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Farmacología y Farmacovigilancia Molecular

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PÁG. 1 GENERANDO COMPETENCIAS

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INDICE Introducción CAPITULO I MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES POR RECEPTORES DE MEMBRANA             

Comunicación celular Tipos de receptores.

Tiempo de respuesta de receptores.

Receptores ionotrópicos Receptores ligados a proteínas g Receptores con actividad enzimática intrínseca.

Receptores asociados a proteína Receptores de la familia tnf/ngf Regulación de receptores de membrana Receptores con actividad enzimática intrínseca.

Receptores asociados a proteína Receptores de la familia tnf/ngf Regulación de receptores de membrana

CAPITULO II MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN CELULAR IMPLICACIONES FISIOPATOLÓGICAS          

Redes de señalización celular Tipos de receptores Sistemas de transmisión de señales en el interior de la célula Papel fundamental de las proteínas g como interruptores moleculares Quinasas y fosfatasas Factores de transcripción El diseño modular permite ensamblar Complejos de proteínas señalizadoras Mecanismos de regulación y desensibilización: el ejemplo de las quinasas de receptores acoplados a proteínas g Interconexión de redes de señalización

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Importancia fisiopatológica y farmacológica de los sistemas de señalización celular Vías de señalización relacionadas con oncogénesis Patologías cardiovasculares Dianas de fármacos Retos futuros

BIBLIOGRAFIAS CUESTIONARIO

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INTRODUCCIÓN

La Farmacovigilancia nos permite un conocimiento más acabado de los riesgos y beneficios de la terapéutica con fármacos lo que sin duda se trasladará en una atención más efectiva de los pacientes.

En este capítulo hablaremos de la transducción de señal donde se conocerá como ocurre cuando una molécula de señalización extracelular activa un receptor de superficie de la célula. A su vez, este receptor altera moléculas intracelulares creando una respuesta.

El Diplomado en Farmacología es un programa de estudio ofrecido por la asociación de capacitación integral en salud y el convenio con la universidad peruana los andes, destinado a profesionales del área de la salud.

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CAPITULO I MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES POR RECEPTORES DE MEMBRANA 1.1.

COMUNICACIÓN CELULAR

El primer punto importante cuando se aborda el estudio de la transducción señales es la comunicación celular, la cual es necesaria para regular y coordinar las distintas funciones fisiológicas. Las células se comunican por sustancias químicas llamadas mensajeros primarios, los cuales, de forma general, pueden agruparse en cuatro tipos principales: - Neurotransmisores.- Moléculas de señalización utilizadas por el Sistema Nervioso para comunicar entre si sus distintas estructuras o comunicarse con los órganos periféricos.

- Hormonas.- Moléculas de señalización, formadas por las glándulas endocrinas que regulan la casi totalidad de las funciones fisiológicas ejercidas por los distintos órganos.

- Factores de Crecimiento.- Moléculas de señalización por lo general asociadas al control de la proliferación, diferenciación y la muerte celular.

- Citoquinas.- Moléculas de señalización implicadas en el control de la inmunidad del organismo frente a agentes extraños (virus, bacterias, parásitos) o propios (cáncer). Esta agrupación de señales por tipos tiene más un valor formativo que real, ya que las funciones fisiológicas humanas normalmente implican a distintas señales englobadas en los apartados anteriores. Un ejemplo ilustrativo lo constituye el ciclo ovulatorio. En la pubertad, el sistema nervioso central recoge informaciones del organismo, transmitidas por descargas hormonales, de factores de crecimiento y citoquinas, que quedan recogidas por el “Gonadostato”, estructura implicada en la regulación del comienzo y posterior continuidad del ciclo ovárico. El acumulo de información en el gonadostato, en un momento dado del desarrollo, es tal que provoca la activación de determinadas vías de neurotransmisión que confluyen en el Hipotálamo y activan la síntesis y secreción de factores estimulantes del ciclo (entre ellos, LHRH, Hormona Liberadora de LH). Estas sustancias llegan a la Hipófisis, donde activan la secreción de hormonas tales como LH (Hormona Luteinizante) y FSH (Hormona Estimulante de Folículos). Las hormonas hipofisarias estimularán en el ovario la maduración de ciertos folículos, lo cual MODULO III

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implica la síntesis de estrógenos y progestágenos, de factores de crecimiento y ciertas citoquinas. Estas sustancias ejercen dos efectos fundamentales. Por un lado, provocan la maduración de un único folículo y la atresia del resto (procesos de proliferación, diferenciación y muerte), así como la proliferación del endometrio para hacerle receptivo al ovocito, en caso de fecundación, y, por otro, envían señales a las estructuras anteriores (SNC, hipotálamo e hipófisis), las cuales son integradas en su conjunto, regulando la secreción de las señales implicadas con el fin de asegurarse la culminación perfecta del ciclo ovárico. Si no hay fecundación, la suma de concentraciones de neurotransmisores, hormonas, factores de crecimiento y citoquinas, disparan otra serie de procesos como la involución del endometrio (apoptosis) y el comienzo de un nuevo ciclo ovárico.

Los límites que definen a los distintos tipos de señales a veces no están demasiado claros, ya que se conocen ejemplos de sustancias neurotransmisoras que pueden actuar como hormonas (dependiendo de la concentración y de la célula diana). De igual forma, algunas hormonas en ocasiones se comportan como factores de crecimiento.

1.1.1. Tipos de Comunicación Intercelular.

Tradicionalmente, basándose en la distancia que ha de recorrer el mensajero primario para ejercer su efecto en la célula diana, se han distinguido tres tipos generales de comunicación: - Señalización endocrina.- Las señales (usualmente hormonas) deben de recorrer distancias considerables (hasta más de 1 m) para actuar sobre la célula diana y normalmente son transportadas por la sangre. Dada la dilución que sufre la hormona en el sistema sanguíneo necesita que las moléculas receptoras presenten una elevada afinidad por estas.

- Señalización paracrina.- Las señales liberadas por una célula afectan a células en su proximidad (menos de 1 μm). La conducción de un impulso eléctrico desde una neurona a otra neurona o a una célula muscular es un ejemplo de señalización paracrina. Dada la elevada concentración de neurotransmisor que se consigue en este tipo de señalización, la afinidad de las moléculas receptoras no necesita ser muy elevada.

- Señalización autocrina.- En este caso, la célula responde a sustancias liberadas por ella misma. La mayoría de los factores de crecimiento actúan de esta forma o de forma paracrina, para estimular el crecimiento y la proliferación celular. Las células tumorales en muchos casos producen factores de crecimiento que, de forma descontrolada, promueven el crecimiento de la masa tumoral.

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Además de estos tipos generales de comunicación, las células pueden recibir señales del medio extracelular por dos tipos más de mecanismos: - Señalización Yuxtacrina o comunicación Célula- Célula. Son mecanismos bastante importantes de comunicación. En general, están mediados por proteínas de membrana plasmática de una célula que son reconocidas por proteínas receptoras de otra célula. La interacción de la proteína ligando con la proteína receptora dispara ciertas vías de señalización en la célula diana.

Ejemplos de este mecanismo se dan en células del sistema inmune (adhesión de leucocitos, reconocimiento por células T citotóxicas de células infectadas, etc.). Otro mecanismo importante de resaltar en la comunicación intercelular es la existencia de “Gap Junctions” entre células vecinas. La estructura Gap Junction comunica los citoplasmas de células vecinas, mediante el establecimiento de “poros”, permitiendo el intercambio de metabolitos de pequeño peso molecular (usualmente no mayores de 1kd), incluyendo a la mayoría de segundos mensajeros.

- Comunicación Célula-Matriz Extracelular. Son mecanismos de comunicación que permiten la adhesión de las células a las proteínas extracelulares de la matriz extracelular (fibronectina, laminina, colágenos, etc.). Es un mecanismo crucial para el modelado (desarrollo) o remodelado (tras algún tipo de lesión) de los órganos.

Finalmente, en los últimos años, se han puesto de manifiesto diversos ejemplos de señalización que se engloban dentro del término de Señalización Intracrina.

En este caso, un metabolito originado en la célula puede disparar vías de señalización en la propia célula sin necesidad de salir al exterior. Un ejemplo válido lo constituye la regulación de la biosíntesis del colesterol. Cuando las concentraciones de colesterol endógenas son muy elevadas, esta molécula es capaz de activar un represor transcripcional que inhibe la transcripción de los genes implicados en la biosíntesis de novo del colesterol.

1.2.

TIPOS DE RECEPTORES.

Para que una molécula señal sea reconocida por la célula diana se necesita de la presencia de una molécula receptora que pueda modificar su actividad biológica al interaccionar con la señal. Las moléculas receptoras o Receptores se clasifican en dos tipos principales, dependiendo de la naturaleza química del ligando o señal. Así, si la señal o Ligando es de naturaleza liposoluble podrá atravesar la membrana plasmática sin mucha dificultad e interaccionar con sus receptores intracelulares. La interacción posibilita la activación del receptor y la posterior regulación de la expresión génica de un grupo determinado de genes.

A estos receptores se les denomina MODULO III

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Receptores Nucleares o Receptores Intracelulares. Por el contrario, si la señal es de naturaleza hidrosoluble, dado que no podrá atravesar la membrana plasmática, necesita de la existencia de receptores asociados a la membrana plasmática. La activación del receptor por el ligando promueve, en la mayoría de los casos, la formación de moléculas transductoras de la señal que reciben el nombre de Segundos Mensajeros. Estas moléculas son las responsables de activar los procesos biológicos en las células diana mediante la activación de rutas de transducción específicas que, en último término, también modificaran la expresión de grupos de genes. A este tipo de receptores se les denomina Receptores de Membrana Plasmática, siendo objeto de este tema su estudio así como las rutas de transducción generadas por ellos. Los receptores de membrana se han agrupado en cuatro tipos generales (Figura 1.1): - Receptores Ionotrópicos.- La unión del ligando cambia la conformación del receptor de modo que permite el flujo de un determinado ion a través del receptor. El movimiento iónico resultante altera el potencial eléctrico de la membrana celular. Un ejemplo lo constituye el receptor de acetilcolina en la placa motora.

- Receptores metabotrópicos.- También conocidos como receptores asociados a proteínas G o receptores Serpentínicos. Estos receptores están asociados a proteínas G. La unión del ligando activa a una proteína G, la cual a su vez activa o inhibe a una determinada enzima que genera un segundo mensajero, o bien modula la actividad de un canal iónico, causando un cambio en el potencial de membrana. Ejemplos de señales que actúan a través de este tipo de receptores son epinefrina, serotonina y glucagón.

Figura 1.1. Tipos de receptores en la señalización celular

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- Receptores con actividad enzimática intrínseca.- Como su nombre indica, la activación del receptor por el ligando propicia que el receptor muestre una actividad enzimática. Este grupo engloba a receptores con distintas actividades enzimáticas. Así por ejemplo, el factor natriurético atrial al interaccionar con su receptor activa su actividad guanilato ciclasa, la activación del receptor de leucocitos CD45 activa su actividad tirosina fosfatasa, la activación de los receptores de insulina y de muchos factores de crecimiento que provoca la aparición de actividades tirosina quinasa (insulina, factor de crecimiento epidérmico) o serina/treonina quinasa (factor de crecimiento transformante tipo ß).

- Receptores asociados a tirosin-quinasas citosólicas.- También conocidos como superfamilia de receptores de citoquinas. Estos receptores carecen de actividad catalítica pero se asocian directamente, tras su activación, con proteínas citosólicas que tienen actividad tirosina quinasa. Ejemplos de señales que interaccionan con este tipo de receptores son prolactina y hormona del crecimiento (hormonas), la mayoría de citoquinas e interferones y ciertos factores de crecimiento (eritropoyetina).

1.3 TIEMPO DE RESPUESTA DE RECEPTORES. Una característica que conviene destacar en este punto es la rapidez o lentitud de los distintos receptores en generar una respuesta biológica precisa. Los receptores ionotrópicos se activan por ligando permitiendo el flujo de iones a favor de un gradiente de concentración. Esta respuesta que provoca cambios en el potencial de membrana puede observarse en ms después de la activación del receptor. Por otra parte, algunos segundos mensajeros, generados por receptores metabotrópicos, pueden modular canales iónicos. Dado que se requieren varios eventos (activación del receptor, interacción con proteínas G del receptor para su activación e interacción de la proteína G con el canal que va a modular) el cambio en potencial de membrana tarda más tiempo en producirse, por lo general varios segundos. La mayoría de receptores metabotrópicos y con actividad enzimática intrínseca a través de sus rutas de transducción modulan positiva o negativamente las actividades de enzimas citosólicas, pudiéndose observar dichas modulaciones tras varios minutos (entre 2 y 15) de la adición del factor. Finalmente, las rutas de transducción de la mayoría de los receptores (sean de membrana o intracelulares) modifican la actividad transcripcional de proteínas nucleares implicadas en la síntesis de ARNm específicos, en el primer caso de una forma indirecta y en el segundo de una forma directa.. En estos casos la cadena de eventos es aún mayor por lo que los efectos biológicos tardan en observarse varias horas.

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Figura 1.2. Esquema de receptor ionotrópico.

1.4.

RECEPTORES IONOTRÓPICOS

Como se han definido anteriormente, la unión del ligando al receptor (canal) origina un cambio en la estructura de este que permite el flujo a favor de gradiente de iones específicos. La estructura prototipo de los receptores ionotrópicos queda esquematizada en la figura 2.1. Estos receptores están formados por cinco subunidades proteicas que se disponen integradas en la membrana plasmática formando una estructura de anillo, quedando situado el “poro” iónico en el centro de dicha estructura.

Además del sitio de unión con el ligando, estos receptores, suelen presentar dominios de regulación de la actividad del canal. Dichos dominios pueden presentarse orientados al exterior celular o al interior citosólico. Los primeros suelen ser regulados por otras señales químicas que modifican la estructura del canal regulando el flujo iónico. Los segundos, si bien presentan la misma función de regulación, normalmente, reflejan cambios en el estado de fosforilación del canal, lo cual depende del estado de funcionamiento de otras rutas de señalización. Por lo tanto, podemos distinguir dos etapas de señalización: la primera donde la unión del neurotransmisor provoca la apertura del canal y la segunda donde la acción de otras señales (otros neurotransmisores o rutas de señalización disparadas por hormonas) modula el flujo iónico a través de dicho canal, siendo un control mucho más fino de modulación.

Es conveniente distinguir en este punto la existencia de dos tipos generales de canales iónicos: operados por ligando (el caso que nos ocupa) y operados por voltaje. Estos últimos, a diferencia de los primeros, no necesitan de la unión de un ligando para activarse sino que responden a cambios del potencial MODULO III

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de membrana de la célula. Ejemplos de este tipo de canales lo constituyen los canales para Na+ y K+, presentes en los axones de las neuronas y que están implicados en la transmisión del impulso nervioso, o canales de Ca2+ implicados fundamentalmente en procesos de exocitosis. El hecho de que estos canales no necesiten de ligando para su activación no implica que no puedan ser modulados por mecanismos similares a los descritos para los receptores ionotrópicos.

Figura 1.3. Esquema de receptor acoplado a proteínas G.

