PROPAGACIÓN DE Cattleya rex EN CULTIVO IN VITRO Henry Manuel Vera Tudela Ramírez
Tarapoto-Perú
“PROPAGACIÓN DE Cattleya rex en CULTIVO IN VITRO”
Henry Manuel Vera Tudela Ramírez Agrónomo
TARAPOTO – PERÚ 2013
I.
INTRODUCCIÓN
La actividad agrícola constituye la actividad productiva más importante de una zona y base de una economía nacional, en un extremo de la agricultura regional se sitúa la agricultura comercial, generalmente de pequeña y mediana escala, en el otro extremo la agricultura de subsistencia, esto ha generado problemas como la tala indiscriminada de los bosques con esto la destrucción de habitads de especies de orquídeas y su comercialización ilícita.
Existe la necesidad de buscar soluciones rápidas como la introducción de nuevas tecnologías ajustables a la realidad de la región, razón por la cual CORPORACION G Y G E.I.R.L a través del laboratorio de CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES, cuyo fin es multiplicar masivamente orquídeas y otras plantas ornamentales, manteniendo las características genéticas.
Las técnicas de tejidos vegetales, se representa como una alternativa a las metodologías convencionales de propagación, permitiendo la multiplicación de individuos de una especie en periodos cortos sin tener pérdidas ya sea por semillas u otros órganos; este método permite la propagación de especies selectas altamente productivas. Así mismo la aplicación de métodos en cultivo in vitro facilita la conservación de bancos de germoplasma, con la finalidad de mantener especies con su característica genéticas originales.
Para investigaciones futuras en el campo agronómico la propagación in vitro es una técnica aplicable en la región San Martín, esta ha servido de base a muchos países industrializados constituyéndose hoy en una herramienta más importante para el desarrollo de la agricultura y la floricultura.
El presente trabajo describe las actividades realizadas en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la empresa CORPORACION G Y G E.I.R.L como parte de prácticas pre-profesionales realizada durante el periodo Junio a Setiembre del 2013
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II.
ANTECEDENTES 2.1 Cultivo de Tejidos in vitro
(Abdelnour, E; et, al. 1994) dice que, se le define como un enfoque multidisciplinario que involucra varias ciencias (biología, bioquímica, genética, virología, agronomía, ingeniería, química, medicina y veterinaria entre otras) cuyo fundamento es el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre. El cultivo de tejidos o propagación in vitro consiste en cultivar un inóculo con potencialidad de diferenciación bajo condiciones asépticas en presencia de un medio nutritivo, dicha capacidad de regenerar un nuevo individuo entero es única de las plantas. Al igual que en otros métodos de multiplicación vegetativa o asexual, los individuos descendientes de una planta madre propagada in vitro son clones, es decir, copias genéticamente idénticas a la planta madre, mientras que en plantas propagadas por semilla (propagación sexual), la descendencia no es clónica puesto que cada semilla tiene su propia base genética resultante de la mezcla de sus progenitores, por tanto cada individuo es único.
(RUÍZ, 2003) dice, que es un grupo heterogéneo de técnicas, mediante las cuales un explante (parte separada de un vegetal, célula, tejido, embriones, etc.) con potencialidad de diferenciación se cultiva bajo condiciones asépticas, en presencia de un medio de cultivo constituido por macronutrientes, vitaminas y hormonas que se incuban bajo condiciones ambientales controladas.
(ROCA Y MROGINSKI, 1991) menciona que las técnicas de cultivo in vitro han contribuido no solo a un mejor entendimiento de los eventos de diferenciación celular, si no aún mejor aprovechamiento de tales eventos en la explotación más eficiente de las plantas. Al igual que otros métodos de multiplicación vegetativa o asexual, los individuos descendientes de una planta madre cultivada in vitro son clones, es decir copias genéticamente iguales entre ellas e idénticas a la madre. 3
(Mejia, 1998) menciona que el cultivo de tejidos vegetales es una importante técnica nueva de propagación de plantas que se halla a disposición del cultivador, pero aún no es ampliamente usada debido a su poca difusión. La reproducción vegetativa, si ocurre naturalmente o con la intervención humana, se inicia a partir de tallos, raíces, hojas; no hay mesclas de caracteres genéticos, la cual ocurre en la reproducción sexual a nivel de las flores. El principio de cultivo de tejidos es simple; primero, es necesario aislar una parte de la planta (explante); segundo, proveer al explante de un medio ambiente apropiado (medio de cultivo adecuado y en condiciones físicas propias de la especie) en el cual pueda expresar su potencial intrínseco o inducido, partiendo de un stock de plantas de sanidad aprobada. Estas son multiplicadas asépticamente bajo una cámara de flujo laminar, se seccionan segmentos de tallos u otras partes de la planta, son transferidos a recipientes de vidrio con medio fresco de cultivo, los recipientes son sellados con tapas autoclavables y cintas de parafilm.
