larga.

Mutaciones productoras: c. Sustitución de un nucleótido del triplete de terminación. Ej.: Hb Constant Spring (Cadena alfa. Se añaden 31 aminoácidos más – 172 en total).

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 1. Variantes estructurales Fusi贸n de genes de globinas.

Mutaci贸n productora: Sobrecruzamiento desigual entre genes de diferentes globinas Hb. Lepore (delta/beta) Hb. Antilepore (beta/delta)

Fusión de Genes de Globinas

δ X

β

δ

β/δ

Hb Anti-Lepore

δ/β δ

β

β

Hb Lepore

HEMOGLOBINA LEPORE  Alto recuento de eritrocitos  VCM disminuido  HCM disminuido  ADE normal  Dianocitos  Bandas: A/X/A2  Hb A2: normal o disminuida  Banda X: hasta 15%  Test de falciformación: Neg  Metabolismo del hierro normal

ANEMIA FALCIFORME  Herrick (1910). Individuo de color con forma inusual en sus eritrocitos: falciforme.  Taliaferro y Huck (1923). Morfología falciforme, Carácter hereditario  Beet y Neel (1949).

Homozigotos recesivos  Anemia falciforme Heterozigotos  Rasgo falciforme

ANEMIA FALCIFORME

 Ingram (1956). La diferencia entre la hemoglobina normal (Hb A) y la responsable de la anemia falciforme (HbS) estriba en un cambio de aminoácido en la cadena de la beta globina (aminoácido nº 6)

ANEMIA FALCIFORME

 Pauling y col. (1949). La forma de hoz depende del estado y naturaleza de la hemoglobina.  Comportamiento en microscopio de luz polarizada.  Distinto comportamiento la hemoglobina en electroforesis.

Anemia Falciforme Distribuci贸n en el Mundo

La mutaci贸n que conduce a la aparici贸n de la HbS ocurri贸 3 veces como m铆nimo en las poblaciones africanas.

LABORATORIO

ANEMIA FALCIFORME ERITROCITOS CON Hb S

Anemia Falciforme Cadena Beta

Mutaci贸n Normal

A. Falciforme

Ac Glut谩mico

Valina

GAA

GUA

GAG

GUG

Anemia Falciforme Problemas Asociados  Anemia  Modificaciones óseas  Cardiovasculares  Dolores Abdominales  Alteraciones de diferentes órganos (bazo, pulmones, riñones, ...)  Etc.

Anemia Falciforme Obturaci贸n de capilares

SÍNDROMES CON Hb S Criterios básicos para iniciar screening 

Noción de la frecuencia de las diferentes patologías para población en estudio



Procedencia geográfica del paciente y sus ancestros



Evitar estudiar a pacientes transfundidos



Estudiar simultáneamente: 

Paciente



Su familia



Un control normal

la

SÍNDROMES CON Hb S Pruebas de laboratorio: 

Hemograma completo con recuento de reticulocitos



Marcadores de hemólisis (LDH, Haptoglobina, Bt/Bd)



Electroforesis de Hemoglobinas a pH alcalino



Test de falciformación



Test de isopropanol



Cuantificación de hemoglobinas



Metabolismo del hierro



Estudio familiar



Estudios adicionales: 

Electroforesis a pH ácido

SÍNDROMES CON Hb S Laboratorio general: 

Reticulocitos aumentados: 8-10%



LDH aumentada



Haptoglobina: disminuída



Bilirrubina total aumentada a expensas de indirecta



Ferritina: normal o aumentada

SÍNDROMES CON Hb S Homocigota S/S

Anemia normo o macrocítica: 

Hb: 7-8g/dl



VCM: 85-95fl



CHCM: normal o aumentado



Anisopoiquilocitosis, hipocromía



Drepanocitos



Policromatofilia



Cuerpos de Howell-Jolly

 Eritroblastos circulantes

Variantes de Hbs con movilidad electroforética ≈ HbS Electroforesis a pH alcalino

Electroforesis a pH ácido

Sickling/ Isopropanol

Hb D–Los Angeles β 121 glu → gln

S

A

Neg/ Neg

Hb G-Philadelphia α 68 asn → lys

S

A

Neg/ Neg

Hb Hasharon α 47 asp → lys

S

S

Neg/ Pos

Ligeramente anódica a S

A

Neg/ Neg

Hb Lepore δβ fusión

SÍNDROMES CON Hb S Desórdenes con Hb S asintomáticos: 

Portador de Hb S (βA/ βS)



Doble heterocigota Hb S y PHHF (βS/ βPHHF)

Desórdenes con Hb S sintomáticos: 

Doble heterocigota Hb S y HB C (βS/ βC)



Doble heterocigota Hb S y δβ talasemia (βS/ βδβ)



Doble heterocigota Hb S y β+ talasemia (βS/ β+)



Homocigota Hb S (βS/ βS)



Doble heterocigota Hb S y β0talasemia (βS/ β0)



Doble heterocigota Hb S y Hb D PUNJAB (βS/ βD)



Doble heterocigota Hb S y Hb O ARAB (βS/ βO)

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 2. Variantes tasa de síntesis

TALASEMIAS Variantes patológicas de hemoglobinas caracterizadas porque la síntesis de globinas alfa o las beta se reduce en mayor o menor medida.