1.5. RESEPTORES LIGADOS A PROTEINAS G Muchos receptores en su ruta de transducción activan a proteínas transductoras denominadas proteínas G, las cuales a su vez modulan positiva o negativamente la actividad de enzimas capaces de originar segundos mensajeros. Si bien estos receptores unen diferentes hormonas y median diferentes respuestas celulares, tienen una serie de características estructurales y funcionales comunes: a- La secuencia aminoacídica del receptor contiene siete segmentos en ahélice formados por 22-24 residuos hidrofóbicos que están integrados en la membrana plasmática (figura 3). b- El lazo de residuos aminoacídicos entre las a-hélices 5 y 6 y el extremo Cterminal del receptor, ambos en la parte citosólica del mismo, son importantes para las interacciones con las proteínas G. c- La proteína G transductora asociada con el receptor funciona como un interruptor molecular, presentando su estado inactivo cuando se encuentra unida a GDP. La unión del ligando al receptor causa la liberación del GDP de la proteína G y su intercambio por GTP, presentando ahora su estado activo.

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d- La proteína G activada (unida a GTP) interacciona y modula (activa o inhibe) a una enzima efectora, la cual cataliza la formación de un segundo mensajero, o bien modula la actividad de canales iónicos. e- La hidrólisis del GTP unido a la proteína G revierte a la proteína G a su estado inactivo. Se han caracterizado distintos tipos de enzimas efectoras capaces de ser activadas por proteínas G (figura 1.4): - Adenilato Ciclasa (AC).- enzima generadora de AMPciclico (AMPc), el cual es capaz de activar a la proteína quinasa A (PKA) en su ruta de transducción.

- Fosfolipasa C (PLC).- enzima generadora de Inositol trifosfato (IP3) y Diacilglicerol (DAG), los cuales son capaces de activar, respectivamente, a las proteína quinasa Ca-calmodulina (PK Ca-CaM) y a la proteína quinasa C (PKC) en su ruta de transducción.

- Fosfolipasa A2 (PLA2).- enzima generadora de Acido araquidónico (AA), el cual es capaz de activar a la proteína quinasa C (PKC) en su ruta de transducción.

Por otra parte, con respecto a la modulación de canales iónicos se ha visto que median la apertura de canales de K+ y de Ca2+.

Figura 1.4 Activación de diversos efectores por proteínas G.

1.5.1. Proteínas G Como hemos dicho anteriormente, las proteínas G actúan como transductores de la información generada en la unión del ligando al receptor y son capaces, dependiendo del tipo celular y del receptor específico) de poder modular la actividad de proteínas efectoras o canales iónicos. Las proteínas G reciben MODULO III

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este nombre por su capacidad de intercambiar los nucleótidos GTP/GDP, modulándose así su actividad biológica. Estas proteínas forman una superfamilia en la que se pueden distinguir dos familias a su vez: la familia de las proteínas G heterotrímericas y la familia de proteínas G pequeñas, cuyo nombre hace alusión a su bajo peso molecular comparado con el de las anteriores. En este punto nos referiremos a las proteínas G heterotrímericas ya que son las que tienen capacidad de interaccionar con receptores activados.

Las proteínas G pequeñas también pueden estar implicadas en rutas de transducción de señales, como es el caso de p21-RAS que estudiaremos más adelante. Otros ejemplos de proteínas G pequeñas lo constituyen G-Tu (factor de elongación en la síntesis de proteínas, o rab-3, proteína implicada en los procesos de exocitosis.

Las proteínas G heterotrímericas, están formadas por las subunidades a, b y g.

Si bien en los últimos años se ha descrito la implicación de las subunidades b y g en la transducción de algunas señales, la mayoría de la acciones descritas implican a la subunidad a. En el caso de las proteínas G heterotrímericas, la capacidad de interacción con los nucleótidos GTP o GDP reside en la subunidad a, presentando para ello un dominio de interacción con nucleótidos, que presenta también una actividad enzimática GTPasa; es decir, la subunidad a es capaz de forma intrínseca de hidrolizar el GTP a GDP, función esencial en el control de las rutas de transducción donde está implicada. Aparte del dominio de interacción con el GTP, pueden distinguirse otros tres dominios: el dominio de interacción con las subunidades b y g, situado en el extremo Nterminal, el dominio de interacción con la enzima efectora o el canal, y el dominio de interacción con el complejo receptor-ligando, en su extremo Cterminal (Figura 1.5).

La clasificación de las proteínas G heterotrímericas se hace en función del tipo de subunidad a que presenten, ya que se conocen diversos tipos de subunidades a. Se considera que proceden de un gen ancestral común y, si

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bien presentan una elevada homología de secuencia, existen pequeñas diferencias que son las que originan su especificidad. Así, por ejemplo, las subunidades a de tipo ai y ao presentan deleciones en el extremo N-terminal, lo cual origina variaciones en la interacción con las subunidades b y g. Las subunidades b y g (tienen fundamentalmente la función de anclaje a la membrana y son de menor peso molecular, 36 y 10 kd, respectivamente. Como se ha mencionado anteriormente, existen muchas clases de proteínas G, pudiendo mediar efectos de señalización de algunos neurotransmisores (acetilcolina, norepinefrina, etc.), hormonas (glucagón, adrenalina, TSH, etc.) y ciertas citoquinas; en concreto, las quimoquinas, que son citoquinas implicadas en la atracción de células del sistema inmune al foco infeccioso, siendo un ejemplo la Interleuquina 8. Además de la transducción estas señales, las proteínas G están implicadas en la transducción de señales sensitivas, como lo constituyen los casos de transmisión de impulsos visuales (at), olfatorios (aollf) o del gusto (ag).

En la actualidad, las distintas proteínas G se han agrupado en cuatro familias que se nombran con un subíndice que indica la primera función por la que se caracterizaron. Estudios posteriores han probado que pueden realizar más de una función, dependiendo del tipo celular donde se expresen. Estas subfamilias son: Gs (estimula adenilato ciclasa), Gi (inhibe adenilato ciclasa), Gq (estimula PLC) y G12, de función desconocida. Por otra parte, muchas de las subunidades a pueden ser modificadas covalentemente y de forma irreversible por toxinas bacterianas, lo cual afecta a la actividad de dichas subunidades.

Concretamente, la toxina colérica causa la ADP-ribosilación de un resto de Arg del dominio de interacción con el GTP, lo que hace que la subunidad alterada pierda la capacidad de hidrolizar el GTP y, por lo tanto, que la subunidad as se encuentre siempre en estado activo (fig. 1.5). Una consecuencia de la activación irreversible son las diarreas típicas en personas infectadas de cólera.

La toxina pertussis también produce la ADP-ribosilación de subunidades a (ai y ao), siendo en este caso la modificación en un residuo de Cys, en el dominio Cterminal o de interacción con el receptor. En este caso, la modificación produce la falta de interacción entre el receptor y la proteína efectora y la ausencia de señalización por esta vía. Esto influye en la sensibilidad a la histamina y en la bajada de las concentraciones de glucosa que se producen en la tosferina.

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Figura 1.6. Activación de proteínas G heterotriméricas.

La tabla 1.1 resume las principales familias de proteínas G, destacando sus efectos, su posibilidad de ADP-ribosilación, su distribución por tejidos y algunos ejemplos de señales implicadas.

1.5.2. Mecanismos de Activación de Proteínas G. Las proteínas G heterotrímericas, en su estado inactivo, presentan GDP unido a la el complejo interacciona con la proteína G, lo que permite el intercambio de GDP por GTP. Esta activación provoca además la disociación de la subunidad a de las subunidades b y g La subunidad a-GTP está preparada para actuar sobre el efector y modular su actividad. Dado que la subunidad a presenta una actividad GTPasa intrínseca, la hidrólisis posterior del GTP a GDP posibilita la reasociación de las subunidades a, b y g, con lo cual obtenemos la configuración de partida (Fig. 1.6).

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1.5.3. Ruta de transducción del AMPc. El objetivo de este apartado es resaltar algunas de las características más sobresalientes de las proteínas implicadas en esta ruta de transducción; así como poner de relieve la importancia del fenómeno de amplificación de señal a través de sucesivas etapas. La adenilato ciclasa (AC) fue la primera enzima caracterizada capaz de ser activada por proteínas G. La AC cataliza el ciclamiento del ATP (substrato) para originar AMP cíclico (AMPc), que es la molécula con actividad de segundo mensajero. En la célula existen enzimas (fosfodiesterasas) capaces de catabolizar el AMPc, transformándolo en 5’AMP. Experimentos realizados midiendo las concentraciones de AMPc intracelulares tras la exposición de las células a una hormona, como glucagón o adrenalina, demuestran que se alcanza un pico de concentración a los 2 minutos, el cual desciende rápidamente de tal manera que a los 5-7 minutos las concentraciones han vuelto a sus valores basales. Este dato nos demuestra que para la transmisión de la señal no se necesita mantener elevadas las concentraciones por tiempos largos. La ventaja de este mecanismo radica en que la célula puede responder a un nuevo impulso hormonal en un periodo relativamente corto de tiempo y, por otra parte, puede integrar al mismo tiempo las señales recibidas por otras rutas de transducción, las cuales pueden ser de signo contrario.

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La AC presenta dos dominios hidrofóbicos por los cuales permanece anclada a la membrana citoplasmática, separados por un dominio citosólico que es donde radica su actividad enzimática. Finalmente existe un cuarto dominio citosólico que es donde reside la capacidad de interacción con las proteínas G específicas. En la actualidad, se han caracterizado distintas proteínas con actividad adenilato ciclasa pero que difieren en sus propiedades, ya que pueden ser reguladas por distintas proteínas G, presentar localizaciones tisulares diferentes, y pueden ser reguladas positivamente por Ca2+ o por subunidades b-g. Atendiendo a que puedan o no puedan ser activadas por el ion Ca2+ se clasifican como de Tipo I (ACI y ACIII) o de Tipo II (ACII y ACIV), respectivamente. A su vez, las AC de tipo I pueden ser reguladas o no de forma negativa por las subunidades b-g. Así , la AC1, que presenta este tipo de regulación negativa, se diferencia de la AC3, que no lo presenta. La potencia de inhibición de las subunidades b-g es unas 20 veces menor que la potencia de activación de la subunidad as. Si imaginamos un sistema ideal celular con un único tipo de receptor acoplado a proteínas G y con una actividad ACI; en este sistema, dado que la relación as/b-g es de 1, la célula, tras la activación del receptor activaría la AC1 sin el menor problema. Sin embargo, en los sistemas celulares reales, coexisten distintos tipos de proteínas G, algunas de las cuales (Gqo G12) si bien no interaccionan de forma directa a través de su subunidades a con AC1 si pueden incrementar las concentraciones de las subunidades b-g intracelu-lares, pudiendo llegar a compensar por este aumento de concentración su menor potencia para la inhibición.

Figura 1.7. Modelo de disociación parcial.

Enlazando con lo anterior, es conocido que los receptores que activan a proteínas Gi son capaces de inhibir la actividad AC. Sin embargo, no se ha podido demostrar la asociación directa AC-subunidad ai, por lo cual se ha postulado que este tipo de proteínas G actuaría inhibiendo a la AC mediante el aumento de las concentraciones de subunidades b-g, las cuales secuestrarían

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rápidamente a las subunidades as (Fig. 1.7). Finalmente, las AC de tipo II comparten dos características: la ya mencionada de no ser reguladas por calcio y la se ser positivamente moduladas por subunidades bg. Hay que destacar en este punto que si bien tradicionalmente (los últimos 15 años¡¡) se pensaba que las subunidades bg presentaban un único papel en el anclaje a la membrana, en los últimos años se están caracterizando diversos subtipos para ambas subunidades, lo cual puede afectar a las AC de diferentes maneras, todavía no identificadas.

El incremento en los niveles de AMPc, como consecuencia de la activación de AC, pone en marcha el siguiente paso en la transducción de señal, que consiste en la activación de la protein-quinasa A (PKA). La PKA consta de cuatro subunidades: dos reguladoras y dos catalíticas. En el proceso de activación se requiere la unión de dos moléculas de AMPc por molécula reguladora. Dicha unión desplaza el equilibrio de interacción entre ambos tipos de subunidades de tal forma que las subunidades catalíticas se liberan de las reguladoras y quedan activadas pudiendo realizar la fosforilación de proteínas específicas en residuos Ser o Tre, utilizando como cosusbtrato el ATP (fig. 1.8).

La identificación de proteínas substrato de la PKA ha permitido conocer que dichos substratos son proteínas modulables por fosforilación y que éstas presentan un amplio rango de actividades biológicas, ya que se han identificado proteínas del tipo de canales iónicos (proteínas de membranas), como canales de K+ que ven disminuida su actividad en la salida al exterior de dicho ion, enzimas citosólicas relacionadas con el metabolismo general (glucógeno fosforilasa, piruvato quinasa, etc) o factores transcripcionales nucleares, como es el caso de la proteína CREB (proteína de unión al elemento de respuesta activado por AMPc), la cual puede modificar la expresión génica de determinados genes.

Dado que existe una enzima específica (fosfodiesterasa), capaz de inactivar al AMPc, a medida que las concentraciones de AMPc vayan disminuyendo, las subunidades reguladoras de la PKA dejaran de interaccionar con el segundo mensajero y empezaran a desplazar el equilibrio hacia la forma inactiva. Si midiéramos las concentraciones de PKA activa en sistemas ideales (cultivo de células) observaríamos que la PKA empezaría a activarse a los 2 minutos, alcanzaría un pico máximo hacía los 5 minutos y prácticamente estaría en estado basal (no activo) a los 15 minutos. De igual forma existen enzimas fosfatasas específicas para las distintas proteínas substratos de la PKA (Serintreonin-fosfatasas). La medición de las formas activas de estas proteínas substratos en nuestro sistema ideal nos daría curvas de activación, similares pero retrasadas ligeramente en el tiempo. Así, considerando el caso del factor de transcripción CREB, veríamos una activación máxima a los 10-15 minutos (CREB-P) y su vuelta al estado basal (no fosforilado, CREB, y por lo tanto inactivo) aproximadamente a los 30 minutos.

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Figura 1.8. Activación de Proteína quinasa A y de sus dianas moleculares.

A la vista de los datos anteriores podrían plantearse algunas preguntas: ¿Cómo una ruta de señalización con un tiempo de actuación tan relativamente corto puede generar cambios tan profundos en las células? ¿Qué ventaja evolutiva supone tener vías de señalización de corta duración? La respuesta a la primera pregunta se centra en el fenómeno de amplificación en cascada, el cual lo explicaremos con el ejemplo de una ruta activada por AMPc, la hidrólisis del glucógeno hepático para producir glucosa plasmática. El organismo responde a la bajada de concentración de glucosa en plasma (tras un periodo de ayuno, por ejemplo) incrementando las concentraciones de glucagón, hormona del páncreas endocrino, sintetizada por las células a, que al interaccionar con su receptor en la célula hepática, pondrá en marcha la ruta de activación de la PKA. Esta enzima es capaz de fosforilar, y en consecuencia activar, a la enzima citosólica Fosforilasa b quinasa, la cual a su vez fosforila y activa a la Glucógeno fosforilasa b, enzima que actúa sobre el glucógeno realizando la hidrólisis de enlaces a 1-4 y rindiendo restos de glucosa 1-fosfato, la cual tras sucesivos pasos, se transforma en glucosa que podrá abandonar la célula hepática con el fin de mantener la homeostasis de glucosa en plasma. Si suponemos que la célula hepática presenta 10 receptores de glucagón en su superficie, lo cual es un número muy conservador (se conocen ejemplos de tipos celulares con 20.000 receptores/célula), y que en cada paso de la ruta cada enzima es capaz de activar 10 moléculas del paso siguiente por minuto (número todavía más conservador ya que la actividad enzimática para estas enzimas está en el rango de nmoles-μmoles/min, el resultado sería la liberación de 1millón de moléculas de glucosa por célula y por minuto!! Para contestar a la segunda pregunta, y utilizando el ejemplo del ayuno, el glucagón también induce, a través de CREB, la expresión del gen de la fosfoenol-piruvato carboxiquinasa (PEPCK), enzima de la ruta gluconeogénica implicada en la

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síntesis de glucosa a partir de substratos no glucídicos. Mientras el organismo siga en ayuno, el hígado podrá responder a las nuevas moléculas de glucagón que, por vía sanguínea, lleguen procedentes del páncreas. Si en un momento dado el organismo ingiere alimento rico en carbohidratos, el páncreas dejara de liberar glucagón y empezará a liberar insulina (hormona con efectos metabólicos opuestos que estudiaremos más adelante en este tema). En este caso, cuando las concentraciones crecientes de insulina lleguen al hígado, encontraremos una célula adaptada a un metabolismo de ayuno (por las anteriores señales de glucagón) que empieza a recibir señales contrarias.

En un tiempo de actuación similar al anterior la insulina revierte el metabolismo del glucógeno (inactivando a la glucógeno fosforilasa b y activando al mismo tiempo a la glucógeno sintasa, para completamente la transcripción del gen de la PEPCK (inhibe la funcionalidad de CREB), reduce la vida media de los RNAm de este gen y desestabiliza la proteína ya formada para que sea degradada rápidamente. Así, el organismo, en tiempos inferiores a 1 hora cambia su comportamiento metabólico con respecto a la glucosa. Otro ejemplo de adaptación todavía más corto en el tiempo lo constituye la preparación a una situación de peligro para el organismo (descarga de adrenalina, que actúa de forma muy similar al glucagón con respecto al sistema AC). Por tanto, la existencia de múltiples pasos en las rutas de señali-zación supone una mejor amplificación de respuesta, la posibilidad de que una misma ruta module muchos procesos moleculares distintos y también disponer de más puntos de regulación o control, lo cual proporciona un ajuste mucho más fino o preciso.

1.5.4.-Ruta de transducción del Fosfatidil Inositol.

De forma análoga a como las subunidades as activan la AC, otras subunidades a (ai, ao o aq ) son capaces de activar a la enzima efectora Fosfolipasa C (PLC). En este caso el substrato de la enzima que al transformarse origina los segundos mensajeros son las moléculas de Fosfatidil Inositoles. Estas moléculas, además de ser precursoras de segundos mensajeros tienen importancia en el anclaje de proteínas extracelulares a la membrana plasmática. Los fosfatidil inositoles (PI) son fosfolípidos que se caracterizan por poder presentar varios grados de fosforilación a través de las funciones alcohol de la molécula de inositol (ver figura 1.9), siendo el substrato de la PLC la molécula de Fosfatidil Inositol 4,5 bifosfato (PIP2). La PLC causa la hidrólisis del enlace éster entre el grupo alcohol primario de la molécula de glicerol y el ácido fosfórico, originando las moléculas de diacilglicerol (DAG) y de Inositol 1,4,5 - trifosfato (IP3).

Los productos de la reacción tienen la característica de actuar como segundos mensajeros en sendas rutas de transducción. Así, el DAG, que queda unido a MODULO III

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la membrana, es capaz de activar a la protein-quinasa C (PKC), la cual, de forma análoga a la descrita para PKA es capaz de modular por procesos de fosforilación la actividad de muchas proteínas, ya sean de membrana, citosólicas o factores de transcripción. Por su parte, el IP3, que es soluble en el citoplasma, mediante su interacción con canales de Ca2+ tetraméricos, situados fundamentalmente en el retículo endoplásmico, puede incrementar las concentraciones de Ca2+ citosólico de 10 a 1000 veces. El aumento en las concentraciones de este ion activa la función de varias proteínas que son dependientes de él. Entre estas proteínas dependientes de Ca2+ destaca la Calmodulina una proteína reguladora de ciertas proteína quinasas (PK CaCaM), las cuales, una vez activadas, tienen efectos análogos a los descritos para otras proteína quinasas.

Figura 1.9. Generación de segundos mensajeros (IP3 e 1,2-diacilglicerol) por Fosfolipasas C

Se conocen varios subtipos de PLC que, al igual que vimos para la AC, se clasifican en función de las moléculas implicadas en su activación. De los diversos tipos los más importantes son: -PLC b .- Son las activadas por proteínas G. Dependiendo de la subunidad a implicada en su activación, los receptores responsables de su activación se clasifican en Familia Gq y Familia Gi. Son bastantes las moléculas de señalización capaces de activar este tipo de efector: neurotransmisores

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(Noradrenalina, Acetilcolina o 5-hidróxi-triptamina), neuropéptidos (vasopresina, angiotensina, Péptido Intestinal Vasoactivo -VIP-, o colecistoquimina) u hormonas (glucagón, GnRH, TRH).

-PLC g .- Son activadas por receptores con actividad tirosin-quinasa intrínseca, tales como receptores de EGF, FGF o PDGF (factores de crecimiento epidérmico, fibroblástico y derivado de plaquetas, respectivamente). Este tipo de activación consiste en la interacción de la PLC g con estos receptores a través de dominios SH2 (ver más adelante en el tema). Dentro de este tipo de PLC también se han descrito algunas que pueden ser activadas por Ca2+.

Al igual que vimos para la ruta activada por AC, la ruta de la PLC es inactivada de forma parecida. El catabolismo (inactivación) de los segundos mensajeros implica varios pasos enzimáticos (figura 1.10) que finalizan en la formación de Fosfatidil Inositol 4,5 bifosfato; es decir, el PIP2, que era el substrato de la PLC, se recupera a partir de los productos del metabolismo de IP3 y DAG. Por tanto, para la síntesis de ambos compuestos es necesario el correcto funcionamiento de la ruta de degradación. El IP3 se defosforila, por acción de fosfatasas, en reacciones sucesivas para dar lugar a Inositol. Por su parte, el DAG se fosforila por acción de una quinasa para dar lugar a ácido fosfatídico, el cual mediante una citidil transferasa forma fosfatidil-CMP. El inositol y el fosfatidil-CMP son substratos de una sintasa que origina fosfatidil-Inositol (PI), que por sucesivas fosforilaciones origina Fosfatidil Inositol 4,5 bifosfato.

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Figura 1.10. Metabolismo de IP3 y Diacilgliceroles.

Esta molécula puede servir de substrato para la generación de nuevos segundos mensajeros tras la correspondiente activación de la ruta. La inhibición farmacológica de esta ruta de resíntesis por Li+ se utiliza en el tratamiento de enfermos maniacodepresivos. En concreto se ha podido demostrar que el Li+ inhibe a las fosfatasas implicadas en la generación de inositol. Para terminar la transmisión de esta vía deben además de retirarse las elevadas concentraciones de Ca2+. Existen en la célula varios sistemas capaces de realizar esta función (figura 11): - ATPasa Ca2+ dependiente.- expulsa Ca2+ al exterior de la célula en contra de gradiente y, por lo tanto con gasto energético. Presentan Km muy bajas (100-200 nM).

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- ATPasa del retículo endoplásmico. Similares a las anteriores con la excepción de que no son dependientes de Ca2+.

- Intercambiador Na+- Ca2+.- Intercambia 3 Na+- por 1 Ca2+ .Sólo interviene si las concentraciones de Ca2+ son muy altas.

- Mecanismo mitocondrial.- El funcionamiento de la cadena de transporte electrónico conlleva la salida de H+ al exterior de la mitocondria, creando un potencial de membrana que es aprovechado por la F1-ATPasa para la síntesis de ATP. Cuando las concentraciones de Ca2+ son elevadas este potencial de membrana puede ser aprovechado para la entrada de este ion al interior mitocondrial por los transportadores específicos.

Figura 1.11 Homeostasis de Ca2+ intracelular.

PKC y PK Ca-CaM Como se ha mencionado anteriormente son las principales enzimas en la transducción de la señal por la ruta de la PLC. Ambas presentan actividad sertrequinasa. La PKC en realidad es una familia de proteínas (a, b, g, d, e, m, z) que si bien median la misma acción catalítica, difieren en sus características.

Las conocidas como típicas (a, b, g) se caracterizan por ser activadas, además de por DAG que es el verdadero desencadenante de su activación, por Ca2+ y fosfolípidos. La PKC se encuentra en forma inactiva en el citosol. La aparición de DAG en la membrana promueve su asociación con esta y, en presencia de Ca2+ sufre un cambio conformacional en su dominio regulador que activa a la enzima (dominio catalítico).

Con respecto a la PK Ca-CaM, la calmodulina, el mediador proteíco de muchas reacciones enzimáticas reguladas por Ca2+, contiene cuatro centros de unión a MODULO III

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Ca2+ de alta afinidad. La unión del Ca2+ induce un cambio conformacional en la calmodulina que le permite interaccionar activamente con la PK que regula (figura 1.12).

Figura 1.12. Activación de PK Ca-CaM.

Al igual que vimos para la proteína PKA, tanto la PKC como la PK Ca-CaM son capaces de inducir, mediante procesos de fosforilación, la modulación de múltiples proteínas que manifiestan diversas activi-dades biológicas (transportadores iónicos, enzimas de rutas metabólicas, factores transcripcionales, etc).

1.5.5. Integración de rutas de transducción.

En un momento dado de su desarrollo una célula puede recibir distintas señales, que pueden modular procesos biológicos comunes. Por lo tanto la célula debe de disponer de los mecanismos moleculares precisos mediante los cuales dirigir los efectos metabólicos de estas distintas rutas. Cabe distinguir en este punto dos posibles niveles de regulación: - en las propias rutas de transducción.

- en las rutas diana modulables (glucogenolisis, contracción muscular, secreción endocrina, etc).

Con respecto a la regulación de vías de transducción por otras vías de transducción hay numerosos ejemplos que demuestran la existencia de dos tipos generales de regulación: regulación positiva, donde la activación de una

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vía coopera en la activación de otra, y regulación negativa, donde la activación de una vía conduce a la inhibición de otra. Considerando las dos rutas hasta ahora explicadas (AC y PLC) tenemos un ejemplo de regulación positiva si consideramos que la activación de PLC, vía IP3, aumenta las concen-traciones de Ca2+, el cual es capaz de estimular algunos tipos de AC. En sentido contrario, la activación de PKA, vía AMPc, reduce los niveles de IP3. De igual forma, la fosfodiesterasa capaz de hidrolizar la estructura cíclica de AMPc es activada por el complejo Ca-CaM. Estos tipos de regulación que afectan a dos o más vías entre sí, a veces pueden encontrarse en una misma vía. Así, por ejemplo, la PKC es capaz de modular por fosforilación bombas de Ca2+ o el antiportador Na+/Ca2+, contribuyendo por estos efectos a bajar las concentraciones de Ca2+ citosólico elevadas, lo cual necesita para ser activa.

En este caso podemos hablar de efectos sinérgicos. En el lado opuesto estarían los efectos de retroalimentación, mediante los cuales una enzima o metabolitos situado en pasos posteriores de la vía de transducción puede modular negativamente pasos previos de la vía. Así, por ejemplo, la PKC activada tiende a disminuir las concentraciones de IP3. Todos los sistemas propuestos confluyen en la idea de que las rutas de señalización están altamente reguladas.

1.5.6. Ruta del Acido Araquidónico (AA).

El ácido araquidónico es un segundo mensajero implicado en varias rutas de señalización. Su generación como segundo mensajero puede provenir de la activación de dos rutas distintas: la activación de fosfolipasa A2 (PLA2), enzima que cataliza la hidrólisis del enlace éster entre el alcohol secundario del glicerol y el ácido graso de varios fosfolípidos, o por la activación de la DAG lipasa que, catalizando la misma reacción, se distingue de la anterior por utilizar como substrato el DAG. Por tanto, el DAG no sólo funciona como segundo mensajero en la ruta de los fosfatidil inositoles sino que además funciona como precursor de otros mensajeros (Figura 1.13).

Se conocen dos subtipos de PLA2 que se diferencian por su localización celular (membrana citoplasmática o citosol) y por el tipo de proteínas implicadas en su activación, ya que las asociadas a membranas son activadas por proteínas G mientras que las citosólicas resultan activadas por otras rutas de señalización (ver más adelante). Dentro de las funciones desempeñadas por el ácido araquidónico pueden distinguirse aquellas ejercidas en el interior de la célula donde se ha generado (movilización de depósitos de Ca2+ internos, activación de PKC de forma análoga al DAG) y las ejercidas al salir de la célula y poder funcionar como una molécula se señalización en células vecinas.

El metabolismo del AA implica procesos de regulación por retroalimentación, ya que es capaz de inhibir a la PLA2, y procesos de transformación en MODULO III

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metabolitos, ya que es substrato de diversas enzimas que lo transforman en otras moléculas también implicadas en señalización (leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos, epóxidos). Estos compuestos junto con el AA son conocidos como mensajeros retrógrados; es decir, tienen la capacidad para salir de la célula y unirse a receptores de membrana plasmática de la propia célula (S. autocrina) o de células vecinas (S. paracrina).

1.5.7. Ruta del Ácido Fosfatídico (PA).

Presente en diversos tipos celulares (neuronas, miocitos, hepatocitos, células endoteliales y del sistema hematopoyético) e implicada en la regulación de múltiples procesos fisiológicos (regulación metabólica, secreción, inflamación, proliferación) se encuentra la generación de ácido fosfatídico como segundo mensajero. En esta ruta el substrato fisiológico es la fosfatidil colina que sufre la hidrólisis del enlace éster entre el resto de fosfato y la colina, reacción calatizada por la Fosfolipasa D (PLD) para originar PA y colina. El PA además de actuar como segundo mensajero para la activación de varias proteína quinasas, puede servir como precursor de otros mensajeros como el DAG o el ácido araquidónico, mediante sendas reacciones enzimáticas catalizadas por la fosfatidato fosfohidrolasa (DAG) y la PLA2 (AA). La PLD, a diferencia de otras fosfolipasas, se activa por ciertas proteínas G pequeñas (ARF, Rho; ver más adelante) en combinación con PIP2.

1.6. RECEPTORES CON ACTIVIDAD ENZIMÁTICA INTRÍNSECA. Este grupo de receptores, a diferencia de los anteriores, no requiere de moléculas intermedias para la activación de enzimas efectoras sino que la unión del ligando al receptor es capaz de activar la catálisis del propio receptor.

Los receptores de este tipo se clasifican dependiendo de la actividad enzimática que presenten.

1.6.1. Receptores con actividad Guanilato ciclasa.

La unión del factor natriurético atrial a su receptor, en células colectoras renales, provoca la activación de la actividad guanilato ciclasa, presente en el dominio citosólico que cicla la molécula de GTP para dar GMP cíclico (GMPc).

Esta molécula actua como segundo mensajero en la activación de la proteína quinasa G (PKG), que cataliza fosforilaciones de proteínas similares a las descritas para PKA o PKC (Figura 1. 14).

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Figura 1.14. Activación de receptores con actividadGuanilato ciclasa.

Existe un segundo grupo de proteínas con actividad guanilato ciclasa que se diferencian de las anteriores por presentarse en el citosol. Las guanilato ciclasas solubles son activadas por el óxido nítrico (NO), un gas sintetizado a partir de arginina en una reacción catalizada por oxidasas de función mixta, denominadas óxido nítrico sintasas (NOS) y de las que se conocen varios subtipos. Las guanilato ciclasas presentan en su centro activo un grupo hemo necesario para su actividad y que es donde reside el dominio de interacción con el NO. Esta molécula esta implicada en la generación de procesos inflamatorios y se considera un neurotransmisor.

1.6.2 Receptores con actividad Tirosina Quinasa.

Los receptores con actividad tirosina quinasa pueden agruparse, dependiendo de su composición, en receptores monoméricos, que incluye receptores para varios factores de crecimiento (EGF, NGF, PDGF, etc) o receptores multiméricos, cuyo paradigma es el receptor de insulina. Independientemente de la composición del receptor, estas proteínas presentan los dominios típicos de receptores de membrana: extracelular, por donde se une el ligando, transmembrana, por donde permanece anclado a la membrana, y citosólico, donde reside la actividad tirosina quinasa. En este tipo de receptores, la unión del ligando al receptor provoca la dimerización de estos. La proximidad física de ambas moléculas permite la activación de la actividad catalítica produciéndose la fosforilación cruzada de ambas en restos de tirosina; es decir, cada monómero del receptor activado es capaz de producir la fosforilación de algunos restos en la otra molécula, proceso que se conoce como autofosforilación. La fosforilación de determinados restos de tirosina produce la aparición de dominios de reconocimiento para otras proteínas lo cual es esencial en la ruta de transducción (figura 1.15).

Se han identificado dos tipos de proteínas que pueden interaccionar con los receptores activados:

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- Proteínas adaptadoras que realizan el acoplamiento entre el receptor activado y otras moléculas de señalización pero que carecen de actividad intrínseca en la señalización, como es el caso de GRB2.

Figura 1.15. Activación de receptores con actividad Tirosina quinasa.

Los dominios SH2 aparecen coloreados en gris.

- Proteínas con actividad enzimática implicadas en las rutas de señalización, como es el caso de GAP (proteína activadora de la función GTPasa de Ras; ver más adelante), Syp, una proteína con actividad fosfatasa, y enzimas implicadas en la síntesis de derivados del fosfatidil inositol como la fosfatidilinositol-3 quinasa (PI3K) o la PLCg (figura 1.9).

La interacción entre estas proteínas y los receptores activados se lleva a cabo por dominios específicos de las proteínas denominados dominios SH2 (dominio de homología con Src 2). Pequeñas variaciones en los dominios SH2 de las proteínas facilitan su unión a algunos restos fosfo-tirosina del receptor con mayor afinidad que a otros restos fosfotirosina, de tal manera que no todas las proteínas con dominios SH2 se unen con idéntica afinidad a un determinado resto fosfo-tirosina (figura 1.16).

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Figura 1.16. Ciclo de activación-inactivación de Ras Una proteína que juega un papel importante en la transducción de señal por este tipo de receptores es Ras, la cual pertenece a la familia de proteínas G pequeñas y está implicada en la regulación de procesos tales como la proliferación y la diferenciación celular. Como se mencionó anteriormente estas proteínas son interruptores moleculares que necesitan del intercambio de moléculas GDP-GTP para variar su actividad biológica. A diferencia de las proteínas G heterotriméricas, donde el intercambio de GTP por GDP era inducido por la interacción con los receptores activados, las proteínas G pequeñas necesitan de la presencia de otras proteínas, denominadas factores intercambiadores de nucleótidos de Guanina (GEF) que facilitan la disociación del GDP, con lo cual el GTP puede unirse de forma espontánea (figura 1.16).

La unión de GTP provoca la disociación del intercambiador produciendo la forma activa de Ras. El paso de la forma activa de Ras a la forma inactiva es acelerado enzimáticamente por ciertas proteínas que reciben el nombre de GAP (proteína activadora de GTPasa). La existencia de GAP hace que en sistemas celulares la vida media de Ras-GTP no supere el minuto.

Dado que Ras carece de dominios SH2 necesita para su activación por receptores con actividad tirosina quinasa de proteínas adaptadoras. Además de dominios SH2, existen otros tipos de dominios implicados en el reconocimiento de proteínas, tales como dominios SH3 (reconocen secuencias ricas en prolina) o PTB. La proteína GRB2 es una proteína adaptadora que presenta dominios SH2, mediante los cuales puede interaccionar con los receptores activados, y dominios SH3, mediante los cuales puede interaccionar con otras proteínas capaces de reconocerlos. Sos que es una proteína intercambiadora de nucleótidos de guanina (GEF) tiene la característica de poder reconocer dominios SH3, de tal manera que puede interaccionar con el adaptador GRB2 (unido al receptor activado) a través de los dominios SH3. El complejo Receptor-GRB2-Sos está en condiciones de activar a Ras que pone en marcha una cascada de fosforilación de proteínas que, eventualmente, finaliza en el

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núcleo modificando la expresión génica. La figura 1.17 esquematiza la activación de Ras en la transducción de señal generada por EGF.

Figura 1.17. Papel de proteínas adaptadoras en la activación de rutas de transducción por RAS. La serie de eventos que siguen a la activación de Ras presenta una gran convergencia en todas las especies estudiadas. Los pasos más relevantes son (figura 1.18):  



Ras activado se une al extremo N-terminal de Raf, una serina-treonina quinasa.

El complejo Ras-Raf interacciona y fosforila, a través de Raf, a MEK, una quinasa dual, ya que puede fosforilar a otras proteínas en restos serina y tirosina.

MEK fosforila y activa a las MAP quinasas (MAPK- Mitogen Activated Protein Kinase), otra serina-treonina quinasa.

MAPK fosforila a muy diferentes proteínas que están implicadas en la regulación del ciclo celular y la diferenciación. Entre dichas proteínas cabe destacar otras proteína quinasas (pp90rsk) y ciertos factores transcripcionales.

Estudios recientes han confirmado la existencia de otros miembros de la familia de MAPKs. En la actualidad se distinguen tres subfamilias de MAPKs: A) -ERK (Extracellular Regulated Kinases) se corresponden con las mencionadas anteriormente como MAPKs, estando por tanto implicadas en los procesos de proliferación y diferenciación.

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Figura 1.18 Activación de quinasas reguladas extracelularmente (ERK).

B) JNK (Jun N-terminal Kinasas) se denominan así por identificarse por primera vez su implicación en la fosforilación de la proteína JUN (que junto con FOS forman el factor transcripcional AP-1). Estas quinasas son activadas en respuesta a múltiples señales (citoquinas, hormonas) y están relacionadas con los procesos infeccioso-inflamatorios, de estrés celular y de supervivencia celular).

C) p38-MAPKs constituyen el tercer tipo de MAPKs. También pueden ser activadas por múltiples señales y se han relacionado con los procesos de estrés celular y de supervivencia/muerte celular. La finalización de señalización en rutas acopladas a la fosforilación de proteínas es realizada por proteínfosfatasas (fosfo-tirosina o fosfoserina/treonina fosfatasas). Se conocen varias familias de fosfatasas que difieren en sus especificidades de acción y localización celular (citosol, núcleo, etc).

Activación del receptor de Insulina A diferencia de los otros receptores de esta familia (por ejemplo EGF), el receptor de insulina una vez activado, no interacciona con proteínas a través de dominios SH2 (con la excepción de Shc), sino que fosforila a ciertas proteínas citosólicas de elevado peso molecular (aprox. 130 kDa) denominadas IRS (Insulin Receptor Substrates). En la actualidad se han descrito tres proteínas con esta característica (IRS 1, IRS 2 e IRS 3). La fosforilación de IRS por la actividad quinasa del receptor de insulina crea los sitios de reconocimiento para la interacción con otras proteínas (GRB2, PI3K, Syp) y su consiguiente activación, a través de dominios SH2 (figura 1.19).

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Figura 1.19. Activación de IRS-1 por el receptor de insulina.

Así la actividad PI3K se incrementa 10 veces cuando esta proteína interacciona con IRS 1, incrementándose el tráfico de membranas. De forma análoga, Syp, con actividad fosfatasa, se activa al interaccionar con IRS 1 de modo que puede desfosforilar a esta proteína terminando así su señalización. IRS-1 se caracteriza por la presencia de dominios PH, que permiten la estabilización de la interacción con el receptor a través de su afinidad por fosfolípidos de la membrana.

1.6.3. Receptores con actividad Serina-Treonina Quinasa.

Son también conocidos como receptores de la familia del TGFb. El TGF-b1 es el prototipo de una familia de moléculas de señalización que incluye a los factores de crecimiento transformantes tipo beta, las activinas, las inhibinas, las proteínas morfoge-néticas óseas (BMP) y la hormona Antimülleriana. Los miembros de esta familia ejercen una gran variedad de efectos biológicos en diversos tipos celulares, teniendo especial importancia durante el desarrollo embrionario y la formación de tejidos. En el adulto están implicados en procesos tales como la reparación de tejidos, la modulación del sistema inmune y la regulación del ciclo ovárico. Estas moléculas de señalización inician sus acciones celulares mediante su unión a receptores con actividad intrínseca serina/treonina-quinasa. La familia de receptores consta a su vez de dos tipos: tipo I y tipo II, que son estructuralmente muy similares, con regiones extracelulares ricas en cisteina y regiones intracelulares que consisten principalmente de los dominios quinasa. Los receptores de tipo I, pero no los de

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tipo II, presentan una región rica en residuos de glicina y serina (dominio GS) en el dominio yuxtamembranal. Cada miembro perteneciente a esta familia se une a una combinación característica de receptores tipo I y tipo II siendo necesaria esta interacción para desencadenar los procesos de señalización intracelulares (Tabla 1.2).

El TGF-b1, como ejemplo, se une en primer lugar al receptor de tipo II, lo cual ocurre en la membrana celular formando oligómeros que presentan actividad quinasa. A continuación el receptor de tipo I (que carece de actividad quinasa intrínseca y no puede unirse al TGF-b en ausencia de receptor tipo II) es reclutado al complejo; El receptor tipo II fosforila al receptor tipo I en el dominio GS y lo activa presentando entonces actividad quinasa.

Como consecuencia de la activación del receptor de tipo I, este es capaz de fosforilar a ciertas proteínas citosólicas, denominadas SMAD, las cuales una vez activadas tienen la capacidad de translocarse al núcleo y ejercer sus efectos reguladores (figura 1.20) sobre la expresión génica.

Figura 1.20. Activación del complejo de receptor para TGF-

1.7. RECEPTORES ASOCIADOS A PROTEÍNA Quinasas citosólicas.

Un gran número de citoquinas, algunas hormonas (prolactina, hormona del crecimiento, leptinas) y ciertos factores de crecimiento (eritropoyetina, G-CSF) se caracterizan por presentar receptores sin actividad catalítica pero

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desencadenar procesos de fosforilación de proteínas en tiempos similares a los conseguidos por los receptores considerados en el apartado 1.6. Una característica que comparten muchas citoquinas y algunos factores de crecimiento es la implicación de una proteína transductora de membrana necesaria para la activación de rutas de señalización. Estas proteínas transductoras si bien por sí solas no son capaces de interaccionar con el receptor en ausencia de ligando (al igual que lo descrito para los receptores tipo I del TGF-b), interaccionan con el receptor activado por ligando, siendo la formación del complejo ligando-receptortransductor el desencadenante de las rutas de transducción asociadas. Atendiendo a la homología entre los distintos receptores que componen esta superfamilia, estos se han clasificado en dos tipos generales: a) Receptores de Tipo I Los receptores de tipo I comparten una serie de motivos conservados en sus dominios extracelulares que consisten en 4 residuos de cisteína y el motivo WSXWS (Trp-Ser-X-Trp-Ser). Dentro de esta familia de receptores, las citoquinas pueden a su vez clasificarse dependiendo del tipo de proteína transductora que presenten. Así, la familia gp130 se caracteriza por la interacción de esta proteína (gp130) con los receptores específicos para IL-6, IL-11, IL-12, LIF (factor inhibidor de la leucemia), OnM (oncostatina M), CNTF (factor neurotrófico ciliar) y G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos). La familia gp140 engloba a IL-3, IL-5 y GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos). Por último, la familia g -C engloba a las interleuquinas 2, 4, 7, 9, 13 y 15. Si bien algunas de estas citoquinas pueden inducir la fosforilación de determinadas proteína- quinasas, como Lyn, Lck o Fyn (por IL-2) o Lyn, Hck o Fps (por IL-3), la característica común de todas estas citoquinas es su capacidad de activar a uno o más miembros de la familia de las JAK (Janus Kinase). Se conocen cuatro quinasas en esta familia: JAK1, JAK2, JAK3 y tyk2 y todas tienen actividad tirosina quinasa. b) Receptores de Tipo II Integrada por los receptores de interferones. Los interferones se clasificaron inicialmente por el tipo de célula productora como interferones de leucocitos, de fibroblastos o inmunes. La nomenclatura actual se basa principalmente en su secuencia; y así designa a los interferones de leucocitos como IFN-a e IFN-w, a los de fibroblastos como IFN-b y a los de tipo inmunes como IFN-g . Los IFNs a y b comparten el mismo tipo de receptor mientras que los IFN g presentan un receptor específico. El último componente de esta familia lo constituye la IL-10.

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Tabla 1.2. Miembros de la Familia del TGF- , sus receptores, moléculas de señalización y principales respuestas biológicas.

Independientemente del tipo de receptor (I o II) y del tipo de ligando, la unión del ligando al receptor desencadena la siguiente cadena de eventos moleculares (figura 1.21): 1- Dimerización de receptores o de receptorestransductores.

2- Activación de JAKs, las cuales producen la fosforilación cruzada de las mismas.

3- Las JAK fosforiladas son capaces de fosforilar a los receptores en residuos de tirosina creando sitios de reconocimiento para dominios SH2.

4- Estas secuencias fosforiladas son reconocidas por diversas proteínas con dominios SH2, de entre las cuales destacan las proteínas STAT (signal transducer and activators of transcription).

5- La interacción de proteínas STAT con los receptores permite la fosforilación de las STAT por las JAK. 6- Dichas fosforilaciones crean a su vez en las proteínas STAT sitios de reconocimiento para dominios SH2. Dado que cada proteína STAT presenta un sitio de reconocimiento y un dominio SH2, estas proteínas pueden dimerizarse y translocarse al núcleo para regular la expresión de juegos específicos de genes.

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La fosforilación del receptor permite además la interacción de éste con otras proteínas que contienen dominios SH2 como Shc, proteína adaptadora implicada en la activación de Ras, que puede activar la ruta de las MAPK (ERK). Un ejemplo de este tipo de activación múltiple lo supone la fosforilación de STAT3 en células T, donde la interacción de IL-2 con su receptor controla la progresión de la fase G1 a S, la expansión clonal y la diferenciación funcional.

La interacción de IL-2 con sus receptores supone la activación de JAK1 y JAK3 y la consecuente fosforilación de STAT3 en su residuo Tyr-705 (Figura 1.22).

Por otra parte, la fosforilación del receptor de IL-2 (cadena b) favorece su interacción con Shc y la consecuente activación de Ras, que conduce a la fosforilación de STAT3 en su residuo Ser-727. Esta segunda ruta que lleva a la fosforilación del residuo de serina también puede desencadenarse por el receptor de la célula T (TCR).

Figura 1.21. Cascada de fosforilaciones en la activación de STAT.

Especificidad de Respuesta Biológica por STATs En la actualidad se han clonado 4 proteínas de la familia JAK y siete proteínas de la familia STAT. Por otra parte se conocen más de 35 señales extracelulares, capaces de activar dicha ruta de transducción, que desencadenan respuestas biológicas de Figura 1.22. Activación de las rutas asociadas aRas y JAKpor IL-2 lo mas variadas (activación de múltiples respuestas del sistema inmune, diferenciación del epitelio mamario, de linfocitos T, de eritrocitos, etc). La pregunta que surge es ¿Como un juego tan pequeño de proteínas puede generar tanta diversidad de efectos biológicos? La respuesta puede estar en parte explicada considerando la especificidad de las proteínas STAT en el reconocimiento de los receptores de esta familia, ya que sólo algunas STAT reconocen determinado receptor, por ejemplo, la proteína STAT 2 sólo se ha demostrado su interacción con el receptor para IFN a/b. La figura 1.23 esquematiza algunas de las posibles interacciones. Parte de la respuesta se explicará en el próximo tema cuando se aborde el estudio de la existencia de programas genéticos específicos para los distintos tipos celulares.

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Figura 1.22. Activación de las rutas asociadas aRas y JAKpor IL-2

Figura 1.23. Especificidad de respuesta biológica 1.8. RECEPTORES DE LA FAMILIA TNF/NGF Los receptores de esta familia están implicados, con algunas excepciones en la señalización yuxtacrina; es decir, tanto el ligando como el receptor son proteínas de membrana con dominios extracelulares a través de los cuales se establece la señalización.

El TNF-a (Factor de Necrosis Tumoral), que tiene la característica de ser un ligando de señalización paracrina, es una citoquina pleiotrópica que funciona como un mediador de la regulación inmune, la respuesta inflamatoria y la apoptosis en algunos tipos celulares. Un exceso en la producción de TNF se ha ligado al desarrollo de ciertas enfermedades tales como el shock séptico y

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ciertos desordenes autoinmunes. Las respuestas celulares promovidas por el TNF se inician mediante su interacción con dos tipos distintos de receptores celulares, el receptor de tipo I (55 kDa) y el de tipo II (75 kDa). Ambos tipos de receptores forman parte de la familia de receptores del TNF entre cuyos miembros se incluyen el antígeno Fas (inductor de apoptosis, también llamado Apo-1 o CD95), CD27 (antígeno de activación de células T), CD30 (marcador del linfoma de Hodgkin) y CD40 (antígeno de células B), los cuales comparten la característica de secuencias ricas en cisteina en sus dominios extracelulares.

Esta familia de citoquinas genera respuestas celulares que incluyen la diferenciación, la proliferación, la activación de NF-kB y la muerte celular, promoviendo la agregación de monómeros de receptores. En general los dominios citoplasmáticos de esta familia de receptores carecen de dominios comunes, lo cual sugiere que pueden utilizar mecanismos distintos. La excepción ocurre con el receptor tipo I del TNF y el antígeno Fas, ya que ambos presentan en su extremo carboxilo terminal un dominio de aproximadamente 80 aminoácidos que se ha denominado "dominio de muerte" (DD= death domain). A los dominios citoplasmáticos de los receptores pueden asociarse dos familias de proteínas denominadas TRAF (Factores Asociados al Receptor de TNF) y TRADD y que están implicadas en la transducción de la señal al núcleo (figura 1.24). En este caso de señalización podemos hablar del reclutamiento de proteínas al complejo receptor(es)-ligando(s) del tal manera que una proteína transmite la señal a la siguiente proteína en la cascada a través de interacciones proteina-proteina, sin mediar procesos de modificación covalente (fosforilaciones) como hemos visto para otros tipos de receptores, mediante interacciones por dominios homólogos.

Figura 1.24 Rutas de transducción asociadas a TNF. Para el caso del receptor I del TNF las posibles secuencias de eventos moleculares, tras la formación del complejo receptor (trímero)-ligando, serían:

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asociación de TRADD (mediante los dominios DD) al complejo. asociación de TRAF2 a TRADD. La activación de TRAF2 permite que esta proteína interaccione con otras como NIK (proteína quinasa que al activarse puede generar una ruta de fosforilaciones o RIP que puede asociarse con RAID y ésta activar algunas caspasas que están implicadas en la señalización de muerte celular. asociación de MORT1/FAD (mediante dominios DD) con la consiguiente activación de algunas caspasas.

La activación de este tipo de receptores, además de las vías de quinasas consideradas de estrés (Jun quinasa, p38), conlleva la activación de dos procesos contrapuestos en la célula: la activación de caspasas, proteasas intracelulares que dirigen el proceso apoptótico, y la activación de los miembros de la familia del factor nuclear NF-kB que, mediante la activación génica, actua como un factor de supervivencia (ver tema 2). Dependiendo del tipo celular y de la predominancia de unas rutas sobre otras (muerte/supervivencia) el efecto final una vez integradas las distintas vías de señalización puede ser de muerte (apoptosis) o proliferación celular.

1.9. REGULACIÓN DE RECEPTORES DE MEMBRANA El número y la actividad de receptores funcionales implicados en señalización sobre la superficie de la célula no es constante. El nivel de receptores para una determinada hormona puede incrementarse (up-regulation) o disminuir (downregulation), permitiendo de esta forma a la célula responder óptimamente a ligeras variaciones en los niveles hormonales. La exposición prolongada de una célula a elevadas concentraciones de un ligando normal-mente resulta en una reducción en el número de sus receptores funcionales, causando por consiguiente la desensibilización de la célula para ese ligando.

El fenómeno de la down-regulation de receptores de superficie celular puede ocurrir de varias formas. Los receptores pueden ser internalizados por endocitosis, disminuyendo así su número en la superficie y entonces ser destruidos o almacenados (secuestrados) en vesículas intracelulares. En cualquier caso se finaliza la acción del ligando. El que la célula elija uno u otro mecanismo depende del tiempo de duración del estímulo. Tras tiempos cortos de exposición a la señal (minutos) la célula secuestra en vesículas a los receptores: si el estímulo perdura en el tiempo (horas) entonces se activa la vía de degradación de receptores tras la fusión de vesículas lisosomales (figura 1.25). Es conocido que la activación de PI3K juega un importante papel en el tráfico de vesículas.

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Figura 1.25. Regulación de receptores de membrana.

Alternativamente, puede que el número de receptores no se modifique pero si su actividad, de modo que el receptor sea incapaz de unirse con el ligando o si bien puede unirse, el complejo receptorligando no induzca la respuesta celular normal. Los ejemplos mejor conocidos implican cambios en el estado de fosforilación de los receptores que causan la inactivación de estos (inactivación por fosforilación). Esta inactivación del receptor puede ser generada por mecanismos de retroalimentación (desensibilización homóloga); es decir, por moléculas diana de la propia vía activada por el complejo receptor-ligando (por ejemplo, las desensibilizaciones del receptor de EGF por PKC o del receptor ßadrenérgico por PKA y ßARK, enzima activada por subunidades bg y que solo fosforila a receptores que están acomplejados a ligando) o por otras vías de señalización. En este caso son bien conocidos los efectos de PKA en la inactivación de receptores, acoplados a proteínas G, activados por distintos ligandos (desensibilización heteróloga).

Figura 1.26. Control de la actividad de receptores acoplados a proteínas G. La desensibilización de receptores tiene un papel importante en la regulación de la respuesta celular causada por el ligando, ya que permite a la célula ajustar la sensibilidad del receptor a la concentración de ligando a la cual es estimulada, de modo que puede mantener una respuesta fisiológica normal. dado que los receptores fosforilados son continuamente desfosforilados por

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fosfatasas constitutivas, el número de grupos fosfato por moléculas de receptor refleja la cantidad de ligando unido en los últimos 1-10 minutos. Si ocurre un incremento en la cantidad de ligando, el correspondiente incremento en AMPc conduce a la fosforilación y desensibilización de más receptores, de modo que la producción de AMPc y las consiguientes respuestas activadas por éste permanecen más o menos constantes. Si el ligando desaparece, el receptor pasará a estar completamente desfosforilado y a un estado de alta sensibilidad, en cuyo caso podrá responder a concentraciones muy bajas de ligando. La figura 1.26 esquematiza el bucle de retroalimentación que controla la actividad de receptores acoplados a proteínas G.

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CAPITULO II MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN CELULAR IMPLICACIONES FISIOPATOLÓGICAS

El estudio de los sistemas de transducción de señal y de los mecanismos de comunicación intercelular ha experimentado un extraordinario desarrollo en los últimos años. Estos nuevos resultados están conduciendo a la incorporación de nuevos conceptos críticos para poder entender cómo las células reciben y coordinan señales del entorno y de otras células del mismo organismo, controlando así los procesos de proliferación, diferenciación, morfología, migración o muerte celular.

Los sistemas de comunicación y señalización celular son determinantes fundamentales de la coordinación y las funciones de los distintos tipos celulares a través del control de la expresión génica y de la función de las proteínas.

Estos sistemas serán los que controlen dónde, cuándo, cuánto y por cuánto tiempo se expresan los RNA. En el caso de las proteínas, los mecanismos de señalización celular controlan, además, los cambios de localización, el tráfico de proteínas dentro de una célula, cómo se degradan, y las interacciones funcionales que establecen. De forma coherente con este decisivo papel en la función de los organismos, se estima que más del 20% de los genes del genoma humano codifican proteínas implicadas en transducción de señales.

Por otra parte, la alteración de estos sistemas está en la base de múltiples patologías, como el cáncer, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares, inflamatorias o neuro-degenerativas. Dada la enorme amplitud de este tema, en este capítulo sólo intentaré resumir las principales estrategias y principios en los que se basan los complejos circuitos de señalización celular, y algunos ejemplos de sus repercusiones fisiopatológicas.

REDES DE SEÑALIZACIÓN CELULAR Los sistemas de señalización son extraordinariamente complejos, asemejándose a complicadas redes o circuitos con múltiples elementos de intersección y control. Las vías de comunicación celular son sistemas en cascada, con una serie de etapas secuenciales, en las que cabe distinguir un proceso de detección de un mensajero por un receptor, seguida de un proceso

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de transducción o de transformación de esa señal extracelular en una intracelular.

La diseminación de esas señales intracelulares (también denominadas segundos mensajeros) y su interacción con proteínas efectoras permite regular los procesos celulares básicos y las funciones fisiológicas integradas (1). Por tanto, estos sistemas son un poderoso instrumento para modular las funciones del organismo. Es importante recordar que estos sistemas, para ser eficaces, tienen que funcionar de forma transitoria y controlada. Por tanto, además de los procesos de detección, transformación y amplificación de la señal, tienen que existir sistemas de terminación, adaptación e integración que aseguren en todo momento su activación y desactivación controlada, así como su interconexión con el conjunto de señales que en cada momento recibe cada célula. Cuando estos mecanismos de control sufren alguna alteración o funcionan mal, se producen situaciones patológicas (2). Por ello, estos sistemas pueden utilizarse también como diana de fármacos que modifiquen las funciones celulares o su comportamiento erróneo.

Desde el punto de vista estructural, los mensajeros pueden ser pequeñas sustancias químicas (adrenalina, glutamato), péptidos o proteínas muy complejas. Los receptores, que muy frecuentemente son proteínas situadas en la membrana de las células, actúan como detectores y «decodificadores» de la señal que porta el mensajero, transformándola en una señal intracelular o segundo mensajero. Los segundos mensajeros, ya desde dentro de la célula, modifican la actividad, localización o interacciones entre proteínas celulares (controlando así el metabolismo o la función del citoesqueleto, por ejemplo) y también regulan la expresión génica, promoviendo una respuesta celular específica e integrada (1).

A principios de los años 1960 existía todavía un conocimiento muy escaso de las características moleculares de los receptores y de los mecanismos de transmisión de la señal. En esta década se produjeron dos avances conceptuales críticos: la teoría de la regulación alostérica de las proteínas propuesta por Monod, Changeux y Jacob en 1963, y la teoría del segundo mensajero sugerida por Earl Sutherland en 1962. Sutherland había trabajado con el Nobel Carl Cori, estudiando los mecanismos por los que la adrenalina regula la degradación de glucógeno a glucosa en el hígado, activando una enzima denominada glucógeno fosforilasa. Más adelante descubrió que, para promover este efecto, la adrenalina no entra en la célula, sino que estimula la síntesis en el otro lado de la membrana de otra molécula distinta, el AMP cíclico (formado por la enzima adenilil ciclasa) que actúa como «segundo mensajero», que es la que transmite la señal a las proteínas intracelulares (3).

Como comentó posteriormente Martin Rodbell en su discurso Nobel en 1994 (4), las teorías de Monod y de Sutherland influyeron mucho en las investigaciones posteriores para desentrañar los mecanismos detallados de MODULO III

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señalización: «Era extraordinariamente atractiva la noción de que la adenilil ciclasa (la enzima de membrana responsable de la formación de AMPc a partir de ATP) era una enzima alostérica con dos sitios diferentes, uno receptor y otro catalítico... La localización asimétrica en la membrana celular de estos sitios .el sitio alostérico que reconoce a la hormona mirando al exterior de la célula y el sitio catalítico que transforma ATP en AMPc hacia el interior, proveía un marco conceptual para investigar las bases moleculares de la acción hormonal».

FIGURA 1. Principales estrategias de transmisión de señales a través de la membrana plasmática y de propagación intracelular.

TIPOS DE RECEPTORES Estas ideas básicas han sido el motor que ha conducido, en los últimos cuarenta años, a la identificación molecular de receptores y de sus mecanismos de acción, a la búsqueda de nuevos segundos mensajeros y a profundizar en las vías por las que éstos pueden alterar las distintas funciones celulares. Así, hoy sabemos que hay receptores-canales, que dejan pasar o no iones (como calcio, sodio o cloruro) a través de la membrana plasmática (a favor de su gradiente electroquímico) dependiendo de la presencia de un mensajero en el exterior de la célula, y que existe otra gran familia de receptores-enzimas, proteínas en los que la presencia de un mensajero específico en el exterior celular modifica la actividad catalítica (tirosina quinasa, tirosina fosfatasa, serina treonina quinasa, guanilato ciclasa, etc.) de otra zona de la proteína en la cara citoplasmática o interior de la célula, alterando las funciones de la misma (1, 5).

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En otros casos, el procedimiento es algo más complejo. A los conceptos de discriminador (receptor) y de amplificador (la actividad que genera el segundo mensajero), se añadía el de transductor. En ese nuevo esquema, el transductor es una entidad molecular independiente que permite acoplar una actividad receptora con otra actividad amplificadora o efectora, que ya no tienen por qué residir o co-existir en la misma proteína. En estos sistemas participan tres proteínas distintas: el receptor, la proteína acopladora o transductora, y la proteína efectora/amplificadora.

Martín Rodbell y Alfred Gilman identificaron en la década de los setenta y los ochenta a esas proteínas transductoras, denominadas proteínas G por su capacidad de unir nucleótidos de guanina. Como detallaré más adelante, esas proteínas pueden actuar como interruptores moleculares, activándose transitoriamente, y pueden controlar una gran cantidad de efectores (adenilil ciclasa, fosfolipasas, canales iónicos), participando en una gran diversidad de procesos fisiológicos (3, 4, 6). Al tipo de receptores que utilizan esas proteínas G para controlar las funciones celulares se les denomina «receptores acoplados a proteínasG», o GPCR por sus siglas en inglés (G protein- coupled receptors).

Como prueba del éxito evolutivo de este mecanismo de señalización celular, los GPCR constituyen, con más de 1.000 genes que codifican receptores de ese tipo en el genoma humano, la superfamilia de receptores de membrana más extensa, más ubicua y más versátil (6, 7). Es conveniente señalar que estos procesos no agotan los mecanismos de respuesta al entorno que se conocen. Así, existen receptores intracelulares, presentes en el citoplasma o en el núcleo de las células, que responden a mensajeros lipofílicos, como las hormonas esteroideas o las hormonas tiroideas, que sí atraviesan la membrana plasmática. Por otra parte, además de mediante mensajeros extracelulares solubles secretados al medio, las células pueden también recibir señales de la matriz extracelular o, en el caso de las células adyacentes, comunicarse mediante contactos célula-célula, o mediante «gap-junctions», que pueden permitir el intercambio de pequeñas sustancias entre células vecinas y coordinar así su funcionamiento y su respuesta a estímulos. Finalmente, últimamente están también cobrando mucha importancia los «mensajeros desde dentro», las señales que surgen en el interior de las células, en muchos casos como detectores o como consecuencia de situaciones de «peligro». El DNA dañado (8), la hipoxia, (9) los radicales libres de oxígeno (10), el estado energético de la célula (a través de los niveles de AMP) y distintos intermediarios metabólicos (11), se está descubriendo que desencadenan importantes respuestas celulares, interactuando en muchos casos con sistemas de señalización «convencionales» que operan desde el exterior

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celular. Comprender cómo se integran estos mensajeros provenientes del interior y del exterior es un reto y una complejidad añadida al estudio de los procesos de comunicación celular.

Es también esencial recordar el papel fundamental del sistema nervioso y del sistema endocrino en la coordinación de la respuesta del organismo. En los organismos complejos, es necesario coordinar las respuestas de cada célula para que trabajen en armonía con las células vecinas del mismo órgano o tejido, y éstos entre sí para permitir una respuesta fisiológica apropiada. En esta coordinación desempeñan un papel fundamental el sistema nervioso y el sistema endocrino, como se detallará más aadelante.

SISTEMAS DE TRANSMISIÓN DE SEÑALES EN EL INTERIOR DE LA CÉLULA Además de los receptores capaces de detectar las señales extracelulares, ¿cuáles son las principales estrategias en las que se basa su propagación en el interior celular? ¿cómo se puede ir transfiriendo esa señal de forma ordenada?

En la enorme complejidad y diversidad de estas vías de transducción emergen algunas propiedades o estrategias esenciales (2, 12-16): o La utilización de las proteínas G monoméricas y heterotriméricas como interruptores moleculares que permiten la activación transitoria de otras proteínas. . El papel central de los sucesos de fosforilación/desfosforilación en el control de la actividad, localización celular, interacciones y degradación de las proteínas implicadas. . La existencia de múltiples «módulos» o dominios funcionales (SH2, SH3, PTB, PDZ, PH, «Pro-boxes», etc.) en proteínas transductoras, lo que permite su ensamblaje y desensamblaje transitorio (controlado por mensajeros extracelulares) en complejos multimoleculares encargados de transmitir la señal, favoreciendo interacciones secuenciales entre proteínas, el reclutamiento y activación de enzimas y/o su proximidad a sustratos específicos. o La existencia de mecanismos de terminación y adaptación de la señal de tanta complejidad como los propios procesos de activaci ón, así como de fluctuaciones espacio-temporales en la señalización. o La inclusión de las cascadas «lineales» clásicas de transducción en redes («networks») de señalización complejas, gracias a la presencia de múltiples elementos de intersección y transmodulación.

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En efecto, nuestro conocimiento en las vías de señalización celular está desvelando la existencia de múltiples interacciones reguladas a diversos niveles. Los compleos bucles de retroalimentación positiva y negativa, la existencia de detectores de coincidencia de señal, de mecanismos de amplificación o de vías paralelas o redundantes, son elementos comunes con el diseño de circuitos por los ingenieros. Entender las propiedades, no siempre intuitivas, de estos circuitos de señalización, para poder predecir su comportamiento en diversas circunstancias fisiológicas y patológicas es hoy uno de los grandes retos de este campo.

PAPEL FUNDAMENTAL DE LAS PROTEÍNAS G COMO INTERRUPTORES MOLECULARES Como hemos comentado, los sistemas de señalización intracelular utilizan de forma generalizada las denominadas proteínas G (monoméricas o heterotriméricas) como interruptores moleculares que se activan transitoriamente. Estas proteínas pueden encontrarse en dos conformaciones espaciales diferentes: una forma inactiva, cuando unen al nucleótido GDP, y otra forma activada capaz de unirse con otras proteínas celulares denominadas efectoras, cuando une GTP (Figura 2). Pero esta activación es intrínsecamente transitoria, ya que estas proteínas son GTPasas, es decir, destruyen al cabo de un breve tiempo el GTP, transformándolo de nuevo en GDP, y vuelven así a su estado basal (6, 17).

FIGURA 2. Ciclo de las proteínas G monométricas o heterotriméricas. Estas proteínas se comportan como un interruptor molecular en cascadas de señalización, al oscilar entre dos estados conformacionales, uno inactivo y otro activo. La interacción con estimuladores de la disociación de GDP (GEF, del inglés Guanine nucleotide Exchange Factor), como los GPCR, promueve la entrada de GTP y la transmisión de la señal, necesariamente transitoria al actuar la actividad GTPasa intrínseca de las proteínas G. Este proceso de terminación de señal puede verse reforzado por su asociación a moléculas GAP/RGS. Los GDI (Guanine nucleotide dissociation inhibitors) estabilizan lan conformación basal, como el dímero Gbetagama en el caso de las proteínas G heterotriméricas.

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El encendido (intercambio de GDP por GTP) y el apagado (hidrólisis de GTP) de este interruptor molecular se puede modular por su interacción con otras proteínas. Como se ha mencionado antes, unos 1.000 genes de nuestro genoma codifican por una familia de receptores con siete dominios transmembrana, los receptores acoplados a proteína G (GPCR), que median las acciones de múltiples mensajeros, hormonas y neurotransmisores, como la adrenalina, la dopamina, la hormona estimulante del tiroides o los opiáceos (6).

Cuando estos receptores reconocen a su mensajero, cambian su conformación y pueden entonces interaccionar con la proteína G unida a GDP, lo que a su vez promueve el intercambio de GTP por GDP. La proteína G en su estado activo interacciona con efectores (como la adenilato ciclasa, fosfolipasa β, canales iónicos, etc.) modificando parámetros intracelulares que diseminan la señal extracelular (6). Este proceso es transitorio, porque la proteína G hidroliza GTP a GDP y vuelve a su conformación basal.

Muchos otros procesos celulares utilizan otro tipo de proteínas G, monom éricas, como las familias de proteínas, Ras, Rap, Rac, Rho, Rab,ARF, etc., para controlar múltiples aspectos de proliferación, diferenciación, morfología del citosqueleto o tráfico vesicular (17-21).

QUINASAS Y FOSFATASAS Otra estrategia fundamental en los procesos de comunicación celular es la utilización de procesos de fosforilación y des-fosforilación de proteínas, que pueden modificar de forma reversible la actividad de muchas proteínas celulares. La introducción de un grupo fosfato en un residuo de Serina, Treonina o Tirosina por una quinasa, o su desaparición por acción de una fosfatasa, puede modificar la conformación, la actividad, o localización de una proteína (Figura 3). La utilización conjunta de quinasas y fosfatasas permite también disponer de otro tipo de interruptores moleculares, que encienden o apagan funciones celulares. Se estima que casi un tercio de las proteínas pueden ser reguladas por esta estrategia, y en el genoma humano se han identificado más de 500 proteínas quinasas y del orden de 130 fosfatasas (2).

Muchos de los genes identificados como oncogenes (es decir, aquellos genes que mutados dan lugar a cáncer) pertenecen a estos grupos de proteínas, lo que da idea de su extraordinaria importancia fisiológica y patológica (22, 23).

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FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN Otro aspecto fundamental de los sistemas de señalización celular es su capacidad de control de la expresión génica, mediante la modificación de la actividad de los denominados «factores de transcripción». Se calcula que la regulación transcripcional se basa en al menos 2.000 de estos factores proteicos codificados en el genoma de mamíferos, que en general comparten las características de poseer un sitio de unión a secuencias reguladoras específicas en el DNA, y un dominio que le confiere potencial modulador, por su capacidad de interaccionar con otros elementos de la maquinaria transcripcional, afectando positiva o negativamente a su función. Pues bien, la expresión, localización o la actividad de estos factores de transcripción está estrictamente controlada por los sistemas de transducción, también mediante mecanismos que incluyen la fosforilación/ de fosforilación, la proteólisis, la interacción con otras proteínas o las fluctuaciones de metabolitos que actúan como segundos mensajeros (24).

FIGURA 3. La activación mediante diversos mecanismos de quinasas implicadas en se-ñalización celular (como PKA, PKC, o c-Src, entre otras) permite liberar interacciones inhibitorias y promueve la fosforilación secuencial de distintas proteínas celulares (enzimas, canales, proteínas del citoesqueleto, factores de transcripción, etc.), dando lugar a una respuesta fisiológica integrada.

EL DISEÑO MODULAR PERMITE ENSAMBLAR COMPLEJOS DE PROTEÍNAS SEÑALIZADORAS Por último, otra estrategia común en los procesos de comunicación intracelular, que también se utiliza conjuntamente con las anteriores, es la existencia de múltiples «módulos» o dominios funcionales en las proteínas transductoras de señal, que van a permitir su ensamblaje y desensamblaje transitorio en complejos multimoleculares implicados en señalización. Muchas proteínas de señalización están construidas a base de «módulos» parecidos, que tienen

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determinada capacidad de unirse unos con otros, o de reconocer determinadas señales en las células, como por ejemplo la existencia de residuos de tirosina fosforilados (módulos SH2), de secuencias ricas en prolina (módulos SH3) o de mayor concentración de derivados lipídicos del fosfatidilinositol (módulos PH) (12, 25-27). Tony Pawson, uno de los pioneros en la caracterización funcional de estos módulos, ha sugerido que esta estrategia permite generar una gran diversidad de proteínas señalizadoras a partir de distintas combinaciones de un número limitado de dominios funcionales con características comunes (Figura 4).

FIGURA 4. Principales interacciones modulares que participan en el ensamblaje de complejos de señalización En definitiva, pueden construirse sistemas de señalización muy complejos y altamente regulados, combinando las distintas estrategias de los interruptores moleculares de las proteínas G, las quinasas/fosfatasas, y los procesos de ensamblaje/desensamblaje controlado de complejos multimoleculares basados en la estructura modular de muchas de las proteínas implicadas. Por ejemplo, muchos de los denominados factores de crecimiento, mensajeros que regulan la proliferación y diferenciación de múltiples tipos celulares, son reconocidos por proteínas receptoras que, como consecuencia de este acto de complementareidad molecular, dimerizan y estimulan una actividad quinasa residente en la propia proteína receptora, que se auto-fosforila en residuos de tirosina (5). Estos aminoácidos así modificados actúan como «reclamo» de otras proteínas que poseen unos módulos funcionales denominados SH2, que reconocen específicamente tirosinas fosforiladas (en determinados contextos

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de secuencia) (27). De esta forma, se promueve un reclutamiento o ensamblaje específico de proteínas intracelulares. En muchas ocasiones, estas proteínas modulares reclutadas contienen como otra de sus piezas un factor de intercambio GTP/GDP de las proteínas G monoméricas Ras. De esta forma, la llegada del mensajero extracelular permite, en un momento y en un lugar específico, el encendido de este «interruptor molecular» en el interior de la célula. La proteína G Ras activa a su vez a otra quinasa (Raf), que entonces estimula a otra quinasa (MEK), y ésta a otra quinasa (MAPK) que finalmente se traslada al núcleo a modificar la expresión génica mediante la fosforilación de factores de transcripción que se unen a secuencias presentes en el DNA de diversos genes (28-30). Estos sistemas en cascada son muy típicos y presentan un extraordinario poder de amplificación.

En resumen, la utilización combinada de quinasas, proteína G y módulos de ensamblaje permite articular una amplia dinámica de cambios secuenciales, de modificación de la localización y actividad de proteínas celulares, característicos de los sistemas de señalización celular.

MECANISMOS DE REGULACIÓN Y DESENSIBILIZACIÓN: EL EJEMPLO DE LAS QUINASAS DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNAS G Otra característica general de los sistemas de señalización celular es su capacidad de modular las características de la respuesta a un determinado estímulo en función de las circunstancias concurrentes, de lo que podríamos llamar su «memoria de activación». Así, la respuesta de una célula a un mismo estímulo podrá ser mayor o menor si previa o simultáneamente ha recibido otro estímulo de un mensajero diferente, en lo que se denominan procesos de transmodulación. Por otra parte, se conoce como desensibilización al fenómeno biológico por el que la respuesta celular disminuye con el tiempo en presencia de un estímulo de intensidad constante. Dicho de otra forma, el sistema de alguna forma recuerda si ha sido estimulado previamente por el mismo mensajero. Esta pérdida de respuesta ante la presencia crónica de un estímulo tiene una notable importancia fisiológica y farmacológica. Estos procesos de transmodulación, desensibilización y control son un importante área de estudio actual dentro del campo de la señalización celular.

Se han investigado en profundidad en los últimos años los mecanismos de regulación de la señalización a través de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR). La estimulación de GPCR conduce, a través de su interacción con proteínas G heterotriméricas y otras proteínas celulares, a la modulación de múltiples vías de señalización intracelular. Éstas incluyen las rutas «clásicas» de segundos mensajeros controlados por adenilil ciclasas, fosfolipasas y canales iónicos y, según se está demostrando MODULO III

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más recientemente, las distintas cascadas de quinasas activadas por mitógenos y por estrés (ERK/MAPK, JNK, p38, ERK5) o la vía PI3K/Akt (6, 28, 30). Estas rutas, a través de sus efectos sobre distintos procesos celulares y sobre la transcripción génica, tienen gran importancia en el control de la proliferación, diferenciación, supervivencia o quimiotaxis.

Además de promover la activación de proteínas G, la estimulación de GPCR conduce a su interacción con unas quinasas específicas, denominadas GRKs (del inglés G protein-coupled receptor kinases), que los fosforilan en residuos intracelulares. Eso permite a su vez que se unan al receptor fosforilado las proteínas llamadas arrestinas, que evitan que el receptor se comunique con las proteínas G aunque esté presente el estímulo, esto es, promueven la desensibilización del sistema (31, 32).

La fosforilación específica del receptor (sólo en su estado activado) por la quinasas GRKs y la posterior unión de las arrestinas se ha mostrado como un mecanismo universal de regulación de la práctica totalidad de la GPCR, e incluso podría ser extensible a otras familias de receptores. Estos mecanismos de regulación utilizan las mismas estrategias (fosforilación y ensamblaje secuencial y controlado de proteínas) que las propias de la diseminación de la señal.

El trabajo de diversos grupos de investigación durante estos últimos años ha desvelado otras y muy importantes funciones adicionales para las GRKs y las arrestinas. Tras la fosforilación por GRK y la unión de arrestinas, se inicia un proceso de internalización transitoria de receptores que permite su desfosforilación y reciclaje a la membrana plasmática en forma funcional, proceso en el que GRKs y arrestinas están también implicadas, propiciando el acoplamiento de los receptores con la maquinaria endocítica mediante la unión de β-arrestinas a clatrina y a la proteína adaptadora AP-2, quizá también con la participación de la interacción de GRKs con otras proteínas celulares (33). La presencia de los GPCR en endosomas en un entorno de pH ácido propicia la acción de fosfatasas que los desfosforilan y resensibilizan o bien los conduce a degradación en lisosomas.

Se conocen hasta el momento en mamíferos siete genes para GRKs. Todas las GRKs comparten un dominio central catalítico, similar a otras serina/treonina quinasas. El dominio C-terminal es de tamaño variable, y parece facilitar su interacción con fosfolípidos y/o proteínas de membrana. El extremo N-terminal contiene señales de interacción aún no caracterizadas con GPCR, además de una región de homología a la familia de proteínas RGS (Regulators of G protein signaling). Las GRK1 y 7 se expresan fundamentalmente en la retina, GRK4 en testículos, y el resto son de expresión ubicua en el adulto, aunque con diferencias en sus niveles tisulares. De todas ellas, la isoforma GRK2 es la MODULO III

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mejor caracterizada y la que ha despertado mayor interés, por su importante papel en la regulación de diversos tipos de GPCR y sus alteraciones en diversas circunstancias patológicas (31, 32).

En lo que respecta a las arrestinas, se han descrito las arrestinas visuales, expresadas en retina, y las denominadas β-arrestina-1 y β-arrestina-2, de expresión ubicua, y cuyas diferencias funcionales se están ahora comenzando a explorar activamente (31, 33). Puesto que un número limitado de (7) GRKs y de arrestinas (3) participan en la regulación de muchos GPCR, se piensa que su función es muy importante y que deben estar finamente reguladas. Más aún, si se tiene en cuenta que, además de participar en la desensibilización, tráfico intracelular y re-sensibilización de GPCR, datos obtenidos en los últimos años indican que las GRKs y arrestinas son componentes fundamentales de las propias cascadas de señalización iniciadas por estos receptores, por su capacidad de interaccionar directamente con otras proteínas celulares, que pueden ser así atraídas al entorno del receptor.

En efecto, datos recientes indican que β-arrestina puede reclutar otras proteínas celulares al complejo de señalización de GPCR, como la tirosina quinasa c-Src, la quinasa JNK3, y componentes de la cascada Raf/MEK/Erk, lo que sugiere un papel esencial para GRKs y β-arrestina en la modulación de cascadas mitogénicas y de estrés por GPCRs. Se ha especulado que el papel de proteína «andamio» de β-arrestina permitirá la activación selectiva de MAPK en determinadas localizaciones subcelulares citoplasmáticas. Por otra parte, datos recientes indican que las funciones adaptadoras de las arrestinas podrían ampliarse. Se ha publicado que β-arrestina 1 interacciona con la proteína transductora Dishevelled, con una fosfodiesterasa de AMPc (PDE4), con el regulador del citoesqueleto Ral-GDS, o con los componentes de la cascada de señalización de NF-κB y del receptor de la insulina. También con la E3 ubiquitina ligasa Mdm2, lo que promueve la ubiquitinación de β-arrestina y de receptores β2adrenérgicos, lo que a su vez es crítico para la internalización y la degradación de esos receptores, respectivamente [revisado en (33)].

En la misma línea, resultados recientes de distintos laboratorios (incluido el nuestro) indican que GRKs, y particularmente GRK2, es capaz de interaccionar y de fosforilar otras proteínas diferentes de los GPCR, lo que amplía también, como en el caso de las arrestinas, el espectro de sus funciones celulares y plantea la necesidad de un mejor conocimiento de su red de interacciones e interconexiones funcionales (31, 32).

La proteína GRK2 se caracteriza, además de por su función quinasa, por ser una proteína con diversos dominios de unión proteína-proteína que permiten su interacción directa con moléculas relevantes en señalización, como PI3K, el MODULO III

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inhibidor de Raf1 o RKIP, la subunidad Gαq de las proteínas G, subunidades βγ de proteínas G heterotriméricas o el factor regulador de adhesiones focales GIT/Cool, entre otras. El significado funcional de estas interacciones se conoce sólo parcialmente, pero posibilita que GRK2, de modo independiente de fosforilación, modifique la actividad, localización, estabilidad o capacidad de interacción de estos factores, u otros por determinar, con sus moléculas efectoras, como el bloqueo de la interacción de PLCβ con Gαq en presencia de GRK2. Por otro lado, GRK2 tiene capacidad para fosforilar diversos sustratos diferentes de receptores de membrana, como fosducinas, sinucleinas, tubulina o el factor ribosomal P2, pudiendo modular procesos como la síntesis de proteínas o la arquitectura del citoesqueleto (31-33).

El relevante papel de GRKs y arrestinas tanto en la modulación como en las propias vías de señalización mediadas por GPCR, sugiere que cambios en la expresión y/o actividad de estas proteínas podrían afectar a la eficacia y características de las vías de transducción mediadas por GPCR y tener trascendencia fisiopatológica. De acuerdo con esa idea, se han descrito cambios en los niveles y/o en la actividad de estas GRKs, en particular GRK2, en distintas situaciones patológicas, como el fallo cardiaco congestivo, la hipertensión (aumento) o la artritis reumatoide (disminución). Estos cambios pueden contribuir al desarrollo o al desencadenamiento de estas patologías (31, 32, 34). Se han descrito numerosos mecanismos que mantienen a GRK2 inhibida, desde su estructura tridimensional en estado de conformación inactiva hasta la interacción con actinina, Ca2+/calmodulina, caveolina o proteínas del retículo, interacciones que cambian su localización subcelular e inhiben su actividad. Asimismo, la fosforilación de GRK2 por otras quinasas modula tanto la actividad catalítica frente a receptores como la localización subcelular, promoviendo su estimulación (fosforilación por c-Src y PKC) o inhibición (fosforilación por ERK1/2). Por último, diferentes mecanismos transcripcionales y de control de la estabilidad son responsables de los niveles de expresión de GRK2 (32, 34).

Nuestro grupo ha contribuido en los últimos años a desvelar estos mecanismos, habiendo establecido que la degradación de GRK2 puede contribuir a las disfunciones de GRK2 observadas en determinadas patologías y a su desarrollo, Así, hemos descrito el rápido reciclaje de GRK2 por la vía del proteasoma dependiente de ubiquitina y su estimulación por GPCR (35), lo cual permite, en condiciones crónicas de activación de receptores, preservar cierta capacidad de respuesta a subsiguientes estímulos. Este rápido reciclaje de la quinasa depende del reclutamiento de c-Src al receptor mediado por βarrestina y de la fosforilación de GRK2 por c-Src en residuos que hemos definido y que promueven su ubiquitinación y degradación (36). La fosforilación por ERK1/2 en la serina 670 de GRK2 induce también su degradación por el proteasoma (37).

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INTERCONEXIÓN DE REDES DE SEÑALIZACIÓN El concepto de que la capacidad de una célula para regular múltiples funciones de forma coordinada se basa en la organización de sus redes de señalización ha sido recientemente desarrollado por Iyengar y colaboradores (14). Las interconexiones entre vías de transducción se producen gracias a la existencia de proteínas señalizadoras capaces de recibir e integrar múltiples señales («puntos de cruce» o «junctions») o de interaccionar con múltiples efectores (puntos de dispersión de señal o «nodes»), modulando así simultáneamente diversas funciones celulares (múltiples «outputs»). Las adenilil ciclasas serían un ejemplo de proteína integradora de múltiples señales celulares, que recogen información procedente de la actividad de diversos receptores de membrana plasmática (receptores acoplados a distintas proteínas G heterotriméricas, modulación de Ca2+ intracelular a través de receptores de glutamato-NMDA o de la vía receptores tirosina-quinasa/Fosfolipasa Cγ, etc.).

Los niveles resultantes de AMPc serían un indicador del balance de señales entre las distintas vías, y a su vez modularían a la PKA, que actuaría como «nodo» por su capacidad de fosforilar y regular múltiples componentes celulares implicados en funciones diversas, como proteínas del citoesqueleto, factores de transcripción, metabolismo, etc. Otro ejemplo clásico de «nodo» serían los receptores con actividad tirosina quinasa, capaces de reclutar diversas combinaciones de proteínas transductoras implicadas en distintos procesos celulares (5). Los múltiples efectos de la activación de la vía MAPK/ERK sobre el crecimiento celular son también el resultado de las distintas acciones del «nodo» MAPK sobre la expresión génica, la síntesis de proteínas, la síntesis de nucleótidos, o el control del ciclo celular (vía el ensamblaje de complejos ciclina D1-CdK4) (38). Es importante también destacar que las funciones de «junction» y «node» pueden coexistir en una misma proteína.

Así, proteínas G monoméricas como cdc42 pueden ser activadas por diversos tipos de receptores, y a su vez interaccionar con varios efectores que regulan la migración celular (vía PAK), la transcripción génica (vía el factor de respuesta al suero SRF), o la traducción de proteínas (vía la S6-quinasa) (14).

Una posible conclusión desconcertante de los recientes estudios sobre vías de transducción seria que toda una serie de caminos de señalización «fundamentales» (las diversas cascadas secuenciales de quinasas que confluyen en MAPK/ERK1/2, JNK, p38, Erk5, etc.; la actividad PI3K; la vía NFkB; los niveles intracelulares de calcio y AMPc) son modulados por una gran cantidad de tipos de receptores que, sin embargo, son capaces de producir respuestas celulares específicas. Esto plantea el problema de entender cómo MODULO III

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se genera especificidad en la señal, probablemente una «especificidad combinatorial», es decir como reflejo de una combinación particular de grados de modulación de las diversas cascadas de señalización. Los procesos concretos implicados (proteínas de anclaje y de andamio que permiten el ensamblaje diferenciado de proteínas transductores, los mecanismos de consolidación de la señal y la existencia de umbrales de señalización) son un campo futuro de trabajo de gran interés y dificultad.

IMPORTANCIA FISIOPATOLÓGICA Y FARMACOLÓGICA SISTEMAS DE SEÑALIZACIÓN CELULAR

DE

LOS

Muchas situaciones patológicas se derivan de un funcionamiento alterado (excesivo o disminuido) de los sistemas de comunicación celular. A su vez, múltiples fármacos actúan modulando las cascadas de señalización a diferentes niveles (39, 40). El cáncer, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares, los procesos neurodegenerativos o inflamatorios cursan con alteraciones en sistemas de señalización celular, ya sea por cambios en los niveles de mensajeros, en el número o la funcionalidad de los receptores o de los distintos componentes de las cascadas de transducción, o en una mezcla de estos motivos.

En ocasiones pueden producirse alteraciones genéticas que lleven a una señalización constitutiva e independiente del factor extracelular. Este tipo de alteraciones afectan fundamentalmente a aquellas moléculas que regulan positivamente las rutas de señalización. Por otro lado, pueden producirse alteraciones genéticas que eliminen la función de una proteína concreta, bien debido a la pérdida del gen respectivo o a mutaciones puntuales que creen problemas en la expresión de una proteína o en su actividad biológica (22, 23).

Este tipo de disfunciones afectan a moléculas que actúan como reguladoras negativas de las cascadas de señalización. El ejemplo más prototípico de estas disfunciones moleculares es el cáncer, una enfermedad que se origina como consecuencia de la desregulación de las cascadas de señalización que modulan la proliferación celular, la diferenciación celular, la detección/reparación de daño genético, y el proceso de apoptosis.

Ahora sabemos que esta patología se debe a la acumulación de mutaciones que determinan bien la activación constitutiva (en el caso de los oncogenes) o la inactivación (en el caso de los genes supresores de tumores) de proteínas implicadas en la señalización celular. El resultado son rutas de señalización constitutivamente activas, que dan órdenes continuas de proliferación celular sin posibilidad de control externo (22, 23, 40).

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VÍAS DE SEÑALIZACIÓN RELACIONADAS CON ONCOGÉNESIS El repertorio de vías de transducción implicadas en cáncer es creciente, y sólo pretendo aquí enumerar algunas de ellas, para dar idea de su diversidad y potenciales interacciones. Receptores con actividad tirosina-quinasa (RTKs)..Los RTK median las acciones de múltiples factores que controlan el crecimiento y la diferenciación celular (5), y sus cascadas de señalización concentran un número muy elevado de oncoproteínas. La activación incontrolada de estas vías puede producirse por sobreexpresión del propio factor de crecimiento (PDGFs, FGFs, entre otros); por mutaciones, fusiones o deleciones en los propios receptores que conducen a su dimerización y/o activación constitutiva de su dominio citoplásmico catalítico (por ejemplo, mutaciones en Neu/Erb2 o en el receptor de CSF-1, las fusiones Tel.PDGFβR o RIαPKA-Ret); o por la sobreexpresión o amplificación del receptor, como sucede con el receptor HER-2, cuyos niveles están aumentados en el 25-30% de los tumores de mama [ver revisiones (22, 23, 41)].

Este tipo de receptores desempeña también un papel importante en metástasis y angiogénesis. Así, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y su receptor (Met) son importantes en la motilidad e invasividad de células epiteliales y endoteliales. Por otra parte, muchos tumores sólidos producen el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) en respuesta a hipoxia, lo que es crítico para la angiogénesis característica de esas situaciones (42).

Proteínas adaptadoras, transductoras y moduladoras de RTKs..La desregulación de los procesos de proliferación y diferenciación celular puede tener también su origen en cambios en la expresión o actividad de proteínas citosólicas adaptadoras que conducen la señal de RTKs, como ShC, Nck o Crk. Las alteraciones en la familia de tirosina quinasas citosólicas tipo Src, generalmente por pérdida de alguno de sus mecanismos autoreguladores, son también muy importantes por sus repercusiones en el control del ciclo celular, la adhesión celular, la supervivencia y la angiogénesis (43). También la alteración de proteínas reguladoras negativas de RTKs, como Cbl (implicada en la ubiquitinación y degradación de RTKs y tirosina quinasas citosólicas) puede promover transformación celular (44).

Proteínas G monoméricas de las familia ras y rho/rac/cdc42..El papel central de Ras en muchas vías de señalización celular hace que diversos tipos de alteraciones relacionadas con ella estén implicadas en el desarrollo de tumores (20, 22, 23). Son frecuentes las mutaciones constitutivamente activas de HRas, K-Ras y N-Ras, y las alteraciones en sus proteínas activadoras Ras-GEF (intercambiadores de GDP por GTP), en sus proteínas atenuadoras Ras-GAP (que incrementan su actividad GTPásica), o en proteínas efectoras de ras (raf y la cascada MEK/ERK 1/2, PI3K, PKC-ZETA, etc.) también están implicadas en MODULO III

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tumorogénesis. Aunque se conoce en menor detalle, lo mismo sucede para la familia rho/rac/cdc42, habiendo sido caracterizadas como onco proteínas formas mutantes de factores de intercambio de nucleótidos específicos, como Dbl, Vav, Lbc y un largo etcétera.

Es importante destacar aquí las importantes conexiones entre esa familia de proteínas y el control del citoesqueleto, en el contexto de los importantes cambios en la expresión de proteínas del citoesqueleto y en la desorganización del citoesqueleto de actina que tiene lugar en las células transformadas, y la relación de esos sucesos con la capacidad de las células tumorales para crecer de forma independiente de adhesión a sustrato.

Vías de señalización mediadas por PI3K..La modulación de la actividad de distintas isoformas de PI3K es una diana habitual en las vías de señalización de numerosos RTKs y de otros tipos de receptores (45, 46). Los productos de la actividad PI3K modulan una gran variedad de efectores celulares, entre los que destaca la serina/treonina quinasa Akt/PKB. Esta vía está implicada en el control de la proliferación, supervivencia y migración celular, mediante la acción de PKB sobre dianas como GSK3, Bad o factores de transcripción antiapoptóticos de la familia Forkhead (47). De acuerdo con ese papel, el oncogen v-Akt es un potente agente transformador. Es interesante mencionar que la inactivación de la subunidad catalítica p110 gamma de PI3K da lugar al desarrollo de adenocarcinomas colorectales invasivos en ratones (48).

Por otra parte, la proteína encargada de inactivar los productos de la PI3K, la fosfatasa de lípidos PTEN, es un potente gen supresor de tumores, que es uno de los que aparece delecionado o mutado con más alta frecuencia en diversos tipos de cáncer (49).

Receptores acoplados a proteínas G heterotriméricas..La numerosa familia (más de 1.000 miembros) de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) se ha relacionado habitualmente con la modulación de vías de segundos mensajeros «clásicos», como el calcio o el AMP cíclico, y sólo recientemente se está prestando atención a su capacidad de regular la proliferación, diferenciación y supervivencia celular (6, 28, 30). Además de la capacidad de AMPc de transmodular diversas vías mitogéncias, tanto a través de PKA como directamente modulando intercambiadores de nucleótidos de proteínas G monoméricas, se une un creciente abanico de mecanismos que conectan GPCR con caminos «típicos» de RTKs mencionados más arriba, como las vías ERK/JNK/p38, o la activación de PI3K o de la tirosina quinasa citosó- lica Src (6).

La migración de células tumorales y el fenómeno de metástasis comparten similitudes con el tráfico de leucocitos, regulado por quimioquinas y sus receptores. Recientemente, se ha descrito que la expresión específica de MODULO III

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receptores de quimioquinas en células tumorales es un evento esencial que conduce a la invasión celular y metástasis de esas células tumorales de forma órgano-específica y dependiente de quimioquinas y sus correspondientes receptores, sugiriendo un papel relevante para los mismos en la invasividad celular (50).

Vía de JAK-STAT..La vía de señalización JAK-STAT desempeña un papel esencial en mediar las acciones de citoquinas y factores como el factor de crecimiento, y comparte en su estrategia de señalización muchos elementos con la de RTKs (51). Estas cascadas regulan muchos aspectos críticos del crecimiento, diferenciación y supervivencia celular, y su des-regulación es frecuente en muchos tumores primarios, como los linfomas de células T (52).

Vía de señalización de TGF-ß..Existen sólidas evidencias del papel del receptor de TGFß, a través de los moduladores de transcripción denominados Smads, como supresores de tumores (53). Esta función supresora está alterada en diversos tipos de cáncer debido a mutaciones en el propio receptor de TGFß, en las proteínas Smad 2 o Smad 4, o en otros componentes de la vía de transducción. Sin embargo, se ha observado que TGFß puede también exacerbar el fenotipo maligno en ciertas situaciones experimentales, así como promover migración y metástasis nduciendo transiciones epitelio/mesénquima (53).

Otras vías implicadas..Diversas cascadas de transducción inicialmente identificadas por su papel en desarrollo embrionario, como las vías Wnt/Wingless, Hedgehog/Patched o Notch, parecen desempeñar un papel importante en el control de la diferenciación y proliferación celular en el adulto (54, 55). Por otra parte, es de gran relevancia para los procesos tumorogénicos el adecuado control de la adhesión celular, en la que la expresión de cadherinas y cateninas y los contactos célula-célula desempeñan un papel clave. La expresión de E-cadherina está frecuentemente disminuida en células tumorales, donde también aparecen mutaciones en este gen. Datos recientes sugieren que la expresión de E-cadherinas estar ía regulada por el factor de transcripción Snail, lo que refuerza la relación entre la transición epitelio/mesénquima y la capacidad migratoria y Los procesos tumorogénicos y metastáticos.

PATOLOGÍAS CARDIOVASCULARES Los receptores acoplados a proteínas G median las acciones de mensajeros esenciales para la función del sistema cardiovascular. En efecto, la activación de receptores α y β-adrenérgicos, angiotensina II o endotelina, desempeña un papel central en la regulación de la contractilidad cardiaca, de la resistencia vascular, en el desarrollo del sistema cardiovascular o en el crecimiento y MODULO III

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remodelación de los diversos tipos celulares cardiovasculares. Estos receptores y sus sistemas de transducción constituyen la diana de múltiples fármacos utilizados en el tratamiento del fallo cardíaco congestivo, la angina de pecho, o la hipertensión, enfermedades muy frecuentes y que constituyen un objetivo sanitario de primer orden (58-61). Todos estos receptores tienen en común que están regulados por GRKs y arrestinas. Puesto que, como se ha comentado, los niveles de ciertas GRKs están aumentados en fallo cardiaco congestivo, isquemia miocárdica, hipertrofia ventricular o hipertensión, es evidente el interés de investigar por qué se producen esos cambios y su repercusión funcional en la patogenia y evolución de diferentes cardiopatías.

Diferentes estímulos patofisiológicos tales como infarto de miocardio, hipertensión, enfermedades de las válvulas cardiacas, miocarditis viral o cardiomiopatía dilatada pueden provocar un aumento en la carga hemodinámica en corazón. Ello genera una respuesta hipertrófica adaptativa de los miocitos cardiacos que se caracteriza por un aumento de la masa y el volumen de cada célula individual y por la alteración del patrón de expresión génica. Como consecuencia se producen cambios en la batería de proteínas contráctiles y se activa la inducción de un programa de expresión de genes embrionarios, no expresados en condiciones normales. Si el estrés hemodinámico persiste, el corazón sobrecargado entra en una fase crítica de transición desde una hipertrofia compensatoria a un fallo cardiaco.

Las situaciones de fallo cardiaco ponen en marcha mecanismos compensatorios del sistema simpático, que aumenta la estimulación adrenérgica, lo que a su vez promueve la desensibilización de los receptores adrenérgicos (posiblemente potenciada por el incremento en GRKs) y una disminución selectiva en el número de receptores β1-adrenérgicos, ya que los niveles de β2AR no se encuentran tan alterados. Este desaco plamiento de receptores β1-adrenérgicos de proteínas G puede a su vez facilitar su acoplamiento a otras vías de señalización, como MAPK. Por otra parte, diversos receptores acoplados a proteínas Gαq (α1- AR, endotelina 1, angiotensina II) son capaces de promover un fenotipo hipertrófico tanto en modelos celulares como in vivo. Consistentemente, ratones transgénicos que sobreexpresan Gαq o formas constitutivamente activas de esta proteína desarrollan cardiomiopatía dilatada y fallo cardiaco. La señalización mediada por Gαq pone en marcha diversas vías intracelulares que podrían contribuir a este fenotipo, como la estimulación de PKC, de diversos módulos de quinasas mitogénicas y de estrés (Erk ½; JNK/p38; Erk5) y la activación de factores de transcripción de la familia MEF-2 y calcineurina.

Datos recientes también señalan la importancia de la ruta PI3K/PTEN en el desarrollo y el mantenimiento de hipertrofia cardiaca (58-62).

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OTRAS PATOLOGÍAS En otras muchas enfermedades se encuentran alterados los niveles de mensajeros y/o las rutas de señalización que controlan. La diabetes, por ejemplo, es resultado de reducidos niveles de la insulina, mensajero clave en el control de la glucosa plasmática (diabetes tipo I) o de una reducida eficacia de la cascada de señalización de la insulina (diabetes tipo II) (63). En patologías cardiovasculares, existen, como ya he comentado, aumentos en los niveles de mensajeros como catecolaminas, angiotensina o endotelina, que alteran a su vez el normal funcionamiento y crecimiento de tipos celulares cardiovasculares, y pueden conducir a hipertrofia cardiaca y a fallo cardiaco. En la enfermedad de Parkinson, la degeneración de las neuronas de determinada zona del cerebro disminuye los niveles del neurotransmisor dopamina.

Es interesante también señalar que diversos patógenos utilizan rutas de señalización para causar sus efectos. Así, la toxina colérica, «estropeando» el interruptor molecular de la proteína Gs de las células del epitelio intestinal, inhibiendo su actividad GTPásica y dejándola irreversiblemente en su estado activo, lo que altera el tráfico de iones y líquido a través del intestino y promueve la deshidratación y diarrea típicas de la infección con Vibrio cholera.

Otras toxinas bacterianas, como la pertúsica (causante de la tos ferina), o la botulínica, tienen como dianas otras proteínas G (Gi heterotrimérica y proteínas Rho monoméricas, respectivamente).

Otras bacterias, como Salmonella o Yersinia, y distintos virus (SIDA, herpes, Epstein-Bar, etc.) han desarrollado o tomado evolutivamente moléculas de señalización (en algunos casos versiones truncadas o alteradas constitutivamente) que les permiten controlar a su gusto las rutas biológicas de las células que infectan, facilitando su internalización, proliferación, o la evasión del sistema inmune.

DIANAS DE FÁRMACOS El mejor conocimiento de los procesos de señalización implicados y alterados en los distintos procesos fisiológicos y patológicos permite también utilizarlos como dianas de fármacos. La idea básica es aprovechar la gran capacidad de control de las funciones celulares de estos sistemas para modificarlas de la forma más eficaz y específica posible (39-41, 62). En algunos casos, la estrategia consiste en modular exógenamente los niveles de mensajero, bien para evitar su carencia, como sería el caso de la administración de insulina, o para evitar que se produzca en exceso, como la aspirina y los inhibidores de ciclooxigenasas de nueva generación, que evitan la excesiva síntesis de los mensajeros denominados prostaglandinas y de otros derivados del ácido araquidónico, controlando así procesos inflamatorios.

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En otros casos, se administran compuestos químicos capaces de unirse con gran afinidad a los mismos receptores que los mensajeros endógenos, consiguiendo así mimetizar (agonistas) o impedir (antagonistas) su acción. Por ejemplo, agonistas de receptores beta2-adrenérgicos son eficaces broncodilatadores; antagonistas beta1-adrenérgicos se utilizan para el tratamiento de la hipertensión; antagonistas del receptor H2 de la histamina inhiben la excesiva secreción gástrica; agonistas de receptores de opiáceos, como la morfina, se utilizan como analgésicos, etc.

Todos estos últimos son ejemplos de fármacos moduladores de distintos miembros de la gran superfamilia de receptores de membrana, denominados receptores acoplados a proteínas G, de los que ya hemos hablado, y de los que se estima que existen del orden de 1.000 en los genomas de vertebrados, aunque hasta ahora en humanos sólo se conocen los mensajeros endógenos y la función fisiológica esencial de unos 160. Más del 50 por ciento de los fármacos actualmente en el mercado tienen como diana miembros de esta familia de receptores, lo que da idea de su importancia actual y futura.

La identificación de los procesos biológicos en los que participan los receptores aún «huérfanos» (es decir, de los que se conoce el gen, pero de los que se ignora la función que controlan y el mensajero endógeno) y de posibles ligandos moduladores es un reto muy atractivo en el inmediato futuro (6).

La modulación farmacológica de los sistemas de señalización celular puede, además, realizarse a otros niveles distintos de la interacción receptormensajero. Se trata en este caso de interferir específicamente en las actividades de componentes clave de la cascada de señalización intracelular.

Así, puede controlarse la desaparición de segundos mensajeros, como los inhibidores de fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos (estrategia de fármacos tipo Viagra, por ejemplo).

Un campo de enorme interés es el de las enzimas que fosforilan (quinasas) o desfosforilan (fosfatasas) a otras proteínas, que es, como se ha mencionado, una estrategia ampliamente utilizada en biología para modificar temporalmente su actividad, localización o estabilidad. Fármacos inmunosupresores empleados para evitar el rechazo a órganos transplantados, como la ciclosporina, son inhibidores de una proteína fosfatasa modulada por calcio, denominada calcineurina. En el caso de las quinasas, un área experimental muy activa (con varios ensayos en fases I a III) es la búsqueda de inhibidores de tirosina quinasas asociadas a receptores de factores de crecimiento relacionados con el cáncer (40, 41). Muy recientemente, el mejor conocimiento del papel celular y de la estructura de una tirosina quinasa denominada Abl ha conducido al descubrimiento de un nuevo fármaco, denominado Glivec, que ya MODULO III

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ha demostrado ser de gran eficacia en el tratamiento de cierto tipo de leucemia y de cáncer. En definitiva, el estudio del campo de la comunicación celular va a ser clave en el futuro para la identificación de nuevas dianas terapéuticas.

RETOS FUTUROS Para avanzar en esta formidable tarea será necesario, sin duda, un mejor conocimiento de las redes de interacción funcional entre genes y proteínas, y de su control por los sistemas de señalización celular. Tendremos que entender mejor cómo se genera especificidad y complejidad en las distintas cascadas de transducción de señal, comprender cómo la célula integra las distintas señales que recibe en el tiempo; los patrones de localización subcelular de los mensajes generados, las fluctuaciones espacio-temporales de la señal, o qué determina la amplitud y la duración de la activación de los sistemas de señalización celular (1). También debemos tener en cuenta que las células en el organismo y las que están alteradas en patologías no están aisladas. Por ejemplo, los procesos cancerosos son el resultado de un conjunto de interacciones entre las células transformadas y otros tipos celulares. Por lo tanto, hay que intentar resolver la situación de ese conjunto integrado, considerando todas las interrelaciones relevantes, procurando desarrollar los adecuados sistemas experimentales.

Este conocimiento más profundo del «interactoma» celular debe ir acompañado de otras estrategias. Es fundamental la información sobre los genes que son críticos para modificar el estado fisiológico normal y provocar la patología. Para identificarlos existen dos grandes aproximaciones: los estudios de asociación genética, cuando puedan establecerse claramente en humanos; y los estudios de modificación de la expresión génica en modelos animales mediante disrupción o modificación génica, o las nuevas tecnologías de RNA de interferencia. En la actualidad, tras la secuenciación del genoma del ratón y de otros organismos modelo, hay programas de investigación muy activos para variar la expresión de todos los genes de una manera sistemática, y ver cuál es su repercusión a nivel de fenotipo, dando así idea de cuál es la función fisiológica relevante de estos genes. Este es un reto muy importante, porque supone ser capaces de llegar a una caracterización fenotípica en profundidad de los modelos animales, lo que requiere instalaciones, personal y metodología adecuada.

Actualmente, la mayor parte de la información sobre la función génica, y sobre la posible utilidad como diana terapéutica de determinados genes, se basa en la utilización de modelos experimentales, como son cultivos celulares, modelos animales de enfermedades, y la modificación de expresión génica en distintas especies modelo. Sin embargo, desde un punto de vista crítico, hay que plantearse hasta qué punto son sistemas que reflejan adecuadamente la MODULO III

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complejidad de la fisiología y de la patología humana. Para sacar el mayor partido posible a esta información tendremos que conocer, cada vez mejor, los cambios concretos en la expresión génica y las alteraciones fenotípicas reales asociadas a las patologías humanas, utilizando para este objetivo las nuevas metodologías genómicas.

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PROGRAMA DE ACTUALIZACIÓN PROFESIONAL

Desarrolle el siguiente cuestionario y entréguelo a nuestras coordinadoras académicas o envíelo a nuestras oficinas de enlace académico a nivel nacional.

CUESTIONARIO III

1. ¿Explique la acción de los Receptores Acoplados a Proteínas G (GPCR)?.

2. ¿Explique la acción de los Receptores enzimáticos?

3. ¿Explique la acción de los Receptores nucleares?

4. ¿Explique la acción de los Receptores ionotrópicos?

5. ¿Comente brevemente las implicaciones fisiopatológicas de los mecanismos de señalización celular?

MODULO III

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