(Aceves, J. et. al, 1994) menciona que, WHITE en el año de 1932, logra el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos ápices de raíces de jitomate. Los tejidos meristemáticos del ápice radical propiciaron crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo. La falla en los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se debió, como lo menciona White, a la mala elección del material vegetativo y a la simplicidad de los medios de cultivo utilizados. El logro de White le da un buen impulso al desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro; sin embargo en sus trabajos realizados hasta entonces no obtienen proliferación celular en forma, los ápices de raíz solo crecen en longitud como lo harían normalmente como parte de la raíz de la planta intacta. No es así hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferación celular in vitro en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultáneamente la formación de una masa de células parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos)
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utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las técnicas de cultivo in vitro.
(Roca, 1991) menciona, que es útil destacar la secuencia de eventos asociados a la multiplicación de plantas mediante la técnica de cultivo aséptico, de la siguiente manera: ETAPA 0 Etapa inicial, que comprende la selección de una modalidad de pretratamiento para volver funcional la estrategia que se adopte. ETAPA I Es la etapa de establecimiento, el cual se establece el cultivo inicial o primario. ETAPA II Es la etapa de multiplicación de brotes o multiplicación simplemente. ETAPA III Corresponde al enraizamiento o etapa de pretransplante, tiene como objetivo producir una planta autótrofa que pueda sobrevivir a las condiciones de transplante en el medio de cultivo. ETAPA IV Transferencia final a la etapa de medio ambiente y que este en condiciones de adaptarse a factores externos no controlados (luz, humedad, etc.).
Frecuentemente las condiciones específicas del medio o cultivo aséptico están asociadas con cada una de las etapas mencionadas, y cuando
sea
posible
conviene
establecer
una
estrategia
de
multiplicación basada en la interpretación de dichas condiciones. Sin embargo, no se debe llegar a la deducción de que estas etapas son siempre completamente distintas y separables. 2.1.1 El entorno del cultivo Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el biotopo de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por esa razón se realiza una simplificación de la 5
realidad escogiendo aquellos factores que se pueda mantener controlado.
En resumen el cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica que exige un control absoluto del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante. Conviene por tanto, conocer cuáles son los principales factores que conforman el ambiente del explanto y que deberán ser controlados.
De estas consideraciones surge el establecimiento de los cultivos de tejidos, es decir, la separación del explante y las operaciones relacionadas con su incubación in vitro, dependerá en gran medida del tipo de explante y del sistema de cultivo que se emplee, lo que a su vez dependerán del objetivo perseguido. En otras palabras, las técnicas que se emplean para cultivar protoplastos no son exactamente las mismas que se usan para cultivar meristemas; del mismo modo, un determinado sistema de cultivo puede ser de gran utilidad para el logro de un objetivo pero puede no ser útil para otro (Roca y Mroginski, 1991).
2.1.2 Micropropagacion
Cuando un inoculo con potencialidad de diferenciación se incuba en condiciones favorables (balance hormonal apropiado) regenera un nuevo individuo. La micropropagacion es prácticamente una multiplicación masiva in vitro (Roca y Mroginski, 1991).
2.1.3 Ventajas de la micropropagacion
(Mejia, 1998) menciona:
- Es uno de los métodos conocidos más utilizado actualmente para erradicar patógenos. - Permite uniformidad genética. 6
- Manejo de grandes volúmenes de plantas en un área pequeña. - Los materiales pueden ser propagados en cualquier época del año. - Se propaga masivamente plantas libres de enfermedades en corto tiempo. - No existe la perdida de las características genéticas del material. - Reduce los costos de labores agronómicas en el mantenimiento de los explantes en incubación. - El resultado es la obtención de plantas libres de enfermedades. - Se obtiene plantas homogéneas. - Se conservan materiales que están en proceso de extinción. - Propagación de especies de difícil multiplicación por sistemas tradicionales.
2.1.4 Desventajas de la micropropagacion
(Mejia, 1998) menciona:
- Variación de respuesta entre los genotipos. - Se requiere de personal especializado. - Requiere de infraestructura y equipamiento. - Los productos químicos son de elevado costo. - Contaminación de materiales por inadecuado desarrollo de asepsia. - Perdida de materiales por desperfectos de equipos (aire acondicionado, fluorescentes, ozonizador y otros). - Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.
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2.2 Vitropatógenos
(García et al., 2007) menciona que, la contaminación microbiana es uno de los problemas más graves en la propagación in vitro de especies vegetales en el mundo, ya que produce cuantiosas pérdidas de material vegetal tanto en la micropropagacion comercial como en los trabajos de investigación. Los contaminantes más frecuentes in vitro son los hongos, bacterias y levaduras, que en muchos casos no son patógenos en condiciones de campo.
2.3 Eliminación de bacterias y hongos
(García et al., 2007) menciona que, Se han establecido numerosos procedimientos tecnológicos para controlar o disminuir la presencia de contaminantes y el empleo de productos químicos (fungicidas y antibióticos) ha constituido una vía rápida tanto para atenuar como para eliminar estos microorganismos (Carrazana et al., 1997). Con el fin de atenuar el uso de estos compuestos y sus consecuentes efectos negativos, se buscan nuevas alternativas sobre la base de productos naturales. Se cree que la producción de aceites esenciales por las plantas está fundamentalmente justificada como un mecanismo de defensa contra los patógenos y plagas (Oxenham, 2003) y han mostrado un amplio espectro de actividad contra microorganismos patógenos de plantas y humanos (Qamar y Choudhary, 1991). Por ejemplo, el aceite esencial de Cymbopogon nardus que es extraído de las hojas y el tallo de la planta, es un aceite volátil con propiedades antisépticas, desodorantes, insecticidas, tónicas y estimulantes (Shahi y Tava, 1993). Se ha demostrado que aceites esenciales de plantas del género Cymbopogon, poseen propiedades antimicrobianas, incluyendo a C. nardus (Saikia et al., 2001), es por eso que este trabajo tuvo como objetivo evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de C. nardus para el control de microorganismos contaminantes, aislados del cultivo in vitro de especies vegetales.
