Factor neurofrótico

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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 97906022.5 kFecha de presentaci´on: 14.02.1997 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 822 829 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 11.02.1998

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54 T´ıtulo: Utilizaci´ on del factor neurotr´ ofico derivado de c´ elulas gliales (GDNF) para el tratamiento

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de las deficiencias auditivas.

30 Prioridad: 23.02.1996 US 606176

13.09.1996 US 710219

One Amgen Center Drive Thousand Oaks, California 91320-1799, US

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72 Inventor/es: Magal, Ella

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74 Agente: Ungr´ıa L´ opez, Javier

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.08.2002

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.08.2002

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73 Titular/es: Amgen Inc.

Aviso:

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas).

Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 170 938 T3 DESCRIPCION Utilizaci´on del factor neurotr´ ofico derivado de c´elulas gliales (GDNF) para el tratamiento de las deficiencias auditivas.

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Antecedentes de la invenci´ on La presente invenci´on est´a relacionada de manera general con la prevenci´on y/o tratamiento de lesiones o de la degeneraci´on de c´elulas sensoriales del o´ıdo interno, tales como las c´elulas ciliadas y las neuronas auditivas, mediante la administraci´ on de un producto proteico factor neurotr´ ofico derivado de una l´ınea de c´elulas gliales (GDNF). La invenci´on se refiere espec´ıficamente a la prevenci´on y/o tratamiento de la p´erdida auditiva debida a una variedad de causas.

Los factores neurotr´ oficos son prote´ınas naturales, encontradas en el sistema nervioso o en tejidos no nerviosos inervados por el sistema nervioso, que act´ uan para estimular la supervivencia y mantener la diferenciaci´on fenot´ıpica de ciertas poblaciones de c´elulas nerviosas y/o gliales (Varon y col., Ann. Rev. Neuroscience, 1:327, 1979; Thoenen y col., Science, 229:238, 1985). Debido a este papel fisiol´ ogico, los factores neurotr´ oficos son u ´ tiles para tratar la degeneraci´ on de tales c´elulas nerviosas y la p´erdida de la funci´ on diferenciada resultante de un da˜ no nervioso. El da˜ no nervioso est´a causado por condiciones que comprometen la supervivencia y/o la funci´ on correcta de uno o m´as tipos de c´elulas nerviosas, incluyendo: (1) el da˜ no f´ısico, que causa la degeneraci´ on de los procesos axonales (que a su vez produce la muerte de las c´elulas nerviosas) y/o de los cuerpos de las c´elulas nerviosas pr´oximas al lugar del da˜ no, (2) el cese temporal o permanente de flujo sangu´ıneo (isquemia) hacia partes del sistema nervioso, como en la aplopej´ıa, (3) la exposici´ on intencionada o accidental a neurotoxinas, tales como los agentes quimioterap´euticos para el c´ancer y el SIDA cisplatino y didesoxicitidina, respectivamente, (4) enfermedades metab´ olicas cr´ onicas, tales como diabetes o disfunci´ on renal, o´ (5) enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la Esclerosis Lateral Amiotr´ofica, que resultan de la degeneraci´ on de poblaciones neuronales espec´ıficas. Con el fin de que un factor neurotr´ofico particular sea potencialmente u ´ til en el tratamiento del da˜ no nervioso, la clase o clases de c´elulas nerviosas da˜ nadas deben ser sensibles al factor. Se ha establecido que todas las poblaciones de neuronas no son sensibles a, o no se ven afectadas igualmente por, todos los factores neurotr´oficos.

El primer factor neurotr´ ofico identificado fue el factor de crecimiento nervioso (NGF). El NGF es el primer miembro de una familia definida de factores tr´ oficos, llamados neurotrofinas, que actualmente incluye el factor neurotr´ ofico derivado de cerebro (BDNF), la neurotrofina 3 (NT-3), NT-4/5 y NT-6 (Thoenen, Trends. Neurosci., 14:165-170, 1991; Snider, Cell, 77:627-638, 1994; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18:223-253, 1995). Se sabe que estas neurotrofinas act´ uan a trav´es de la familia de receptores de la tirosina quinasa trk, esto es, trkA, trkB, trkC y el receptor de baja afinidad p75 (Snider, Cell, 77:627638, 1994; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18:223-253, 1995; Chao y col., TINS, 18:321-326, 1995).

El factor neurotr´ ofico derivado de una l´ınea de c´elulas gliales (GDNF) es una prote´ına recientemente descubierta identificada y purificada utilizando ensayos basados en su eficacia para promover la supervivencia y estimular el fenotipo transmisor de las neuronas dopamin´ergicas mesencef´alicas in vitro (Lin y col., Science, 260:1130-1132, 1993). El GDNF es un homod´ımero glicosilado unido por disulfuro que tiene cierta homolog´ıa estructural con la superfamilia de prote´ınas del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) (Lin y col., Science, 260:1130-1132, 1993; Krieglstein y col., EMBO J., 14:736-742, 1995; Poulsen y col., Neuron, 13:1245-1252, 1994). Se ha detectado ARNm del GDNF en c´elulas musculares y en las c´elulas de Schwann del sistema nervioso perif´erico (Henderson y col., Science, 266:1062-1064, 1994; Trupp y col., J. Cell Biol., 130:137-148, 1995) y en los astrocitos de tipo I del sistema nervioso central (Shaar y col., Exp. Neurol., 124:368-371, 1993). In vivo, el tratamiento con GDNF ex´ ogeno estimula el fenotipo dopamin´ergico de las neuronas de la sustancia nigra y restaura los d´ eficits funcionales inducidos por axotom´ıa o por neurotoxinas dopamin´ergicas en modelos animales de la enfermedad de Parkinson (Hudson y col., Brain Res. Bull., 36:425-432, 1995; Beck y col., Nature, 373:339-341, 1995; Tomac y col., Nature, 373:335-339, 1995; Hoffer y col., Neurosci. Lett., 182:107-111, 1994). Aunque originalmente se pens´ o que era relativamente espec´ıfico para las neuronas dopamin´ergicas, al menos in vitro, est´an comenzando a surgir indicios que indican que el GDNF puede tener un espectro mayor de dianas neurotr´ oficas adem´as de las neuronas dopamin´ergicas mesencef´alicas y las neuronas motoras som´aticas (Yan y Matheson, Nature, 373:341-344, 1995; Oppenheim y col., Nature, 373:344-346, 1995; Matheson y col., Soc. Neurosci. Abstr., 21:544, 1995; Trupp y col., J. Cell Biol., 130:137-148, 1995). En particular, se encontr´o que el GDNF ten´ıa eficacia neurotr´ ofica sobre las neuronas motoras colin´ergicas del tronco cerebral y de la m´edula espinal, tanto in vivo como in vitro (Oppenheim y col., Nature, 373:344-346, 1995; Zurn y col., Neuroreport, 6:113-118, 1994; Yan y col., Nature, 373:341-344, 1995; Henderson y col., Science, 266:1062-1064, 1994), sobre neuronas de la retina, tales como las fotorreceptoras, in vitro (Solicitud de 2

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EE.UU. N◦ de Serie 08/564.833 actualmente pendiente, de Louis, registrada el 29 de Noviembre de 1995) y sobre c´elulas de los ganglios retinales in vitro e in vivo (Solicitud de EE.UU. N◦ de Serie 08/564.458 actualmente pendiente, de Yan, registrada el 29 de Noviembre de 1995) y sobre las neuronas sensoriales del ganglio de la ra´ız dorsal in vitro e in vivo (Solicitud de EE.UU. N◦ de Serie 08/564.844 actualmente pendiente (de Yan y col.), registrada el 29 de Noviembre de 1995).

Es de inter´es general para la presente invenci´on WO 93/06116 (Lin y col., Empresa Conjunta SyntexSynergen Neuroscience), publicada el 1 de Abril de 1993, que describe que el GDNF es u ´til para el tratamiento de lesiones nerviosas, incluyendo las lesiones asociadas con la enfermedad de Parkinson. Son tambi´en de inter´es un trabajo de Schmidt-Kastner y col., Mol. Brain Res., 26:325-330, 1994, en el que ARNm del GDNF result´ o detectable y fue regulado al alza despu´es de ataques inducidos por pilocarpina; trabajos de Shaar y col., Exp. Neurol., 124:368-371, 1993 y Shaar y col., Exp. Neurol., 130:387-393, 1994, en los que astrocitos del cerebro anterior basal expresaban niveles moderados de ARNm de GDNF bajo condiciones de cultivo, pero GDNF no alteraba la actividad de ChAT del cerebro anterior basal y un trabajo en la Solicitud de EE.UU. N◦ de Serie 08/535.682, actualmente pendiente, registrada el 28 de Septiembre de 1995, en el que GDNF es u ´ til para tratar lesiones o la degeneraci´ on de neuronas colin´ergicas del cerebro anterior basal. No se ha demostrado previamente que el GDNF estimule la supervivencia, la regeneraci´on o la protecci´ on frente a la degeneraci´ on de c´elulas del o´ıdo interno tales como las c´elulas ciliadas y las neuronas auditivas.

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Las c´elulas ciliadas neuroepiteliales del ´organo de Corti del o´ıdo interno, convierten el sonido en actividad neural, que se transmite a lo largo de la divisi´on coclear del octavo nervio craneal. Este nervio consta de fibras de tres tipos de neuronas (Spoendlin, H.H. En: Friedmann, I., Ballantyne, J., eds. Ultrastructural Atlas of the Inner Ear. London, Butterworth, pp. 133-164, 1984): 1) neuronas aferentes, que est´ an en el ganglio espiral y conectan la c´ oclea con el tronco cerebral; 2) neuronas olivococleares eferentes, que se originan en el complejo olivar superior y 3) neuronas adren´ergicas aut´onomas, que se originan en el tronco simp´ atico cervical e inervan la c´oclea. En el humano, hay aproximadamente 30.000 neuronas cocleares aferentes, con axones mielinados, constando cada una de ellas de 50 laminillas aproximadamente y 4-6 µm de di´ ametro. Esta estructura histol´ ogica forma la base de una velocidad de conducci´ on uniforme, que es una caracter´ıstica funcional importante. Por toda la longitud del nervio auditivo, hay una disposici´ on tr´ ofica de fibras aferentes, con fibras “basales” enrolladas sobre las fibras “apicales” colocadas en el centro de forma retorcida similar a una soga. Spoendlin (Spoendlin, H.H. En: Naunton, R.F., Fernadex, C., eds. Evoked Electrical Activity in the Auditory Nervous System. London, Academic Press, pp. 21-39, 1978) identific´ o dos tipos de neuronas aferentes en el ganglio espiral sobre la base de diferencias morfol´ ogicas: las c´elulas de tipo I (95 %) son bipolares y tienen cuerpos celulares mielinados y axones que se proyectan hacia las c´elulas ciliadas internas. Las c´elulas de tipo II (5 %) son monopolares con axones no mielinados y se proyectan hacia las c´elulas ciliadas externas del ´organo de Corti. Cada c´elula ciliada interna est´a inervada por 20 fibras aproximadamente, cada una de las cuales hace sinapsis solamente sobre una c´elula. En contraste, cada c´elula ciliada externa est´ a inervada por seis fibras aproximadamente, y cada fibra se ramifica para inervar a 10 c´elulas aproximadamente. En la c´oclea, las fibras se dividen en: 1) un grupo espiral interno, que surge primariamente de manera ipsilateral y hace sinapsis con las neuronas aferentes a las c´elulas ciliadas internas y 2) un grupo radial externo m´as numeroso que surge principalmente de manera contralateral y hace sinapsis directamente con las c´elulas ciliadas externas. Existe un umbral m´ınimo para una frecuencia, la frecuencia caracter´ıstica o mejor frecuencia, pero el umbral se eleva marcadamente para frecuencias por encima y por debajo de este nivel (Pickles, J.O. En: Introduction to the Physiology of Hearing. London, Academic Press, pp. 71-106, 1982). Las fibras nerviosas auditivas individuales parecen comportarse por tanto como filtros de banda u ´ til de frecuencias. La membrana basilar vibra preferencialmente a frecuencias diferentes, a diferentes distancias a lo largo de su longitud, y la selectividad de frecuencias de cada fibra nerviosa coclear es similar a la de la c´elula ciliar interna a la que la fibra est´a conectada. As´ı, cada fibra nerviosa coclear exhibe una curva de rotaci´ on que cubre un rango diferente de frecuencias desde su fibra vecina (Evans, E.F. En: Beagley H.A. ed. Auditory Investigation: The Scientific and Technological Basis. New York, Oxford University Press, 1979). Mediante este mecanismo, los sonidos complejos son desglosados en sus frecuencias componentes (resoluci´ on de frecuencias) por los filtros del o´ıdo interno.

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La p´erdida auditiva de un grado suficiente para interferir con las comunicaciones sociales y relacionadas con el trabajo, est´ a entre las discapacidades neurales cr´onicas m´as comunes en la poblaci´on de EE.UU. Sobre la base de los datos de encuestas sobre la salud (Vital and Health Statistics. Serie 10. N◦ 176. Washington, D.C. (Publicaci´ on de DHHS n◦ (PHS) 90-1504)), se calcula que el 4 por ciento aproximadamente de personas menores de 45 a˜ nos de edad y el 29 por ciento aproximadamente de las personas de 65 a˜ nos o mayores tienen una p´erdida de audici´ on discapacitante. Se ha estimado que m´ as de 28 millones de americanos tienen un deterioro de la audici´ on y que tantos como 2 millones de este grupo est´an 3

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profundamente sordos (un informe del grupo de trabajo sobre el Plan Estrat´egico Nacional. Bethesda, Md.: National Institute of Health, 1989). La frecuencia de la p´erdida auditiva aumenta dram´ aticamente con la edad. Aproximadamente 1 por 1000 ni˜ nos tiene una p´erdida auditiva suficientemente grave para impedir el desarrollo sin ayuda del lenguaje hablado (Gentile, A. y col., Characteristics of persons with impaired hearing: United States, 1962-1963. Serie 10. N◦ 35. Washington, D.C.: Government Printing Office, 1967 (Publicaci´on de DHHS n◦ (PHS) 1000)) (Human communication and its disorders: an overview. Bethesda, Md.: National Institutes of Health, 1970). M´ as de 360 por 1000 personas mayores de 75 a˜ nos de edad tienen una p´erdida auditiva discapacitante (Vital and Health Statistics. Serie 10. N◦ 176.

Washington, D.C. (Publicaci´ on de DHHS n◦ (PHS) 90-1504)).

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Se ha calculado que el coste de la productividad perdida, de la educaci´ on especial y del tratamiento m´edico puede ser superior a 30 billones de $ por a˜ no para los trastornos auditivos, del habla y del lenguaje (1990 Annual Report of the National Deafness and other Communication Disorders Advisory Board. Washington, D.C.: Government Printing Office, 1991. (Publicaci´ on de DHHS n◦ (NIH) 913189)). Las principales causas comunes de la sordera profunda en la infancia son trastornos gen´eticos y meningitis, que constituyen el 13 por ciento y el 9 por ciento aproximadamente del total, respectivamente (Hotchkiss, D. Demographic aspects of hearing impairment: questions and answers. 2a¯ ed. Washington, D.C.: Gallaudet University Press, 1989). En aproximadamente el 50 por ciento de los casos de sordera infantil, la causa es desconocida pero es debida probablemente a causas gen´eticas o a una predisposici´on gen´etica (Nance, W.E., Sweeney, A. Otolaryngol. Clin. North Am., 8:19-48, 1975).

Una discapacidad en cualquier lugar a lo largo de la ruta auditiva, desde el canal auditivo externo hasta el sistema nervioso central, puede tener como resultado una p´erdida auditiva. El aparato auditivo puede ser subdividido en el o´ıdo externo y medio, el o´ıdo interno y el nervio auditivo y las rutas auditivas centrales. La informaci´on auditiva en los humanos es transformada desde una se˜ nal mec´anica a un impulso el´ectrico conducido neuralmente por la acci´ on de 15.000 c´elulas neuroepiteliales aproximadamente (c´elulas ciliadas) y 30.000 neuronas de primer orden (c´elulas del ganglio espiral) en el o´ıdo interno. Todas las fibras centrales de neuronas del ganglio espiral forman sinapsis en el n´ ucleo coclear del tronco cerebral pontino. El n´ umero de neuronas implicadas en la audici´on aumenta dram´ aticamente desde la c´oclea al tronco cerebral auditivo y a la corteza auditiva. Toda la informaci´ on auditiva es transformada por solamente 15.000 c´elulas ciliadas, de las cuales las llamadas c´elulas ciliadas internas, en un n´ umero de 3500, son cr´ıticamente importantes ya que forman sinapsis con el 90 por ciento aproximadamente de las 30.000 neuronas auditivas primarias. De este modo, el da˜ no a un n´ umero de c´elulas relativamente peque˜ no en la periferia auditiva puede conducir a una p´erdida sustancial de la audici´ on. Por tanto, la mayor´ıa de las causas de la p´erdida sensorineural pueden ser atribuidas a lesiones del o´ıdo interno (Nadol, J.B., New England Journal of Medicine, 329:1092-1102, 1993).

La p´erdida auditiva puede ser a nivel de conductividad, sensorineural y a nivel central. La p´erdida auditiva conductiva est´ a causada por lesiones que implican al o´ıdo externo o medio y que tienen como resultado la destrucci´on de la ruta normal del sonido transmitido por el aire amplificado por la membrana timp´ anica y los huesecillos hacia los fluidos del o´ıdo interno. La p´erdida auditiva sensorineural est´ a causada por lesiones de la c´oclea o de la divisi´on auditiva del octavo nervio craneal. La p´erdida de audici´ on ´ central es debida a lesiones de las rutas auditivas centrales. Estas constan del complejo del n´ ucleo olivar coclear y dorsal, de los col´ıculos inferiores, de los cuerpos geniculados medios, de la corteza auditiva en los l´obulos temporales y de los tractos de fibras de interconexi´ on aferentes y eferentes (Adams, R.D. y Maurice, V. Eds. En: Principles of Neurology. 1989. McGraw-Hill Information Services Company. pp.

226-246).

Seg´ un se mencion´ o previamente, al menos un 50 por ciento de los casos de sordera profunda en la infancia tienen causas gen´eticas (Brown, K.S. Med. Clin. North Am., 53:741-72, 1969). Si se considera que la probabilidad de que una predisposici´ on gen´etica sea un factor causante principal de la presbiacusia - o p´erdida auditiva relacionada con la edad - que afecta a un tercio de la poblaci´ on de m´ as de 75 a˜ nos de edad (Nadol, J.B. En: Beasley, D.S, Davis, G.A., eds. Aging: Communication Processes and Disorders. New York: Grune & Stratton, 1981:63-85), los factores gen´eticos y hereditarios son probablemente la u ´ nica causa m´ as com´ un de p´erdida auditiva. Las anomal´ıas gen´eticas son mucho m´as com´ unmente expresadas como p´erdida auditiva sensorineural que como p´erdida auditiva conductiva. La p´erdida auditiva sensorineural gen´eticamente determinada es claramente una causa importante, si no la principal, de la p´erdida sensorineural, particularmente en ni˜ nos (Nance, W.E., Sweeney, A. Otolaryngol.

Clin. North Am., 8:19-48, 1975). Entre las formas de s´ındromes m´as comunes de p´erdida sensorineural est´an el s´ındrome de Waardenburg, el s´ındrome de Alport y el s´ındrome de Usher.

Una variedad de f´ armacos com´ unmente utilizados tienen propiedades otot´ oxicas. Los m´as conocidos 4

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son los antibi´oticos aminogluc´osidos (Lerner, S.A. y col. eds. Aminoglycoside Ototoxicity. Boston: Little, Brown, 1981; Smith, C.R. y col. N. Engl. J. Med., 302:1106-9, 1980), los diur´eticos del asa (Bosher, S.K. Acta Otolaryngol. (Stockh.) 90:4-54, 1980), los salicilatos (Myers, E.N. y col. N. Engl. J. Med., 273:587-90, 1965) y los agentes antineopl´asicos tales como cisplatino (Strauss, M. y col. Laryngoscope, 143:1263-5, 1983). Se ha descrito tambi´en ototoxicidad durante la administraci´ on oral o parenteral de eritromicina (Kroboth, P.D. y col. Arch. Intern. Med., 1:169-79, 1983; Achweitzer, V.G., Olson, N. Arch.

Otolaryngol., 110:258-60, 1984).

La mayor´ıa de las sustancias otot´ oxicas causan la p´erdida de audici´ on da˜ nando la c´ oclea, particularmente las c´elulas ciliadas auditivas y la estr´ıa vascular, un o´rgano epitelial especializado en el o´ıdo interno, que es responsable de la homeostasis de fluidos y electrolitos (Nadol, J.B. New England J. Med., 329:1092-1102, 1993). Puede tener lugar una degeneraci´ on neural secundaria muchos a˜ nos despu´es de un acontecimiento otot´oxico que afecte a las c´elulas ciliadas. Hay indicios de que algunas sustancias otot´oxicas pueden ser concentradas selectivamente en el o´ıdo interno, teniendo como resultado una p´erdida sensorineural progresiva a pesar de la interrupci´ on de la administraci´on sist´emica (Federspil, P. y col. J. Infect. Dis., 134 Supl.:S200-S205, 1976).

El trauma debido a una sobreestimulaci´ on ac´ ustica es otra causa principal de la sordera. Existe una susceptibilidad individual al trauma por ruido. Puede tener lugar una p´erdida de audici´ on sensorineural cl´ınicamente importante en algunas personas expuestas a ruido de alta intensidad, incluso por debajo de los niveles aprobados por la Occupational Safety and Health Agency (Osguthorpe, J.D. ed. Washington D.C.: American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery Foundation, 1988).

Los procesos desmielinizantes, tales como la esclerosis m´ ultiple, pueden causar una p´erdida auditiva sensorineural (Noffsinger, D. y col. Acta Otolaryngol. Suppl. (Stockh.), 303:1-63, 1972). M´as recientemente, se ha reconocido una forma de p´erdida auditiva sensorineural mediada por el sistema inmune (McCabe, B.F. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol., 88:585-9, 1979). La p´erdida auditiva es normalmente bilateral, progresa r´ apidamente (medida en semanas y meses) y puede estar o no asociada con s´ıntomas vestibulares.

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Una variedad de tumores, primarios y metast´ asicos, pueden producir una p´erdida auditiva conductiva o una p´erdida auditiva sensorineural por la invasi´ on del o´ıdo interno o del nervio auditivo (Houck, J.R. y col. Otolaryngol. Head Neck Surg., 106:92-7, 1992). Una variedad de trastornos degenerativos de causa desconocida pueden producir una p´erdida auditiva sensorineural. El s´ındrome de Meniere (Nadol, J.B. ed. Meniere’s disease: pathogenesis, pathophysiology, diagnosis, and treatment. Amsterdam: Kugler & Ghedini, 1989), caracterizado por una p´erdida auditiva sensorineural fluctuante, v´ertigo epis´odico y tinnitus, parece estar causado por un trastorno de la hemostasis de fluidos en el o´ıdo interno, aunque la patog´enesis permanece desconocida. La p´erdida auditiva sensorineural idiop´ atica repentina (Wilson, W.R. y col. Arch. Otolaryngol., 106:772-6, 1980), que causa una sordera sensorineural de moderada a grave, puede ser debida a varias causas, incluyendo isquemia del o´ıdo interno y laberintitis v´ırica.

La presbiacusia, p´erdida auditiva asociada con la edad, afecta a m´ as de un tercio de personas con m´ as de 75 a˜ nos de edad. La correlaci´ on histopatol´ ogica m´ as com´ un de la presbiacusia es la p´erdida de c´elulas neuroepiteliales (ciliadas), neuronas y de la estr´ıa vascular del sistema auditivo perif´erico (Schuknecht, H.F. Pathology of the Ear. Cambridge, Mass: Harvard University Press, 1974:388-403). La presbiacusia es mejor comprendida como resultado de efectos acumulativos de varias influencias nocivas durante la vida, incluyendo trauma por ruidos, ototoxicidad y degeneraci´ on influenciada gen´eticamente.

Se ha demostrado que ciertos factores neurotr´ oficos regulan la diferenciaci´ on y la supervivencia neuronal durante el desarrollo (Korsching, S. J. Neurosci., 13:2739-2748, 1993) y protegen a las neuronas del da˜ no y de las toxinas en el adulto (Hefti, Neurosci., 6:2155-2162, 1986; Apfel y col. Ann. Neurol., 29:8789, 1991; Hyman y col. Nature, 350:230-233, 1991; Knusel y col., J. Neurosci., 12:4391-4402, 1992; Yan y col. Nature, 360:753-755, 1992; Koliatsos y col. Neuron., 10:359-367, 1993). Estudios de hibridaci´ on in situ indican que ARNms para los receptores de neurotrofinas TrkB y TrkC son expresados por ganglios cocleovestibulares en desarrollo (Ylikoski y col. Hear. Res., 65:69-78, 1993; Schecterson y col. Hearing Res., 73:92-100, 1994) y que se encuentran ARNms para BDNF y NT-3 en el o´ıdo interno, incluyendo el organo de Corti (Pirvola y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9915-9919, 1992; Schecterson y col. Hea´ ring Res., 73:92-100, 1994; Wheeler y col., Hearing Res., 73:46-56, 1994). Se investig´o el papel fisiol´ ogico de BDNF y NT-3 en el desarrollo de los sistemas vestibular y auditivo en ratones que llevaban un gen de BDNF y/o NT-3 eliminado (Ernfors y col. Neuron, 14:1153-1164, 1995). En la c´oclea, los mutantes de BDNF perdieron las neuronas espirales de tipo 2, produciendo la ausencia de inervaci´on de las c´elulas ciliadas externas. Los mutantes de NT-3 mostraron una escasez de aferentes y perdieron el 87 por ciento 5

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de neuronas espirales, que correspond´ıan presumiblemente a neuronas de tipo 1, que inervan las c´elulas ciliadas internas. Los mutantes dobles ten´ıan una p´erdida auditiva, careciendo de todas las neuronas vestibulares y espirales. El requisito de los receptores TrkB y TrkC para la supervivencia de poblaciones neuronales espec´ıficas y el mantenimiento de la inervaci´ on de la diana en el sistema sensorial perif´erico del o´ıdo interno, fue demostrado mediante el estudio de ratones que llevaban una mutaci´ on en la l´ınea germinal del dominio catal´ıtico de la tirosina quinasa de estos genes (Schimmang y col. Development, 121:3381-3391, 1995). Gao y col. (J. Neurosci., 15:5079-5087, 1995) mostraron la potencia estimuladora de la supervivencia de NT-4/5, BDNF y NT-3 para las neuronas del ganglio espiral postnatal de rata en cultivos disociados, y que NT-4/5 proteg´ıa a estas neuronas de los efectos neurot´ oxicos del f´ armaco anticanceroso cisplatino. Adem´ as, se ha demostrado tambi´en que BDNF y NT-3 apoyan la supervivencia de neuronas auditivas de rata adulta en cultivos disociados (Lef`ebvre y col. NeuroReport, 5:865-868, 1994).

No ha habido informes previos de la utilizaci´ on de GDNF en el tratamiento de la p´erdida auditiva.

Como el deterioro de la audici´ on es una desgracia seria, la identificaci´on de cualquier agente y m´etodo de tratamiento que pueda proteger a las neuronas auditivas y a las c´elulas ciliadas de un da˜ no, ser´ıa de gran beneficio.

Resumen de la invenci´ on

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La presente invenci´on se refiere a la utilizaci´on de un producto proteico factor neurotr´ ofico derivado de una l´ınea celular glial (GDNF) para la fabricaci´ on de un medicamento para tratar la p´erdida auditiva sensorineural, adecuado para la administraci´ on a un sujeto que tenga una lesi´ on en el o´ıdo interno de una cantidad terap´euticamente eficaz de GDNF. Por ejemplo, la p´erdida auditiva puede estar asociada con una lesi´on o con la degeneraci´on de las c´elulas ciliadas neuroepiteliales (c´elulas ciliadas cocleares) o de las neuronas del ganglio espiral en el o´ıdo interno.

La presente invenci´on est´a basada en los descubrimientos de que las c´elulas ciliadas responden a GDNF resistiendo a los efectos t´oxicos de ototoxinas, tales como cisplatino y neomicina, y de que las neuronas auditivas responden tambi´en a GDNF resistiendo a los efectos t´oxicos de una variedad de ototoxinas, tales como por ejemplo cisplatino, neomicina y salicilato de sodio. Por tanto, puede administrarse una cantidad terap´euticamente eficaz del producto proteico GDNF para estimular la protecci´ on, la supervivencia o la regeneraci´on de c´elulas ciliadas y de neuronas del ganglio espiral.

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Se ha descubierto tambi´en que pueden tratarse lesiones o trastornos del aparato vestibular mediante la administraci´on a un sujeto que tenga tal lesi´ on o trastorno de una cantidad terap´ euticamente eficaz de un producto proteico GDNF. Tales lesiones pueden tener como resultado mareos, v´ertigo o p´erdida del equilibrio.

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Se contempla que tales productos proteicos GDNF incluir´ıan una prote´ına GDNF tal como la representada por la secuencia de amino´ acidos mostrada en la Figura 1 (SEC ID N◦ :1), as´ı como variantes y derivados de la misma. Se contempla tambi´en que tales productos proteicos GDNF incluir´ıan [Met−1 ]GDNF.

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De acuerdo con la invenci´ on, el producto proteico GDNF puede ser administrado parenteralmente a una dosis que oscila desde 1 µg/kg/d´ıa aproximadamente hasta 100 mg/kg/d´ıa aproximadamente, t´ıpicamente a una dosis de 0,1 mg/kg/d´ıa aproximadamente a 25 mg/kg/d´ıa aproximadamente, y normalmente a una dosis de 5 mg/kg/d´ıa aproximadamente a 20 mg/kg/d´ıa aproximadamente. Se contempla tambi´en que, dependiendo de las necesidades del paciente individual y de la v´ıa de administraci´ on, el producto proteico GDNF puede ser administrado con una menor frecuencia tal como semanalmente o varias veces por semana, en lugar de diariamente. Se contempla adem´ as que el producto proteico GDNF puede ser administrado directamente en el o´ıdo medio o en el o´ıdo interno. Una persona experta en la t´ecnica apreciar´a que con tal administraci´ on de una cantidad m´ as peque˜ na del producto proteico GDNF puede utilizarse, por ejemplo, una dosis de administraci´ on directa en el o´ıdo medio o en el o´ıdo interno en el rango de 1 µg/o´ıdo aproximadamente a 1 mg/o´ıdo aproximadamente en una u ´nica inyecci´on o en inyecciones m´ ultiples.

Se contempla adem´as que el producto proteico GDNF sea administrado en combinaci´ on o conjunci´ on con una cantidad eficaz de un segundo agente terap´eutico tal como BDNF y NT-3. La invenci´on proporciona tambi´en la utilizaci´on del producto proteico GDNF en la fabricaci´ on de un medicamento o composici´ on farmac´eutica para el tratamiento de lesiones o de la degeneraci´on de las c´elulas ciliadas y de las neuronas auditivas para la variedad de causas de la p´erdida auditiva sensorineural. Tales composiciones farmac´euticas incluyen formulaciones del producto proteico GDNF para el o´ıdo medio e interno, 6

ES 2 170 938 T3 t´ opicas, orales, solas o en combinaci´ on con implantes cocleares.

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Se apreciar´ a tambi´en por los expertos en la t´ecnica que el proceso de administraci´on puede ser realizado por medio de terapia celular y terapia g´enica, seg´ un se describir´ a adicionalmente m´as adelante. Por ejemplo, en un medio de terapia g´enica las c´elulas han sido modificadas para que produzcan y secreten el producto proteico GDNF. Las c´elulas pueden ser modificadas ex vivo o in vivo. Numerosos aspectos y ventajas adicionales de la invenci´on ser´ an obvios para los expertos en la t´ecnica despu´es de considerar la siguiente descripci´on detallada de la invenci´ on que describe las realizaciones de la misma actualmente preferidas.

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Descripci´ on detallada de la invenci´ on

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La presente invenci´on se refiere a la utilizaci´on de un producto proteico factor neurotr´ ofico derivado de una l´ınea celular glial (GDNF) para la fabricaci´ on de un medicamento para prevenir y/o tratar la p´erdida auditiva sensorineural, adecuado para administrar una cantidad terap´euticamente eficaz de GDNF. De acuerdo con un aspecto de la invenci´ on, el producto proteico GDNF es utilizado para la fabricaci´ on de un medicamento para tratar c´elulas ciliadas y neuronas auditivas da˜ nadas, adecuado para administrar una cantidad terap´euticamente eficaz del producto proteico GDNF y donde el producto proteico GDNF va a ser administrado por medio de una composici´ on farmac´eutica, de la implantaci´ on de c´elulas que expresan GDNF o mediante terapia g´enica de GDNF. La invenci´on puede ser practicada utilizando cualquier producto proteico GDNF biol´ ogicamente activo, incluyendo una prote´ına GDNF representada por la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID N◦ :1, incluyendo variantes y derivados de la misma.

Adem´as de la administraci´on oral, parenteral o t´ opica del producto proteico GDNF, se contempla la administraci´on a trav´es de procedimientos de terapia celular y terapia g´enica.

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La presente invenci´on est´ a basada en los descubrimientos iniciales de que GDNF protege a las c´elulas ciliadas de la muerte celular inducida por ototoxinas en cultivos de explantes de c´ oclea de rata y en neuronas del ganglio espiral disociadas en cultivo procedentes de ratas adultas. Se contempla que la administraci´on del producto proteico GDNF ex´ ogeno proteger´ a a las c´elulas ciliadas y a las neuronas del ganglio espiral del da˜ no traum´ atico (tal como un trauma por ruido y tratamientos agudos o cr´ onicos con cisplatino y antibi´ oticos aminogluc´osidos) o del da˜ no resultante de una falta de factores neurotr´ oficos causada por la interrupci´ on del transporte de los factores desde el ax´on hasta el cuerpo celular. Se espera que tal tratamiento permita a las c´elulas ciliadas y/o a las c´elulas auditivas tolerar agresiones intermitentes procedentes de un trauma por ruido medioambiental o de tratamientos con ototoxinas y enlentecer la degeneraci´on progresiva de las neuronas auditivas y de las c´elulas ciliadas que es responsable de la p´erdida auditiva en condiciones patol´ogicas tales como la presbiacusia (p´erdida auditiva relacionada con la edad), la degeneraci´ on sensorineural heredada y las p´erdidas auditivas post-idiop´ aticas, y conservar la integridad funcional del o´ıdo interno. Apoyar´ a tambi´en a las neuronas auditivas para un funcionamiento mejor y m´ as largo de los implantes cocleares.

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De acuerdo con la invenci´ on, el producto proteico GDNF puede ser administrado en el o´ıdo medio a una dosis que oscila desde 1 µg/kg/d´ıa aproximadamente hasta 100 mg/kg/d´ıa aproximadamente, t´ıpicamente a una dosis de 0,1 mg/kg/d´ıa aproximadamente a 25 mg/kg/d´ıa aproximadamente, y normalmente a una dosis de 5 mg/kg/d´ıa aproximadamente a 20 mg/kg/d´ıa aproximadamente. El producto proteico GDNF puede ser administrado directamente en el o´ıdo interno en los casos en los que ya ha tenido lugar una invasi´ on del o´ıdo interno tal como en el procedimiento de implante coclear o en cirug´ıas del o´ıdo interno. En tales casos, se administrar´a una cantidad menor del producto proteico GDNF, por ejemplo de 1 µg/o´ıdo aproximadamente a 1 mg/o´ıdo aproximadamente en una u ´nica inyecci´on o en inyecciones m´ ultiples. En los casos en los que se necesite una administraci´on cr´ onica del factor, se colocar´a una minibomba Alzet unida a una c´ anula, el extremo de la cual ser´ a introducido en el o´ıdo medio o en el o´ıdo interno para una liberaci´ on continua del factor. El GDNF puede ser tambi´en desarrollado en forma de gotas para el o´ıdo que penetrar´ an en la membrana timp´anica de la bulla. Se contempla adem´as que el producto proteico GDNF puede ser administrado con una cantidad eficaz de un segundo agente terap´eutico para el tratamiento de la degeneraci´ on de las neuronas auditivas, junto con BDNF y NT-3, as´ı como con otros factores o f´armacos utilizados actualmente o en el futuro para el tratamiento de las diferentes patolog´ıas del o´ıdo interno. M´ as adelante se describen con m´as detalle una variedad de formulaciones farmac´euticas y diferentes t´ecnicas de administraci´ on.

Seg´ un es utilizado en la presente, el t´ermino “producto proteico GDNF” incluye un factor neurotr´ ofico derivado de una l´ınea celular glial natural purificado, sint´etico o recombinante, variantes del GDNF biol´ ogicamente activas (incluyendo variantes por inserci´ on, sustituci´ on y deleci´on) y derivados del mismo qu´ımicamente modificados. Se incluyen tambi´en GDNFs que son sustancialmente hom´ologos al GDNF 7

ES 2 170 938 T3 humano que tiene la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID N◦ :1. Los productos proteicos GDNF pueden existir como homod´ımeros o heterod´ımeros en su forma biol´ ogicamente activa.

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El t´ermino “biol´ogicamente activo” seg´ un es utilizado en la presente significa que el producto proteico GDNF presenta propiedades neurotr´ oficas similares, pero no necesariamente todas las mismas propiedades, y no necesariamente en el mismo grado, a las del GDNF que tiene la secuencia de amino´acidos oficas particulares de inter´es depende mostrada en la SEC ID N◦ :1. La selecci´on de las propiedades neutr´ de la utilizaci´on para la que est´e siendo administrado el producto proteico GDNF. El t´ermino “sustancialmente hom´ologo” seg´ un es utilizado en la presente, significa que tiene un grado de homolog´ıa con el GDNF que tiene la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID N◦ :1 que es preferiblemente superior al 70 %, m´as preferiblemente superior al 80 % e incluso m´ as preferiblemente superior al 90 % o al 95 %. Por ejemplo, el grado de homolog´ıa entre la prote´ına de rata y la humana es del 93 % aproximadamente, y se contempla que el GDNF de mam´ıfero preferido tendr´a igualmente un alto grado de homolog´ıa. El porcentaje de homolog´ıa seg´ un se describe en la presente, es calculado t´ıpicamente como el porcentaje de residuos de amino´acidos encontrados en la m´ as peque˜ na de las dos secuencias que se alinean con id´enticos residuos de amino´acidos en la secuencia que est´a siendo comparada, cuando pueden introducirse cuatro huecos en una longitud de 100 amino´ acidos para ayudar a tal alineaci´on (seg´ un est´ a descrito por Dayhoff, en Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. (1972). Preferiblemente, el porcentaje de homolog´ıa seg´ un se describi´ o anteriormente es calculado como el porcentaje de componentes encontrados en la m´as peque˜ na de las dos secuencias que pueden encontrarse tambi´en en la m´as grande de las dos secuencias (con la introducci´on de huecos), siendo definido un componente como una secuencia de cuatro amino´acidos contiguos. Se incluye tambi´en como sustancialmente hom´ ologo cualquier producto proteico GDNF que pueda ser aislado en virtud de la reactividad cruzada con anticuerpos hacia el GDNF de la SEC ID N◦ :1, o´ cuyos genes puedan ser aislados mediante hibridaci´on con el gen o con segmentos del gen que codifica el GDNF de la SEC ID N◦ :1.

Los productos proteicos GDNF de acuerdo con esta invenci´ on pueden ser aislados o generados por cualquier medio conocido por los expertos en la t´ecnica. Ejemplos de m´etodos para producir productos proteicos GDNF u ´ tiles en la presente invenci´on est´an descritos en la Solicitud de EE.UU. N◦ de Serie 08/182.183 registrada el 23 de Mayo de 1994 y en sus solicitudes parentales; Solicitud de PCT N◦ PCT/US92/07888 registrada el 17 de Septiembre de 1992, publicada como WO 93/06116 (Lin y col., Empresa Conjunta Syntex-Synergen Neuroscience); Solicitud de Patente Europea N◦ 92921022.7, publicada como EP 610 254; y la Solicitud de EE.UU. copropiedad y copendiente N◦ de Serie 08/535.681 registrada el 28 de Septiembre de 1995 (“Factor Neurotr´ ofico Truncado Derivado de una L´ınea Celular Glial”).

Los productos proteicos GDNF que existen de manera natural pueden ser aislados de preparaciones de c´elulas neuronales de mam´ıfero o de una l´ınea celular de mam´ıfero que secrete o exprese GDNF. Por ejemplo, WO 93/06116 describe el aislamiento de GDNF de medio de crecimiento condicionado sin suero de c´elulas de glioblastoma B49. Los productos proteicos GDNF pueden ser sintetizados tambi´en qu´ımicamente por cualquier medio conocido por los expertos en la t´ecnica. Los productos proteicos GDNF son producidos preferiblemente mediante t´ecnicas recombinantes porque son capaces de conseguir cantidades de prote´ına comparativamente mayores con m´ as pureza. Las formas de productos proteicos GDNF recombinantes incluyen formas glicosiladas y no glicosiladas de la prote´ına, y prote´ına expresada en sistemas celulares bacterianos, de mam´ıfero o de insectos.

En general, las t´ecnicas recombinantes implican el aislamiento de los genes responsables de la codificaci´on del GDNF, el clonaje del gen en vectores y tipos celulares adecuados, la modificaci´ on del gen si es necesario para que codifique una variante deseada y la expresi´ on del gen con el fin de producir el producto proteico GDNF. Alternativamente, puede sintetizarse qu´ımicamente una secuencia de nucle´otidos que codifique el producto proteico GDNF deseado. Se contempla que el producto proteico GDNF puede ser expresado utilizando secuencias de nucle´otidos que difieran en el tratamiento de los codones debido a las degeneraciones del c´odigo gen´etico o a variaciones al´elicas. WO 93/06116 describe el aislamiento y la secuenciaci´on de un clon de ADNc del gen de GDNF de rata, y el aislamiento, secuenciaci´ on y expresi´on de un clon de ADN gen´ omico del gen de GDNF humano. WO 93/06116 describe tambi´en vectores, c´elulas hu´esped y condiciones de crecimiento en cultivo para la expresi´on del producto proteico GDNF. Vectores adicionales adecuados para la expresi´ on del producto proteico GDNF en E. coli est´an descritos en la Solicitud de Patente Europea publicada N◦ EP 0 423 980 (“Factor de C´elulas Madre”) publicada el 24 de Abril de 1991. La secuencia de ADN del gen que codifica el GDNF humano maduro y la secuencia de amino´acidos de GDNF est´an mostradas en la Figura 19 (SEC ID N◦ 5) de WO 93/06116.

La Figura 19 no muestra la secuencia codificadora completa para la porci´on pre-pro del GDNF, pero los 8

ES 2 170 938 T3 primeros 50 amino´acidos del pre-pro GDNF humano est´an mostrados en la Figura 22 (SEC ID N◦ :8) de WO 93/06116.

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El GDNF que existe de manera natural es un d´ımero unido por disulfuro en su forma biol´ ogicamente activa. El material aislado despu´es de la expresi´on en un sistema bacteriano es esencialmente biol´ogicamente inactivo y existe como un mon´ omero. Es necesario un replegamiento para producir el d´ımero unido por disulfuro biol´ ogicamente activo. Los procesos para el replegamiento y la maduraci´ on del GDNF expresado en sistemas bacterianos est´an descritos en WO 93/06116. Ensayos in vitro est´andar para la determinaci´ on de la actividad del GDNF est´an descritos en WO 93/06116 y en la Solicitud de EE.UU. copropiedad y copendiente N◦ de Serie 08/535.681, registrada el 28 de Septiembre de 1995.

A. Variantes del GDNF

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El t´ermino “variantes del GDNF” seg´ un es utilizado en la presente incluye polip´eptidos en los que se han eliminado residuos de amino´acidos (“variantes por deleci´on”), se han insertado residuos de amino´acidos (“variantes por adici´ on”) o se han sustituido residuos de amino´ acidos (“variantes por sustituci´on”) en la secuencia de amino´acidos del GDNF que existe de forma natural. Tales variantes son preparadas introduciendo los cambios de nucle´ otidos apropiados en el ADN que codifica el polip´eptido o mediante s´ıntesis qu´ımica in vitro del polip´eptido deseado. Se apreciar´ a por los expertos en la t´ecnica que pueden realizarse muchas combinaciones de deleciones, inserciones y sustituciones siempre que la mol´ecula final posea la actividad biol´ ogica del GDNF. Las t´ecnicas de mutag´enesis para la sustituci´on, inserci´on o eliminaci´on de uno o m´ as residuos de amino´acidos seleccionados son bien conocidas por las personas expertas en el oficio (por ejemplo, Patente on de las variantes: la pode EE.UU. N◦ 4.518.584). Existen dos variables principales en la construcci´ sici´on del lugar de la mutaci´ on y la naturaleza de la mutaci´ on. En el dise˜ no de variantes del GDNF, la selecci´on del lugar de la mutaci´ on y de la naturaleza de la mutaci´ on depender´ an de la(s) caracter´ıstica(s) del GDNF que se vaya a modificar. Los lugares de la mutaci´on pueden ser modificados individualmente o en serie, por ejemplo, (1) sustituyendo primeramente con opciones de amino´ acidos conservadoras y luego con selecciones m´as radicales dependiendo de los resultados conseguidos, (2) eliminando el residuo de amino´ acido diana o´ (3) insertando residuos de amino´ acidos adyacentes al sitio localizado. Se prefieren los cambios conservadores de 1 a 20 amino´acidos. Una vez que se ha determinado la secuencia de amino´acidos del producto proteico GDNF deseado, se determina f´ acilmente la secuencia de ´acido nucleico a utilizar en la expresi´on de la prote´ına. Pueden producirse tambi´ en variantes por deleciones N-terminales y C-terminales mediante enzimas proteol´ıticos.

Para las variantes del GDNF por deleci´ on, las deleciones oscilan generalmente de 1 a 30 residuos aproximadamente, m´ as habitualmente de a 1 a 10 residuos aproximadamente y t´ıpicamente de 1 a 5 residuos contiguos aproximadamente. Se contemplan deleciones N-terminales, C-terminales e intrasecuencia internas. Pueden introducirse deleciones en regiones de baja homolog´ıa con otros miembros de la superfamilia del TGF-β con el fin de modificar la actividad del GDNF. Ser´ a m´as probable que deleciones en ´areas de homolog´ıa sustancial con otras secuencias de la superfamilia del TGF-β, modifiquen m´ as significativamente la actividad biol´ ogica del GDNF. El n´ umero de deleciones consecutivas ser´a seleccionado de tal manera que se conserve la estructura terciaria del producto proteico GDNF en el dominio afectado, por ejemplo, entrecruzamiento de ciste´ınas. Ejemplos no limitantes de variantes por deleci´ on incluyen productos proteicos GDNF truncados a los que les faltan de uno a cuarenta amino´ acidos N-terminales del GDNF, o variantes que carecen del residuo C-terminal del GDNF, o combinaciones de los mismos, seg´ un est´a descrito en la Solicitud de EE.UU. copropiedad y copendiente N◦ de Serie 08/535.681 registrada el 28 de Septiembre de 1995.

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Para las variantes por adici´ on del GDNF, las adiciones en la secuencia de amino´acidos incluyen t´ıpicamente fusiones N- y/o C-terminales que var´ıan en longitud desde un residuo hasta polip´eptidos que contienen cien o m´as residuos, as´ı como adiciones intrasecuencia internas de uno o m´ ultiples residuos de amino´acidos. Las adiciones internas pueden oscilar generalmente de 1 a 10 residuos aproximadamente, m´as t´ıpicamente de 1 a 5 residuos aproximadamente y normalmente de 1 a 3 residuos de amino´ acidos aproximadamente. Ejemplos de variantes por adici´ on N-terminal incluyen GDNF con un residuo metionilo N-terminal (un artefacto de la expresi´ on directa de GDNF en un cultivo de c´elulas bacterianas recomon de una secuencia se˜ nal N-terminal heter´ ologa binantes), que es denominado [Met−1 ]GDNF, y la fusi´ al extremo N de GDNF con el fin de facilitar la secreci´ on de GDNF maduro a partir de c´elulas hu´esped recombinantes. Tales secuencias se˜ nal ser´ an obtenidas generalmente de, y por tanto ser´ an hom´ ologas a, la especie de c´elula hu´esped deseada. Las adiciones pueden incluir tambi´en secuencias de amino´acidos derivadas de la secuencia de otros factores neurotr´oficos. Un producto proteico GDNF preferido para ser 9

ES 2 170 938 T3 utilizado de acuerdo con la presente invenci´on es el [Met−1 ]GDNF humano recombinante.

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Las variantes del GDNF por sustituci´on tienen al menos un residuo de amino´ acido de la secuencia de amino´ acidos del GDNF eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Tales variantes por sustituci´ on incluyen variantes al´elicas, que se caracterizan por cambios en la secuencia de nucle´otidos que ocurren de manera natural en la poblaci´ on de la especie y que pueden tener o no como resultado un cambio de amino´ acidos. Ejemplos de variantes por sustituci´ on (ver, por ejemplo, la SEC ID N◦ :50) est´an descritos en la Solicitud de EE.UU. copropiedad, copendiente, N◦ de Serie 08/535.681 registrada el 28 de Septiembre de 1995.

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Mutaciones espec´ıficas de la secuencia de amino´acidos del GDNF pueden implicar modificaciones para un sitio de glicosilaci´on (por ejemplo, serina, treonina o asparragina). La ausencia de glicosilaci´on o una glicosilaci´on parcial solamente resultan de una sustituci´ on o una deleci´on de amino´ acidos en cualquier sitio de reconocimiento de glicosilaci´on unido a asparragina, o en cualquier sitio de la mol´ecula que est´e modificado por la adici´ on de un carbohidrato unido a O. Un sitio de reconocimiento de glicosilaci´ on unido a asparragina comprende una secuencia tripept´ıdica que es reconocida espec´ıficamente por los enzimas celulares apropiados para la glicosilaci´on. Estas secuencias tripept´ıdicas son Asn-Xaa-Thr o Asn-Xaa-Ser, donde Xaa puede ser cualquier amino´ acido distinto de Pro. Una variedad de sustituciones o eliminaciones de amino´ acidos en una o en las dos posiciones de amino´acidos primera o tercera de un sitio de reconocimiento de glicosilaci´on (y/o una deleci´on del amino´ acido en segunda posici´on) tienen como resultado la no glicosilaci´on en la secuencia tripept´ıdica modificada. De este modo, la expresi´on de secuencias de nucle´otidos alteradas apropiadamente produce variantes que no est´an glicosiladas en ese sitio. Alternativamente, la secuencia de amino´acidos del GDNF puede ser modificada para a˜ nadir sitios de glicosilaci´on.

Un m´etodo para identificar residuos o regiones de amino´ acidos para mutag´enesis es denominado “mutag´enesis de barrido de alanina” seg´ un est´a descrito por Cunningham y Wells (Science, 244:1081-1085, 1989). En este m´etodo, se identifica un residuo de amino´ acido o un grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se sustituye por un amino´ acido neutro o cargado negativamente (muy preferiblemente alanina o polialanina) para influir en la interacci´ on de los amino´ acidos con el entorno acuoso circundante dentro o fuera de la c´elula. Aquellos dominios que demuestren una sensibilidad funcional a las sustituciones son luego refinados mediante la introducci´on de residuos adicionales o alternos en los lugares de sustituci´on. De este modo, se determina el sitio diana para introducir una variaci´ on en la secuencia de amino´acidos, se realiza un barrido de alanina o una mutag´enesis aleatoria en el codon o en la regi´on de la secuencia de ADN diana correspondiente, y las variantes del GDNF expresadas son sometidas a selecci´on por la combinaci´ on o´ptima de la actividad y el grado de actividad deseados.

Los sitios de mayor inter´es para la mutag´enesis por sustituci´on incluyen sitios en los que los amino´acidos encontrados en las prote´ınas GDNF de varias especies son sustancialmente diferentes en t´erminos del tama˜ no de la cadena lateral, de la carga y/o de la hidrofobicidad. Otros sitios de inter´es son aqu´ellos en los que residuos particulares de prote´ınas similares a GDNF, obtenidas de varias especies, son id´enticos. Tales posiciones son generalmente importantes para la actividad biol´ogica de una prote´ına.

Inicialmente, estos sitios son sustituidos de una manera relativamente conservadora. Tales sustituciones conservadoras est´an mostradas en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones tienen como resultado un cambio de la actividad biol´ ogica, entonces se introducen cambios m´as sustanciales (sustituciones ejemplares) y/o pueden realizarse otras adiciones o eliminaciones, y los productos resultantes son sometidos a selecci´on por su actividad.

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ES 2 170 938 T3 TABLA 1 Sustituciones de Amino´ acidos 5

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Residuo Original

Sustituciones Preferidas

Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) Ile (I)

Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Pro Arg Leu

Leu (L)

Ile

Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V)

Arg Leu Leu Gly Thr Ser Tyr Phe Leu

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Sustituciones Ejemplares Val; Leu; Ile Lys; Gln; Asn Gln; His; Lys; Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn; Gln; Lys; Arg Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucina norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Arg; Gln; Asn Leu; Phe; Ile Leu; Val; Ile; Ala Gly Thr Ser Tyr Trp; Phe; Thr; Ser Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleucina

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Se espera que las modificaciones conservadoras de la secuencia de amino´acidos (y las modificaciones correspondientes en las secuencias de ´acido nucleico codificadoras) produzcan productos proteicos GDNF que tengan caracter´ısticas funcionales y qu´ımicas similares a las del GDNF natural. En contraste, pueden realizarse modificaciones sustanciales de las caracter´ısticas funcionales y/o qu´ımicas de los productos proteicos GDNF, seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto polipept´ıdico en el ´area de la sustituci´ on, por ejemplo como una conformaci´ on de l´ amina o helicoidal, (b) de la carga o de la hidrofobicidad de la mol´ecula en el sitio diana o (c) del tama˜ no de la cadena lateral. Los residuos que existen de manera natural est´ an divididos en grupos sobre la base de las propiedades comunes de la cadena lateral: 1) hidrof´ obicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) hidrof´ılicos neutros: Cys, Ser, Thr;

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3) a´cidos: Asp, Glu; 4) b´ asicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

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5) residuos que afectan a la orientaci´on de la cadena: Gly, Pro; y 6) arom´ aticos: Trp, Tyr, Phe.

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Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el cambio de un miembro de una de estas clases por otro. Tales residuos sustituidos pueden ser introducidos en regiones de la prote´ına GDNF que son hom´ ologas con otras prote´ınas de la superfamilia del TGF-β o en las regiones no hom´ ologas de la mol´ecula.

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ES 2 170 938 T3 B. Derivados del GDNF

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Pueden prepararse derivados qu´ımicamente modificados del GDNF o variantes del GDNF por una persona experta en la t´ecnica dadas las descripciones de la presente. Los restos qu´ımicos m´as adecuados para derivatizaci´ on incluyen pol´ımeros solubles en agua. Un pol´ımero soluble en agua es deseable porque la prote´ına a la cual est´a unido no precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiol´ ogico.

Preferiblemente, el pol´ımero ser´a farmac´euticamente aceptable para la preparaci´on de un producto o de una composici´ on terap´eutica. Una persona experta en la t´ecnica ser´a capaz de seleccionar el pol´ımero deseado sobre la base de consideraciones tales como si el conjugado pol´ımero/prote´ına ser´a utilizado terap´euticamente, y si es as´ı, la dosificaci´ on deseada, el tiempo en la circulaci´ on, la resistencia a proteolisis y otras consideraciones. La eficacia de la derivatizaci´on puede ser determinada administrando el derivado en la forma deseada (esto es, mediante una bomba osm´ otica o, m´ as preferiblemente, mediante inyecci´on o infusi´ on, o formulado adicionalmente para la v´ıa de administraci´on oral, pulmonar o para otras v´ıas de administraci´on) y determinando su eficacia.

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Pol´ımeros solubles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietil´en glicol (PEG), copol´ımeros de etil´en glicol/propil´en glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivin´ılico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copol´ımero de etileno/anh´ıdrido maleico, poliamino´ acidos (homopol´ımeros o copol´ımeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona)polietil´en glicol, homopol´ımeros de polipropil´en glicol, copol´ımeros de ´oxido de polipropileno/´ oxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivin´ılico y mezclas de los mismos. El propionaldeh´ıdo de polietil´en glicol puede tener ventajas en la fabricaci´ on debido a su estabilidad en agua.

El pol´ımero puede tener cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Para polietil´en glicol, el peso molecular preferido oscila desde 2 kDa aproximadamente hasta 100 kDa aproximadamente para facilidad de manejo y fabricaci´ on (indicando el t´ermino “aproximadamente” que en las preparaciones de polietil´en glicol algunas mol´eculas pesar´an m´ as, algunas menos, que el peso molecular indicado). Pueden utilizarse otros tama˜ nos, dependiendo del perfil terap´eutico deseado (por ejemplo, la duraci´ on deseada de la liberaci´on mantenida, los efectos, si es que hay alguno, sobre la actividad biol´ogica, la facilidad de manejo, el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietil´en glicol sobre una prote´ına o variante terap´eutica).

El n´ umero de mol´eculas de pol´ımero as´ı unidas puede variar, y una persona experta en la t´ecnica ser´a capaz de determinar el efecto sobre la funci´on. Se puede monoderivatizar o se puede proporcionar una di-, tri-, tetra- u otra combinaci´ on de derivatizaci´on, con los mismos o diferentes restos qu´ımicos (por ejemplo, pol´ımeros, tales como pesos diferentes de polietil´en glicoles). La proporci´on de mol´eculas de pol´ımero respecto a las mol´eculas de prote´ına (o p´eptido) variar´ a, as´ı como lo har´ an sus concentraciones, en la mezcla de reacci´on. En general, la proporci´ on o´ptima (en t´erminos de eficacia de la reacci´on en cuanto a que no haya un exceso de prote´ına o pol´ımero sin reaccionar) estar´a determina por factores tales como el grado de derivatizaci´on deseado (por ejemplo, mono-, di-, tri-, etc.), el peso molecular del pol´ımero seleccionado, si el pol´ımero est´a ramificado o no ramificado y las condiciones de reacci´on.

Las mol´eculas de polietil´en glicol (u otros restos qu´ımicos) ser´an unidas a la prote´ına teniendo en consideraci´on los efectos sobre los dominios funcionales o antig´enicos de la prote´ına. Existen varios m´etodos de uni´ on disponibles para los expertos en la t´ecnica. Ver, por ejemplo, EP 0 401 384 (acoplamiento de PEG a G-CSF), ver tambi´en Malik y col., Exp. Hematol., 20:1028-1035, 1992 (que describe la polietil´en glicolaci´on de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietil´en glicol puede ser unido covalentemente a residuos de amino´ acidos mediante un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Grupos reactivos son aqu´ellos a los que puede unirse una mol´ecula de polietil´en glicol activada. Los residuos de amino´ acidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y el residuo de amino´ acido N-terminal. Aqu´ellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ´acido asp´ artico, residuos de ´acido glut´ amico y el residuo de amino´ acido C-terminal. Pueden utilizarse tambi´en grupos sulfhidrilo como grupo reactivo para unir la(s) mol´ecula(s) de polietil´en glicol. Para fines terap´euticos, se prefiere la uni´on a un grupo amino, tal como la uni´ on al extremo N o a un grupo de lisina. La uni´ on en residuos importantes para la uni´ on a receptores debe ser evitada si se desea la uni´on a un receptor.

Se puede desear espec´ıficamente una prote´ına modificada qu´ımicamente en el extremo N-terminal.

Utilizando polietil´en glicol como una ilustraci´on de las presentes composiciones, se puede seleccionar a partir de una variedad de mol´eculas de polietil´en glicol (por peso molecular, ramificaci´ on, etc.), la proporci´ on de mol´eculas de polietil´en glicol respecto a las mol´eculas de prote´ına (o p´eptido) en la mezcla de reacci´on, el tipo de reacci´ on de polietil´en glicolaci´on a realizar y el m´etodo para obtener la prote´ına 12

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polietil´en glicolilada N-terminalmente seleccionada. El m´etodo para obtener la preparaci´ on polietil´en glicolilada N-terminalmente (esto es, separando este resto de otros restos monopolietil´en glicolilados si es necesario) puede ser mediante purificaci´on del material polietil´en glicolilado N-terminalmente a partir de una poblaci´ on de mol´eculas de prote´ına polietil´en glicoliladas. La modificaci´on qu´ımica N-terminal selectiva puede ser realizada mediante alquilaci´ on reductora que aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al extremo N-terminal) disponibles para derivatizaci´ on en una prote´ına particular. Bajo las condiciones de reacci´ on apropiadas, se consigue una derivatizaci´ on sustancialmente selectiva de la prote´ına en el extremo N con un pol´ımero que contenga un grupo carbonilo. Por ejemplo, se puede polietil´en glicolizar N-terminalmente selectivamente la prote´ına realizando la reacci´ on a un pH que permita aprovechar las diferencias de pKa entre el grupo e-amino de los residuos de lisina y el grupo a-amino del residuo N-terminal de la prote´ına. Mediante tal derivatizaci´on selectiva, se controla la uni´on de un pol´ımero soluble en agua a una prote´ına: la conjugaci´ on con el pol´ımero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la prote´ına y no se produce una modificaci´ on significativa de otros grupos reactivos, tales como los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. Utilizando alquilaci´on reductora, el pol´ımero soluble en agua puede ser del tipo descrito anteriormente, y deber´a tener un u ´ nico aldeh´ıdo reactivo para acoplarse a la prote´ına. Puede utilizarse propionaldeh´ıdo de polietil´en glicol que contiene un u ´ nico aldeh´ıdo reactivo.

La presente invenci´on contempla la utilizaci´on de derivados que son GDNF expresados en procariotas, o variantes de los mismos, unidos a al menos una mol´ecula de polietil´en glicol, as´ı como la utilizaci´on de GDNF o variantes del mismo, unidos a una o m´ as mol´eculas de polietil´en glicol a trav´es de un enlace acilo o alquilo.

La polietil´en glicolaci´on puede ser llevada a cabo mediante cualquiera de las reacciones de polietil´en glicolaci´on conocidas en la t´ecnica. Ver, por ejemplo, Focus on Growth Factors, 3(2):4-10, 1992; EP 0 154 316; EP 0 401 384; y las dem´ as publicaciones citadas en la presente que se refieren a polietil´en glicolaci´on.

La polietil´en glicolaci´on puede ser llevada a cabo a trav´es de una reacci´on de acilaci´on o de una reacci´on de alquilaci´on con una mol´ecula de polietil´en glicol reactiva (o con un pol´ımero soluble en agua reactivo an´ alogo).

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La polietil´en glicolaci´on por acilaci´on implica generalmente la reacci´on de un derivado ´ester activo de polietil´en glicol con la prote´ına GDNF o con la variante. Puede utilizarse cualquier mol´ecula de PEG reactiva conocida o descubierta posteriormente para llevar a cabo la polietil´en glicolaci´on de la prote´ına GDNF o de la variante. Un ´ester de PEG activado preferido es PEG esterificado con N-hidroxisuccinimida.

Seg´ un se utiliza en la presente, se contempla que “acilaci´on” incluya sin limitaci´on los tipos de enlaces siguientes entre la prote´ına terap´eutica y un pol´ımero soluble en agua tal como PEG: amida, carbamato, uretano y similares. Ver Bioconjugate Chem., 5:133-140, 1994. Las condiciones de reacci´ on pueden ser seleccionadas de cualquiera de las conocidas en la t´ecnica de polietil´en glicolaci´on o las desarrolladas posteriormente, pero deben evitarse condiciones de temperatura, solvente y pH que inactivar´ıan el GDNF o la variante a modificar.

La polietil´en glicolaci´on por acilaci´on tendr´ a como resultado generalmente una prote´ına GDNF o variante poli-polietil´en glicolizada. Preferiblemente, el enlace de conexi´on ser´a una amida. Tambi´en preferiblemente, el producto resultante estar´ a sustancialmente s´olo (por ejemplo, > 95 %) mono-, di- o tri-polietil´en glicolizado. Sin embargo, pueden formarse algunas especies con grados mayores de polietil´en glicolaci´on en cantidades que dependen de las condiciones de la reacci´on espec´ıfica utilizadas. Si se desea, especies polietil´en glicolizadas m´ as purificadas pueden ser separadas de la mezcla, particularmente las especies no reaccionadas, mediante t´ecnicas de purificaci´ on est´andar, incluyendo, entre otras, di´ alisis, desplazamiento salino, ultrafiltraci´ on, cromatograf´ıa de intercambio i´onico, cromatograf´ıa de filtraci´ on en gel y electroforesis.

La polietil´en glicolaci´on mediante alquilaci´on implica generalmente la reacci´on de un derivado aldeh´ıdico terminal de PEG con la prote´ına GDNF o la variante en presencia de un agente reductor. La polietil´en glicolaci´on por alquilaci´ on puede tener tambi´en como resultado una prote´ına GDNF o variante poli-polietil´en glicolizada. Adem´ as, se pueden manipular las condiciones de reacci´on para favorecer la polietil´en glicolaci´on sustancialmente s´ olo en el grupo a-amino del extremo N de la prote´ına GDNF o de la variante (esto es, una prote´ına mono-polietil´en glicolizada). En el caso de monopolietil´en glicolaci´on o de poli-polietil´en glicolaci´on, los grupos de PEG son unidos preferiblemente a la prote´ına a trav´es de un grupo -CH2 -NH-. Con referencia particular al grupo -CH2 -, este tipo de enlace es referido en la presente como un enlace “alquilo”.

La derivatizaci´ on a trav´es de alquilaci´on reductora para producir un producto monopolietil´en gli13

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colizado, aprovecha la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al extremo N) disponibles para derivatizaci´ on. La reacci´on es realizada a un pH que permite sacar ventaja de las diferencias de pKa entre los grupos e-amino de los residuos de lisina y el grupo a-amino del residuo N-terminal de la prote´ına. Mediante tal derivatizaci´ on selectiva, se controla la uni´on de un pol´ımero soluble en agua que contiene un grupo reactivo tal como un aldeh´ıdo, a una prote´ına: la conjugaci´ on con el pol´ımero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la prote´ına y no se produce una modificaci´ on significativa de otros grupos reactivos tales como los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. En un aspecto importante, la presente invenci´ on contempla la utilizaci´on de una preparaci´ on sustancialmente homog´enea de mol´eculas del conjugado monopol´ımero/prote´ına GDNF (o variante) (significando una prote´ına GDNF o variante a la que se ha unido una mol´ecula de pol´ımero sustancialmente s´olo (esto es, > 95 %) en una u ´nica posici´ on). M´ as espec´ıficamente, si se utiliza polietil´en glicol, la presente invenci´on abarca tambi´en la utilizaci´on de la prote´ına GDNF o de la variante polietil´en glicolizada que carece posiblemente de grupos de uni´on antig´enicos, y que tiene la mol´ecula de polietil´en glicol acoplada directamente a la prote´ına GDNF o a la variante.

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Por tanto, se contempla que los productos proteicos GDNF que van a ser utilizados de acuerdo con la presente invenci´on pueden incluir prote´ına GDNF o variantes polietil´en glicolizadas, en las que el(los) grupo(s) PEG est´ a(n) unido(s) a trav´es de grupos acilo o alquilo. Seg´ un se discuti´ o anteriormente, tales productos pueden ser mono-polietil´en glicolizados o poli-polietil´en glicolizados (por ejemplo, conteniendo 2-6, y preferiblemente 2-5, grupos PEG). Los grupos PEG son unidos generalmente a la prote´ına en los grupos a- o e- amino de los amino´acidos, pero se contempla tambi´en que los grupos PEG puedan estar unidos a cualquier grupo amino unido a la prote´ına que sea suficientemente reactivo para resultar ligado a un grupo PEG bajo condiciones de reacci´ on adecuadas.

Las mol´eculas polim´ericas utilizadas en las aproximaciones de acilaci´on y alquilaci´ on pueden ser seleccionadas de entre pol´ımeros solubles en agua seg´ un se describi´ o anteriormente. El pol´ımero seleccionado debe ser modificado para que tenga un u ´ nico grupo reactivo, tal como un ´ester activo para acilaci´on o un aldeh´ıdo para alquilaci´on, preferiblemente, de tal manera que el grado de polimerizaci´ on pueda ser controlado seg´ un se proporciona en los presentes m´etodos. Un ejemplo de aldeh´ıdo de PEG reactivo es el propionaldeh´ıdo de polietil´en glicol, que es estable en agua, o los derivados mono C1-C10 alcoxi o ariloxi del mismo (ver, la Patente de EE.UU. 5.252.714). El pol´ımero puede ser ramificado o no ramificado.

Para las reacciones de acilaci´on, el(los) pol´ımero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un u ´ nico grupo ´ester reactivo. Para la actual alquilaci´on reductora, el(los) pol´ımero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un u ´nico grupo aldeh´ıdo reactivo. Generalmente, el pol´ımero soluble en agua no ser´ a seleccionado de residuos glicosilo que existen de manera natural, ya que ´estos son producidos normalmente m´as convenientemente por sistemas de expresi´on recombinantes de mam´ıfero. El pol´ımero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado.

Un pol´ımero soluble en agua particularmente preferido para ser utilizado en la presente es polietil´en glicol. Seg´ un es utilizado en la presente, polietil´en glicol tiene la intenci´on de abarcar cualquiera de las formas de PEG que han sido utilizadas para derivatizar otras prote´ınas, tal como mono-(C1-C10) alcoxio ariloxi-polietil´ en glicol.

En general, la derivatizaci´on qu´ımica puede ser realizada bajo cualquier condici´ on adecuada utilizada para hacer reaccionar una sustancia biol´ogicamente activa con una mol´ecula polim´erica activada. Los m´etodos para preparar una prote´ına GDNF o una variante polietil´en glicolizadas comprender´ an generalmente las etapas de (a) reacci´ on de una prote´ına GDNF o de la variante con polietil´en glicol (tal como un derivado ´ester o aldeh´ıdo reactivo de PEG) bajo condiciones por las cuales la prote´ına resulte unida a uno o m´ as grupos de PEG, y (b) obtenci´ on del(los) producto(s) de reacci´ on. En general, las condiciones de reacci´on o´ptimas para las reacciones de acilaci´on ser´ an determinadas caso por caso sobre la base de par´ ametros conocidos y de los resultados deseados. Por ejemplo, cuanto mayor sea la relaci´on PEG:prote´ına, mayor ser´ a el porcentaje de producto poli-polietil´en glicolizado.

La alquilaci´on reductora para producir una poblaci´ on sustancialmente homog´enea de mol´eculas del conjugado monopol´ımero/prote´ına GDNF (o variante) comprender´ a generalmente las etapas de: (a) reacci´on de una prote´ına GDNF o de una variante con una mol´ecula de PEG reactiva bajo condiciones de alquilaci´on reductora, a un pH adecuado para permitir la modificaci´ on selectiva del grupo a-amino en el extremo amino de dicha prote´ına GDNF o variante; y (b) obtenci´ on del(los) producto(s) de reacci´on.

Para una poblaci´ on sustancialmente homog´enea de mol´eculas de conjugado monopol´ımero/prote´ına GDNF (o variante), las condiciones de la reacci´on de alquilaci´on reductora son aqu´ellas que permitan la uni´ on selectiva del resto polim´erico soluble en agua al extremo N de la prote´ına GDNF o de la variante.

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Tales condiciones de reacci´on proporcionar´ an generalmente diferencias de pKa entre los grupos amino de la lisina y el grupo a-amino en el extremo N (siendo el pKa el pH al cual el 50 % de los grupos amino est´an protonados y el 50 % no lo est´ an). El pH influye tambi´en sobre la proporci´on de pol´ımero respecto a prote´ına a utilizar. En general, si el pH es m´ as bajo, se desear´ a un exceso mayor de pol´ımero respecto a prote´ına (esto es, cuanto menos reactivo sea el grupo a-amino N-terminal, m´as pol´ımero se necesitar´a para conseguir condiciones o´ptimas). Si el pH es m´as elevado, la proporci´ on pol´ımero:prote´ına no necesita ser tan grande (esto es, est´an disponibles m´ as grupos reactivos, por lo que se necesitan menos mol´eculas de pol´ımero). Para los fines de la presente invenci´on, el pH estar´ a generalmente en el rango de 3-9, preferiblemente 3-6.

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Otra consideraci´ on importante es el peso molecular del pol´ımero. En general, cuanto mayor sea el peso molecular del pol´ımero, menos mol´eculas de pol´ımero pueden ser unidas a la prote´ına. De manera similar, debe tenerse en cuenta la ramificaci´on del pol´ımero cuando se optimizan estos par´ ametros. Generalmente, cuanto mayor sea el peso molecular (o cuanto m´ as ramificaciones haya) mayor ser´a la proporci´ on pol´ımero:prote´ına. En general, para las reacciones de polietil´en glicolaci´on contempladas en la presente, el peso molecular medio preferido es de 2 kDa aproximadamente a 100 kDa aproximadamente. El peso molecular medio preferido es de 5 kDa aproximadamente a 50 kDa aproximadamente, particularmente preferiblemente de 12 kDa aproximadamente a 25 kDa aproximadamente. La proporci´ on de pol´ımero soluble en agua respecto a la prote´ına GDNF o a la variante oscilar´a generalmente desde 1:1 a 100:1, preferiblemente (para poli-polietil´en glicolaci´on) de 1:1 a 20:1 y (para monopolietil´en glicolaci´on) de 1:1 a 5:1.

Utilizando las condiciones indicadas anteriormente, la alquilaci´ on reductora proporcionar´ a la uni´ on selectiva del pol´ımero a cualquier prote´ına GDNF o variante que tenga un grupo a-amino en el extremo amino, y proporcionar´ a una preparaci´ on sustancialmente homog´enea de conjugados monopol´ımero/prote´ına GDNF (o variante). El t´ermino “conjugado monopol´ımero/prote´ına GDNF (o variante)” es utilizado en la presente para indicar una composici´ on formada por una u ´nica mol´ecula de pol´ımero unida a una mol´ecula de prote´ına GDNF o de prote´ına variante de GDNF. El conjugado monopol´ımero/prote´ına GDNF (o variante) tendr´ a preferiblemente una mol´ecula de pol´ımero situada en el extremo N, pero no en los grupos amino laterales de la lisina. La preparaci´ on tendr´ a preferiblemente m´as del 90 % de conjugado monopol´ımero/prote´ına GDNF (o variante), y m´ as preferiblemente m´as del 95 % de conjugado monopol´ımero/prote´ına GDNF (o variante), siendo el resto de las mol´eculas observables mol´eculas que no han reaccionado (esto es, prote´ınas que carecen del resto polim´erico).

Para la presente alquilaci´on reductora, el agente reductor debe ser estable en soluci´on acuosa y debe ser capaz preferiblemente de reducir s´olo la base de Schiff formada en el proceso inicial de la alquilaci´ on reductora. Los agentes reductores preferidos pueden ser seleccionados de borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, dimetilamina borano, trimetilamina borano y piridina borano. Un agente reductor particularmente preferido es cianoborohidruro de sodio. Otros par´ ametros de la reacci´on tales como solventes, tiempos de reacci´on, temperaturas, etc., y los medios para la purificaci´on de los productos, pueden ser determinados caso por caso sobre la base de la informaci´on publicada referente a la derivatizaci´ on de prote´ınas con pol´ımeros solubles en agua (ver las publicaciones citadas en la presente).

C. Composiciones Farmac´euticas del Producto Proteico GDNF

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Las composiciones farmac´euticas del producto proteico GDNF incluyen t´ıpicamente una cantidad terap´euticamente eficaz de un producto proteico GDNF en mezcla con uno o m´ as materiales de formulaci´ on farmac´euticamente y fisiol´ogicamente aceptables. Los materiales de formulaci´on adecuados incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes, conservantes, colorantes, agentes aromatizantes y diluidores, agentes emulsionantes, agentes de suspensi´ on, solventes, rellenos, agentes de carga, tampones, veh´ıculos para la administraci´on, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmac´euticos. Por ejemplo, un veh´ıculo adecuado puede ser agua para inyecci´on, soluci´ on salina fisiol´ ogica o perilinfa artificial, suplementados posiblemente con otros materiales comunes en las composiciones para administraci´on parenteral. Soluci´ on salina tamponada neutra o soluci´ on salina mezclada con seroalb´ umina, son ejemplos adicionales de veh´ıculos.

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El solvente primario en un veh´ıculo puede ser acuoso o no acuoso por naturaleza. Adem´ as, el veh´ıculo puede contener otros excipientes farmac´euticamente aceptables para modificar o mantener el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disoluci´ on o el olor de la formulaci´ on. De manera similar, el veh´ıculo puede contener tambi´en otros excipientes farmac´euticamente aceptables para modificar o mantener la velocidad de liberaci´on del producto proteico GDNF, o para estimular la absorci´on o la penetraci´on del producto proteico GDNF a trav´es de la membrana timp´ anica. Tales excipientes son aquellas sustancias que se emplean normalmente y habitualmente 15

ES 2 170 938 T3 en la formulaci´ on de dosificaciones para administraci´ on en el o´ıdo medio en forma de dosis unidad o de dosis m´ ultiple.

