ТРАНСПОРТ ГЛУТАМАТУВ ТРОМБОЦИТАХ

1234567890 1234567890 1234567890 1234567890

Л.О. КАСАТКІНА Т.О. БОРИСОВА

ТРАНСПОРТ ГЛУТАМАТУ В ТРОМБОЦИТАХ Касаткіна Л.О. м.н.с. відділу нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ. Автор понад 20 наукових праць, в тому числі 7 статей у міжнародних фахових виданнях та 4 патентів України.

ISBN 978-966-02-6632-2

9

789660

266322

Борисова Т.О. д.б.н., пров.н.с. відділу нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ. Автор понад 120 наукових праць, в тому числі 30 статей у міжнародних фахових виданнях та 6 патентів України.

0

255

1

16 14 12 10 8 6 4

1 NIH

03

2 µm

M L-Glu

06 09 01 20 1501 80 2102 40

L.A. KASATKINA, T.A. BORISOVA

GLUTAMATE TRANSPORT IN PLATELETS

Kiev 2013

Л.О. КАСАТКІНА, Т.О. БОРИСОВА

ТРАНСПОРТ ГЛУТАМАТУ В ТРОМБОЦИТАХ

Київ 2013

УДК 576.342:612.822 Монографія узагальнює результати світових та власних досліджень авторів щодо транспорту глутамату в тромбоцитах. В роботі наведено сучасні дані про структуру, транспортний цикл та механізми регуляції роботи високоафінних Na+-залежних транспортерів глутамату, розглянуто особливості функціонування глутаматних рецепторів та шляхи вивільнення глутамату з тромбоцитів. Для науковців, викладачів, аспірантів, студентів біологічних спеціальностей та медиків, чия діяльність та інтереси пов’язані з біохімією, нейрохімією, нейрофізіологією та тромбоцитарною біологією. Висвітлені у монографії питання можуть бути цікавими для широкого кола читачів. Монография обобщает результаты мировых и собственных исследований авторов, посвященных изучению транспорта глутамата в тромбоцитах. В работе приведены современные данные о структуре, транспортном цикле и механизмах регуляции работы высокоаффинных Na+-зависимых транспортеров глутамата, рассмотрены особенности функционирования глутаматных рецепторов и пути высвобождение глутамата из тромбоцитов. Для ученых, преподавателей, аспирантов, студентов биологических специальностей и медиков, чья деятельность и интересы связаны с биохимией, нейрохимией, нейрофизиологией и тромбоцитарной биологией. Освещенные в монографии вопросы могут быть интересными для широкого круга читателей.

The book summarizes the data of the literature and own research results on glutamate transport in platelets. The novel data on the structure, transport cycle and mechanisms of regulation of highaffinity Na+-dependent glutamate transporters, the specific aspects of functioning of glutamate receptors and mechanisms of glutamate release from platelets were discussed.

For researchers, teachers, graduate students in biology and medicine whose activities and interests relate to biochemistry, neurochemistry, neurophysiology and platelet biology. Highlights of the book may be of interest to a wide range of readers.

Рецензенти: заслужений діяч науки і техніки, д.б.н, пров.н.с. лабораторії біології стовбурових клітин відділу клітинної мембранології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України М.К.Малишева д.б.н., гол.н.с. відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Д.В. Колибо Затверджено до друку Вченою радою Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України 23 жовтня 2012 року

ISBN 978-966-02-6632-2

© Л.О. Касаткіна, Т.О. Борисова, 2013

ЗМІСТ Передмова……………………………………………………..............

Preface.................................................................................................... Перелік умовних скорочень………………………………….............

8 10 12

Розділ 1 Тромбоцити як об’єкт нейробіології (Касаткіна Л.О.)

1.1 1.2 1.2.1

1.2.2.

Морфологія тромбоцита та транспорт нейромедіаторів.................................................................. Глутаматні рецептори в тромбоцитах.............................. Іонотропні глутаматні рецептори ………………............

NMDA-рецептори...............................................................

AMPA-рецептори................................................................ Каїнатні рецептори............................................................. Метаботропні глутаматні рецептори................................

14 16 16 18 19 21 22

Розділ 2 Високоафінні Na+-залежні глутаматні транспортери в тромбоцитах (Касаткіна Л.О.)

2.1.

2.2.

2.3.

2.4.

Типи високоафінних Na+-залежних глутаматних транспортерів...................................................................... Молекулярна структура високоафінних Na+-залежних глутаматних транспортерів................................................ Транспортний цикл та стехіометрія процесу високоафінного Na+-залежного накопичення глутамату............................................................................. Аналіз високоафінного Na+-залежного накопичення глутамату в тромбоцитах...................................................

23 24

26 28

Розділ 3 Регуляція функціонування глутаматних транспортерів в тромбоцитах (Борисова Т.О.)

3.1.

3.2.

Зміна поверхневої експресії високоафінних Na+залежних глутаматних транспортерів під дією субстрату............................................................................. Мембранний потенціал плазмалеми та високоафінне Na+-залежне накопичення глутамату тромбоцитами…..

36 37 5

3.3.