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2.4 La autoclave y su funcionamiento
2.4.1 Esterilización
(Roca, 1991) menciona, el calor es uno de los agentes que se utiliza con más frecuencia en la esterilización. Se puede usar en forma de llama directa, calor húmedo (vapor) o como calor seco (aire caliente); cuando se utiliza en calor húmedo puede ser de forma de vapor abierto o vapor bajo presión. Ocasionalmente se puede usar agua caliente pero no hirviendo.
2.4.2 Vapor bajo presión (autoclave)
El vapor bajo presión es muy eficiente para destruir todas las formas de bacterias y hongos y sus esporas, y es el método más utilizado para esterilizar diferentes materiales incluyendo los medios de cultivo (siempre y cuando no contengan componentes termolábiles) (Roca y Mroginski, 1991).
2.4.3 Funcionamiento de la autoclave
(Roca y Mroginski, 1991) menciona, al utilizarlo es necesario extraer todo el aire antes de empezar el proceso de esterilización ya que, a presiones iguales la temperatura de una mezcla de aire y vapor no es tan alta como la del vapor puro; la extracción del aire se logra automáticamente al permitir que el vapor expulse el aire del aparato antes de cerrar la válvula correspondiente. La temperatura dentro del autoclave se regula mediante la presión y directamente proporcional a ésta; la presión se lee en un manómetro que forma parte del autoclave. Para esterilizar los materiales relacionados con el cultivo de tejidos se acostumbra a usar una presión de 15 libras (lb) durante 20 minutos, a esta presión la temperatura del vapor es aproximadamente 121°C suficiente para matar virtualmente todas las formas de vida en cinco minutos. La desinfección se limita al 9
proceso de destrucción de los microorganismos mediante métodos químicos; la esterilización se refiere a menudo al método físico para la destrucción de los microorganismos. Se utiliza la palabra axénico para las preparaciones que están libres de virus, viroides o micoplasma.
2.5 Medios de cultivo
Una vez definido el objetivo perseguido con el cultivo in vitro de un determinado explante, es necesario elegir un medio apropiado de cultivo, en el cual hay que considerar no solo sus componentes si no su preparación. En la actualidad existen innumerables formulaciones cada una de las cuales contiene entre 15 a 35 compuestos químicos que suministran carbono, sustancias reguladoras de crecimiento y otras sustancias, (Roca y Mroginski, 1991).
Concentraciones ideales de sustancias químicas necesarias y las combinaciones apropiadas de nutrientes, así como su forma química adecuada, ha sido posible establecer cultivos para casi todas las partes de la planta en diversas especies vegetales. (Ruíz, 2003).
2.6
Consideraciones en la preparación de medos de cultivo
Es necesario preparar el medio utilizando agua destilada. Se debe evitar el almacenamiento prolongado del medio para evitar la acumulación de contaminantes; todas las sustancias químicas usadas para su preparación deben ser de un alto grado de pureza. Para la preparación de los medios dependerá en primera instancia del tipo de medio, de su consistencia y de la presencia de componentes termolábiles, (Roca y Mroginski, 1991).
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2.7
Sustancias orgánicas complejas usadas en germinación asimbiótica de semillas de orquídeas.
(Padilla, E. 2008) en su tesis hace mención que, un gran número de aditivos se usan para favorecer la germinación asimbiótica de semillas de orquídeas y el subsecuente desarrollo y diferenciación de los protocormos (Arditti, 1967).
Los más frecuentes usados son el endosperma líquido de coco, el jugo de tomate y el fruto de plátano. Steward and Simmonds (1954) reportaron que las capas formativas del fruto del plátano poseen sustancias que estimulan la división en células de zanahoria; con solo esta evidencia disponible, Khalifah (1966 b) llegó a la conclusión de que estas sustancias responsables de la división celular eran las citoquininas.
Encontraron que el fruto de plátano contiene pequeñas cantidades de compuestos inductores de la división celular [zeatina, zeatin-ribosido y 6(2-isopentilamino) purina pero que comparados con el endosperma líquido del coco su actividad era extremadamente baja: 20 ml. de este aditivo daban una respuesta similar a 500 g de plátano. Sin embargo, existen evidencias que el efecto del plátano sobre el desarrollo de las orquídeas puede deberse a la presencia de otros compuestos distintos a las citoquininas, pues se ha reportado la presencia de compuestos afines a giberalinas y auxinas en el mismo (Khalifah. 1966a, 1966b).