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Una vez que la composici´on terap´eutica ha sido formulada, puede ser almacenada en viales est´eriles como una soluci´ on, suspensi´ on, gel, emulsi´on, s´ olido o polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden ser almacenadas en una forma lista para usar o en una forma, por ejemplo liofilizada, que requiera la reconstituci´on antes de la administraci´ on.

Las formulaciones farmac´euticas ´optimas ser´an determinadas por una persona experta en la t´ecnica dependiendo de consideraciones tales como la v´ıa de administraci´ on y la dosificaci´ on deseada. Ver, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a¯ Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) p´ aginas 1435-1712. Tales formulaciones pueden influir sobre el estado f´ısico, la estabilidad, la velocidad de liberaci´ on in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo de las presentes prote´ınas GDNF, variantes y derivados.

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Est´ an previstas tambi´en otras formas de administraci´on eficaces tales como formulaciones de liberaci´on lenta en el o´ıdo medio, nebulizaciones para inhalaci´ on o formulaciones activas oralmente. Por ejemplo, en una formulaci´ on de liberaci´ on mantenida, el producto proteico GDNF puede estar unido o incorporado a preparaciones particuladas de compuestos polim´ ericos (tales como ´acido polil´actico, ´acido poliglic´olico, etc.) o a liposomas. Puede utilizarse tambi´en ´acido hialur´ onico, y ´este puede tener el efecto de estimular una duraci´ on mantenida en la circulaci´ on. La composici´on farmac´eutica del producto proteico GDNF puede ser formulada tambi´en para administraci´ on en el o´ıdo medio, por ejemplo mediante infusi´ on o inyecci´on en la membrana timp´ anica, y puede incluir tambi´en formulaciones de liberaci´on lenta o de circulaci´on mantenida. Tales composiciones terap´euticas administradas en el o´ıdo medio est´an t´ıpicamente en forma de una soluci´ on acuosa libre de pir´ ogenos, aceptable para el o´ıdo medio, que contiene el producto proteico GDNF en un veh´ıculo farmac´euticamente aceptable. Un veh´ıculo preferido es agua destilada est´eril.

Se contempla tambi´en que ciertas formulaciones conteniendo el producto proteico GDNF van a ser administradas oralmente. El producto proteico GDNF que es administrado de esta manera puede estar encapsulado y puede ser formulado con o sin aquellos veh´ıculos utilizados habitualmente en la fabricaci´on de formas de dosificaci´ on s´olidas. La c´ apsula puede ser dise˜ nada para que libere la porci´on activa de la formulaci´ on en el punto del tracto gastrointestinal en el que la biodisponibilidad est´ a maximizada y la degradaci´ on presist´emica est´a minimizada. Pueden incluirse excipientes adicionales para facilitar la absorci´ on del producto proteico GDNF. Pueden emplearse tambi´en diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusi´ on, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensi´ on, agentes desintegrantes para tabletas y aglutinantes.

La formulaci´ on de preparaciones t´ opicas para el o´ıdo, incluyendo soluciones, suspensiones y ung¨ uentos para el o´ıdo medio, es bien conocida por los expertos en la t´ecnica (ver Remington’s Pharmaceutical Scienon, Cap´ıtulo 86, p´ aginas 1581-1592, Mack Publishing Company, 1990). Est´ an disponibles ces, 18a¯ Edici´ otros modos de administraci´on, incluyendo inyecciones para el o´ıdo medio, y son tambi´en bien conocidos m´etodos y medios para producir preparaciones para el o´ıdo medio adecuadas para tales modos de administraci´on.

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Seg´ un es utilizado en esta solicitud, “o´ıdo medio” se refiere al espacio entre la membrana timp´anica y el o´ıdo interno. Esta posici´ on es externa a todo el tejido del o´ıdo interno y podr´ıa no requerirse un procedimiento invasivo para acceder a esta regi´on si se desarrollara una formulaci´on de tal modo que el GDNF penetrara a trav´es de la membrana timp´anica. Por lo dem´ as, el material ser´a introducido en el o´ıdo medio por inyecci´on a trav´es de la membrana timp´anica o, en el caso de que se necesiten administraciones repetidas, se realizar´a un orificio en la membrana timp´ anica. Ejemplos de tales sistemas incluyen insertos y gotas, geles o ung¨ uentos aplicados “t´opicamente” que pueden ser utilizados para suministrar el material terap´eutico a estas regiones. Un orificio en la membrana timp´anica es un procedimiento muy frecuente realizado en las visitas a la consulta, en casos tales como infecciones del o´ıdo medio (normalmente en ni˜ nos). El orificio cierra espont´ aneamente despu´es de unos pocos d´ıas.

En la utilizaci´on del producto proteico GDNF aqu´ı descrita para el tratamiento de una enfermedad o de una lesi´ on del o´ıdo interno, es tambi´en ventajoso que una formulaci´ on aplicada t´ opicamente incluya un agente para estimular la penetraci´ on o el transporte del agente terap´eutico al o´ıdo medio e interno. Tales agentes son conocidos en la t´ecnica. Por ejemplo, Ke y col., EE.UU. 5.221.696 describen la utilizaci´ on de materiales para incrementar la penetraci´ on de preparaciones oft´ almicas a trav´es de la c´ornea.

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Los sistemas para el o´ıdo interno son aquellos sistemas que son adecuados para ser utilizados en cualquier compartimento tisular en, entre o alrededor de las capas de tejido del o´ıdo interno, tales como la c´oclea y el ´organo vestibular. Estos lugares incluyen las diferentes estructuras de la c´oclea tales como la estr´ıa vascular, la membrana de Reissner, el o´rgano de Corti, el ligamento espiral y las neuronas cocleares.

Podr´ıa no requerirse un procedimiento invasivo para acceder a esas estructuras, ya que se ha demostrado que la prote´ına penetra a trav´es de la membrana de la ventana redonda a la perilinfa del o´ıdo interno. Un veh´ıculo particularmente adecuado para la introducci´ on de GDNF en el o´ıdo interno por penetraci´on a trav´es de la membrana de la ventana redonda es la perilinfa artificial. Esta soluci´on consta de D-glucosa on salina tamponada con 10,00 mM, CaCl2 1,5 mM, MgCl2 1,5 mM en una soluci´on al 1,0 % de soluci´ fosfato de Dulbecco en agua desionizada a 280-300 mOsm y a un pH de 7,2. Otra preparaci´ on m´as puede implicar la formulaci´ on del producto proteico GDNF con un agente, tal como microesferas o liposomas inyectables en el o´ıdo medio, que proporcione la liberaci´on lenta o mantenida de la prote´ına que puede ser entonces suministrada como una inyecci´ on de dep´ osito (depot). Otro medio adecuado para la introducci´ on del producto proteico GDNF en el o´ıdo interno incluye dispositivos implantables para el suministro de f´ armacos o que contengan el producto proteico GDNF, y un implante coclear atravesado por un t´ unel a fin de que el GDNF pueda ser suministrado continuamente al o´ıdo interno a trav´es del mismo.

Las preparaciones para el tratamiento del o´ıdo de la presente invenci´on, particularmente las preparaciones t´ opicas, pueden incluir otros componentes, por ejemplo conservantes aceptables para el o´ıdo medio, agentes de tonicidad, cosolventes, agentes para la formaci´ on de complejos, agentes tamponantes, antimicrobianos, antioxidantes y surfactantes, como es bien conocido en la t´ecnica. Por ejemplo, agentes adecuados para aumentar la tonicidad incluyen haluros de metales alcalinos (preferiblemente cloruro de sodio o potasio), manitol, sorbitol y similares. Se a˜ nade ventajosamente suficiente agente para incrementar la tonicidad a fin de que la formulaci´ on que va a ser instilida en el o´ıdo sea compatible con la osmolaridad de la endolinfa y de la perilinfa. Conservantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, timerosal, fenetil alcohol, metilparab´en, propilparab´en, clorhexidina, a´cido s´ orbico y similares. Puede utilizarse tambi´en como conservante per´oxido de hidr´ ogeno. Cosolventes adecuados incluyen, pero no se limitan a, glicerina, propil´en glicol y polietil´en glicol. Agentes adecuados para la formaci´ on de complejos incluyen cafe´ına, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-betaciclodextrina. Los tampones pueden ser tampones convencionales tales como borato, citrato, fosfato, bicarbonato o Tris-HCl. Los componentes de la formulaci´on est´an presentes en concentraciones que son aceptables para el lugar de administraci´ on en el o´ıdo medio o interno. Por ejemplo, se utilizan tampones para mantener la composici´on a pH fisiol´ogico o a un pH ligeramente inferior, t´ıpicamente en un rango de pH de 5 aproximadamente a 8 aproximadamente.

Componentes de la formulaci´ on adicionales pueden incluir materiales que proporcionen una permanencia prolongada del agente terap´eutico administrado en el o´ıdo medio para maximizar el contacto t´ opico y estimular la absorci´on a trav´es de la membrana de la ventana redonda. Los materiales adecuados incluyen pol´ımeros o materiales formadores de gel que proporcionan una viscosidad incrementada a la preparaci´ on para el o´ıdo medio. La idoneidad de las formulaciones de la presente invenci´ on para liberaci´ on controlada (por ejemplo, suministro mantenido y prolongado) de un agente para el tratamiento del o´ıdo interno, puede ser determinada por varios procedimientos conocidos en la t´ecnica. Otra preparaci´ on m´as para el o´ıdo puede implicar una cantidad eficaz del producto proteico GDNF en mezcla con excipientes no t´ oxicos aceptables para el tratamiento del o´ıdo medio que sean adecuados para la fabricaci´ on de tabletas.

Mediante la disoluci´on de las tabletas en agua est´eril, o en otro veh´ıculo apropiado, pueden prepararse soluciones para el tratamiento del o´ıdo medio en forma de dosis unidad. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes tales como almid´ on, gelatina o acacia.

Administraci´ on/Suministro del Producto Proteico GDNF

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El producto proteico GDNF puede ser administrado parenteralmente a trav´es de una v´ıa subcut´ anea, intramuscular, intravenosa, transpulmonar, transd´ermica, intratecal o intracerebral. Para el tratamiento de condiciones del o´ıdo interno, el producto proteico GDNF puede ser administrado en el o´ıdo medio (o directamente en el o´ıdo interno, especialmente en los casos en los que tiene ya lugar un procedimiento invasivo), mediante aplicaci´on t´ opica, insertos, inyecci´on, implantes, terapia celular o terapia g´enica.

Por ejemplo, implantes de liberaci´on lenta que contengan el factor neurotr´ ofico incluido en una matriz polim´erica biodegradable pueden suministrar el producto proteico GDNF. El producto proteico GDNF puede ser administrado extracerebralmente en una forma que haya sido modificada qu´ımicamente o em17

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paquetada a fin de que atraviese la barrera hematoencef´ alica, o puede ser administrado en conexi´ on con uno o m´ as agentes capaces de estimular la penetraci´on del producto proteico GDNF a trav´es de la barrera.

De manera similar, el producto proteico GDNF puede ser administrado en el o´ıdo medio o en el o´ıdo interno, o puede ser administrado en la parte superior de la membrana timp´ anica en conexi´ on con uno o m´as agentes capaces de estimular la penetraci´on o el transporte del producto proteico GDNF a trav´es de las membranas del o´ıdo. La frecuencia de dosificaci´ on depender´ a de los par´ ametros f´armacocin´eticos del producto proteico GDNF seg´ un est´e formulado y de la v´ıa de administraci´on.

La dosis espec´ıfica puede ser calculada de acuerdo con consideraciones del peso corporal, del a´rea de la superficie corporal o del tama˜ no del o´rgano. El refinamiento posterior de los c´alculos necesarios para determinar la dosificaci´ on apropiada para el tratamiento que implica a cada una de las formulaciones mencionadas anteriormente, es realizado rutinariamente por las personas con experiencia habitual en la t´ecnica y est´a dentro del a´mbito de las tareas realizadas de manera rutinaria, especialmente a la luz de la formulaci´ on sobre la dosificaci´ on y de los ensayos descritos en la presente. Las dosificaciones apropiadas pueden ser determinadas mediante el empleo de los ensayos establecidos para determinar las dosificaciones utilizadas junto con los datos de dosis-respuesta apropiados. Se apreciar´a por los expertos en la t´ecnica que la dosificaci´on utilizada en las formulaciones administradas en el o´ıdo interno ser´ a min´ uscula en comparaci´on con la utilizada en una inyecci´on sist´emica o en una administraci´ on oral.

El r´egimen de dosificaci´on final implicado en la fabricaci´ on de un medicamento para tratar las condiciones anteriormente descritas ser´a determinado por el m´edico que atiende, considerando varios factores que modifican la acci´ on de los f´armacos, por ejemplo la edad, condici´on, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infecci´ on, la hora de administraci´ on y otros factores cl´ınicos. A medida que se realicen estudios, surgir´ a m´as informaci´ on referente a los niveles de dosificaci´on apropiados para el tratamiento de varias enfermedades y condiciones.

Se prev´e que la administraci´ on continua o el suministro mantenido de GDNF puede ser ventajoso para un tratamiento dado. Aunque la administraci´ on continua puede ser realizada a trav´es de un medio mec´anico, tal como con una bomba de infusi´ on, se contempla que puedan practicarse otros modos de administraci´ on continua o casi continua. Por ejemplo, la derivatizaci´ on qu´ımica o la encapsulaci´on pueden tener como resultado formas de liberaci´ on mantenida de la prote´ına que tengan el efecto de una presencia continua, en cantidades predecibles, sobre la base de un r´egimen de dosificaci´on determinado. De este modo, los productos proteicos GDNF incluyen prote´ınas derivatizadas o formuladas de otro modo para efectuar tal administraci´ on continua.

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Se contempla tambi´en la terapia celular con el producto proteico GDNF, por ejemplo, la implantaci´ on en el o´ıdo medio o interno de c´elulas que produzcan el producto proteico GDNF. Esta realizaci´ on implicar´ıa la implantaci´ on en los pacientes de c´elulas capaces de sintetizar y secretar una forma biol´ogicamente activa del producto proteico GDNF. Tales c´elulas productoras del producto proteico GDNF pueden ser c´elulas que sean productores naturales del producto proteico GDNF (an´alogas a las c´elulas de glioblastoma B49), o pueden ser c´elulas recombinantes cuya capacidad para producir el producto proteico GDNF haya sido aumentada por transformaci´ on con un gen que codifique el producto proteico GDNF deseado en un vector adecuado para estimular su expresi´ on y secreci´on. Con el fin de minimizar una reacci´ on inmunol´ ogica potencial en los pacientes a los que se est´a administrando el producto proteico GDNF de una especie for´anea, se prefiere que las c´elulas naturales productoras del producto proteico GDNF sean de origen humano y produzcan el producto proteico GDNF humano. De igual modo, se prefiere que las c´elulas recombinantes productoras del producto proteico GDNF sean transformadas con un vector de expresi´on que contenga un gen que codifique un producto proteico GDNF humano. Las c´elulas implantadas pueden estar encapsuladas para evitar la infiltraci´ on del tejido circundante. Pueden implantarse en pacientes c´elulas animales humanas o no humanas en recintos de protecci´on o membranas polim´ericas semipermeables biocompatibles, que permiten la liberaci´on del producto proteico GDNF, pero que impiden la destrucci´on de las c´elulas por el sistema inmune del paciente o por otros factores perjudiciales del tejido circundante. Tal implante, por ejemplo, puede estar unido a la membrana de la ventana redonda del o´ıdo medio para producir y liberar el producto proteico GDNF directamente en la perilinfa.

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Se contempla tambi´en que las propias c´elulas del paciente pueden ser transformadas ex vivo para producir el producto proteico GDNF y ser implantadas directamente sin encapsulaci´ on. Por ejemplo, las c´elulas de sost´en del ´organo de Corti pueden ser recuperadas, cultivadas y transformadas con un vector apropiado y trasplantadas de nuevo en el o´ıdo interno del paciente donde producir´ an y liberar´an la prote´ına GDNF o la variante de la prote´ına GDNF deseada.

Se prev´e tambi´en la terapia g´enica con el producto proteico GDNF in vivo mediante la introducci´ on 18

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del gen que codifica el producto proteico GDNF en c´elulas diana del o´ıdo interno, a trav´es de la inyecci´on local de una construcci´ on de a´cido nucleico o de otros vectores de suministro apropiados (Hefti, J. Neurobiol., 25:1418-1435, 1994). Por ejemplo, una secuencia de a´cido nucleico que codifique un producto proteico GDNF puede estar contenida en un vector v´ırico adenoasociado o en un vector adenov´ırico para su transporte a las c´elulas del o´ıdo interno. Vectores v´ıricos alternativos incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirus, virus del herpes simple y virus del papiloma. La transferencia f´ısica, in vivo o ex vivo seg´ un sea apropiado, puede ser realizada tambi´en mediante transferencia mediada por liposomas, inyecci´on directa (ADN desnudo), transferencia mediada por receptores (complejo ligando-ADN), electroporaci´ on, precipitaci´ on con fosfato de calcio o bombardeo de micropart´ıculas (escopeta g´enica).

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La metodolog´ıa para la encapsulaci´ on en membranas de c´elulas vivas es familiar para las personas con experiencia habitual en la t´ecnica, y la preparaci´ on de las c´elulas encapsuladas y su implantaci´ on en pacientes puede ser realizada sin una experimentaci´on excesiva. Ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N´ umeros 4.892.538, 5.011.472 y 5.106.627. Un sistema para encapsular c´elulas vivas est´a descrito en la Solicitud de PCT WO 91/10425 de Aebischer y col. Ver tambi´en, la Solicitud de PCT WO 91/10470 de Aebischer y col., Winn y col., Exper. Neurol., 133:322-329, 1991, Aebischer y col., Exper. Neurol., 111:269-275, 1991; Tresco y col., ASAIO, 38:17-23, 1992. Las t´ecnicas para formular una variedad de otros medios de liberaci´ on mantenida o controlada, tales como transportadores de liposomas, part´ıculas o esferas bioerosionables e inyecciones de dep´ osito (depot), son tambi´en conocidas por los expertos en el oficio.

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Debe se˜ nalarse que las formulaciones del producto proteico GDNF descritas en la presente pueden ser utilizadas para aplicaciones veterinarias adem´ as de humanas, y que el t´ermino “paciente” no debe ser interpretado de una manera limitante. En el caso de aplicaciones veterinarias, los rangos de dosificaci´on deben ser los mismos que los especificados anteriormente.

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Otros aspectos y ventajas de la presente invenci´ on ser´an comprendidos despu´es de la consideraci´on de los ejemplos ilustrativos siguientes. El Ejemplo 1 aborda los efectos de la administraci´ on del producto proteico GDNF sobre c´elulas ciliadas en un sistema de cultivo de explantes de c´ oclea. El Ejemplo 2 aborda los efectos de la administraci´ on del producto proteico GDNF sobre neuronas del ganglio espiral, en un cultivo de c´elulas disociadas generado a partir de la c´ oclea. Los resultados de los estudios de cultivos de explantes del o´rgano de Corti y los de los cultivos de neuronas del ganglio espiral de rata adulta, demostraron que el producto proteico GDNF tiene actividad neutr´ ofica y protectora para las neuronas auditivas y para las c´elulas ciliadas del ´organo de Corti contra ototoxinas, que no se conoc´ıa anteriormente que eran sensibles a GDNF. Ejemplos Ejemplo 1

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El Producto Proteico GDNF Protege a las C´elulas Ciliadas Cocleares Frente a Ototoxicidad Materiales 45

Los materiales utilizados en el Ejemplo siguiente fueron obtenidos seg´ un sigue. ´ Soluci´ on para Disecci´ on del Organo de Corti

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Soluci´ on salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS; 1x, sin cloruro de calcio, sin cloruro de magnesio. # de Cat. 14190-136, Gibco BRL), conteniendo 1,5 g/l de D-glucosa (Dextrosa. # de Cat. 15023-021, Gibco BRL). ´ Medio de Cultivo para Explantes del Organo de Corti

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1. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco con alta concentraci´ on de glucosa (DMEM; 1x, con Lglutamina, sin piruvato de sodio. # de Cat. 11965-084, Gibco BRL).

2. 0,15 g/100 ml de D-glucosa (Dextrosa. # de Cat. 15023-021, Gibco BRL).

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3. 1 % de suplemento N-2 (100x, # de Cat. 17502-030, Gibco BRL).

4. 100 Unidades/ml de penicilina G, potasio (Penicilina; # de Cat. 21840-020, Gibco BRL).

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M´etodos Preparaci´ on del Medio 5

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El DMEM fue suplementado con un 1 % de suplemento N-2 y se a˜ nadi´ o D-glucosa a una concentraci´on final de 1,5 g/l. Se a˜ nadi´ o penicilina a 100 Unidades/ml. Despu´es de mezclar, el medio fue filtrado y o nuevo justo antes de su utilizaci´on con el fin de minimizar las mantenido a 4◦ C. El medio se prepar´ variaciones entre experimentos. Se utilizaron pipetas y recipientes de pl´astico todo el tiempo para minimizar la adsorci´on de prote´ınas.

Soluciones del Producto Proteico GDNF

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Los productos proteicos GDNF recombinantes humanos purificados fueron preparados como soluciones de 1 mg/ml en D-PBS (soluci´on salina tamponada con fosfato preparada con agua destilada) que conten´ıa un cinco por ciento de seroalb´ umina bovina. Las soluciones fueron almacenadas en al´ıcuotas a -85◦C. Se prepararon diluciones seriadas (0,1; 1; 10; 25; 50 ng/ml en medio de cultivo normal) en microplacas de 96 pocillos. Se a˜ nadieron 10 microlitros de las soluciones del producto proteico GDNF concentradas diez veces a medio de cultivo para explantes de ´organo de Corti que conten´ıa o no (control) ototoxinas (90 µl). Los cultivos control recibieron medio normal (10 µl). Los tratamientos con el producto proteico GDNF se iniciaron el d´ıa del plaqueo. El segundo d´ıa, los medios fueron cambiados por medios que conten´ıan las ototoxinas solas, junto con GDNF o sin ambos (control).

Herramientas de Disecci´ on y Placas de Cultivo

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1. Las pinzas de disecci´on de 4” y 5” y las tijeras de disecci´on de 4” eran de Roboz Surgical, Washington, DC.

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2. Las microplacas de 96 pocillos est´eriles Falcon (fondo plano. # de Cat. 3072), el material de pl´ astico para cultivo de tejidos y los tubos de centr´ıfuga de polipropileno eran de Beckton-Dickinson, Lincoln Park, New Jersey.

Ototoxinas y Reactivos Relacionados

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1. Soluci´ on de neomicina (# de Cat. N1142, Sigma. St. Louis, MO), utilizada a una concentraci´ on final de 0,6 mM (en cada experimento se preparaba una soluci´ on nueva a˜ nadiendo 90 µl de neomicina 1 mg/ml a 1410 µl de medio).

2. Cisplatino (Platinol-AQ. # de Cat. NDC 0015-3220-22, Bristol Myers Squibb Laboratories, Princeton, New Jersey). Utilizado a una concentraci´on final de 35 µg/ml (se preparaba una soluci´ on nueva en cada experimento a˜ nadiendo 52,5 µl de cisplatino 1 mg/ml a 1447,5 µl de medio).

3. Triton X-100 (t-octilfenoxipoli-etoxietanol. # de Cat. X-100, Sigma. St. Louis, MO).

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4. Faloidina (marcada con FITC. # de Cat. P-5282, Sigma. St. Louis, MO).

5. Vectashield (Medio de Montaje. # de Cat. H-1000, Vector, Burlingame, CA). ´ Preparaci´ on de Explantes de Organo de Corti de Rata

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Los explantes de ´organo de Corti fueron obtenidos de ratas Wistar P3-P4. Las ratas fueron decapitadas, se extirp´ o la mand´ıbula inferior y se extrajo la piel. Se recogi´ o el hueso temporal en soluci´on de disecci´on, la c´ apsula o´tica fue expuesta y la c´apsula coclear ´oseo-cartilaginosa fue separada cuidadosamente del hueso temporal. La c´oclea liberada fue transferida a otra placa Petri con soluci´ on de disecci´on para una disecci´ on posterior. Se obtuvieron o´rganos de Corti intactos mediante la utilizaci´ on de unas pinzas finas para sujetar el tejido del nervio VIII central y extraerlo, posteriormente la membrana de la estr´ıa vascular fue desprendida cuidadosamente, comenzando desde el v´ertice o base. El ´organo de Corti fue luego transferido a una placa Petri de 35 mm de di´ ametro que conten´ıa PBS fr´ıo suplementado con glucosa y estaba listo para ser cultivado.

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ES 2 170 938 T3 Procedimiento para el Cultivo de Explantes de C´ oclea

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Se cultivaron explantes de c´ oclea en microplacas de 96 sin revestir. Un u ´ nico o´rgano de Corti fue colocado en un pocillo y fue mantenido flotando en el medio. Los explantes fueron mantenidos en medio normal durante 24 horas (90 µl/pocillo). Una soluci´ on de prote´ına GDNF (10 µl) fue a˜ nadida a los cultivos “tratados” y se a˜ nadieron 10 µl de medio a los controles. Despu´es de 24 horas de incubaci´ on, los medios fueron cambiados y los explantes fueron expuestos a medio que conten´ıa ototoxina (90 µl), con soluci´on de prote´ına GDNF (10 µl) o sin ella (control). Los cultivos fueron incubados durante 3 d´ıas adicionales. Los explantes fueron luego fijados con paraformaldeh´ıdo al 4 % en D-PBS 0,1 M durante 30 minutos a temperatura ambiente y procesados para inmunotinci´ on.

Tinci´ on de C´elulas Ciliadas con FITC-Faloidina

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Con el fin de identificar y contar las c´elulas ciliadas en el ´organo de Corti, se utiliz´ o un m´etodo de inmunotinci´ on directa para marcar la actina presente de manera natural en los haces de estereocilios de las c´elulas ciliadas. Los explantes fueron lavados tres veces con D-PBS (200 µl por pocillo) y permeabilizados con Triton X-100 al 1 % en D-PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despu´es de tres lavados en D-PBS, los explantes fueron incubados con faloidina marcada con FITC (1:60 de la soluci´on madre, 50 µl/pocillo) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las placas fueron cubiertas con papel de aluminio ya que la faloidina es sensible a la luz. Despu´es de tres lavados m´as con D-PBS, los explantes marcados fueron colocados en una gota de glicerol sobre un portaobjetos del microscopio, cubiertos con un cubreobjetos de vidrio y sellados con esmalte de u˜ nas. Los explantes fueron observados bajo un microscopio invertido de fluorescencia Nikon Diaphot-300, utilizando filtros para FITC y o´ptica para fluorescencia.

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Determinaci´ on del N´ umero de C´elulas Ciliadas

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Para cada punto experimental, se utilizaron de 2 a 4 c´ ocleas. En cada c´oclea, se cont´o el n´ umero de c´elulas ciliadas en 2-3 secciones de 175 µm de longitud cada una. Solamente se analizaron secciones de la espira media de la c´oclea. Cada experimento fue repetido varias veces. El n´ umero de c´elulas ciliadas de los cultivos control y tratados con cisplatino o neomicina fue generado a partir del an´ alisis de 40 c´ocleas por punto.

Resultados

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Las c´elulas ciliadas de los cultivos de explantes flotantes no murieron durante el periodo del experimento de cuatro d´ıas. De este modo, el n´ umero de c´elulas te˜ nidas con faloidina presentes al final del periodo experimental de 4 d´ıas, en ausencia de ototoxinas y tratamientos, fue 105,4 ± 6,9 (n=28). Las ototoxinas a˜ nadidas a los explantes el segundo d´ıa despu´es del plaqueo, causaron una p´erdida significativa del n´ umero de c´elulas ciliadas encontradas despu´es de 4 d´ıas in vitro. La exposici´on a 35 µg/ml de cisplatino 24 horas despu´es del plaqueo, produjo una p´erdida del 80 por ciento aproximadamente de c´elulas ciliadas: solamente sobrevivieron el 21,2 % ± 6,0 (n=40) del n´ umero inicial de c´elulas ciliadas (Tabla 2) y despu´es de la exposici´on a neomicina 0,8 mM, solamente sobrevivieron un 7,4 % ± 4,7 (n=43) de las c´elulas ciliadas (Tabla 2).

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(Ver Tabla 2 en la p´ agina siguiente) 55

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ES 2 170 938 T3 TABLA 2 Efecto de GDNF sobre c´elulas ciliadas cocleares expuestas a cisplatino Supervivencia de las C´elulas Ciliadas ( % de las no tratadas)

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Tratamiento

GDNF a˜ nadido en el momento del plaqueo

GDNF a˜ nadido 24 horas despu´es del plaqueo

Cisplatino solo (35 µl/ml)

21,3 ± 4,0 (n=30)

21,3 ± 4,0 (n=30)

Cisplatino + GDNF, 0,05 ng/ml

35,2 ± 5,4 (n=5)∗

ND

Cisplatino + GDNF, 0,1 ng/ml

39,6 ± 10,5 (n=17)∗

37,8 ± 11,8 (n=5)∗

Cisplatino + GDNF, 1 ng/ml

46,7 ± 10,8 (n=20)∗

51,0 ± 8,0 (n=4)∗

Cisplatino + GDNF, 10 ng/ml

46,7 ± 7,7 (n=16)∗

49,7 ± 4,6 (n=5)∗

Cisplatino + GDNF, 25 ng/ml

ND

45,0 ± 12,0 n=3)∗

Cisplatino + GDNF, 50 ng/ml

46,8 ± 10,5 (n=13)∗

ND

10

15

20

25

30

El GDNF fue introducido en los cultivos de explantes el d´ıa del plaqueo o´ 24 horas despu´es del plaqueo.

Se a˜ nadi´ o cisplatino (35 µg/ml) 24 horas despu´es del plaqueo y los cultivos fueron incubados durante 3 d´ıas adicionales. Las c´elulas ciliadas fueron te˜ nidas con FITC-faloidina. El n´ umero de c´elulas ciliadas fue contado en la espira media de la c´ oclea en 2-3 secciones de 175 µm cada una. Los resultados est´an expresados como el porcentaje de c´elulas ciliadas presentes en los cultivos no tratados despu´es de 4 d´ıas in vitro (105,4 ± 6,9; n=28). Cada n´ umero es la media ± DE de n c´ocleas. ∗

35

Significativamente diferente de cisplatino solo a p<0,05 (Test t)

ND: no determinado

40

45

50

55

60

Hab´ıa una notable diferencia en la morfolog´ıa de los o´rganos de Corti entre estos dos tratamientos: mientras que el tratamiento con neomicina tuvo como resultado una p´erdida casi completa de c´elulas ciliadas, aqu´ellas que permanec´ıan estaban todav´ıa organizadas en la estructura t´ıpica de cuatro filas (3 filas de c´elulas ciliadas externas y una fila de c´elulas ciliadas internas). El tratamiento con cisplatino, por otra parte, produjo una notable alteraci´ on de la estructura de cuatro filas y las c´ elulas supervivientes estaban situadas aleatoriamente.

En los cultivos que recibieron GDNF en el momento del plaqueo (pretratamiento), un n´ umero significativo de c´elulas ciliadas sobrevivieron a la exposici´on de 3 d´ıas a las ototoxinas (desde el d´ıa 2 hasta el d´ıa 4). En los cultivos expuestos a cisplatino, el tratamiento con concentraciones de GDNF tan bajas como 0,05 ng/ml caus´ o un incremento de la supervivencia de c´elulas ciliadas desde el 21 % (cultivos no tratados) hasta el 35 %. Se alcanz´ o una actividad protectora m´ axima con 0,1 ng/ml de GDNF (41 % de supervivencia) (Tabla 3). En los cultivos expuestos a neomicina, GDNF a 0,1 ng/ml increment´o el n´ umero de c´elulas ciliadas desde el 7 % hasta el 22 %; se observ´o una actividad m´ axima de GDNF (37 % de supervivencia) con 10 ng/ml de GDNF (Tabla 3). El tratamiento con GDNF conservaba la morfolog´ıa de cuatro filas en los cultivos tratados con neomicina, pero no imped´ıa su alteraci´ on por cisplatino.

Con el fin de analizar adicionalmente la capacidad del GDNF para rescatar a las c´elulas ciliadas de la ototoxicidad, se realiz´o un conjunto de experimentos en los que se a˜ nadi´ o GDNF 24 horas despu´es del plaqueo, al mismo tiempo que los cultivos fueron expuestos a las toxinas (cotratamiento). Los resultados indican que bajo este paradigma experimental, GDNF es capaz de rescatar a las c´elulas ciliadas en el mismo grado que cuando se administraba antes de la exposici´on a las toxinas (Tablas 2 y 3).

22

ES 2 170 938 T3 TABLA 3 Efecto de GDNF sobre c´elulas ciliadas cocleares expuestas a neomicina Supervivencia de las C´elulas Ciliadas ( % de las no tratadas)

5

Tratamiento

GDNF a˜ nadido en el momento del plaqueo

GDNF a˜ nadido 24 horas despu´es del plaqueo

Neomicina sola (0,8 mM)

7,1 ± 4,2 (n=42)

7,1 ± 4,2 (n=42)

Neomicina + GDNF, 0,05 ng/ml

19,5 ± 7,5 (n=6)∗

23,0 ± 6,2 (n=3)∗

Neomicina + GDNF, 0,1 ng/ml

22,0 ± 4,1 (n=13)∗

27,0 ± 14,7 (n=3)∗

Neomicina + GDNF, 1 ng/ml

28,2 ± 6,1 (n=19)∗

26,2 ± 6,4 (n=4)∗

Neomicina + GDNF, 10 ng/ml

37,4 ± 4,8 (n=11)∗

ND

Neomicina + GDNF, 50 ng/ml

34,4 ± 5,3 (n=7)∗

ND

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25

30

El GDNF fue introducido en los cultivos de explantes el d´ıa del plaqueo (pretratamiento) o´ 24 horas despu´es del plaqueo (cotratamiento). Se a˜ nadi´ o neomicina (0,8 mM) 24 horas despu´es del plaqueo y los cultivos fueron incubados durante 3 d´ıas adicionales. Las c´elulas ciliadas fueron te˜ nidas con FITCfaloidina. El n´ umero de c´elulas ciliadas fue contado en la espira media de la c´oclea en 2-3 secciones de 175 µm cada una. Los resultados est´ an expresados como el porcentaje de c´elulas ciliadas presentes en los cultivos no tratados despu´es de 4 d´ıas in vitro (105,4 ± 6,9; n=28). Cada n´ umero es la media ± DE de n c´ocleas. ∗

35

Significativamente diferente de neomicina sola a p<0,05 (Test t)

ND: no determinado Ejemplo 2

40

El Producto Proteico GDNF Estimula la Supervivencia de Neuronas Auditivas del O´ıdo Interno (Neuronas del Ganglio Espiral) y las Protege Frente a Ototoxinas Materiales Los materiales utilizados en el Ejemplo siguiente fueron obtenidos seg´ un sigue.

45

Medios de Cultivo Celular

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55

60

Medio de Eagle Modificado de Dulbecco con alta concentraci´ on de glucosa (DMEM; #11965-092), medio F12 de Ham (F12; #11765-021), suplemento de medio B27 (#17504-010), penicilina/estreptomicina (#15070-014), L-glutamina (#25030-016), soluci´ on salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS; #14190-052), laminina de rat´ on (#23017-015), seroalb´ umina bovina y fracci´ on V (#110-18-017) eran todos de GIBCO/BRL, Grand Island, NY. El suero de caballo inactivado por calor era de HyClone, Logan, Utah. Hidrobromuro de poli-L-ornitina (P-3655), insulina bovina (I-5500), transferrina humana (T-2252), putrescina (P-6024), progesterona (P-6149) y selenito de sodio (S-9133) eran todos de Sigma Chemical Company, Saint-Louis, MO. Papa´ına, desoxirribonucleasa I (ADNasa) y ovoalb´ umina (sistema de dosiciaci´on de papa´ına) eran de Worthington Biochemicals, Freehold, NJ. Las microplacas de 96 pocillos est´eriles Falcon (#3072), el material de pl´astico para cultivo de tejidos y los tubos de centr´ıfuga de polipropileno eran de Beckton-Dickinson, Oxnard, CA. La malla de nailon de 20 µm Nitex (#460) era de Tetko, Elmsford, NY. Las pinzas de disecci´ on de 4” y las tijeras de disecci´ on de 4” eran de Roboz Surgical, Washington, DC.

23

ES 2 170 938 T3 Anticuerpos y Reactivos Relacionados

5

El anticuerpo policlonal de conejo Enolasa Espec´ıfica Neuronal (NSE), era de Chemicon (#AB951), el anti-IgG de conejo producido en cabra biotinilado (#BA-1000) y el complejo avidina/biotina conjugado a peroxidasa (ABC Elite; kit PK-6100) eran de Vector Laboratories, Burlingame, CA. La 3’,3’diaminobencidina era de Cappel Laboratories, West Chester, PA. El tamp´ on bloqueante Superblock en PBS (#37515) era de Pierce, Rockford, IL. El Triton X-100 (X100), Nonidet P-40 (N6507) y el per´ oxido de hidr´ ogeno (30 %, v/v; H1009) eran de Sigma. Todos los dem´as reactivos fueron obtenidos de Sigma Chemical Company (Saint-Louis, MO), a no ser que se especifique de otro modo.

10

Ototoxinas El cisplatino (Platinol-AQ, #NDC 0015-3220-22) era de Bristol-Myers-Squibb, Princeton, NJ; el salicilato de sodio era de J.T. Baker, Phillipsburg, NJ (#3872-01) y la neomicina era de Sigma (#N1142).

15

M´etodos Preparaci´ on de los Medios 20

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30

Se prepar´ o un medio basal como una mezcla 1:1 de DMEM y medio F12, y fue suplementado con el suplemento para medio B27 a˜ nadido como una soluci´ on madre concentrada 50 veces. El suplemento para medio B27 consta de biotina, L-carnitina, corticosterona, etanolamina, D(+)-galactosa, glutation reducido, a´cido linol´eico, ´acido linol´enico, progesterona, putrescina, acetato de retinilo, selenio, T3 (triyodo1-tironina), DL-alfa-tocoferol (vitamina E), DL-alfa-tocoferol acetato, seroalb´ umina bovina, catalasa, insulina, super´ oxido dismutasa y transferrina. Se a˜ nadi´ o L-glutamina a una concentraci´ on final de 2 mM aproximadamente, penicilina a 100 UI/l aproximadamente y estreptomicina a 100 mg/l aproximadamente. Se a˜ nadi´ o suero de caballo inactivado por calor a una concentraci´ on final del 2,5 por ciento aproximadamente, se a˜ nadi´ o D-glucosa a una concentraci´on final de 5 g/l, el agente tamponante HEPES fue a˜ nadido a una concentraci´ on final de 20 mM aproximadamente, se a˜ nadi´ o insulina bovina a una concentraci´on final de 2,5 mg/ml aproximadamente y se a˜ nadi´ o transferrina humana a una concentraci´ on final de 0,1 mg/ml aproximadamente. Despu´es de mezclar, el pH fue ajustado a 7,3 aproximadamente y on con el el medio fue mantenido a 4◦ C. Los medios fueron preparados nuevos justo antes de su utilizaci´ fin de minimizar las variaciones entre experimentos. Se utilizaron pipetas y recipientes de pl´ astico todo el tiempo para minimizar la adsorci´ on de prote´ınas.

35

Soluciones del Producto Proteico GDNF

40

45

Los productos proteicos GDNF recombinantes humanos purificados fueron preparados como soluciones de 1 mg/ml en D-PBS (soluci´ on salina tamponada con fosfato preparada con agua destilada) conteniendo un cinco por ciento de seroalb´ umina bovina. Las soluciones fueron almacenadas en al´ıcuotas a -85◦ C. Se prepararon diluciones seriadas en microplacas de 96 pocillos. Se a˜ nadieron 10 µl de las soluciones del producto proteico GDNF concentradas diez veces a los cultivos celulares que conten´ıan medio de cultivo (90 µl). Los cultivos control recibieron D-PBS con un 5 por ciento de alb´ umina (10 µl). Los tratamientos con el producto proteico GDNF fueron a˜ nadidos a los cultivos una hora despu´es de que las c´elulas fueran sembradas o´ 24 horas despu´es, solos o junto con las ototoxinas.

Preparaciones de Ototoxinas

50

55

La neomicina fue a˜ nadida directamente de la soluci´ on madre (10−3 M aproximadamente) a 10 µl por pocillo para tener como resultado en una concentraci´ on final de 10−4 M aproximadamente. El cisplatino fue diluido con medio de cultivo a partir de la soluci´ on madre (1 mg/ml) hasta una soluci´ on de 20 µg/ml y a˜ nadido a 10 µl por pocillo, para tener como resultado una concentraci´on final de 2 µg/ml. El salicilato de sodio fue preparado a partir de polvo en una soluci´ on madre de 1 M en PBS y diluido posteriormente en el medio de cultivo hasta 100 mM, lo cual tuvo como resultado una concentraci´on final de 10 mM cuando se a˜ nadi´ o al cultivo a 10 µl/pocillo.

Sustrato del Cultivo

60

Para estimular la fijaci´ on o´ptima de las c´elulas del ganglio espiral sobre el sustrato y la emergencia de neuritas, las superficies de las placas de microvaloraci´ on (el sustrato del cultivo) fueron modificadas mediante revestimiento secuencial con poli-L-ornitina seguido por laminina de acuerdo con el procedimiento siguiente. La superficie de las placas fue cubierta completamente con una soluci´ on est´eril de poliornitina 24

ES 2 170 938 T3 0,1 mg/ml en a´cido b´ orico 0,1 M (pH 8,4) durante al menos una hora a temperatura ambiente, seguido por un lavado est´eril con agua Super-Q. El lavado acuoso fue luego aspirado y se a˜ nadi´ o una soluci´ on de 10 µg/ml de laminina de rat´ on en PBS y se incub´o a 37◦C durante dos horas. Estos procedimientos fueron realizados justo antes de utilizar las placas con el fin de asegurar la reproducibilidad de los resultados.

5

Preparaci´ on de Cultivos de C´elulas del Ganglio Espiral de Rata

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Se inyect´o a ratas Wistar de tres a cuatro semanas de edad (obtenidas de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) una sobredosis de la soluci´ on siguiente (ketamina (100 mg/ml); xilazina (20 mg/ml) y maleato de acopromazina (910 mg/ml) en proporciones de 3:3:1), se sacrificaron por decapitaci´on y el hueso temporal con la c´oclea fueron disecados y transferidos de manera est´eril a PBS con 1,5 g/l de glucosa sobre hielo. Se proces´ o un m´ aximo de 30 c´ocleas por experimento. Las c´ocleas fueron abiertas y se recogi´o el ´organo de Corti con el modiolo o´seo en un tubo de 50 ml est´eril que conten´ıa 5 ml de medio de disociaci´on (120 unidades de papa´ına y 2000 unidades de ADNasa en HBSS). El tejido fue incubado durante 30 minutos a 37◦C aproximadamente en un agitador de plataforma rotatoria a 200 rpm aproximadamente, posteriormente la soluci´ on de disociaci´on fue sustituida por una nueva y la incubaci´ on se prolong´ o durante otros 30 minutos. Las c´elulas fueron luego dispersadas mediante trituraci´ on a trav´es de pipetas Pasteur pulidas al fuego, tamizadas a trav´es de una malla de nailon Nitex de 40 µm para desechar el tejido no disociado y centrifugadas durante cinco minutos a 200 x g utilizando una centr´ıfuga cl´ınica IEC. La pella celular resultante fue resuspendida en HBSS que conten´ıa ovoalb´ umina y 500 unidades de ADNasa aproximadamente, se dispuso sobre la parte superior de una soluci´ on de ovoalb´ umina al cuatro por ciento (en HBSS) y se centrifug´ o durante 6 minutos aproximadamente a 500 x g. La pella final fue resuspendida en 6 ml aproximadamente de medio de cultivo y se sembr´ o a 90 µl/pocillo en las placas pre-revestidas.

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Inmunohistoqu´ımica de las C´elulas del Ganglio Espiral

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Las neuronas del ganglio espiral fueron identificadas mediante tinci´ on inmunohistoqu´ımica de la enolasa espec´ıfica neuronal (NSE). Los cultivos de c´elulas del ganglio espiral fueron fijados durante 10 minutos aproximadamente a temperatura ambiente con paraformaldeh´ıdo al ocho por ciento en D-PBS, pH 7,4, a˜ nadidos al medio de cultivo a 100 µl/pocillo y luego sustituidos por 100 µl de paraformaldeh´ıdo al cuatro por ciento durante 10 minutos adicionales, seguido por tres lavados en D-PBS (200 µl por pocillo de 6 mm). Los cultivos fijados fueron luego incubados en tamp´ on bloqueante Superblock en PBS, que conten´ıa un uno por ciento de Nonidet P-40 para incrementar la penetraci´ on del anticuerpo. Se aplicaron luego anticuerpos anti-NSE policlonales de conejo (Chemicon) a una diluci´ on 1:6000 en el mismo tamp´ on, y los cultivos fueron incubados durante dos horas a 37◦C en un agitador rotatorio. Despu´es de tres lavados con D-PBS, se detectaron los anticuerpos unidos a las c´elulas del ganglio espiral utilizando anti-IgG de conejo producido en cabra biotinilado (kit Vectastain de Vector Laboratories, Burlingame, CA) a una diluci´ on 1:300 aproximadamente. El anticuerpo secundario fue incubado con las c´elulas durante una hora aproximadamente a 37◦ C, las c´elulas fueron luego lavadas tres veces con D-PBS. El anticuerpo secundario fue marcado posteriormente con un complejo avidina-biotina-peroxidasa diluido 1:300 y las c´elulas fueron as con D-PBS, los incubadas durante 60 minutos aproximadamente a 37◦C. Despu´es de tres lavados m´ cultivos de c´elulas marcadas se hicieron reaccionar durante 5 minutos en una soluci´ on de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4, que conten´ıa un 0,04 % de 3’,3’-diaminobencidina-(HCl)4, un 0,06 por ciento de NiCl2 y un 0,02 por ciento de per´ oxido de hidr´ ogeno.

Determinaci´ on de la Supervivencia de las C´elulas del Ganglio Espiral

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60

Despu´es de varios tiempos en cultivo (24 horas, 3 d´ıas y 4 d´ıas), cultivos de c´elulas del ganglio espiral de rata fueron fijados, procesados e inmunote˜ nidos para NSE seg´ un se describi´ o anteriormente, y los cultivos fueron luego examinados con una o´ptica de luz brillante a un aumento de 200x. Se contaron todas las neuronas NSE-positivas presentes en un pocillo de 6 mm. Las c´elulas del ganglio espiral viables se caracterizaban porque ten´ıan un cuerpo redondo con un tama˜ no que oscilaba de 15-40 µm y ten´ıan procesos neur´ıticos. Las c´elulas del ganglio espiral que mostraban signos de degeneraci´ on, tales como pericarios irregulares, vacuolados o neuritas fragmentadas, fueron excluidas del recuento (la mayor´ıa de las c´elulas del ganglio espiral degeneradas, sin embargo, se desprend´ıan del sustrato del cultivo). El n´ umero de c´elulas fue expresado como c´elulas/pocillo de 6 mm o como el n´ umero de cambios con relaci´on a la densidad de c´elulas control.

Resultados Se utilizaron cultivos de neuronas del ganglio espiral de rata para demostrar el efecto del producto 25

ES 2 170 938 T3

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proteico GDNF sobre la supervivencia y protecci´on frente a ototoxinas. Las c´elulas del ganglio espiral fueron obtenidas de c´ ocleas de rata de tres a cuatro semanas de edad. Las c´elulas disociadas fueron luego sembradas en microplacas revestidas con poliornitina-laminina a una densidad de 1 c´ oclea por 2 pocillos aproximadamente en DMEM/F12 suplementado con suplemento para medio B27, un 2,5 por ciento de suero de caballo inactivado por calor, D-glucosa, HEPES, insulina y transferrina. Los cultivos consist´ıan en una mezcla de neuronas y c´elulas no neuronales. Sin embargo, las u ´nicas neuronas presentes eran neuronas del ganglio espiral y fueron identificadas por la presencia de inmunorreactividad de NSE. A la concentraci´on sembrada (1 o´rgano de Corti disociado en 2 pocillos), el n´ umero de c´elulas NSE-positivas por pocillo 24 horas despu´es de la siembra era de 127 ± 17 (n=7) bajo las condiciones control (sin tratamientos a˜ nadidos). Al final del experimento, 4 d´ıas despu´es de la siembra, el n´ umero de neuronas por pocillo se redujo hasta 64 ± 4,7, lo cual representa un 50,5 % ± 3,7 del n´ umero presente despu´es de 24 horas in vitro, bajo las condiciones control.

El efecto de la administraci´ on del producto proteico GDNF fue determinado sobre la supervivencia y la maduraci´ on morfol´ ogica de neuronas de ganglio espiral de rata cultivadas, as´ı como sobre su capacidad para resistir el efecto t´ oxico de una ototoxina conocida tal como cisplatino. Los cultivos de las c´elulas del ganglio espiral fueron tratados 24 horas despu´es de la siembra con el producto proteico GDNF recombinante humano (que variaba desde 50 ng/ml a 0,1 ng/ml) solo o en combinaci´ on con cisplatino (35 µg/ml). Veinticuatro horas despu´es de la siembra, no hab´ıa diferencia en el n´ umero de neuronas auditivas entre los cultivos control y los tratados con GDNF a 1 ng/ml y 10 ng/ml (127 ± 17; 126 ± 24 y 125 ± 19 neuronas/pocillo, respectivamente). Despu´es de un periodo adicional de 3 d´ıas, el tratamiento con GDNF a una concentraci´ on de 1 ng/ml no tuvo como resultado un incremento significativo del n´ umero de c´elulas neuronales. Hubo, sin embargo, un efecto tr´ ofico marcado: los somas neuronales eran m´as grandes y las fibras m´ as largas y m´as elaboradas que en los cultivos control. En los cultivos tratados con 10 ng/ml de GDNF, el 72 % aproximadamente de las neuronas presentes despu´es de 24 horas sobreviv´ıan, representando un incremento del 44 % sobre los cultivos control (Tabla 4). El efecto tr´ ofico era incluso m´as potente que en los cultivos tratados con 1 ng/ml de GDNF. El GDNF proteg´ıa tambi´en a las neuronas del ganglio espinal de la toxicidad del cisplatino (Tabla 4).

La exposici´on de los cultivos a 5 µg/ml de cisplatino 24 horas despu´es de la siembra, tuvo como resultado la p´erdida del 94 % aproximadamente del n´ umero inicial (a las 24 horas) de las neuronas despu´es de 4 d´ıas en cultivo. Cuando se a˜ nadi´ o GDNF junto con el cisplatino, el n´ umero de neuronas encontradas despu´es de 4 d´ıas era significativamente mayor. Este efecto protector del GDNF era dependiente de la dosis: se encontraron 20,1 ± 5,1; 27,5 ± 3,2 y 32,8 ± 1,0 de las neuronas presentes al comienzo del tratamiento t´ oxico con concentraciones de GDNF de 1 ng/ml, 10 ng/ml y 25 ng/ml, respectivamente (datos no mostrados). Estos resultados indican que el 63 por ciento aproximadamente de las neuronas que responden al GDNF (el 44 % aproximadamente de la poblaci´ on de neuronas del ganglio espiral) pueden ser tambi´en protegidas contra la toxicidad del cisplatino.

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TABLA 4 Efecto del GDNF sobre la supervivencia de neuronas del ganglio espiral Supervivencia de las Neuronas del Ganglio Espiral ( % del n´ umero inicial despu´es de 24 horas)

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Tratamientos 50

Ninguno GDNF, 10 ng/ml

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Ninguno

Cisplatino (5 µg/ml)

48,5 ± 4,5 (n=9)

6,1 ± 1,2 (n=3)

71,6 ± 7,4 (n=5)∗∗

32,8 ± 1,0 (n=3)∗

GDNF y cisplatino fueron a˜ nadidos a cultivos de neuronas disociadas del ganglio espiral 24 horas despu´es del plaqueo. Los cultivos fueron incubados durante 3 d´ıas adicionales y se determin´o el n´ umero de neuronas contando las c´elulas NSE-inmunorreactivas. El n´ umero de c´elulas neuronales est´ a expresado como el porcentaje de neuronas presentes despu´es de 24 horas in vitro. Cada resultado es la media ± DE de n cultivos. ∗

Significativamente diferente de cisplatino solo a p<0,05 (Test t)

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ES 2 170 938 T3 ∗∗

Significativamente diferente del control no tratado a p<0,05 (Test t)

Ejemplo 3 5

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El Producto Proteico GDNF Estimula la Supervivencia In Vivo de C´elulas Ciliadas Cocleares El ejemplo siguiente demuestra que la administraci´ on en el o´ıdo interno del producto proteico GDNF protege a las c´elulas ciliadas cocleares frente a ototoxicidad en un modelo animal. El GDNF fue introducido en el o´ıdo interno mediante una c´ anula insertada en la escala timp´anica a trav´es de un orificio taladrado en la espiral basal de la c´ oclea. La c´anula estaba conectada a una minibomba Alzet cargada con GDNF (50 ng/ml) con una velocidad de liberaci´ on de 0,5 µl/hora durante 14 d´ıas. Se comenz´o a inyectar cisplatino i.m. dos d´ıas despu´es de la canulaci´on a 1 mg/ml diariamente durante 15 d´ıas o a 7,5 mg/kg dos veces, con un intervalo de 5 d´ıas (inserci´ on de la Figura 2). El experimento fue concluido despu´es de 27 d´ıas. Las c´elulas ciliadas fueron te˜ nidas con FITC-faloidina y se determin´ o su n´ umero en la espira media de la c´oclea (en al menos el 20 % de la parte de la espira media). Los resultados est´an expresados como el porcentaje de c´elulas ciliadas perdidas por cada cobayo individual en el o´ıdo tratado con GDNF (o´ıdo derecho) y en el o´ıdo no tratado (o´ıdo izquierdo).

Materiales

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Los materiales utilizados en el Ejemplo siguiente fueron obtenidos seg´ un sigue.

Materiales para la Preparaci´ on de las Minibombas 25

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alogo BB317-85, era de Bolab Products [(800) El tubo de vinilo m´edico de tama˜ no V/4, N◦ de Cat´ 331-7724]. Se utilizaron pipetas de pl´ astico de 5 ml de marca Fisher. Se utiliz´ o un tubo de poliimida Microlumen, # de Cat´ alogo 8004853 OG (Tampa, Florida). El producto de silicona m´edica MDX 4-4210 era de Dow Corning Corporation, Midland, MI. El moderador de flujo para la minibomba osm´ otica Alzet alogo 2002, eran de Alza Corp., Palo Alto, CA. Cinta (cinta y la minibomba osm´ otica Alzet, N◦ de Cat´ TimeMed). Prosil-28, Producto N◦ 11975-0, era de PCR Incorporated, Gainesville, Florida. Los productos proteicos GDNF recombinantes humanos purificados fueron preparados como una soluci´ on de 50 ng/ml en D-PBS y BSA 0,1 %. El azul de metileno al 0,1 % est´eril (# de Cat´alogo M-9140) disuelto en PBS, y el aceite mineral (# de Cat´ alogo 400-5), eran de Sigma.

Procedimiento para la Preparaci´ on de las Minibombas El tubo de vinilo fue cortado en una secci´ on de cuatro pulgadas aproximadamente y colocado a trav´es de un tornillo de carpintero miniatura. En el extremo del tubo de vinilo se coloc´ o una pieza del tubo de Poliimida Microlumen (7 mm). Se mezcl´o silicona a˜ nadiendo 10 partes aproximadamente de la base y una parte del agente de endurecimiento. Se coloc´ o una gota en la abertura del tubo de vinilo utilizando una sonda fina y el tubo Microlumen fue introducido en el vinilo, dejando una longitud de 3,75 mm que se extend´ıa desde el tubo de vinilo. Utilizando una gota de silicona en la sonda, se cre´ o un peque˜ no baloncillo alrededor del tubo Microlumen, a 0,5 mm del extremo, y se dej´ o secar durante una noche.

El di´ametro de una pipeta de 5 ml fue incrementado mediante la aplicaci´ on de tres capas conc´entricas de cinta a lo largo de la longitud de la pipeta. Se dej´ o un hueco constante en el que la pipeta permanec´ıa descubierta. Se enroll´ o alrededor de la pipeta un tubo V/4 y las espiras fueron ajustadas de modo que hubiera dos extremos de tubo sueltos y hubiera un contacto continuo entre todas las espiras. Dos tiras finas de cinta fueron alineadas con los extremos de la cinta que estaba sobre la pipeta para asegurar la espiral en su sitio. Dos l´ıneas finas de Superglue se aplicaron uniformemente sobre las espiras. Despu´es de secar durante un m´ınimo de una hora, los extremos sueltos fueron alineados paralelamente aproximadamente a la pipeta y asegurados en su sitio con una tira de cinta. Se aplic´ o una gota de Superglue para afianzar el tubo a las espiras. Despu´es de secar durante una noche, la cinta fue retirada y las espiras fueron deslizadas fuera de la pipeta. Se insert´ o un moderador de flujo en uno de los extremos sueltos y se asegur´o con una gota de Superglue.