Високоафінне Na+-залежне накопичення глутамату тромбоцитами при деполяризації плазматичної мембрани..................................................................................

ліпідного оточення Розділ 4 Вплив глутаматних транспортерів (Борисова Т.О.)

4.1.

4.2.

4.3.

4.4.

4.5.

4.6.

38

на активність в тромбоцитах

Зниження рівня мембранного холестеролу в тромбоцитах з використанням метил-βциклодекстрину.................................................................. Вплив MβCD на протонний градієнт секреторних гранул тромбоцитів…........................................................ Вплив MβCD на мембранний потенціал тромбоцитів… Вплив MβCD на вивільнення ендогенного глутамату з тромбоцитів......................................................................... Вплив комплексу MβCD-холестерол (1:0,2), який збагачує мембрану холестеролом, на протонний градієнт секреторних гранул тромбоцитів………........... Високоафінне Na+-залежне накопичення глутамату при зниженні рівня мембранного холестеролу в тромбоцитах........................................................................

44 48 50 50

52

53

Розділ 5 Організація секреторного апарату та механізм екзоцитозу в тромбоцитах (Касаткіна Л.О.)

5.1.

5.2.

5.3.

5.4 5.5.

Везикулярні транспортери глутамату……………........... Типи секреторних гранул в тромбоцитах………............ Регуляція секреції гранул за участю протеїнкінази……

SNARE-опосередковане злиття мембран………............. Спільні та відмінні риси у організації секреторного апарату в тромбоцитах та нервових закінченнях……....

Розділ 6 Шляхи вивільнення глутамату з тромбоцитів (Борисова Т.О.) Аналіз базального вивільнення глутамату з 6.1. тромбоцитів….....................................................................

6.2. Аналіз транспортер-залежного вивільнення глутамату 6

56 57 60 62 65

67

з тромбоцитів шляхом гетерообміну та за умов деполяризації плазматичної мембрани…......................... 68 Аналіз зміни внутрішньоклітинної концентрації Na+ в 6.3. тромбоцитах при деполяризації плазматичної мембрани…......................................................................... 70 6.4. Вивільнення глутамату з тромбоцитів шляхом екзоцитозу…....................................................................... 71 Аналіз вивільнення ендогенного глутамату з 6.5. тромбоцитів при дисипації протонного градієнта секреторних гранул............................................................ 74 Вивільнення глутамату з тромбоцитів під дією 46.6. амінопіридину..................................................................... 78 Післямова……………………………………………………….......... 84 Afterword................................................................................................ 87 Список цитованих джерел................................................................... 89 Додаток: методи дослідження…………………………..................... 111

7

ПЕРЕДМОВА Глутамат є основним збуджуючим нейромедіатором у центральній нервовій системі (ЦНС) ссавців. Він, зокрема, бере участь процесах розпізнавання, пам'яті, навчання тощо. Тривале підвищення концентрації глутамату в синаптичній щілині призводить до надмірної стимуляції глутаматних рецепторів, що зумовлює розвиток нейротоксичності та загибель нейронів [Featherstone & Shippy, 2008]. Єдиним шляхом швидкого видалення нейромедіатору з синаптичної щілини є його транспорт високоафінними Na+-залежними глутаматними транспортерами ЕААТ 1-5, локалізованими у плазматичній мембрані нейронів і гліальних клітин [Danbolt, 2001]. Глутаматні транспортери плазматичної мембрани використовують Na+/K+ електрохімічний градієнт як рушійну силу для транспорту глутамату в цитозоль. Дослідження тромбоцитів в переважній своїй більшості стосуються їх участі у процесах зсідання крові. Однак окрім своєї основної функції, яку тромбоцити виконують у системі гемостазу, вони є об’єктом уваги нейробіологів. Це зумовлено тим, що в тромбоцитах представлений комплекс молекул, залучених до транспорту глутамату (а також ГАМК та серотоніну), та рецептори до цих нейромедіаторів. Тромбоцити експресують високоафінні Na+-залежні глутаматні транспортери нейронального та гліального типу (ЕААТ 1-3) на плазматичній мембрані. Глутамат з цитозолю акумулюється в секреторних гранулах тромбоцитів за участю двох типів везикулярних транспортерів глутамату VGLUT1 та 2. Крім того, на мембрані тромбоцитів представлені іонотропні (NMDA-, AMPA- та каїнатні) та метаботропні (mGlu3,4) глутаматні рецептори. Встановлено, що тромбоцити є важливою системою кліренсу глутамату з крові, та припускається, що транспорт цього нейромедіатора в тромбоцитах може бути важливим для загального гомеостазу глутамату в ЦНС. При підвищенні позаклітинної концентрації глутамату цей нейромедіатор може видалятись з позаклітинного простору не лише за рахунок роботи глутаматних транспортерів нервових клітин, але й з залученням глутаматних транспортерів ендотеліальних клітин надходити в плазму крові через гематоенцефалічний бар’єр [O'Kane et al., 1999; Gottlieb et al., 2003]. Порушення транспорту глутамату є характерною рисою патогенезу багатьох нейрологічних захворювань, стрімке поширення яких 8