(Valmayor. 1972), reportó que el endosperma líquido del coco solamente permite una pobre diferenciación en protocormos de Dendrobium, Vanda y Cattleya, mientras que su combinación con extractos de plátano resulta en un buen desarrollo de raíces y tallos. 2.8
Carbón activado (Padilla, E. 2008) en su tesis hace mención que, el carbón utilizado en el cultivo de tejidos es el carbón resultante de la combustión de tejidos vegetales (madera, residuos de madera, papel, lignina, etc.). Actualmente 11
es incluido con frecuencia en la formulación de medios de cultivo in vitro de orquídeas, tanto para la siembra de plántulas como de protocormos obtenidos a partir de semillas o de meristemas (Yam et. al., 1990). Algunos solutos de una solución son adsorbidos por el carbón activado cuando entran en contacto con este, el grado de adsorción depende de la temperatura, el pH, y la composición química de la sustancia adsorbida, siendo mayormente adsorbidos los compuestos moderamente polares y pocos solubles, como fenoles, fitohormonas y vitaminas, en comparación con los muy polares o los apolares: azucares, sorbitol, manitol, etc. que no son adsorbidos (Weatherhead et. al., 1979). Las sales inorgánicas muy disociadas no son adsorbidas por el carbón activado, pero si son los de muy baja solubilidad como cationes di- o polivalentes. Es por ello en estos casos importantes el uso de agentes quelantes (EDTA) que incrementan la solubilidad de los mismos (Yam et. al., 1990). Varios mecanismos se han propuesto para explicar el efecto benéfico del carbón activado en el cultivo de orquídeas (Weatherhead et. al., 1978). En primer lugar la contribución de minerales en forma de impurezas estaría enriqueciendo el medio de cultivo. Segundo, la capacidad para adsorber metabolitos fitotóxicos que estarían siendo liberados al medio de cultivo por los tejidos (fenoles y sus oxidados, hidroxiquinonas, ácido para – hidro – benzoico). Tercero la adsorción de sustancias producidas durante la esterilización en el medio de cultivo, como el hidroximetilfurfural, resultado de la deshidratación de las hexosas que afectan el crecimiento y desarrollo de las plántulas. Cuarto, la adsorción de etileno que inhibe el crecimiento y la diferenciación de las plántulas y protocormos. Para el cultivo de orquídeas se utiliza carbón activado en medios de cultivo para germinación de semillas y en medios para desarrollo como para etapas posteriores (replante) a una concentración de 2 g/l.
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2.9
Experiencias en cultivo in vitro de orquídeas con medios de cultivo casero.
2.9.1 Medios de cultivo para la siembra de semillas y meristemas.
(Padilla, E. 2008) en su tesis dice que (Machado. 2003) menciona, que para un laboratorio casero, se puede preparar medios con componentes de fácil adquisición y baratos. Estos medios son tan eficientes y en algunos casos hasta mejores que los medios usados tradicionalmente en el cultivo in vitro de orquídeas. Los componentes para la preparación del medio de cultivo casero se pueden adquirir en cualquier feria libre o mercado de productos de primera necesidad, la preparación del medio es tan fácil que quien sabe preparar una vitamina para su consumo personal, sabrá también con seguridad hacer un excelente medio para producir orquídeas.
2.9.2 Receta de un medio de cultivo para cultivar semillas.
(Machado. 2003), recomienda que todos los componentes a usarse en la preparación de un medio de cultivo debe ser orgánico sin agroquímicos, estos son: Plátano seda semi maduro sin cascara, aproximadamente 50 g. Papaya (una cuchara de sopa bien llena) aproximadamente 50 g. Tomate cereza (cinco pequeños tomates) aproximadamente 50 g. Agua de coco verde (1 vaso) aproximadamente 120 ml. Azúcar (una cuchara de sopa) aproximadamente 20 g. Agar-Agar (una cuchara de sopa) aproximadamente 10 g. Polvo de carbón (una cuchara de sopa) aproximadamente 01 g. Agua destilada completar para un litro.
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2.10 Características de la orquídeas
2.10.1 Clasificación taxonómica
(Dresler, 1993) menciona, Clasifica a las orquídeas de la siguiente manera:
REYNO:
Plantae
SUBREINO:
Embriofitos
PHYLLIUM:
Traqueofitas
SUBPHYLLIUM:
Pterópsidos
CLASE:
Angiosperma
SUBCLASE:
ORDEN:
SUBORDEN:
FAMILIA:
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Monocotiledoneas
Microsperma
Ginandras
Orquídeas
2.10.2 Género Cattleya
(Cavero, M. et. al., 1991) menciona, que el género dedicado a Willian Cattle, eminente horticultor y uno de los primeros aficionados en tener una colección privada de orquídeas. Este género es conocida por los cultivadores como “la reina de las orquídeas”.
Crece en forma epifita o algunas veces sobre rocas; se conoce unas 65 especies, todas en américa tropical, extendiéndose desde México hasta Argentina.
Presentan pseudobulbos prominentes, los cuales pueden ser unifoliados o bifoliados. En la mayoría de las especies los pedúnculos florales emergen del extremo superior del pseudobulbo adulto y los botones florales están envueltos en una espata simple o doble. En casi todos los casos, los sépalos están notoriamente extendidos y los pétalos son más anchos que los sépalos, el labelo es grande y vistoso.
Las
Cattleyas
son
las
orquídeas
más
ampliamente
comercializadas. Miles de híbridos han sido producidos cruzando Cattleyas con géneros aliados o próximos.
Para el Perú se reportan seis especies, distribuidas en Amazonas, Cajamarca, Huánuco, Junín, Loreto, Piura, San Martín y Tumbes.
(Gutierrez et. al, 1998) menciona, el género Cattleya requiere de una cantidad de luz del 70 – 80% y en algunos casos de luz solar directa, mientras otras requieren de menor intensidad luminosa como es el caso de la Phalaenopsis y Góngora. Las quemaduras por exceso de luz causan daños irreversibles en la hoja y esta puede llegar a secarse. Las orquídeas de climas cálidos prefieren temperaturas mayores a 21°C y los de clima intermedio toleran 15
tanto temperaturas altas como bajas. El riego de las orquĂdeas debe hacerse por las maĂąanas para que las plantas tengan tiempo de secarse en el transcurso del dĂa. Regar en las tardes o en las noches favorece la apariciĂłn de pudriciones y enfermedades causadas por hongos y bacterias.
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III.
ACTIVIDADES DESARROLLADAS 3.1 Organización del laboratorio El laboratorio de Cultivo de Tejidos de la empresa CORPORACION G Y G E.I.R.L está constituido por 3 ambientes, distribuidos de la siguiente manera: 3.1.1 Área de Recepción, lavado y preparación de medio de cultivo Aquí se recepcionan los materiales vegetales para siembra procedentes del vivero y frascos de vidrio para su lavado, para que sean reutilizados nuevamente como frascos in vitro (conteniendo el medio de cultivo) ; cuenta con un lavadero para agua fría, así mismo un grifo para las actividades de lavado.
Aquí se preparan los medios de cultivo para la siembra del material vegetal, para ello cuenta con una autoclave el cual es utilizado para el autoclavado de los medios de cultivo, esterilización de material de vidrio conteniendo material vegetal contaminado. Cuenta también con un espacio para almacenar los materiales de vidrio, plástico y reactivos químicos. Este ambiente cuenta con una mesa de trabajo para la preparación de los medios de cultivo, así también equipos como: pH metro, balanza analítica, autoclave, refrigeradora, microscopio, estufa para los materiales quirúrgicos.
3.1.2 Área de Siembra y Transferencias En esta área se realiza las siembras, el trabajo de excisión, inoculación y transferencia de los explantes a los frascos de vidrio que contienen el medio de cultivo. Este trabajo se realiza con altos niveles de limpieza ambiental, esta área implementada con una cámara de flujo laminar horizontal de aire filtrado de baja presión la cual es útil para realizar la siembra y la transferencia de los materiales vegetales (Orquídeas). 17
3.1.3 Área de incubación Los cultivos se incuban en un ambiente apropiado donde se encuentran las estanderias metálicas los cuales sirven para colocar los frascos tapados herméticamente el cual contiene las semillas de Cattleyas ya sembradas.; esta área mantiene las condiciones favorables para el desarrollo de los cultivos. La regulación de la temperatura se logra por medio de equipos de aire acondicionado de pared programables, el cual mantiene la temperatura favorable entre 20 y 28°C. La iluminación se está aprovechando las horas de luz del día de las 6:00 antes medidiano hasta las 18 horas, a partir de esta hora se encienden las luces de los tubos de fluorescentes hasta las 22 horas cumpliendo así las necesidad del cultivo de 16 horas luz y posterior 8 horas de oscuridad; el cuarto de incubación tiene en las ventanas vidrios transparentes la cual permite la entrada de las luz del día. 3.2 Uso de materiales y equipo de laboratorio 3.2.1 Lavado y esterilización de materiales de vidrio Los materiales de vidrio son lavados con agua y detergente en el lavatorio y enjuagados con agua de caño y posteriormente con agua destilada y esterilizadas en la autoclave a una presión de 15 lb. Y a una temperatura de 121°C durante 15 minutos; este proceso se realiza con la finalidad de eliminar cualquier agente contaminantes en los materiales. 3.2.2 Preparación soluciones desinfectantes para el material vegetal Se preparó con la finalidad de desinfectar cápsulas, semillas u otro material vegetal para que estén libres de agentes contaminantes y posteriormente sembrarlos utilizando a cámara de flujo laminar en los frascos conteniendo el medio de cultivo semisólido.
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La solución que se utiliza con más frecuencia en el laboratorio para la desinfección de materiales vegetales es la lejía comercial que contiene como ingrediente activo al Hipoclorito de Sodio al 4.9% (NaOCl), el cual hay que baja la concentración para desinfección de capsulas al 1% y para semillas al 0.5%. Para bajar la concentración del Hipoclorito de Sodio se utilizó la siguiente formula:
V1.C1 = V2.C2 Dónde: V1: volumen inicial
V2: volumen final
C1: concentración inicial
C2: concentración final
Pasos a seguir:
El volumen inicial (V1 en mililitros), es el volumen requerido de lejía comercial.
La
concentración
inicial
(C1
en
porcentaje),
es
la
concentración de Hipoclorito de Sodio de la lejía comercial (4.9% de NaOCl).
El volumen final (V2 en mililitros), es el volumen de agua requerido.
La
concentración
final
(C2 en
porcentaje),
es
la
concentración esperada. Para la limpieza de la mesa de trabajo de la cámara de flujo laminar, material quirúrgico y otros materiales se utiliza alcohol medicinal de 70° y 96° (grados).
3.2.3 Uso de la balanza analítica La balanza analítica es indispensable para el pesado de los insumos para el preparado del medio de cultivo, donde cada peso tiene que ser exacto según como indican la tabla de formulación.
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La balanza nos permite pesar cantidades pequeñas como miligramos (mg.) y que es muy imposible pesar en balanzas convencionales. 3.2.4 Uso del pH metro El pH metro permite medir exactamente el pH de la preparación de los medios de cultivo ya que es indispensable para que las plántulas se desarrollen adecuadamente. Esta constituido básicamente por un electrodo sensible y un tablero de control el cual nos permite medir y calibrar el pH del medio de cultivo dependiendo del requerimiento del cultivo o especie, la calibración se realiza haciendo la aplicación de Ácido Clorhídrico a 1 Normal (HCl al 1N) en caso de bajar el pH del medio de cultivo, y Hidróxido de Sodio a 1 Normal (NaOH) en caso de subir el pH del medio de cultivo, así llegar al rango de pH requerido. 3.2.5 Uso y mantenimiento de la autoclave La autoclave proporciona vapor bajo presión y es muy eficiente para destruir todas las formas de vitropatógenos. Al utilizarlo, se extrae todo el aire antes de empezar el proceso de esterilización, la extracción de aire se logra automáticamente al permitir que el vapor expulse
el
aire
del
aparato
antes
de
cerrar
la
valvula
correspondiente. La temperatura dentro de la autoclave se regula mediante la presión; la presión se lee en un manómetro que forma parte de la autoclave. Para esterilizar los materiales se utiliza una presión de 15 libras (15lb) durante 20 minutos, a esta presión la temperatura del vapor es aproximadamente 121°C suficiente para matar todas las formas de vida (Roca y Mroginsk, 1991).
El mantenimiento de la autoclave, como la limpieza interior es importante ya que se almacena de tanto uso desperdicio de materiales esterilizados, se debe lavar con bastante agua y detergente y enjugar con agua corriente y posterior con agua
20
destilada; luego llenar con agua destilada hasta su nivel y la autoclave está listo para ser utilizado nuevamente.
3.2.6 Limpieza y desinfección del área de trabajo, instrumentos, recipientes y del investigador en el laboratorio.
Los contaminadores más comunes son las bacterias y las esporas de hongos que habitan en el ambiente y el polvo que se filtra por las ranuras
de
las
puertas.
Evitar
la
contaminación
con
microorganismos es un aspecto básico que se debe tener en cuenta para el éxito en el establecimiento de los cultivos y su manipulación.
Área de trabajo. Los equipos como la balanza analítica, el pH metro, microondas, mesa de trabajo, cámara de flujo laminar, etc., deben desinfectarse con alcohol etílico de 70° o 96°antes de realizar los trabajos en el laboratorio. El piso, las estanderias metálicas y las paredes impregnadas de polvo se deben limpiar y utilizar alcohol. Los instrumentos. Los instrumentos de trabajo se deben esterilizar antes de utilizarlos. Se debe tener en cuenta que los instrumentos inicialmente estériles pueden contaminarse con agentes contaminantes del aire, de superficies vegetales mal desinfectadas, de las manos del técnico, de la exhalación del investigador; se debe utilizar varios juegos de las mismas herramientas y mantener la asepsia de las que se ha usado colocando los instrumentos en alcohol etílico de 70° o 96° de 3 a 4 minutos, luego flamearlas cuidadosamente en el mechero de alcohol ( de tres a cuatro flameadas). El exceso de flameo hace que el metal pierda temple y oxide los instrumentos, hay que tener mucho cuidado con este procedimiento. El exterior de los recipientes de cultivo. Existe la posibilidad que durante el tiempo transcurrido entre la esterilización de los recipientes con los medios de cultivo y el momento de usarlos, se localizan en su exterior ciertos contaminadores, de tal manera 21
que se mantenga estéril el interior de los frascos, por lo tanto, se debe flamear obligatoriamente la boca de cada frasco antes y después de sembrar el explante. El investigador o técnico de laboratorio. E el principal contaminador del ambiente del laboratorio. El investigador al ingresar al laboratorio debe lavarse las manos con bastante agua y jabón, usar bata limpia de laboratorio, guantes limpios y mascarilla de boca y nariz, esto al momento de realizar la siembra de los explantes en la cámara de flujo laminar. Otro dato importante es que no se debe manipular los frascos en el cuarto de incubación con las manos sucias, pueden dejar señales de focos de contaminación al momento de las transferencias a otros frascos en la cámara de flujo laminar.
3.3 Preparación de medios de cultivo, fase de siembra y método de siembra
La preparación de los medios de cultivo se realizó siguiendo los protocolos ya establecidos en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la empresa CORPORACION G y G E.I.R.L, solo variando la formulación para
cada
fase
(germinación,
multiplicación,
enraizamiento).
La
formulación tomada para este trabajo fue de un medio de cultivo casero con insumos como azúcar, complejo B, Bayfolan (fertilizante foliar), plátano seda, carbón activado y agar; tomado de (Padilla, E., 2008).
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3.3.1 Medio de cultivo para germinación
La formulación que se utilizó para la primera fase de iniciación o germinación de las semillas de Cattleya es la siguiente: Tabla N° 01 Formulación: Germinación Volumen: 1 litro Insumos
Unidad
Cantidad por Litro
Fertilizante Bayfolan (11 – 08 – 06)
ml
7.10
Complejo B + Zn
ml
3.00
Azúcar blanca
g
20.00
Agar
g
Carbón vegetal molido o activado
g
2.00
Plátano seda
g
40.00
Agua destilada
ml
1000.00
------
5.1 – 5.4
pH
Depende de la marca
Fuente: Padilla, E., 2008
Figura N° 1. Insumos para la preparación del medio de cultivo casero
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Protocolo de preparación de medio de cultivo para germinación de Cattleya sp. Lavar con agua de caño los frascos de vidrio y dejar escurrir el agua Enjuagar con agua destilada los frascos de vidrio de dejar escurrir el agua En un vaso de precipitado de 1 litro, dispensar 700 ml. de agua destilada Colocar los 700 ml. de agua destilada en el vaso de una licuadora Agregar el plátano seda, azúcar, carbón, bayfolan, complejo B Utilizando una licuadora, licuar los insumos hasta homogenizar la solución Colocar el medio licuado en el vaso de precipitado Enrazar a un litro con agua destilada Medir el pH del medio Ajustar el pH con Ácido Clorhídrico (HCl) si el pH del medio esta alto, o el Hidróxido de Potasio (KOH) si el pH está bajo Agregar el agente gelatizante Agitar y dispensar el medio en cada uno de los frascos de vidrio Tapar con el papel aluminio y papel reciclado y ajustar con hilo pabilo Autoclavar los frascos conteniendo el medio de cultivo a 15 libras de presión por 15 minutos a una temperatura de 121°C Agitar los frascos autoclavados y dejar enfriar a temperatura ambiente Almacenar los frascos conteniendo los medios semisólidos
3.4 Recolección de material vegetal y pasos a seguir para su introducción a in vitro Se recolectaron cápsulas en estado óptimo para su siembra, tanto cápsulas abiertas (dehiscente) y cápsulas cerradas (indehiscente).
3.4.1 Cápsula cerrada (indehiscente)
El procedimiento a seguir es la siguiente:
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Lavado de cápsula La cápsula se lava con agua corriente y enjuagada con agua destilada para eliminar impurezas de la superficie.
Figura N° 2. Lavado de la cápsula antes de la desinfección con Hipoclorito de Sodio Desinfección de la cápsula Se desinfecta con una solución preparada de Hipoclorito de Sodio al 1% (NaOCl), se sumerge la cápsula en la solución por 20 minutos y luego enjuagada con agua destilada estéril y se deja escurrir todo el agua, y la cápsula esta lista para ser abierta al interior de la cámara de flujo laminar con material quirúrgico estéril.
Figura N° 3. Desinfección de cápsula en Hipoclorito de Sodio
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Figura N° 4. Enjuague de cápsula en agua destilada estéril Extracción de la semilla La cápsula desinfectada es abierta con una pinza y un bisturí sobre una placa Petri estéril, es expuesta la semilla y espolvoreada sobre otra placa Petri estéril, la semilla extraída se le agrega agua destilada estéril en mínima proporción con la finalidad de diseminar uniformemente la semilla al momento de la siembra.
Figura N° 5. Cortes con el bisturí a la cápsula para la extracción de las semillas
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Figura N° 6. Extracción de semillas de la cápsula
Figura N° 7. Agregando agua destilada estéril para diseminar las semillas
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Figura N° 8. Diseminación de semillas con agua destilada estéril Siembra La siembra se realiza con una cucharita estéril el cual nos permite recoger con facilidad las semillas de la placa Petri, se siembra a razón de 2 a 3 cucharaditas sobre el medio de cultivo en frascos de 250 ml de capacidad, se tapa con el papel aluminio y se sella con el parafilm (cinta plástica), se etiqueta el frasco y está listo el frasco con la siembra.
Figura N° 9. Siembra de semillas diseminadas en agua destilada estéril
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Figura N° 10. Tapado, sellado y etiquetado de frascos sembrados Incubación Los frascos se colocan en la sala de incubación a una temperatura de 26°C, es en este lugar donde las semillas germinan y las plántulas in vitro se desarrollan hasta la etapa final donde tienen que salir a aclimatación en vivero.
Figura N° 11. Frascos con siembras en la sala de incubación
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3.4.2 Cápsula abierta (dehiscente) Para el trabajo de desinfección de cápsula abierta donde las semillas estaban expuestas al medio ambiente se utilizó la desinfección por el método de la jeringa que detallo a continuación: Para este método se utilizaron jeringas estériles de 20 centímetros y nuevas adquiridas en las farmacias. Se extrae en embolo del cuerpo de la jeringa y se introduce un trozo de algodón al fondo del cuerpo, luego comprimir el algodón para que quede seguro y firme.