TALASEMIAS 2. Variantes tasa de síntesis Tipos de Talasemias: 1.- Beta-Talasemias: Síntesis reducida de globinas beta.

• Muy frecuentes en poblaciones del área mediterránea.

• Origen: mayoritariamente por mutaciones puntuales (sustitución de nucleótidos, deleción de 1 ó 2 nucleótidos, ...), aunque la tercera parte de las betatalasemias que se encuentran en el sureste asiático se deben a una deleción grande (619 bp) que se extiende desde el intrón 2 hasta más allá de la región 3' del gen beta.

BETA TALASEMIAS 2. Variantes tasa de síntesis •Dos grandes tipos clínicos Beta Talasemias: • Beta-talasemia mayor (major).

• Beta-talasemia menor (minor).

• [ B-Talasemia Intermedia ] •Correspondencia genética de las entidades clínicas: • B-Talasemia mayor: Los dos cromosomas 11 tienen el gen de la beta globina con mutación. Homocigóticos o heterocigóticos compuestos.

• B-Talasemia menor: Solo 1 cromosoma 11 contiene el gen de la beta globina con mutación.

BETA TALASEMIAS 2. Variantes tasa de síntesis • Tipos de cromosomas 11 con mutaciones que producen beta-talasemia: • Beta +: La mutación no impide que el gen sintetice algo de globinas beta.

• Beta 0: La mutación impide totalmente la síntesis de globinas beta, bien porque no se produce RNAm o bien porque se produzca pero no sea traducible.

BETA TALASEMIAS

* β+

βο

βο

βο

βο

β

ο

βο

β+

* Muy frecuente en el área mediterránea Beta 0  alelo nulo o amorfo Beta +  alelo hipomorfo

Mange y Mange.- Genetics. Human Aspects

ALFA TALASEMIAS

Frecuente en Asia

Frecuente en África y región mediterránea

Vogel & Motulsky.- Human genetics. Problems & approaches

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 2. Variantes tasa de síntesis Entidades clínicas Alfa Talasemias:

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 2. Variantes tasa de síntesis 2.- Alfa-Talasemias: Síntesis reducida de globinas alfa.

•

Muy frecuentes en el Sureste de Asia.

•

Origen: Mayoritariamente por grandes dilecciones.

Pueden desaparecer 1, 2, 3 ó los 4 genes de las alfa globinas.

VARIANTES DE HEMOGLOBINAS 2. Variantes tasa de síntesis Tipos de cromosomas 16 con mutaciones que producen alfa-talasemia: •

Alfa +: Se sintetiza algo de globinas alfa.

Normalmente, deleción de uno de los dos genes alfa.

•

Alfa 0: No se sintetizan globinas alfa. Normalmente, deleción de los dos genes alfa

Thalassemia minor

Thalassemia major

SÍNDROMES CON Hb S Cuantificación de Hemoglobinas: Heterocigota S/B 

Cuantificación de Hb A2: 2.5 - 3.5%



Cuantificación de Hb F: <1%



Cuantificación de Hb S: 35 - 45%

SĂ?NDROMES CON Hb S Electroforesis de hemoglobina en acetato de celulosa, pH alcalino

SĂ?NDROMES CON Hb S Electroforesis de hemoglobina en gel de agar, pH alcalino

Hb A Hb F Hb S/D/G

LABORATORIO Electroforesis de hemoglobina en gel de agar, pH รกcido

F

A S C A2 D G Lepore

TEST DE FALCIFORMACIÓN

Paciente

LABORATORIO Electroforesis de hemoglobina en acetato de celulosa, pH alcalino

SÍNDROMES CON Hb S Test de falciformación

SÍNDROMES CON Hb S Doble heterocigota S/β Anemia microcítica hipocrómica: 

Hb: 8 -10g/dl



VCM: 65 -75fl



HCM: disminuído



Anisopoiquilocitosis



Drepanocitos



Policromatofilia



Dianocitos



Cuerpos de Howell-Jolly



Eritroblastos circulantes

SÍNDROMES CON Hb S Cuantificación de Hemoglobinas: 

Cuantificación de Hb A2: normal



Cuantificación de Hb F: aumentada en forma variable



Cuantificación de Hb S: mayor al 80%

SÍNDROMES CON Hb S Estudio familiar  Anemia microcítica hipocrómica:  Alto recuento de eritrocitos  VCM disminuído(<78 fl)  HCM disminuido(<27pg)  ADE normal  Dianocitos y punteado basófilo  Ẽ a pH alcalino: Bandas: A/A2  Hb A2: >3.5%  Metabolismo del hierro normal

SÍNDROMES CON Hb S Doble heterocigota S / C (Hb C

β 6glu → lys )

Anemia microcítica: 

VCM disminuído



CHCM aumentada



Dianocitos



Células densas



Drepanocitos



Policromatofilia

LABORATORIO Electroforesis de Hb en acetato de celulosa a pH 8,4:

SÍNDROMES CON Hb S Cuantificación de Hemoglobinas: 

Cuantificación de Hb A2 + HbC: 40-50%



Cuantificación de Hb F: aumentada en forma variable



Cuantificación de Hb S: 40-50%

LABORATORIO ESTUDIO FAMILIAR Electroforesis de Hb en acetato de celulosa a pH 8,4: