Український біохімічний журнал №4, 2012

ISSN 0201–8470

УКРАЇНСЬКИЙ

Індекс 74497

БІОХ­ІМІЧНИЙ

ЖУРНАЛ

20­­12, том 84, № 4

У К РАЇ НС Ь К ИЙ БІ ОХ І­ МІ ЧН И Й ЖУР Н АЛ , 2 01 2 , том 8 4 , № 4

­­ THE UKRAINIAN BIOCHEMICAL JOURNAL УКРАИНСКИЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

ISSN 0201—8470. Укр. біохім. жур­­н. 2012. Т. 84, № 4­­­. 1—124

Н ау к о в и й

журнал

• З ас н о ва н и й 1 9 2 6

р.

• В и ход и т ь

о д и н ра з н а д в а м і с я ц і

національна АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

УКРАЇНСЬКИЙ БІОХІМІЧНИЙ ЖУРНАЛ УКРАИНСКИЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ THE UKRAINIAN BIOCHEMICAL JOURNAL Том 84, № 4, липень-серпень, 2012

Київ

Зм іст огляди Жерносеков Д. Д., Юсова Е. И., Гриненко Т. В. Роль плазминоген/плазмина в функционировании клеток крови .................................................................. 5

Експериментальні роботи Родрігес Р. Р., Лущик І. С., Оболенська М. Ю. Стехіометрична модель фолатзалежного метаболізму одновуглецевих груп у плаценті людини ........... 20 Драгущенко О. О. , Міня І. Й., Полєжаєва Т. А., Старосила Д. Б., Карпова І. С., Оболенська М. Ю., Рибалко С. Л. Вплив противірусних речовин різної хімічної природи на експресію генів ІФНα, ПКР, ОАС1а i РНК-ази L ..................................................................................................................................................... 32 Semchuk N. M., Vasylyk Yu. V., Lushchak Ok. V., Lushchak V. I. Effect of short-term salt stress on oxidative stress markers and antioxidant enzymes activity in tocopherol-deficient Arabidopsis thaliana plants ..................................................................................... 41 Левчук Н. І., Пушкарьов В. М., Ковзун О. І., Микоша О. С., Гула Н. М., Тронько М. Д. Вплив N-стеароїлетаноламіну на інтенсивність фрагментації ДНК у пухлинній та позапухлинній тканинах кори надниркових залоз людини ...................................................................... 49 Мединська К. О., Нурищенко Н. Є., Пелюх Л. І., Шелюк О. В.

ATP-азна активність актоміозинового комплексу скелетних м’язів кроля за дії ультразвуку ................ 54 Ґудзь Є. А., Гула Н. М., Хмель Т. О., Горідько Т. М., Башта Ю. М., Панчук Р. Р., Стойка Р. С., Рябцева А. О., Заіченко О. С. Антитоксичні ефекти N-стеароїлетаноламіну в суспензії та у складі нанокомпозитного комплексу в органах мишей з карциномою Льюїс за введення доксорубіцину .......................................... 61

© Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, 2012

Короткі повідомлення Захарян Г. В. Изменения содержания гликолипидов, сфингозина и цитокинов в головном мозгу крыс при его экспериментальном отеке ................................................................................................................ 70

Методи Шевченко В. Б., Даценко А. И., Шаблыкин О. В., Осадчук Т. В., Ляхов А. М., Пивоваренко Ю. В., Макара В. А. Определение АФК в присутствии биологически активных веществ по флуоресценции пористого кремния ................................................................................................................. 74

Математичне моделювання біохімічних процесів Бобровник С. А., Демченко М. А., Комисаренко С. В. Новый подход в определении аффинности двухвалентных антител методом поверхностного плазмонного резонанса. Теория ................................................................................................ 79

Історія біохімії Комісаренко С. В., Виноградова Р. П., Данилова В. М. Лауреати премії НАН України імені Палладіна Олександра Володимировича 1977–1978 рр. .............. 88

Тези доповідей конференції молодих учених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2012» Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, травень, 2012 р., Київ ............................................. 97

2

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

CON T E N Ts Surveys Zhernossekov D. D., Yusova E. I., Grinenko T. V. Role of plasminogen/plasmin in functional activity of blood cells ........................................................................... 5

Experimental Works Rodriguez R. R., Lushchyk I. S., Obolenska M. Yu. Stoichiometric model of folate-dependent metabolism of one-carbon units in human placenta ....................... 20 Dragushchenko О. O., Minia I. I., Poliezhaeva T. A., Starosyla D. B., Karpova I. S., Obolenska M. Yu., Rybalko S. L. Influence of chemically different antiviral substances on the expression of IFNα, PKR, OAS1a and RNAse L genes .......................................................................................................................................... 32 Semchuk N. M., Vasylyk Yu. V., Lushchak Ok. V., Lushchak V. I. Effect of short-term salt stress on oxidative stress markers and antioxidant enzymes activity in tocopherol-deficient Arabidopsis thaliana plants ..................................................................................... 41 Levchuk N. I., Pushkarev V. M., Kovzun O. I., Mikosha A. S., Gula N. M., Tronko M. D. Effect of N-stearoylethanolamine on the DNA fragmentation intensity in tumour and extratumoral tissues of the human adrenal cortex ............................................................................................. 49 Medynska K. O., Nurishchenko N. Ye., Pelyukh L. I., Shelyuk O. V. ATPase activity of rabbit skeletal muscles actomyosin complex under ultrasound effect .................................... 54 Goudz I. A., Gula N. M., Khmel T. O., Goridko T. M., Bashta Y. M., Panchuk R. R., Stoika R. S., Ryabtseva A. A., Zaichenko O. S. Antitoxical effects of N-stearoylethanolamine in suspension and in nanocomposite complex in the organs of mice with the lewis carcinoma under doxorubicin administration ........................................... 61

Brief Notes Zakaryan G. V. Changes in content of glycolipids, sphingosine and cytokines in the rat brain with experimental edema ........ 70

Methods Shevchenko V. B., Dacenko O. I., Shablykin O. V., Osadchuk T. V., Lyakhov A. M., Pivovarenko Y. V., Makara V. A. Estimation of the ros in the presence of biologically active substances by porous silicon fluorescence ..................................................................................................................................... 74

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

3

Mathematical Modeling of Biochemical Processes Bobrovnik S. A., Demchenko M. O., Komisarenko S. V. New approach in evaluating affinity of bivalent antibodies by the method of surface plasmon resonance. Theory ......................................................................................................................................... 79

The History of Biochemistry Komisarenko s. V., Vynogradova R. P., Danilova V. M. Laureates of the O. V. Palladin Prize of NAS of Ukraine of 1977-1978 ............................................................... 88

Theses of reports of the Conference of Young Scientists Urgent Problem of Biochemistry and Biotechnology – 2012 Palladin Institute of Biochemistry of the National Acsdemy of Sciences of Ukraine, May, 2012, Kyiv ............................................................................................................................................................ 97

4

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

огл яди УДК 577.151.6:612.115

Роль плазминоген/плазмина в функционировании клеток крови Д. Д. Жерносеков, Е. И. Юсова, Т. В. Гриненко Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев; e-mail:grinenko@biochem.kiev.ua

В обзоре представлены сведения о структурных особенностях плазминоген/плазминовой молекулы, определяющих специфичность межмолекулярных взаимодействий и обеспечивающих многообразие ее биологических функций. Приведены основные принципы современной классификации плазминогеновых рецепторов и факторы, влияющие на их экспрессию. Рассмотрены механизмы, регулирующие образование и активность плазмина на поверхности клеток, фибрина и протеинах экстрацеллюлярного матрикса. Обобщены данные литературы и результаты исследований авторов о влиянии плазминоген/ плазмина на процесс агрегации тромбоцитов, индуцируемый различными агонистами. Обсуждаются вопросы участия плазминоген/плазмина в атерогенезе и ангиогенезе, опосредуемых рецепторами эндотелиоцитов. Особое внимание уделено провоспалительной функции плазминоген/плазмина, которая реализуется через регуляцию процессов активации, секреции, миграции и апоптоза моноцитов и макрофагов. К л ю ч е в ы е с л о в а: плазминоген, плазмин, лизинсвязывающие участки крингловых доменов, плазминогеновые рецепторы, клетки крови, агрегация тромбоцитов, клеточный сигналинг, ангиогенез, воспаление.

П

лазминоген/плазминовая система обес­ печивает растворение фибриновых сгустков и поддерживает гемостатический баланс крови. В последние два десятилетия развитие технологии инактивации генов, выведение трансгенных мышей с дефицитом определенных протеинов и большой экспериментальный материал, накопленный при работе с различными линиями клеток, позволили установить, что эта система выполняет в организме различные функции в нормальных

и патологических условиях и принимает участие в таких процессах, как ремоделирование тканей, репродукция, ангиогенез, воспаление, инвазия опухолевых клеток и др. (рис. 1). Сериновая протеиназа плазмин (3.4.21.7) в организме находится в виде неактивного зимогена плазминогена, который может быть трансформирован в активный энзим плазмин эндогенными активаторами: тканевой активатор играет доминирующую роль в процессе фибринолиза, тогда как урокиназа – в акти-

Список сокращений: 6-АГК – 6-аминогексановая кислота; К – крингловый домен; к.е. – казеинолитическая единица; AG490 – (α-циано-(3,4-дигидрокси)-N-бензилциннамид); α2-APm – α2-антиплазмин; АР-1 – активирующий протеин-1; аpoLp(a) – аполипопротеин а; AMCA – транс-4-аминометил-циклогексановая кислота; ATF2 – активирующий фактор транскрипции-2; EMSA – метод сдвига электрофоретической подвижности; FACS – метод сортировки активированных флюоресценцией клеток; FMLP – формил-метионил-лейцил-фенилаланин; c-Fos – протеин Fos-семейства; Fos B – протеин Fos-семейства; c-JAK – янус киназа; Jun – протеин Jun-семейства; IKK – киназа IκB; IκB – ингибитор κB; IL – интерлейкин; LBS – лизин-связывающий сайт; MAPK – митогенактивируемая протеинкиназа; NF-κB – ядерный фактор κB; PAI‑1 – ингибитор активатора плазминогена I типа; PAR – рецепторы, активируемые протеиназами; SB203580 – 4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфонилфенил)-5-(4-пиридил)1Н-имидазола;. STAT – преобразователь сигнала и активатор транскрипции; t-МСР-1 – моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1; TF – тканевый фактор; TNF-α – фактор некроза опухоли-α; tPA – тканевый активатор плазминогена.

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

5

Огляди

Рис. 1. Схема образования плазмина и его участия в различных биологических процессах [1]

Рис. 1

вации межклеточного протеолиза. Активность плазминоген/плазминовой системы контролируется различными ингибиторами. Фибринолиз и межклеточный протеолиз с участием плазмина зависят от образования молекулярных ансамблей плазминогена и его активаторов на фибрине и мембраносвязанных протеинах поверхности клеток. В обоих случаях связывание плазминогена приводит к его концентрированию на нерастворимых поверхностях, изменению конформации и вследствие этого к ускорению активации и увеличению локальной энзиматической активности. Плазмин, образованный на фибрине или клеточной поверхности, защищен от действия основного ингибитора α2-APm, что позволяет ему проявлять протеолитическую активность в микроокружении, богатом ингибиторами. Связывание плазминогена с клеточными рецепторами, также как и их экспрессия, регу-

6

лируется многими факторами: протеиназами, гормонами, цитокинами, внутриклеточной концентрацией ионов кальция, аффинностью рецептора к лиганду, влиянием модуляторных протеинов на участки связывания в молекуле плазминогена и на рецепторах. В последнее время накапливается все больше экспериментальных данных об участии плазминоген/ плазмина в функциональной активности клеток, которое реализуется через сигнальные внутриклеточные пути. Целью данной работы является обобщение новых сведений о структурных особенностях участков распознавания в молекуле плазминогена, разнообразии рецепторов плазминогена и возможных механизмах регуляции плазминоген/плазмином функциональной активности клеток крови – тромбоцитов, моноцитов и эндотелиальных клеток.

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

Рис. 1

Огляди

Рис. 2 индуцированной плазмином активации сигнальных путей – NF-κB, JAK/STAT и p28/ Рис. 2. Схема AP-1 [93] масштабной активации моноцитов, начиная от стимуляции биосинтеза липидных медиаторов до экспрессии генов. Итак, плазмин, вызывая полномасштабную активацию моноцитов человека, включаю­ щую высвобождение липидных медиаторов, хемотаксис, индукцию цитокинов и тканевого фактора, является патофизиологическим стимулом, задействованным в распространении воспалительного процесса. Таким образом, плазминоген/плазминовая система помимо фибринолитической выполняет в организме и другие физиологические и патологические функции, реализуемые путем взаимодействия зимогена с рецепторами клеток и регуляцией их активности. Генерируемый на поверхности клеток плазмин непосредственно или через активацию матриксных металлопротеиназ вовлекается в процессы межклеточного протеолиза, тем самым участвуя в миграции клеток. Активируя или освобождая факторы роста, он влияет на пролиферацию эндотелиоцитов, стимулируя процессы ангиогенеза. Плазминоген, связываясь с различными протеинами-рецепторами на поверхности клеток, может модулировать межклеточные взаимодействия, влияя на адгезию моноцитов или агрегацию тромбоцитов и 16

нейтрофилов. Плазминоген/плазмин участвует в распространении воспалительного процесса. Активируя рецепторы моноцитов, плазмин запускает множественные сигнальные пути клетки, приводящие к экспрессии генов и индукции цитокинов. Межмолекулярные взаимодействия плазминоген/плазмина обес­ печиваются структурными отличиями лиганд­ связывающих участков крингловых доменов и конформационной изменчивостью молекулы. Дальнейшие исследования процессов с учас­ тием плазминоген/плазмина в системе гемостаза будут направлены на решение проблем, связанных с тромбогенезом, онкогенезом и ангиопатиями. Роль плазміноген/плазміну у функціонуванні клітин крові Д. Д. Жерносєков, О. І. Юсова, Т. В. Гриненко Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ; e-mail:grinenko@biochem.kiev.ua

В огляді представлено дані про структурні особливості плазміноген/плазмінової молекули, що обумовлюють специфічність ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

Д. Д. Жерносеков, Е. И. Юсова, Т. В. Гриненко

міжмолекулярних взаємодій та визначають різноманітність її біологічних функцій. Наведено основні принципи сучасної класифікації плазміногенових рецепторів та фактори, що впливають на їх експресію. Розглядаються механізми, що регулюють утворення та активність плазміну на поверхні клітин, фібрину та протеїнах екс­ трацелюлярного матрикса. Узагальнено дані літератури та власних досліджень авторів стосовно впливу плазміноген/плазміну на агрегацію тромбоцитів, індуковану різними агоністами. Обговорюється питання про участь плазміноген/плазміну в атерогенезі та ангіогенезі, що опосередкована рецепторами ендотеліоцитів. Особливу увагу приділено прозапальній функції плазміноген/плазміну, яка реалізується через регуляцію процесів активації, секреції, міграції та апоптозу моноцитів і макрофагів. К л ю ч о в і с л о в а: плазміноген, плазмін, лізинзв’язувальні ділянки кринглових доменів, плазміногенові рецептори, клітини крові, агрегація тромбоцитів, клітинний сигналінг, ангіогенез, запалення.

Role of plasminogen/plasmin in functional activity of blood cells D. D. Zhernossekov, E. I. Yusova, T. V. Grinenko Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv; e-mail:grinenko@biochem.kiev.ua

Summary The article deals with the data concerning structural peculiarities of plasminogen/plasmin molecule, which define the specificity of intermolecular interactions and provide the variety of its biological functions. The main principles of the modern classification of plasminogen receptors and factors, which modulate their expression, have been presented. We have considered the mechanisms regulating both plasmin formation and activity on the surface of cells, fibrin and proteins of extracellular matrix. The data of previous investigators and our own results, concerning the influence of plasminogen/plasmin on platelet aggregation induced by different agonists, have been summarized. The participation of plasminogen/plasmin in atherogenesis and angiogenesis mediated­by endotheliocyte receptors has been discussed. Special attention was given to plasminogen/plasmin proISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012 т. 84, № 4

inflammatory function, which is realized by regulatory processes of activation, secretion, migration and apoptosis of monocytes and macrophages.

K e y w o r d s: plasminogen, plasmin, lysinebinding sites of kringle domains, plasminogen receptors, blood cells, platelet aggregation, cell signa­ling, angiogenesis, inflammation.

1. Parry M. A., Zhang X. C., Bode W. // Trends Biochem. Sci. – 2000. – 25, N 2. – P. 53–59.

2. Zhang L., Seiffert D., Fowler B. J. et al. // Thromb. Haemost. – 2002. – 87, N 3. – P. 493–501.

3. Lijnen H. R., Van Hoef B., Collen D. // Eur. J. Biochem. – 1981. – 120, N 1. – P. 149–154.

4. Wang H., Prorok M., Bretthauer R. K., Castel­ lino F. J. // Biochemistry. – 1997. – 36, N 26. – P. 8100–8106.

5. Ponting C. P., Marshall J. M., Cederholm– Williams S. A. // Blood Coagul. Fibrinolysis. – 1992. – 3, N 3. – P. 605–614.

6. Tulinsky A. // Thromb. Haemost. – 1991. – 66, N 1. – P. 16–31.

7. Lietha D., Chirgadze D. Y., Mulloy B. et al. // EMBO J. – 2001. – 20, N 20. – P. 5543–5555.

8. Chirgadze D. Y., Htpple J. P., Zhou H. et al. // Nat. Struct. Biol. – 1999. – 6, N 1. – P. 72–79.

9. Ruggeri R. M., Vitarelli T., Barresi G. et al. // Eur. J. Histochem. – 2010. – 54, N 2: e24.

10. Lucas J. M. A., Fretto L. J., McKee P. A. // J. Biol. Chem. – 1983. – 258, N 7. – P. 4249– 4256.

11. Гриненко Т. В., Кудинов С. А. / Биохимия животных и человека. – К.: Наук. думка, 1991. – 15. – С. 66–76.

12. Гриненко Т. В., Юсова О. І., Задорожна М. Б., Макогоненко Є. М. // Укр. біохім. журн. – 2002. – 74, № 6. – С. 83–90.

13. Herren T., Swaisgood C., Plow E. F. // Front.

Biosci. – 2003. – 8: d 1–8.

14. Knudsen B. S., Silverstein R. L., Leung L. L. et al. // J. Biol. Chem. – 1986. – 261, N 23. – P. 10765–10771.

15. Kim P. Y., Tieu L. D., Stafford A. R. et al. // Ibid. – 2012. – 287, N 7. – P. 4652–4661.

16. Geiger J. H., Cnudde S. E. // J. Thrombos.

Haemost. – 2004. – 2, N 1. – P. 23–34.

17. Wahl M. L., Kenan D. J., Gonzalez-Gronov M., Pizzo S. V. // J. Cell Biochem. – 2005. – 96, N 2. – P. 242–261.

18. Aisina R. D., Mukhametova L. I., Gulin D. A. et al. // Biochemistry (Mosc). – 2009. – 74, N 10. – P. 1104–1113.

19. Movery Y. M., Pizzo S. V. // Blood. – 2009. – 114, N 9. – P. 1727–1728.

17

Огляди

20. Ma J., Li C., Shao C., Gao G., Yang X. // Mol. Vis. – 2012. – 18. – P. 330–336.

21. Abad M. C., Arni R. K., Grella D. R. et al. // J. Mol. Biol. – 2002. – 318, N 4. – P. 1009–1017.

22. Rios-Steiner J. L., Schenone M., Mochalkin J. et al. // J. Mol. Biol. – 2001. – 308, N 4. – P. 705–719.

23. Burgin J., Schaller J. // Cell Mol. Life Sci. – 1999. – 55, N 1. – P. 135–141.

24. Cristen M. T., Franc P., Llinas M. // Bioche­ mistry. – 2010. – 49, N 33. – P. 7131–7150.

25. Cao Y., Ji W. R., Davidson D. et al. // J. Biol.

Chem. – 1996. – 271, N 46. – P. 29461–29467.

26. Ji W. R., Castellino F. J., Chang Y. et al. // FASEB J. – 1998. – 12, N 15 – P. 1731–1738.

27. Chang Y., Mochalkin I., McCance S. G. et al. // Biochemistry. – 1998. – 37, N 10 – P. 3258– 3271.

28. Ji W. R., Barrientos L. G., Llinas M. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1998a. – 247, N 2 – P. 414–419.

29. Lay A. J., Jiang X. M., Daly T. et al. // J. Biol.

Chem. – 2002. – 277, N 11 – P. 9062–9068.

30. Marshall J. M., Brown A. J., Ponting C. P. // Biochemistry. – 1994. – 33, N 12. – P. 3599– 3606.

31. Cockell C. S., Marshall J. M., Cederholm– Williams S. A. et al. // Biochem. J. – 1998. – 333, N 1 – P. 99–105.

32. Warejcka D. J., Twining S. S. // Ibid. – 2005. – 393, Pt 3. – P. 703–712.

33. Madoiwa S., Arai K., Ueda Y. et al. // J. Biochem. – 1997. – 121, N 2. – P. 278–287.

34. Markus G. // Fibrinolysis. – 1996. – 10, N . – P. 75–85.

35. Wiman B. // Methods Enzymol. – 1981. – 80. – P. 395–408.

36. Coughlin P. B. // FEBS J. – 2005. – 272, N 19. – P. 4852–4857.

37. Schaller J., Gerber S. S. // Cell Mol. Life Sci. – 2011. – 68, N 5. – P. 785–801.

38. Asakura H. // Rinsho Byori. – 2011. – 59, N 10. – P. 970–977.

39. Bass R., Ellis V. // Biochem. Soc. Trans. – 2002. – 30, N 2 – P. 189–194.

40. Dejouvencel T., Doeuvre L., Lacroix R. et al. // Blood. – 2010. – 115, N 10. – P. 2048–2056.

41. Lacroix R., Sabatier F., Mialhe A. et al. // Ibid. – 2007. – 110, N 7. – P. 2432–2439.

42. Pepper M. S., Vassalli J. D., Montesano R., Orci L. // J. Cell Biol. – 1987. – 105, N 6, Pt 1. – P. 2535–2541.

43. Степанова В. В., Ткачук В. А. // Биохимия. – 2002. – 67, вып. 1. – С. 127–138.

44. Redlitz A., Tan A. K., Eaton D. L., Plow E. F. // J. Clin. Invest. – 1995. – 96, N 5. – P. 2534– 2538.

18

45. Swaisgood C. M., Schmitt D., Eaton D., Plow E. F. // Ibid. – 2002. – 110, N 9 – P. 1275–1282.

46. Miles L. A., Fless G. M., Scanu A. M. et al. // Thromb. Haemost. – 1995. – 73, N 3. – P. 458–465.

47. Hancock M. A., Boffa M. B., Marcovina S. M. et al. // J. Biol. Chem. – 2003. – 278, N 26. – P. 23260–23269.

48. Choi K. S., Fitzpatrick S. L., Filipenko N. R. et al. // Ibid. – 2001. – 276, N 27. – P. 25212– 25221.

49. Das R., Pluskota E., Plow E. P. // Trends Cardiovasc. Med. – 2010. – 20, N 4 – P. 120– 124.

50. Wang H., Doll J. A., Jiang K. et al. // Cancer.

Res. – 2006. – 66, N 14. – P. 7211–7215.

51. Plow E. F., Herren T., Redlitz A. et al. // FASEB J. – 1995. – 9, N 10. – P. 939–945.

52. Lishko V. K., Novokhatny V. V., Yakubenko V. P. et al. // Blood. – 2004. – 104, N 3. – P. 719– 726.

53. Miles L. A., Hawley S. B., Baik N. et al. // Front. Biosci. – 2005. – 10. – P. 1754–1762.

54. Lopez–Alemany R., Longstaff C., Hawley S. et al. // Am. J. Hematol. – 2003. – 72, N 4. – P. 234–242.

55. Wygrecka M., Marsh L. M., Morty R. E. et al. // Blood. – 2009. – 113, N 22. – P. 5588–5598.

56. George J. N., Lyons R. M., Morgan R. K. // J. Clin. Invest. – 1980. – 66, N 1. – P. 1–9.

57. Dudani A. K., Ben–Tchavtchavadze M., Porter S., Tackaberry E. // Biochem. Cell.

Biol. – 2005. – 83, N 1. – P. 28–35.

58. Kishimoto T. K., Baldwin E. T., Anderson D. C. / in Gallin G. I., Snydermam R. (eds.). – Inflammation: Basic principles and clinical correlates. – Philadelphia, PA: Lippincott, Williams and Wilkins. – 1999. – P. 537–569.

59. Yakubenko V. P., Lishko V. K., Lam S. C. T., Ugarova T. P. // J. Biol. Chem. – 2002. – 277, N 50. – P. 48635–48642.

60. Philippeaux M. M., Vesin C., Tacchini– Cottier F., Piguet P. F. // Eur. J. Haemotol. – 1996. – 56, N 3. – P. 130–137.

61. Tarui T., Majumdar M., Miles L. A. // J. Biol.

Chem. – 2002. – 277, N 37. – P. 33564–33570.

62. Gilbert C. / IXth Congress of Int. Soc. Haematol. Bangkok, Thailand. – 1999. – P. 207–210.

63. Miles L. A., Ginsberg M. H., White J. G., Plow E. F. // J. Clin. Invest. – 1986. – 77, N 6. – P. 2001–2009.

64. Schafer A. I., Adelman B. // Ibid. – 1985. – 75, N 2. – P. 456–461.

65. Gouin I., Lecompte T., Morel M–C. et al. // Circulation. – 1992. – 85, N 3. – P. 935–941.

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

Д. Д. Жерносеков, Е. И. Юсова, Т. В. Гриненко

66. Sheu J. R., Fong T. H., Liu C. M. et al. // Brit.

J. Pharmac. – 2004. – 143, N 1. – P.193–201.

67. Schafer A. I., Maas A. K., Ware J. A. et al. // J. Clin. Invest. – 1986. – 78, N 1. – P. 73–79.

68. Niewiarowski S., Senyi A. F., Gillies P. // Ibid. – 1973. – 52, N 7. – P. 1647–1659.

69. Kahn M. L., Hammes S. R., Botka C., Coughlin S. R. // J. Biol. Chem. – 1998. – 273, N 36. – P. 23290–23296.

70. Roka–Moya Y. M., Zhernossekov D. D., Gri­ nenko T. V. et al. / Bulletin of the University of Kiev, series: Biology. – 2011. – 58. – P. 34–36.

71. Roka–Moya Y. M. / Abstracts of the VI Inter­ national young scientists’ conference, Kharkiv, – 2011. – P. 64–65.

72. Zhernosekov D. D., Zolotareva E. N. // Biopolym.

Cell. – 2011. – 27, N 4. – P. 258–263.

73. Chew D. P., Bhatt D. L., Sapp S. et al. // Circulation. – 2001. – 103, N 2. – P. 201–206.

74. Kim J., Hajjar K. A. // Front. Biosci. – 2002. – 7. – P. 341–348.

75. Dudani A. K., Ganz P. R. // Brit. J. Haematol. – 1996. – 95, N 1. – P. 168–178.

76. Brownstein C., Deora A. B., Jacovina A. T. et al. // Blood. – 2004. – 103, N 1. – P. 317–324.

77. MacLeod T. J., Kwon M., Filipenko N. R. et al. // J. Biol. Chem. – 2003. – 278, N 28. – P. 25577–25584.

78. Luscinskas F. W., Gimbrone M. A. // Annu.

Rev. Med. – 1996. – 47. – P. 413–421.

79. Simmet T., Luck W. // Thromb. Res. – 1989. – 54, N 5. – P. 423–433.

80. Weide I., Simmet T. // Ibid. – 1993. – 71, N 3. – P. 185–192.

81. Kaplan A., Silverberg M. // Blood. – 1987. – 70, N 1. – P. 1–15.

82. Weide I., Romisch J., Simmet T. // Ibid. – 1994. – 83, N 7. – P. 1945–1951.

83. Weide I., Tippler B., Syrovets T. et al. // Thromb.

Haemost. – 1996. – 76, N 4. – P. 561–568.

84. Syrovets T., Tippler B., Rieks M. et al. // Blood. – 1997. – 89, N 12. – P. 4574–4583.

85. Ryan T., Lai L., Malik A. // J. Cell Physiol. – 1992. – 151, N 2. – P. 255–261.

86. Chang W., Shi G-Y., Chow Y-H et al. // Am. J. Physiol. – 1993. – 264, (2 Pt 1) – P. 271–281.

87. Sozzani S., Luini W., Molino M. et al. // J. Immunol. – 1991. – 147, N 7. – P. 2215–2221.

88. Mitchell J., Baik N., Castellino J. et al. // Blood. – 2006. – 107, N 11. – P. 4383–4390.

89. Miles L., Dahiberg C., Piescia J. et al. // Biochemistry. – 1991. – 30, N 6. – P. 1682– 1691.

90. Syrovets T., Jendrach M., Rohwedder A. et al. // Blood. – 2001. – 97, N 12. – P. 3941–3950.

91. Mackman N. // Thromb. Haemost. – 1997. – 78, N 1. – P. 747–754.

92. Guha M., Mackman N. // Cell Signal. – 2001. – 13, N 2. – P. 85–94.

93. Syrovets T., Simmet T. // Cell. Mol. Life Sci. – 2004. – 61, N 7–8. – P. 873–885.

94. Barysek L., Syrovets T., Simmet T. // J. Biol.

Chem. – 2002. – 277, N 36. – P. 33509–33517. Получено 23.03.2012

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012 т. 84, № 4

19

Е Кспериме н т а л ьн і р об о ти УДК 618.36, 547.436

Стехіометрична модель фолатзалежного метаболізму одновуглецевих груп у плаценті людини Р. Р. Родрігес1, І. С. Лущик 2 , М. Ю. Оболенська1 Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ; e-mail: northernwizard@yandex.ua; 2 Національний університет «Києво-Могилянська Академія», Україна 1

Роботу присвячено створенню математичної моделі фолатзалежного метаболізму одновуг­ лецевих груп (ФЗМОГ) і дослідженню її функціонування в плаценті людини в умовах навантаження гомоцистеїном і найпоширеніших мутацій в генах метилентетрагідрофолатредуктази (МТГФР) і цистатіонін-β-синтази (ЦБС). При моделюванні враховані специфічні для плаценти особливості експресії генів, які кодують ензими ФЗМОГ. За допомогою програмних інструментів Metatool і COBRAToolbox визначено ключові метаболіти, елементарні моди і метаболічні потоки в різних реакціях системи. Показано, що найвразливішими ланками системи є реакції фолатного циклу і синтезу попередників нуклеїнових кислот, інозин- і тимідинмонофосфатів, які залежно від умов змінюються в межах від істотного пригнічення до активації. Найстабільнішими ланками системи виявляються реакції синтезу глутатіону і таурину. Результати моделювання ФЗМОГ збігаються з результатами, експериментально одержаними в схожих умовах. За деяких накладених умов виявляються раніше неочевидні зв’язки між ланками системи, що стає підставою для цілеспрямованої перевірки передбачень, одержаних за допомогою моделі. К лючові

Ф

с л о в а: фолатзалежний метаболізм одновуглецевих груп, стехіометрична модель, гомоцистеїн, поліморфізм, метилентетрагідрофолат редуктаза, цистатіонінβ-синтаза.

олатзалежний метаболізм одновуглецевих груп (ФЗМОГ) об’єднує реакції, в яких похідні фолієвої кислоти різного ступеня окислення є безпосередніми або опосередкованими постачальниками одновуглецевих груп. Центральне місце у ФЗМОГ займають два тісно пов’язаних між собою цикли – тетрагідрофолатний і метіоніновий (рис. 1). Із тетрагідрофолатним циклом пов’язані синтез попередників нуклеїнових кислот, а саме синтез de novo пуринових нуклеотидів, утворення дезокситимідинмонофосфату із дез­ оксиуридинмонофосфату, а також формілування метіоніну в складі метіонінової аміноацил-тРНК [1]. З метіоніновим циклом безпосередньо пов’язані усі реакції метилування в клітині і, зокрема, метилування ДНК, транссульфування гомоцистеїну з утворенням цистеїну і подальшим синтезом таурину і глутатіону [2–6]. Таким чином, від роботи двох циклів ФЗМОГ залежать найважливіші

20

процеси в клітині – синтез ДНК і РНК, підтримання окисно-відновного статусу, епігенетична регуляція експресії генів, процес ініціації трансляції в мітохондріях, детоксикаційні властивості клітини. Розлади у фолатзалежних процесах відповідно обговорюються в контексті численних захворювань серцево-судинної і центральної нервової сис­ тем, акушерської патології та деяких видів раку [2, 7–9]. Показником стану ФЗМОГ вважається рівень гомоцистеїну. Основну увагу в роботі зосереджено на ФЗМОГ у плаценті людини. Це пов’язано з тим, що плацента відіграє істотну, а іноді і провідну, роль у виникненні акушерської патології. Гіпергомоцистеїнемія (в крові матері) як показник порушення ФЗМОГ асоціюється з незарощенням нервової трубки у плода [10]. Попередні дослідження, проведені в нашій лабораторії, вперше показали, що в плаценті вагітних із діагнозом «прееклампсія» у ФЗМОГ спостерігається підвищення вмісту ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84 № 4

р. р. родрігес, і. с. лущик, м. Ю. оболенська

Рис. 1. Схема фолатзалежних процесів у плаценті людини. Червоним кольором позначені метаболіти фолатного циклу, зеленим – амінокислоти, фіолетовим – метаболіти, що беруть участь у синтезі глутатіону, жовтим – метаболіти шляху синтезу таурину, а в блакитних овалах – назви реакцій за абревіатурою ензимів: AICART – фосфорибозиламіноімідазол-карбоксамід формілтрансфераза (ФРАІКФТ, англ. Phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase, 2.1.2.3), CBS – цистатіонін-β-синтаза (ЦБС, англ. Cystathionine β-synthase, 4.2.1.22), CD – цистеїндіоксигеназа (ЦД, англ. Cysteine dioxygenase, 1.13.11.20), CTGL – цистатіонін-γ-ліаза (ЦЛ, англ. Cystathionine γ-lyase, 4.4.1.1), DHFR – дигідрофолатредуктаза (ДГФР, англ. Dihydrofolate reductase, 1.5.1.3), FTS – форміаттетрагідрофолат-синтетаза (ФТГФЛ, англ. Formate-tetrahydrofolate ligase, 6.3.4.3), GCL – глутамат-цистеїн лігаза (ГЦЛ, англ. Glutamate-cysteine ligase, 6.3.2.2), GS – глутатіонсинтетаза (ГС, англ. Glutathione synthase, 6.3.2.3), htDH – гіпотаурин дегідрогеназа (ГТД, англ. Hypotaurine dehydrogenase, 1.8.1.3), MAT – метіонін-аденозилтрансфераза, (МАТ, англ. Methionine adenosyltransferase, 2.5.1.6), Methylases (МТ) – метилтрансферази, Metin – імпорт метіоніну, MS – метіонінсинтаза (МС, англ. Methionine synthase, 2.1.1.13), MTCH – метенілтетрагідрофолатциклогідролаза (МТГФЦГ, англ. Methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase, 3.5.4.9), MTD – ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012 т. 84, № 4

21

експериментальні роботи

метилентетрагідрофолат-дегідрогеназа (МТФД, англ. Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, 1.5.1.5), MTHFR – метилентетрагідрофолат-редуктаза (МТГФР, англ. Methylenetetrahydrofolate reductase, 1.5.1.20), PGT – фософорибозилгліцинамід-формілтрансфераза (ФГФТ, англ. Phosphoribosylglycinamide formyltransferase, 2.1.2.2), SADC – сульфонілаланіл-декарбоксилаза (САД, англ. Sulfonilalanine decarboxylase, 4.1.1.29), SAHH – S-аденозилгомоцистеїн гідролаза (АГГ, англ. Adenosylhomocysteinase, 3.3.1.1), SHMT – серингідроксиметилтрансфераза (ГГМТ, (англ. Glycine hydroxymethyltransferase, 2.1.2.1), TS – тимідилат синтаза (ТС, англ. Thymidylate synthase, 2.1.1.45). Метаболіти: 5mthf – N5-метилтетрагідрофолат, 10fTHF – N10-формілтетрагідрофолат, AICAR – аміноімідазолкарбоксамід рибонуклеотид, CH2THF — N5,N10-метилентетрагідрофолат, CHTHF – N5,N10-метенілтетрагідрофолат, Cys – цистеїн, Сystathionine – цистатіонін, DHF – дигідрофолат, dTMP – деокситимідин монофосфат, dUMP – деоксиуридин монофосфат, GAR – гліцинамід рибонуклеотид, Glut – глутамат, Glut-Cys – γ-глутаміл цистеїн, Gly – гліцин, GSH – глутатіон, Hcy – гомоцистеїн, Hypotaurine – гіпотаурин, Met – метіонін, S – неметильований субстрат, S-met – метильований субстрат, SAH – S-аденозилгомоцистеїн, SAM – S-аденозилметіонін, Ser – серин, SulfAla – сульфонілаланін, Taurine – таурин, THF – тетрагідрофолат гомоцистеїну, зниження вмісту фолатів на фоні інших відхилень у складі амінотіолів. Ці зрушення можуть бути патогенетичними факторами розвитку хвороби [11–13]. Порушення ФЗМОГ виникають із різних причин. До найдослідженіших належать нестача фолієвої кислоти, вітамінів (В2, В6, В12), які є кофакторами в реакціях ФЗМОГ, поліморфізм ензимів цієї системи. Слід зазначити, що численні ензими ФЗМОГ є високополіморфними. Серед останніх, насамперед, виокремлюють метилентетрагідрофолатредуктазу (MTHFR), що відновлює метилентетрагідрофолат до метилтетрагідрофолату, який надає метильну групу для реакції реметилування гомоцистеїну. Гетерозиготне С677Т-носійство гену MTHFR зустрічається майже у 50% людей європейської популяції, в тому числі і в Україні [12, 14]. Воно супроводжується зниженням у середньому на 35% активності ензиму [15] і підвищеним ризиком виникнення різних захворювань [9, 16]. Ген, що кодує ензим цистатіонін-β-синтазу (CBS), також є поліморфним, і його варіант із вісімнадцятьма тандемними повторами ділянки у 31пн (31 base pairs variable number of tandem repeats, 31bp VNTR ) на межі 13-й екзон – 13-й інтрон зустрічається в 60% людей європейської популяції, а ензим має знижену (на ∼38%) активність [17]. Зустрічаються й інші заміни в гені CBS, які супроводжуються зниженням ензиматичної активності, наприклад, T833C поліморфізм в cis-положенні з інсерцією 68 пн в районі 844-го нуклеотиду у 8-у екзоні [18]. Обидва гени, MTHFR і CBS, знаходяться в різних хромосомах і успадковуються незалежно, тому комбінація названих мутантних форм цих генів має зустрічатися приблизно у 30% населення (50%×60%/100%=30%). Впливу 22

носійства однонуклеотидних замін в інших ензимах приділено значно менше уваги. З огляду на роль ФЗМОГ у загальному метаболізмі і функціонуванні клітини, ми припускаємо, що зміни у функціонуванні одного з ензимів неодмінно призведуть до змін в інших ланках системи, не кажучи вже про збіг мутацій в генах декількох ензимів, що в цілому позначиться на функціонуванні клітини. Дослідити експериментально та із статистично значущою ймовірністю роль поліморфізму різних генів фолатзалежних процесів у функціонуванні всієї системи досить складно через необхідність обстеження надзвичайно великої кількості осіб і трудомісткості визначення численних показників. Цілісне уявлення про роботу системи можна отримати за допомогою комп’ютерного моделювання метаболізму і симуляції різних умов функціонування системи. Існують три підходи до моделювання метаболізму: моделювання структури (топології) системи; стехіометричне моделювання, яке враховує стехіометрію реакцій та використовує обмеження, що вводяться на підставі результатів експериментальних досліджень, і створення кінетичної моделі з використанням кінетичних характеристик ензимів, даних щодо концентрації метаболітів і регуляції реакцій [19]. На сьогодні створено кінетичні моделі фолатного метаболізму для печінки людини [20] і для раку товстого кишечника [21] та досліджено вплив мутацій на різні ланки системи [22]. Створення кінетичних моделей ФЗМОГ для плаценти людини ускладнене наявністю тканиноспецифічних особливостей експресії генів і відсутністю достатньої кількості даних щодо кінетичних характеристик ензимів і концентрації метаболітів в органі. Раніше проISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

р. р. родрігес, і. с. лущик, м. Ю. оболенська

ведений аналіз публікацій щодо експресії генів ФЗМОГ у плаценті людини показав, що деякі гени (формілтетрагідро-фолатдегідрогенази, бетаїн-гідроксиметилтрансферази, гліцин-Nметилтранс-ферази) не експресуються (або концентрація індивідуальних РНК нижча за чутливість використаних методів) [23]. Цей результат врахований при побудові моделі. Метою нашої роботи було створити стехіометричну модель ФЗМОГ для плаценти людини і провести аналіз поведінки системи в умовах симуляцїі підвищеного вмісту гомоцистеїну, зниженої на 35% активності MTHFR (носійство гетерозиготності С677Т MTHFR) і на 38% активності CBS (варіант гену CBS із 18 тандемними повторами 31 пн), а також означених варіантів у різних комбінаціях. Вибираючи гени-кандидати для моделювання наслідків мутацій в них, ми керувалися частотою, з якою мутації та їх комбінації зустрічаються в європейській популяції людей, а саме більше ніж у 25% населення. Функціонування системи характеризували через елементарні моди (ЕМ), які відображають всі можливі розподіли метаболічних потоків у метаболічній мережі за стаціонарного стану, і через баланс стаціонарних метаболічних потоків системи. Ми вперше побудували математичну модель ФЗМОГ для плаценти людини, відтворили, використовуючи модель, різні умови функціонування системи в залежності від вмісту гомоцистеїну і обох мутацій і визначили їх вплив на кожну із ланок системи. Методи Фолатзалежні процеси відбуваються у трьох компартментах клітини – в цитозолі, мітохондріях і ядрі [24]. У цій роботі для моделювання обрано фолатзалежні процеси, які відбуваються в цитозолі клітин плаценти (табл. 1), і враховано тканиноспецифічні особливості метаболізму. Ключові метаболіти системи, тобто метаболіти, які беруть участь у найбільшій кількості реакцій і слугують зв’язуючими ланками циклів, і набір елементарних мод визначено за допомогою відкритої і доступної (http://pinguin.biologie.uni-jena.de/ bioinformatik/networks/) програми Metatool [25]. Кожна метаболічна система характеризується певними елементарними модами. Набір елементарних мод описує всі можливі потоки метаболітів у системі в умовах її стаціонарного стану. Елементарна мода – це направлений шлях, що включає мінімальний набір реакцій від одного зовнішнього метаболіту до іншого.

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012 т. 84, № 4

Вона характеризується унікальним набором ензимів. Будь-який шлях може бути представлений як лінійна комбінація елементарних мод. Моделювання і аналіз поведінки системи ФЗМОГ за різних умов її функціонування виконано із застосуванням методу «Балансу стаціонарних потоків» і програмного забезпечення COBRAToolbox [26], що знаходиться у відкритому доступі (http://opencobra. sourceforge.net/openCOBRA/). На першому етапі було отримано значення метаболічних потоків через реакції системи, яка знаходиться у стаціонарному стані. При цьому враховували стехіометрію реакцій, їх оборотність/ необоротність, а як об’єктивну функцію обирали максимум потоків через усі реакції системи. Значення метаболічних потоків через реакції виражали в умовних одиницях у довільно обраному інтервалі від нуля до ста. На наступному етапі проведено моделювання інших умов функціонування системи шляхом примусового зменшення або збільшення значення потоку через певну реакцію. Таким чином, змодельовано сім варіантів функціонування системи – умовно «нормальний стан» за максимально ефективної роботи системи і шість варіантів, що відрізняються від «нормального стану»: 1. двократне збільшення концентрації гомоцистеїну завдяки збільшенню в два рази потоку через реакцію SAHH, яка безпосередньо веде до утворення гомоцистеїну; 2. гетерозиготне С677Т-носійство гену MTHFR, змодельоване зниженням потоку через реакцію MTHFR на 35%; 3. гетерозиготне С677Т-носійство гену MTHFR в комбінації з підвищеною в два рази концентрацією гомоцистеїну; 4. носійство варіанта гену CBS з 18 тандемними повторами ділянки в 31 пн, змодельоване зниженням метаболічного потоку через реакцію CBS на 38%; 5. носійство варіанта гену CBS з 18 тандемними повторами ділянки в 31 пн у комбінації з підвищеною концентрацією гомоцистеїну; 6. комбінація означених мутантних форм генів MTHFR і CBS. Результати Для моделювання фолатзалежних процесів використано реакції, які обрано з урахуванням тканиноспецифічної особливості експресії генів ФЗМОГ у плаценті людини (табл. 1). Ключові метаболіти системи. За участю в деяких реакціях (без урахування транспорт­ них) ключові метаболіти розташовуються у по23

експериментальні роботи

Т а б л и ц я 1. Стехіометрія реакцій, використаних для моделювання № п/п

Реакції за назвою ензиму

Стехіометрія реакцій Реакції метіонінового циклу

1

MAT

ATP + H2O + Met = dph + ph + SAM

2

Methylases

S + SAM = SAH + Smet

3

SAHH

H2O + SAH = Adn + Hcy

4

MS

Hcy + x5mthf = Met + THF Реакції тетрагідрофолатного циклу

5

MTHFR

CH2THF + H + NADPH = NADP + x5mthf

6

MTD

CH2THF + NADP = CHTHF + H + NADPH

7

MTCH

CHTHF + H2O = 10fthf

8

FTS

ATP + Frmt + THF = ADP + ph + x10fthf

9

DHFR

DHF + H + NADPH = NADP + THF

10

SHMT

Ser + THF = CH2THF + Gly + H2O Реакції синтезу пуринів і піримідинів

11

PGT

GAR + x10fthf = AICAR + THF

12

AICART

AICAR + x10fthf = FICAR + THF

13

TS

CH2THF + dUMP = DHF + dTMP Реакції транссульфування

14

CBS

Hcy + Ser = Cst + H2O

15

CTGL

Cst + H2O = Cys + NH3 + 2oxbt Реакції синтезу таурину

16

CD

Cys + O2 = SulfAla

17

SADC

SulfAla = CO2 + hyptaur

18

htDH

H2O + hyptaur + NAD = H + NADH + taur Реакції синтезу глутатіону

19

GCL

ATP + Cys + Glut = ADP + GlutCys + ph

20

GS

ATP + GlutCys + Gly = ADP + GSH + ph Реакції введення/виведення метаболітів

21

Taur_out

taur = taurex

22

Met_in

Met_out1 = Met

23

Cys_in

Cys_out1 = Cys

24

Glut_in

Glut_out1 = Glut

25

Ser_in

Ser_out1 = Ser

26

Gly_in

Gly_out1 = Gly

27

GSH_out

GSH = GSH_out

рядку спадання – THF (6 реакцій), CH2THF (4), 10fthf (4), Cys (3), Hcy (3), Ser (2) і Met (2). Елементарні моди потоків. В досліджуваній системі було визначено 23 елементарні моди, які наведено в табл. 2 в порядку збільшення чисельності реакцій в моді (довжини моди).

24

Найкоротша мода містить 3 реакції, а найдовша — 16. За частотою участі тієї чи іншої реакції в різних елементарних модах можна зробити висновок щодо важливості цієї реакції для системи. Найчастіше в модах зустрічається реакція, яку каталізує ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

р. р. родрігес, і. с. лущик, м. Ю. оболенська

Т а б л и ц я 2. Елементарні моди потоків у системі фолатзалежних процесів № п/п

Довжина моди

1

3

(1 AICART) (2 FTS) (1 PGT)

2

5

(1 CD) (1 Cys_in) (1 htDH) (1 SADC) (1 Taur_out)

3

5

(1 DHFR) (-1 Gly_in) (1 Ser_in) (1 SHMT) (1 TS)

4

5

(1 DHFR) (1 FTS) (-1 MTCH) (-1 MTD) (1 TS)

5

6

(1 Cys_in) (1 GCL) (1 Glut_in) (1 Gly_in) (1 GS) (-1 GSH_out)

6

6

(1 FTS) (1 Gly_in) (-1 MTCH) (-1 MTD) (-1 Ser_in) (-1 SHMT)

7

7

(1 AICART) (-2 Gly_in) (2 MTCH) (2 MTD) (1 PGT) (2 Ser_in) (2 SHMT)

8

8

(1 CBS) (1 CTGL) (-1 Cys_in) (1 MAT) (1 Met_in) (1 Methylases) (1 SAHH) (1 Ser_in)

9

8

(-1 Gly_in) (1 MAT) (1 Methylases) (1 MS) (1 MTHFR) (1 SAHH) (1 Ser_in) (1 SHMT)

10

8

(1 FTS) (1 MAT) (1 Methylases) (1 MS) (-1 MTCH) (-1 MTD) (1 MTHFR) (1 SAHH)

11

9

(1 Cys_in) (1 DHFR) (1 GCL) (1 Glut_in) (1 GS) (-1 GSH_out) (1 Ser_in) (1 SHMT) (1 TS)

12

10

(1 Cys_in) (-1 FTS) (1 GCL) (1 Glut_in) (1 GS) (-1 GSH_out) (1 MTCH) (1 MTD) (1 Ser_in) (1 SHMT)

13

11

(1 CBS) (1 CD) (1 CTGL) (1 htDH) (1 MAT) (1 Met_in) (1 Methylases) (1 SADC) (1 SAHH) (1 Ser_in) (1 Taur_out)

14

11

(1 AICART) (2 Cys_in) (2 GCL) (2 Glut_in) (2 GS) (-2 GSH_out) (2 MTCH) (2 MTD) (1 PGT) (2 Ser_in) (2 SHMT)

15

12

(1 CBS) (1 CTGL) (1 GCL) (1 Glut_in) (1 Gly_in) (1 GS) (-1 GSH_out) (1 MAT) (1 Met_in) (1 Methylases) (1 SAHH) (1 Ser_in)

16

12

(1 Cys_in) (1 GCL) (1 Glut_in) (1 GS) (-1 GSH_out) (1 MAT) (1 Methylases) (1 MS) (1 MTHFR) (1 SAHH) (1 Ser_in) (1 SHMT)

17

12

(1 CBS) (1 CTGL) (-1 Cys_in) (1 FTS) (1 Gly_in) (1 MAT) (1 Met_in) (1 Methylases) (-1 MTCH) (-1 MTD) (1 SAHH) (-1 SHMT)

18

14

(1 CBS) (1 CTGL) (1 DHFR) (1 GCL) (1 Glut_in) (1 GS) (-1 GSH_out) (1 MAT) (1 Met_in) (1 Methylases) (1 SAHH) (2 Ser_in) (1 SHMT) (1 TS)

19

14

(1 CBS) (1 CTGL) (1 GCL) (1 Glut_in) (1 GS) (-1 GSH_out) (2 MAT) (1 Met_in) (2 Methylases) (1 MS) (1 MTHFR) (2 SAHH) (2 Ser_in) (1 SHMT)

20

15

(1 CBS) (1 CD) (1 CTGL) (1 FTS) (1 Gly_in) (1 htDH) (1 MAT) (1 Met_in) (1 Methylases) (-1 MTCH) (-1 MTD) (1 SADC) (1 SAHH) (-1 SHMT) (1 Taur_out)

21

15

(1 CBS) (1 CTGL) (1 FTS) (1 GCL) (1 Glut_in) (2 Gly_in) (1 GS) (-1 GSH_out) (1 MAT) (1 Met_in) (1 Methylases) (-1 MTCH) (-1 MTD) (1 SAHH) (-1 SHMT)

22

15

(1 CBS) (1 CTGL) (-1 FTS) (1 GCL) (1 Glut_in) (1 GS) (-1 GSH_out) (1 MAT) (1 Met_in) (1 Methylases) (1 MTCH) (1 MTD) (1 SAHH) (2 Ser_in) (1 SHMT)

23

16

(1 AICART) (2 CBS) (2 CTGL) (2 GCL) (2 Glut_in) (2 GS) (-2 GSH_out) (2 MAT) (2 Met_in) (2 Methylases) (2 MTCH) (2 MTD) (1 PGT) (2 SAHH) (4 Ser_in) (2 SHMT)

Реакції в елементарних модах потоків

В модах, наведених в табл. 2, реакції позначені абревіатурою ензиму, який каталізує цю реакцію.

