CITOMETRÍA DE FLUJO. Es una técnica de análisis celular multiparamétrico.
CARACTERISTICAS: Sencilla. Rápida. De gran especificidad. Lee varios parámetros en una célula. Interrelaciona parámetros de todas las células. De rutina e investigación.
APLICACIÓN. Para el estudio de hemopatías malignas: Diagnóstico. Clasificación. Evaluación pronóstica. Seguimiento. Recuento de progenitores hematopoyéticos para TMO.
¿QUÉ BUSCAMOS PARA ELLO? Poblaciones de células anormales por número, estadio madurativo, clonalidad o fenotipo aberrante. Son células que tienen alteraciones en:
LA MORFOLOGÍA: • en tamaño
EL INMUNOFENOTIPO: • inmunofenotipo aberrante.
• en granularidad
EL GENOTIPO: • en el contenido de ADN • en la expresión de genes
LA BIOQUÍMICA.
¿QUÉ TIPO DE CÉLULAS ESTUDIAMOS?
Células hematológicas, principalmente leucocitos. Células presentes en: médula ósea, sangre periférica y líquidos orgánicos (en estos su número y variedad es menor).
LEUCOCITOS. Función principal: defensa contra la infección. Granulocitos: Poseen gránulos en su citoplasma. Neutrófilos Eosinófilos Basófilos.
No granulocitos: Sin gránulos en su citoplasma. Monocitos: Linfocitos:
linfocitos B. linfocitos T. linfocitos NK.
¿Qué analizamos en esas células? La presencia o ausencia de antígenos: ANTÍGENOS (Ag): moléculas ajenas al organismo.
ANTICUERPOS (Ac): defensa contra los antígenos.
•Se les une un anticuerpo dirigido específicamente contra ellos.
•Capaz de unirse con el antígeno que lo causa.
En citometría son:
Nosotros usaremos:
CD (Cluster Differentiation antigen): Marcadores antigénicos de superficie.
AcMo (Anticuerpos monoclonales) conjugados con fluorocromos.
¿EN QUÉ CONSISTE LA CITOMETRÍA? En la medición de las propiedades fisicoquímicas de células marcadas, al interaccionar de una en una con una fuente de luz (láser).
NECESARIO.
Muestra adecuada y en suspensión. Marcadores. Citómetro de flujo.
MUESTRA. Muestra con células, vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célula única.
Tipos posibles de muestra: Sangre periférica. Médula ósea. Líquidos orgánicos: LCR. Tejidos sólidos (ganglios o MALT). Productos de aféresis.
MARCADORES FLUORESCENTES
Fluorescencia: emisión de E. en forma de luz por una sustancia, para retornar a su estado original tras ser excitada por una luz de E. mayor. Flurocromo: molécula química que emite fluorescencia. Marcador fluorescente: molécula fluorescente (fluorocromo) conjugada a un anticuerpo específico para una antígeno leucocitario (CD).
¿Qué marcadores utilizamos? FITC (isocianato de fluoresceína). PE (ficoeritrina). ECD (ficoeritrina-rojo Texas). PC5 (ficoeritrina-cianina 5). PC7 (ficoeritrina-cianina 7).
CITÓMETRO DE FLUJO. Partes: •SISTEMA FLUÍDICO: - Inyección de la muestra. - Cámara de flujo. •SISTEMA ÓPTICO: - Fuentes de luz. - Detectores •SISTEMA ELECTRÓNICO: - Amplificador y convertidor. - Sist. informático
CITOMETRO DE FLUJO. SISTEMA FLUÍDICO Consta de dos fluidos: • El que lleva en suspensión la muestra. • El que lo envuelve dando estabilidad.
Mediante el flujo laminar las células avanzan una a una, y en la cámara de flujo interaccionan con un haz de luz láser.
CITÓMETRO DE FLUJO. SISTEMA ÓPTICO Este sistema se compone de dos tipos de ópticas: Óptica de excitación: Láser. Lentes para enfocar y dirigir el haz de luz.
Óptica de lectura: Lentes de recolección de luz emitida por la interacción entre la luz láser y las partículas. Sistema de espejos y filtros: para dirigir los haces de longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.
CITOMETRO DE FLUJO. SISTEMA ELECTRÓNICO Convierte la señal luminosa en impulsos eléctricos que se traducen en imágenes.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA. PROCESO. 1º. Muestra con células, vivas o fijadas, en suspensión celular. 2º. Se ponen en contacto con los anticuerpos monoclonales marcados con los fluorocromos que nos interesan. 3º. Se pasan las células en suspensión y de una en una por delante de un haz de láser. 4º. La célula dispersa el rayo de luz y emite fluorescencia. 5º. Estas señales son recogidas por detectores. 6º. La información de los detectores pasa a un ordenador que la procesa.
¿QUÉ PARÁMETROS MEDIMOS?:
Características morfológicas. Tamaño. Complejidad: depende de la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula. Características antigénicas. Inmunofenotipo: presencia o ausencia de determinados antígenos.
¿CÓMO LOS OBTENEMOS? Mediante la luz que proyectamos y la respuesta de la célula.
Vemos así: Cómo se dispersa la luz en dirección: Frontal: (FSC) proporcional al tamaño celular. Ortogonal: (SSC) proporcional a la cantidad de estructuras granulares o complejidad de la célula. Gracias a ambos parámetros, podemos identificar claramente los grupos de células. La intensidad de fluorescencia: cuatro o cinco parámetros según los equipos.
LECTURA DE LA MUESTRA.
Su resultado es una cuantificación de las células adquiridas en regiones predeterminadas. Se utilizan tres datos: Número total de eventos. Número total de leucocitos (CD45+). Número total de células adquiridas dentro de las regiones seleccionadas.
¿EN QUÉ CONSISTE LA CITOMETRÍA ?
Con los resultados podemos: definir las células afectadas, la línea celular hacer una correcta clasificación de la neoplasia según los anticuerpos monoclonales o ver estudios posteriores. ver la evolución de la enfermedad ver la eficacia el tratamiento de cara a cambios en este o un posible transplante.
EN CUENTA. Inconvenientes Se pierde la información sobre la arquitectura de los tejidos. Ventajas: Analizar un elevado número de partículas en un corto período de tiempo (500 partículas/segundo). Empleo de múltiples marcajes. Cuantificar la intensidad antigénica. Mayor sensibilidad y objetividad que permiten detectar enfermedad residual mínima y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales Analizar poblaciones celulares y epítopos celulares. Almacenar informáticamente la información del análisis para poderla utilizar en cualquier momento y reanalizarla.
RESUMEN Técnica multiparamétrica para analizar células. Sencilla. Rápida. Gran especificidad. Informa de varios parámetros Muy usada. Función: el estudio de hemopatías malignas en su: Diagnóstico. Clasificación. Tratamiento. Pronóstico. Necesario: muestra celular adecuada tecnología: citómetro y fluorescencia personal formado tiempo otras pruebas posibles estudios posteriores
RESUMEN
Información sobre: Estadio de maduración hematopoyética precursores hematopoyéticos CD34 + Implicación en la respuesta inmunitaria Grado de activación celular Diagnóstico y clasificación de la enfermedad hematológica. Leucemias agudas. Síndromes linfoproliferativos. Síndromes mielodisplásicos. Mielomas. Hemoglobinuria paroxística nocturna Detección de enfermedad mínima residual