Las espiras fueron lavadas abundantemente con Prosil-28 al 1 % en agua, aclaradas completamente con agua y luego lavadas abundantemente con etanol al 70 %. El etanol fue retirado por medio de una jeringa o vac´ıo de aire. Las espiras se dejaron en un desecador con vac´ıo de aire durante al menos 30 minutos y se mantuvieron durante una noche en el desecador cerrado y herm´ etico seguido por esterilizaci´on con gas. Durante el procedimiento de carga, el dispositivo espiral fue mantenido horizontalmente tanto tiempo como fue posible para impedir el movimiento impulsado por la gravedad de los l´ıquidos de 27

ES 2 170 938 T3 GDNF, aceite y colorante. Se evit´ o la formaci´on de burbujas de aire en la bomba o en las espiras. La bomba fue sumergida en PBS est´eril e incubada durante una noche a 37◦ C.

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La carga de la bomba con colorante azul de metileno se realiz´ o manteniendo la bomba en posici´ on vertical. Una jeringa cargada con colorante fue insertada completamente en la bomba y el colorante fue inyectado hasta que la bomba rebos´ o. Se evit´ o la inyecci´on de burbujas de aire en la bomba. Una pieza corta de tubo V/4 est´eril fue colocada en el moderador de flujo. El GDNF fue cargado a una concentraci´on de 50 ng/ml en PBS + BSA 0,1 %, en un volumen total de 230 µl, a unos 10 mm del extremo de la c´anula, utilizando una jeringa conectada con el tubo V/4. Para los experimentos control con el veh´ıculo, se carg´ o en las bombas el mismo volumen de PBS + BSA 0,1 %. Se retir´ o la pieza corta de tubo V/4. Se carg´ o luego aceite mineral en el dispositivo espiral con una jeringa de tal manera que se interpon´ıan entre el fluido de la bomba y el fluido de la l´ınea (fluido de infusi´ on) un espacio de aire de 2 mm y 7 mm de aceite mineral. Se insert´o completamente en la bomba un moderador de flujo.

Inserci´ on de la bomba en el o´ıdo interno Materiales

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La cola adhesiva para tejidos - cianoacrilato, era de Vetbond Tissue Adhesive, 3M Animal Care Products, St. Paul, MN. El cemento de carboxilato ESPE Durelon, # de cat´ alogo 03828, era de ESPEPremier Sales Corp., Norristown, PA. El metacrilato de metilo era de Lang Jet Acrylic, Lang Dental MFG, Co., Wheeling, IL. El instrumental de disecci´ on era de Roboz Surgical. Se utilizaron xilazina, ketamina y buprenorfina. El ung¨ uento oft´ almico lubricante (L´agrimas AKWA) era de Akorn Inc., Abita Springs, LA. La xiloca´ına al 2 %, N◦ de cat´alogo NDC 0186-0160-01, era de ASTRA. La grasa de silicona de grado m´edico, Art. N◦ 51.300, era de Unimed. El cemento de carboxilato en polvo Durelon Pulver, alogo D-82229, era de ESPE, Seefeld. El ung¨ uento de sulfato (bacitracina zinc-neomicina, N◦ N◦ de cat´ de cat´alogo 0168-0012-31) era de Fougera.

Procedimiento

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Cobayos albinos (250-350 g) fueron anestesiados con una mezcla de xilazina 10 mg/kg, ketamina 40 mg/kg y buprenorfina 0,05 mg/kg. El a´rea del o´ıdo derecho fue afeitada caudalmente, comenzando 2 cm aproximadamente anterior al vertex, 4-5 cm posterior a la esc´apula y post-auricularmente. El a´rea afeitada fue lavada con Betadine. Se aplic´ o un ung¨ uento oft´ almico lubricante a ambos ojos. Se inyect´o subcut´ aneamente xiloca´ına en el tejido que iba a ser cortado. Utilizando una t´ecnica as´eptica, se realiz´o una incisi´ on post-auricular. Utilizando una aguja fina se taladr´ o un orificio en la bulla para exponer la cavidad del o´ıdo medio y visualizar la c´oclea. Se taladr´ o manualmente un peque˜ no orificio en la pared ´osea de la espira basal, debajo de la ventana redonda, utilizando una aguja fina. El extremo de la c´ anula fue insertado en el orificio hasta que la gota de silicona se asent´o contra el hueso, lo cual colocaba el extremo de la c´anula a mitad de camino aproximadamente en el canal de la escala timp´ anica. Se coloc´ o una gota de cianoacrilato en el orificio de la bulla. Se coloc´ o cemento de carboxilato alrededor de la c´anula sobre el cianoacrilato. Una vez que se hubo endurecido el cemento, se confirm´o la colocaci´on y el resto del orificio fue cubierto con cemento de carboxilato sobre una capa de grasa de silicona. Se realiz´o una bolsa subcut´ anea entre las esc´apulas para acomodar la bomba que fue posteriormente insertada. La bolsa subcut´ anea fue lavada una vez con 3 ml de una soluci´ on de nitrofurazona disuelta en PBS est´eril y se llen´o posteriormente con 3 ml de PBS est´eril m´as un 1 % de gentamicina para evitar la infecci´on. La incisi´on fue cerrada con grapas para heridas y despu´es se aplic´o polvo de nitrofurazona alrededor de la herida.

Inducci´ on de sordera Materiales

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El cisplatino (Platinol-AQ), N◦ de cat´alogo NDC 0015-3220-22, era de Bristol-Myers Squibb Laboratories, Princeton, N.J. Procedimiento

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Las inyecciones de cisplatino (i.p.) comenzaron dos d´ıas despu´es de la implantaci´on de la minibomba.

Se utilizaron dos paradigmas de aplicaci´on: dos inyecciones de 7,5 mg/kg realizadas a un intervalo de 5 d´ıas, o bien 1 mg/kg diariamente, durante 15 d´ıas.

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ES 2 170 938 T3 Perfusi´ on

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Despu´es de cuatro semanas, los cobayos fueron anestesiados profundamente con una mezcla de xilazina y ketamina y fueron perfundidos transcardialmente con PBS enfriado en hielo seguido por paraformaldeh´ıdo al 4 % en PBS enfriado en hielo. Se extrajeron los huesos temporales y la c´ oclea ´osea fue colocada en paraformaldeh´ıdo al 4 % para post-fijaci´ on durante una noche a 4◦ C. Tinci´ on

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Para te˜ nir las c´elulas ciliadas se utilizaron los m´etodos de preparaci´ on de la superficie y tinci´ on con faloidina. La c´ oclea ´osea fue abierta con una aguja fina o con una hoja de bistur´ı #11. La estr´ıa vascular fue retirada utilizando unas pinzas finas. En una placa Petri conteniendo PBS, la membrana basal fue disecada cuidadosamente del modiolo ´oseo utilizando unas pinzas finas. Se tuvo cuidado para extraerla intacta. El procedimiento para la tinci´ on con faloidina fue similar al realizado para los explantes in vitro, con los cambios siguientes: se realiz´o permeabilizaci´on durante 20-30 minutos y se a˜ nadi´ o faloidina durante 90 minutos. Piezas del v´ertice, de la espira media y de la espira basal fueron montadas en un cubreobjetos de vidrio de 60 x 22. Se a˜ nadi´ o una gota de medio para montaje VECTASHIELD y se cubrieron las muestras con un cubreobjetos de 22 x 22 mm y se sellaron con esmalte de u˜ nas para impedir la evaporaci´on.

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An´ alisis de los datos

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Cada c´oclea fue examinada bajo el microscopio con un conjunto de filtros para FITC. Se seleccionaron ocho segmentos con la mayor p´erdida de c´elulas ciliadas de la espira media de la membrana basal y se fotografiaron utilizando una impresora unida a un ordenador. El contaje de c´elulas ciliadas se realiz´o manualmente, utilizando las fotograf´ıas. En cada animal, se compar´o la p´erdida de c´elulas ciliadas del o´ıdo izquierdo (como control, esto es sin infusi´ on de GDNF) con la p´erdida de c´elulas ciliadas en el o´ıdo derecho (infundido con GDNF).

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Resultados

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Las inyecciones de cisplatino tuvieron como resultado una p´erdida significativa de c´elulas ciliadas en la c´oclea. Esta p´erdida, en las secciones de la espira media analizadas de los o´ıdos izquierdos de tres cobayos inyectados con cisplatino a 1 mg/kg diariamente durante 15 d´ıas, fue del 49,2 %, 21,2 % y 46,9 %. Adem´as, en el cobayo inyectado con cisplatino a 7,5 mg/kg dos veces, en lugar de 1 mg/kg diariamente, hab´ıa una p´erdida del 42 % de c´elulas ciliadas en el o´ıdo izquierdo. La introducci´ on de GDNF en el o´ıdo interno derecho de cada uno de los cobayos, tuvo como resultado una reducci´ on significativa de la p´erdida de c´elulas ciliadas. La proporci´on entre el n´ umero de c´elulas ciliadas perdidas respecto al n´ umero de c´elulas ciliadas totales contadas en la c´oclea fue seg´ un sigue: 241/486, 113/530 y 244/513 en el o´ıdo izquierdo (control), mientras que sus equivalentes en el o´ıdo derecho (tratado con GDNF) fueron 83/492, 28/498 y 126/512, respectivamente. Estas proporciones representan un incremento de la p´erdida de c´elulas ciliadas entre el o´ıdo izquierdo y derecho de cada animal en el orden de x3, x4,2 y x1,9 para los tres animales. En el cobayo inyectado con 7,5 mg/kg de cisplatino, hab´ıa tambi´en un incremento de 2 veces de la p´erdida de c´elulas ciliadas en el o´ıdo no tratado (izquierdo) en comparaci´ on con el o´ıdo tratado (ver la Figura 2).

En los animales a los que se hab´ıa implantado una minibomba rellena de veh´ıculo en lugar de GDNF, no hab´ıa diferencia en el n´ umero de c´elulas ciliadas encontradas en el o´ıdo izquierdo (o´ıdo no tratado) y en el o´ıdo derecho (implantado).

Ejemplo 4

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Inyecciones del Producto Proteico GDNF Estimulan la Supervivencia In Vivo de C´elulas Ciliadas Cocleares

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El ejemplo siguiente demuestra que los productos proteicos GDNF protegen a las c´elulas ciliadas cocleares contra la ototoxicidad en un modelo animal cuando son aplicados en el o´ıdo medio. Se introdujo GDNF en el o´ıdo medio derecho mediante una u ´nica inyecci´on a trav´es de la membrana timp´anica a una concentraci´on de 1 mg/ml en PBS + BSA 1 %, en un volumen de 125-135 µl. Las inyecciones i.m. de cisplatino comenzaron un d´ıa despu´es de la inyecci´on de GDNF a 7,5 mg/kg, dos veces, con un intervalo de 5 d´ıas. El experimento fue finalizado tres d´ıas despu´es de la segunda inyecci´on de cisplatino. Las c´elulas ciliadas fueron te˜ nidas con FITC-faloidina y se determin´ o su n´ umero en la espira media de la c´oclea (en al menos el 20 % de la parte de la espira media). Los resultados (Figura 3) est´ an expresados como el porcentaje de c´elulas ciliadas perdidas para cada cobayo individual en el o´ıdo tratado con GDNF 29

ES 2 170 938 T3 (o´ıdo derecho) y en el no tratado (o´ıdo izquierdo).

Materiales 5

Los materiales utilizados en este experimento fueron los mismos que los utilizados en el Ejemplo 3.

Procedimiento

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Se anestesiaron cobayos albinos (que pesaban 600-700 g) con una mezcla de xilazina 10 mg/kg, ketamina 40 mg/kg y buprenorfina 0,05 mg/kg. Bajo un microscopio quir´ urgico, se realiz´o un orificio en la membrana timp´ anica del o´ıdo derecho mediante la inserci´on en la membrana de una aguja de 27 gauges.

En otra posici´ on de la membrana timp´ anica, se inyect´ o la prote´ına GDNF humana (a una concentraci´ on de 1 mg/ml en PBS + BSA 1 %) en la cavidad del o´ıdo medio, de tal manera que se llenara toda la cavidad (125-135 µl). Unos cuantos animales fueron inyectados solamente con veh´ıculo (PBS + BSA 0,1 %) en lugar de GDNF. Al d´ıa siguiente, se realiz´ o una inyecci´on i.m. de cisplatino (7,5 mg/kg). Cinco d´ıas m´as tarde, se realiz´o una segunda inyecci´ on a la misma concentraci´on. Tres d´ıas despu´es (8 d´ıas de periodo total del experimento), los animales fueron sacrificados, los tejidos fueron fijados y las c´ocleas fueron analizadas seg´ un se describi´ o en el Ejemplo 3.

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Resultados

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A los ocho d´ıas, los cuatro cobayos inyectados con cisplatino presentaban una p´erdida significativa de c´elulas ciliadas en la c´oclea. En los o´ıdos izquierdos, los o´ıdos que no recibieron GDNF, la p´erdida de c´elulas ciliadas en la espira media de la c´oclea fue: 34 %, 47 %, 42 % y 41 %. La inyecci´on de GDNF en la cavidad del o´ıdo medio derecho, a 1 mg/ml, redujo significativamente esta p´erdida: 16 %, 23 %, 21 % y 29 %, respectivamente (Figura 3). Los cobayos que recibieron inyecciones de veh´ıculo en el o´ıdo derecho en lugar de GDNF, no mostraron diferencia en el n´ umero de c´elulas ciliadas entre el o´ıdo derecho (tratado) y el izquierdo (no tratado).

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ES 2 170 938 T3 REIVINDICACIONES

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1. La utilizaci´on de un producto proteico factor neurotr´ ofico derivado de una l´ınea de c´elulas gliales (GDNF) para la fabricaci´ on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento de la p´erdida auditiva sensorineural.

2. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 1, en la que la p´erdida auditiva est´ a asociada con una lesi´ on en el o´ıdo interno.

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3. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 1, en la que la p´erdida auditiva est´ a asociada con una lesi´ on o con la degeneraci´on de las c´elulas ciliadas neuroepiteliales del o´ıdo interno.

4. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 1, en la que la p´erdida auditiva est´ a asociada con una lesi´ on o con la degeneraci´on de las neuronas del ganglio espiral.

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5. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 1, en la que el producto proteico GDNF es la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID N◦ :1 o una variante o un derivado de la misma.

6. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 5, en la que el producto proteico GDNF tiene la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID N◦ 1.

7. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 5, en la que el producto proteico GDNF es [Met−1 ]GDNF.

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8. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 1, en la que el producto proteico GDNF va a ser administrado a una dosis de 1 µg/kg/d´ıa aproximadamente a 100 mg/kg/d´ıa aproximadamente.

9. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 1, en la que el producto proteico GDNF va a ser administrado mediante un medio de terapia celular o de terapia g´enica en el que las c´elulas han sido modificadas para producir y secretar el producto proteico GDNF. 10. La utilizaci´ on de acuerdo con la reivindicaci´ on 9, en la que las c´elulas han sido modificadas ex vivo.

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11. La utilizaci´ on de acuerdo con la reivindicaci´ on 9, en la que las c´elulas han sido modificadas in vivo.

12. La utilizaci´ on de un producto proteico factor neurotr´ ofico derivado de una l´ınea de c´elulas gliales (GDNF) para la fabricaci´ on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento de lesiones o trastornos del aparato vestibular.

13. La utilizaci´ on de acuerdo con la reivindicaci´ on 12, en la que la lesi´on o trastorno tiene como resultado mareos, v´ertigo o p´erdida del equilibrio.

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14. La utilizaci´ on de acuerdo con la reivindicaci´ on 12, en la que el producto proteico GDNF es la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID N◦ : 1 o´ una variante o derivado de la misma.

15. La utilizaci´ on de acuerdo con la reivindicaci´ on 14, en la que el producto proteico GDNF tiene la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID N◦ 1.

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16. La utilizaci´ on de acuerdo con la reivindicaci´ on 14, en la que el producto proteico GDNF es [Met−1 ]GDNF. 17. La utilizaci´ on de acuerdo con la reivindicaci´ on 12, en la que el producto proteico GDNF va a ser administrado a una dosis de 1 µg/kg/d´ıa aproximadamente a 100 mg/kg/d´ıa aproximadamente.

18. La utilizaci´ on de acuerdo con la reivindicaci´ on 12, en la que el producto proteico GDNF va a ser administrado mediante un medio de terapia celular o de terapia g´enica en el que las c´elulas han sido modificadas para producir y secretar el producto proteico GDNF.

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ES 2 170 938 T3 19. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 18, en la que las c´elulas han sido modificadas ex vivo.

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20. La utilizaci´on de acuerdo con la reivindicaci´ on 18, en la que las c´elulas han sido modificadas in vivo.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales.

Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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ES 2 170 938 T3 LISTAS DE SECUENCIAS ´ GENERAL: (1) INFORMACION 5

(i) SOLICITANTES: Ella Magal ´ (ii) T´ITULO DE LA INVENCION: M´etodo para Prevenir y Tratar la P´erdida Auditiva Sensorineural y Trastornos Vestibulares Utilizando un Producto Proteico Factor Neurotr´ ofico Derivado de una L´ınea de C´elulas Gliales (GDNF)

10

´ (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 1 ´ PARA CORRESPONDENCIA: (iv) DIRECCION 15

(A) DESTINATARIO: AMGEN INC. (B) CALLE: 1840 DeHavilland Drive (C) CIUDAD: Thousand Oaks

20

(D) ESTADO: California (E) PA´IS: Estados Unidos de Am´erica 25

(F) ZIP: 91320 (v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disco magn´etico flexible

30

(B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS 35

(D) PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versi´on #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: ´ (A) NUMERO DE SOLICITUD:

40

(B) FECHA DE REGISTRO: ´ (C) CLASIFICACION: 45

´ SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE: (viii) INFORMACION (A) NOMBRE: Curry, Daniel R. ´ (B) NUMERO DE REGISTRO: 32.727

50

´ (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: A-392 ´ PARA TELECOMUNICACION: ´ (ix) INFORMACION

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´ (A) TELEFONO: 805-447-8102 (B) TELEFAX: 805-499-8011 ´ (C) TELEX:

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ES 2 170 938 T3 ´ PARA LA SEC ID N◦ :1: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 134 residuos de amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

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(ix) CARACTER´ISTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: secuencia de amino´ acidos deducida para el GDNF humano maduro ´ DE LA SECUENCIA: SEC ID N◦ :1: (xi) DESCRIPCION Ser Pro Asp Lys Gln 1 5 Arg Gln Ala Ala Ala 20 Arg Arg Gly Gln Arg 35 Ile His Leu Asn Val 50 Glu Glu Leu Ile Phe 65 Glu Thr Thr Tyr Asp 80 Arg Leu Val Ser Asp 95 Ala Phe Asp Asp Asp 110 His Ile Leu Arg Lys 125

Met Ala Val Leu Pro 10 Ala Asn Pro Glu Asn 25 Gly Lys Asn Arg Gly 40 Thr Asp Leu Gly Leu 55 Arg Tyr Cys Ser Gly 70 Lys Ile Leu Lys Asn 85 Lys Val Gly Gln Ala 100 Leu Ser Phe Leu Asp 115 His Ser Ala Lys Arg 130

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Arg Arg Glu Arg Asn 15 Ser Arg Gly Lys Gly 30 Cys Val Leu Thr Ala 45 Gly Tyr Glu Thr Lys 60 Ser Cys Asp Ala Ala 75 Leu Ser Arg Asn Arg 90 Cys Cys Arg Pro Ile 105 Asp Asn Leu Val Tyr 120 Cys Gly Cys Ile