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012 т. 84, № 4

25

експериментальні роботи

серингідроксиметилтрансфераза, і супутня їй реакція постачання в систему серину (участь у 15 модах із 23). Серин постачає одновуглецеві групи для тетрагідрофолатного циклу, а зав­ дяки реакції МТГФР і далі через реметилування гомоцистеїну одновуглецевий фрагмент використовується для синтезу метіоніну з гомоцистеїну. Серин є також субстратом у реакції транссульфування гомоцистеїну з утворенням цистатіоніну. У 13 із 23 мод присутні реакції метіонінового циклу, які забезпечують утворення S-аденозилметіоніну і метилування. Для порівняння лише в трьох модах присутні реакції синтезу таурину, при цьому одна з цих мод (мода №2) містить виключно набір реакцій тауринового синтезу. Це свідчить про відносну незалежність тауринового синтезу від тетрагідрофолатного і метіонінового циклів, а саме про можливість функціонування шляху синтезу таурину, навіть у разі зупинки реакцій інших ланок ФЗМОГ.

Баланс стаціонарних потоків системи ФЗМОГ. Значення метаболічних потоків сис­ теми було розраховано за допомогою програмного забезпечення COBRAToolbox і наведено в умовних одиницях довільно обраного інтервалу від 0 до 100. Як видно з рис. 2, найбільші величини потоків спостерігаються в реакціях транспортування серину, реакціях метіонінового циклу, окрім синтезу метіоніну, утворення глутатіону, транссульфування і транспортування глутамату. Поведінка системи ФЗМОГ за різних умов її симуляції. Величини метаболічних потоків в реакціях системи за різних умов симуляції наведено в умовних одиницях у табл. 3. Навантаження системи гомоцистеїном призводить до зниження на 72% метаболічного потоку через реакції MTCH і MTD, які ведуть до утворення 10-формілтетрагідрофолату – метаболіту, необхідного для синтезу de novo азотистого кільця пуринових нуклеотидів.

Рис. 2. Розподіл метаболічних потоків за вихідних умов функціонування системи 26

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

р. р. родрігес, і. с. лущик, м. Ю. оболенська

Т а б л и ц я 3. Зміни потоків через реакції ФЗМОГ (у % по відношенню до вихідних умов) № п/п

Потік

2хГц

MTHFR С677T генотип

2 хГц + MTHFR C677T

CBS 31 bp VNTR генотип

2 x Гц + CBS 31 bp VNTR

MTHFR C677T + CBS 31 bp VNTR

Реакції метилування 1

MAT

112

95

108

93

109

87

2

Methylases

112

95

108

93

109

87

3

SAHH

112

95

108

93

109

87

4

MS

112

70

79

118

129

83

Реакції фолатного циклу 5

MTHFR

112

70

79

118

129

83

6

MTD

28

126

52

129

0

164

7

MTCH

28

126

52

129

0

164

8

FTS

84

101

84

114

112

115

9

DHFR

70

108

76

118

84

128

10

SHMT

78

96

72

120

85

117

Реакції синтезу попередників нуклеїнових кислот 11

PGT

70

108

76

118

84

128

12

AICART

70

108

76

118

84

128

13

TS

70

108

76

118

84

128

Реакції транссульфування 14

CBS

112

104

118

84

101

88

15

CTGL

112

104

118

84

101

88

Реакції синтезу таурину 16

CD

93

108

101

99

94

107

17

SADC

93

108

101

99

94

107

18

htDH

93

108

101

99

94

107

Реакції синтезу глутатіону 19

GCL

90

102

92

105

97

107

20

GS

90

102

92

105

97

107

Реакції транспортування 21

Taur_out

93

108

101

99

94

107

22

Met_in

112

104

118

84

101

88

23

Cys_in

45

100

40

147

84

150

24

Glut_in

90

102

92

105

97

107

25

Ser_in

96

100

96

101

94

102

26

Gly_in

130

120

156

54

135

75

27

GSH_out

90

102

92

105

97

107

Знижуються на 30% потоки через реакції AICART i PGT, а також через реакцію TSсинтезу тимідинмонофосфату з уридинмонофосфату, і реакцію DHFR-відновлення ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012 т. 84, № 4

дигідрофолату до тетрагідрофолату. Загалом знижуються метаболічні потоки всіх реакцій фолатного циклу, окрім MTHFR. Натомість активуються шляхи реметилування та транс27

експериментальні роботи

Fig. 4. Involvement of tocopherol in antioxidant system of plant. Abbreviation: AsA, ascorbate; MDA, monodehydroascorbate; DHA, dehydroascorbate; GSH, reduced glutathione; GSSG, oxidized glutathione; Toc, tocopherol; Toc •, tocopheryl-radical; LOOH, lipid hydroperoxide; LOO •, lipid peroxyl radical. Enzymes involved: APX, ascorbate peroxidase; GR, glutathione reductase; DHAR, dehydroascorbate reductase; MDAR, monodehydroascorbate reductase, CAT, catalase; SOD, superoxidedismutase; POD, peroxidase time, the lack of tocopherols in vte1 mutant plants may be compensated by an increase of carotenoid and anthocyanin concentrations in response to the salt stress. Вплив короткотривалого сольового стресу на маркери оксидативного стресу та активність антиоксидантних ензимів у токоферолдефіцитних рослин Arabidopsis thaliana Н. М. Семчук, Ю. В. Василик, Ок. В. Лущак, В. І. Лущак Прикарпатський національний університет імені Василя Стефаника, Івано-Франківськ, Україна; e-mail: lushchak@pu.if.ua

Досліджено вміст каротиноїдів, антоціанів, рівень пероксидного окислення ліпідів та активність антиоксидантних ензимів у рослин Arabidopsis thaliana дикого типу і дефектних за біосинтезом токоферолу лініях vte1 та vte4 за дії 200 мМ NaCl протя46

гом 24 годин. Сольовий стрес призводив до зростання інтенсивності пероксидного окислення ліпідів у всіх трьох досліджуваних ліній рослин. За дії сольового стресу концентрація каротиноїдів та активність каталази, аскорбатпероксидази, гваяколпероксидази та глутатіонредуктази зростали у рослин дикого типу та токоферол-дефіцитної лінії vte1, проте, підвищення концентрації антоціанів спостерігалося тільки у рослин мутантної лінії vte1. У рослин мутантної лінії vte4, яка містить γ-токоферол замість α-токоферолу, відповідь на сольовий стрес відбувалася через узго­ джену дію супероксиддисмутази та ензимів аскорбат-глутатіонового циклу, а саме аскорбатпероксидази, дегідроаскорбатредуктази, глутатіонредуктази та глутатіон-S-транс­ ферази. Можна дійти висновку, що сольовий стрес супроводжується оксидативним стресом у трьох досліджуваних ліній рослин, разом з тим різні механізми задіяні в адаптації рослин дикого типу та токоферол-дефіцитних ліній. К л ю ч о в і с л о в а: антиоксидантні ензими, Arabidopsis thaliana, оксидативний стрес, сольовий стрес, токофероли.

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

NS E

+D ox K

NS E +

іц ин

іц ин До кс ор уб

До кс ор уб

Се

Ін та кт ні Пу хл ин Пу а хл ин а + NS E

є. А. ¥удзь, н. м. гула, т. о. хмель та ін.

**

**

6

#

#

5

@ #

4 3 2

4

5

+D ox K

3

NS E

2

+

1

До кс ор уб

0

іц ин

1

6

NS E

До кс ор уб

іц ин

Рис. 1. Вміст сечовини в плазмі крові мишей (ммоль/л плазми): 1 – Інтактні; 2 – Пухлина; 3 – Пухлина+NSE; 4 – Доксорубіцин; 5 – Доксорубіцин+NSE; 6 – NSE+DoxK. Тут і на рис. 2–9: * зміни вірогідні відносно групи «Інтактні» (Р < 0,05); # зміни вірогідні відносно # # групи100 «Пухлина» (Р < 0,05); @ зміни вірогідні 90 відносно групи «Доксорубіцин» (Р < *0,05)* атинін, мкмоль/ л плазми

Рис. 1

7

Ін та кт ні Пу хл ин Пу а хл ин а + NS E

Сечовина,ммоль/л ммоль/л плазми плазми крові Сечовина, крові

80 70 ISSN 0201 60 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012 т. 84, № 4 50 40 30 20

#

100 90

*

80 70 60 50 40

2

3

4

# *

5

До кс До ор уб кс ор іц ин уб іц ин + N SE N SE +D ox K

1

ух ли на ух ли на + N SE

та кт ні

30 20 10 0

Ін

6

П

Рис. 2. Вміст креатиніну в плазмі крові мишей (мкмоль/л плазми): 1 – Інтактні; 2 – Пухлина; 3 – Пухлина+NSE; 4 – Доксорубіцин; 5 – Доксорубіцин+NSE; 6 – NSE+DoxK П

Показник рівня сечовини в плазмі крові використовують для оцінки клубочкової фільтрації. Водночас потрібно враховувати той факт, що рівень сечовини може підвищуватися за рахунок катаболізму протеїнів. На рис. 1 показано, що розвиток пухлини призводить до зростання рівня сечовини в плазмі крові. За введення доксорубіцину рівень сечовини плазми крові мишей-пухлиноносіїв також є підвищеним. Введення суспензії NSE на фоні доксорубіцину, а також введення композиту запобігає підвищенню рівня сечовини. Одержані дані про зменшення рівня сечовини в плазмі крові мишей свідчать про здатність NSE як у вигляді суспензії, так і у складі композиту, знімати прояви нефротоксичності в умовах нашого експериРис. 2 менту. Введення доксорубіцину спричинює підвищення рівня креатиніну в плазмі крові мишей-пухлиноносіїв (рис. 2). Введення суспензії NSE і композиту не знімає вищезазначеного ефекту доксорубіцину. Рівень креатиніну залишається підвищеним. Відомо, що аспартатамінотрансфераза та аланінамінотрансфераза є внутрішньо­ ензимами. Зростання клітинними активності цих ензимів відбувається при патологіях, перебіг яких пов’язаний з некрозом клітин. Підвищення активності аспартатамінотрансферази в плазмі крові є клінічним маркером інфаркту міокарда, а рівень активності аланінамінотрансферази характеризує ступінь ушкодження печінки

Креатинін, мкмоль/л плазми Креатинін, мкмоль/ л плазми

Рис. 1

за деяких патологічних станів, що пов’язані з деструкцією клітин печінки [25]. Деструкція клітин під дією доксорубіцину відбувається за рахунок зростання експресії індуцибельної NO-синтази міокарда, що, в свою чергу, призводить до підвищення оксидативного та нітрозативного стресу. Активні форми кисню та азоту призводять до нітрування протеїнів та окислення ліпідів, що в кінцевому разі спричинює загибель клітини шляхом некрозу [26]. На рис. 3. показано, що розвиток пухлини спричинює зростання активності аспартатамінотрансферази. Введення доксо­ рубіцину не змінює активності ензиму в крові пухлиноносіїв. У разі введення суспензії NSE на фоні доксорубіцину активність аспартатамінотрансферази дещо знижується. Вираженіший ефект спостерігається за дії композиту. Одержані дані свідчать на користь того, що введення NSE як у вигляді суспензії, так і у складі композиту сприяє зниженню активності аспартатамінотрансферази. Такий ефект відображає часткове зняття токсичних проявів доксорубіцину в тканині серця. На рис. 4 показано, що застосування доксорубіцину підвищує активність аланінамінотрансферази в плазмі крові. Пероральне введення суспензії NSE не знімає ефектів, спричинених доксорубіцином. Введення доксорубіцину у складі компо зиту попереджає зростання активності аланінамінотрансферази у плазмі крові. зростання активності Запобігання аланінамінотрансферази виявлено лише за застосування композиту, що свідчить про його 63

*

#

@

*

#

*

0,2

0,15 0,35

@

*

*

0,30,1 0,30

#

*

0,05

0,20 0,2

@

#

*

0,25

*

+D ox K

+ ци н Дк со ру бі 6

NS E

+ ци н

До кс ор уб

5

+D ox K

ин

4

NS E

NS E

ин іц До кс ор уб

+ на 3

іц

NS E

2

+

1

на

ак тн і

00

Пу хл ин а

0,05

Пу хл и

Ін т

Пу хл ин а

ак тн і

0,10 0,1

NS E

0

0,15 0,15

Ін т

мкмоль піровиноградної кислоти/1 мл плазми мкмоль піровиноградної кислоти/ 1 мл плазми

0,25 експериментальні роботи

NS E

мкмоль піровиноградної кислоти/ 1 м

*

0,3

Рис. 3

Дк со ру бі

Пу хл и

Рис. 3. Активність аспартатамінотрансферази в плазмі крові мишей: 1 – Інтактні; 2 – Пухлина; 3 – Пухлина+NSE; 4 – Доксорубіцин; 5 – Доксорубіцин+NSE; 6 – NSE+DoxK

0,14 0,14

#

0,14

*

0,12 0,12 0,12

#

#

*

#

*

0,10,10 0,1

*

@

0,08

@

0,08 0,08

0,06

0,04 0,06 0,06

4

5

xK

3

NS E+ Do

2

NS E

на

Пу хл и

1

ин

+ на

Пу хл и

0 0

До кс NS Д ор уб E оксо іц ин ру бі ци н + NS До E кс NS ор До E+ уб Do кс іц xK о

на

Пу хл и

Ін т

ак тн і

0,02 0,02

NS E

0,02 0,04 0,04 0

ак тн і

мкмоль

мкмоль піровиноградної кислоти/1 мл плазми

мкмоль піровиноградної кислоти//11 мл піровиноградної кислоти млплазми плазми

Рис. 3

6

виражений антитоксичний ефект у тканині печінки. Із даних літератури відомо, що розвиток онкологічного Рис. 4 процесу призводить до розбалансування активності ензимів антиоксидантного захисту тканин безпосередньо неуражених пухлиною, зокрема до зменшення активності супероксиддисмутази [27]. Наші результати, представлені на рис. 5, добре узгоджуються з даними літератури. Розвиток пухлини супроводжується зменшенням у тканині серця активності супероксиддисмутази. Доксорубіцин сам і в комплексі із 64

ру б

іц

ин

+

+

на

Пу хл и

Ін т

Рис. 4. Активність аланінамінотрансферази в плазмі крові мишей: 1 – Інтактні; 2 – Пухлина; Рис. 4 3 – Пухлина+NSE; 4 – Доксорубіцин; 5 – Доксорубіцин+NSE; 6 – NSE+DoxK суспензією NSE не змінює активність ензиму, а введення NSE у складі композиту сприяє відновленню активності супероксиддисмутази до рівня його в інтактних тварин. Під час дослідження активності глутатіон­ пероксидази та каталази в тканині серця мишей з карциномою Льюїс вірогідні зміни не зафіксовано. Таким чином, в наших експериментах встановлено, що застосування композиту сприяє нормалізації активності супероксиддисмутази в тканині серця. Раніше було показано, що введення суспензії NSE зменшує

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

є. А. ¥удзь, н. м. гула, т. о. хмель та ін.

ум.од./хв на мг протеїну

Ум. од./хв на мг протеїну

1400 1400 1200 1200

#

1000 1000 800 800

*

600 600 400 400 200 200

00

і1 тн ак т Ін

2

на ли ух

+

N

3 SE

н4 іци б у ор

+

N

5 SE

+D

K6 ox

E П н а в тканині ин Рис. 5 Активність супероксиддисмутази серця іцмишей: 1 NS– Інтактні; 2 – Пухлина; кс ли б о х у 6 – NSE+DoxK у Д 3 – Пухлина+NSE; 4 – Доксорубіцин; 5 – Доксорубіцин+NSE; П ор кс До

ox K

E

S

+D

N

N SE

+

До кс ор уб іц ин

До кс ор уб іц ин

SE

N

+

ух ли на

Цікаво, що найбільшою мірою як і у разі вивчення ензимів антиоксидантного захисту серця, змінювалась активність супер­ оксиддисмутази, хоча спрямованість цих змін у різних органах була різною, що вказує на органоспецифічні ефекти препаратів. Результати,* представлені на рис. 7, демонструють, що пухлинний ріст призводить до зростання активності супероксиддисмутази в # тканині нирок мишей-пухлиноносіїв. Введення доксорубіцину не спричиняє істотних змін активності супероксиддисмутази. Введення суспензії N-стеароїлетаноламіну не призводить до змін активності цього ензиму, які були зумовлені розвитком пухлини. Застосування композиту приводить до нормалізації активності супероксиддисмутази.

K н SE ox N іци Найвираженіші зміни б +D активності ензимів + у р SE ин антиоксидантного захисту спричиненні розсо N біц ок у Д р витком пухлини, було виявлено в печінці. о с ок Цікаво, Дщо саме в цьому органі активність глутатіонпероксидази і супероксиддисмута зи залежать від дії NSE та доксорубіцину. Дослідження активності глутатіонпероксидази

300 300 250 250

*

*

200 200 150 150 100 100

ox K

5

6

+D

E S N

N

4

+

3

SE

2

+

1

ух ли на

00

До кс ор уб іц ин

50 50

Ін та кт ні

нмоль глутатіону /хв на мг протеїну

нмоль глутатіону/хв на мг протеїну

П

П

ух ли на

Ін та ум.од./хв на мг протеїну кт ні

нмоль глутатіону /хв на мг протеїну

активність індуцибельної NO-синтази аорти та серця щурів Рис. 5 [28]. Одержаний нами ефект може бути реалізований за рахунок модуляції композитом активності індуцибельної NOсинтази, що, в 300 свою чергу, приводить до зменшення продукції активних форм кисню та азо250 ту, які здатні впливати на активність ензимів 1400 * антиоксидантного захисту.

200 1200 Дослідження активності глутатіон­ пероксидази (рис. у тканині нирок мишей150 6) 1000 пухлиноносіїв показали, що в умовах* роз800 100 витку карциноми спостерігається вірогідне 600 збільшення активності цього ензиму порівняно 50 400 з групою інтактних тварин. Пероральне введення суспензії N-стеароїлетаноламіну та ком200 0 позиту не знімає ефектів, спричинених роз0 витком пухлини. і SE на тн При визначенні активності каталази тка- + N ли ак т х у а Ін П нини нирок мишей з карциномою Льюїс було ин хл у показано, що розвиток пухлини також приП зводить до зростання активності цього ензиму. Введення суспензії N-стеароїлетаноламіну та композитуРис. 6 не спричиняє вірогідних змін щодо активності цього ензиму. Рис. 5

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012 т. 84, № 4

Рис. 6

N SE

До кс ор уб іц ин

ух ли на

П

П

Рис. 6. Активність глутатіонпероксидази в тканині нирок мишей: 1 – Інтактні; 2 – Пухлина; 3 – Пухлина+NSE; 4 – Доксорубіцин; 5 – Доксорубіцин+NSE; 6 – NSE+DoxK

65

експериментальні роботи

1000 1000

Ум. од./хв на мг протеїну ум.од./хв на мг протеїну

900 900

*

*

800 800

*

700 700 600 600

*

500 500

@#

400 400 300 300 200 200

6

+D ox K

5

E

4

N

S

До кс ор уб іц ин

Ін та кт ні

3

SE

2

ух ли на

1

N

100 100 0

300 300

Пухлина + NSE

SE

N

+D ox K

E

S

N

N

SE

+

SE

Пухлина

*

нормалізує активність супероксиддисмутази в

умовах усіх застосованих нами способів його * введення. Суспензія NSE знижує рівень сечо# вини в плазмі крові @ пухлиноносіїв, зростання якого бу­ ло виявлено як наслідок введення доксорубіцину. У плазмі крові мишей-пухлиноносіїв суспензія NSE та композит знижує активність аспартатамінотрансферази – основного маркера пошкодження тканини серця, зро* * стання якої спричинено розвитком пухлини. *Доксорубіцин підвищує активність # аланінамінотрансферази – маркера ураження печінки в крові пухлиноносіїв, а введення композиту запобігає зростанню активності

ензиму. N-стеароїлетаноламін здебільшого сприяє нормалізації активності ензимів анти-

0

Інтактні

+

До кс ор уб іц ин

ух ли на +

ух ли на

П

Рис. 7

нмоль глутатіону/хв на мг протеїну нмоль глутатіону /хв на мг протеїну

N

ух ли на

П

Ін та кт ні

в тканині печінки, представлені на рис. 8, по700 казали, що розвиток пухлини призводить до 600 зменшенняРис. 7 активності вищезазначеного ензиму. Введення доксорубіцину посилює зміни 500 активності ензиму, спричинені розвитком 400 пухлини. Застосування композиту, але не 300 300 суспензії NSE, запобігає падінню активності 200 глутатіонпероксидази в тканині печінки.