Figura N° 12. Retiro del embolo del cilindro de la jeringa
Figura N° 13. Trozo de algodón comprimido al interior del cilindro de la jeringa
30
Se introduce las semillas al cuerpo de la jeringa.
Figura N° 14.
Introducción de semillas al cilindro de la jeringa
Se coloca el embolo de la jeringa.
Figura N° 15.
Introducción de semillas más el embolo al cilindro de la jeringa
31
Se succiona la solución de Hipoclorito de Sodio al 0.5% (NaOCl) y se realiza la desinfección de las semillas
agitando
continuamente la jeringa (se realizó tres lavadas).
Figura N° 16. Desinfección con Hipoclorito de Sodio
Las semillas desinfectadas
se enjuagan con agua destilada
estéril. El proceso de desinfección y enjuague debe realizarse por 15 minutos y por tres veces.
Figura N° 17. . Enjuague de semillas con agua destilada estéril 32
Se quita el embolo del cilindro de la jeringa para extraer las semillas desinfectadas y enjuagadas.
Figura N° 18. Extracción del embolo del cilindro de la jeringa
Se quita la aguja hipodérmica del cilindro y utilizando un alambre se empuja por la boquilla de la jeringa el algodón y así se extrae las semillas que son colocadas a una placa Petri estéril.
Figura N° 19. Extracción de semillas del cilindro de la jeringa 33
Se siembra las semillas en los frascos conteniendo el medio de cultivo, se flamea la boca del frasco de vidrio, se tapa con el papel aluminio y sella con la cinta plástica.
Figura N° 20. Siembra de semillas en el frasco con medio de cultivo
Figura N° 21. Flameado de boca de frasco para garantizar la esterilidad de la siembra
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Figura N° 22. Tapado con el papel aluminio y sellado del frasco con la cinta plástica
Se etiqueta y se traslada el frasco con la siembra a la sala de incubación.
Figura N° 23. Etiquetado de frascos
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Figura N° 24. Frascos con siembras en la sala de incubación
Se hace mención que durante el periodo de prácticas desarrollada en la empresa, solo se llevó a cabo una etapa del desarrollo in vitro, que fue la etapa de iniciación (FASE I) o instalación de siembras de Cattleya sp. La cual menciono a continuación: Fase de Iniciación o Fase I Es la etapa o fase de iniciación o de establecimiento, se sembró las semillas de la Cattleya sobre la superficie del medio de cultivo (medio de cultivo casero). Es muy importante la observación continua de los frascos para verificar que no haya, fenolizacion, vitrificación y contaminación, en caso de que hubiera contaminación se separa los frascos, se autoclava para matar el agente contaminante y se lava los frascos de vidrio para ser reutilizados.
36
IV.
BIBLIOGRAFÍAS
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37
10. Machado, D. 2003. Orquídeas. Manual práctico de reproduction. Editorial Expressao e Cultura. Pp: 5 – 9. 11. Oxenham, SK. 2003 “Classification of an Ocimun basilicum germplasm collection and examination of the antifungal effects of the essential oil of basil. Glasgow, (University of Glasgow UK PhD thesis). 12. Padilla, E., 2008 Tesis “Evaluación de medios de cultivo para la micropropagacion in vitro de Orquídeas de las especies Cattleya sp. Y Oncidium lanceanum en Tarapoto” Universidad Nacional de San Martín. 13. Qamar, S y Choudhary F M (1991). Pak. J. Sct. Indl. Res. 34: 30-31. 14. Ruíz. 2003 Tesis “Micropropgación
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38
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39
V.
ANEXO
40
Anexo N掳 01: Fertilizante utilizado para la preparaci贸n de medios de cultivo.
Anexo N掳 02: Complejo B, utilizado como fuente de vitamina en la preparaci贸n de medios de cultivo
41
Anexo N掳 03: Rompimiento de testa y desarrollo de embri贸n de Cattleya rex
Anexo N掳 04: Sala de incubaci贸n de frascos sembrados con semillas de Cattleya rex
42
Anexo N째 05: Germinaci처n de semillas de Cattleya rex a las pocas semanas de haberlas sembradas en medio casero
Anexo N째 06: Flor de Cattleya rex
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GLOSARIO
CÁPSULA
Fruto seco, con una o más cavidades que contienen varias semillas y cuya dehiscencia se efectúan según el plano que no es perpendicular al eje del fruto.
DEHISCENCIA
Acción de abrirse naturalmente las anteras de una flor o el pericarpio de un fruto, para dar salida al polen o a la semilla.
ENRAZAR
Agregar, nivelar con agua u otra solución.
EMBRIÓN
En las plantas fanerógamas, embozo de la futura planta, contenido en la semilla.
IN VÍTRO
Cultivo en vidrio.
TESTA
Cubierta externa de la semilla, derivada del tegumento y de consistencia y dureza variables.
MICROPROPAGACIÓN
Multiplicación masiva en in vitro.
VITROPATÓGENOS
Contaminantes por hongos, bacterias y otros en el proceso in vitro.
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