250 100 Дані, представлені на рис. 9, демонструють 0 зростання активності супероксиддисмутази в 200 тканині печінки мишей-пухлиноносіїв. Отже, * розвиток онкологічного процесу спричинює 150 активацію одного з основних ензимів антиоксидантного захисту в усіх досліджуваних 100 органах. Введення доксорубіцину не впливає на активність супероксиддисмутази тканини 50 NSE як без доксорубіцину, печінки. Введення так і на фоні застосування доксорубіцину

До кс ор уб іц ин

800

*

До кс ор уб іц ин

*

П

П

900 ум.од./хв на мг протеїну нмоль глутатіону /хв на мг протеїну

+

Рис. 7. Активність супероксиддисмутази в тканині нирок мишей: 1 – Інтактні; 2 – Пухлина; 1000 4 – Доксорубіцин; 5 – Доксорубіцин+NSE; 6 – NSE+DoxK 3 – Пухлина+NSE;

Доксорубіцин Доксорубіцин + NSE

NSE+DoxK

250 250

Рис. 8

200 200

*

150 150

*

* *#

100 100 50 50

0

1 Інтактні

2 Пухлина

3 + Пухлина NSE

4 5 Доксорубіцин Доксорубіцин + NSE

6 NSE+DoxK

Рис. 8. Активність глутатіонпероксидази в тканині печінки мишей: 1 – Інтактні; 2 – Пухлина;

3 – Пухлина+NSE; 4 – Доксорубіцин; 5 – Доксорубіцин+NSE; 6 – NSE+DoxK

Рис. 8 66

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4

є. А. ¥удзь, н. м. гула, т. о. хмель та ін.

*

350 350

ум.од./хв на мг протеїну

Ум. од./хв на мг протеїну

300 300 250 250 # 200 200

#

150 150 100 100 50 50

00

1 Інтактні

2 Пухлина

3 Пухлина + NSE

4 5 Доксорубіцин Доксорубіцин + NSE

6 NSE+DoxK

Рис. 9. Активність супероксиддисмутази в тканині печінки мишей: 1 – Інтактні; 2 – Пухлина;

3 – Пухлина+NSE; 4 – Доксорубіцин; 5 – Доксорубіцин+NSE; 6 – NSE+DoxK

Рис. 9 оксидантного захисту тканин серця, нирок та печінки мишей – пухлиноносіїв, що отримували доксорубіцин. Антитоксические эффекты N-стеароилэтаноламина в составе суспензии и нанокомпозитного комплекса в органах мышей с карциномой Льюис в условиях введения доксорубицина Е. А. Гудзь1, Н. М. Гулая1, Т. А. Хмель1, Т. Н. Горидько1, Ю. Н. Башта1, Р. Р. Панчук2 , Р. С. Стойка2 , А. А. Рябцева3, А. С. Заиченко3 Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев; e-mail: ngula@biochem.kiev.ua; 2 Институт биологии клетки НАН Украины, Львов; 3 Национальний университет «Львовская Политехника», Украина 1

На модели острой интоксикации доксорубицином в условиях развития карциномы Льюис у мышей-самок в ткани сердца, почек, печени и плазме крови показаны антиоксидантные эффекты N-стеароилэтаноламина

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012 т. 84, № 4

(NSE) в составе нанокомпозитного комплекса и в суспензии. Суспензия NSE снижает уровень мочевины в плазме крови опухоленосителей, рост которого был обнаружен в результате введения доксорубицина. При введении нанокомпозитного комплекса концентрация этого метаболита остается на уровне его у интактных животных. В плазме крови мышейопухоленосителей суспензия NSE и композит снижают активность аспартатаминотрансферазы, основного маркера повреждения ткани сердца, рост активности которой был вызван развитием опухоли. Доксорубицин повышает активность аланинаминотрансферазы, маркера поражения печени, в крови опухоленосителей, введение NSE в составе композита предотвращает рост активности энзима.

N-стеароилэтаноламин как в составе нанокомпозитного комплекса, так и в составе сус­ пензии способствует восстановлению баланса активности энзимов антиоксидантной защиты тканей сердца, почек и печени мышей-опухоленосителей, которые получали доксорубицин. К лючевые с л о в а: N-стеароил­ этаноламин, доксорубицин, сердце, почки, печень, нанокомпозиты, системы транспорта препаратов.

67

експериментальні роботи

Antitoxical effects of N-stearoylethanolamine in suspension and in nanocomposite complex in the organs of mice with the lewis carcinoma under doxorubicin administration I. A. Goudz1, N. M. Gula1, T. O. Khmel1, T. M. Goridko1, Y. M. Bashta1, R. R. Panchuk2 , R. S. Stoika2 , A. A. Ryabtseva3, O. S. Zaichenko3 Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv; e-mail: ngula@biochem.kiev.ua; 2 Institute of Cell Biology, National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv; 3 National University Lviv Politekhnika, Ukraine 1

Summary The antioxidant effects of N-stearoylethanolamine (NSE) in the nanocomplex composition and in suspension are shown on the model of intoxication by doxorubicin in conditions of development of the Lewis carcinoma in the heart, kidneys and liver tissue and in the blood plasma of female mice. The NSE suspension reduces the level of urea in the blood plasma of mice with the Lewis carcinoma, which growth was revealed as a result of introduction of doxorubicin. Under introduction of nanocomplex the amount of urea remains at the level of that in the intact mice. In the blood plasma of mice with the Lewis carcinoma the NSE suspension and nanocomplex reduce activity of aspartate aminotransferase, the basic marker of necrosis of the heart tissue, growth of which was caused by the tumour development. Doxorubicinum increases activity of alanine aminotransferase, the marker of the liver lesion; introduction of NSE in the nanocomplex composition prevents the growth of the enzyme activity. N-stearoylethanolamine, both in the nanocomplex and in suspension, modulates activity of enzymes of antioxidantive protection of the heart, kidney and liver tissue of mice with the Lewis carcinoma.

Key w o r d s: N-stearoylethanolamine, doxorubicin, heart, kidney, liver, delivery of medications systems.

1. Dutta R. C. // Curr. Pharm. Des. – 2007. – 13, N 7. – P. 761–769.

2. Young R. C., Ozols R. F., Myers C. E. // N. Engl. J. Med. – 1981. – 305.– P. 139–153.

68

3. Takemura G., Fujiwara H. // Prog. Cardiovasc.

Dis. – 2007. – 49, N 2. – P. 330–352.

4. Mukhopadhyay P., Rajesh M., Bátkai S. et al. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2009. – 296, N 5. – Н.1466–Н.1483.

5. Pacher P., Beckman J. S., Liaudet L. // Physiol.

Rev. – 2007. – 87, N 1. – P. 315–424.

6. Bai P., Mabley J. G., Liaudet L. et al. // Oncol.

Rep. – 2004. – 11, N 2. – P. 505–508.

7. Myers C. E., McGuire W. P., Liss R. H. et al. // Science. – 1977. – 197. – P. 165–167.

8. Tokarska-Schlattner M., Zaugg M., Zuppinger C. et al. // J. Mol. Cell Cardiol. – 2006. – 41, N 3. – P. 389–405.

9. Nicolay K., Aue W. P., Seelig J. et al. // Biochim.

Biophys. Acta. – 1987 – 929, N 1. – P. 5–13.

10. Kintzel P. E. // Drug. Saf. – 2001. – 24, N 1. – P. 19–38.

11. Reinhold S. W., Reichle A., Leiminger S. et al. // M.C. Res. Notes. – 2011. – 4, N 2. – P. 4–24.

12. Casanova M. L., Blazguez C., MartinezPalacio J. et al. // J. Clin. Invest. – 2003. – 111, N 1.– P. 43–50.

13. Vignot S., Besse B., de la Motte Rouge T. et al. // Bull Cancer. – 2006. – 93, N 2.– P. 163–170.

14. Flygare J., Gustafsson K., Kimby E. et al. // FEBS Lett. – 2005. – 579, N 30.– P. 6885– 6889.

15. Sarnataro D., Grimaldi C., Pisanti S. et al. // Ibid. – N 28.– P. 6343–6349.

16. Nithipatikom K., Endsley M. P., Isbell M.A. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2005. – 332, N 4.– P. 1028–1033.

17. Гула Н. М., Хмель Т. O., Клімашевський В. М. и др. // Укр. біохім. журн. – 2006. – 78, № 1. – С. 135–142.

18. Zaichenko A., Mitina N., Shevchuk O. et al. // Pure Appl. Chem. – 2008. – 80, N 11. – P. 2309–2326.

19. Zaichenko O., Stoika R., R.Mitina R. et al. // Біотехнологія. – 2008. – 1, N 1. – С. 86–99.

20. Lowry O. H., Rosenbrough N. J., Farr A. L. et al. // J. Biol. Chem. –1951. – 193, N 1. – P. 265–275.

21. Королюк М. Л., Иванова Л. И., Майорова И. Г. и др. // Лаб. дело. – 1988. – № 1. – С. 16–18.

22. Чвари С., Андел Т., Штренгер Я. // Там же. – 1991. – № 10. – С. 9–13.

23. Переслегина И. А. // Там же. – 1989. – № 11. – С. 20–23.

24. Тиц Н. А. // Энциклопедия клинических лабораторных тестов. – 1997 – С. 277–178.

25. Анисимов А. А. / Медицинская энзимо­ логия. – Горький, 1978. – 150 с.

ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2012, т. 84, № 4